Upload
maria-inggrit-christiyanti
View
808
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
PANDUAN PRAKTIKUMMIKROBIOLOGI (BIO 202P)
Disusun oleh :
Maria Dwi Budi Jumpowati
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
JURUSAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2010
ACARA I
ASISTENSI PRAKTIKUM
A. JADWAL DAN MATERI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI T.A. 2010/2011
MATERI SUB POKOK BAHASAN WAKTU
Asistensi 1. Penjelasan materi dan tata tertib praktikum2. Evaluasi dan penilaian praktikum3. Pengenalan nama dan fungsi alat4. Tayangan video prosedur kerja praktikum
7 September
Dasar-dasar Teknik Mikrobiologi
1. Sterilisasi2. Pembuatan Media Pertumbuhan (Media
Padat dan Cair)3. Teknik Pemindahan Mikrobia
14 Sept & 21 Sept
Dasar-dasar Teknik Mikrobiologi
1. Pengenalan Mikrobia di Alam2. Teknik Biakan Murni
28 Sept & 5 Okt
Identifikasi Mikrobia Secara Morfologi
1. Morfologi Sel Bakteri : Macam-macam Pengecatan Bakteri
2. Morfologi Koloni Bakteri3. Morfologi Sel Fungi
12 Okt, 19 Okt & 26 Okt
Identifikasi Mikrobia Secara Biokimia
1. Pengujian Mikrobia Secara Biokimia2. Identifikasi Bakteri Tak Dikenal
2 Nov, 9 Nov & 16 Nov
Pertumbuhan Mikrobia (tentatif)
1. Pengukuran Pertumbuhan Secara Langsung2. Pengukuran Secara Tidak Langsung (Viable
Count)3. Penentuan Kurva Pertumbuhan
23 Nov & 30 Nov
REVIEW
B. TATA TERTIB
a. Mahasiswa diharuskan memakai jas praktikum berwarna putih dengan rapi dan sopan.
b. Mahasiswa bekerja secara berkelompok sesuai pengelompokan yang telah ditentukan, dan
masing-masing mahasiswa diharapkan proaktif untuk belajar.
c. Mahasiswa diharuskan bekerja secara terencana, hati-hati dan teliti. Setelah selesai
praktikum, alat-alat maupun bahan yang digunakan harus dikembalikan dalam kondisi
bersih dan utuh.
d. Mahasiswa yang memecahkan, merusakkan dan atau menghilangkan alat diharuskan
melapor ke dosen/assisten jaga dan mengganti alat tersebut secepatnya.
e. Mahasiswa diharuskan menjaga kemurnian bahan-bahan yang dipakai dan menjauhkan
segala macam kontaminan yang dapat mengganggu kevalidan hasil praktikum.
f. Tidak ada inhal.
2
g. Setelah selesai pelaksanaan dan pengamatan praktikum, mahasiswa wajib membuat
laporan data sementara yang akan dikoreksi oleh dosen pendamping. Laporan sementara
yang sudah disetujui assisten bisa langsung dibawa pulang untuk dibuat laporan resmi
mata acara praktikum pada hari itu. Pengamatan dilakukan sesuai kebutuhan dan waktu
yang telah ditentukan.
h. Untuk mengikuti praktikum minggu berikutnya diharuskan sudah menyerahkan laporan
resmi perseorangan dari acara praktikum minggu sebelumnya. Bila pada saat itu tidak
menyerahkan laporan, nilai laporan = 0.
i. Bila mahasiswa berhalangan dan tidak dapat mengikuti acara praktikum yang
menyebabkan nilai-nilainya kosong, maka nilai akhir adalah seluruh nilai yang ada dan
kemudian dikonversi berdasar standart nilai yang telah ditetapkan.
C. PENILAIAN (terintegrasi dengan nilai teori) :
a. Unsur yang dinilai dalam praktikum :
Pretest (lesan) 15 %
Postest (lesan) 15 %
Diskusi 20 %
Aktivitas 20 %
Laporan 30 %
b. Konversi : Nilai Total (N)
N 75,00 = A
60,00 N 75,00 = B
45,00 N 60,00 = C
30,00 N 45,00 = D
N 30,00 = E
D. LAIN- LAIN :
Hal-hal yang belum diatur di sini, akan disampaikan kemudian.
PROSEDUR BAKU PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
3
Setiap praktikan akan selalu berhubungan dengan mikroba patogen selama menjalankan
Praktikum Mikrobiologi. Untuk mencegah hal-hal yang tidak diinginkan, setiap praktikan
diharuskan mentaati peraturan yang telah ditetapkan dan menjalankan petunjuk yang diberikan
assisten/dosen jaga.
1. Tas dan benda-benda lain yang tidak diperlukan diletakkan pada tempat yang disediakan.
Jangan sekali-kali meletakkannya di atas meja laboratorium!
2. Seka-lah baik-baik meja laboratorium dengan desinfektan sebelum dan sesudah kegiatan
laboratorium.
3. Cucilah tangan anda baik-baik dengan air dan sabun sebelum dan sesudah kegiatan
laboratorium. Lakukan hal yang sama bila anda meninggalkan laboratorium untuk ke toilet atau
bila anda ke luar dari ruangan laboratorium.
4. Jangan merokok, makan atau minum di ruang laboratorium.
5. Jauhkan tangan anda dari mulut, hidung, mata dan telinga selama anda bekerja di laboratorium.
6. Perlakukan semua organisme yang anda tangani sebagai patogen atau mampu menimbulkan
penyakit. Kebanyakan biakan yang disediakan laboratorium tidak berbahaya, tetapi beberapa di
antaranya berbahaya.
7. Anda tidak diperkenankan membawa keluar biakan mikroba apa pun dari ruangan
mikroba/ruangan laboratorium.
8. Usahakan supaya mikroba yang anda tangani tidak tercecer dan tidak tercampur dengan
mikroba lain.
