Poslijediplomski sveučilišni doktorski studij BIOFIZIKA

_Izvješće o predloženoj temi

Povjerenstvo za ocjenu prijave teme doktorskog rada:

1. Doc. dr. sc. Stjepan Orhanović - predsjednik

2. Dr. sc. Bono Lučić, viši znanstveni suradnik (Institut Ruđer Bošković, Zagreb)

3. Prof. dr. sc. Davor Juretić - član

FAKULTETSKOM POVJERENSTVU ZA BIOFIZIKU I VIJEĆU STUDIJA

POSLIJEDIPLOMSKOG SVEUČILIŠNOG STUDIJA „BIOFIZIKA“

Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Splitu, Nikole Tesle 12, 21000 Split

Predmet: Izvješće o predloženoj temi

Pristupnice Nade Ilić pod naslovom

Design and Testing of Adepantins – Functional Artificial Antibiotics

Fakultetsko vijeće Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Splitu, na sjednici

održanoj 28. studenoga 2012 godine imenovalo nas je u stručno povjerenstvo za ocjenu

prijave teme doktorskog rada pristupnice Nade Ilić pod naslovom

Design and Testing of Adepantins – Functional Artificial Antibiotics

Razmotrivši privitke prijave teme i usmenu prezentaciju pristupnice podnosimo

Poslijediplomski sveučilišni doktorski studij BIOFIZIKA

_Izvješće o predloženoj temi

IZVJEŠĆE

1. Životopis pristupnice

Obrazovanje pristupnice:

Srednja škola: 2. Jezična gimnazija u Splitu, 1997. godine

Studij: Biologija i kemija, profesorski smjer na Fakultetu prirodoslovno-matematičkih

znanosti i odgojnih područja u Splitu – 2002. godine zvanje: profesor biologije i kemije

Doktorski studij: upisala doktorski studij biofizike na PMF-u Sveučilišta u Splitu, 2008.

godine

Zaposlenje pristupnice:

1999-2000: demonstrator na Fakultetu prirodoslovno-matematičkih znanosti i odgojnih

područja u Splitu

2004-2005: profesor biologije i kemije, te administrator u Gimnazijskom kolegiju „Kraljica

Jelena“

2007-danas: znanstveni novak/asistent na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu u Splitu, na

projektu „Razvoj i primjene principa maksimalne proizvodnje entropije“, broj 177-1770495-

0476, profesora Davora Juretića

2. Znanstvena i stručna aktivnost pristupnice

Projekt:

Razvoj i primjene principa maksimalne proizvodnje entropije, 177-1770495-0476, Davor

Juretić – znanstveni novak

Bilaterale i stipendije:

ZŽ2 (SV1) - Design and synthesis of selective peptide antibiotics, Bilateralna suradnja

Hrvatska – Italija 2009-2011, Davor Juretić (Hrvatski koordinator), Alessandro Tossi

(Talijanski koordinator)

Alpe-Adria scolarship (2010) – na 5 mjeseci - Designing, synthesis and control of therapeutic

activity of novel selective peptide antibiotics, Alessandro Tossi, Davor Juretić, Nada Ilić

Poslijediplomski sveučilišni doktorski studij BIOFIZIKA

_Izvješće o predloženoj temi

Članci

1. Ilić, N., Novković, M., Guida, F., Xhindoli, D., Benincasa, M., Tossi, A., Juretić, D.,

Selective antimicrobial activity and mode of action of adepantins, glycine-rich peptide

antibiotics based on anuran antimicrobial peptide sequences, BBA Biomembranes 2012 (In

press).

2. Juretić, D., Vukičević, D., Petrov, D., Novković, M., Bojović, V., Lučić, B., Ilić, N., Tossi,

A., Knowledge-based computational methods for identifying or designing novel, non-

homologous antimicrobial peptides, Eur. Biophys. J. 2011, 40, 371–385, DOI

10.1007/s00249-011-0674-7

3. Juretić, D., Vukičević, D., Ilić, N., Antcheva, N., Tossi, A., Computational Design of

Highly Selective Antimicrobial Peptides, J. Chem. Inf. Model. 2009, 49, 2873–2882

