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MANUAL TECNICO PARA LA PRODUCCIÓN DE Trichoderma spp., COMO FUNGICIDA BIOLÓGICO EN LA SOCIEDAD COOPERATIVA

“EQUIPO DE COMPOSTEO DE ATLIXCO” ECOMATLIX S. C. de R. L. de C. V., EN ATLIXCO, PUEBLA.

Elaboró:

ING. VICENTE NOLASCO GUZMÁN

Asesor:

M. C. Víctor De La Cruz Isidro

Mayo de 2010

Laboratorio de Trichoderma

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INTRODUCCIÓN

La Sociedad Cooperativa ECOMATLIX R. L. de C. V. (Equipo de Composteo de Atlixco S. C. de R. L. de C. V.), es una organización que se dedica a la producción de insumos orgánico, para la agricultura, dividiéndose en diferentes áreas, de las cuales son: área de producción de abonos orgánicos, área de producción de nematodos entomopatógenos área de producción de Trichoderma spp como fungicida.

Este documento es un manual que concentra los procedimientos detalladamente, para proporcionar al trabajador una herramienta de consulta, con el fin de estandarizar los pasos a seguir en la producción de Trichoderma, como fungicida biológico.

Para la realización del manual acudimos y nos incorporamos a las actividades cotidianas del laboratorio, con el fin de seguir los pasos y fijar los procedimientos más adecuados en cada fase. Y de acuerdo a esta forma de producción y la tecnología aplicable, se clasifica la producción como semi-industrial.

La Sociedad Cooperativa ECOMATLIX, considera que es de vital importancia que se cuente con esta herramienta dentro del Laboratorio de Trichoderma, con el objetivo de hacer llegar de manera rápida y eficiente, de los requerimientos y pasos a seguir en la producción de Trichoderma. Y de esta manera, cumplir con los requerimientos de calidad del producto a obtener.

El manual se divide partes, de las cuales: identificación del manual, objetivos y justificación del manual, políticas del laboratorio, términos y definiciones, procedimientos control de calidad, medios de cultivo e instalaciones.

El objetivo fundamental de la elaboración de este manual es precisar los procedimiento de producción, así como, la de ubicar los puntos críticos de la misma. Además de, presentar los métodos que más se adecúen para cierta actividad y de acuerdo también, a las posibilidades del laboratorio.

Manual técnico de producción de Trichoderma

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JUSTIFICACIÓN

Ecomatlix S. C de R. L. de C. V. es una pequeña empresa que fue creada en el año

2008, iniciando operaciones a partir de octubre de 2009, por lo que tiene muchas

necesidades y limitantes, entre las que destacan las de carácter organizacional,

operativo y administrativo, así como de recursos financieros, materiales, humanos y

de tiempo.

Considerando el buen uso de los recursos disponibles, y establecer las formas de

operación efectiva se lograra menguar los problemas que enfrenta la empresa en la

actualidad.

Por lo mencionado arriba, se realiza el presente manual técnico enfocado a definir

los procedimientos, funciones y actividades secuenciales en cada área, con el

objetivo de agilizar los procedimientos que realiza el personal, ahorrar tiempo y

recursos de las que se encuentra limitado.

MARCO DE REFERENCIA

El proyecto se llevó a cabo en Las Nieves, una de las colonias que conforman al municipio

de Atlixco, en el estado de Puebla. Está ubicado a 1,840 m de altitud. Se encuentra a una

hora de la cuidad de puebla.

Las Nieves se encuentra en la zona oriente de la región centro del municipio de Atlixco, a

25 kilómetros al oeste de la Ciudad de Puebla. De acuerdo a los resultados que presenta el

II Conteo de Población y Vivienda del 2005, el municipio cuentan con un total de 122,149

habitantes. Tiene acceso por la autopista a Puebla, así como por el libramiento Puebla –

Matamoros.

El domicilio donde se encuentra la clínica agro – biológica es en la Calle Europa Número 8,

Colonia Las Nieves, Atlixco, Puebla.


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Mapa de localización de la clínica agro – biológica de reproducción de nemátodos

Atlixco es un municipio que se localiza al suroeste de la ciudad de Puebla de Zaragoza,

capital del estado mexicano de Puebla. Es conocido por su buen clima y la gran actividad

florística, comercial y turística que le valieron haber sido llamada Atlixco de las Flores, El

mejor clima del mundo. El último domingo de septiembre, Atlixco es la sede de un festival

en el que se reúnen los representantes de las once regiones culturales del estado de

Puebla, festival que es llamado Huey Atlixcáyotl o "Fiesta Grande de Atlixco" y que es

patrimonio cultural del estado de Puebla. La cabecera municipal es la Heroica Ciudad De

Atlixco De Mújica y Osorio, tercera ciudad por habitantes en el estado, después de Puebla

Capital y Tehuacán.

Tiene una altitud promedio de 1840m sobre el nivel del mar. Sus coordenadas geográficas

son los paralelos 18º 49` 30" y 18º 58` 30" de latitud norte y los meridianos 98º 18` 24" y

98º 33` 36" de longitud occidental.

Tiene una superficie de 229.22 kilómetros cuadrados que lo ubica en el 51º lugar con

respecto a los demás municipios del estado.

El municipio colinda al Norte con el municipio de Tanguismanalco, al Noreste con los

municipios de Santa Isabel Cholula y Ocoyucan, al Suroeste con el municipio de


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Atzitzihuacan, al Sur con los municipios de Huaquechula y Tepeojuma, Sureste con el

municipios de San Diego la Meza Tochimiltzingo, al Este con la Ciudad de Puebla, y al

Oeste con el municipio de Tochimilco.

At lixco

Mapa de macro localización del municipio de Atlixco.

Clima

En el territorio del municipio se presenta la transición entre los climas templados del norte

del estado y los cálidos del sur; presenta dos variantes de clima: templado y cálido.

Clima templado subhúmedo con lluvias en verano. Este clima es característico de las áreas

montañosas del Noroeste, es decir de las estribaciones de la Sierra Nevada.

Clima semicálido subhúmedo con lluvias en verano. Este clima se localiza al centro y sur

ocupando la mayor parte del municipio.


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Clima templado subhúmedo con lluvias en verano. Se localiza al sureste y extremo

noroeste, en las zonas montañosas.

Orografía

El territorio del municipio se encuentra comprendido dentro de dos unidades

morfológicas divididas por la cota 2,000 que atraviesa el Noroeste; hacia el Noroeste se

encuentra el valle de Puebla, y de la cota hacia el este, el valle de Atlixco; ambos

descienden de las faldas meridionales de la Sierra Nevada.

La orografía del terreno muestra su menor altura al sur con 1,700 metros sobre el nivel del

mar; conforme se avanza el Noroeste, el nivel del terreno va ascendiendo suavemente,

por ser estribaciones del Volcán Iztaccíhuatl; así, el extremo Noroeste alcanza la cota de

2,500 metros.

El centro del municipio es un extenso valle, que lo recorre de norte a sur, y es donde se

concentran la mayor parte de las localidades y vías de comunicación.

Al Sureste, aparecen formaciones montañosas aisladas que culminan en los cerros de

Zoapiltepec y Texistle, que alcanzan un nivel superior a los 2,100 metros sobre el nivel del

mar; también existen unos cerros aislados al norte, como el Pochote, Tecuitlacuelo, loma

La Calera, el Charro.

Hidrografía

El municipio pertenece por completo a la subcuenca del Río Nexapa, afluente del Atoyac.

El municipio es regado por numerosas corrientes que provienen de las estribaciones del

Iztaccíhuatl, siendo la principal el río Nexapa, uno de los pocos de carácter permanente y

que cruza por la mitad del valle de Atlixco. Otras corrientes importantes son: el

Cuescomate que cruza la ciudad de Atlixco, el río Molino y el río Palomas. Las numerosas


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corrientes temporales, originadas por deshielos del volcán, forman una gran cantidad de

barrancas al Noroeste.

Cabe destacar que existe todo un sistema de canales de riego distribuidos por todo el

territorio, como el Sifón, la Candelaria, los Molinos, Catecuxco, Moraleda, etc. Diversos

son los recursos hidrográficos del municipio, tanto para la agricultura como para

diversión.

CARACTERÍSTICAS SOCIOECONÓMICAS

Evolución Sociodemográfica

En 1995 el municipio contó con 112,570 habitantes, representando el 2.5 % de la

población total del Estado, de los cuales 53,510 son hombres y 58,970 son mujeres. Tiene

una densidad de población de 514 habitantes por kilómetro cuadrado y una tasa de

crecimiento anual de 1.33 %; se estima que para el año 2000 la población del municipio

sea de 127,311 habitantes, con una densidad de población de 555 habitantes por

kilómetro cuadrado. Tiene una tasa de natalidad de 32.7 %; una tasa de mortalidad de 6.1

% y una tasa de mortalidad infantil de 18.4 %.

Con respecto a marginación el municipio tiene un índice de -.0948 %; esto quiere decir

que su grado de marginación baja, por lo que ocupa el 208 lugar en el contexto estatal y el

1,947avo. lugar en el contexto nacional.

Actividad económica

Agricultura

El municipio tiene una gran actividad en este sector, se cultiva alfalfa y produce una

variedad de granos como: maíz, trigo, frijol, sorgo, cebada, garbanzo, haba y cacahuate;

en cuanto a la horticultura destaca el chile verde, jitomate, lechuga, col, zanahoria,


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calabacitas, rábano y chícharo; también se encuentran condimentos como: perejil,

cilantros, epazote y diversos tipos de especies. Con relación a la fruticultura se encuentran

plantaciones de guayabas, chirimoya, anona, jicama, limón, lama, granada y durazno; de

manera especial destaca el aguacate criollo y el injertado en espléndidas variedades.

Floricultura

Es importante mencionar a la floricultura ya que el clima del municipio es ideal para el

desarrollo de una extensa variedad de flores como: gladiola, crisantemo, orquídeas,

alhelíes, rosas, nardos, bugambilias, manto y cempazúchil, principalmente. Los domingos

se pueden comprar a precios económicos en la Plaza de la cabecera municipal.

Ganadería

Sobresale la producción de ganado bovino para carne y leche y porcino; también se

cuenta con lanar, caprino, equino así como mular y asnal.

Apicultura

Esta se ha incrementado notablemente en el municipio lográndose una considerable

producción de excelente calidad para la exportación.

Industria

Fabricación de alimentos, elaboración de bebidas, industria textil, fabricación de prendas

de vestir, industrias metálicas básicas, maquinaria y equipo trabajan cuero, pieles, cartón

y vidrio, así como molienda de nixtamal, tortillerías y matanza de ganado.


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En el sector industrial se cuenta con 10 fábricas de distintas actividades como confección

de ropa, material de construcción, material eléctrico y electrónico, empacadoras, además

de 18 talleres de producción de alimentos en diferentes colonias de la ciudad y Juntas

Auxiliares, así mismo, existen 10 talleres artesanales.

Pesca

Cuenta con el Centro Piscícola de San Diego Acapulco y con los tanques de Metepec,

donde a baja escala, se encuentran criaderos de carpa.

Minería

Existen dos fondos mineros de relativa importancia, uno produce barita y otro caliza.

Turismo

Entre los principales atractivos con que cuenta el municipio destacan las arquitecturas

religiosas, como lo es el Ex-convento del Carmen del Siglo XVI. La feria regional del

aguacate. El Huey Atlixcáyotl, significa reunión de los pueblos; se celebra en el cerro de

San Miguel; el último domingo de septiembre se reúnen alrededor de Atlixco todos los

pueblos; donde realizan danzas para que llueva todo el año y a partir de este día empieza

a llover. El manantial y el balneario de Axocopan de aguas medicinales, así como los

balnearios la Curva, Agua Verde, la Planta, El Paraíso y Las Canoas. Existen las cascadas de

San Pedro y los Molinos, además cuenta con parques infantiles y lugares para día de

campo. La Feria Internacional de la Rosa (finales de octubre a principios de noviembre).


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Comercio

En la cabecera del municipio se observa un comercio muy diversificado y de gran

movimiento, no obstante la cercanía con la capital del estado; en su mayor parte la

población se surte en establecimientos comerciales como: abarrotes y misceláneas,

mercado de frutas y legumbres, almacenes de ropa, muebles para el hogar, aparatos

eléctricos, papelerías, ferreterías, agencias para automóviles, materiales para la

construcción, entre otros.

Servicios

En cuanto a los servicios se dispone de gran variedad de establecimientos que prestan una

diversidad de servicios tales como: hospedaje, restaurantes y fondas para la preparación

de alimentos, talleres de reparación de automóviles, de aparatos eléctricos, instituciones

financieras, etc.

OBJETIVOS

Describir y conjuntar los procedimientos que se llevan a cabo para la reproducción de Trichoderma.

Disponer como herramienta básica, para instruir al personal asignado al laboratorio en la reproducción del hongo Trichoderma.


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METODOLOGÍA

Para la realización de este manual se siguieron las siguientes actividades

Se hicieron visitas y recorrido a las instalaciones de la empresa, para conocer las principales arreas con las que cuenta la empresa.

En los diferentes recorridos hechos se tomaron fotografías, así como, entrevistas con los empleados que laboran en las diferentes áreas.

Durante la estancia me incorpore a las actividades cotidianas del laboratorio, realizando los procedimientos, para afirmar detalles de los mismos.

Asistí a los cursos de asesoría que la empresa contrato para la capacitación de los empleados.

Se redacto varios borradores y se sometió a revisión con el responsable técnico del laboratorio.

RESULTADOS

De la información colectada en las diferentes actividades mencionadas en la metodología, se obtiene los resultados. De las cuales se presentan de la siguiente forma: políticas y normas para el laboratorio, asepsia del laboratorio, procedimientos (aislamientos de la cepa, preparación de matrices, preparación de sustrato, esterilización, inoculación, incubación, secado y envasado y control de calidad), y la elaboración de medios de cultivo y características de las instalaciones. Y que se describen a continuación.

POLÍTICAS Y NORMAS DEL LABORATORIO

Dentro del laboratorio

No fumar, comer o beber dentro del laboratorio.

Usar una bata y mantenerla abrochada.

Guarda tus prendas de abrigo y los objetos personales en un armario y no dejar

objetos personales en la mesa de trabajo.

Mantener las puertas cerradas, para evitar el flujo de contaminantes dentro y fuera del laboratorio.


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Se restringe la entrada a personas ajenas al personal de laboratorio, en horas de trabajo.

Personal

Usar ropa cómoda y evitar prendas sueltas.

Evitar peinado suelto, no usar anillos, pulseras o accesorios en las manos.

Mantener las manos limpias y secas, evitar actividades si presenta heridas en las

manos.

Evitar visitas a otros laboratorios si no es cuestión de trabajo.

Evite usar accesorios sueltos, así como, pulseras, anillos, etc.

Seguridad

Mantén el área de trabajo limpia y ordenada

Evitar verter residuos sólidos en los fregaderos, deben emplearse recipientes para residuos que se encuentran en el laboratorio.

Contar con un botiquín y mantener al personal al tanto de su ubicación.

Usar equipo de protección (guantes, lentes, etc.) al manipular recipientes que

contengan sustancias peligrosos (agua caliente, acido, etc).

Usar los materiales de acuerdo a las instrucciones indicadas para cada equipo.


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ASEPSIA DEL LABORATORIO

La limpieza dentro del laboratorio es un requisito fundamental en para trabajar con organismos como hongos. Esta condición, puede garantizar que se realiza un trabajo confiable y seguro. También se requiere de la limpieza frecuente para garantizar el buen funcionamiento del equipo con que se cuenta, realizar esta actividad cada vez que se realice una actividad.

Algunas de las actividades que se mencionan deben realizarse periódicamente, o varias veces a la semana, según se recomiende para evitar la presencia de problemas como la contaminación.

Aseo del laboratorio

Como se ha mencionado arriba del nivel de riesgo que se tiene de contaminación en el laboratorio, por causa y tipo de organismos con las que se trabaja, importante realizar la limpieza de todas las areas todos los días tanto de de paredes, pisos, puertas, muebles, etc.

Esta actividad debe hacerse diario en el área de incubación y dos veces a la semana en el área de secado, a fin de evitar crecimientos en techos y paredes, usando la solución de hipoclorito de sodio al 0.1%. En otras áreas como la de esterilización, e incubación debe asearse diariamente.

Lavado de materiales

En el laboratorio, es fundamental lavar todo material inmediatamente después de ser usado, asegurando así, que, no se tengan crecimiento de organismos en los materiales.

Para hacer el lavado, es recomendable tallar los materiales con una fibra fina y jabón detergente. El enjuague debe hacerse con agua limpia dos veces, preferentemente el agua debe ser esterilizado.

Esterilización de materiales

La esterilización de los materiales como cristalería, y medios de cultivos, nos aseguran que estas se encuentran en asepsia y permite realizar los trabajos sin dificultades. La esterilización, debe hacerse en una autoclave preferentemente, a 15 libras de presión durante 20 minutos, como mínimo.

En el laboratorio se cuenta con una autoclave para hacer este paso. El proceso de esterilización consiste en:


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Agregar agua a la autoclave, hasta el nivel indicado.

Acomodar el material a esterilizar en la canastilla, para el caso de los tubos de ensayo deben colocarse en una gradilla, y tapar con tapones de algodón y papel aluminio, para dejar que circule el aire caliente; cuando se use matraces también debe seguirse las recomendaciones que los tubos de ensayo. Acomodar siempre los materiales, en forma que deje circular el aire caliente.

Introducir la canastilla en la autoclave y cerrar, debe apretarse bien los tornillos de forma alternada. Tener cuidado que antes de meter la canastilla se encuentre el protector de la resistencia.

Encender, y dejar abierto la válvula de liberación de presión durante 15 minutos (purga).

Cerrar la válvula de escape, y esperar a que eleve la presión a 2 atmosferas o 15 libras, y mantener a esta presión durante 20 minutos como mínimo.

Completado los 20 minutos, abrir la válvula de escape y liberar la presión lentamente.

Cuando se esterilicen líquidos, evitar llenar los frascos. El llenado máximo de estos es hasta tres cuartos, dejando un espacio para permitir una leve ebullición del liquido.

Los rayos de luz ultravioleta (UV), también es eficaz para esterilizar superficies, ya que esta luz tiene poco penetración.

Para la esterilización de materiales deben de cubrirse con papel de estraza y después con polipapel, este último puede remplazarse con papel aluminio, según la disposición.

Desinfección de ambiente

Trabajar con microorganismos, misma a la que se dedica este laboratorio es muy importante mantener la limpieza de materiales, equipo, utensilios, etc., así como, el ambiente.

En el laboratorio se cuentan con procedimiento para reducir la contaminación por microorganismos como hongos entomopatogenos, fitopatogenos, patógenos del hombre, saprofitos, etc. Que puedan interferir en la realización adecuada del trabajo. Los organismos pueden encontrarse en el aire, paredes, techos, superficies, estantes entre otros.

El alcohol al 70% es comúnmente utilizado para realizar esta actividad, ya que desnaturaliza las proteínas, disolviendo las capas lipídicas y como agente deshidratante. Esta solución se usa para desinfectar la cámara de flujo laminar, otras superficies y las


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manos antes de realizar alguna actividad, como, inoculación, evaluación u observación de cajas petri con crecimiento, o alguna actividad que represente riesgo de contaminación.

Otro de los productos usado es el hipoclorito de sodio a 0.1%, se usa para desinfectar paredes, techos, mesas, pisos, puertas y ventanas. Hacer una limpieza con esta solución en todo el cuarto de inoculación, siempre antes de realizar un trabajo en ella. Para así reducir, al mínimo el riesgo de contaminación.


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PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCION DE Trichoderma

Los pasos aquí descritos se hace referencia para la producción de 10 kilogramos del hongo Trichoderma, usando como sustrato arroz.

Pasos previos a la producción

A. AISLAMIENTO

Esta etapa consiste en salir al campo a colectar tierra o suelo infectado por el hongo. Si se

colecta en campo, debe hacerse en un lugar donde el ambiente no haya sido modificado

tanto por el hombre. También puede obtenerse de plantas o medios artificiales como

PDA, este ultimo cuando la cepa se adquiere con otro laboratorio especializado. De esta

fuente, se ocupa una muestra con un asa bacteriológica y se implanta a un medio de

cultivo, preferentemente PDA. Este paso debe hacerse, bajo estrictas normas de higiene y

asepsia, ya que es el primer paso de todo el proceso productivo.

El aislamiento puede hacerse de manera directa o dilución seriada:

Aislamiento directa.

Este método consiste en obtener el hongo directamente del cuerpo del insecto infectado

con un asa bacteriológica, pasándolo directamente a un medio de cultivo. Antes de tomar

la muestra, se debe desinfectar al insecto con una solución de hipoclorito de sodio al 5%.

Para llegar a tener un cultivo puro, es necesario hacer uno o dos reaislamientos a partir

del inoculo original.

En cada siembra de aislamientos, las cajas se colocan en una cámara germinadora o de

incubación, a una temperatura de 24-25°C, durante 4-6 días. En este tiempo debe hacerse

revisiones a cada 24 horas, y desechar las contaminantes.

Se prefiere este método ya que el personal, que se tiene en la empresa domina el método.

Haciendo así, mas rápido y efectivo el procedimiento.


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B. PREPARACIÓN DE MATRICES

Una vez que se haya obtenido el cultivo puro se procede a reproducir los matrices. Para la

obtención de matrices, se sigue los pasos que a continuación se explican:

Preparación de sustrato.

Se lava (con agua fría) y se remojan de 3 a 4 kilogramos de arroz, con agua a una

temperatura de 70°C, durante 40 minutos. En ocasiones, el remojado puede variar

en tiempo, para ello debe revisarse el arroz a que quede suave.

Poner a escurrir el arroz, de 30 a 40 minutos, revisar que el arroz este suelto y sin

escurrir.

El arroz se pone en bolsas o matraces de un litro, de aproximadamente 30 a 40

gramos. Posteriormente se engrapan o se amarran con ligas.

Se esterilizan las bolsas, durante 25 minutos, a 15 libras de presión.

Y se dejan enfriar durante 24 horas.

Inoculación.

Una vez enfriadas las bolsas se inoculan con el cultivo puro que se haya obtenido

del aislamiento.

En agua esterilizada, que contenga algún tipo de adherente, se mezcla en inoculo,

de las cajas petri o tubos de ensayo, y se agita fuertemente durante 1 minuto.

Con una jeringa se inyecta el inoculo a las bolsas o matraces, y se agita el arroz,

para distribuir muy bien el inoculo.


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Incubación.

Una vez inoculadas las bolsas se depositan en una estufa bacteriológica a una

temperatura de 25°C, durante 8 días. Revisar cada 24 horas, para evitar o detectar

posible contaminación.

Conservación.

A los 8 días, cuando se tenga un buen crecimiento, las matrices se pueden meter a

refrigeración, para prolongar su conservación.

Cuando se tiene el laboratorio en producción los pasos anteriores no se repiten a menudo, ya que las matrices pueden conservarse bajo refrigeración. De esta manera se conservan y se van utilizando una por cada vez que se inocule.

Por ello, la preparación de matrices puede hacerse cada 20 o 30 días, con el fin de renovar las matrices que a utilizar.

Pasos que se siguen para la producción comercial de Trichoderma spp.

A. PREPARACIÓN DEL SUSTRATO En esta fase consiste en acondicionar el arroz (sustrato) que es utilizado. Esta parte comprende, desde el pesado hasta el embolsado (Para la realización de esta actividad se deben seguir los siguientes pasos:

Pesar 10 Kg de arroz blanco.

Revisar y separa las impurezas que presenten gran dimensión.

Lavar el arroz con abundante agua, 3 veces preferentemente, para el lavado del arroz, puede utilizarse agua de la llave.

Remojar el arroz en agua caliente a 70°C durante 40 a 45 minutos. Este tiempo también puede ajustarse, viendo el arroz cuando adquiera una consistencia blanda, que al momento de presionar un la uña se quiebre sin presentar resistencia, ni emita algún sonido al quebrarse.

Si se recomienda aplicar un antibiótico, debe hacerse en este momento, para que este producto realice su función y también pueda ser absorbido.


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Una vez alcanzado esta consistencia, se pone a escurrir en un cedazo de plástico. Se escurre durante 30 minutos, o también se puede ajustar el tiempo checando que al momento de tomar un puño de arroz, esta ya no quede adherida a la palma de la mano.

Una vez escurrido se pasa a bolsas de 25 x35 de polipapel de alta densidad. Cada bolsa debe contener aproximadamente 150 gramos de arroz.

Las bolsas se cierran, haciendo un doblado triple formando un triangulo y al final se engrapa. Una vez engrapado se revisa que las bolsas no contengan demasiado aire.

Anotar siempre en la hoja de registro los datos de: tiempo de remojado, tiempo de escurrido, temperatura del agua que se uso para remojar, si se le agregó algún antibiótico o algún producto

B. ESTERILIZACIÓN

Una vez que las bolsas estén cerradas y engrapadas, se procede a acomodar en la canastilla de la autoclave. Para ello se deben enrrollar las bolsas para que queden en forma de taco alargado y que de pauta de acomodo.

Las bolsas deben acomodarse entrelazadas, dando campo a que pueda circular libremente el calor dentro de la autoclave, y que alcance el calor a todas las bolsas.

Meter la canastilla a la autoclave y cerrar la misma, posteriormente esperar a que se purgue durante 15 minutos.

Una vez purgada la autoclave se cierra la válvula de escape y se espera a que eleve la presión a 15 lbs.pul-2, y mantener arriba de este nivel durante 20 minutos.

Pasados los 20 minutos, se abre la válvula de presión al mínimo posible, para empezar a liberar la presión lentamente y evitar la ruptura de las bolsas.

Una vez liberada la presión se abre la autoclave y se traslada el arroz al cuarto de inoculación.

Al sacar las bolsas la canastilla, se le aplica cierta presión con la mano protegido de un guante de gamuza, para romper los bloques formados por la presión durante la esterilización.

Las bolsas preparadas y esterilizadas se dejan enfriar durante 24 horas, a fin de evitar la muerte del inoculo.


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C. INOCULACIÓN

Después del enfriado se prepara el cuarto de inoculación. Es importante limpiar toda esta área con una disolución de 0.1% de hipoclorito de sodio, para desinfectar la cámara de flujo laminar.

Posteriormente se prepara el inoculo: en 500 ml agua mas 0.5 ml de INEX-A esterilizada se agrega 10 cucharadas de matriz (arroz con crecimiento de Trichoderma) o bien el contenido de 2 tubos de ensayo.

Se mezcla muy bien, hasta que la solución tome un color verde intenso o se deprendan las esporas del arroz.

Una vez hecha la solución se acercan las bolsas y con un marcador se les hace una marca.

Con la ayuda de una jeringa automática (de preferencia) se introduce el inoculo a la bolsa, con una dosis de 1 a 10 ml dependiendo de la concentración de la solución.

Una vez introducida el inoculo se sella la bolsa con cinta masking.

En la cinta que se ocupo para sellar el orificio de inoculación se escribe la fecha de inoculación.

Después de inocular, se le da una movimiento al arroz con el fin de deshacer los bloques de arroz que se hayan formado durante la esterilización y esparcir el inoculo en el sustrato.

D. INCUBACION

Una vez inoculadas y dada el primer movimiento, las bolsas se trasladan al cuarto de inoculación.

las bolsas se colocan en los estantes de manera ordenada, sin que se encimen y separadas entre ellas de entre 1 y 2 centímetros.

Una vez acomodadas se dejan en plena oscuridad y sin perturbación, aproximadamente 72 a 80 horas.

Después del reposo se le da un leve movimiento. Este movimiento también se determina si se hace o no, de acuerdo a la formación de micelio entre los granos de arroz. El movimiento se realiza cuando, dentro de la bolsa se forma un cuerpo compacto y gran crecimiento de micelio.


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Después de este tiempo se debe poner luz (preferentemente azul), y se deja que continúe el crecimiento del hongo.

El segundo movimiento, que se da en la etapa de incubación es a los 10 a 13 días, después de inoculado. En este tiempo, puede hacerse un orificio pequeño a la bolsa, a fin de dejar que se intercambie el aire dentro de la bolsa. El movimiento que se le dará debe ser muy leve, cuidando de no romper totalmente los cuerpos que ha formado el crecimiento del micelio. El objetivo de este movimiento es dejar que circule el aire.

Posterior a este movimiento, se debe mantener en observación a todo el lote, con el fin de saber el momento exacto en que debe ser puesto a secar.

Evitar que las bolsas, que ya tuvieron crecimiento y esporularon, vuelva a tener crecimiento de micelio, ya que esta no volverá a forma esporas.

E. SECADO Y COSECHA

Este proceso se realiza cuando la bolsa con crecimiento tomado un color verde uniforme, color característico de la cepa. En caso de que haya un crecimiento deficiente, la bolsa debe ser puesto a secar, entre los 15 y 18 días después de ser inoculado, bajo estas condiciones no se recomienda dejar más tiempo ya que no habrá más crecimiento y también se perderá lo poco que ha esporulado.

El secado debe hacerse en un lugar donde circule aire fresco y seco, evitar que la temperatura se eleve a más de 28°C, asi como, la exposición directa del sol, durante el secado.

Se debe levantar cuando el arroz quede suelo y no de muestra de contener humedad mayor de 8%.

Cuando esto suceda, se debe levantar y embolsar. También se debe tomar una muestra, etiquetar ambas contenedores, con la fecha de cosecha y el lote a que pertenece.

El producto obtenido o cosechado debe mantenerse en refrigeración, para mantener la calidad y asegurar la viabilidad de las esporas.


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F. CONTROL DE CALIDAD

Todo producto obtenido dentro del laboratorio se debe muestrear al momento de ser cosechado, así como, de ser observado durante su producción, anotar que si se cumplieron las recomendaciones y si se siguió el procedimiento adecuadamente.

De la muestra obtenida se debe a proceder hacer las siguientes pruebas.

a) Conteo de esporas.

Para el conteo de esporas se prepara un dilución, a razón de 5 gramos de arroz con Trichoderma en 500 ml de agua, a esta mezcla se le agrega 0.5 de adherente (INEX-A), para facilitar el desprendimiento de las esporas de las superficie del arroz.

La esta mezcla se agitar con fuerza durante 5 minutos.

De la mezcla se toma un ml con un micro tubo y se coloca en la cámara Neubauer, y se procede a contar las esporas en el microscopio.

Se deben hacer conteo de 5 secciones por lo menos, y luego calcular el promedio.

Para obtener la concentración se aplica la siguiente fórmula:

퐸/푔푟 = (⊠× 10 000 × 25)퐷푀

E/gr. = numero de esporas que se tienen en un gramo de producto. ⊠ = promedio de esporas por sección del conteo. 10 000 = constante la formula. 25 = numero de secciones de las cámara neubauer D = cantidad de agua ocupada. M = gramos de arroz con crecimiento de Trichoderma, usados para la

dilución.

