HIZLI VİRAL TANI TESTLERİ

Doç. Dr. Dilek ÇolakAkdeniz Üniversitesi Tıp FakültesiTıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Viroloji Bilim Dalı

FEN. 2004. Ankara

Virolojik Tanı Yöntemleri

Direkt tanı

yöntemleri

İndirekt tanıyöntemleri

Virolojik Tanı Yöntemleri1. Direkt Tanı yöntemleri

• Direkt incelemeHistolojiSitoloji

• Elektron mikroskobisi yöntemi• Hücre kültürleri• Antijenlerin saptanması

İmmün boyama (-floresan, -peroksidaz, vb)ELISALateks agl.

• Nükleik asitlerin tayiniMoleküler testler

Virolojik Tanı Yöntemleri2. İndirekt Tanı Yöntemleri

• Özgül antikorların araştırılmasıIgM

IgG

IgG avidite

serum, BOS, vb

Sitoloji:Virus grubu !

Tzanck smear HSV - VZV

Sitoloji:

İntranükleer inklüzyonlar CMV

Elektron Mikroskobisi Yöntemi

Dışkı Rotavirus, Adenovirus

Vezikül sıvısı HSV, VZV

Adenovirus Rotavirus(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)

Elektron Mikroskobisi Yöntemi

Elektron Mikroskobisi Yöntemi

Direkt görüntüVirus karekterizasyonuHızlıAyrdedici

PahalıDuyarlılık 106part./ml

İmmün Elektron Mikroskobisi

Araştırma lab.

Hücre kültürleri

• KonvansiyonelCPE

• Geç sonuç (1-30 gün)• Örnek kalitesi ve transportu çok önemli• Kontaminasyon riski• Örneklerin toksik etkisi• Üremeyen viruslar

Hücre kültürleri

• Hızlı hücre kültürleriCMV 48 saat

Hücre kültürleri

Viral Antijenlerin Saptanması

• Hızlı• Canlı virusa gerek yok

• İmmünfloresan boyama (FAT)

• EIA• Lateks agl.

• RSV• Influenza• Parainfluenza• Adenovirus• HSV

• Varicella-zoster• CMV• Rotavirus• HBV

Viral Antijenlerin Saptanması

Viral Antijenlerin SaptanmasıNazofaringeal aspirat

Dışkı

Deri

Kan

RSVInfluenza A and BParainfluenzaAdenovirus

RotavirusesAdenoviruses

HSVVZV

CMV (pp65 antijenemi testi)

Viral Antijenlerin Saptanmasıİmmünfloresan boyama

(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

Viral Antijenlerin Saptanması

FAT

Deride HSV (DFA)

Periferik kan lökositleri

Ciddi lökopenide yetersiz kalır!

3-4 saat

CMV antijenemi testi;CMV pp65 antijeni

Viral Antijenlerin Saptanması

pp65 antijenemi testi

Viral Antijenlerin Saptanması

RSV

FAT

Influenza A

HSV 1-2;

Duyarlılık Özgüllük PPD NPDFAT 80 93.3 92.3 95.1Shellvial-IP 87.6 100 100 96.9Kon.kültür 100 100 100 100

Chan EL et al. Clin Diagn Lab Immunol 2001;8:909-912

1188 nazal yıkama örneği sitospin preparatıFAT x Hızlı hücre kült.

%Virus Duyarlılık Özgüllük PPD NPDADV 62.5 100 100 93.8Infl.A 80 98.6 85 99.6Infl.B 67.4 100 100 98PI.1,2,3 88.5 99.7 96.4 98.9RSV 93.8 95.6 87 98Toplam 86.7 93.8 87.9 93.1

Rochol C, et al. Pediatrics 2004;113:e51-e56

FAT yönteminde: • Örnek kalitesi çok önemli• Örnekte yeteri kadar hücre olmalı

“yalancı negatif sonu甕 Deneyimli personel gerekli• Çok sayıda örneğin incelenmesi zor

EIA

Viral Antijenlerin Saptanması

Viral Antijenlerin Saptanması

EIA

• Çok çeşitli örnek çalışılır

• Fazla sayıda örnek çalışılır

• Otomasyon

Viral Antijenlerin Saptanması

Membran EIA

Viral Antijenlerin Saptanması

Lateks aglütinasyon

Nükleik Asit Tayini

Moleküler testler• Polimeraz zincir reaksiyonu

Klasik PCRReal-time PCR

• Hibridizasyon

Nükleik Asit Tayini

Klasik PCR

C obas Am plicor CM V M onitor1. D N A ekstraksiyonu

plazm a2. Am plifikasyon (PC R )

ve h ibridizasyon(C M V, IC )

3. Sonuçların basılm ası

4. D uyarlılık sın ırları4x102-1x105 kopya/m l p lazm a

Nükleik Asit Tayini

                                       

