BAB VPEMBAHASANUji konfirmasi merupakan uji lanjutan dari uji screening narkotika / psikotropika dimana uji konfirmasi merupakan pemeriksaan yang lebih akurat karena hasil yang diperoleh merupakan hasil yang sudah definitif menunjukkan jenis zat narkotika / psikotropika dalam suatu sampel yang dianalisis. Dalam uji konfirmasi narkotika / psikotropika, sampel yang digunakan adalah sampel urine pasien yang dicurigai mengandung zat narkotika / psikotropika. Penggunaan sampel urine dikarena dalam sampel urine obat, racun, dan metabolit ada dalam konsentrasi yang lebih besar dibandingkan dalam darah. Sebelum melakukan uji konfirmasi terhadap jenis narkotika / psikotropika, dilakukan suatu pemisahan zat narkotika / psikotropika terlebih dahulu dari sampel yang akan dianalisis. Pemisahan tersbut dilakukan dengan menggunakan proses ekstraksi.Ekstraksi merupakan proses pemisahan analit dari suatu matriks sampel menggunakan pelarut dimana analit tersebut sangat larut dalam pelarut yang digunakan namun zat pengotornya tidak larut. Dalam proses ekstraksi, setelah analit dalam sampel larut dalam pelarut organik yang digunakan, kemudian dilakukan suatu proses penguapan untuk menghilangkan pelarut tersebut sehingga diperoleh analitnya saja untuk selanjutnya dianalis, dimana hal ini disebut dengan tahap isolasi. Dalam proses ekstraksi, syarat untuk pelarut sesuai yang dapat digunakan yaitu memiliki kakuatan mengekstraksi yang baik sehingga analit yang akan diekstraksi dapat dipisahkan sepenuhnya dari matriks sampel dan zat pengotor, kelarutannya rendah dalam air, memiliki kerapatan yang rendah dalam air, memiliki volalitas moderat agar mudah diuapkan saat akan memperoleh analit yang larut dalam pelarut tersebut namun pelarut tersebut tidak boleh terlalu volatile sehingga pada saat digunakan untuk melarutkan analit atau preparasi sampel pelarut tersebut tidak cepat menguap seluruhnya, bersifat stabil dan tidak mudah terbakar, murah, kemurniannya tinggi, tidak mengabsorpsi sinar UV atau tdak memiliki aktivitas elektrokimia sehingga tidak mengganggu proses analisis analit.Dalam praktikum yang dilakukan, proses ekstraksi dilakukan untuk memperoleh obat obat golongan Amfetamin dan Opiat dari sampel urine yang selanjutkan akan dianalisis dengan menggunakan spektrofotodensitometri. Dalam proses analisis obat golongan Amfetamin, yang menjadi sasaran dalam proses analisis yaitu amfetamin, metamfetamin, methylendioxy amfetamin (MA) dan methylendioxy metamfetamin (MDMA). Sedangkan untuk obat golongan Opiat, yang menjadi sasaran dalam proses analisis yaitu kodein dan morfin.Ada beberapa metode ekstraksi, yaitu ekstraksi padat cair, ektraksi cair cair, dan ekstraksi fase padat (Solid Phase Extraction/ SPE). Dalam praktikum yang dilakukan, metode ekstraksi yang digunakan yaitu ekstraksi cair cair.