Posteri

1. Ilić, N., Novković, M., Guida, F., Xhindoli, D., Benincasa, M., Tossi, A., Juretić, D.,

Adepantins, computationally designed, glycine-rich peptide antibiotics, with low toxicity and

very high G- selectivity// 2nd NAM Workshop: New Antimicrobials Workshop in Trieste,

Trst, Italija, 2012. 37 (poster, sažetak, znanstveni)

2. Ilić, N., Novković, M., Guida, F., Antcheva, N., Tossi, A., Copić, T., Puizina, J., Juretić,

D., Adepantins, a new class of ab-initio designed antimicrobial peptides // Book of Abstracts

AMP2010/ Juretić, Davor; Separovic, Frances (ur.). Split: Sveučilište u Splitu, Prirodoslovno-

matematički fakultet, 2010. 41-41 (poster,sažetak,znanstveni). - nagrada za najbolji poster.

3. Juretić, D., Vukićević, D., Ilić, N., Bojović, V., Tossi A., Design optimisation of novel

peptide antibiotics predicted to have high selectivity against G-negative bacteria // The 3rd

Adriatic Meeting on Computational Solutions in the Life Sciences/. Primošten, rujan 2009.

Book of Abstracts, Tomić, Sanja; Smith, David (ur.). Zagreb: Centre for Computational

Solutions in the Life Sciences, Ruđer Bošković Institute, 2009. 59-59 (poster, sažetak,

znanstveni)

4. Juretić, D., Vukičević, D., Bojović, V., Lučić, B., Ilić N., Design principles for peptide

antibiotics // From solid state to biophysics, 4-th conference, Cavtat, Croatia, June 2008

(poster, sažetak, znanstveni)

Poslijediplomski sveučilišni doktorski studij BIOFIZIKA

_Izvješće o predloženoj temi

5. Juretić, D., Bojović, V., Lučić, B., Ilić, N., Predicting the therapeutic index of peptide

antibiotics, // Third Austrian-Croatian Science Days, Grac, Austrija, listopad 2007. (poster,

sažetak, znanstveni)

Predavanja:

Pristupnica je do sada na preddiplomskom studiju držala laboratorijske vježbe iz Opće

kemije za fizičare, te na diplomskom studiju iz biofizike vježbe iz slijedećih predmeta:

Metodologija istraživanja u prirodnim znanostima, Bioenergetika i Bioinformatika.

3. Mišljenje o predloženoj temi doktorskog rada

Tema doktorske disertacije Nade Ilić bavi se dizajnom, sintezom i testiranjem

peptidnih antibiotika. Za neke bolesti peptidni antibiotici su obećavajuća zamjena za klasične

antibiotike na koje su bakterije sve više otporne. Mehanizam djelovanja peptidnih antibiotika

je takav da ponajprije uključuje interakciju s fosfolipidima membrane. Očekuje se da će

bakterije teže razviti otpornost na membranski-aktivne peptide upravo zbog njihovih

općenitih i raznovrsnih mehanizma povećavanja permeabilnosti bakterijske unutrašnje

membrane. Bakterije imaju znatno jače električno polje usmjereno prema citoplazmi i

znatno više fosfolipida s negativno nabijenim polarnim glavama na vanjskoj strani

citoplazmatske membrane nego stanice sisavaca. Zbog toga pozitivno nabijeni antimikrobni

peptidi puno jače djeluju na bakterijske nego na eukariotske stanice. Ipak, ima dosta

antimikrobskih peptida koji razorno djeluju i na ljudske stanice pa ih prije možemo smatrati

toksinima nego antibioticima. Premda je to ponekad korisno za eliminaciju tumorskih

stanica, ipak je potrebno pronaći ili konstruirati takve antimikrobne petide koji će biti

minimalno toksični za ljudske stanice kao što su crvene krvne stanice i maksimalno selektivni

prema nekim patogenim bakterijama. Tek pronalskom takvih peptida bio bi opravdan naziv

peptidni antibiotici.

