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CATEDRA DE MICROBIOLOGIA VETERINARIA AÑO 2014 COLORANTES Y TINCION DE LOS MICROORGANISMOS MV. Fernando A. Hilal

Coloraciones y Tinciones

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Coloraciones y Tinciones

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  • CATEDRA DE MICROBIOLOGIA VETERINARIA AO 2014

    COLORANTES Y TINCION DE LOS MICROORGANISMOS

    MV. Fernando A. Hilal

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    Introduccin

    La morfologa bacteriana puede examinarse de dos maneras:

    1. Preparado fresco forma y movilidad

    2. Preparado coloreado forma y estructuras

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    Colorantes Son sustancias qumicas que poseen afinidad por

    algn componente celular, dando su color a la clula.

    Se clasifican en*: 1. Bsicos o catinicos 2. cidos o aninicos 3. Colorantes liposolubles * Vullo D, Wachsman M, Alche L. Microbiologa en prctica. Manual de tcnicas de laboratorio para la

    enseanza de microbiologa bsica aplicada. Ed. Atlante.

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    Colorantes

    Origen y composicin

    Pueden ser naturales o artificiales /sintticos.

    La estructura qumica bsica es el anillo benceno asociado con radicales cromforos.

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    Colorantes

    Fuente: Elmer Koneman, Stephen Allen. Diagnstico microbiolgico. Ed. Mdica Panamericana.

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    Coloraciones o tinciones

    Procedimiento por el cual se logra:

    1. Resaltar los microorganismos en el fondo del preparado

    2. Diferenciarlos entre s y de los elementos y detritos del fondo.

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    Coloraciones o tinciones

    Clasificacin:

    1. Positivas

    Simples : azul de metileno

    Diferenciales: Tincin de Gram

    Estructurales: Tincin de Schaeffer y Fulton

    2. Negativas

    Se colorea el fondo pero no la clula: nigrosina

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    Preparacin del extendido

    Muestra proveniente de la clnica

    Sangre, orina, lquidos de puncin, hisopados de conducto auditivo, membranas fetales, abortos y natimortos, rganos, etc.

    Muestra de alimentos

    A partir de cultivos.

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    Preparacin del extendido

    Objetivo:

    Lograr en un espacio de 1 cm2 una monocapa de clulas aptas para ser teidas

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    Preparacin del extendido

    Hisopados

    Muestras lquidas

    Fuente: Gua de prcticas de microbiologa e inmunologa. Departamento de Microbiologa II. Universidad complutense de Madrid. Ao 2011.

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    Secado y fijacin

    Secado: al aire a temperatura ambiente o bien sobre la llama a 30 cm de la misma.

    Fijacin:

    Calor: flameado o en platina a 60C durante 10

    Qumico: metanol 95

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    Tincin de Gram

    Principal tcnica usada para el examen microscpico.

    Pocas bacterias escapan a la tcnica (clamidias, espiroquetas por ejemplo)

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    Tincin de Gram

    Fundamento: las diferencias en la composicin de las paredes de las bacterias, las cuales segn el colorante que retengan y se observe, se denomina como GRAM + o GRAM -

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    Tincin de Gram

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    Tincin de Gram 1. Fijacin. 2. Cristal violeta 1 a 2 minutos. 3. Lavar con agua. 4. Lugol 1 minuto. 5. Volcar el excedente. 6. Decolorar con alcohol acetona

    10 a 20 segundos. 7. Lavar con agua. 8. Safranina 1 minuto. 9. Volcar el excedente y lavar con

    agua. 10. Dejar secar y observar con

    objetivo de inmersin.

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    Tincin de Gram

    Vidaver, A.K. and P.A. Lambrecht. Bacteria as plant pathogens. Departament of plant pathology. Nebraska University, NE, USA.

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    Tincin de Gram

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    Tinciones especiales

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    Tincin de Ziehl Neelsen (Tincin para AAR en caliente)

    Tincin para alcohol acido resistencia.

    Fundamento: Las paredes celulares contienen cidos grasos de cadena larga que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol cido, despus de la tincin con colorantes bsicos (carbolfucsina)

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    Tincin de Ziehl - Neelsen 1. Fijacin. 2. Cubrir con carbolfucsina y calentar

    hasta vapores blancos (tres veces). No debe llegar a ebullicin.

    3. Dejar el colorante cinco minutos. 4. Lavar con agua destilada. 5. Decolorar con el alcohol cido

    durante un minuto, realizar nuevamente en caso necesario.

    6. Lavar con agua destilada. 7. Cubrir con azul de metileno un

    minuto. 8. Lavar con agua destilada, secar y

    observar con objetivo de inmersin.

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    Tincin de Kinyoun (Tincin para AAR en fro)

    Fundamento: Similar a la Tincin de Ziehl Neelsen

    La carbolfucsina al contener mayor cantidad de fucsina y fenol, no es necesario calentar.

    El procedimiento de tincin es el mismo (exceptuando el calentamiento)

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    Mycobacterium avium

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    Tincin Ziehl Neelsen modificada

    Fundamento: similar a la Tincin de Ziehl Neelsen, pero el lavado alcohol acido es mas suave.