9. Bila biakan yang sedang anda pindahkan tercecer ke lantai atau di meja praktikum, tuangkan
desinfektan di atasnya, seka dengan kertas tissue/kapas dan buang di tempat yang disediakan
untuk bahan-bahan bukan kaca yang terkontaminasi.
10. Bila anda memecahkan tabung berisi mikroba, tuangkan desinfektan ke atasnya, sapukan dan
buang di tempat yang disediakan untuk pecahan kaca atau tuangkan spiritus dan kemudian
bakar.
11. Bila anda terkontaminasi atau terluka, hubungi assisten/dosen jaga.
12. Buanglah sampah-sampah yang tidak terkontaminasi di tempat yang disediakan.
13. Jarum inokulasi dan ose harus disterilkan dengan cara memijarkan seluruh panjang kawatnya
sebelum dan sesudah setiap penggunaan. Percikan biakan dapat dihindarkan dengan cara
memulai pemanasan di dalam kerucut api sebelah dalam yang berwarna lebih biru.
14. Apabila pipet yang sama perlu digunakan lebih dari 1 kali, jangan meletakkannya langsung di
atas meja di antara penggunaan, tetapi letakkanlah pada penyangga pipet yang telah tersedia.
15. Api pada pembakar bunsen harus dimatikan pada waktu tidak digunakan.
16. Biakan yang tidak diperlukan lagi serta bahan-bahan bekas pakai yang mempunyai potensi
bahaya harus diletakkan dalam tempatnya masing-masing yang disediakan sebagai berikut :
4
a. Cawan petri, labu dan reaksi diletakkan di tempat yang disediakan.
b. Pipet harus diletakkan dalam wadah berisi desinfektan
c. Kaca obyek dan penutupnya harus diletakkan dalam tempat-tempat khusus yang telah
diberi desinfektan. Bakteri yang ada pada kaca obyek belum tentu mati semuanya
sekalipun telah difiksasi dengan panas, jadi berhati-hatilah menanganinya.
d. Jangan sekali-kali membuang biakan di tempat cuci.
17. Kurangi bercakap-cakap selama praktikum, agar tidak merugikan pekerjaan sendiri atau rekan
lain.
18. Setiap pengerjaan praktikum dan pengamatan harus dicatat dengan cermat.
19. Setiap praktikan diwajibkan membersihkan mikroskop dan mengembalikan ke tempat semula
setelah digunakan, selain itu praktikan diharuskan untuk membersihkan meja kerja, memeriksa
nyala api dan listrik dipadamkan, menutup kran air dan gas, mencuci tangan dengan
desinfektan/lysol, kemudian melapor ke assisten/dosen jaga.
20. Cucilah jas laboratorium dan masker anda sehingga selalu bersih pada waktu anda datang
kembali ke laboratorium pada waktu berikutnya.
ACARA I
PENGENALAN ALAT DAN FUNGSINYA
5
Tujuan : mengenal bermacam-macam alat dan cara penggunaannya pada praktikum mikrobiologi
Beberapa alat yang perlu diketahui fungsinya adalah sebagai berikut :
1. Jarum ose/ loop/sengkelit digunakan untuk menanam mikroba dengan cara goresan/streak
2. Batang bengkok/spreader/batang Drigalsky digunakan untuk menanam mikroba dengan
cara sebar/pulasan/spread
3. Jarum enten digunakan untuk mengambil mikroba berupa biakan jamur/fungi
4. Jarum inokulasi/needle digunakan untuk menanam mikroba dengan cara tusukan
5. Microbiological Safety Cabinet (MSC) adalah ruang/lemari tempat menanam mikroba
6. Autoklaf digunakan untuk sterilisasi alat/bahan/media tertentu dengan menggunakan uap
panas bertekanan (moist heat).
7. Colony counter untuk menghitung jumlah koloni mikroba dan mungkin ukurannya.
8. Mikroskop digunakan untuk pemeriksaan suatu sediaan secara mikroskopis.
9. Inkubator digunakan untuk inkubasi media yang telah ditanami mikrobaa dan untuk
menyimpan bahan pemeriksaan di mana mikroba yang terkandung akan mati bila disimpan
dalam lemari es.
10. Lemari pendingin/refrigerator digunakan untuk menyimpan media steril yang siap pakai
agar isi dan mutu media tersebut tidak berubah, menyimpan untuk sementara waktu
bahan/spesimen yang belum sempat diperiksa agar tidak mengalami perubahan dan
menyimpan cakram antibiotik/antibiotic disk yang belum dipakai agar tidak mengalami
perubahan.
11. Alat-alat lain yang perlu diketahui di laboratorium mikrobiologi : mikropipet, pelobang
sumuran, haemositometer, cawan petri, lampu bunsen, kaca obyek, kaca obyek cekung,
oven, shaker incubator, shaker resiprok, vortex, glass pin, kaca penutup, pinset, gelas arloji,
disk blank, disk antibiotik, filter bakteri, tabung durham, tabung bentuk U.
Pertanyaan:
1. Tuliskanlah alat-alat apa saja yang digunakan di Lab Mikrobiologi yang belum disebutkan
diatas, juga fungsinya!
2. Tuliskan prinsip kerja autoklaf!
ACARA II
DASAR - DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI.
6
Tujuan :
1. Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh suatu media
untuk pertumbuhan mikroba.
2. Mempelajari macam-macam teknik sterilisasi
3. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis.
4. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba.
5. Mengenal bermacam-macam mikroba di alam
B. DASAR TEORI DAN PROSEDUR KERJA :
1. Media dan Cara Pembuatan Media
Pembiakan mikrobia di laboratorium memerlukan media yang berisi zat hara serta
lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroba. Media adalah suatu bahan yang digunakan
untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat makanan. Selain untuk
menumbuhkan mikroba, media dapat juga digunakan untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat-
sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Lay, 1994; Jutono dkk, 1980).
Syarat media yang baik untuk pertumbuhan mikroba adalah lingkungan kehidupannya harus
sesuai dengan lingkungan pertumbuhan mikroba tersebut, yaitu : susunan makanannya (media
harus mengandung air untuk menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat/metabolisme, juga
mengandung sumber karbon, mineral, vitamin dan gas), tekanan osmose yaitu harus isotonik,
derajat keasaman/pH umumnya netral tapi ada juga yang alkali, temperatur harus sesuai dan steril.
Media harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu: sumber energi
(contoh: gula), sumber nitrogen, juga ion inorganik essensial dan kebutuhan yang khusus, seperti
vitamin (Jawetz dkk, 1996).
Berdasarkan komposisi kimianya, media dapat dibedakan menjadi media sintetik yaitu
media yang susunan kimianya diketahui dengan pasti, medium ini biasanya digunakan untuk
mempelajari kebutuhan makanan mikroba. Media non sintetik (kompleks) yaitu media yang
susunan kimianya tidak dapat diketahui dengan pasti, media ini digunakan untuk menumbuhkan
dan mempelajari taksonomi mikroba. Berdasarkan konsistensinya media dapat dibedakan menjadi :
media cair, media padat, dan media padat yang dapat dicairkan (Lay, 1994; Jutono dkk, 1980;
Jawetz dkk, 1996).
Alat dan bahan :
a. Media Nutrien Agar (NA) (Oxoid)
b. Media Nutrien Broth (NB) (Oxoid)
c. Aquades
d. Cawan petri
e. Tabung reaksi
7
f. Batang pengaduk, pipet volume, erlenmeyer, penangas/elemen pemanas
Cara kerja :
1. Timbang media NA (Oxoid) dan NB (Oxoid) sesuai prosedur di kemasan. (Catatan :
Buatlah 50 ml media NA untuk setiap kelompok kecil praktikum dan 50 ml media NB
untuk satu golongan praktikum). Penimbangan media dilakukan secara teliti dan cepat,
kemudian serbuk media dimasukkan secara hati-hati ke dalam erlenmeyer.
2. Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk
3. Panaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen pemanas sampai media
tercampur homogen (ditunjukkan dengan warna yang kuning jernih). Perhatian :pada saat
pemanasan jangan sampai terbentuk buih berlebihan sampai meluap!
4. Sebelum diotoklaf, tuangkan media NA dengan volume tertentu menggunakan pipet volume
: 5 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA miring, 10 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA
tegak, 15 ml untuk NA dalam cawan petri untuk percobaan 4b (metode isolasi pour plate),
sisanya untuk NA dalam cawan petri untuk percobaan 6 (pengenalan mikroba di alam).
Tutup tabung reaksi dengan kapas atau penutup tabung (penutupan jangan terlalu rapat!)
5. Sebelum diotoklaf, tuangkan NB ke dalam tabung reaksi untuk 6 kelompok praktikum
dalam 1 golongan. Masing-masing tabung reaksi @ 8 ml. Tutup tabung reaksi dengan kapas
atau penutup tabung (penutupan jangan terlalu rapat!)
6. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan autoklaf selama
15 menit, tekanan 1 atm 121oC. Pelajari cara mengoperasikan autoklaf dengan benar!
7. Setelah diotoklaf : media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak tabung
dan biarkan memadat, media NA 5 ml inkubasikan miring dan biarkan memadat. Media sisa
NA tuangkan dalam cawan petri dan biarkan memadat (untuk percobaan 6 : pengenalan
mikroba di alam). Media NA 15 ml dibiarkan sampai suhu 45-50oC (untuk percobaan 4b
: metode isolasi pour plate).
8. Media NB dalam tabung reaksi biarkan dingin. Seluruh media NA dan NB ini akan
digunakan untuk percobaan selanjutnya.
2. Sterilisasi
Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan dari segala
macam bentuk kehidupan terutama mikroba (termasuk spora mikroba). Penyelidikan sesuatu
spesies mikroba selalu didasarkan atas penyelidikan sifat biakan murni spesies tersebut. Oleh
karena itu, untuk dapat memisahkan kegiatan mikroba yang satu dengan mikroba lainnya, atau
untuk memelihara sesuatu mikroba secara biakan murni, perlu digunakan alat-alat dan medium
yang steril. Suatu benda atau substansi hanya dapat steril; tidak akan pernah mungkin setengah
steril atau hampir steril (Pelczar, 1988)
8
Ada beberapa cara yang umum yang dipakai dalam sterilisasi yaitu: panas, bahan kimia, dan
penyaringan. Macam sterilisasi yang digunakan tergantung pada macamnya bahan dan sifat bahan
(ketahanan terhadap panas, bentuk bahan yang disterilkan : padat, cair atau berbentuk gas).
i. Sterilisasi dengan panas, paling banyak digunakan, dapat dibedakan menjadi 3 jenis, yaitu:
1) Dengan pemijaran, umumnya digunakan untuk mensterilkan jarum platina, ose dan
lainnya.
2) Dengan udara panas kering (dry heat) untuk mensterilkan alat-alat gelas, seperti
erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, dan alat-alat gelas lainnya.
3) Dengan udara panas lembab (moist heat) yaitu dengan uap air panas bertekanan, alat
yang digunakan disebut autoklaf. Sterilisasi ini merupakan cara sterilisasi yang paling
baik, biasanya digunakan untuk mensterilkan media kultur.
ii. Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi), bahan-bahan lain yang sangat peka terhadap
pemanasan (serum, antibiotika, toksin, vitamin dll) atau relatif tidak tahan terhadap
pemanasan yang tinggi (medium yang mengandung senyawa gula dll) tidak dapat
disterilkan dengan pemanasan, untuk keperluan ini dipakai filter bakteri.
iii. Sterilisasi dengan bahan kimia, bahan-bahan yang mudah rusak bila disterilkan pada suhu
tinggi (dari plastik) dapat disterilkan secara kimiawi dengan menggunakan bahan kimia, gas
atau radiasi. Bahan kimia ialah suatu substansi (padat, cair atau gas) yang dicirikan oleh
komposisi molekuler yang pasti dan menyebabkan terjadinya reaksi, contohnya : senyawa
fenolik, alkohol, klor, iodium, dan etilen oksida. Beberapa bahan kimia yang dapat
digunakan untuk sterilisasi gas yaitu: etilen oksida, asam perasetat, formal dehida dan
glutaral dehida alkalin (Pelczar, 1988; Volk & Wheeler, 1988; Hugo & Russell, 1987).
