Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật

Các thử nghiệm sinh Các thử nghiệm sinh hóahóa

GV: Nguyễn Văn Hạnh

Chương 4

Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSV

Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa.

Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV:◦Cách truyền thống◦Sử dụng các bộ KIT◦Sử dụng các thiết bị tự động

Thử nghiệm khả năng lên Thử nghiệm khả năng lên menmenMục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các

nguồn CH của các VSVNguyên tắc: VSV sử dụng CH tao acid

giảm pH môi trườngCác loại carbonhydrate

◦ Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose …◦ Dicarbonhydrate: sucrose, lactose …◦ Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose◦ Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO◦ Các loại đường rượu: chứa chức -OH

Phenol Red Carbohydrate Phenol Red Carbohydrate BrothBroth

Hấp ở 115oC trong 15 phút

Trang 104

Thử nghiệm khả năng lên Thử nghiệm khả năng lên menmen

Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm

VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH thay đổi màu chất chỉ thị phenolred

Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng

Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ

Thử nghiệm CitrateThử nghiệm Citrate

Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất.

Cở sở sinh hóa:

◦VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm hóa MT

◦VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT

Thử nghiệm CitrateThử nghiệm Citrate

Môi trường Simmon citrate agar (tr. 105)

Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g

Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g

NaCl 5g

Sodium citrate 2g

MgSO4 0,2g

Bromothymol blue 0,08g

Agar 13g

Thử nghiệm CitrateThử nghiệm CitrateChú ý

- Cấy lượng sinh khối vừa đủ - Có đối chứng trắng đi kèm

Đối chứng trắng

Pứ âm tính Pứ dương tính

Thử nghiệm UreaseThử nghiệm UreaseMục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease

Cơ sở sinh hoá:(NH2)2CO + H2O 2 NH3 + CO2

tăng pH môi trường đỏ phenol (vàng – đỏ)

Môi trường sử dụng:◦Urea Broth (Rustigian – Stuart)◦Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)

Môi trường Urea BrothMôi trường Urea Broth

Thực hiện◦Chuẩn bị môi trường◦Cấy VSV vào 5ml môi

trường◦ủ 37oC/24 giờ◦Quan sát

Thử nghiệm UreaseThử nghiệm Urease

Thử nghiệm khả năng sinh Thử nghiệm khả năng sinh HH22SS

Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2SCơ sở sinh hóa:

Acid amin chứa S H2S

Thiosulfate H2S

H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS)

desulfohydrase

thiosulfate reductase


Để phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giống Proteus

Môi trường sử dụng:

◦KIA, TSI (thạch nghiêng)

◦SIM, PIA (thạch sâu)

◦BSA (thạch đĩa)

Cấy vsv lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48h)


Đọc kết quả:

Xuất hiện màu đen trong môi trườngKhông xuất hiện màu đen trong môi trường

(+)

(-)

(+)ĐC


(+) (+)(-)

Pancreatic digest of casein (casitone)

20.0 g

Peptic digest of animal tissue (beef extract)

6.1 g

Ferrous ammonium sulfate

0.2 g

Sodium thiosulfate 0.2 g

Agar 3.5 g

Thử nghiệm khả năng sinh Thử nghiệm khả năng sinh IndolIndol

Mục đíchPhát hiện các VSV có khả năng sinh indol các VSV có hệ emzym tryptophanase

Chủng VSVChủng VSV MT canh tryptonMT canh trypton

Thuốc thử Kovac’s

Pứ dương tínhPứ dương tính Pứ âm tínhPứ âm tính

37oC / 24h

Thử nghiệm khả năng sinh Thử nghiệm khả năng sinh IndolIndol

Là phản ứng giúp phân biệt◦E. coli (+) với Klebsiella (-)◦Proteus mirabilis (-) với Proteus khác

(+)◦Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)…

Đối chứng (+) Proteus rettgeri (-) Serratia

marcescens

Thử nghiệm KIA/TSIThử nghiệm KIA/TSIKIA: Kligler iron agar (trang 99)

