UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

CARRERA DE MEDICINA

Asignatura: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍAPRACTICA 2: Técnica de Tinciones de la pared Bacteriana: Gram y Ziehl-Neelsen marzo - agosto/2015

UNIDAD DE COMPETENCIA

ELEMENTOS DE COMPETEMCIA (contenido)

TRABAJO AUTONOMOTECNICAS /INSTRUMENTOS

DE EVALUACIONDominio TaxonomíaAvance Conocer motivos del extendidoProceso frotisInicio fundamentoDominio entender por que la coloracionAvance Saber por la coloracionProceso real i zar la coloracionInicio describi r los pasos de la coloracionDominio entender por que la coloracionAvance Saber por la coloracionProceso real i zar la coloracionInicio describi r los pasos de la coloracionDominio crear relaciones estructura lesAvance entender las relaciones estructura lesProceso comocer los compomentes Inicio describi r las estructuras

Coloracion de gram

Colracion de Ziehl - Neelsen

Pared bacteriana

Practica Nº 3 Técnica de Tinciones

Bacterianas

CRITERIOS DE EVALUACION

Teorico-practico

Teorico-practico

Teorico-practico

Teorico-practico

Investigar el motivo por que el frotis para la coloración debe medir 1x2 cmTraer formatos de reportes de laboratorio de coloracion gramTraer informes de reportes de laboratorio de coloracion Ziehl - Traer maqueta de la pared bacteriana de gram pos itivos , negativos y

Fundamento, taxonomía y extendido

RESULTADO DE APRENDIZAJE: interpretar los resultados de las coloraciones de la pared bacterianaOBJETIVO:

Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram y Bacilos Alcohol-Acido Resistentes Reconocer los microorganismos Bacilo alcohol-acido resistentes y Gram positivos y negativos, al

igual de la aplicabilidad clínica de la tinción.

1.-IntroducciónTaxonomíaTodos los organismos tienen un nombre que consta de dos partes: el género seguido por la especie (es decir, el Homo sapiens). (La forma correcta de escribir es la primera letra del género va en mayúsculas, la especie va en minúsculas y en cursiva). Las bacterias se han agrupado y denominado principalmente en su morfológicas y bioquímicas / metabólicas diferencias. Sin embargo, las bacterias son ahora también clasificadas de acuerdo a su inmunología y las características genéticas. Las tinciones las cuales permiten al médico - clínico determinar rápidamente el organismo que está causando la infección de un paciente.

PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO PARA LA MICROSCOPIA OPTICAEn la preparación de los extendidos se utilizan en forma directa las muestras del paciente o se aplican los microorganismos provenientes de cultivos.

Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de líquido aspirado (Fig. 1). El material que se va a teñir se coloca en forma de una gota (si la muestra es líquida), o se rota de adentro a fuera (si está en un hisopo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco, en la parte media con un largo aproximado de 2 cm por 1 cm de ancho.

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Se deja secar y se fija al portaobjeto mediante:1).- una platina caliente (a 60⁰C) durante por lo menos 10 minutos 2).- cubriéndolo con metanol al 95% durante 1 minuto o3).- flameando la placa portaobjetos por el mechero en tres ocasiones

Para examinar los microorganismos que crecen en líquidos corporales se aplica una gota de la muestra aspirada sobre el portaobjetos, se seca y se fija. Por último, el método de tinción que se debe utilizar está determinado por el tipo de microorganismo buscado.

COLORACION GRAMDado que las bacterias no tienen color y por lo general invisible para la microscopía de luz, diferentes técnicas de tinción se han desarrollado para visualizarlas. La más útil es la tinción de Gram, que separa los organismos en 2 grandes grupos: gram-positivos y gram-negativas. Esta tinción también permite que el clínico pueda determinar si el organismo tiene las características:Forma: redondo o en forma de varilla, etc.Agrupación: racimos, cadenas, etc.Reacción de gram: positiva o negativa,Cantidad: 1, 2, 3, etc. x campo o +, ++, +++, ++++Elementos acompañantes: PMN, eritrocitos, detritus, células, etc.

La tinción de gram es la técnica principal utilizada para el examen microscópico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clínica pueden detectarse con este método. Las únicas excepciones son:

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A

B

Fig 1.- frotis obtenidos por rotación de un hisopo (A) y deposito con pipeta (B) de la muestra del paciente sobre un portaobjetos

de vidrio.

Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las células huésped (p. ej., chlamydias).

Los que carecen de pared celular (p. eje., mycoplasmas y ureoplasmas). Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por el microscopio óptico (p. ej.,

espiroquetas). Los que tienen una diferente composición en su pared y no captan los colorantes (p. ej.,

mycobacterias).

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.

Si bien la evaluación de la tinción de Gram del frotis directo se utiliza de rutina como una ayuda en el diagnóstico de las infecciones bacterianas, es posible que se detecten y no deben ignorarse hallazgos inesperados pero importantes de otras etiologías infecciosas. Por ejemplo, las células y los elementos

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Fig. 2.- Estructura de paredes bacterianas GRAM(+) y

micóticos por lo general se tiñen como gram positivos pero pueden captar el cristal violeta de manera deficiente y aparecer como gram variables (p. ej., rosa y violeta) o gram negativos. Dado que con la tinción de Gram pueden detectarse otros agentes además de los hongos:

Como células inflamatorias (PMN o mononucleares) Elementos sanguíneos (eritrocitos) Restos celulares o mucosos (detritus celulares) Células epiteliales

CAUSAS QUE ALTEREN LA COLORACIÓN DE GRAM

I: Edad de la bacteria. II: Errores del operador. III: Uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas), es por esta situación que junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias gram positivas (ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. Coli).

COLORACION DE ZIEHL-NEELSENLa tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial que se basa en que las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-acido, después de la tinción con colorantes básicos. Las mycobacterias absorben los colorantes solo muy lentamente debido a la elevada proporción de ceras y lípidos en la pared celular. Para acelerar la absorción del colorante fuscina y así la formación del complejo micolatofusina en la pared celular, se calienta la solución de fuscina fenicada aplicada sobre el preparado normalmente hasta la formación de vapores. Una vez que las mycobacterias han absorbido el colorante, difícilmente lo ceden a pesar del tratamiento con solución decolorante alcohol-ácido clorhídrico. Por esto se denominan bacilos alcohol ácido resistente o BAAR y aparecen en el preparado microscópico teñidas de rojo, mientras que todos los microorganismos no resistentes a los ácidos se tiñen de acuerdo con la contratinción.1

Las mycobacterias no constituyen el único grupo que tienen propiedades alcohol-ácido resistentes. Las especies de Nocardia y Rhodococcus poseen una alcohol-acido resistencia parcial así como Legionella micdadei causante de neumonía. Los quistes de los géneros Cryptosporidium e Isospora tienen resistencia definida a las tinciones con ácido alcohol

LA MUESTRA.La muestra más examinada es el esputo. Sin embargo, dado que el mycobacterium puede afectar a cualquier órgano, con menor frecuencia puede requerirse la investigación de muestras muy variadas como: orina,

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líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias de piel, hueso, aspirado gástrico, lavado bronquial.

2. MATERIALES REQUERIDOS Portaobjetos Cubreobjetos Asas de inoculación Mechero Bunsen Pipetas Hisopos Colorantes para gram y ZIEHL-NEELSEN Solución salina aplicadores soporte para los extendidos lápiz para marcar láminas portaobjetos

3. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

PROCEDIMIENTO:El procedimiento clásico de la tinción de Gram consiste en fijar el material orgánico a la superficie del portaobjetos del microscopio ya descrito.REACTIVOS:

cristal violeta o violeta de genciana lugol o disolución de Lugol Alcohol cetona Safranina

Primer paso en la tinción de Gram es la aplicación del colorante principal cristal violeta (metil rosanilina o violeta de genciana) por un minuto. Luego se lava con agua corriente abundante, aplica un mordiente, el yodo de Gram (lugol), para que el colorante alcalino se una a la pared celular a través de enlaces químicos por un minuto y se lava. El tercer paso la decoloración distingue las bacterias gram positivas de las gram negativas y se realiza con alcohol acetona por 30 segundos y se lava. Después de la decoloración los microorganismos aparecen como gram positivos retienen el cristal violeta y los gramnegativos lo pierden. El último paso agregar colorante de contraste safranina (Contra tinción) teñirá de color rosa o rojo las bacterias gramnegativas claras por un minuto y se lava. Después de todo esto se deja secar.

OBSERVACION DE LA TINCION DE GRAM.Una vez teñido el frotis se observa con el objetivo de inmersión (1.000x). Cuando el material orgánico se tiñe con Gram (p. ej., frotis directo) el portaobjetos se evalúa en busca de la presencia de células bacterianas así como de las reacciones Gram, (Fig. 3) En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:

Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.

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TÉCNICA COLORACIÓN ZIEHL-NEELSEN• Ubicar al lado de la mesa el recipiente para descartar el material con tapa• Para cada muestra, numerar una lámina portaobjetos, • Tomar la muestra y la lámina correspondiente y colocarlas detrás del mechero de manera que la llama quede entre el operador y el frasco. Esta posición protegerá al laboratorista de posibles formaciones de aerosoles al abrir el frasco.• Destapar con cuidado el envase.• Partir un aplicador en dos, tratando de que las puntas queden ásperas.• Tomar una parte del aplicador seleccionar la partícula más densa o purulenta de la muestra de esputo. •Colocar la(s) partícula(s) seleccionada(s) sobre el portaobjetos y extenderla(s) de acuerdo a procedimiento de extensión del frotis descrito anteriormente.REACTIVOS:

Fucsina fenicada básica Alcohol acido 3,0 % Azul de metileno

COLORACIÓN EN CALIENTE PROCEDIMIENTO:1.- Se fija la muestra al portaobjetos con calor o alcohol.2.- Se cubre el frotis con papel filtro 3.- Colocamos el reactivo de colorante de carbolfuscina cubriendo todo la placa4.- Se calienta con suavidad hasta la aparición de vapores mediante flameo por debajo de la rejilla de sostén con un mechero de gas, si el colorante se evapora demasiado se coloca más, se deja actuar el colorante sobre el portaobjetos durante 5 minutos.5.- Se retira el papel filtro, inclina el frotis para eliminar el exceso de colorante y se lava con agua destilada con un chorro constante y no fuerte.6.- Se decoloran con ácido alcohol al 3,0 % durante 3 minutos. Se lavan los frotis con agua destilada y se los inclina para escurrir el resto de agua.7.- Se cubren los frotis con reactivo de azul de metileno durante 1 minuto.8.- Se lavan con agua destilada y se dejan secar al aire.9.- Se examinan con aceite de inmersión en búsqueda de BAAR5.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LAS MYCOBACTERIASLos bacilos acidorresistentes tienen entre 1 y l0 μm de largo. Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul. A veces se observan con gránulos o cuentas intensamente coloreados en el interior, pueden aparecer como bastones muy largos o como bacilococos. Otros microorganismos pueden presentar distintos grados de ácido resistencia, como Rhodococous spp., Nocardía spp., Legionella spp. y los quistes de Críptosporidio e Isospora spp. Se observan como cocos,

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bacterias con formas variadas (pleomórficas), filamentos que a veces están cortados, o como esferas de gran tamaño si se las compara con las bacterias.

RESULTADOS: Positiva bacilos rojos delgados en rosario BAARNegativo ausencia de bacilos rojos delgados en rosario en 100 campos no BAAR

Un hallazgo positivo significa “presencia de bacilos alcohol acido resistentes” y un hallazgo negativo significa “ausencia de bacilos alcohol acido resistentes”.

AUTOEVALUACION E INVESTIGACION1. Cite 2 ejemplos de microorganismos gram positivos y gram negativos.2. Enumere 3 diferencias entre gram positivos y gram negativos3. Investigar que debe constar en un reporte (resultado) de coloración de Gram?4. Indicaciones para solicitar una coloración de gram y ZIEHL-NEELSEN5. Cuando se define que una muestra de esputo es adecuada?.6. En una coloración de gram se reporta detritus celulares cual es la importancia?7. En el reporte de gram se indica la presencia de bacterias por cruces (+) o número por campo (1-2xc)

que es lo correcto?

BIBLIOGRAFÍA1. Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana,2. Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual moderno, México, México

2002.3. Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial Panamericana, Buenos Aires –

Argentina, 2 004.

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Universidad Central del EcuadorFacultad de Ciencias Médicas

Carrera de Medicina

PRE-REQUISITOS DE MICROBIOLOGIA

NOMBRE: DOCENTE: FECHA: AYUDANTE:PARALELO: GRUPO:

PREGUNTA 1.

PREGUNTA 2

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Universidad Central del EcuadorFacultad de Ciencias Médicas

Carrera de medicina

POST-REQUISITOS DE MICROBIOLOGIA

NOMBRE: DOCENTE: FECHA: AYUDANTE:PARALELO: GRUPO:

PREGUNTA 1.

PREGUNTA 2

PREGUNTA 3

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