Prosedur Kerja :
Lakukan prosedur sterilisasi sesuai dengan alat-alat praktikum yang digunakan dalam Acara I
3. Teknik - Teknik Pemindahan Kultur Mikroba
Untuk mencegah tercemarnya biakan murni, perlu diadakan teknik aseptik pada waktu
memindahkan mikroba. Dalam percobaan-percobaan ini akan dipelajari cara-cara memindahkan
biakan murni dengan cara aseptik.
Alat dan bahan :
1. Media NA miring dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)
2. Media NA tegak dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)
3. Media nutrien cair atau NB dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)
4. Jarum ose
5. Jarum inokulasi
6. Kultur murni bakteri E. coli
9
7. Lampu bunsen
8. Vortex mixer
Cara kerja:
1. Siapkan media NA dan NB hasil percobaan 1 (media NA miring, media NA tegak dan
media NB/cair). Pemindahan kultur mikroba dilakukan satu persatu untuk masing-masing
media.
2. Longgarkankan tutup dari masing-masing tabung reaksi yang berisi media (jangan di
lepaskan!).
3. Pegang tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri E. coli di tangan kiri.
4. Pegang jarum ose pada tangan kanan dan bakar di atas nyala lampu bunsen hingga kawat
memijar. Perhatian : pemanasan jarum ose dilakukan dari pangkal ke ujung sampai
memijar, sebelum digunakan kawat didinginkan beberapa saat!
5. Pegang ose menggunakan ibu jari dan jari telunjuk, gunakan jari kelingking untuk membuka
tutup tabung reaksi (tutup tabung reaksi tetap dipegang seperti posisi semula).
6. Bakar mulut tabung reaksi, masukkan jarum ose dan ambil 1 ose biakan bakteri.
7. Bakar kembali mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali.
8. Ambillah tabung reaksi yang akan diinokulasi dengan tangan kiri, dengan cara yang sama
buka tutup tabung reaksi, dan bakar mulut tabung reaksi.
9. Inokulasikan biakan bakteri pada tabung reaksi inokulasi dengan cara goresan zigzag pada
permukaan NA miring.
10. Bakar mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali, kemudian bakar ose.
11. Beri label : tanggal percobaan, nama bakteri, teknik pemindahan dan nama kelompok.
12. Lakukan dengan cara yang sama untuk media nutrien cair/NB menggunakan jarum ose dan
media agar tegak secara tusukan tegak lurus menggunakan jarum inokulasi.
13. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.
4. Teknik-teknik Isolasi atau Penanaman Mikroba
Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktor-faktor nutrisi serta kebutuhan akan
oksigen (gas, O2 atau udara). Cara menumbuhkan mikroba yang anaerob sangat berbeda dengan
yang aerob. Mengisolasi suatu mikroba ialah memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya di
alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Untuk isolasi harus
diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat
lain untuk pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980).
Mikroba jarang terdapat di alam dalam keadaan murni. Kebanyakan merupakan campuran
bermacam-macam spesies mikroba. Macam-macam cara mengisolasi dan menanam mikrobia
adalah : 1). Spread plate method (cara tebar/sebar), 2). Streak plate method (cara gores), 3). Pour
plate method (cara tabur).
10
a. Spread Plate Method (Cara Tebar/Sebar)
Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur
mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat.
Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi
sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap,
sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-
300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung.
Alat dan bahan :
1. Spreader/batang bengkok/batang Drigalsky
2. Pipet volume, lampu bunsen
3. Media NA dalam cawan petri
4. Kultur murni bakteri E. coli
5. Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0,9%)
Cara kerja :
1. Buatlah pengenceran 10-1 – 10-6 dari kultur murni bakteri dengan larutan pengencer.
2. Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan bakar leher tabung.
3. Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media NA dalam cawan petri.
4. Bakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan dingin.
5. Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan sampai
permukaan agar mengering.
6. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik selama 24 jam
pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.
7. Bandingkan pertumbuhan dari tiap-tiap pengenceran.
b. Pour Plate Method (Cara Tabur)
Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur
45-50oC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan
petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang
mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980)
Alat dan bahan:
1. Media NA dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)
2. Cawan petri steril
3. Kultur murni bakteri E. coli
4. Pipet volume, lampu bunsen
Cara kerja:
11
1. Dinginkan media NA dalam tabung reaksi sampai suhu ± 45 - 500C (cirinya : terasa hangat
di kulit/tidak ‘kemranyas’).
2. Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher botol.
3. Pindahkan 1 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi yang mengandung NA secara
aseptis.
4. Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah mengandung kultur
murni bakteri ke dalam cawan petri.
5. Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA sampai homogen.
Penggoyangan petri jangan terlalu kuat. Pada saat penuangan media, petri bisa diletakkan
dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api (zona steril).
6. Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam. Inkubasi terbalik
dilakukan setelah agar memadat. Amati pertumbuhannya.
c. Streak Plate Method (Cara Gores)
Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar
sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Cara ini dasarnya ialah
menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan medium agar yang
sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni
terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk,
1980). Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang
memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan lempengan
yang basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan agar yang benar-benar kering
permukaannya (Lay, 1994)
Alat dan bahan :
1. Media NA dalam cawan petri
2. Kultur murni bakteri E. coli)
3. Jarum ose
4. Lampu bunsen
Cara kerja :
1. Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan. Gunakan ose yang
telah dingin untuk menggores pada permukaan media agar dalam cawan petri.
2. Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan media agar dimulai pada
satu ujung. Perhatikan teknik penggoresan!
Ose disentuhkan pada permukaan media agar dalam cawan petri, sewaktu menggores ose
dibiarkan meluncur di atas permukaan agar.
12
3. Setiap kali menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih dahulu dan
biarkan dingin.
4. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati pertumbuhannya.
5. Pengenalan Mikroba di Alam
Berbagai mikroba seringkali dijumpai di berbagai lingkungan di alam, baik di air, tanah
maupun udara. Percobaan ini bertujuan untuk mengenali macam-macam mikrobia yang ada di alam
seperti bakteri, yeast dan fungi.
Alat dan bahan :
1. Media NA dalam cawan petri (hasil percobaan 1)
2. Aquades steril
3. Cotton bud
4. Spidol
Cara kerja:
a. Cawan petri berisi NA (hasil percobaan 1) dibagi menjadi 4 bagian.
b. Basahi cotton bud dengan air, usap permukaan lantai dan inokulasikan pada cawan petri
(1/4 bagian, beri beri kode 1).
c. Letakkan jari anda pada cawan petri bagian 2 (kode 2).
d. Basahi cotton bud lainnya dan usapkan pada bagian dalam pipi (selaput mukosa mulut),
inokulasikan pada cawan petri (kode 3).
e. Pada bagian ke-4 pada cawan, basahi cotton bud yang lain dan inokulasikan pada tempat-
tempat di sekitar anda yang dimungkinkan terdapat mikroba (misal permukaan kulit yang
berkeringat, permukaan tembok, jendela, atau permukaan alat-alat yang lain).
f. Inkubasi secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam pada suhu kamar dan amati
pertumbuhannya.
g. Amati dan bedakan mikroba yang mungkin tumbuh, apakah bakteri, yeast atau fungi.
C. PERTANYAAN-PERTANYAAN DISKUSI :
1. Apa fungsi agar pada media pertumbuhan?
2. Sterilisasi adalah upaya pengendalian mikroba. Apa tujuan pengendalian mikroba?
3. Pemijaran merupakan salah satu macam sterilisasi secara ………..
Bagaimana prinsip kerjanya?
4. Mengapa pada waktu inkubasi cawan petri harus diletakkan terbalik?
5. Jelaskan prinsip dasar dan tujuan teknik isolasi mikroba secara streak plate, pour plate dan
spread plate!
6. Apa yang dimaksud dengan kultur murni/biakan murni?
13
7. Bagaimana teknik penggoresan yang benar pada teknik isolasi secara streak plate agar
supaya didapatkan koloni bakteri terpisah?
8. Sebutkan mikroba yang tumbuh dan Anda temukan di alam dalam praktikum ini!
Bagaimana ciri-ciri/karakter morfologi untuk membedakan mikroba-mikroba tersebut!
9. Pertanyaan lain dapat diberikan assisten/dosen.
14
ACARA III
III. 1. MORFOLOGI SEL : MACAM-MACAM PENGECATAN
Tujuan: - mempelajari jenis-jenis pengecatan bakteri
Pembuatan pulasan bakteri
1. Labellah objek gelas yang kering dan bersih. Sterilkan jarum ose dengan membakar diatas
pembakar spirtus.
2. Jika kultur dalam bentuk cairan (suspensi), ambillah 1 ose penuh dan letakkan ditengah-tengah
objek gelas dan ratakan.
3. Jika kutur dalam medium padat, ambillah dengan jarum ose satu bagian kecil kultur dan letakkan
ditengah objek gelas yang sebelumnya telah diberi air dan ratakan.
4. Biarkan kering dengan mengangin-anginkan objek gelas.
5. Fiksasi pulasan bakteri dengan menggunakan bahan kimia atau dengan melewatkan diatas
pembakar spirtus (hati-hati, jangan sampai terlalu kering), tergantung jenis pengecatannya.
A. Pengecatan Gram
Pengecatan ini dikembangkan pertama kali oleh Christian Gram (1884) dan termasuk
pengecatan differensial, karena dapat membedakan bakteri yang bersifat gram positif dan gram
negatif.
Dari segi pewarnaan perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif dapat diamati
dengan jelas. Bakteri Gram positif mengikat cat utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak
dapat dilunturkan oleh cat peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan (safranin), hal ini
disebabkan karena sifat dinding sel dan sitoplasmanya, yang mempunyai afinitas kuat terhadap
kompleks crystal violet dan iodine (jodium). Bakteri Gram negatif tidak mengikat cat utama secara
kuat, sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan.
Perbedaan sifat bakteri Gram positif dan gram negatif tidak mutlak tegas dan spesifik, tetapi
masih tergantung pada beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam pengecatan Gram.
Alat dan bahan:
1. Objek gelas
2. mikroskop
3. Crystal violet
4. Larutan iodine
5. Alkohol 95%
6. Safranin.
7. Minyak immersi
8. Campuran kultur B. subtilis dan E. coli
15
Cara kerja :
1. Buatlah pulasan bakteri diatas objek gelas, keringkan dan fiksasi dengan api.
2. Teteskan cat crystal violet dan diamkan 30-60 detik.
3. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir.
4. Teteskan larutan iodine dan diamkan selama 1-2 menit.
5. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan peluntur) dengan alkohol
(kira-kira 20 detik, hati-hati jangan sampai berlebihan yang mengakibatkan kesalahan hasil).
6. Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin selama 10-20 detik.
7. Cuci kembali dengan air, angin-anginkan dan amati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat,
menggunakan minyak immersi.
B. Pengecatan Acid Fast (Ziehl Neelsen)
Pertama-tama dikembangkan oleh Ehrlich pada tahun 1882, yang kemudian dikembangkan
oleh Ziehl dan Neelsen. Pengecatan acid fast bertujuan untuk membedakan bakteri yang tahan
terhadap pencucian asam (acid fast) dan yang tidak tahan terhadap pencucian asam.
Bakteri tahan asam umumnya mempunyai kandungan lemak kompleks yang tinggi didalam
dinding selnya, hal ini membuat mereka bersifat hidrofobik dan sulit untuk di cat. Penggunaan
carbolfuchsin bersamaan dengan pemanasan membuat lapisan lemak menjadi lunak sehingga cat
dapat menembus ke dalam sel. Selain itu fenol (yang melarutkan fuchsin) lebih mudah larut dalam
lemak dari pada air.
Alat dan bahan :
1. Gelas obyek
2. Mikroskop
3. Cat Ziehl Neelsen carbolfuchsin
4. Peluntur (Alkohol 95%)
5. Metylen blue
6. Kultur Nocardia dan E. coli
Cara kerja :
1. Buatlan pulasan bakteri, dan fiksasi di atas pembakar spiritus.
2. Tutupkan dengan sepotong kertas filter, tambahkan larutan carbolfuchsin, panaskan di atas
pembakar spiritus dengan nyala kecil (hati-hati!), diamkan selama 5-10 menit.
3. Dinginkan, cuci dengan air mengalir dan angin-anginkan.
4. Cuci dengan larutan peluntur sambil digoyang-goyangkan sampai seluruh tak nampak.
5. Cuci dengan air mengalir, keringkan.
6. Bubuhkan dengan cat penutup (metylen biru), selama 20-30 detik.
7. Cuci, keringkan dan amati dengan perbesaran kuat menggunakan minyak immersi.
16
C. Pengecatan Dinding Sel
Pengecatan dinding sel dilakukan dengan menggunakan crystal violet. Dinding sel berwarna
violet, sedangkan sel, akan berwarna ungu muda.
Alat dan bahan:
1. Objek gelas
2. Alkohol 95 %
3. Asam tannic
4. Crystal violet
5. Kultur B. subtilis
Cara kerja:
1. Buatlah pulasan bakteri dan fiksasi dengan alkohol 95% selama 15 menit.
2. Cucilah dibawah air mengalir.
3. Tambahkan asam tannic, biarkan selama 15 menit.
4. Cuci dibawah air mengalir.
5. Tambahkan larutan cat 0,02% crystal violet selama 2 menit.
6. Cuci dan amati dengan perbesaran kuat dengan menggunakn minyak immersi.
D. Pengecatan spora
Sifat spora bakteri adalah tahan terhadap bahan-bahan kimia, sehingga sulit dilakukan
pengecatan spora. Spora dapat dicat dengan menggunakan metylen biru, acid fast atau dengan
pengecatan khusus untuk spora.
Tidak semua bakteri dapat membentuk spora, dan ukuran spora dapat bermacam-macam,
lebih kecil, sama atau lebih besar dari sel vegetatif nya. Letaknya juga bermacam-macam; ditengah
(sentral), diujung sel (terminal) atau subterminal (disebut juga parasentral, jika spora terletak
diantara tengah-tengah dan ujung sel).
Alat dan bahan:
1. Objek gelas
2. Malachite green 5%
3. Safranin
4. Mikroskop
5. Minyak immersi
6. Kultur E. coli dan B. subtilis
Cara kerja:
1. Buatlah pulasan bakteri dan fiksasi diatas pembakar spirtus.
2. Tetesi dengan Malchite green dan panasi (kira-kira 1 menit).
17
3. Cuci dengan air mengalir dan tambahkan cat safranin selama 30-40 detik.
4. Cuci dan amati dengn perbesaran kuat. Spora bakteri akan berwarna hijau.
E. Neisser' s Method
Metoda ini digunakan untuk mengecat granula-granula metakromatik atau volutin yang
merupakan bahan cadangan makanan. Umumnya graula-granula ini banyak terdapat pada sel-sel
yang telah tua dan sel yang telah terhenti pertumbuhannya.
Alat dan bahan:
1. Objek gelas
2. Neisser's metylen biru
3. Neisser's iodine (jodium)
4. Neutral red
5. Kultur Nocardia
Cara kerja:
1. Buatlah pulasan bakteri dan fiksasi dengan panas.
2. Bubuhi dengan Neisser's metylen biru selama 3 menit.
3. Cuci dengan air, tetesi dengan Neisser's iodine selama 1 menit.
4. Cuci dengan air, kemudian lakukan pengecatan dengan menggunakan Neutral red.
5. Cuci dibawah air mengalir. Amati dibawah mikroskop.
Granula volutin akan tampak berwarna biru.
Pertanyaan:
1. Apa fungsi minyak imersi pada pengamatan 1000x atau lebih?.
2. Apakah kelemahan pengecatan gram?
F. Gerakan Bakteri
Tujuan: Untuk melihat pergerakan bakteri di bawah mikroskop maupun pada media pertumbuhan.
Beberapa spesies bakteri yang mempunyai flagella atau filamen yang panjang yang ada
didalam larutan mengadakan pergerakan. Pergerakan ini dapat diamati secara langsung pada
metoda tetes gantung atau secara tidak langsung dengan tusukan.
1. Tetes Gantung / Hanging Drop
Alat dan bahan:
1. Gelas benda dan penutup
2. Tusuk gigi
18
3. Vaselin
4. Biakan murni E. coli dan S. typhimurium
Cara kerja:
1. Dengan menggunakan tusuk gigi, tempatkanlah 4 gumpalan vaselin pada objek gelas kira-kira
seluas ujung-ujung gelas penutup.
2. Letakkan 1 ose kultur pada gelas penutup (jika media padat, tambahkan kultur dengan air).
3. Balikkan gelas benda pada gelas penutup dengan hati-hati sedemikian sehingga ujung-ujung
vaselin pada gelas benda berlekatan dengan gelas penutup.
4. Balikkan dengan hati-hati gelas benda.
5. Amati dengan perbesaran lemah dan dengan menutup sebagian difragma (hati-hati dengan
adanya gerakan "brownian")
2. Cara Tusukan
Alat dan bahan:
1. Tabung reaksi yang berisi 0,2-0,4% agar.
2. Biakan murni E. coli dan S. typhimurium
Cara kerja:
1. Inokulasikan masing-masing biakan bakteri pada media agar yang telah steril dengan
menggunakan jarum inokulasi secara tusukan.
2. Inkubasikan pada temperatur kamar selama 24-48 jam.
3. Amati hasil pertumbuhan dan gambarkan.
Pertanyaan:
1. Bandingkan kedua metoda diatas yang digunakan untuk mendeterminasi pergerakan bakteri.
19
III.2. MORFOLOGI KOLONI MIKROBA
Tujuan: mengenal bermacam-macam bentuk koloni bakteri berdasarkan konsistensi media
pertumbuhannya.
Bentuk-bentuk koloni bakteri digunakan untuk mempermudah identifikasi dan determinasi
suatu biakan murni bakteri. Morfologi-morfologi koloni bakteri dapat dibedakan atas bentuk,
ukuran, tekstur, warna koloni.
Bentuk-bentuk koloni tergantung pada konsistensi medianya. Pada media cair sifat bakteri
pada oksigen sangat mudah dilihat dan penampakan koloninya dapat dibedakan menjadi: serabut,
cincin, dan selaput. Demikan pula pada media agar tegak atau miring, mempunyai bentuk yang
spesifik.
A. Medium Cair
Alat dan bahan:
1. Tabung reaksi
2. Ose
3. Biakan murni bakteri B. subtilis dan E. coli dalam nutrien agar miring
4. Medium nutrien cair
Cara kerja:
1. Siapkan medium yang telah disterilkan.
2. Inokulasikan biakan murni dengan menggunakan ose pada medium cair
3. Inkubasikan pada temperatur 370C selama ± 48 jam
4. Amati pertumbuhan pada permukaan media, kekeruhan, bau dan ada tidaknya endapan.
B. Medium Nutrien Agar Tegak
Alat dan bahan:
1. Tabung reaksi
2. Jarum inokulasi
3. Biakan murni bakteri E. coli dan B. subtilis
4. Medium nutrien agar
Cara kerja:
1. Siapkan medium yang telah disterilkan.
2. Inokulasi biakan murni dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan sampai ke dalam
tabung.
3. Inkubasikan pada temperatur 370C/suhu kamar selama 48 jam
20
4. Amati pertumbuhannya, merata atau tidak (permukaan, dasar atau keseluruhan), bentuk
pertumbuhan pada bekas tusukan (filiform, echinulate, bead, villous).
C. Medium Nutrien Agar Miring
Alat dan bahan:
1. Ose
2. Medium nutrien padat
3. Biakan kultur bakteri E. coli dan B. subtilis
Cara kerja:
1. Medium yang telah disterilkan diinokulasi dengan biakan murni bakteri dengan menggunakan
ose secara goresan.
2. Inkubasi pada temperatur 370C selama 48 jam.
3. Amati pertumbuhan, tipis, sedang, lebat atau tidak ada, bentuk pertumbuhan pada goresan,
elevasi, kilat, topografi, warna, bau, dan konsistensinya.
D. Media Nutrien Agar (Cawan Petri)
Alat dan bahan:
1. Spreader
2. Cawan NA
3. Kultur E. coli dan B. subtilis
Cara kerja:
1. Inokulasikan 0,1 ml kultur bakteri (perhatikan pengencarannya) pada media NA secara spread
plate.
2. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar, selama 24 jam.
3. Amati pertumbuhan kedua bakteri dan bandingkan.
Pertanyaan:
1. Untuk pengamatan morfologi, pertumbuhan pada media manakah yang paling valid digunakan.
2. Pertumbuhan pada media cair biasanya digunakan untuk melihat sifat apa?.
21
III. 3. MORFOLOGI FUNGI
Fungi adalah mikroorganisma eukariotik, yang dapat berbentuk uniseluler, disebut yeast
(khamir) ataupun multiseluler, disebut mold (jamur). Dinding sel dari fungi sebagian besar tersusun
atas chitin, selulosa, dan glucan. Mereka tidak dapat mengadakan fotosintesa dan hidup secara
saprofitik. Apapun bentuknya, baik uni atau multiseluler, kesatuan individual dari fungi disebut
thallus.
Fungi yang tumbuh memanjang seperti filamen disebut hifa, dan jika jumlahnya banyak dan
berkoloni disebut miselium. Menurut fungsinya hifa dapat dibedakan menjadi: hifa fertil, hifa yang
dapat membentuk sel-sel reproduktif atau badan buah dan hifa vegetatif, hifa yang berfungsi
mencari makanan kedalam substrat.
A. Jamur
1. Pengamatan langsung
Alat dan bahan:
Petri mengandung biakan jamur
Cara kerja:
Pindahkan tutup petri dan amati secara langsung atau menggunakan loupe, gambarkan dan jelaskan.
2. Preparat basah
Alat dan bahan:
1. Gelas benda dan gelas penutup
2. Mikroskop
3. Biakan jamur: Aspergilus sp, Penicillium sp, Mucor sp, dan Rhizopus sp.
Cara kerja:
1. Bersihkan gelas benda, dan tetesi dengan metylen blue.
2. Ambillah sedikit biakan jamur dengan jarum preparat.
3. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran sedang.
4. Gambar dan beri keterangan.
B. Khamir
Merupakan fungi bersel satu yang mikroskopik yang tidak membentuk pertumbuhan dengan
miselium. Sebagian khamir termasuk dalam kelas Ascomycetes, sebagian kecil termasuk kelas
Basidiomycetes dan Fungi imperfecti. Umumnya khamir berkembang biak dengan budding (tunas).
Khamir mempunyai ukuran 4-20 x lebih besar dari bakteri, tergantung dari spesiesnya.
Dindingnya terdiri dari khitin, dan dibawah dinding sel terdapat membran sitoplasma yang bersifat
permeabel selektif.
22
Morfologi khamir secara mikroskopi dapat diamati baik dengan melakukan pengecatan
maupun tidak. Pengamatan morfologi sel-sel yang masih hidup biasanya digunakan biakan murni
yang masih muda (berumur 24-48 jam). Pengecatan dapat menggunakan pengecatan negatif
ataupun menggunakan pengecatan khusus.
Alat dan bahan:
1. Gelas benda dan penutup
2. Mikroskop
3. Methylen blue
4. Biakan khamir: S. cerevisiae dan Schizosacc. octoporus atau S. pombe.
Cara kerja:
1. Bersihkan gelas benda dan penutup.
2. Letakkan 1 ose biakan khamir ditengah-tengah gelas benda dan campurkan dengan 1 tetes
larutan methylen blue.
3. Tutup dengan gelas penutup, hati-hati jangan sampai terbentuk gelembung.
4. Amati dengan perbesaran lemah dan kuat.
5. Bandingkan kedua jenis sel tersebut diatas (terutama cara pembelahannya).
Pertanyaan:
1. Apa perbedaan antara S. cerevisiae dengan Schizosacc. pombe?.
2. Apa perbedaan antara Rhizopus dan Mucor?.
23
ACARA IV
IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA BIOKIMIA DAN DETERMINASI BAKTERI
Bahan:
1. 2 buah petri yag berisi 2 macam bakteri, gram negatif dan gram positif.
2. Bahan pengecatan gram3. H2O2
4. Objek gelas.
5. Bahan untuk oksidase test.
6. Bahan untuk O-F test
7. NA tegak
8. Bahan untuk sitrat test
9. Bahan untuk test dekarboksilase lisin
10. Gelatin
11. TSI.
12. KCN test
13. Test fermentasi karbohidrat
14. Test untuk pembentukan indol
15. Test VP
16. Test urea
Cara kerja:
1. Test untuk tabel I :
a. Pengecatan gram
Lakukanlah pengecatan gram seperti cara yang telah diberikan.
b. Test katalaseLetakkan 1 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada objek gelas dan tambahkan 1 ose kultur dari
koloni tunggal. Amati, test positif jika timbul buih seketika.
c. Test oksidase
Letakkan 2-3 tetes larutan tetramethyl-paraphenyldiamine pada keras saring. Ambillah sampel
dari koloni tunggal dan letakkan pada kertas saring yng telah ditetesi reagen. Amati, reaksi positif
terjadi jika timbul warna ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit.
d. Test O-F (Oksidasi-Fermentasi)
Inokulasikan media O-F yang mengandung glukosa ( yang ditutup dengan parafi lunak dan
yang tidak ditutup) secara tusukan. Amati setelah 24 jam. Oksidase (terbentuk warna kuning pada
tabung yang tidak ditutup) terjadi pada organisme yang aerobic dan fermentasi ( pada tabung yang
ditutup dengan parafin) terjadi pada anaerobic.
24
e. Test pergerakan
Dengan menggunakan Hanging Drop metode.
2. Test untuk tabel II
a. Penggunaan sitrat
Menggunakan media Koser sitrat, mikroorganisme diinokulasi, kemudian diinkubasi pada
370C selama 48 jam.
b. Test dekarboksilase lisin
Pada medium yang mengandung lisin dan kontrol diinokulasi secara tusukan dan diinkubasi
pada 370C selama 24-48 jam. Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu-kuning dan kembali ke
ungu, sementara pada kontrol dari ungu-kuning.
c. Hidrolisis gelatin
Dengan cara tusukan, inokulasikan mikroorganisme pada media yang mengandung gelatin
sekurang-kurangnya 72 jam pada temperatur 370C. Positif berarti terjadi pencairan.d. Pembentukan H2S.
Dengan menggunakan TSI medium, positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hitam.
Inkubasikan selama 24-48 jam.
e. KCN
Inokulasikanlah KCN broth, tutuplah botol dan inkubasikan ada 370C selama 24 jam. Adanya
kekeruhan menunjukan pertumbuhan yang berarti positif. Catatan: test ini harus dibaca setelah 24
jam, kemungkinan terjadi kesalahan jika terjadi penguapan KCN.
f. Fermentasi karbohidrat.
Inokulasikan media yang mengandung karbohidrat dengan 2 tetes kultur. Inkubasikan selama
24-48 jam. Hasil positif jika terjadi perubahan warna.
g. Pembentukan indol
Inokulasikan tripton atau air pepton dengan 2 tetes kultur tak dikenal. Inkubasikan pada 370C
selama 48 jam. Tambahkan reagen Kovac pada tabung bagian bawah. Adanya warna merah/merah
muda menunjukkan adanya pembentukan indol.
h. VP (Voges Proskauer)
Inokulasikan mikroorganisme pada VP media dan inkubasikan selama 48 jam. Tambahkan 0,6
ml larutan nafto 5% dilanjutkan 0,2 ml KOH 40%. Kocoklah, longgarkan tutupnya, kocok kembali,
ulangi setiap 5 menit, bacalah perubahan warnanya setelah 10-15 menit. Bila tes positif, terjadi
warna merah agak muda.
i. Urease
Inokulasikan urea broth yang mengandung indikator fenol merah dengan 1 tetes kultur.
Amatilah perubahan warna menjadi merah setealah 24 jam pada temperatur 370C
3. Lengkapilah tabel dibawah ini
25
Gram pos Gram neg
Bentuk
PergerakanTumbuh dengan adanya O2
Katalase
Oksidase
Gukosa
O-F test
Identifikasi
Gram neg
Penggunaan sitrat
KCN
Hidrolisis gelatin
Arabinosa
Laktosa
Sukrosa
Adonitol
Dulcitol
Mannitol
Inositol
IndolH2S
Urease
Dekarboksilase lisin
Kontrol dekarboksilase
Identifikasi
Pertanyaan:
1. Mengapa untuk identifikasi bakteri pengecatan gram perlu dilakukan?
26