Nükleik Asit Tayini

Real-time PCR

Plato fazı

Geçiş fazı

Logaritmik faz

Döngü sayısı

Eşik çizgisi

Sinyal

10 20 30

Baz çizgisi

Amplifikasyonla ilişkili floresan sinyallerinin alınması için gereken siklus sayısı (Ct değeri), başlangıçtaki hedef nükleik asit miktarıyla ters orantılı

Nükleik Asit TayiniReal-time PCR

SYBR green I

Fluorescense resonance energy transfer (FRET)

Hibridizasyon probları

Taq-man probları

Molecular beacons

Nükleik Asit Tayini

Real-time PCR ürün saptama

SYBR green

FRET

Taq-man probları

Molecular Beacons

1- Tam kandan nükleik asit izolasyonu1- Tam kandan nükleik asit izolasyonu

3- Hibridizasyon elekt.kemilumin.

saptama (CMV, IC)

3- Hibridizasyon elekt.kemilumin.

saptama (CMV, IC)

lineer faz

Primer 1Primer 1Revers TranskriptazRevers Transkriptaz

RNaRNazz HHPrimer 2Primer 2Revers TranskriptazRevers Transkriptaz

T7 RNA polT7 RNA poliimeramerazzPrimer 2Primer 2

Revers TranskriptazRevers Transkriptaz Revers TranskriptazRevers TranskriptazRNaRNazz H H Primer 1Primer 1

• sense RNA• antisense RNA• sense DNA• antisense DNA

amplifikasyon fazı

Nuclisens pp67 (NASBA) testiNuclisens pp67 (NASBA) testi

2- İzotermal amplifikasyon(41°)

2- İzotermal amplifikasyon(41°)

4. Duyarlılık: 700 RNA molekülü

Hybrid capture CMV DNA testi• 1-DNA

ekstraks.• Tam kan

• 2-Hedef DNA’nın CMV RNA probu ile hibridizasyon

• 3-DNA: RNA hybridlerinin antikorla tutulmasıby antibody

4- Konjugat

•5.Kemilüm.saptama

Quantiplex (bDNA) CMV testi

1-DNA izolasyonu ve denatürasyonu

2-HibridizasyonCMV gB/UL 56

solid faz

3-Hibridizasyon(bDNA)

4-bDNA hibridizasyonu

5-Substrat

İşaretli probO O OOH2

OPO-2

Duyarlılık: 900 kopya/106 lökosit

Quantiplex (bDNA) CMV testi

1-DNA izolasyonu ve denatürasyonu

2-HibridizasyonCMV gB/UL 56

solid faz

3-Hibridizasyon(bDNA)

4-bDNA hibridizasyonu

5-Substrat

İşaretli probO O OOH2

OPO-2

Duyarlılık: 900 kopya/106 lökosit

ADV, 37 konjonktival sürüntü örneği

%Test Duyarlılık Özgüllük PPD NPDH.kült. 76.9 100 100 64.7FAT 73.1 100 100 61.1PCR 88.4 100 100 78.6

Percivalle E, et al. J Clin Virol 2003;28:257-264

FAT (-) diğer testler

132 KHT alıcısıADV, >5000 örnek perif. kan lökositleriReal-time PCR dışkı

idrarboğaz sürüntüsü

Periferik kan löokositlerinde PCR (+)

İnvaziv ADV inf. göstergesi

Lion T, et al. Blood 2003;102:1114-1120

Moleküler testler: Avantajları

• Hızlı

• Duyarlılık yüksek“latent viruslar için kantitatif testler”

• Pek çok patojen için uygulanabiliyor

• Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski çok az“MagnaPure+LightCycler”

Tedavi monitörizasyonu

Moleküler testler: Dezavantajları

• Çoğu standardize değil“internal ve eksternal kalite kontrol uygulamaları”

• Lab.lar arası sonuç karşılaştırması zor“tanı karmaşası”

• PCR temelli olanlarda IC kullanılmalı

• Rutin sonuç verirken dikkat!

• Pahalı

•Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski fazla“in house PCR”

Seroloji:

BOS’da antikor tayini:HerpesviruslarRespiratuvar viruslar

İntratekal antikor sentezi olduğu gösterilmeli

BOS spesifik Ab :serum spesifik Ab BOS IgG:serum IgG 1.5

İletişim

Laboratuvar klinik

Toplantılar Karşılıklı bilgilendirmeHasta bilgileri paylaşılmalı..........

YorumElde edilen sonuçlar

neyin göstergesine diyorşimdi n’olacak?

Mikrobiyolog yaptığı testin sonucunun yorumunu yapabilmeli

Klinisyen istediğitestin sonucununyorumunu istemeli,öğrenmeli

“Rekabet ile işbirliğini harmanlayıp;

düşleri ortak bir gerçekliğe aktarmak...”

Bahar Ö. Düzgören