Para que un lote pueda ser envasado debe tener una concentración de esporas a 1x1011 esporas por kilogramo de arroz. Considerando que las mismas tengan una viabilidad del 100%. Por lo mismo debe asegurarse qué, el numero de esporas contenidas en el envase sea mayor a 1x1011. De la forma anterior sea crea un margen de seguridad.

b) Prueba de viabilidad de las esporas.

De la misma muestra obtenida para el conteo de esporas se toma una parte (3 gramos) y se diluye en 500 ml. De agua con 2 gotas de adherente (INEX-A).


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Luego en la cámara de flujo laminar se siembra un mililitro, en medio Agua-Dextrosa-Agar, en cajas petri, con una “L” esterilizado, de cristal.

Una vez sembradas se pone en incubación en estufa bacteriológica a una temperatura de 25°C, durante 14 a 15 horas.

Trascurrido este tiempo se procede al conteo de las esporas que han germinado. Con la ayuda del microscopio.

En el conteo, se considera una espora germinado aquella que presente el tubo germinativo de buen tamaño o por lo menos mayor al tamaño de la espora.

Debe hacerse por lo menos 10 a 12 muestreos en cada caja petri, y sembrar dos cajas petri de cada lote cosechado, o un total de 250 conidios, germinadas y no germinadas.

Las esporas no germinadas, también se cuentan y posteriormente se saca una relación de las esporas germinadas y las no germinadas.

Para que un lote se considere de buena calidad debe tener una viabilidad superior a 80%. Este producto puede procederse a envasar.

Para que pueda ser envasado debe contener más o superior a 1x1012 esporas en cada kilogramo. No estar contaminado, con otros organismos patógenos. Contener humedad del 8% o menos.

c) Supervisión del proceso

En producción de organismos como agentes de biocontrol requiere de un adecuado control de las condiciones químicas y físicas, que aseguren su máxima eficacia en el campo. Los cuales son:


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G. ENVASADO Y ETIQUETADO

A esta etapa se encuentra solamente el producto que haya sido autorizado por control de calidad, es decir, que se haya producido de acuerdo a las recomendaciones y tener el nivel de viabilidad requerida, así como, la concentración de esporas por gramo.

Pesar 1000 gramos de arroz con Trichoderma.

Ponerlo en una bolsa metalizada, de aluminio preferentemente.

Retirar el exceso contenido de aire de la bolsa.

Sellar el recipiente con calor. Revisar que el cerrado sea uniforme y correcta.

Pegar la etiqueta en el sobre, estableciendo en ella: o Lote y fecha de caducidad. o Concentración de esporas y porcentaje de viabilidad. o Modo de uso: cultivo, material de aplicación, equipo de protección

necesaria. o Requerimiento de almacenaje y transporte, así como, manipulación. o Información de la empresa y forma de contactar.

DIAGRAMA GENERAL PROCEDIMIENTOS


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MEDIOS DE CULTIVO

El medio de cultivo es una sustancia o solución que permite el crecimiento de microorganismos, mientras que el cultivo es el crecimiento del organismo. Estas deben contener los nutrientes que permitan el libre crecimiento, y aseguren su desarrollo y reproducción de los hongos. Se recomienda que sean ligeramente ácido (7-6.8), para facilitar el crecimiento e inhibir el crecimiento de otros organismos (bacterias). Se le puede agregar una solución antibacteriana, para evitar contaminación de las muestras o crecimientos.

Para evitar contaminaciones y operar con seguridad, los medios de cultivo deben de manipularse en la campana de flujo laminar. A continuación se menciona el procedimiento general de elaboración.

Procedimiento de elaboración

En el laboratorio se elabora medios de cultivo con diferentes componentes según el objetivo de uso, o tipo de crecimiento que se necesita observar o tener. De los medios más usados son: PDA, Agar-agua y Dextrosa-agar.

El procedimiento de elaboración es similar para ello se explicara el procedimiento general y al final se aclararan los diferencias que puedan existir.

En un matraz de un litro se agregan los diferentes componentes del medio de cultivo, de acuerdo a la cantidad que se requiera preparar.

Una vez puesto los componentes, se agrega agua. La cantidad requerida de acuerdo a tipo de medio y la cantidad a elaborar.

Mover la mezcla, hasta que se disuelvan los componentes.

Poner a fuego lento la mezcla, hasta que tome un color claro y uniforme. Mover constantemente.

Una vez que haya tomado una coloración uniforme. Esperar a que a que tenga tres hervores (espuma).

Cuando ya no se presente mas espuma, se debe retirar del fuego y preparar para que sea esterilizado.

Todo medio debe ser esterilizado 20 minutos, a 15 libras de presión, y 110°C.


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Preparación del medio para su uso.

Cuando se utilice cristalería como contenedor (tunos de ensaye, cajas petri, matraz, fresco, etc.), se debe de vaciar el medio en estos contenedores antes de esterilizar. Con el fin de esterilizar todo al mismo tiempo.

Cuando se utilice plástico como contenedor y otro material que no pueda ser esterilizado en autoclave, entonces el vaciado se hace después de esterilizar el medio.

Medio Agar-Agua

Este medio solo contiene Agar en una concentración de 10 g de agar para un litro de medio. El contenido de agar puede variar según los requerimientos.

Es un medio pobre en la que el micelio que crece muy dispersa. Se usa para activar cepas, o realizar un aislamiento de punta de hifa.

Medio PDA

Este medio de cultivo contiene Agar 15 g, Dextrosa 20 g, Neopeptona 10 g, para un litro.

La diferencia de este medio con los demás es que el agua que se le va a agregar se prepara de la siguiente forma. En un litro de agua se agrega 100 gramos de papa perfectamente picada (0.5 cm), y luego se pone a baño maría a una temperatura de 60 a 70°C, durante 30 minutos. Posteriormente se filtra y se le agrega a medio.

Es un medio que sirve para aislar todo tipo de hongos parásitos de insectos, plantas y saprofitos, presenta buen crecimiento y esporulación.

De este medio solo excluyendo el agar se puede obtener el medio PD, que es usado frecuentemente para la preparación de inoculo en forma masiva.

Medio Dextrosa-Agar

Este medio los ingredientes van a una concentración de 15 g de Agar y 10 g de Dextrosa, en 1000 ml de agua.


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Sabouraud

Este medio contiene 20g de dextrosa, 10g peptona, 18g de agar y 1000 mL de agua.

Es un medio de cultivo para aislar hongos de animales, aunque también se usa para otros hongos. Los hongos crecen bien y espurulan, pero no es útil para estudiar la esporulación.


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INSTALACIONES

El laboratorio deberá estar seccionado y tener puertas, para el acceso a las diferentes áreas. Las áreas con las que debe contar un laboratorio son:

Área de esterilización: donde se deberá ubicar la autoclave, material de esterilización y preparación del sustrato.

Área de inoculación: deberá de ocuparse para inocular, y los que equipos que se tienen son: campana de flujo laminar, una ventana de flujo laminar, estufa bacteriológica, y mesa de trabajo.

Área de incubación: se debe contar con estantes, termómetro y medidor de humedad. Área donde se tiene el producto en crecimiento.

Área de secado: debe contar con estantes, una mesa de trabajo, y charolas de secado.

Área de envasado: se deba contar con pesas, estantes, mesa de trabajo, y el equipo necesario para envasar el producto.

Área de control de calidad: se debe contar con estantes, mesa de trabajo, es donde se debe de colocar el microscopio, y donde se deben tener las muestras de trabajo del producto obtenido.

Área de lavado: se debe de contar con un lavadero, y un área para secar el material que se lave.

Se recomienda que las mesas, bancos, estantes, puertas, paredes, techos sean pintadas de color blanco. Con el fin de detectar posible crecimiento sobre la superficie de estas. Además de contar con equipos que faciliten su limpieza diaria.

RECOMENDACIONES

Del estudio realizado se detectan varios problemas en la operación, que pueden desprenderse por desconocimiento de los trabajadores, aunado también a la falta de equipos para dichos procesos. Para ello se hacen las siguientes recomendaciones:

Que el personal que se reclute para laborar dentro del laboratorio tenga una preparación de nivel superior y que tenga conocimiento en el área de biología, química y agronomía.


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Mantener bajo refrigeración el producto a temperatura de 4 a 7°C, y una humedad relativa de 5% dentro del almacén (refrigerador), para mantener la calidad requerida en el mercado.

Definir las características del envase para el producto final, tomando en cuenta que cumpla con las recomendaciones de salubridad y sanidad vegetal, a fin de evitar problemas de carácter legal.

Que los socios que integran a la organización se integren y conozcan los procesos que se lleva cabo en el laboratorio, para que entiendan la importancia de seguir a pie las recomendaciones de las autoridades de sanidad, en cuestionas de empaque y estándares de calidad.

Promover el producto para canalizarlo inmediatamente después de su cosecha, con el fin acortar el tiempo de almacenado, evitando así, que el producto mengua su calidad (porcentaje de viabilidad).

CONCLUSIONES

En el trabajo se definen los procedimientos para la reproducción del hongo Trichoderma spp, tomando en cuenta el equipamiento del laboratorio y el personal que labora en la misma. De la misma manera el manual se presenta como una herramienta con la cual puede la empresa instruir al personal que labora en el laboratorio, facilitando su integración.

Tomar en cuanta de las recomendaciones realizadas, y seguir los procedimientos que se describen en este manual, elevara y garantizara que el producto que se ofrezca a los productores sea de calidad.


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ANEXOS: I fotos

Remojado de sustrato (arroz) Sellado de bolsas para esterilizar

Autoclave esterilizando sustrato Preparación del inoculo

Inoculacion de arroz Cuarto de incubación

Evaluación de crecimiento y movimiento de

bolsas Secado de arroz con crecimiento


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Pasado y envasado del producto Producto final

Microscopio con material para pruebas Conteo de pruebes de viabilidad

Conteo de esporas en camara Neubauer Crecimiento en activacion de cepa

Elaboración de medio de cultivo Vaciado de medio de cultivo en cajas


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Cajas petri con medio de cultivo para

pruebas de viabilidad Tubos de ensayo para siembra de matrices

Inoculación de tubos de ensayo Incubación de matrices en tubos de ensayo

Matrices en tubos de ensayo Campana de flujo laminar con luz UV

Documents

2 manual tecnico-trichoderma