Problem smanjivanja toksičnosti peptida uz istodobno pojačavanje njihovog

selektivnog djelovanja na bakterije vrlo je složen, jer je u praksi teško odvojiti pojačanu

antibakterijsku aktivnost od porasta hemolitične aktivnosti (toksičnoati) modificiranih

peptida. Publicirano je na stotine znanstvenih radova koji su koristili skupu i subjektivnu

metodu mnogobrojnih pokušaja i pogrešaka da bi se na kraju pronašli jedan ili dva

Poslijediplomski sveučilišni doktorski studij BIOFIZIKA

_Izvješće o predloženoj temi

antimikrobska peptida s povećanim terapeutskim indeksom, dakle peptida s većom

selektivnošću za bakterijske u odnosu na ljudske stanice. Malo je bilo uspješnih pokušaja da

se iskoriste fizikalno kemijske karakteristike peptida i raspodjela tih karakteristika uzduž

sekvence peptida da bi se na racionalan i objektivan način našli najbolji deskriptori koji

povezuju strukturu i selektivno djelovanje antimikrobskih peptida.

Prva faza takvog projekta sastoji se u prikupljanju podataka o selektivnosti

antimikrobskih peptida izravno u publiciranim znanstvenim radovima, jer podaci u biološkim

bazama podataka nisu dovoljno dobro sistematizirani niti su dovoljno pouzdani. Nakon što je

taj posao obavljen, cilj samostalnog rada pristupnice sastojao se u konstrukciji pouzdane

baze podataka za treniranje i za testiranje algoritma. Premda pristupnica nije imala kao svoj

cilj rada konstrukciju ili usavršavanje algoritma za predviđanje terapeutskog indeksa i za

predviđanje primarne strukture peptida za koje se očekuje da će biti selektivni peptidni

antibiotici, pristupnica je imala podjednako važan cilj sinteze i testiranja peptida, dakle

dobivanja eksperimentalne potvrde da originalni algoritmi Prirodoslovno-matematičkog

fakulteta u Splitu dobro rade.

U svom izlaganju pristupnica je vrlo detaljno opisala sve metode koje se moraju

upotrijebiti da bi se peptidi, koji su prije postojali samo u virtualnom svijetu računala,

sintetizirali, pročistili, karakterizirali i analizirali s obzirom na mehanizam njihovog djelovanja

na bakterijske i na ljudske stanice. Prijedlog pristupnice dobro definira na koja sva pitanja

doktorska disertacija mora odgovoriti i koje će se metode upotrijebiti da se to postigne.

Stoga držimo da je sadržaj predložene teme rada vrlo aktualan i važan za biofiziku interakcije

antimikrobnih peptida s različitim stanicama i različitim modelima umjetnih membrana, kao

što su velike vesikule sa samo jednom topološki zatvorenom membranom, takvog sastava

lipida da imitiraju ljudske ili bakterijske membrane. Izabrana tema rada dobro je fokusirana

na adepantine, peptidne antibiotike za koje se očekuje da su vrlo selektivni za Gram-

negativne bakterije i da imaju nisku toksičnost, dakle visoki terapeutski indeks.

Prezentaciju o temi doktorata pristupnica je održala na engleskom jeziku. Prijavu je

pristupnica sustavno obrazložila te potkrijepila relevantnim literaturnim podacima.

Preporučamo da se prihvati tema doktorskog rada Nade Ilić.

4. Očekivani rezultati i njihov doprinos znanosti.

Poslijediplomski sveučilišni doktorski studij BIOFIZIKA

_Izvješće o predloženoj temi

Znanstveni doprinos ogleda se u inovativnosti pristupu kreiranja novih peptidnih

antibiotika, koji su obećavajući spojevi u današnje doba povećanja bakterijske rezistencije na

klasične antibiotike. Ovim pristupom moguće je smanjiti troškove nasumičnog kreiranja

novih ili popravljanja prirodnih antimikrobnih peptida, za koje se traži da imaju veliku

selektivnost za bakterijske u odnosu na ljudskih stanice.

Za potrebe rada kreirana je baza peptida koja je podjeljena na skup za treniranje i

testiranje, na osnovu kojih su konstruirani algoritmi Prediktor i Designer (Juretić i sur., 2009,

pod brojem 3 među člancima pristupnice). Prediktor daje predviđanje terapeutskog indeksa

za peptide slične antimikrobnim peptidima vodozemaca. Taj algoritam radi samostalno ali je

također ugrađen i u algoritam Designer koji bi trebao biti u stanju da konstruira „in-silico“

potpuno novu klasu linearnih antimikrobnih peptida s tendencijom da poprime sekundarnu

strukturu uzvojnice u dodiru s citoplazmatskom membranom bakterija. Pomoću navedenih

algoritama moguće je konstruirati umjetne antibiotike, koji bi prema modelu trebali biti

izrazito selektivni.

Kao rezultati ovoga doktorskoga rada bit će provedeni laboratorijski testovi

napravljeni na novoj klasi umjetnih peptidnih antibiotika nazvanih adepantinima. Izabrani

testovi trebali bi pokazati jesu li adepantini uistinu selektivni, jako antimikrobski aktivni

protiv Escherichia coli, te jesu li slabo hemolitični prema ljudskim crvenim krvnim stanicama.

Provjerit će se i njihova aktivnost na gram pozitivne bakterije Staphylococcus aureus.

Eksperimenti bi trebali dati i podatke konstruira li algoritam Designer zaista peptide koji

poprimaju konformaciju alfa uzvojnice u organskom otapalu ili u dodiru s umjetnim

vesikulama čiji sastav lipida membrane oponaša sastav fosfolipida iz citoplazmatske

membrane gram-negativnih bakterija. Rad će odgovoriti i na pitanje da li i kako adepantini

utječu na povećanje permeabilnosti modelnih membrana, bakterijskih i ljudskih stanica.

Eksperimentalno testiranje uključuje primjenu metoda razvijenih u biokemiji peptida,

kao i biofizikalnih, biokemijskih i mikrobioloških metoda za karakterizaciju peptida. Ovim bi

se istraživanjem prikupili podaci o funkcionalnosti peptida čije su sekvence predviđane

pomoću inovativnih bioinformatičkih metoda sakupljanja i analize podataka radi

pronalaženja optimalnih deskriptora koji dobro povezuju primarnu strukturu i selektivnost

peptidnih antibiotika. Završetkom testiranja bilo bi moguće usavršiti razvijene

bioinformatičke alate ili konstruirati nove koji bi se temeljili na sličnim značajkama. Ukoliko

Poslijediplomski sveučilišni doktorski studij BIOFIZIKA

_Izvješće o predloženoj temi

se spojevi konstruirani ovim inovativnim metodama pokažu zadovoljavajućim, otvaraju se

mogućnosti njihovog daljnjeg ispitivanja s ciljem njihovog uvođenja u širu primjenu,

uključujući i primjenu u medicini.

5. Predloženi mentor

Mentor Prof. dr. sc. Davor Juretić brojnim izvornim radovima dokazuje svoju

kompetentnost da pristupnicu Nadu Ilić usmjeruje u predloženim istraživanjima, nadzire njen

rad i savjetuje je u obradi dobivenih rezultata.

Komentor Prof. dr. sc. Alessandro Tossi brojnim izvornim radovima dokazuje svoju

kompetentnost da pristupnicu Nadu Ilić usmjeruje u predloženim istraživanjima, nadzire njen

rad i savjetuje je u obradi dobivenih rezultata.

6. Mišljenje i prijedlog

U obrazloženju prijedloga teme pristupnica je sustavno obrazložila i potkrijepila

poznate znanstvene činjenice adekvatnim izborom relevantnih literaturnih podataka. Jasno

je odredila ciljeve istraživanja, a metode koje će rabiti u postizanju rezultata su sofisticirane i

suvremene s obzirom na dosege u biofizici, bioinformatici, biokemiji i molekularnoj biologiji .

Ispunila je sve uvjete da pristupi izradbi i obrani doktorske teze, od kojih je najvažniji taj da je

kao prvi autor publicirala jedan CC rad i kao ko-autor sudjelovala u izradbi još dva CC rada.

Stoga smatramo da pristupnica ispunjava sve potrebne uvjete za izradbu doktorskog rada i

predlažemo Vijeću poslijediplomskog sveučilišnog studija „Biofizike“, Prirodoslovno-

matematičkog fakulteta Sveučilišta u Splitu da se tema pod naslovom Design and Testing of

Adepantins – Functional Artificial Antibiotics prihvati kao tema doktorske disertacije

pristupnice Nade Ilić.

Za mentora pristupnice predlažemo Prof. dr. sc. Davora Juretića, a za komentora Prof.

dr. sc. Alessandra Tossija.

U Splitu, 07. Prosinca 2012.