Ekstraksi Cair-Cair (liquid extraction, solvent extraction)Ekstraksi cair-cair yaitu pemisahan solute dari cairan pembawa (diluen) menggunakan solven cair. Campuran diluen dan solven tersebut bersifat heterogen (immiscible, tidak saling campur), dan jika dipisahkan terdapat 2 fase, yaitu fase residu (rafinat), berisi diluen dan sisa solut dan fase solven (ekstrak), berisi solute dan solven (Anonim, 2011).Pada ekstraksi cair-cair, satu komponen bahan atau lebih dari suatu campuran dipisahkan dengan bantuan pelarut. Proses ini digunakan secara teknis dalam skala besar misalnya untuk memperoleh vitamin, antibiotika, bahan-bahan penyedap, produk-produk minyak bumi dan garam-garam logam. Proses inipun digunakan untuk membersihkan air limbah dan larutan ekstrak hasil ekstraksi padat cair (Anonim, 2011).Ekstraksi cair cair merupakan ekstraksi suatu analit yang didasarkan atas distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur. Dalam proses ektraksi cair cair terdapat beberapa tahap, yaitu adjust pH (penyesuaian pH), partition, dan separated phase. Pada proses pengerjaannya, sampel urine yang akan dianalisis diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung centrifuge, kemudian ditambahkan dengan buffer fosfat pH 9,3 sebanyak 1 ml dengan tujuan untuk mengkondisikan pH sampel agar sesuai dengan pH yang baik untuk proses ekstraksi (basa) karena semakin tinggi pH larutan akan semakin tinggi pula jumlah analit yang akan dperoleh. Setelah itu ditambahkan dengan 2 ml campuran kloroform isopropanol yang sebelumnya telah dicampurkan dengan perbandingan 3:1, dimana campuran kloroform isopropanol berfungsi sebagai pelarut yang akan membuat analit dalam sampe diperoleh kembali dengan jumlah yang lebih tinggi dibandingkan dengan menggunakan yang lain. Sampel urine, buffer fosfat pH 9,3 dan campuran kloroform isopropanol dalam tabung centrifuge tersbut kemudian di vortex dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit agar terbentuk emulsi yang sempurna sehingga analit atau sasaran zat dalam proses analisis dapat larut dengan baik hingga selanjutnya dilakukan proses centrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk memperoleh hasil pemisahan antara fase kloroform dan fase airnya. Fase kloroform merupakan fraksi yang mengandung analit yang diinginkan. Setelah proses centrifuge, fase kloroform akan berada dibagian bawah tabung centrifuge karena kloroform memiliki berat jenis yang lebih besar dibandingkan dengan berat jenis air. Fase kloroform tersbut kemudian di pipet dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Sedangkan fase air yang tersisa dalam tabung centrifuge diekstraksi kembali. Hal ini dilakukan karena diduga dalam fase air tesbut masih terdapat analit / zat yang diinginkan. Oleh karenanya, dilakukan kembali penambahan buffer fosfat dengan pH yang lebih tinggi dari pH buffer fosfat sebelumnya yaitu 10,5 untuk memaksimalkan perolehan analit yang terdapat dalam fase air tersbut. Kemudian ditambahkan campuran kloroform isopropanol kembali dan dilakukan proses vortex dan centrifugasi dengan waktu dan kecepatan yang sama. Dari proses tersebut juga akan diperoleh fase kloroform dimana fase kloroform ini ditambahkan pada fase kloroform pertama yang terdapat dalam tabung reaksi untuk selanjutnya dipindahkan ke dalam botol vial dan di uapkan pada suhu 60 - 700C menghilangkan pelarut pelarut organik yang sebelumnya digunakan untuk proses elusi sehingga diperoleh analit murni dari target yang diinginkan.Analit yang telah diperoleh baik dengan ekstraksi cair cair direkonstitusi dengan methanol sebanyak 25l dengan tujuan untuk melarutkan analit tersebut sehingga diperoleh dalam bentuk cairan sehingga memudahkan analit untuk selanjutnya dilakukan uji konfirmasi dengan metode KLT Spektrodensitometri.Setelah diperoleh analit dari sampel urine yang akan dianalisis, kemudian analisis analit tersebut dilanjutkan pada uji konfirmasi. Dalam praktikum yang dilakukan, uji konfirmasi dilakukan dengan menggunakan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis) Spektrofotodensitometri Penyiapan Fase DiamSetelah diperoleh analit dari sampel urine yang akan dianalisis, kemudian analisis analit tersebut dilanjutkan pada uji konfirmasi. Dalam praktikum yang dilakukan, uji konfirmasi dilakukan dengan menggunakan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis) Spektrofotodensitometri. Hal pertama yang dilakukan dalam uji konfirmasi dengan KLT Spektrodensitometri adalah menyiapkan plat lapis tipis yang akan digunakan untuk menotolkan noda analit yang telah diperoleh sebelumnya. Preparasi plat lapis tipis sangat penting untuk dilakukan karena akan menentukan hasil dari proses selanjutnya dari uji konfirmasi ini. Plat lapis tipis yang digunakan mengandung silika gel yang berperan sebagai fase diam. Plat umumnya berukuran 20X20 cm, namun pada praktikum yang dilakukan, plat yang diperlukan berukuran 5 X 10 cm, sehingga harus dilakukan pemotongan terlebih dahulu sebelum plat tersebut digunakan. Dalam pemotongan plat, ada beberapa syarat yang harus dipenuhi, antara lain: Alas yang digunakan untuk memotong plat harus bersih, halus serta terbuat dari keramik atau kaca. Alat pemotong yang digunakan harus tajam dan tidak boleh berkarat. Dalam pemotongan plat, tidak harus dipaksakan pemotongan tersebut dilakukan dalam sekali tahap pemotongan. Pengulangan pemotongan boleh dilakukan hingga plat benar benar terputus dengan sempurna.