Pepton 20gLactose 20gGlucose 1gNaCl 5gFeric ammonium citrate 0,5gSodium thiosulphate 0,5gAgar 15gPhenol red 0,025gNước cất 1 lít

pH 7,4±0,2

Thử nghiệm KIA/TSIThử nghiệm KIA/TSITSI: Triple sugar iron agar (trang 106)

Pepton 20gLactose 10gSucrose 10gGlucose 1gNaCl 5gFeric ammonium sulphate o,2gSodium thiosulphate 0,2gAgar 13gPhenol red 0,025gNước cất 1 lít

pH 7,4±0,2

Thử nghiệm KIA/TSIThử nghiệm KIA/TSI

Mục đích: phát hiện khả năng◦sử dụng các nguồn cacbonhydrate◦sinh H2S

◦tạo hơi (gas)

Ủ 37oC/24 giờỦ 37oC/24 giờQuan sát:

Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S

Thử nghiệm KIA/TSIThử nghiệm KIA/TSI

11 22 33 44 55 66 77 88 1100

99 1111ĐC

Thử nghiệm MR (Methyl red)Thử nghiệm MR (Methyl red)Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và

duy trì các acid bền trong quá trình lên men glucose.

Cơ sở sinh hóa:◦ Chất chỉ thị pH: methyl red

◦ MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid

◦ MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính

Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC

dưới 4,4 5,0 – 5,8 trên 6,0

Thử nghiệm MR (Methyl Thử nghiệm MR (Methyl red)red)

Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth)

Chủng VSVChủng VSV

ủ 2 – 5 ngày

37oC

Pứ âm tínhPứ âm tính Pứ dương tínhPứ dương tính ĐCĐCMR-VP brothMR-VP broth

Thử nghiệm VP (Voges – Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)Proskauer)Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản

phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men glucose

Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn.2 pyruvate acetoin + 2 CO2

Thử nghiệm VP (Voges – Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)Proskauer)

Môi trường sử dụng: MR-VPPhương pháp tiến hành:

◦Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP◦Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC◦Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ◦Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4

giờ.

Thử nghiệm VP (Voges – Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)Proskauer)

Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng(+) : Enterobacter cloacea(-) : E. coli

Đọc kết quả:(+): màu đỏ trên môi

trường(-): mặt môi trường không

đổi màu (+)(-)

Thử nghiệm Bile EsculinThử nghiệm Bile Esculin

Mục đích: xác định khả năng thủy giải glucoside esculin thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật.

Cơ sở sinh hoá:◦Esculin là hợp chất nhân tạo◦Esculetine được phóng thích phản ứng

với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đen

Môi trường Bile Esculine Môi trường Bile Esculine AgarAgarBeef extract 3g

Pepton 5g

Esculin 1g

Mật bò (Oxgall) 40g

Ferric citrate 0,5g

Agar 15g

Nước cất 1 lít

Glucose

Esculetine

Phân tử Esculine

Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine

Thử nghiệm Bile EsculinThử nghiệm Bile Esculin

Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+)

Thử nghiệm MalonateThử nghiệm MalonateMục đích

Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng malonate như nguồn carbon duy nhất

Cơ sở sinh hoáMalonate là chất cạnh tranh với succinateKhi VSV phân hủy được malonate thì cũng phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác tạo thành sp kiềm làm tăng pH môi trường

Thử nghiệm MalonateThử nghiệm Malonate

Môi trường sử dụng:

Malonate broth (bromothymol blue)

Dương tính: MT chuyển màu xanh da trời

Âm tính: MT không đổi màu và không sinh khối

(+)

(-)ĐC

pH <6,0 6,0 – 7,6 pH >7,6

Thử nghiệm catalaseThử nghiệm catalase

Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzym catalase.