    Indicada para Nocardia.

    Solucin alcohol cido con 0,5 a 1 % de H2SO4.

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    Nocardia asteroides

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    Tincin de endoesporas

    Mtodo Schaeffer Fulton

    Fundamento: El colorante verde de malaquita es un colorante neutro que no posee afinidad por ninguna estructura en particular, pero el calor permite que este ingrese a la espora resistiendo los lavados ulteriores. El colorante de contraste tie el resto de la clula.

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    Tincin de endoesporas 1. Preparar los extendidos. (Bacillus,

    Clostridium) 2. Cubrir con verde malaquita y calentar a la

    llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 minutos.

    3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

    4. Cubrir con safranina 1 minuto. 5. Lavar con abundante agua el exceso de

    colorante. 6. Secar la preparacin. 7. Observar la preparacin al microscopio la

    disposicin y la morfologa de la esporas.

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    Tincin de endoesporas

    Localizacin y morfologa de las esporas de Bacillus

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    Bacillus subtilis

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    Tincin negativa

    Indicada para evidenciar la cpsula.

    Fundamento: Se realiza con colorantes aninicos que no penetran en la clula, pero s tien el fondo. Proporciona visin de la forma y tamao celular, y evidencia la cpsula.

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    Tincin negativa Puede realizarse con Nigrosina o con tinta china. Procedimiento:

    1. Colocar una gota de nigrosina en un extremo del portaobjetos.

    2. Mezclar la muestras (Bacillus o E. coli) con el ansa de siembra sobre la gota de colorante.

    3. Realizar un frotis. 4. Secar al aire. 5. Observar al microscopio con objetivo 40X y luego 100x

    con aceite de inmersin.

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    Tincin Negativa

    Tincin negativa de Staphylococcus aureus con nigrosina.

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    Coloracin de flagelos

    Mtodo de Leifson

    Fundamento: Tras la aplicacin de un mordiente (c. tnico) al extendido se incrementa el grosor de los flagelos y fimbrias que sern teidos por un colorante bsico.

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    Coloracin de Flagelos

    Soluciones:

    1. Fucsina bsica (sol. Alcohlica al 1,2 %)

    2. cido tnico (sol acuosa al 3 %)

    3. Cloruro de sodio (sol. Acuosa al 15%)

    La solucin final se consigue combinando parte iguales de la tres soluciones anteriores

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    Tincin de Flagelos

    Procedimiento: 1. Lavar, desengrasar y flamear perfectamente un

    portaobjeto. 2. Colocar 2 gotas del suspendido bacteriano 3. Dejar secar al aire 4. Colocar solucin final de colorante entre 5 y 15

    minutos (hasta formacin de precipitado) 5. Lavar con agua, dejar secar y observar con objetivo de

    inmersin.

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    Tincin de Flagelos

    Vibrio cholerae Proteus sp.

    Mtodo de Leifson Mtodo de Ryu

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    Tincin de espiroquetas

    Impregnacin argntica por mtodo de Fontana Tribondeau.

    Fundamento: se utiliza acido tnico como mordiente y luego se realiza la impregnacin argntica con AgNO3 amoniacal (solucin de Fontana)

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    Tincin de espiroquetas Procedimiento: 1. Realizar el extendido (debe ser limpio) 2. Fijar con alcohol. 3. Cubrir con acido tnico al 5% y calentar hasta emisin

    de vapores sin que hierva. 4. Lavar con agua desionizada 5. Cubrir con solucin de Fontana recientemente

    preparada hasta color castao (de ser necesario calentar suavemente)

    6. Lavar con agua destilada, secar y observar.

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    Tincin de espiroquetas

    La impregnacin argntica es un mtodo til de demostracin de Leptospiras en fetos bovinos abortados, ya que los intentos de aislamiento a partir de material fetal fallan frecuentemente*

    *Mtodos de laboratorio para leptospirosis. Nota tcnica N 9. OPS OMS.

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    Tincin de espiroquetas

    Treponema pallidum

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    NORMAS BASICAS DE BIOSEGURIDAD Es obligatorio: 1. Uso de delantal o guardapolvo. 2. Uso de guantes, barbijos y/o antiparras cuando sea necesario. 3. Uso de rejillas para el pelo o cofias. 4. Uso de calzado cerrado. 5. Adecuado manejo del material y las instalaciones. 6. Limpiar materiales y mesadas. 7. Apagar mecheros y cerrar llaves de gas al final de la jornada. 8. Desechar slidos y papeles en recipientes adecuados y clasificados. 9. Depositar materiales qumicos de desecho (formol, soluciones

    alcohlicas, etc.) en recipientes habilitados para dicho fin exclusivamente.

    10. No desechar en sistemas de desage.

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    NORMAS BASICAS DE BIOSEGURIDAD

    Est terminantemente prohibido:

    1. Fumar y/o masticar coca.

    2. Comer y/o beber.

    3. Tomar mate.

    4. Oler y/o probar compuestos qumicos.

    5. Trabajar solo en situaciones de alto riesgo.

    6. Jugar y/ correr en los laboratorios.