Hal tersebut dilakukan agar diperoleh plat yang tidak bergerigi, dan bebas dari kontaminas, karena plat yang bergerigi dapat mengganggu proses elusi sehingga menghasilkan elusi analit yang tidak lurus sempurna (miring), berekor (tailing) serta terbentuk jalur elusi baru. Plat yang telah dipotong dengan baik, harus diberi identitas berupa kode arah elusi dipojok kanan atau kiri atas dengan menggunakan pensil dan tidak boleh menggunakan ballpoint. Walapun pensil dan ballpoint sama sama mengandung bahan kimia, tetapi bahan kimia yang terkandung dalam pensil masih bisa ditoleransi oleh plat dibanding bahan kimia yang terkandung dalam ballpoint. Selain itu, apabila menggunakan ballpoint, saat plat dicuci dengan menggunakan methanol, kemungkinan tinta dari ballpoint tersebut akan luntur dan mengotori plat. Fungsi dari pemberian kode arah elusi adalah agar proses pencucian plat dan proses elusi dapat berjalan kearah yang sama, sebab apabila arah pencucian plat dengan arah elusi berbanding terbalik, akan menyebabkan kotoran plat yang telah dibawa ke bagian atas plat saat pencucian plat dengan methanol akan turun kembali ke daerah uji saat proses elusi yang menyebabkan analit yang dielusikan akan terelusi bersama pengotor pengotor tersebut sehingga mengganggu proses analisis analit. Selain itu, plat yang telah dipotong harus diberi batas atas dengan menggunakan pensil sekitar 1 cm dengan tujuan agar titik akhir elusi dari masing masing noda dapat diamati dengan jelas. Selain itu juga untuk memastikan agar masing masing noda tidak menyentuh pengotor pengotor hasil pencucian plat yang terkumpul dibagian atas plat.Sebelum digunakan, plat yang telah dipotong tersebut dicuci dan diaktivasi. Pencucian harus dilakukan sebab plat kemungkinan mengandung pengotor karena faktor internal maupun eksternal. Faktor internal yang dimaksud adalah pada saat proses pembuatan plat tersebut, sedangkan faktor eksternal adalah pada saat penyimpanan plat itu sendiri. Pencucian dilakukan dengan menggunakan larutan methanol yang merupakan pelarut polar / semi polar yang dapat melarutkan banyak senyawa. Arah proses pencucian harus disesuaikan dengan kode arah elusi yang telah ditetepkan sebelumnya karena methanol itu ikut bermigrasi bersama pengotor kearah pencucian. Sebenarnya larutan yang lebih baik digunakan untuk proses pencucian plat adalah fase geraknya sendiri karena fase geraknya tersebut akan secara langsung membawa zat yang dianggap sebagai pengotor oleh fase gerak itu sendiri sehingga plat tersebut akan terbebas dari semua pengotor yang dapat mengganggu proses elusi. Sedangkan apabila menggunakan methanol, zat yang tidak larut dalam methanol namun merupakan pengotor bagi fase gerak, maka pada saat proses elusi analit dengan fase geraknya tersebut proses elusi akan diganggu oleh pengotor tersebut. Namun, dalam praktikum yang dilakukan, pencucian dilakukan dengan menggunakan methanol mengingat methanol merupakan pelarut yang umum digunakan dan mudah diperoleh dipasaran serta dapat melarukan banyak zat. Untuk memastikan telah tercucinya plat dengan sempurna, perlu diperhatikan bahwa saat bagian paling atas plat telah terbasahi semua maka perlu ditunggu lagi selama 10 menit sehingga meyakinkan area penotolan dan elusi analit dan standar telah bebas dari kotoran dan zat-zat pengganggu.Tahap selanjutnya dilakukan proses aktivasi plat dengan pemanasan plat pada suhu 600C selama 10 menit di dalam oven. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan uap air dan pengotor yang menempel pada sisi aktif plat karena methanol yang digunakan untuk pencucian plat terdiri atas campuran air dan methanol sehingga kemungkinan air tersebut terjerat dalam silika gel dan menyebabkan silika gel tersebut menjadi jenuh dan harus diaktivasi. Oleh karenanya proses aktivasi dilakukan dengan menghilang air yang terjerat dalam silika gel tersebut sehingga silika gel tersebut tidak jenuh dan agar plat dapat memberikan respon baseline yang lebih baik serta mengurangi ratio gangguan (noise ratio).

Penyiapan larutan PengembangSelain memilih fase diam (TLC plate), memilih eluen pengembang kromatografi lapis tipis (KLT) juga merupakan faktor yang berpengaruh besar, karena hanya beberapa kasus solvent pengembang yang hanya terdiri dari satu komponen saja. Pada umumnya campuran larutan pengembang KLT (solvent system) bisa sampai enam komponen dengan perbandingan tertentu.Campuran larutan/eluen pengembang KLT ini berfungsi untuk : Melarutkan campuran bahan Mengangkut bahan untuk dipisahkan pada lapisan fase diam (sorben) Memberikan nilai hrf senyawa yang terpisah Memberikan selektivitas yang memadai untuk campuran bahan untuk dipisahkan.

Adapun syarat eluen KLT (mobile phase) antara lain : Kemurnian yang memadai Stabilitas yang memadai Viskositas rendah Partisi/pemisahan linier Tekanan uap sedang Daya toksik yang serendah mungkin

Dalam pelaksanaannya, yang paling sulit dilakukan adalah bagaimana memilih solvent system/fase gerak yang cocok agar komponen senyawa terpisah baik. Cara memilih fase gerak KLT bisa dilakukan sendiri dengan orientasi dari beberapa komponen pelarut dan perbandingan. Namun demikian untuk mendapat hasil yang memuaskan juga butuh waktu lama. Optimasi fase gerak KLT ini bisa juga sesuai mengambil dari literatur. Apabila dari literatur belum cocok pemisahan senyawanya, bisa dirubah rasio/perbandingan solvennya. Namun terkadang juga dari literature masih menuliskan sistem pelarut pengembang yang sangat beracun atau karsinogenik, misalnya benzene. Jika menggunakan komponen pengembang seperti ini perlu diperhatikan alat safety bagi pengguna.Seri buku eluotropic memperkenalkan pengganti benzena yang bisa diganti toluene yang sesuai dengan kekuatan elusi dan koefisien kecepatannya. Tips praktis memilih eluen pengembang KLT adalah mencari dari literatur. Apabila tidak ditemukan fase gerak yang cocok, bisa mencoba mulai dari solvent tunggal yang mempunyai kekuatan elusi menengah. Biasanya sebagai fase diam dicoba dulu menggunakan silica gel 60, sebelum dilanjutkan pengujian lain atau perubahan. Larutan pengembang yang digunakan dalam praktikum ini adalah larutan pengembang sistem TB dan TAEA. Larutan pengembang TB dibuat dengan mencampurkan sikloheksana, toluene, dan dietilamin dengan perbandingan 75:15:10 dalam sebuah labu ukur. Sedangkan larutan pengembang TAEA dibuat dengan mencampurkan toluene: aseton: etanol: ammonia (45:45:7:3), dimasukan ke labu ukur dan dikocok sampai homogen.

Penjenuhan Bejana KromatografiTahapan selanjutnya adalah penjenuhan chamber, tujuan dari penjenuhan chamber adalah untuk mengoptimalisasi proses pengembang fase gerak. Sebelum dijenuhkan, dipilih terlebih dahulu chamber yang sesuai dengan ukuran plat. Karena Plat yang digunakan berukuran 5 X 10 cm, maka chamber yang digunakan adalah chamber dengan ukuran yang sesuai dengan ukuran plat. Kemudian penjenuhan chamber dilakukan dengan cara memasukkan 10 ml larutan pengembang TB ke dalam chamber yang telah di berisi sebuah kertas saring kemudian chamber ditutup rapat dengan penutupnya selama kurang lebih 30 menit. Fungsi penambahan kertas saring ke dalam chamber saat proses penjenuhan chamber adalah untuk mengetahui chamber tersebut sudah jenuh atau belum. Apabila chamber telah jenuh, maka kertas saring dalam chamber tersebut akan terbasahi seluruhnya oleh larutan pengembang TB. Namun, dalam prakteknya tentu saja akan sangat sulit melihat kejelasan penjenuhan ini. Sebab terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi, seperti ukuran kertas saring yang digunakan bervariasi sehingga kecepatan terbasahinya kertas saring juga akan berbeda pula. Semakin kecil ukurannya akan semakin cepat terbasahi dan diasumsikan telah terjenuhinya chamber. Namun jika ukuran kertas saring yang digunakan lebih besar maka tentu saja akan menyebabkan lebih lamanya kertas saring itu terbasahi sehingga waktu penjenuhan chamber akan lebih lama. Oleh karena itu digunakan parameter waktu saja yaitu waktu penjenuhan selama 30 menit. Untuk volume larutan pengembang (eluen) TB yang dimasukkan ( 10 mL) harus lebih rendah dari spot noda pada plat (< 1cm) nantinya saat plat dimasukkan ke dalam chamber agar spot noda yang ditotolkan tidak larut ke bawah dan dapat terelusi sempurna. Selain itu penjenuhan chamber harus dilakukan pada tempat yang datar dan bebas dari getaran sehingga penjenuhan berjalan lebih efektif.