Cơ sở sinh hoá: ◦Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí

tùy ý

◦ H2O2 H2O + O2 (bọt khí)

(hydrogen peroxide)

catalase


Thực hiện◦VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)◦Đặt VSV lên lam kính sạch◦Nhỏ H2O2 30% ◦Quan sát sau 1-2 giây Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện



Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H2O2 30%

Thử nghiệm Thử nghiệm decarboxylasedecarboxylase

Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm carboxyl ở một số acid amin

Cấu trúc của phân tử Amino acid

3 thử nghiệm quan trọng◦Lysine decarboxylase (LDC)◦Ornithine decarboxylase (ODC)◦Arginine decarboxylase (ADC) /

Arginine dehydrolase (ADH)

Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng, chỉ được tạo ra khi trong môi trường nuôi cấy có cơ chất tương ứng

Cơ sở sinh hoá◦Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường

đổi màu chất chỉ thịMôi trường sử dụng:

Decacboxylase Basal Mediumchỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8)

Thử nghiệm decarboxylase

pH <5,2 5,2 – 6,8

pH >6,8

Biểu hiện sinh hoáDương tính: pH môi trường tăngÂm tính: pH giảm

MT trước khi MT trước khi cấycấy

Pứ dương tínhPứ dương tính Pứ âm tínhPứ âm tính

Thử nghiệm decarboxylaseThử nghiệm decarboxylase

THỬ NGHIỆM COAGULASETHỬ NGHIỆM COAGULASE

Mục đích: Thử nghiệm khả năng làm đông tụ huyết tương bởi enzyme coagulase

Là bước cuối trong định danh các giống Staphylococcus

Chủng đối chứng (+): S. aureus

(-): S. epidermidisThử nghiệm tiến hành với huyết tương và

fibrinogen.

THỬ NGHIỆM COAGULASETHỬ NGHIỆM COAGULASEThử nghiệm bằng 2 cách

Thử trên phiến kính

Đọc kết quả

Giọt nước Sinh khối vsv Huyết tương người+ +

Thử nghiệm trong ống nghiệm:

0,5ml huyết tương

0,5ml huyết dịch sinh khối

Ủ và đọc kết quả mỗi

30 phút

THỬ NGHIỆM COAGULASETHỬ NGHIỆM COAGULASE

Kết quả thử nghiệm Coagulase

(+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương

(-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất

Thử nghiệm gelatinaseThử nghiệm gelatinaseMục đích: thử nghiệm khả năng phân giải

gelatine bởi gelatinase.Cơ sở sinh hóa:

Gelatine polypeptide + acid amin

Gelatine trong môi trường dinh dưỡng môi trường đông đặc

VSV phân hủy gelatine môi trường lỏng

gelatinase

Thử nghiệm gelatinaseThử nghiệm gelatinase

Đối chứng dương: Aeromonas hydrophila

âm: E. coliMôi trường sử dụng Nutrient GelatineDạng ống nghiệm thạch sâuCấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng.

Thử nghiệm gelatinaseThử nghiệm gelatinase

Đọc kết quả(+) môi trường tan chảy(-) môi trường không tan chảy

TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓATN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA

Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển hoá glucose theo các con đường khác nhau

Cơ sở sinh hóa:◦Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường

acid cao◦Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí


Môi trường sử dụng: Oxidation/Fermentation media (Hugh & Leifson media)

Chỉ thị pH: bromocresol purplepH <5,2 5,2 –

6,8pH >6,8


Trực khuẩn gram âm

O (oxidation) Pseudomonas aeruginosa

F (fermentation) Serratia marcescens

Cầu khuẩn gram dương

O (oxidation) Micrococcus luteus

F (fermentation) Staphylococcus aureus

TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓAHÓA

Đọc kết quả:

A: đối chứng

B: phản ứng Ôxi hóa

C: phản ứng lên men

Thử nghiệm nitratase (khử Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)nitrate)

Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrate

Cở sở sinh hóa:

3 2 3 2 2, , , , nitrataseNO NO NH N NH OH NO

NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine hydrochloride chất màu hồng

NO3 + bụi kẽm màu hồng


Phương pháp tiến hành:◦Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi

trường chứa nitrate◦Bổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện

diện của nitrite◦Phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung

lượng kẽm nhỏ để định tính nitrate


Thử nghiệm oxydaseThử nghiệm oxydase

Mục tiêu: phát hiện VSV có hệ enzym oxydase (hệ cytochrom C)

Cơ sở sinh hoáCytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C ôxi hoá +

H2O

Cytochrom C ôxi hoá + TMPD khử TMPD ôxi hoá (màu xanh)


Thuốc thử◦ TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p-

phenylenediamine◦ Bảo quản lạnh trong tối◦ Thời hạn bảo quản: 2 tuần

Đối chứng (+): Serratia marcescens (-) : Proteus rettgeri


Thực hiện:◦Lấy VSV từ Nitrient Agar đặt lên giấy thấm◦Nhỏ thuốc thử TMPD◦Quan sát sau 30 giâyPhản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanhPhản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng


Thử nghiệm ONPGThử nghiệm ONPG

Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß-galactosidase – enzyme cảm ứng.

Cơ sở sinh hóa: ONPG o-nitrophenol

Màu vàngMàu vàngKhông màuKhông màu

Thử nghiệm ONPGThử nghiệm ONPG

Lactose agarLactose agar

Chủng VSVChủng VSV 2ml ONPG broth2ml ONPG broth Pứ (+)Pứ (+) Pứ (-)Pứ (-)

ủ qua đêm

37o

C

Màu vàngMàu vàng

Thử nghiệm khả năng tan Thử nghiệm khả năng tan huyếthuyếtMục tiêu: phát hiện các vi sinh

vật có khả năng làm tan hồng cầu◦Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ …

Cơ sở sinh hoá: ◦Các heamolysine là các tác nhân làm

tan hồng cầu động vật◦Vi sinh vật khác nhau heamolysine

khác nhau cường độ và biểu hiện tan hồng cầu khác nhau

Thử nghiệm khả năng tan Thử nghiệm khả năng tan huyếthuyếtPhân loại: 3 kiểu tan huyết

◦Tan huyết hoàn toàn (ß): vòng tan huyết trong, rõ

◦Tan huyết không hoàn toàn (α):xung quanhvà dưới khuẩn lạc chuyển đục và có màu khác

◦Không tan huyết (ɣ): hoàn toàn không tan huyết

Thử nghiệm CAMPThử nghiệm CAMP

Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan huyết giữa các VSV

Cơ sở sinh hóa:◦S. aureus tiết β-lysin gay tan hồng cầu◦VSV tiết CAMP gây tan huyết◦β-lysin + CAMP gây tan huyết mạnh,

hoàn toànÝ nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus

nhóm B (+) với Streptococcus nhóm khác (-)

Staphylococcus aureus

Streptococcus agalactiae

Streptococcus pyogenes

(+)

(-)

Thử nghiệm tính di độngThử nghiệm tính di động

Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật.

Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm maoCác tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật

vào môi trường thạch mềm (0,5% agar).◦Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục,

phát triển lan ra khỏi vết cấy.◦Vi sinh vật không di động sẽ phát triển

quanh đường cấy, môi trường không bị đục.

Thử nghiệm tính di độngThử nghiệm tính di động

(+) (+)(-)

Ứng dụng thử nghiệm sinh Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa để định danh VSVhóa để định danh VSV

Mỗi loài vsv có những đặc tính sinh hóa khác nhau

Thực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh hóa có thể giúp xác định tên loài (định danh) vi sinh vật đó.

Bảng sinh hóa dùng định danh các loài vi sinh vật đường ruột (trang 23)

Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E(bioMerieux, Inc)

Documents

Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật