OSNOVI GENETIKE

skripta za studente

Poljoprivrednog fakulteta u Kruševcu

docent dr Vesna Perišić

2019.

Poštovani studenti, ova skripta napisana je u želji da vam približim problematiku koju sam predstavila na predavanjima predmeta Genetika i oplemenjivanje. Skripta je nerecenzirana i nelektorisana i kao takva služi za internu upotrebu prilikom spremanja ispita. Izvori za pisanje ove skripte su mnogobrojni. Nisu navedeni izvori fotografija i skica, Nije mi bila namera da se oštete ničija autorska prava. Skripta nije rađena zbog komercijalne dobiti i služiće isključivo i samo za edukacijske svrhe.

Disclaimer: Sources of photographs and sketches were not quoted. I don′t have intention to harm any rights. The manuscript was not written for commercial gain and will be used only for educational purposes.

Sadržaj ISTORIJSKI RAZVOJ GENETIKE 1 NAUČNE DISCIPLINE GENETIKE 2 EKSPERIMENTALNA GENETIKA 3 ĆELIJA I HROMOZOMI 4

Hromozomi 7 GEN, GENOTIP, FENOTIP 10

Multipli alelizam 12 Inkompatibilnost kod biljaka 13

MENDELOVI ZAKONI 14 Dihibridno ukrštanje 16 Test ukrštanje dihibrida 18

GENI I NJIHOVE INTERAKCIJE

20

INTERAKCIJE GENSKIH ALELA 20 Dominantnost i recesivnost: 20

Intermedijarnost (nepotpuna dominantnost): 20

Kodominantnost: 21

INTERAKCIJE NEALELNIH GENA 22 Epistaza

25

Aditivnost (sabirno dejstvo gena) 27 STRUKTURA I FUNKCIJA GENETSKOG MATERIJALA

DNK: Struktura, replikacija i varijacija 29

Struktura nukleinskih kiselina 30 Struktura DNK 32

Replikacija DNK (DNA) 33

Struktura RNK 36 Geni 38 Transkripcija 39 Genetički kod 41 Translacija 42

DEOBA ĆELIJE I OPLODNJA 47 Mitoza – kariokineza (ekvaciona deoba) 47 Mejoza 50 Gametokineza kod životinja 54 Makrosporogeneza i mikrosporogeneza 55 Oplodnja kod biljaka 57

REKOMBINACIJE GENA 59 Vezani geni 59

MUTACIJE 64 Genske mutacije 65 Hromozomske mutacije - Aberacije 68

1

Istorijski razvoj genetike

Razvoj genetike kao naučne discipline može smestiti u prethodnih 100 godina. Ljudi su, doduše nesvesno, primenjivali genetičke principe od najranijih ljudskih civilizacija. Kao dokaz ove tvrdnje može se uzeti proces pripitomljavanja biljaka i životinja, započet pre 10.000 - 12000 godina u oblasti Srednjeg istoka. Prvi odomaćeni organizmi bili su pšenica, grašak, sočivo, ječam, pas, koza i ovca. U drevnoj Asiriji i Vavilonu, pre 4.000 godina, radom čoveka je stvoreno nekoliko stotina sorti urmi, različitih po vremenu sazrevanja, veličini i boji ploda, ukusu i dr.

Stari Grci su veliku pažnju poklanjali reprodukciji i naslednosti kod čoveka. Grčki filozofi su razvili koncept pangeneze, po kojem su posebne čestice (gemule) bile nosioci informacija iz različitih delova tela u reproduktivne organe iz kojih su se prenosile na embrion u momentu stvaranja. Iako naučno netačan, ovaj koncept se održao sve do početka 19. veka. Stari Rimljani su sa uspehom razvili veliki broj metodoloških postupaka u oblasti oplemenjivanja biljaka i životinja, zasnovanih na eksperimentima.

Može se smatrati da je genetika, kao biološka nauka koja se bavi proučavanjem nasleđa promenljivosti i uzroka ontogenetskog razvića, u savremenom smislu značenja, započeta serijom principa i analitičkih procedura 1860. godine.

Najznačajniji momenti u naučnim otkrićima koji su doveli do nastanka genetike su: Hooke je otkrio ćeliju (1665). Grew je izneo dokaze o polnom razmnožavanju biljaka (1676), putem muških i ženskih polnih ćelija. Mendel je utvrdio osnovne principe nasleđivanja (1866) i smatra se osnivačem (ocem) genetike. Brown je opisao ćelijsko jedro (1833). Schleiden i Schwann su predložili osnove teorije o ćeliji (1839), po kojoj je sav život sastavljen od ćelija; ćelije nastaju samo iz prethodno postojećih ćelija i ćelija predstavlja osnovnu jedinicu strukture i funkcije u živim organizmima. Miescher (1869) utvrdio prisustvo dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) u jedru ćelije. Flemming je prvi posmatrao deobu hromozoma i na osnovu toga dao detaljan opis mitoze (1879), pri čemu je pretpostavio da su u jedru smeštene nasledne informacije. Darwin je u publikaciji O poreklu vrsta (1859) objavio teoriju o evoluciji kroz prirodno odabiranje, čime je negirano božansko poreklo živih bića (kreatizam). Sutton i Boveri su utvrdili da su geni, kao jedinice nasleđivanja, smešteni na hromozomima (1902). Morgan je otkrio prve genetičke mutante voćne mušice - Drosophila melanogaster (1910) i razjasnio mnoge nepoznanice u prenošenju naslednih informacija. Fisher, Haldane i Wright su, u prvoj polovini 20. veka, postavili osnove populacione genetike povezujući klasičnu (Mendelovu) genetiku i teoriju evolucije. Hershy i Chase (1952) dokazali da je DNK prenosilac genetičke informacije. Watson i Crick, uporedo sa Wilkins i Franklin, opisali su trodimenzionalnu strukturu DNK (1953), započinjući eru molekularne genetike.

2

Izvedeni prvi eksperimenti sa rekombinantnom DNK (1973). Gilbert i Sanger su razvili prve metode za sekvencioniranje DNK (1977). Mullis (1944) je započeo rad na razvoju lančane reakcije polimeraze (PCR - polymerase chain reaction), metode za brzo umnožavanje malih količina dostupne DNK. Očitan prvi genom živog organizma - bakterije Haemophilus influenzae (1995), metodom sekvencioniranja, a godinu dana kasnije i genom eukariotskog organizma (kvasac). Objavljen prvi, nepotpuni prikaz ljudskog genoma (2000), pri čemu je potpuno sekvencioniranje završeno 2003. godine.

Pojednostavljeno rečeno, genetika je nauka koja se bavi proučavanjem prirode strukture, funkcije, kombinacija i prenošenja gena kod organizama.

NAUČNE DISCIPLINE GENETIKE U toku intenzivnog razvitka od oko osamdeset godina, genetika se razgranala na veći broj naučnih disciplina. Definisanje ovih disciplina mora se izvršiti na dosledan način, što ne znači da oblast koju zahvata jedna od tih disciplina ne zalazi i u druge koje se bave nešto drukčijom problematikom.

Najpogodnije je podelu na genetičke discipline izvršiti na osnovu nivoa organizacije žive materije koja se proučava.

- Molekularna genetika proučava molekulsku strukturu gena i njihovo funkcionisanje u zavisnosti od te strukture. Ispitivanje funkcionisanja gena se u ovom slučaju ograničava na utvrđivanje procesa nastanka njihovih primarnih produkata (tj. jedne od RNK) i na procese prenošenja genetičke informacije preko tih primarnih produkata na stvaranje odgovarajuće strukture molekula proteina, koji predstavlja osnovni rezultat aktivnosti svakog gena. Pojam biohemijska genetika upotrebljava se često kao sinonim pojmu molekularna genetika, mada sa nešto širim značenjem. - Citogenetika izučava mehanizme promenljivosti i nasleđivanja osobina kroz analizu mikroskopske građe i funkcije pojedinih organela ćelije. Posebno intenzivna istraživanja vrše se na hromozomima, kao osnovnim nosiocima naslednih faktora. - Genetika razvića (ili fiziološka genetika) proučava na koji se način kod jedinki – pripadnika pojedinih vrsta ostvaruje razviće određenih osobina, i kako dolazi do toga da delovi tela sa istom genetičkom konstitucijom sasvim različito mogu da izgledaju, tj. „diferenciraju“ se u toku razvića. - Populaciona genetika izučava odnose u genetičkoj strukturi pojedinih grupa organizama, utvrđujući razlike i sličnosti među populacijama iste vrste, kao i uzroke i poreklo nastanka evolucionih adaptacija kod organizama.

U okviru svake od navedenih disciplina naučnici se mogu baviti nizom specifičnih problema. Na primer, u okviru molekularne genetike postoji genetika nukleinskih kiselina ili genetika proteina ili se istraživači bave procesima koji se na molekularnom nivou dešavaju u jednoj od organela (genetika ribozoma, jedarceta-nukleolusa i sl.). U okviru citogenetike, posebno mesto pripada izučavanju promena koja se dešavaju u strukturi hromozoma (mutaciona genetika), mada se ove promene izučavaju i na molekularnom nivou. U okviru

3

genetike razvića može se izdvojiti imunogenetika, genetika starenja ili genetika ponašanja. U okviru populacione genetike može se imati evolucioni pristup (evoluciona genetika), ili se može izučavati uticaj sredine na promenu genetičkog sastava populacije (ekološka genetika).

Podela može da se vrši i prema metodologiji koja se upotrebljava u eksperimentalnom radu, pa postoji, na primer, genetiku zračenja (radijaciona genetika), matematičku, biometrijsku genetiku, itd. Česta je podela prema objektu na kome se istraživanja vrše. Tako razlikujemo, u najopštijem: genetiku mikroorganizama, genetiku biljaka, genetiku životinja i genetiku čoveka. Treba istaći da su genetičari u svojim dosadašnjim istraživanjima koristili sasvim ograničen broj vrsta, tj. da su ispitivanja vršili uglavnom na za to najpogodnijim predstavnicima živih organizama. Tako se može reći da se neko bavi na primer genetikom sisara, insekata, protozoa, algi ili virusa ili još preciznije npr. genetikom drozofile (vinska mušica), pčela, žitarica, neurospora ili genetikom virusa koji izaziva rak.

Danas se sve veća pažnja posvećuje i primeni genetičkih istraživanja, pa razlikujemo na primer kosmičku, veterinarsku, poljoprivrednu ili farmakogenetiku, a u okviru humane genetike – medicinsku, demografsku i eugeniku. Eugenetici se u poslednje vreme pridaje poseban značaj, a cilj joj je da se sa naučnog aspekta sagledaju perspektive čovekove evolucije tj. način kako da se smanji broj štetnih promena koje postoje u ljudskim populacijama (negativna eugenika), odnosno da se favorizuju i stvore uslovi za povoljne nasledne promene (pozitivna eugenika).

Iz sveg iznetog, može se zaključiti da je genetika nerazdvojivo povezana sa drugim biološkim disciplinama i da se služi metodama rada koje se koriste u drugim prirodnim naukama (u fizici i hemiji, prvenstveno), kao i u matematici. Bavljenje genetikom podrazumeva integraciju znanja iz sasvim različitih oblasti, a pred genetičare – istraživače postavljaju se veoma složeni problemi koji se sastoje u utvrđivanju uzroka i porekla specifičnih pojava koje se dešavaju u živim sistemima.

EKSPERIMENTALNA GENETIKA

Dosadašnji rezultati velikog broja ispitivanja sa različitim organizmima su jasno

pokazali da je proučavanje strukture i funkcije gena za razumevanje funkcionisanja bioloških sistema.Neophodno je precizno odrediti različite metode i tehnike rada pri istraživanjima, koje imaju za cilj upoznavanje mehanizama koji objašnjavaju kako geni utiču na svaki aspekt strukture i funkcije organizma, i kakve su mogućnosti da se identifikuju i odrede funkcije gena. Osnovne oblasti genetike kao što su molekularna evoluciona, populaciona, kvantativna su razvijene korišćenjem specijalizovanih znanja iz molekularne biologije, biohemije, statistike i drugih fundamentalnihnauka.

Genetičke analize su od značaja za celu biologiju, a ne samo za nasleđivanje svojstava u užem smislu reči, zbog čega je neophodno primenjivati različite metode ispitivanja gena i njihovih aktivnosti. Metode koje se koriste mogu se ukratko i uopšteno rezimirati na sledeći način: 1. Izolacija fenotipskih varijanti. Najčešće varijante koje se koriste u eksperimentalnim analizama su varijante koje poseduju ekstremne vrednosti svojstva koje se analizira. Svaka ekstremna varijanta, potencijalno predstavlja genetsku komponentu za sintezu budućih sistema. 2. Analiza potomstva kontrolisanog ukrštanja između fenotipskih varijanti. Ovaj tip analize koju je započeo još Mendel, identifikuje gene i njihove alele, njihove lokacije na hromozomima, način nasleđivanja i interakcije. 3. Proučavanje biohemijske osnove procesa koje u ćeliji kontrolišu specifični geni. Život je u osnovni kompleksan skup hemijskih reakcija, tako da je proučavanje načina na koji geni

4

kontrolišu ove reakcije značajan, posebno proučavanje alela koji kontrolišu defektnu biohemijsku reakciju. 4. Mikroskopska analiza. Citogenetička istraživanja strukture hromozoma i hromozomskih aberacija korišćenjem svetlosne, elektronske i fluorescentne mikroskopije u identifikaciji lokacije gena na hromozomima i produkata njihove ekspresije u jedru i citoplazmi. 5. Tehnologija rekombinantne DNK. U posebnom poglavlju su prikazane mogućnosti koje pruža ova tehnologija u genetičkim eksperimentima.

ĆELIJA I HROMOZOMI

Ćelija predstavlja osnovnu gradivnu i funkcionalnu jedinicu živog organizma, u kojoj su sadržane sve neophodne informacije za nastanak i razvoj novog organizma. Citologija je nauka koja se bavi proučavanjem ćelije. Svaka ćelija ima karakterističan oblik i veličinu. Organizmi mogu biti jednoćelijski i višećelijski.

Osnovna podela živih organizama, prema stepenu složenosti građe, izvedena je na dve glavne grupe:

1. prokariote (bakterije, modrozelene alge - Cyanophyceae i gljive Actinomycete) i 2. eukariote (više organizme).

Prokariote su jednoćelijski organizmi i odlikuju se relativno jednostavnom strukturom

ćelije (prosta ćelijska građa sa malim brojem prostijih organela). Ovi organizmi nemaju nukleus, obim ćelije je relativno mali (od 1 do 10 µm), nemaju membrane koje okružuju organele. Genom prokariota čini cirkularni (kružni) molekul DNK bez proteinskog omotača.

Eukariote unutar protoplazme poseduju ćelijske organele sa diferenciranim

membranama (endoplazmatični retikulum, ribozomi, plastidi, Goldžijev kompleks, lizozomi, centrozomi i vakuole), značajne za normalno funkcionisanje ćelije. Sa stanovišta genetike, glavna razlika u odnosu na prokariote je što eukariotske ćelije imaju jasno diferencirano jedro sa jedarcetom. Membrana jedra jasno okružuje genetički materijal (DNK) i odvaja ga od drugih gradivnih elemenata ćelije.

5

Druga značajna razlika između prokariota i eukariota zasniva se u načinu pakovanja (smeštanja) DNK u jedru.

U prokariotskim ćelijama, geni su smešteni, najčešće, na pojedinačnom molekulu DNK, koji predstavlja hromozom. Odstupanje od ovog pravila predstavljaju neke bakterije, koje imaju više od jednog hromozoma, kao i postojanje posebnih molekula DNK – plazmida, koji su nosioci važnih bakterijskih gena. U eukariotskim ćelijama, geni su razmešteni na većem broju, često pravolinijskih hromozoma DNK molekula. Manji broj eukariota poseduje u određenim organelama kružne hromozome DNK molekule sa manjim brojem gena na njima.

Virusi ne pripadaju ni prokariotima, niti eukariotima, s obzirom da nemaju ćelijsku strukturu. Poseduju spoljašnji proteinski omotač koji okružuje nukleinsku kiselinu (DNK ili RNK). Mogu se razmnožavati samo u ćelijama domaćina, što ukazuje na činjenicu da su prvi virusi nastali tek nakon razvoja (evolucije) prve ćelijske strukture. Takođe, među virusima je prisutna i određena diferencijacija s obzirom da geni biljnih virusa imaju više sličnosti sa genima iz biljnih ćelija, nego sa životinjskim virusima.

Suština procesa nasleđa, nasleđivanja i promenljivosti sadržana je u procesu reprodukcije organizma. Ćelija predstavlja osnovnu jedinicu organizma i nosilac je nasleđa i nasleđivanja što je nemoguće u potpunosti razumeti bez poznavanja njene fizičke i biohemijske prirode. Izučavanje uloge i funkcije ćelije i njenih organela kroz proces nasleđivanja i promenljivosti je osnovni zadatak citogenetike.

Ćelija se sastoji iz tri osnovne komponente: ćelijskog zida, citoplazme i jedra, svaka od navedenih komponenti ima svoju specifičnu građu i ulogu u integralnim procesima nasleđivanja, što će biti u daljem tekstu predstavljeno. JEDRO (NUCELUS)

Jedro (lat. nucelus, grč. karyon) je najveća i najznačajnija organela unutar ćelije jer je u njemu DNK kao nosilac genetičkih informacija, koje regulišu i kontrolišu mnoge značajne procese u životu ćelije (replikaciju, sintezu proteina, ćelijsko disanje). Nekada se smatralo da jedro predstavlja kesicu ispunjenu tečnošću u kojoj plivaju hromozomi. Međutim, danas se zna da se u jedru nalaze: jedarce, hromozomi i visoko organizovana unutrašnja struktura (jedarni matriks, sok, citoplazma).

Jedro se ne postoji kod zrelih eritrocita, ćelija spoljašnjeg sloja kože, ćelija očnog sočiva, sitastih ćelija floema kod cvetnica.

Kod eukariota jedro je obavijeno dvostrukom membranom (karioteka) koja odvaja sadržaj jedra od citoplazme, a veza između njih ostvaruju se preko pora u nuklearnoj membrani. Kod prokariota nema oformljenog jedra tako da nukleinske kiseline nisu odvojene od citoplazme i formiraju strukturu označenu kao nukleoid.

Većina vrsta ima jedno jedro – mononuklearne ćelije (alge, gljive, protozoe), ali postoje i ćelije koje su – binuklearne, i više – polinuklearne. Svaka ćelija eukariota ima jedno ili više jedara u toku trajanja njene aktivnosti, ili je jedro prisutno bar na nekom stupnju u toku ćelijske deobe. Za brojne vrste „nižih“ eukariota karakteristično je prisustvo dva ili više jedara. Po pravilu, gubitak jedra izaziva vrlo brzu smrt ćelije. Izuzetak u tom smislu su eritrociti sisara i ćelije floema kod cvetnica. Posle nestanka jedra eritrociti funkcionišu nekoliko meseci, dok se kod ćelija floema normalna funkcija bez jedra održava i u toku više godina.

Citoplazma jedra (karioplazma, nukleoplazma) ima veću gustinu od ćelijske citoplazme, što je posledica manjeg sadržaja vode. Neorganski joni, kao što su Na, K, Cl, nalaze se u jedru u znatno višoj koncentraciji, nego u citoplazmi. Unutar jedra nema

6

membrana, izuzev u slučajevima tranzita materijala u toku deobe jedra. Hromozomi i jedarce (nukleolus) nalaze se u nukleoplazmi. Nukleoplazma se sastoji od mreže proteinskih vlakana, partikula i fibrila različitih organskih i neorganskih materija. Ovaj matriks održava precizan prostorni raspored između jedarnih struktura, ali učestvuje i u replikaciji DNK, ekspresiji gena i modifikaciji produkata gena pre nego što napuste jedro.

Organizacija hromozoma u jedru zasniva na vezivanju različitih struktura hromozoma (centromera, telomera ili drugih heterohromatinskih regiona) za jedarnu membranu. Dakle, svi hromozomi imaju strogo određen položaj jedan prema drugom, a i prema jedru kao celini.

Razlikujemo 3 stanja jedra: - INTERFAZNO – period između dve deobe (u ćelijama koje su sposobne da se dele)

– ranije se nazivalo“mirujuće”; - MITOZNO –u procesu deobe, dolazi do identičnog udvajanja naslednog materijala i

njegove pravilne raspodele na dva jedra; - RADNO (metaboličko) – kod trajnih, diferenciranih ćelija, koje su prestale da se

dele, gde jedro vrši metaboličke funkcije.

JEDARCE – NUKLEOLUS Jedarce (nucleolus) predstavlja vidljivu strukturu jedra vidljivu pod mikroskopom,

koja ima vrlo specifičnu ulogu u kontroli genske aktivnosti. Najčešće je okruglastog oblika i bez membrane. Jedarce ima veoma gustu protoplazmu koja se sastoji od hromatina (kompleks nukleinskih kiselina i proteina) i mase granula ribonukleoproteina. Niz vrsta poseduje samo jedno jedarce, ali ima vrsta sa dva ili više jedaraca. Jedarce obrazuje posebna regija samo nekih hromozoma, nazvana nuklearni organizatori (Mc Clintock 1934).

Pod običnim (svetlosnim) mikroskopom moguće je ustanoviti korelaciju u veličini loptaste strukture bogate nukleinskim granulama – jedarceta i fiziološkog stanja ćelije. Nukleolus je najveći u ćelijama sa visokom aktivnošću (npr. sekretorno tkivo, neuroni...) a najmanje u inaktivnim ćelijama. U proseku, veličina jedarceta varira od 2 – 5 mikrometara. Nukleoidi bakterija, ćelije nekih algi, jedra ćelije embriona eukariota u najranijim stadijumima razvića, kao ni spermatozoidi viših organizama, ne sadrže jedarce. Jedarce nije odvojeno od ostalog dela nukleoplazme membranom.

Avers (1976) navodi da je pod elektronskim mikroskopom moguće razlikovati četiri ultrastrukturne zone jedarceta:

1. Granularna zona (ovu zonu Hay, 1968, naziva „pars granulosa“) koja sadrži sferične partikule, prečnika 15 – 20 nanometara – partikule (granule) nešto manjih dimenzija nego što su to potpuno formirani ribozomi eukariota.

2. Fibrilarna zona („pars fibrosa“) ima fibrile prečnika od 5 – 10 nanometara koje je dosta teško međusobno razlikovati. Kod ćelije sa visokom metaboličkom aktivnošću ova zona je vrlo izražena.

3. Obe zone i fibrilarna i granularna nalaze se u nestrukturnom matriksu, koji se može tretirati kao treća zona. Kroz matriks prolaze vrlo fine končaste tvorevine koje povezuju elemente fibrilarne i granularne zone.

4. Nukleolarni hromatin („pars chromosoma“) je četvrta zona jedarceta. Za ovaj hromatin se zna da su nukleolusi asocirani sa specifičnim hromozomskim mestima (lokusima) koji se nazivaju „organizatori jedarca“ (Mc Clintock, 1934).

U najprostijem slučaju, samo jedan hromozom (po haploidnoj garnituri) nosi ove specifične regione, tako da diploidne ćelije imaju dva, triploidne tri, itd. Međutim, odstupanja od te šeme su česta i nastaju ili zbog spajanja dva nukleolusa ili zato što su lokusi –

7

organizatori jedarca raspoređeni na većem broju hromozoma haploidne garniture (kod čoveka ti lokusi nalaze se na pet različitih hromozoma).

HROMOZOMI: NOSIOCI GENA

Hromatin i metafazni hromozomi Najvažnija funkcija hromozoma je to da je u njima smeštena DNK - funkcionalna

jedinica nasleđa. DNK predstavlja genetički materijal svih ćelija, materijalnu osnovu nasledne supstance. Genomi bakterija i nižih eukariota su vrlo kompaktni, tj. celokupna DNK sekvenca iskorišćena je za kodiranje funkcionalnih genskih produkata. Nasuprot tome, kod viših eukariota hromozomska DNK, pored gena, sadrži i velike količine nekodirajućih sekvenci.

Molekuli DNK kod prokariota su cirkularnog oblika, nisu odvojeni membranom od citoplazme i zajedno sa njom čine strukturu koju nazivamo nukleoid. Često ćete naići na termin ”ogoljena DNK”, tj. DNK bez proteina.

Hromozomi se nalaze u jedru i zavisno od stadijuma ćelijskog ciklusa dosta menjaju

svoj izgled. Najčešće se pod mikroskopom vide kao končaste tvorevine čija veličina i broj može da varira od jedne grupe živih bića do druge, ali je tipična za svaku vrstu. Kada se ćelija podeli, jedro i njegovi hromozomi se takođe podele. Hromozomi su vidljivi pod svetlosnim mikroskopom samo tokom deobe ćelije što je posledica spiralizacije DNK molekula hromozoma, a pod elektronskim mikroskopom tokom čitavog ćelijskog ciklusa. Razlikujemo interfazne hromozome (hromatin) i hromozome neposredno pred deobu, tokom deobe i neposredno posle deobe (hromozomi sa jednom ili dve DNK).

Iako smo i danas još uvek daleko od razumevanja fine strukture hromozoma u interfazi, kod eukariota, hromatin predstavlja kompleks od DNK molekula, proteina i malih količina RNK. (napomena - ovaj hemijski sastav hromatina i hromozoma je isti)

Proteini hromatina su grupisani u dve velike klase: 1. Histoni (bazni proteini) 2. Nehistonski proteini (kiseli proteini)

Histoni su prisutni u hromatinu svih viših eukariota (osim u spermatozoidima gde se umesto histona nalaze bazni proteini, tzv. protamini). Histoni imaju glavnu ulogu u strukturisanju hromatina, oni pomažu u pakovanju DNK u hromozome. Obuhvataju 5 različitih proteina: H1, H2a, H2b, H3 i H4. Histoni kompleksuju sa DNK i formiraju posebne strukture - nukleozome (reaguju pozitivno naelektisani ostaci baznih aminokiselina histona sa kiselim fosfatnim grupama DNK). Svaki nukleozom sadrži po četiri molekula histona - oktamer histona (H2a, H2b, H3 i H4) oko kojih se nalazi DNK, dok je molekul histona H1 na spoljašnjoj strani nukleozoma.

8

Nehistonski proteini su frakcija satavljena od velikog broja jako heterogenih, kiselih proteina. Sastav ovih proteina jako varira, ne samo između vrsta, već i između različitih ćelija unutar istog organizma. Ovi proteini mogu biti regulatori genske aktivnosti.

Pod elektronskim mikroskopom možemo primetiti intenzivno obojen hromatin (heterohromatin) i svetlije obojen hromatin (euhromatin). Heterohromatin je genetički neaktivan. Sastavljen je od gusto pakovanih hromatinskih vlakana i ostaje kondenzovan tokom celog ćelijskog ciklusa. Većina do danas okarakterisanih eukariotskih gena locirana je u euhromatinskim regijama hromozoma.

Pri deobi ćelija (mitozi) dolazi do kondenzovanja hromatina da bi se omogućila ravnomernija raspodela jedarnog genetičkog materijala u dve ćerke ćelije. Kondenzovanjem hromatina jasno se primećuju osnovni gradivni elementi hromozoma: jedna ili dve hromatide, centromera, telomere i mesto replikacije (znači ne menja se hemijski sastav, već samo oblik i veličina).

Od kraja S1 faze do kraja metafaze primećuje se hromozom koji ima dve hromatide i u svakoj hromatidi po jedan lanac DNK. Od početka anafaze do S1 faze hromozomi su sastavljeni od jedne hromatide u kojoj je jedan lanac DNK. Na početku interfaze hromozomi se dekompenzuju DNK i tada su hromozomi vidljivi kao hromatinski materijal (“rasut materijal”).

Centromere predstavljaju primarna suženja, mesta vezivanja niti deobnog vretena,

koje omogućavaju kretanje hromozoma ka polovima tokom ćelijske deobe. Centromera sadrži specifične DNK sekvence na kojoj se vezuju proteini stvarajući kinetohor. Kinetohor je struktura za povezivanje hromozoma sa nitima deobnog vretena.

Primarno suženje deli hromozom na dva “kraka”. Ukoliko kraci nisu jednake dužine, kraći se obeležava sa p (fran. “petite”=mali), a duži krak se obeležava sa q. Prema položaju centromere razlikujemo nekoliko morfoloških tipova hromozoma:

- metacentrični hromozom sa medijalno postavljenom centromerom (i p i q krak su jednake dužine);

- submetacentrični – hromozom ima p krak nešto kraći od q kraka; - akrocentrični hromozom ima centromeru blizu kraja (p krak znatno kraći od q

kraka); - telocentrični hromozom ima centromeru na samom kraju hromozoma (nema p krak). Svaki hromozom, koji ne poseduje centromeru (acentrik), ne može se pomeriti ka

jednom od polova i ući u sastav novoformiranog jedra, tako da se gubi u procesu deobe ćelije. Ovakva pojava ima nesagledive posledice za ćeliju.

9

Slika 1 Slika 2

Hromozomi: 1. od kraja S1 faze do kraja metafaze; 2. od početka anafaze do S1 faze Telomere predstavljaju prirodne krajeve, vrhove hromozoma. Uloga im je da zaštite i

stabilizuju krajeve hromozoma, slično plastičnom vrhu na pertli. Sami krajevi hromozoma (telomere) nisu morfološki različiti od ostalih delova hromozoma. Ipak, kao i centromere, telomere imaju jedinstvenu molekularnu strukturu koja pruža stabilnost i omogućava normalno ponašanje hromozoma pri njihovoj deobi.

Mesto replikacije predstavlja deo hromozoma na kome započinje proces replikacije (umnožavanja) DNK, što za posledicu ima dupliranje svakog hromozoma u ćeliji. Rezultat toga je da nastaju identične kopije tzv. sestrinske hromatide, međusobno povezane centromerom. Svaka sestrinska hromatida se sastoji od jednog molekula DNK.

Hromozomi se mogu prikazivati na različite načine: kariotip (skup svih hromozoma u ćeliji), kariogram (hromozomi poređani po veličini i obliku) i idiogram (šematski prikaz hromozoma). Za svaku eukariotsku vrstu postoji karakterističan broj hromozoma u ćeliji. Tako krompir ima 48 hromozoma, voćna mušica 8, čovek 46. Nije utvrđena povezanost između složenosti organizma i broja hromozoma unutar ćelije.

Kod diploidnih biparentalnih organizama jedan set hromozoma potiče od majke, a drugi od oca.

10

GEN, GENOTIP, FENOTIP

Sve nasledne osobine jedinki koje se prenose kroz generacije kontrolišu geni. Gen

predstavlja jedinicu strukture, funkcije i transmisije naslednog materijala. Gen je deo molekula DNK (kod nekih virusa RNK) koji poseduje šifru za sintezu nekog funkcionalnog molekula RNK (iRNK, tRNK, rRNK ili snRNK). Svaki gen ima određeno mesto (lokus) na hromozomu.

Pored određenog mesta na hromozomu, svaki gen ima određenu strukturu. Struktura gena je određena sastavom i redosledom nukleotida (osnovnih gradivnih jedinica DNK). Jedan gen se može sastojati od 400 do 1800 nukleotidnih parova.

Redosled nukleotida u jednom genu - struktura gena određuje funkciju gena, odnosno informaciju o sintezi tačno određenog molekula proteina ili drugog funkcionalnog molekula RNK (tRNK, rRNK ili snRNK).

Geni mogu da se jave u više različitih oblika (genski aleli). Aleli su forme jednog istog gena koji su smešteni na istom lokusu (mestu) homologih hromozoma, determinišu istu osobinu, ali se mogu kvalitativno razlikovati.

Često se gen ne javlja samo u dva različita oblika (Aa ili Bb ili Cc…), već postoji veći broj alela na datom lokusu (multipli alelizam) (npr. genski aleli za krvnu grupu čoveka IAIBIO). U slučaju multiplih alela, divlji tip gena (A) je mutirao u različito vreme u različite alelne oblike.

Napomenimo da kod diploidne jedinke, bez obzira na broj alela za jedan gen, na jednom lokusu može biti samo dva alela. Tako, čovek na lokusu za krvnu grupu ima tri

11

genska alela IAIBIO, ali na lokusu su aleli IAIB ili IBIO ili IAIO ili IOIO ili IAIA ili IBIB. Ukoliko jedinke na jednom lokusu imaju identične genske alele, takve jedinke označavamo kao homozigotne, ukoliko se aleli na istom lokusu homologih hromozoma razlikuju te jedinke su heterozigoti.

Napomena - homozigotnost i heterozigotnost jedne jedinke se odnosi samo na posmatrane genske alele (znači, jedna jedinka može biti homozigotna za oblik AA, ali heterozigotna za boju Bb).

Homozigoti su obeleženi kao AA, BB, cc, aa, bb, IOIO, IAIA IBIB - istim slovima. Heterozigoti su obeleženi kao Aa, Bb, IAIO, IAIB - različitim slovima.

Hemizigot

Kada je u genotipu individue prisutan samo jedan alel nekog gena, dok drugi alel ne

postoji na homologom hromozomu, tada se govori o hemizigotu. Hemizigoti su muške individue za one gene koji se nalaze samo na X hromozomu koji nije homolog sa Y hromozomom.

Skup gena u jednoj hromozomskoj garnituri (setu) označava se kao genom. Međutim, ukoliko se posmatraju svi nasledni činioci (cela genetička konstitucija) u jednom organizmu, mi ustvari posmatramo genotip. Iako genotip obuhvata sve gene jedne jedinke, radi lakše analize mi često posmatramo jedan lokus (ili nekoliko) i onda objasnimo genotip za taj lokus. Npr. ukrštanje homozigotnih, dominantnih alela za oblik zrna kod graška daje genotip AA za okruglo zrno dok ukrštanje heterozigotnih alela za boju zrna graška daće 3 genotipa – BB i Bb za žutu i genotip bb za zelenu (žuta : zelena=3:1).

Organizam čoveka je diploidan (2n), kariotip čoveka ima 46 hromozoma, genom sadrži 23 hromozoma (samo jedan set označava se kao genom). Pšenica je heksaploid (6n), kariotip pšenice sadrži 42 hromozoma, genom sadrži 7 hromozoma. U svakom organizmu postoji veliki broj gena. Dekodiranjem humanog genoma utvrđeno je da je broj gena koji kodiraju proteine između 20.000 i 25.000.

Genotip nosi informaciju za razviće karakterističnog izleda organizma (fenotip). Znači, fenotip se ostvaruje u konkretnim uslovima sredine (ekspresija genotipa sa nizom morfoloških, fizioloških i ponašajnih osobina).

Genotip+sredina →Fenotip

Geni predstavljaju predispoziciju da se razvije odgovarajući fenotip, dok uslovi sredine mogu predstavljati ogranićavajući faktor te ekspresije. Ekspresija jednog gena ograničena je i interakcijom sa drugim genima. Takođe, pod uticajem sredine

12

podrazumevamo i spoljašnje faktore u kojima se odražava život jedinke, ali i faktore unutar jedinke (hormone, minerale, pH sredine u kojima se odvija život ćelije, i td).

Kod jednog fenotipa razlikujemo kvalitativne i kvantativne osobine. Kvalitativne osobine ispoljavaju se alternativno, tj. obuhvataju samo nekoliko

različitih fenotipova. Najčešće su to morfološke osobine (oblik, boja) različitih organa. Ove osobine su uslovljene genetičkom osnovom individue (major genima), dok faktori spoljašnje sredine nemaju uticaja.

Kod kvantitativnih osobina je primećeno da variraju kontinuirano. Kvantitativne osobine su merljive i predstavljaju visinu težinu, kod životinja, biljaka i ljudi; broj zrna i prinos kod biljaka; krvni pritisak kod ljudi, produkciju mleka kod krava itd. Uslovljene su delovanjem većeg broja gena sa malim efektom, tzv. minor geni. Ekspresija ovih osobina, pored uticaja naslednih faktora, u manjoj ili većoj meri zavisi i od faktora spoljašnje sredine.

Multipli alelizam

Multipli alelizam je postojanje više od dva genska alela na jednom lokusu kod određene biološke vrste. Multipli alelizam je vrlo česta pojava, tj. postoji kod većine gena. Primer - nasleđivanje boje krzna (corium) kod kunića. Postoje četiri alela za ovu osobinu: alel c+ (određuje boju divljeg soja koji su kompletno obojeni); alel cch(činčila obojenost-mešavina boja i bele dlake); alel ch (himalajska obojenost - beli kunići sa crnim vrhovima ekstremiteta) i alel c (albino). Gradacija u dominantnosti ovih alela je c+>cch>ch>c. Genski alel c+je dominantan u odnosu na sve ostale alele, alel cch je dominantan u odnosu na alele ch i c, a recesivan u odnosu na alel c+. Alel ch je dominantan u odnosu na alel c, a recesivan u odnosu na druga dva alela, dok je alel c recesivan u odnosu na ostale alele. Multipni aleli na istom lokusu se obeležavaju istim slovom, s tim što se u superskriptu navode oznake za svaki od alela.

Tipični primer za multipli alelizam je gen koji određuje krvnu grupu čoveka. Ovo je genski lokus ABO, na kome mogu da budu samo dva od moguća tri genska alela IAIBIO. Broj mogućih genotipova u populaciji zavisi od broja genskih alela na datom lokusu i određuje se formulom:

n=k (k+1)/2 gde je n - broj mogućih genotipova k - broj genskih alela na jednom lokusu. Primeri: Ukoliko su aleli heterozigotni Aa (znači dva alela), moguća su tri genotipa

(AA, Aa, aa).

13

Ukoliko ima 4 genska alela (navedeni primer boje kunića) javiće se 10 genotipova, dok će se kod nasleđivanja krvne grupe gde ima tri genska alela za ovu osobinu javiti 6 genotipa (IAIB; IBIO; IAIO; IOIO; IAIA; IBIB).

Inkompatibilnost kod biljaka

Kod nekih biljnih vrsta, koje imaju dvopolne cvetove, postoji čitava serija alela inkompatibilnosti, koji čine te biljne vrste stranooplodnim ili ksenogamnim biljkama. Broj alela inkompatibilnosti je različit kod različitih vrsta (raž, jabuka, višnja, tršnja, orah, detelina).

Ovaj gen se tokom evolucije razvio u veći broj alela. Kod inkompatibilnosti, majka biljka ne prihvata polen koji nosi alel za inkompatibilnost. Na ovaj način se forsira stranooplodnja.

Primer: Ako i polenovo zrno i plodnik cveta sadrže iste allele za inkompatibilnost taj

polen neće klijati i neće doći do oplodnje Ako se u plodniku nalaze aleli za inkompatibilnost S1S2 , samo polenova zrna koja

nemaju ove alele S1S2 će proklijati kroz žig tučka (znači ako imaju alele npr. S3S4 ili S3S5).

14

MENDELOVI ZAKONI

(Dominantno-recesivno ukrštanje) Ove zakone je formulisao 1865. godine češki biolog (kaluđer), sa austrijskim

državljanstvom, Gregor Mendel, a tiču se raspodele gena i osobina u tri sukcesivne generacije monohibridnog ukrštanja različitih sorti baštenskog graška. Mendel je pratio osobine graška koje se ispoljavaju alternativno.

Alternativne osobine koje je Mendel proučavao

Osobina Dominantna Recesivna

1. Boja cveta 2. Boja semena 3. Oblik semena 4. Boja semenjače 5. Oblik mahune 6. Položaj cveta 7. Visina biljke

Ljubičasta Bela Žuta Zelena Okruglo Naborano Zelena Žuta Nabubrela Sužena Bočni Terminalni Visoka Niska

Grašak je diploidna (sadrži dva seta hromozoma), samooplodna biljka. Da je za istraživanja izabrao neku poliploidnu biljku (što je česta pojava kod biljaka), nikada ne bi dobio tako razumljive rezultate. Za ukrštanja, Mendel je koristio genotipove graška sa visokim stepenom homozigotnosti (čiste linije), zahvaljujući samooplodnji iz generacije u generaciju.

Mendel je vršio ukrštanje čistih linija tako što je sa cvetova jedne linije uklanjao prašnike i na tučak nanosio polenov prah druge linije, koja je ispoljavala alternativno svojstvo.

Roditeljsku generaciju označio je sa P (parentalna), a dve generacije potomaka sa F1 (prva filijalna) i F2 (druga filijalna generacija).

15

Zapazio je da su potomci u F1 generaciji isključivo biljke okruglog semena (I

Mendelovo pravilo o uniformnosti prve filijalne generacije potomstva). Pravilo uniformnosti se odnosi na ukrštanje genetički „čistih linija“ kada su svi potomci F1 generacije (genotipski i fenotipski) isti, tj. uniformni.

Kada je posejao ovo seme i dozvolio samooplodnju, u drugoj (F2) filijalnoj generaciji dobio je i okruglo i smežurano seme (generacija razdvajanja). Analizirao je veliki broj semena (kao dobar matematičar znao je da veličina uzoraka smanjuje mogućnost greške u rezultatu) i ustanovio je da između broja okruglog i smežuranog semena postoji određeni odnos 3:1 (pravilo segregacije, razdvajanja)

Na sličan način pratio je i ostale alternativne osobine i utvrdio da se u F1 generaciji ispoljava samo jedan oblik osobine (samo okruglo zrno, samo žuto zrno, samo ljubičasta boja cveta), a da se u F2 generaciji ispoljavaju oba oblika ispitivane osobine u odnosu 3:1 (okruglo:smežurano zrno; žuto:zeleno zrno; ljubičasta boja:bela boja cveta)

Ovakav tip ukrštanja pri kojem se prati samo jedna osobina naziva se monohibridno ukrštanje.

Sa stanovišta genotipa, odnos je 1/4 homozigotnih AA : 1/2 heterozigotnih Aa : 1/4 homozigotnih aa.

Mendel je predvideo da bi u tom slučaju u F3 generaciji heterozigotni genotipovi okruglog semena produkovali i okruglo i smežurano seme, u istom genotipskom odnosu 1:2:1.

Koncept segregacije (razdvajanja) je drugo Mendelovo pravilo: alelni parovi se rastavljaju i raspodeljuju u različite ćelije. Pravilo segregacije podrazumeva da F2 generacija monohibridnog ukrštanja nije uniformna već se razvrstava u različite genotipove (i fenotipove), u određenom brojnom odnosu. Ukoliko je kod ukrštenih čistih linija u genetičkoj determinaciji posmatranih osobina prisutan model dominantnosti–recesivnosti 3/4 jedinki ispoljavaju dominantno svojstvo, a 1/4 – recesivno (odnos 3:1), jer heterozigoti (Aa ili Bb ili Cc) imaju istu ekspresiju kao i dominantni homozigoti (AA ili BB ili CC).

Brojni odnos razdvajanja genotipova i fenotipova u F2 generaciji monohibrida

Genotip Brojni odnos genotipova Fenotip Brojni odnos

fenotipova AA 1 Žuto seme 3 Aa 2 aa 1 Zeleno seme 1

Mendel je shvatio da postoji određeni nasledni faktor (danas je poznato da je to gen) koji kontroliše ispoljavanje (ekspresiju) posmatranih osobina. Takođe, zaključio je da je

16

ispoljena osobina u F1 generaciji dominantna (npr. okruglo zrno), dok je alternativna osobina recesivna (npr. smežurano zrno) i maskirana u F1 generaciji. Znači, nasledni faktor se javlja u različitim oblicima (danas poznati aleli) gde jedan oblik kontroliše okruglo seme (osobinu u F1 generaciji) i to je dominantni alel, dok drugi oblik naslednog faktora kontroliše naborano zrno, koji se ispoljava u F2 generaciji te je taj oblik recesivan (recesivni alel). Oblik zrna ali i ostale posmatrane osobine su, dakle, određene naslednim faktorom koji se javlja u dominantnom (alel A) i recesivnom obliku (alel a).

Nasleđivanje boje zrna

(monohibridno ukrštanje)

Kada je Mendel ukrstio hibridne biljke iz F1 generacije sa recesivnim roditeljem iz P

generacije dobio je jedinke i sa dominantnom osobinom (okruglim zrnom) i sa recesivnom osobinom (smežurano zrno) u odnosu 1:1. Ovo ukrštanje je nazvano povratno ukrštanje. Međutim, ovakvo ukrštanje je i test ukrštanje jer predstavlja dodatnu potvrdu pravila rastavljanja, uz napomenu da se rastavljanje odvija samo kod heterozigota (Aa) koji stvara dva tipa gameta (A i a).

Test ukrštanje monohibrida P: ♀ Aa x ♂ aa F1:

♀/ ♂ a Fenotip

A Aa Žuto 1

a aa Zeleno 1

Dihibridno ukrštanje Mendel je ukrštao biljke graška koje su se razlikovale u dva para alela (za dve

osobine) i pratio je nasleđivanje dve fenotipske osobine. Takvo ukrštanje se naziva dihibridno.

Ukrštanjem čiste linije graška sa dve dominante osobine (okruglo i žuto zrno) i linije sa dve recesivne osobine (smežurano i zeleno), Mendel je u F1 generaciji dobio hibridne biljke isključivo sa okruglim i žutim zrnima (uniformne po genotipu i fenotipu).

17

Kada je dozvolio samooplodnju kod F1 hibrida, Mendel je u F2 generaciji zapazio da

pored roditeljskih kombinacija fenotipova (okruglo i žuto, kao i smežurano i zeleno) postoje i dva nova fenotipa (okruglo i zeleno; smežurano i žuto), koja predstavljaju nove kombinacije gena. Analizirajući veći broj semena, utvrdio je da je brojni odnos fenotipova u F2 generaciji 9:3:3:1 (okruglo i žuto: okruglo i zeleno: smežurano i žuto: smežurano i zeleno)

Ako okruglo seme određuje dominantan alel predstavljen simbolom A, a smežurano seme određuje recesivan alel predstavljen simbolom a, i ako žutu boju određuje dominantni alel predstavljen simbolom B, a zelenu boju recesivni alel predstavljen simbolom b, nasleđivanje boje i oblika graška se može predstaviti na sledeći način (Punetova mreža):

A-Žuta boja a-zelena B- Okruglo b- smežurano

F2: ♀/ ♂ AB Ab aB ab

AB AABB AABb AaBB AaBb

Ab AABb AAbb AaBb Aabb

aB AaBB AaBb aaBB aaBb

ab AaBb Aabb aaBb aabb

U dihibridnom ukrštanju Mendel je dobio rekombinovane fenotipove (fenotipove koji se razlikuju od roditelja po jednoj osobini - okruglo i zeleno zrno; smežurano i žuto zrno). Zaključio je da je ovde došlo i do rastavljanja (segregacije) pojedinačnih parova genskih alela, ali i do nezavisnog kombinovanja alelnih parova različitih gena. Pravilo slobodnog kombinovanja (treće Mendelovo pravilo) ukazuje da se različiti parovi genskih alela slobodno kombinuju tokom gametogeneze. Mendel nije mogao u potpunosti da objasni ovu

P: ♀ AABB x ♂ aabb F1:

♀/ ♂ ab

AB AaBb F

1: ♀ AaBb x ♂ AaBb

18

pojavu jer nije bilo poznato da su hromozomi materijalna osnova nasledne supstance niti da se hromozomi nalaze u setovima, parovima (homologi hromozomi).

Brojni odnos razdvajanja genotipova i fenotipova u F2 generaciji dihibrida Genotip Brojni odnos genotipova Fenotip Brojni odnos fenotipova

AABB AABb AaBB AaBb

1 2 2 4

Okruglo žuto seme 9

AAbb Aabb

1 2

Okruglo zeleno seme 3

aaBB aaBb

1 2

Naborano žuto seme 3

aabb 1 Naborano zeleno seme 1

Ukrštajući hibride iz F1 generacije sa recesivnim roditeljem, Mendel je pokazao da se dobijaju sva četiri fenotipa u odnosu 1:1:1:1. Ovo je test ukrštanja, pomoću koga se može izvesti zaključak o genotipskoj konstituciji jedinki sa dominantnim osobinama u F1 generaciji. Dobijeni odnos 1:1:1:1 ukazuje da su ispitivane jedinke F1 generacije heterozigotne i da stvaraju četiri vrste gameta u mejozi (samo kod heterozigota dolazi do razdvajanja alela). Test ukrštanje dihibrida

P: ♀ AaBb x ♂ aabb

F1:

Broj različitih genotipova i fenotipova u potomstvu pri ukrštanju biljaka ili životinja

zavisi od toga koliko smo genskih lokusa uključili u analizu. Pri monohibridnom ukrštanju kod dominantno-recesivne interakcije između alela,

nakon ukrštanja dve heterozigotne jedinke (Aa x Aa) nastaju tri različita genotipa (AA, Aa i AA), ali dva različita fenotipa u odnosu 3:1. Znači, broj heterozigotnih lokusa u ukrštanju utiče na broj mogućih tipova gameta, a samim tim na broj genotipova i fenotipova.

Odnos broja heterozigotnih lokusa u ukrštanju (n) → broj tipova gameta (2n) → broj genotipova u F2 generaciji (3n) → broj fenotipova u F2 generaciji (2n).

♀/ ♂ ab Fenotip

AB AaBb 1 okruglo žuto

Ab Aabb 1 okruglo zeleno

aB aaBb 1 naborano žuto

ab aabb 1 naborano zeleno

19

Primeri Aa x Aa → 1 heterozigotni lokus A a → 2 tipa gameta AA, Aa, aa → 3 genotipa → 2 fenotipa (sa dominantnom osobinom i recesivnom) Okruglo, žuto AaBb x AaBb → 2 heterozigotna lokusa AB,Ab,aB,ab → 4 tipa gameta → 9 genotipa→ 4 fenotipa (sa dominantnom osobinom i recesivnom) 1.AABB, AABb, AaBB, AaBb - okruglo, žuto 2. Aabb, Aabb - okruglo, zeleno 3. aaBB, aaBb - naborano, žuto 4. aabb - naborano zeleno Ako ukrštate jedinku koja je heterozigotna na 3 lokusa, postoji 8 mogućih

kombinacija gameta, 27 genotipova i 8 fenotipova. Proverite i dokažite!

Broj genotipova i fentipova monohibrida, dihibrida, trihibrida i polihibrida

Broj alelnih gena

Broj heterozigotnih

parova

Broj tipova gameta

Broj zigota

Broj genotipova

u F2

Broj fenotipova

u F2

Broj fenotipova sa rekombinovanim

osobinama Monohibridno 1 2 4 3 2 0 Dihibridno 2 4 16 9 4 2 Trihibridno 3 8 64 27 8 6 Polihibridno n 2n 4n 3n 2n 2n-2

20

Geni i njihove interakcije Interakcije se mogu ostvariti kako između genskih alela, tako i između nealelnih gena (gena koji su na različitim lokusima). Interakcije genskih alela Dominantnost i recesivnost:

U slučaju dominantno-recesivne interakcije jedan genski alel je uvek dominantan u odnosu na drugi (koji je recesivan). To znači da će dominantan alel i u homozigotnom (AA) i u heterozigotnom stanju (Aa) u potpunosti potisnuti ispoljavanje recesivnog alela. Takođe, to znači da je dominantan alel funkcionalan tj. kodira sintezu nekog proteina, dok je recesivan alel nefunkcionalan, tj. ne sintetiše genske produkte (iRNk i proteine). Kod dominantno-recesivne interakcije dovoljan je samo jedan funkcionalan alel da bi se u potpunosti ispoljila fenotipska osobina.

Objasnićemo navedeno na primeru nasleđivanja okruglog zrna kod graška. Genotip AA i Aa daju fenotip okruglog zrna, dok genotip aa daje fenotip smežuranog zrna. Dominantni genski alel A kodira enzim stahiazu koji pretvara ugljeni hidrat stahiozu u skrob. Prisustvo skroba u zrnu omogućava okrugli oblik zrna. Recesivni genski alel a je nefunkcionalan, odnosno ne kodira enzim stahiazu, pa u zrnu ostaje stahioza koja ne može da da okrugli oblik zrna. Znači kod dominantno-recesivnog nasleđivanja je dovoljan samo jedan dominantni, funkcionalni alel A kako bi se ispoljila fenotipska osobina, tj. aleli mogu biti i heterozigotni (Aa).

Intermedijarnost (nepotpuna dominantnost):

Intermedijarni oblik interakcije između genskih alela podrazumeva da intenzitet ispoljavanja osobine zavisi od količine funkcionalnih genskih alela. Odnosno, fenotip heterozigota A1A2 se razlikuje od fenotipa homozigota A1A1 ili A2A2. U slučaju ovog tipa nasleđivanja ne pišu se velika i mala slova jer se ni jedan alel ne ponaša ni dominantno ni recesivno. Homozigoti A1A1 ili A2A2 se međusobno razlikuju u prisustvu ili odsustvu funkcije, međutim funkcionalni gen nema jačinu da potpuno “nadoknadi” odsustvo funkcije nefunkcionalnog gena. Brojni odnos fenotipova u F2 generaciji je 1:2:1 (a ne 3:1, kao što je slučaj kod dominantno-recesivnog nasleđivanja) Primer: Kod kokoši crnu boju perja određuju genski aleli A1A1 koji kodiraju sintezu pigmenta i za ovu sintezu potrebna su dva funkcionalna gena. Belu boju perja određuju genski aleli A2A2 kod kojih nema sinteze pigmenta, a bela boja potiče od ostalih komponenti koje ulaze u građu perja. Heterozigotni hibridi (A1A2) imaju upola manju količinu genskih produkata, tj. manju sintezu pigmenata. Zbog navedenog, ukrštanjem crnih i belih kokošaka dobijaju se Andaluzijske plave koke (nešto između, tj. intermedijarno). Međusobnim ukrštanjem andaluzijskih koka u F2 generaciji dobijaju se 25% crne, 50% plave i 25% bele koke (fenotipski odnos 1:2:1).

21

Kodominantnost:

Kodominantnost podrazumeva neometanu - istovremenu ekspresiju oba genska alela. I u ovom slučaju se ukrštanjem F1 heterozigota u F2 generaciji dobija brojni odnos fenotipova 1:2:1, ali sam mehanizam ostvarivanja heterozigotnog fenotipa se razlikuje od intermedijarnog. Primer: Krvna grupa AB kod čoveka. Kod ove krvne grupe istovremeno se ispoljava i dejstvo alela IA (kodira antigen A (galaktozamin)) i dejstvo alela IB (kodira antigen B (galaktozu)). Zato što ova krvna grupa sadrži oba antigena, samim tim nemaju antitela anti-A i anti-B, ona je univerzalni primalac, tj. čovek sa ovom grupom može primiti krv bilo kog davaoca.

22

Interakcije nealelnih gena

Pojava da dva ili više gena deluju na ispoljavanje jedne osobine, pri čemu se oni nalaze na različitim (nehomologim) hromozomima je interakcija nealelnih gena. Mendel nam je ukazao da se pri različitim ukrštanjima mogu dobiti fenotipovi u različitom odnosu (3:1; 9:3:3:1). Međutim, ekspresija ovih osobina je moguća samo ako se geni koji determinišu praćene osobine nalaze na različitim hromozomima i svoje efekte ostvaruju nezavisno jedni od drugih (oblik određuje jedan gen koji na homologim hromozomima može imati alele A ili a; boju određuje jedan gen na homologim hromozomima koji ima alele B ili b). U procesu gametogeneze jedan homologi hromozom daće alel A (ili alel a) a drugi homologi hromozom alel A (ili alel a) pa će se u F1 generaciji dobiti genotip Aa, itd.

Međutim, geni se nalaze u istom jedru sa nekoliko desetina hiljada drugih gena. Kod interakcije gena je, u većini slučajeva, izražena modifikacija odnosa razdvajanja fenotipova, u odnosu na razdvajanje koje je tipično za dihibridno ukrštanje koje iznosi 9:3:3:1.

Radi lakšeg razumevanja, ovde ćemo objasniti osnovne tipove interakcija nealelnih, tj. nevezanih gena (gena smeštenih na različitim lokusima), uz pretpostavku da se na svakom posmatranom lokusu javlja samo dominantno-recesivna inetrakcija genskih alela.

Za sve oblike interakcije nealelniih gena koristimo termin epistaza. U osnovi, ove interakcije se svode na inhibiciju jednog gena drugim genom (epistaza u užem smislu reči) ili na sadejstvo gena pri ispoljavanju neke fenotipske osobine (komplementarnost). Odstupanje od klasičnog odnosa fenotipova 9:3:3:1 u F2 generaciji dihibridnog ukrštanja, po pravilu ukazuje da postoji neki oblik interakcije nealelnih gena. Osnovni procesi koji su zaslužni za izmenjene Mendelove odnose između fenotipova su: 1. Interakcije između nealelnih gena koji kontrolišu istu osobinu 2. Interakcije nealelnih gena u kojima jedan alel maskira ekspresiju dva alela drugog gena - epistaza Interakcije između nealelnih gena koji kontrolišu istu osobinu

Ako dva para genskih alela utiču na istu fenotipsku osobinu, postoji šansa da genski proizvodi interreaguju i da daju nove fenotipove a rezultat toga su izmenjeni odnosi fenotipova. Ovde postoji kumulativni efekat i komplementarnost. Koepistatični geni

Pri koepistatičnom delovanju gena, na nasleđivanje jedne osobine utiču dva para nevezanih gena. Pri tom je odnos dobijenih fenotipova u F2 generaciji 9:3:3:1, kao da se radi o dihibridnom nasleđivanju, odnosno nasleđivanju dve osobine. Prisustvo jednog ili drugog dominantnog alela nevezanih gena utiče na formiranje različitih fenotipova. Da bi se ostvarila koepistatična interakcija nealelnih gena, u genotipu je potrebno prisustvo oba dominantna nealelna gena, bilo u homozigotnom, bilo u heterozigotnom stanju, pri čemu nastaje novi fenotip.

23

Kada je u genotipu samo jedan dominantan gen (u homozigotnom (AA ili BB) ili heterozigotnom obliku (Aa ili Bb)), fenotip će imati dva oblika jedne osobine (okrugao i spljošten oblik; tamna i žuta boja paprike, ružičastu i grašastu krestu). Međutim, ako u genotipu postoje oba dominantna gena koja određuju jednu istu osobinu (AABB ili AaBb) dobiće se nov fenotip (izdužen oblik; crvena boja paprike; graškasta kresta)

Primeri: U prisustvu oba recesivna alela (aabb) boja perja papagaja je bela. Prisustvo

dominantnog alela A izaziva plavu boju perja, a alela B žutu boju, tj. genotip A-bb je plave boje perja, a genotip aaB- žute boje perja. Ukrštanjem genotipova AAbb sa aaBB u F1 generaciji će se dobiti sve individue zelene boje perja (AaBb), što znači da je došlo do interakcije dva dominantna alela i rezultat je fenotip koji nisu imali roditelji. Prema tome, dva nealelna gena A i B (kao kodominantni geni), kada se nađu skupa daju zelenu boju i nazivaju se koepistatični geni.

Oblik kreste kod kokošaka 9 : 3 : 3 : 1 Oblik kreste kod kokošaka se formira u zavisnosti od prisustva ili odsustva

dominantnih alela dva nevezana gena R i P. U slučaju kada je prisutan samo R alel, oblik kreste je ružast.

To isto važi i za P, čije prisustvo determiniše nastanak grašaste kreste. Kada su

prisutni i P i R aleli, oni interreaguju međusobno i daju novi fenotip - sa orašastom krestom.

24

U prisustvu oba recesivna alela (rrpp), ptice ne proizvode nikakav funkcionalni genski produkt koji bi uticao na oblik kreste i dobijamo samo osnovni oblik (reckava).

Semiepistatični geni

Odnos dobijenih fenotipova kod ukrštanja semiepistatičnih gena je 9:6:1. Dva dominantna alela nevezanih gena, pojedinačno prisutna, određuju istu ekspresiju jedne osobine (isti oblik spljošten kod bundeve, istu boju, istu dužinu). Međutim, kada su oba dominantna alela prisutna u genotipu, bilo u homozigotnom bilo u heterozigotnom obliku - AaBb ili AABB, oni deluju aditivno i dobija se drugi oblik fenotipa (okrugla bundeva). Recesivni aleli u homozigotnom obliku (aabb) daju treći oblik fenotipa - izduženu bundevu. Primer: Oblik tikve. 9 : 6 : 1 Slično ako i kod oblika kreste i kod ove osobine imamo dva lokusa sa dva dominantna i dva recesivna alela. I interakcija između dva nealelska dominantna alela daje novi fenotip. Ipak u ovom slučaju svaki dominantni alel zasebno daje isti oblik i po tome se ovaj odnos nealelskih gena razlikuje. Ako je prisutan bilo koji dominantni alel (sa bilo kog lokusa - oblik je sferičan. Ako su svi aleli na oba lokusa recesivni oni ne daju nikakav proteinski proizvod i oblik tikve je osnovni - izduženi. Ako je prisutan makar jedan dominantni alel na oba lokusa, njihovi proizvodi će interagovati i dati novi fenotip - spljošten.

Izoepistatični geni

Odnos fenotipova kod ukrštanja genotipova sa izoepistatičnim genima je 15:1. Dominantni aleli nevezanih gena, bilo da se jave zajedno ili pojedinačno (u homozigotnom ili heterozigotnom stanju) daju fenotip sa istom osobinom (isti oblik, ista boja, isti broj), dok samo recesivni aleli u svom homozigotnom stanju daju drugi oblik fenotipa. Primer: Oblik lista biljke Capsella bursa pastoris može biti srcast ili izdužen i određen je genima A1 (a1), odnosno A2 (a2). Ukoliko u genotipu postoji barem jedan dominantan gen oblik lista će biti srcast (A1A1A2A2, A1A1A2a2, A1A1a2a2, A1a1A2A2, A1a1A2a2, A1a1a2a2, a1a1A2A2, a1a1A2a2), ali ukoliko se recesivni geni u homozigotnom obliku (a1a1a2a2) oblik ploda će biti izdužen.

25

Interakcije nealelnih gena u kojima jedan alel maskira ekspresiju dva alela drugog gena

Epistaza

Određeni fenotip je obično rezultat procesa koji su kontrolisani sa nekoliko gena. Svaki od gena kontroliše neki od koraka koji zajedno rezultiraju u fenotipu. Epistaza je genska interakcija u kojoj proizvod jednog gena utiče na fenotipsku ekspresiju drugog gena (čiji proizvod utiče na neku osobinu), tako da fenotip sada nastaje pod uticajem prvog, a ne drugog gena. Drugim rečima, jedan genski alel maskira dejstvo drugog genskog alela. Ovim tipom interakcije ne nastaju novi fenotipovi, ali se broj fenotipova može smanjiti jer se pojedine genotipske klase grupišu. Za gen koji maskira ekspresiju drugog gena se kaže da je epistatičan, a onaj čija je ekspresija maskirana je hipostatičan. Takođe epistatični efekat ne mora biti samo u jednom pravcu, ćelijska epistaza se može odigrati u oba pravca između dva lokusa. • Dominantna epistaza – dovoljan je jedan dominantni alel epistatičnog gena da maskira ekspresiju alela drugog gena. • Recesivna epistaza – potrebna su dva resesivna alela epistatičnog gena da bi maskirala ekspresiju alela drugog gena.

• Dominantna epistaza – Dominantni alel jednog lokusa maskira ekspresiju sa drugog. Dominantna epistaza (12 : 3 : 1) je pojava kad makar jedan dominantan alel jednog gena potpuno favorizuje dati fenotip nad drugim genom (A-Bb ili A-BB). Drugi dominantni gen ispoljava efekat samo ukoliko u genotipu ne postoji dominantni oblik prvog gena (aa Bb, ili aaBB). U homozigotnom recesivnom stanju, drugi gen diktira fenotip, zavisno od stanja u kome se on nalazi (aabb → genski alel b će odrediti boju).

26

Primer: boja ploda tikve W-Y- i W-yy je bela (9/16 + 3/16), wwY- je žuta (3/16), wwyy je zelena (1/16). • Recesivna epistaza – dva recesivna alela jednog lokusa maskiraju ekspresiju sa dugog lokusa 9 : 3 : 4. Dva recesivna gena drugog lokusa su hipostatična u odnosu na prvi recesivni par. Dominantni geni ispoljavaju isti oblik fenotipa, ali samo ako recesivni geni nisu homozigotni. Primer 1: Boja krzna kod glodara. Jedinke A-cc i aacc imaju isti fenotip, ćelije albino. A-C- su aguti i aaC- su crni (aguti : crni : albino). C alel stvara proizvod koji utiče na proizvodnju bilo kakvog pigmenta. c u homozigotnom obliku sprečava nastanak bilo kakvog pigmenta A daje proizvod čija je posledica aguti boja (štraftanje crnih dlaka žutim prugama), a daje neaguti boju, on ne daje nikakav proizvod. Primer 2: Ukoliko sinteza pigmenta melanina kod čoveka kodiraju dva gena A i B, u sadejstvu sa poligenima za ovo svojstvo, genotipovi A-B- i aaB- daju različitu količinu melanina, dok će prisustvo recesivnog oblika gena b u homozigotnom stanju (-bb) blokirati sintezu melanina i daće albino fenotip. Primer 3: Vrlo redak gen, odnosno njegov recesivan alel h, kada se nađe u homozigotnom stanju (hh), koči stvaranje antigena A i B u krvi čoveka. Tada se ne ispoljavaju krvne grupe A, B i AB jer, iako osobe imaju alele A ili B (ili oba), je njihovo dejstvo inhibirano ovim recesivnim genom h što predstavlja primer za recesivnu epistazu (tzv. Bombaj fenotip, po indijskom gradu gde je otkriven). Tako npr. iako osoba ima genotip AAhh ona neće imati krvnu grupu A jer je alel A inhibiran. Osoba će tada imati O krvnu grupu.

27

• Dvostruka recesivna epistaza (9 : 7) – kada homozigotno recesivno stanje bilo kog gena potpuno anulira efekat drugog gena. Ovaj odnos može biti i komplementarnost dominantnih alela. Primer 1: Beli cvet: genotipovi sa homozigotnim, recesivnim alelima daju jednu istu boju, dok druga boja nastaje kao rezultat jednog ili drugog ili oba dominantna nealelska gena. ccP- ili C-pp ili ccpp- ljubičasti C-P- bela boja nastaje kao rezulat jednog ili oba. Primer 2: Normalan sluh čoveka ima dva funkcionalna gena (A-B-). Da bi sluh bio normalan neophodno je prisustvo po jednog dominantnog alela oba gena ( genotip A-B-, mogu da budu i homozigoti i heterozigoti). Osobe svih drugih genotipova imaju oštećen sluh (genotipovi A-bb ili aaB- ili aabb). Znači, za nomalan sluh neophodna je aktivnost i jednog i drugog lokusa sa dominantnim alelima A i B. • Dominantno-recesivna epistaza - Dominantni alel jednog genskog lokusa je epistatičan za genske alele drugog lokusa. Istovremeno, recesivni homozigot na drugom lokusu je epistatičan za dominantne i recesivne alele prvog lokusa. Primer 1: Boja perja kod kokoši Obojeno perje se javlja kod kokoši sa funkcionalnim lokusom C-, dok recesivni homozigoti su nefunkcionalni, nesintetišu pigmente pa su beli. Međutim ekspresiju gena C koči dominantni alel inhibitornog gena I, tako da se pri ukrštanju dve heterozigotne jedinke očekuje fenotipski odnos 13:3 (bele:crne). U ovom primeru gen I je epistatičan za C i c, dok je genotip cc epistatičan za I i i. U F2 generaciji dolazi do pojave dva fenotipa – belo i obojeno perje u odnosu 13 : 3. Samo genotip C-ii, koji se javlja u 3/16, daje obojeno perje. Svi ostali genotipovi (C-I-, ccI- i ccii) određuju belo perje – šema ukrštanja : P: CCII x ccii (bele x bele) F1: CcIi x CcIi (bele x bele) F2: C- I- (9), C- ii (3), ccii (1) , ccI- (3) b e l e > 13 : obojene > 3 Aditivnost (sabirno dejstvo gena)

Aditivno dejstvo gena ostvaruje se ako je pojedinačno dejstvo svakog od poligena malo pa svaki od njih doprinosi jačini osobine tako što se njihovo dejstvo sabira. Tako se nasleđuju mnoge kvantitativne osobine, kao što su telesni rast i boja kože i očiju čoveka. U determinaciju (određivanju) ovih osobina čoveka smatra se da učestvuje 3-4 gena (para alela). Što je u genotipu čoveka više dominantnih alela koji podstiču stvaranje pigmenta, boja kože je tamnija. Najtamniju boju kože imaju osobe kod kojih su svi aleli dominantni (AABBCC). Kako se u genotipu osobe broj dominantnih alela smanjuje tako je i boja kože sve svetlija. Najsvetliju boju kože imaju osobe koje sadrže sve recesivne alele (aabbcc).

28

Primer: Pretpostavimo da boju kože određuju samo dva gena A i B. U generaciji su osoba crne boje kože, genotipa AABB i osoba bele boje kože aabb. Analiziraćemo potomke F1 i F2 generacije : P: AABB x aabb F1: AaBb x AaBb U F1 generaciji se formiraju melezi umereno tamne boje kože. Melezi iz F1 generacije obrazuju 4 tipa gameta : AB, Ab, aB i ab koji međusobnim ukrštanjem daju 16 kombinacija genotipova (vidi dihibridno ukrštanje ) koje daju 5 različitih fenotipova: 1. fenotip tamna koža (pigment se obrazuje 100%) koji određuje genotip u kome su svi aleli dominantni – AABB; ovaj genotip se javlja u 1 od 16 kombinacija – 1/16 2. fenotip je manje tamna koža (obrazuje se 75% pigmenta), a genotip je sa tri bilo koja dominantna alela (npr. AABb) – javlja se u 4/16 kombinacija 3. fenotip je umereno tamna koža (obrazuje se 50% pigmenta) – genotip je sa bilo koja dva dominantna alela (npr. AAbb ili AaBb) – javlja se u 6/16 kombinacija 4. fenotip je umereno svetla boja kože (stvara se 25% pigmenta), a genotip je sa jednim, bilo kojim dominantnim alelom (Aabb, aaBb); javlja se u 4/16 kombinacija 5. fenotip je svetla boja kože (pigment se ne stvara), a određuje ga genotip bez dominantnih alela (aabb) koji se obrazuje u 1/16 kombinacija Fenotipski odnos u F2 generaciji pri aditivnom nasleđivanju osobine (boja kože) koja je pod kontrolom dva gena smeštenih na različitim hromozomima je : 1 : 4 : 6 : 4 : 1 (tamna : manje tamna : umereno tamna : umereno svetla : svetla)

29

STRUKTURA I FUNKCIJA GENETSKOG MATERIJALA

DNK: Struktura, replikacija i varijacija Dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) vrši ulogu naslednog materijala zahvaljujući

jedinstvenim osobinama koje poseduje: 1. Skladištenje informacija - Mora sadržati informaciju neophodnu za izgradnju

čitavog organizma, pri čemu se u određenom trenutku ostvaruje ekspresija samo dela nasledne informacije na fenotipskom nivou. Koji geni će biti aktivni zavisi od funkcije ćelije, od faze u kojoj se ćelija nalazi, od uticaja spoljašnje sredine i dr. Ekspresija naslednih informacija predstavlja složen proces, tzv. protok informacija unutar ćelije. Početak ovog procesa predstavlja transkripcija DNK, praćena translacijom informacione RNK (iRNK) u polipeptidni lanac (protein).

2. Replikacija (umnožavanje) - Replikacija genetičkog materijala u identičnom obliku je jedan od preduslova održanja određene vrste i zadržavanja svih specifičnih osobina koje ta vrsta poseduje.

3. Prenošenje informacija: Replikacijom uvećana količina nasledne informacije ravnomerno se, tokom mitoze, raspoređuje na ćerke ćelije, čime se obezbeđuje da svaka somatska (telesna) ćelija sadrži istu informaciju. Udvostručavanje materijala se dešava i tokom mejoze, ali novonastale ćelije (gamete) dobijaju samo polovinu od početne količine genetičkog materijala, pri čemu se formiraju različite kombinacije naslednih informacija.

4. Promenljivost (varijabilnost) - Usled mutacija, hemijskih promena u strukturi DNK, dolazi do promena u genetičkom kodu, što kroz proces transkripcije i translacije i dovodi do formiranja polipeptidnog lanca u izmenjenom obliku. Pored ovoga, genetičke varijacije mogu biti i rezultat promene u broju ili strukturi hromozoma. Ukoliko se ove promene dogode u polnim ćelijama (gametama), biće prenete na potomstvo i raširene u manjoj ili većoj meri.

Radom velikog broja naučnika, od Miescher (otkrio DNK u ćeliji), preko Hershy i Chase (dokazali da je DNK nosilac genetičke informacije), do Watson i Crick (utvrdili strukturu DNK), formulisana je tzv. centralna dogma. Prema ovoj dogmi, DNK molekuli imaju sposobnost umnožavanja (replikacija), predstavljaju matricu na osnovu koje se sintetiše informaciona iRNK (transkripcija), a zatim se od iRNK sintetišu proteini (translacija).

DNK je genetički materijal kod bakterija i viših organizama. Kod bakterija su, pored hromozoma, pronađeni i manji molekuli DNK u obliku prstena koji se nazivaju plazmidi. Njihova replikacija teče nezavisno od replikacije bakterijskog hromozoma, a pri deobi ćelije prenose se u kćerke ćelije. U ćelijama eukariota, pored jedarne DNK, nalaze se molekuli DNK u mitohondrijama i kod biljaka u plastidima.

30

Intenzivnim proučavanjem virusa, došlo se do saznanja da mnogi sadrže samo RNK i proteine, ali ne i DNK. Zaključeno je da je u ovim slučajevima RNK nosilac naslednih informacija. Kao jedan od dokaza za ovu tvrdnju može se uzeti virus mozaika duvana, koji sadrži jednolančani molekul RNK u proteinskom omotaču. Ovakva saznanja dovela su do određene modifikacije centralne dogme, po kojoj i RNK ima sposobnost replikacije, može poslužiti kao matrica za formiranje i molekula DNK i proteina.

STRUKTURA NUKLEINSKIH KISELINA

Osnovna jedinica građe DNK i RNK jeste nukleinska kiselina. Nukleinske kiseline se

danas smatraju ključnim molekulima života, jer su nosioci genetičke informacije. Prvi put su izolovane iz jedra limfocita (Miescher, 1986) i otuda im i naziv (nukleus=jedro). Nukleinske kiseline su polinukleotidi koji su izgrađeni od nukleotida. Nukleotid kao osnovna jedinica građe sadrži tri komponente: azotnu bazu, pentozni šećer i fosfornu kiselinu.

Azotne baze mogu biti purinske (adenin i guanin) i pirimidinske (citozin i timin, tj.

kod RNK umesto timina - uracil).

Nukleotid Fosforna kiselina

Dezoksiriboza – kod DNK Riboza – kod RNK

Azotna baza

Purinske baze

Pirimidinske baze

adenin (А)

guanin (G)

citozin (C)

timin(Т) –kod DNK uracil (U) – kod RNK

31

Azotne baze nose genetičku informaciju u DNA, dok šećerne i fosfatne grupe imaju

strukturnu ulogu.

Prema vrsti šećera - ugljenih hidarta (pentoza) razlikuju se dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) koja sadrži šećer 2'-dezoksiribozu i ribonukleinska kiselina (RNK) koja sadrži šećer ribozu. DNK je genetički materijal većine organizama, dok RNK neposredno učestvuje u sintezi proteina. DNK se razlikuje od RNK u kvalitativnom sastavu azotnih baza. DNK u svom sastavu ima adenin, guanin, citozin i timin, dok RNK poseduje uracil umesto timina.

Azotna baza je sa N-glikozidnom vezom povezana sa pentozom, pri čemu se hidroksilna grupa na C-1'atomu pentoze povezuje sa N-9 atomom purinske baze ili sa N-1 atomom pirimidinske baze. Azotna baza povezana sa pentozom čini nukleozid.

Fosfatna kiselina se takođe vezuje za pentozu i to za peti atom (C atom) dezoksiriboze.

Nukleotidi su fosfatni estri nukleozida. Azotne baze su unutar molekula DNK, vezuju se međusobno vodonikovim vezama, dok su pentozni šećer i fosfatna grupa spolja. Fosfatna grupa povezuje nukleotide tako što se vezuje za 5' C atom pentoze svog nukleotida, ali se istovremeno vezuje i za 3' C atom narednog nukleotida (ovo su reakcije esterifikacije).

Povezivanjem nukleotida ovim tzv. 3',5'-fosfodiestarskim vezama nastaju polinukleotidni lanci. Na jednom kraju polinukleotida nalazi se fosfat vezan za 5' C atom (tzv. 5' kraj), dok se na suprotnom kraju nalazi slobodna OH grupa sa 3' C atoma pentoze

32

(tzv. 3' kraj). Tako da se redosled baza piše u smeru 5'-3', što znači da novi lanac raste ka 3’-OH kraju. Važno je istaći da su lanci DNK međusobno antiparalelni, tj. 5' kraj jednog lanca nalazi se naspram 3' kraja drugog lanca (i obratno).

STRUKTURA DNK

Godine 1953. James Watson i Francis Crick predložili su trodimenzionalnu strukturu

DNK i mogući mehanizam njene replikacije. Važne osobine njihovog molekula DNK jesu: 1) Dva spiralna polinukleotidna lanca uvijena su oko zajedničke ose, gradeći dupli heliks. Lanci se protežu u suprotnim smerovima. 2) Purinske (adenin i guanin) i pirimidinske (timin i citozin) baze smeštene su u unutrašnjosti heliksa, dok su šećeri i fosforne kiseline smešteni u spoljnom delu spirale. 3) Prečnik heliksa je 2 nm. Razmak između susednih baza je 0,34 nm duž ose spirale. Deset baznih parova pravi pun okret (360 0C) u dvostrukom heliksu. Međutim, postoji i konformaciona fleksibilnost DNK molekula. Zavisno od fizičko-hemijskih uslova i interakcija sa molekulima u njenom okruženju, DNK molekul može imati 10 (B-forma DNK) ili 11 nukleotida (A-forma DNK), ali i 12 nukleotida (Z-forma DNK) po okretu. 4) Vodonične veze između parova azotnih baza povezuju dva komplementarna lanca. Adenin je uvek sparen sa timinom (dvostruka vodonična veza), a guanin uvek sa citozinom (trostruka vodonična veza). Znači, svaki azotni bazni par sastoji se od jednog purina i jednog pirimidina. Mada su vodonične veze pojedinačno slabe, veliki broj ovih veza daje visoku stabilnost DNK heliksu. 5) Raspored nukleotida sa određenim azotnim bazama duž polinukleotidnog lanca nije ničim ograničen. Upravo takav „slobodan“ raspored azotnih baza nosi genetičku informaciju.

Dva spiralna lanca sastoje se od niza nukleotida postavljenih jedan prema drugom. Azotne baze jednog lanca komplementarne su sa bazama drugog lanca. Dva lanca DNK su međusobno su komplementarna (ne identična).

33

Kvantitativna analiza (Chargaff) pokazala je određeni molarni odnos između komplementarnih baza. Chargaffova pravila podrazumevaju da je molarni odnos:

A=T G=C A+G=T+C Danas se zna da je kvantitativna zastupljenost parova nukleotida GC u odnosu na AT

karakteristika za svaku grupu organizama. Kod viših biljaka i životinja nalazi se više DNK u kojoj su zastupljeni AT parovi nukleotida, jer se kod njih procenat GC parova nukleotida kreće u granicama između 35% i 50%. Kod bakterija i virusa opseg variranja u procentu GC parova se kreće od 25% do 75%. Smatra se da povećanje AT parova u evoluciji viših organizama vezano sa razvitkom regulatornih oblasti u DNK (regulatornih gena), za koje je utvrđeno da u većem stepenu sadrže te nukleotide)

REPLIKACIJA DNK (DNA) (UDVAJANJE, REPRODUKCIJA)

Molekuli nukleinskih kiselina imaju sposobnost autonomne replikacije. Potrebno je da

se obavi jedna precizna replikacija u ćeliji, čime se dobija još jedan genomski set (ukupno dva), za ćerke ćelije. Model replikacije DNK je semikonzervativan, što znači da jedan roditeljski lanac služi kao matrica za sintezu novog lanca – tako da od jednog molekula DNK nastaju dva dvolančana molekula DNK, sa po jednim starim, roditeljskim lancem i jednim novosintetisanim lancem. Replikacija je i diskontinuirana, što znači da se jedan lanac sintetiše kontinuirano, a drugi se sintetiše u obliku manjih segmenata dužine oko 1000 do 2000 baznih parova kod prokariota, (dužine od 100 do 200 kod eukariota), koje prema njihovom pronalazaču nazivamo Okazaki fragmenti. Sinteza novosintetisanih lanaca je antiparalelna i komplementarna matričnim lancima DNK molekula (sinteza DNK se obavlja u 5' → 3’ pravcu).

Replikacija je proces koji obuhvata ceo DNK molekul. Za replikaciju DNK je neophodno prisustvo čitavog niza enzima:

DNK-nukleaze (helikaza i topoizomeraza) DNK-polimeraza (I, II i III), RNK-polimeraza ili primaza, DNK-ligaza DNK-nukleaze su enzimi koji seku vodonične veze polinukleotidnih lanaca. Za

proučavanje strukture DNK neobično su važni ovi restrikcioni enzimi. Endonukleaze prepoznaju specifične nizove baza u dvolančanoj DNK i seku sredinu lanca, tj. veze između

34

baznih parova. Endonukleaza zaseca nit na određenom mestu i on se pomoću specifičnih enzima (topoizomeraze) raspliće stvarajući Y formaciju (formaciju viljuške).

Ti izvanredno precizni skalpeli velika su pomoć genetičarima. Oni su neophodni instrumenti pri analizi strukture hromozoma, određivanju redosledu baza u velikim molekulima DNK, pri izolaciji gena; kao i pri stvaranju novih molekula DNK koji se zatim mogu klonirati.

DNK-ligaze su enzimi čija je funkcija suprotna od funkcije endonukleaza, tj. oni povezuju nove delove skeleta DNK. DNK-ligaze uspostavljaju vodonične veze između starog lanca i novoformiranog komplementarnog lanca. DNK-ligaze zatvaraju prekide u DNK: pri normalnoj sintezi DNK, pri popravci oštećene DNK i pri povezivanju lanaca DNK u genetičkoj rekombinaciji. Neke ligaze koriste kao izvor energije NAD (E.coli), a neke ATP (životinjske ćelije). DNK-polimeraze (DNK-polimeraza I, II, III) predstavljaju najznačajniju grupu enzima u replikaciji DNK. Njihova osnovna funkcija je stvaranje novog lanca DNK, tj. polimerizovanje pojedinačnih dezoksiribonukleozid-trifosfatnih molekula (dNTP). Uloga ovih enzima je da: 1) Katalizuju sintezu DNK iz dezoksiribonukleozid-trifosfata (dATP, dGTP, dTTP i dCTP), kao prekursora. Tom sintezom uvek upravlja DNK matrica (kalup). 2) Za njihovo otpočinjanje potreban je starter (klica ili engl. primer) molekul sa slobodnom 3'-OH grupom. Zato na odgovarajućim mestima RNK-polimeraza - sintetiše starter = početni kratki segment RNK. 3) Sinteza DNK uvek teče u smeru 5'→3'. 4) Ovi enzimi poseduju egzonukleaznu aktivnost u smeru 3'→5'.

5) DNK-polimeraza I proverava rezultat svakog koraka polimerizacije, što ga je katalizovala pre nego što će katalizovati sledeći korak. To znači da DNK-polimeraza I pokazuje korektivnu funkciju u 3'→5' smeru. DNK-polimeraza III ima funkciju da uglavnom sintetiše novu DNK, dok DNK-polimeraza I odstranjuje početni molekul RNK (starter) i popunjava prazninu koja pri tome nastaje. Na lancu koji se ne replicira kontinuirano, DNK polimeraza III sintetiše nukleotide na Okazaki fragmentima, a DNK polimeraza I otklanja startere (kojih na ovom lancu ima više) i popunjava praznine nukleotidima. Uloga DNK-polimeraze II još nije poznata. RNK-polimeraza (primaze) prepoznaju „mesto na kome počinje replikacija“.

35

Kod eukariota postoji 5 DNK polimeraza – a, b, g, d, e. g polimeraza se nalazi u mitohondrijama i učestvuje u replikaciji mtDNK. Polimeraza a sintetiše Okazakijeve fragmente, a polimeraza d polimerizuje vodeći lanac. Polimeraza b funkcioniše slično DNK polimerazi I prokariota. Polimeraza e učestvuje u reparaciji.

Proces replikacije Kod bakterija replikacija obično počinje u regionu koji je poznat kao početak

replikacije (eng. origin of replication), od koga kreću dve replikacione viljuške u suprotnim pravcima. U toku napredovanja replikacionih viljuški ka terminalnom delu molekula DNK, na novosintetisanim molekulima DNK se mogu javiti nove replikacione viljuške.

Replikacija kod prokariota je vrlo tačno proučena na primeru bakterije E. coli. Replikacija u E. coli teče na sledeči način:

1) Sinteza počinje kada se mali deo prstenastog hromozoma otvori, tj. otvori deo dvostruke spirale tako da nastaje "oko". Specifična RNK-polimeraza ili primaza (nazvana po engleskoj reči primer=osnova) sintetiše početni kratki segment RNK sa otprilike 10-20 baza, koji je komplementaran jednom od lanaca DNK kalupa. Primaza, za razliku od DNK-polimeraza ne zahteva prisutnost startera za početak sinteze polinukleotida.

2) Startert molekul ili RNK molekul se produžuje nadovezivanjem kraćih DNK niti pomoću holoenzima DNK-polimeraze III. Taj enzim, sastavljen od više podjedinica, sintetiše većinu nove DNK i ima vrlo visoku aktivnost, tako da povezuje više od 10.000 nukleotida u minuti.

3) RNK lanac u ovom hibridu RNK-DNK biva kasnije hidrolizovan pomoću DNK-polimeraze I. Poznato je da taj enzim ima i egzonukleaznu aktivnost.

4) Odstranjvanjem RNK segmenta iz novo sintetisanog lanca ostaju znatne praznine između fragmenata DNK. Te praznine popunjava takođe DNK-polimeraza I i zamenjuje nizom dezoksiribonukleotida visoko vernih originalu. Izgleda da je upravo potreba za velikom tačnošću uzrokom tako velike složenosti replikacije DNK. Genetičke analize pokazuju da se na svakih 109 do 1010 baza koje se kopiraju pojavljuje samo jedna greška.

Replikacija kod eukariota Kod eukariota, replikacija ima definisano mesto u ćelijskom ciklusu i to je S faza

interfaze. Heterohromatski regioni, koji su siromašni genima ili su trenutno neaktivni se repliciraju kasnije u odnosu na euhromatin.

Kod linearnih molekula DNK eukariota replikacija počinje na nekoliko mesta, tzv. ARS-ova (autonomous replicating sequence), koji predstavljaju mesto replikacije. I ovde nastaje replikaciona viljuška, sa dva lanca koje se kreću u suprotnim pravcima. Region DNK između dva lanca DNK, u centru kog je početak replikacije, se naziva replikon.

Proces replikacije počinje tako što topoizomeraza odvija lance u početnom regionu, za koji se zatim vezuju molekuli proteina DnkA. Topoizimeraza je enzim koji deluje kao molekulsko vreteno i odmotava dvostuku spiralu DNK.

Zatim protein DnkC dovodi helikazu (DnkB), koja raspliće-seče veze između lanaca (raskida vodonične veze) i formira se tzv. ″replikaciona viljuška″. Za te „raspletene“ lance se odmah vezuju SSB proteini. Uloga tih proteina je stabilizacija jednolančanih DNK.

Primaza (RNK-polimeraza) prepoznaje mesto replikacije i na njemu formira jedan prajmer (kratak lanac RNK) za vodeći lanac i, tokom kretanja replikativne viljuške, niz prajmera za sintezu zaostajućeg lanaca.

36

Formira se replizom koga čine helikaza, primaza, DNK polimeraza a i d (kao polimeraza III) koje sintetišu vodeći lanac i Okazakijeve fragmente počevši od prajmera koje je postavila primaza (RNK primaza).

Novi lanci (vodeći lanac i Okazaki fragmenti drugog lanca) se sintetišu od dezoksiribonukleozida – 3 – fosfata pomoću polimeraza. Polimeraza a sintetiše Okazakijeve fragmente, a polimeraza d polimerizuje vodeći lanac.

Ligaza spaja novosintetisane nukleotide. Ligaza uspostavlja i vodonične veze između komplementarnih baza, ali i fosfodiestarske veze između nukleotida kod Okazakijevih fragmenata. DNK polimeraza b (kao polimeraza I) se kreće iza novonastalih lanaca i svojom egzonukleaznom aktivnošću uklanja RNK polimeraze i ugrađuje dezoksiribonukleotide. Pri replikaciji se dvostruki lanac otvara, tako da redosled baza svakog jednostrukog lanca određuje komplementarne baze lanca koji se sintetiše. Tom sintezom nastaju dva nova molekula DNK od kojih svaki, kako smo već naveli, sadrži jedan lanac starog materijala i jedan novo sintetisani lanac. Koliko god semikonzervativni način replikacije izgleda jednostavan i očigledan, javljaju se dve teškoće.

Prva teškoća je što su niti u dvostrukom lancu omotane jedne oko druge, tako da se ne mogu lako razdvojiti. Druga teškoća je što DNK lanac pri sintezi može rasti samo u smeru 5'→3'. Sinteza se provodi tako da dolazi do nukleofilnog napada 3'-OH grupe dezoksiribonukleozid-trifosfata. Na replikacionoj viljušci, koja se pojavljuje pri replikaciji, samo jedan lanac DNK može rasti prema mestu račvanja, a drugi lanac mora rasti u smeru od tačke račvanja. Zbog tih teškoća replikacija se odvija mnogo složenije. Osim navedenih enzima za DNK replikaciju potrebno je nekoliko pomoćnih proteina - inicijalni proteini (kojih ima najmanje šestnaest). Precizno određivanje vremena početka replikacije vrlo je važno zbog usklađivanja s vremenom deobe ćelije.

STRUKTURA RNK

Ribonukleinske kiseline su polimeri ribonukleotida. Osobine RNK molekula su: - da se mogu replikovati, - da imaju kataboličku funkciju (seku i povezuju RNK molekule i katalizuju formiranje peptidnih veza između amino kiselina).

Prema funkciji u ćeliji, RNK su svrstane u tri glavne grupe: Informacione RNK (iRNK) (messenger - mRNK) Ribozomske RNK (rRNK) Transportne RNK (tRNK). Razlikujemo i heterogenu nuklearnu RNK (hnRNK) i viralnu RNK (vRNK).

Uprkos razlikama u funkciji koju obavljaju, RNK su u osnovi izgrađene po istom principu. Nukleotid se kod RNK sastoji od pentoznog šećera riboze, fosforne kiseline i jedne od azotnih purinskih (adenin i guanin) ili pirimidinskih baza (citozin i uracil). Osim uobičajenih azotnih baza, kod tRNK i rRNK se mogu nalaziti minorne baze nastale modifikacijom osnovnih baza na već sintetisanim molekulima RNK.

37

Ribonukleotid

Sve RNK nastaju transkripcijom DNK. Ribonukleotidi se ugrađuju redosledom koji je komplementaran DNK matrici koja se prepisuje. Redosled nukleotida RNK određuje njihovu primarnu strukturu. Međutim, kod RNK (posebno kod tRNK i rRNK) može se govoriti o sekundarnoj strukturi gde se u kraćim ili dužim segmentima unutar lanca nukleotidi povezuju vodoničnim vezama. Tokom evolucije tRNK i rRNK su obogaćene G-C parovima čime su termodinamički i metabolički ojačale sekundarnu strukturu zbog čega su iRNK znatno podesnije za očitavanje u procesu sinteze proteina.

Informaciona RNK (iRNK) - Funkcija joj je da prenosi informaciju o redosledu aminokiselina u polipeptidnom lancu koji će se sintetisati tokom procesa translacije. iRNK nastaje transkripcijom gena koji kodira tu informaciju i predstavlja vezu između DNK i proteina. Svakom genu ili grupi gena odgovara poseban molekul iRNK. Tako gen ostaje u jedru, a sinteza proteina se odvija u citoplazmi.

iRNK sadrži „leader“ (nekodirajuću sekvencu), protein kodirajuću sekvencu i terminalnu nekodirajuću sekvencu ili poly AAAA rep.

38

Transportne RNK (tRNK ili solubilna) - mali RNK molekuli, sa unutrašnjom

komplementarnošću, tako da grade formu deteline sa tri lista. Imaju akceptorski krak na koji se vezuju aminokiseline - CCA triplet, tri stalne i jednu promenljivu petlju. Na jednoj petlji -antikodonskoj se nalazi antikodon koji prepoznaje odgovarajući kodon iRNK. Postoji više tRNK za istu aminokiselinu. Osim uobičajenih azotnih baza, ove RNK sadrže i ceo niz „neobičnih“ ili „minornih“ baza u građi (pseudouridin, inozin, dihidrourin, itd). tRNK vezuje slobodne aminokiseline u spoljnim delovima citoplazme.

Ribozomalne RNK - Učestvuju u građi ribozoma. U ribozomima se odvija biosinteza

proteina (translacija). rRNK intereaguje sa iRNK i tRNK u svakoj fazi sinteze proteina. rRNK imaju sekvence koje su kompatibilne sa iRNK što omogućava stvaranje inicijalnog kompleksa iRNK-ribozom i pomeranje ribozoma po iRNK (čitanje kodova za sintezu).

Heterogena nuklearna RNK (hnRNK) predstavlja prekursore rRNK i tRNK, odnosno više istih i različitih kopija ovih RNK koje će se razdvojiti i međusobno i od nepotrebnih sekvenci tokom sazrevanja.

Viralne RNK (vRNK) predstavlja genetski materijal virusa. Mogu biti jednolančane i dvolančane.

GENI

Kao što smo već napomenuli, sve nasledne osobine jedinki koje se prenose kroz

generacije kontrolišu geni. Gen predstavlja jedinicu strukture, funkcije i transmisije naslednog materijala. Gen je deo molekula DNK (kod nekih virusa RNK) koji poseduje šifru za sintezu nekog funkcionalnog molekula RNK (iRNK, tRNK, rRNK ili snRNK).

39

Postoje više vrsta gena: - Strukturni gen -segment DNK koji nosi informaciju za sintezu jednog polipeptidnog lanca - Regulatorni geni - regulišu funkciju strukturnih gena - rRNK geni i tRNK geni - nose informaciju za sintezu odgovarajućih RNK Kada se govori o strukturi i funkciji gena, obično se misli na strukturne gene.

Geni su međusobno odvojeni marginama-spejserima (eng.spacer) koje se prepisuju. Sekvenca gena koja se prepisuje se sastoji od: -sekvence promotora (na početku gena) - introna- (unutrašnjih margina) koje se prepisuju, ali se naknadno isecaju - egzona – sekvenci čiji će transkript graditi zrelu iRNk - terminacione sekvence.

TRANSKRIPCIJA

Transkripcija je proces sinteze RNK na osnovu DNK matrice. Počinje na sekvenci promotora i teče do stop-kodona (terminacione sekvence). Ovaj proces katalizuje RNK - polimeraza, a pod uticajem je regulatornih gena, pa se prepisuju samo geni čiji je transkript neophodan za funkciju ćelije. Za transkripciju je potrebno:

- Jednolančana DNK matrica - Substrat ribonukleozid 3-fosfati (rNTP) od kojih nastaje novi RNK molekul - Transkripcioni aparat koji se sastoji od proteina neophodnih za sintezu RNK

40

Transkripcioni lanac je jednolančani matrični razmotani DNK segment. Sinteza RNK se odigrava samo na jednom matričnom lancu DNK. Drugi lanac DNK je nematrični lanac za sintezu RNK.

Transkripcija je selektivni proces jer obuhvata samo deo DNK molekula (gen). Transkripcija se sastoji od: - prepoznavanja promotora - inicijacije, - elongacije i - terminacije. Promotori su specifične nukleotidne sekvence na DNK molekulu. Danas se zna da

starni signal danas predstavlja KOD (triplet nukleotida) A-T-G. RNK polimeraza „putuje“ duž DNK molekula sve dok ne prepozna promotor. Vezujući se za promotor, RNK polimeraze formiraju stabilan „zatvoren“ inicijalni kompleks.

Nakon vezivanja za promotor, nastupa lokalna denaturacija DNK tako da je omogućen pristup prekusorskim molekulima - ribonukleozid 3'-fosfatima. Nastaje „otvoren“ kompleks inicijacije u kome je RNK polimeraza vezana za jedan od lanaca DNK (matrični lanac). Ugrađivanjem prvog nukleotida završen je proces inicijacije i počinje izduživanje RNK lanca (elongacija). Dolazi do konformacije subjedinica od kojih je sastavljena RNK polimeraza što omogućava kretanje RNK polimeraze duž DNK matrice i sintezu lanca RNK.

Tokom elongacije tačnost ugrađivanja nukleotida u rastući lanac RNK zavisi isključivo od RNK polimeraze. Transkripcija je antiparalelna i komplementarna jednom lancu DNK molekula. Sinteza RNK se obavlja u 5’ → 3’ pravcu što znači da RNK molekul raste ka 3’-OH kraju.

Terminacija transkripcije nastupa kada RNK polimeraza naiđe na terminacione sekvence (stop-signali na DNK). Stop-kodoni su TAA, TAG i TGA. Stop-kodone ne prepoznaje tRNK već specifični proteinski faktori (RF-1 i RF-2).

Kod eukariota, nakon transkripcije ovih diskontinuiranih gena nastaje molekul označen kao primarni transkript. Proces formiranja tri osnovna tipa RNK (iRNK, tRNK i rRNK) sposobnih da se uključe u translaciju podrazumeva izvesne hemijske modifikacije i isecanje nekodirajućih sekvenci. Ovaj proces je obrada primarnog transkripta i

41

podrazumeva da se nekodirajuće sekvence - introni isecaju sa primarnog transkripta kako bi u transkriptu bili samo egzoni.

Isecanje introna vrši se pod dejstvom endonukleaze i ligaze, a način isecanja zavisi od tipa RNK. Pre isecanja introna informacionu RNK obeležavamo kao pre-iRNK. Strukture koje isecaju introne u pre-iRNK zovu se splajsozomi (izgrađeni od RNK i proteina).

Kod eukariota na iRNK se posle isecanja introna na 5’ kraju dodaje i karakteristična „kapa“ (eng. cap), dok se na 3’kraju molekula iRNK dodaje tzv.poli-A rep. Kapa formacija predstavlja specifične strukture aminokiselina, poli-A rep strukture nukleotida.

Važno je napomenuti razlike u transkripciji prokariota i eukariota. S obzirom da DNK prokariota nije odvojena membranom, tj. nema jedra, RNK je tokom transkripcije samo jednim krajem vezana za DNK prokariota (3’kraj), dok se za oslobođeni 5’vezuju za ribozome. Znači, translacija (sinteza proteina) može započeti dok još uvek traje transkripcija. Kod eukariota proces transkripcije i translacije su i prostorno i vremenski odvojeni. Znači, transkripcija se odvija u jedru, mora da se završi, da bi transkript iRNK (preko tRNK i rRNK) dospeo do ribozoma u citoplazmi gde onda započinje translacija.

GENETIČKI KOD

Geni kontrolišu strukturu polipeptida pa je važno objasniti kakva je priroda genetičke

šifre (genetičkog koda) koji povezuje sekvencu parova baza u DNK → sekvencu baza u iRNK → sekvencu aminokiselina.

Informacija o primarnoj strukturi proteina koji je kodiran datim genom je zapisana „šifrom“ u kojoj je informacija o sintezi jedne aminokiseline data tripletom nukleotida (kod).

Kombinacijama 4 baze dobijaju se 64 mogućnosti za kodiranje 20 aminokiselina. Kako u proteinima biljaka postoji samo 20 aminokiselina, jednu aminokiselinu može kodirati i više tripleta. Samo su aminokiseline metionin i triptofan specifikovane jednim kodom, dok je za većinu (18) aminokiselina postoji više od jednog tripleta nukleotida (više od jednog koda). Ta pojava (da za jednu aminokiselinu postoje više kodova) se naziva izrođenost genetskog koda. Takođe, postoje i tri tripleta koji kodiraju kraj sinteze proteina.

Šifra u DNK se naziva KOD, u iRNK - KODON, a na tRNK se nalaze ANTIKODONI koji prepoznaju kodone. Genetski kod u tabeli se obično predstavlja kodonima u iRNK.

42

Strukturna i funkcionalna razlika u ćelijama uslovljena je razlikom produkata ekspresije genetičke informacije. Proces sinteze RNK i proteina u toku koga se genetička informacija prenosi se DNK na mesto sinteze proteina u citoplazmi naziva se ekspresija gena. Ona se sastoji iz dva procesa i to transkripcije (sekvenca baza DNK –genetički kod se kopira u molekul iRNK - kodon) i translacija, proces koji kodon u molekulu iRNK prevodi u antikodon za specifičnu tRNK koja nosi odgovarajuću aminokiselinu.

TRANSLACIJA Translacija (biosinteza proteina) predstavlja najkompleksniji biohemijski proces u

živim sistemima. Translacija je ciklični, endogeni, multistepeni biohemijski proces u kojem se slobodne aminokiseline polimerizuju u genetički determinisane sekvence polipeptida.

Stvaranje peptidnih veza između aminokiselina

Nukleotidni sastav DNK određuje strukturu proteina. Eksperimentalno je utvrđeno da

su tri nukleotida (triplet nukleotida) u molekulu DNK „kod ili šifra” za jednu aminokiselinu.

43

Tripleti baza-kodoni u iRNk za sintezu

aminokiselina

Phe – fenilalanin Thr – treonin Asp – asparaginska kiselina Leu – leucin Ala – alanin Glu – glutaminska kiselina Ile – izoleucin Tyr – tirozin Cys – cistein Met – metionin His – histidin Trp – triptofan Val – valin Gln – glutamin Arg – arginin Ser – serin Asn – asparagin Gly – glicin Pro – prolin Lys – lizin STOP – terminalni kodon

Translacija se odigrava u ribozomima. Ribozomi prokariota i eukariota razlikuju se po

veličini i konstanti sedimentacije (S). Svaki ribozom sastoji se od dve podjedinice (velika i mala subjedinica). Svaka podjedinica se sastoji od nekoliko tipova rRNK i oko 50 proteina, tako da se subjedinice razlikuju kako po konstanti sedimentacije, tako i po veličini.

U ovom biohemijskom procesu genetska poruka DNK se pomoću iRNK (koja se vezuje na ribozomima na mestu sinteze proteina) usmerava za povezivanje aminokiselina određenim redosledom, zavisnim od redosleda koda u iRNK. Utvrđeno je da se iRNK kao nit provlači kroz ribozome odnosno njegove agregate koji mogu biti izgrađeni od 4 – 100 ribozoma. Svi ribozomi u ćeliji su identični i nespecifični u smislu da učestvuju u sintezi različitih proteina zahvaljujući očitavanju iRNK sa različitim kodirajućim sekvencama.

Sastav i građa ribozoma

44

Mogućnost prevođenja određenog kodona u odgovarajuću aminokiselinu definisana je strukturom tRNK. Molekul tRNK ima oblik lista deteline koji se sastoji od četiri dvostruko spiralne stabljike i tri jednolančane petlje. Srednja petlja nosi nukleotidni triplet nazvan antikodon, čiji je zadatak da se veže za specifičan kodon u iRNK sparivanjem komplementarnih baza (ponovo model komplementarnosti). Kako se kodoni u iRNK čitaju u smeru 5’→3', antikodoni su orijentisani u smeru 3'→5'. tRNK je specifična za samo jednu aminokiselinu, koju nosi na svom slobodnom 3' kraju.

Pre početka translacije, dejstvom enzima aminoacil-tRNK sintetaze aktiviraju se aminokiseline. Naime, aminoacil tRNK sintetaze prepoznaju kako aminokiselinu, tako i tRNK sa odgovarajućim antikodonom. Ovim „prepoznavanjem“ obezbeđuje se tačno vezivanje aminokiselina sa onom tRNK koja nosi odgovarajući antikodon. Karboksilna grupa određene aminokiseline se vezuje sa 3'-OH grupom na kraju tRNK i tako se prenosi do ribozoma. (Napomenimo, da su ustvari na kraju tRNK uvek CCA baze (citozin-citozin-adenin), tako da se za -OH grupu adenina vezuje karboksilna grupa aminokiseline).

Prema većini autora, i biosinteza proteina može da se podeli u tri faze:

-inicijacija

-elongacija

-terminacija.

Inicijacija uključuje reakcije pre početka formiranja peptidnih veza između dve aminokiseline u sastavu datog proteina. U proces inicijacije uključeni su posebni proteinski faktori tzv. faktori inicijacije (IF). Oni su neophodni kako za povezivanje male subjedinice ribozoma sa iRNK, tako i za ulazak prve tRNK u ribozom.

Faktor inicijacije IF3 male subjedinice ribozoma povezuje sa iRNK. tRNK za koju je vezana aminokiselina metionin (formilovani oblik) povezuje se sa

iRNK na kojoj je kodon za metionin. Aminogrupa metionina u ovoj tRNK je formilovana: N-formil metion i to je tRNKf

Met. Ova tRNKfMet naziva se inicijatorna.

Faktor inicijacije IF2 povezuje tRNKfMet za veću subjedinicu ribozoma. U tom

trenutku su na većoj subjedinici ribozoma formirana tri mesta: aminoacilno (A-mesto),

45

peptidno (P-mesto), i mesto izlaza-exita (E). U P-mestu se već nalazi tRNKfMet, dok je A-

mesto (aminoacilno) trenutno prazno. Elongacija započinje kada u aminoacilno mesto (A-mesto), prema kodonu iRNK,

dolaze ostale tRNK sa aminokiselinama. Tada metionin ostavlja tRNKfMet i njegova COOH

grupa se vezuje peptidnom vezom sa NH2 grupom aminokiseline koja je u aminoacilnom mestu. Time se dve aminokiseline vežu peptidnom vezom, a tRNKf

Met (sada samo tRNK) odlazi na E mesto i oslobađa se. U okrilju ribozoma obezbeđeno je adekvatno prepoznavanje kodona i antikodona, pri čemu ribozom putuje duž iRNK u smeru 5'→3' pomerajući se za po jedan kodon što dovodi do rasta (elongacije) polipeptidnog lanca. Ribozom može da prihvati najviše dve tRNK sa određenim aminokiselinama. Proces stvaranja polipeptidnih veza između dve amnokiseline se nastavlja, sve dok se na iRNK ne pročitaju stop kodoni (terminalni kodoni). Brzina sinteze je 8 – 15 aminokiselina u sekundi, a u jednom momentu veći broj ribozoma može biti aktivan na jednoj iRNK .

Terminacija ili završetak sinteze proteina nastupa kada terminalni kodon iRNK dođe u ribozom. Terminalni kodoni su UAA, UGA i UAG. Pored terminalnih kodona biosintezu zaustavljaju i proteinski faktori R1 (prepoznaje kodone UAA i UAG), R2 (prepoznaje kodone UAA i UGA) i R3 (koji kod biljaka ima GTP – aznu aktivnost).

Posle razdvajanja polipeptida od molekula tRNK i razdvajanja iRNK od kompleksa ribozom – iRNK dolazi do „raspada” ribozoma na dve subjedinice, koje kasnije mogu da budu uključene u drugi ciklus sinteze proteina.

46

Inicijacija

Elongacija

Terminacija

47

DEOBA ĆELIJE I OPLODNJA Nastanak, rast i razvoj svih organizama, od jednoćelijskih do višećelijskih, zasniva se

na deobi ćelija. U tom pogledu, za svaku ćeliju je karakterističan tzv. ćelijski ciklus, tokom kojeg ćelija prolazi kroz određene stadijume i promene od jedne do druge deobe. Novi ćelijski ciklus započinje nakon deobe ćelije i formiranja dve nove ćelije. Svaka od ovih ćelija raste i razvija se i na kraju ciklusa se ponovo deli stvarajući dve nove ćelije. Dužina trajanja ćelijskog ciklusa zavisi od vrste i kod sisara jedan ciklus traje oko 24 časa.

Mitoza – kariokineza (ekvaciona deoba)

Mitoza je indirektna deoba kojom se dele telesne (somatske) ćelije. U literaturi je

poznata i kao ekvaciona deoba ili kaoriokineza. Naziv mitoza potiče od grčke reči “mitos” koja znači nit ili konac i odnosi se na promene koje se dešavaju prvenstveno u „končastim“ hromozima jedra.Tokom mitoze mogu se uočiti dva osnovna momenta: deljenje jedra (kariokineza) i deljenje citoplazme (citokineza).

Mitoza predstavlja poseban tip ćelijske deobe u kojoj od jedne materinske ćelije nastaju dve ćelije kćeri sa istim brojem hromozoma tj. istom naslednom informacijom kao i ćelije iz koje su nastale. Suština ove pojave proizilazi iz činjenice da se svaki hromozom materinske ćelije uzdužno podeli, čemu prethodi duplikacija molekula DNK, na dve hromatide, buduće hromozome novonastalih ćelija kćeri.

Genetički smisao mitoze sastoji se u vernoj reprodukciji nasledne informacije i osnovnih komponenata ćelije nastalih posle deobe citoplazme i njenih organela. S obzirom na to da se po pravilu ista nasledna osnova samo iz materinskih ćelija replicira u ćelije kćeri, mitoza se smatra konzervativnim procesom koji za rezultat ima obrazovanje ćelija kćeri sa praktično identičnom genetskom konstitucijom kao i materinska ćelija. Suština mitoze se nalazi u mehanizmu reprodukcije ćelije, a samim tim i celog organizma. Putem sukcesivnih mitotskih deoba ostvaruje se rast, ontogenetsko razviće organizma i vegetativno razmnožavanje organizama.

Na primer, kod čoveka se oplođena jajna ćelija – zigot na ovaj način počinje deliti, i takvih deoba njenih replika, do odrastanja čoveka ima oko 50, tako da na kraju odrasli organizam ima 1014 ćelija koje imaju, po pravilu, izuzev polnih ćelija, istovetne kariotipove tj. setove hromozoma.

Mitoza je proces deobe i povećanje telesnih (somatskih) ćelija. Kod biljaka mitoza se odvija u vršcima korena, tačkama rasta stabla, semenim pupoljcima i u svim drugim organima koji sadrže meristemsko tkivo. Ostali organi (listovi, stablo) rastu povećanjem zapremine ili volumena ćelija. Kod životinja mitoza se odvija u dubokom sloju pokosnice, u hrskavičinom sloju između dijafize i epifize kosti, u bazalnom sloju ćelija epidermisa, u koštanoj srži, vezivnom tkivu i u svim sluzokožama.

Deoba se odvija GEOMETRIJSKOM progresijom (1–2–4–8–16–32–64 itd), i tako malim brojem deoba i diferencijacijom nastaje organizam koji sadrži milione i bilione ćelija.

48

Šematski prikaz odvijanja ćelijske deobe - MITOZE

Ćelijski ciklus - MITOZA sastoji se od dve glavne faze: interfaze i M faze.

Prva je interfaza, period između ćelijskih deoba, tokom kojeg ćelija raste, razvija se i tokom nje se odvijaju procesi važni za predstojeću deobu. Tokom interfaze se sintetiše (replikuje) nova DNK, stvaraju se RNK i proteini, uz istovremeno odvijanje na stotine biohemijskih reakcija neophodnih za normalno funkcionisanje ćelije.

Interfazu čine tri podfaze: G1, S i G2. Dužina interfaze varira zavisno od tipa ćelije, ali se uopšteno može reći da je trajanje G1 podfaze oko 10 sati, S podfaze 9 sati i G2 podfaze oko 4 sata kod ćelija sisara.

U G1 fazi (period rasta), ćelija raste i sintetiše dezoksiribonukleozid 3-fosfat, ribonukleozid 3-fosfa i druge komponente neophodne za njenu deobu. Za ovu početnu podfazu interfaze karakteristični su procesi transkripcije i translacije.

Pri prelasku ćelije iz G1 faze u S fazu, ćelija prolazi kroz restrikcionu tačku - tačku provere da li je sve spremno za narednu fazu. Interesantno je da, usled određenih regulatornih

49

mehanizama, ćelija može preći iz aktivnog stanja rasta i deobe u fazu nedeljenja (G0), tokom koje zadržava konstantnu veličinu.

Tokom S faze (sintetički period), odvija se intenzivan proces replikacije DNK, kao i sinteza histona, gradivnih komponenti hromozoma. Znači, svi hromozomi u ćeliji su dobili još po jedan molekul DNK, tako da se svaki hromozom sastoji od dva molekula DNK. Odnosno, svaki hromozom u ćeliji ima dve sestrinske hromatide u kojima je po jedan molekul DNK

Nakon toga, ćelija ulazi u G2 fazu (postsintetički period), tokom koje se odvija nekoliko važnih biohemijskih procesa, neophodnih za ćelijsku deobu. Mehanizmima DNK reparacije u G2 fazi otklanjaju se greške na molekulima DNK do kojih je moglo da dođe tokom replikacije. U ovoj fazi je naročito intezivna sinteza tubulina, gradivne komponente deobnog vretena. Centrozomi (par centriola sa centozomskim matriksom) se dupliraju, ali ostaju zajedno kao kompleks sa jedne strane jedra. Na kraju ove podfaze, jasno se uočavaju hromozomi sastavljeni od dve sestrinske hromatide spojene čitavom dužinom.

Centralno mesto u kontroli ćelijskog ciklusa pripada familiji protein kinaza (kinaze su enzimi koji dodaju supstratu fosfatne grupe) nazvanih ciklin-zavisne kinaze (Cdk). Ovi enzimi imaju enzimsku aktivnost samo kada su vezani za proteine cikline. Pronađeno je da postoje četiri klase ciklina, zavisno od faze ćelijskog ciklusa u kojoj se vezuju za Cdk da bi ovi enzimi ostvarili svoju aktivnost/dejstvo. Tri klase ciklina su neophodne svim eukariotskim ćelijama:

1.G1/S ciklini - vezuju Cdk na kraju G1 faze i predodređuju ćeliju da počne sa replikacijom DNK.

2. S ciklini - vezuju Cdk tokom S faze i neophodni su za početak replikacije DNK 3. M ciklini - promovišu mitozu. Četvrta klasa je G1 ciklini koji pomažu ćeliji da prođe kroz restrikcionu tačku u

kasnoj G1 fazi. M faza (mitotska faza) je period intenzivne ćelijske deobe. Za mitotsku fazu

karakterističan je proces deobe jedra (mitoza ili kariokineza), kao i deoba citoplazme (citokineza).

Proces deobe jedra - mitoza dodatno se deli na pet faza: profaza, prometafaza, metafaza, anafaza i telofaza. Za svaku fazu mitoze karakteristični su određeni procesi.

Profaza - Aktivni kompleks M ciklina sa Cdk predstavlja biohemijski signal kojim otpočinje profaza. Kompleks centrozoma se deli i dolazi do međusobnog udaljavanja centriola. Oko njih se radijalno pružaju mikrotubule (aster). U biljnoj ćeliji ne postoje ni centriole ni asteri.

Nakon dupliciranje u S fazi replicirani hromozomi sadrže po dve sestrinske hromatide međusobno spojene na mestu centromere proteinima (kohezini). Ovaj kompleks naziva se kinetohor. Do kraja ove faze niti hromatida se postepeno spiralizuju i skraćuju, i vezuju za mikrotubule (deobno vreteno).

U završnoj profazi (prometafaza) dezintegrišu se jedarne opne i opna jedarceta. Metafaza- dolazi do potpune spiralizacije hromozoma. Tokom metafaze kinetohorne

mikrotubule (deobno vreteno za koje su vezani kinetohori hromozoma) orjentišu hromozome tako da su njihove centromere u jednoj ravni na pola puta od polova deobnog vretena

50

(“metafazna ploča”). Ukoliko neki hromozom nije povezan, njegov kinetohor šalje signal da se anafaza odlaže dok se ne obavi njihovo pravilno povezivanje sa mikrotubulama.

Anafaza - U anafazi se naglo oslobađa kohezin - protein koji je držao sestrinske hromatide zbog čega dolazi do njihovog razdvajanja. Mikrotubule (niti deobnog vretena)povlače razdvojene hromatide i one se kreću ka suprotnim polovima deobnog vretena. Nakon što su sestrinske hromatide napravile izvesno odstojanje dolazi i do udaljavanjacentriola (polova deobnog vretena) što dodatno pomaže razdvajanje sestrinskih hromatida.

Telofaza - završeno je kretanje hromatida ka polovima. Odvija se despiralizacija hromozoma i ponovno formiranje jedarne opne i jedarceta. Nestaju mikrotubule deobnog vretena.

Razdvajanje sestrinskih hromatida rezultira formiranjem dva identična kompleta (garniture, genoma) genetičkih informacija za svaku od novonastalih ćelija. Odvijanje ćelijskog ciklusa određuje nekoliko kontrolnih tačaka, u kojima se ciklus zaustavlja ukoliko nisu ispunjeni svi uslovi za nastupanje sledeće faze (npr. sinteza DNK nije završena, reparacija oštećenih molekula DNK, nepotpuno povezivanje hromozoma sa nitima deobnog vretena i dr.).

Citokineza (deoba citoplazme) obično započinje u anafazi a završava se u telofazi. Krajnji rezultat je formiranje dve nove ćelije sa po jednim jedrom. Postoje i slučajevi izostajanja citokineze, pri čemu dolazi do formiranja višejedarnih ćelija. Kod životinjskih ćelija deoba citoplazme nastaje formiranjem deobne brazde na površini ćelije, dok se kod biljnih ćelija u središnjem delu formira posebna struktura (fragmoblast), koja se postepeno širi ka periferiji ćelije.

Kod ćelija prokariota, deoba je relativno jednostavan proces s obzirom da sadrže samo jedan hromozom. Najčešće, replikacija započinje na specifičnom mestu bakterijskog hromozoma, tzv. mesto replikacije. U optimalnim uslovima, deoba bakterijskih ćelija se obavlja na svakih 20 minuta, tako da u toku 10 sati od jedne jedine bakterijske ćelije može nastati milijardu novih.

Kod eukariotskih ćelija reprodukcija je složeniji proces, s obzirom da veći broj hromozoma mora biti umnožen i raspoređen u nove ćelije. Da bi reprodukcija ćelija eukariota bila uspešna neophodno je da se odigra proces replikacije DNK, razdvajanje nastalih kopija (sestrinskih hromatida) i podela citoplazme. Zahvaljujući ovim mehanizmima, dolazi do prenošenja genetičkih informacija i oni predstavljaju osnovu sličnosti i razlika između roditelja i potomstva.

Mejoza Mejoza predstavlja posebnu vrstu ćelijske deobe, veoma važnu u procesu formiranja

polnih ćelija (gameta ili spora) i razmnožavanju vrsta. Formirane gamete imaju veoma važnu ulogu u prenošenju genetičke informacije sa roditelja na potomstvo, pri čemu u sebi sadrže haploidan (n) broj hromozoma. Tokom mejotičke deobe, svaka novonastala polna ćelija dobija samo jedan hromozom iz homologog para, što predstavlja osnovnu razliku u odnosu

51

na mitozu. Na ovaj način, spajanjem gameta roditelja nastaje potomstvo koje ponovo ima diploidan broj hromozoma, specifičan za datu vrstu.

Početkom 20. veka, Walter Sutton i Theodore Boveri su, prateći procese koji se odvijaju tokom mejoze, došli do zaključka da su geni locirani na hromozomima i da se istovremeno sa razdvajanjem hromozomskih parova u novoformirane gamete, dolazi i do razdvajanja genskih (alelnih) parova. Ovim otkrićem oni su potvrdili pretpostavke koje je formulisao Mendel i postavili osnovu hromozomske teorije o nasleđivanju. Prema ovoj teoriji, sve nasledne osobine su kontrolisane od strane gena lociranih na hromozomima, koji se verodostojno prenose putem gameta na potomstvo, omogućavajući genetički kontinuitet iz generacije u generaciju.

Još jedna bitna razlika u odnosu na mitozu, tokom koje nastaju genetički identične ćelije, jeste da mejotičkom deobom nastaju genetički različite ćelije, koje poseduju jedinstvene kombinacije roditeljskih hromozoma a time i gena. Tako velika genetička varijabilnost unutar gameta omogućava izuzetno veliki broj mogućih kombinacija roditeljskih hromozoma i gena tokom oplodnje. Pored toga, tokom mejoze dolazi i do pojave krosing-overa (razmena delova hromozoma iz homolognog para), što za posledicu ima razmenu genetičke informacije i još veći stepen genetičke varijabilnosti i broj mogućih kombinacija u potomstvu. Zbog ovih pojava, deo nastalog potomstva se u značajnoj meri razlikuje u odnosu na roditelje, čime mejoza predstavlja glavni izvor genetičke varijacije unutar vrste.

Treća bitna razlika u odnosu na mitozu jeste da se mejoza sastoji od dve ćelijske deobe, mejoze I i mejoze II. Tokom mejoze I (redukciona deoba) dolazi do smanjenja broja hromozoma od diploidnog na haploidni. U drugoj mejotičkoj deobi (ekvaciona deoba) odvijaju se procesi odvajanja sestrinskih hromatida, pri čemu u novonastalim ćelijama broj hromozoma ostaje haploidan, po čemu je slična mitozi.

Slično mitozi, dvema ćelijskim deobama prethode G1, S i G2 faza (interfaza), pri čemu kod mejoze ove pripremne faze sinteze proteina, nukleotida i drugih komponenata, kao i replikacija DNK traju znatno duže nego kod mitoze.

I kod mejoze, u S fazi odigrala se replikacija DNK, tako da se svaki hromozom sastoji od dve sestrinske hromatide u kojem je po jedan molekul DNK.

Slično mitozi, mejoza I i II se dele na faze: profaza, metafaza, anafaza i telofaza. Profazu I mejoze I karakterišu veoma složeni procesi zbog čega je izvršena podela na

pet stadijuma: leptoten, zigoten, pahiten, diploten, dijakinezis. Tokom leptotena se odvija kondenzacija homologih hromozoma i oni postaju vidljivi.

U zigotenu se nastavlja skraćivanje i zadebljavanje hromozoma. Homologi hromozomi se približavaju i sparuju u bivalente. Proces sparivanja se naziva sinapsis (sparivanje). Sinapsis omogućava tzv. sinaptički kompleks - proteinska struktura u vidu trake koja blisko povezuje hromatide homologih hromozoma.

52

Ovakva struktura, sastavljena od četiri hromatide naziva se tetrada. Broj tetrada kod

date vrste je jednak haploidnom (n) broju karakterističnom za tu vrstu. U pahitenu se ostvaruje razmena genetičkog materijala (crossing over) što dovodi do

rekombinacija. Mesto odvijanja crossing-overa uočljivo je tek u narednom stadijumu. Stadijum diplotena odlikuje jasnije izražena tetradna struktura i početak razdvajanja homologih parova (desinapsis). Međutim, pojedina područja nesestrinskih hromatida ostaju povezana u tzv. hijazme, za koje se smatra da predstavljaju mesta razmene genetičke informacije putem crossing-overa tokom pahitena. S obzirom da se crossing-over može desiti i između sestrinskih hromatida, čitava struktura povezana hijazmama može imati veoma kompleksan izgled. Mesta na kojima je došlo do crossing-overa imaju izgled mozaika sastavljenog od delova očinskih i majčinskih hromatida.

Dijakinezis predstavlja završni stadijum profaze I. Nastavlja se dalje razdvajanje homologih hromozoma, pri čemu se hijazme pomeraju ka krajevima hromatida (terminalizacija hijazmi), koje su povezane samo vrhovima. Takođe, dolazi do razgradnje jedarceta i jedarne opne, nakon čega se parovi homologih hromozoma razmeštaju u ekvatorijalnu ravan deobnog vretena, što predstavlja završetak profaze I.

Nakon profaze I odvijaju se procesi slični mitozi.

Crossing-over

53

Tokom metafaze I, hromozomi su maksimalno skraćeni i zadebljali. Hijazme na krajevima hromatida predstavljaju jedine tačke u kojima se nesestrinske hromatide dodiruju, tj. mesta na kojima su homologi hromozomi spojeni (sestrinske hromatide u jednom hromozomu spojene su kinetohorom). Deobno vreteno je kompletno formirano i niti su povezane sa centromerama homologih hromozoma. Raspored tetrada u ekvatorijalnoj ravni je slučajan, pri čemu je jedan hromozom svake tetrade orijentisan ka jednom polu a drugi hromozom ka drugom polu.

Tokom svih faza mejoze I, centromere homologih hromozoma ne podležu deobi, tako da sestrinske hromatide ostaju zajedno tokom cele redukcione deobe.

U anafazi I, homeologi hromozomi koji čine polovine svake tetrade bivaju premešteni ka suprotnim polovima ćelije u deobi. Na ovaj način od tetrada se formiraju dijade. Razdvajanje hromozoma poreklom od oca i od majke ka polovima odvija se po principu slučajnosti, što omogućava veliki broj kombinacija hromozoma u gametima po završetku mejoze. S obzirom da sestrinske hromatide u hromozomu (dijadi) ostaju povezane u oblasti centromera, broj dijada-hromozoma na polovima jednak je haploidnom broju.

U telofazi I dijade (hromozomi) su razmeštene na polovima deobnog vretena i kod većine organizama dolazi do formiranja membrane jedra oko dijada i citokinezom nastaju dve ćelije. U tom slučaju, jedro ulazi u kratki interfazni period, pri čemu ne dolazi do replikacije hromozoma s obzirom da se već sastoje od dve hromatide. U suprotnom, ćelije direktno prelaze iz anafaze I u mejozu II.

Mejoza II ili druga deoba omogućava podelu sestrinskih hromatida iz homologog para hromozoma na novoformirane gamete i održavanje njihovog haploidnog broja.

U profazi II, svaka dijada-hromozom se sastoji od para sestrinskih hromatida povezanih centromerom, koje podležu procesu kondenzovanja (zadebljavanja). Tokom metafaze II, formira se deobno vreteno i hromozomi (dijade) se postavljaju u ekvatorijalnu ravan. Razdvajanjem sestrinskih hromatida jednog hromozoma (dijada) ka polovima započinje anafaza II, čime hromatide postaju posebni hromozomi (monade). U telofazi II, na polovima se uočava haploidan broj hromozoma i dolazi do formiranja jedarne opne. Nakon toga, dolazi do deobe citoplazme i despiralizacije hromozoma.

Šema crossing-overa i raspodela hromozoma

54

Kao rezultat svega, formiraju se četiri gamete sa haploidnim brojem hromozoma, koje sadrže različite kombinacije roditeljskih naslednih informacija, zahvaljujući crossing-overu.

Na ovaj način, mejoza u značajnoj meri povećava nivo genetičke varijacije u potomstvu.

Gametokineza kod životinja

Gametogeneza je proces formiranja polnih ćelija (gameta) u gonadama (polnim organima). Proces nastanka spermatozoida naziva se spermatogeneza, a proces nastanka jajne ćelije - ovogeneza. Zna se da gameti imaju haploidan (n) broj hromozoma (kod čoveka 23). Ovo ukazuje da je mejoza sastavni deo gametogeneze.

Gametogeneza prolazi kroz tri faze: umnožavanje, rast i sazrevanje gameta.

Spermatogeneza se kod sisara odvija u testisima (semeničnim kanalima muških gonada) i počinje u vreme polnog sazrevanja (kod muškarca u doba puberteta).

Umnožavanje (spermatogonija) - mitotičkim deobama germinativnih (polnih) ćelija nastaju dve grupe ćelija : spermatogonije (A i B).

Rast - Spermatogonije B prestaju sa umnožavanjem i ulaze u fazu rasta. U ovoj fazi spermatogonije se transformišu (morfološki i biohemijskim procesima) u primarne spermatocite. Ove spermatocite imaju 2n hromozoma jer su nastale iz ćelija koje su se umnožavale mitozom (mitotičkom deobom) u gonadama.

Sazrevanje gameta - primarne spermatocite u ovoj fazi, fazi sazrevanja prolaze kroz mejozu. Nakon mejoze I nastaju sekundarne spermatocite koje imaju haploidan (n) broj hromozoma. Tokom mejoze II svaki hromozom se podelio na dve sestrinske hromatide. Nakon mejoze II od jedne sekundarne spermatocite nastale su dve spermatide, koje takođe imaju haploidan (n) broj hromozoma.

Znači, jedan gamet ulazi u fazu sazrevanja kao primarna spermatocita, nakon mejoze jedan dobijamo dve sekundarne spermatocite. Dve sekundarne spermatocite se dele na po dve hromatide, zbog čega nakon mejoze II dobijamo četiri spermatide.

Spermatide se transformišu tako što postepeno gube citoplazmu, hromatin se izrazito kondenzuje, a Golđijev aparat (organela u ćeliji) na spermatidama stvara vezikulu ispunjenu hidrolitičkim enzimima (akrozom). Ovim procesima se spermatide transformišu u spermatocite - fiziološki spremne da oplode jajnu ćeliju.

Oogeneza se kod ženskih sisara odvija u jajnicima (ovariumima). Počinje u trećem mesecu embrionalnog razvića.

Oogonije (ženske polne ćelije) se mitotičkom deobom razmnožavaju samo u embrionalnom razvoju. U uterusu majke oogonije rastu i prelaze u primarne oocite. Rođenjem, u jajnicima sisara postoje samo primarne oocite. Oocite su okružene posebnim hranljivim ćelijama (folikularne ćelije).

Tokom svog rasta, primarne oocite ulaze u fazu sazrevanja, u mejotičku deobu. Međutim, primarne oocite u mejozi I, u stadijumu diplotena ulaze u fazu mirovanja. Ove ćelije miruju sve do polne zrelosti kada pod uticajem hormona dolazi do umnožavanja folikularnih ćelija - ćelija koje okružuju primarnu oocitu. Zbog rasta ovih ćelija, tečnost

55

folikula potiskuje oocitu ka periferiji folikula. Dok raste folikul, primarna oocita prolazi kroz mejozu I. Nakon mejoze I od jedne primarne oocite sa diploidnim brojem (2n) hromozoma nastaju dve ćelije - jedna sekundarna oocita i jedna primarna polocita. Kada se završi mejoza I, folikul prska i izbacuje sekundarnu oocitu i primarnu polocitu u jajovod.

Obe ćelije u jajovodu prolaze kroz mejozu II, ali od sekundarne oocite na kraju mejoze nastaju dve ćelije - jedna je jajna ćelija, a druga sekundarna polocita. Od primarne polocite na kraju mejoze takođe nastaju dve ćelije - dve sekundarne polocite. Polocite nemaju ulogu u reprodukciji, već samo jajna ćelija.

Spermatogeneza i oogeneza

Makrosporogeneza i mikrosporogeneza

Procesi razvoja polnih ćelija kod biljaka nazivaju se makrosporogeneza i mikrosporogeneza.

Mikrosporogeneza predstavlja razvoj muškog sporofita kod biljaka. Muška mikrospora kod nižih biljaka je polenovo zrno koje klija na žigu (kod skrivenosemenica) ili

56

na semenim zamecima (kod golosemenica). Kod viših biljaka muški polni organ je prašnik u kome se stvara posebno sporogeno tkivo (arhesporijum), koje sadrži veliki broj ćelija.

Kod skrivenosemenica ove ćelije označavamo kao materinske ćelije polena. One se umnožavaju mitozom i daju mikrosporocite. Mikrosporocite ulaze u proces mejoze, pri čemu kao rezultat nastaju četiri ćelije tetrade (mikrosporocit). Pri sazrevanju mikrosporocita ćelije tetrade se raspadaju na pojedine mikrospore, od kojih postaju polenova zrna, u kojima dolazi do obrazovanja unutrašnjeg (intina) i spoljašnjeg omotača (egzina). Ovim se završava proces mikrosporogeneze i počinje proces mikrogametogeneze.

Da bi mikrospore bile spremne za proces oplodnje, svaka mikrospora dalje ulazi u mitotsku deobu dajući jednu vegetativnu i jednu generativnu ćeliju, pri čemu se ćelije drže zajedno u okviru jedne spoljne membrane. Vegetativna ćelija se dalje ne deli, nego se u njenoj citoplazmi nagomilavaju rezervne materije, te je stoga veća od generativne ćelije. S druge strane, generativna ćelija se dalje deli mitotičkom deobom, obrazujući pri tome dve generativne ćelije sa haploidnim brojem hromozoma, koje se označavaju kao spermatične ćelije, odnosno muški gameti. Ova deoba se ostvaruje u polenovom zrnu ili prilikom njegovog klijanja u polenovoj cevčici.

Prikazanim procesima – mikrosporogenezom obrazuju se polenova zrna, a mikrogametogenezom, kroz dve uzastopne mitotske deobe obrazuju se: muški gameti – dve generativne (spermatične) ćelije i jedna vegetativna ćelija. Ove tri ćelije se obavijaju dvostrukom opnom i nastaje polenovo zrno.

Makrosporogeneza predstavlja proces obrazovanja ženskog makrosporocita (tetrade makrospora). U ženskom polnom organu-plodniku razvija se semeni zametak. Obrazovanje makrospora (megaspora) vrši se u semenom zametku (makrosporangiji). Kod skrivenosemenica se u semenom zametku izdvaja samo jedna arhesporijalna ćelija, tzv. materinska ćelija makrospora. Retke su biljke kod kojih se stvara višećelija (vrste iz porodica breza, bukve). Materinska ćelija makrospora intenzivno raste i ulazi u mejozu, čiji rezultat je obrazovanje četiri ćelije – tetrade ili makrospore sa haploidnim brojem hromozoma. Ovim se završava proces makrosporogeneze i počinje proces makrogametogeneze.

Ženski gametofit kod cvetnica je embrionova kesica pa je proces makrogamtogeneze ustvari proces obrazovanja embrionove kesice kod skrivenosemenica. Broj makrospora koje učestvuju u razviću embrionove kesice može biti od jedne do četiri. Kod većine skrivenosemenica, samo jedna makrospora (obično donja) se dalje razvija i obrazuje embrionovu kesicu, dok ostale tri makrospore prestaju da rastu i pod pritiskom embrionove kesice spljošte se i dezintegrišu.

Jedro makrospore dalje se deli mitotskom deobom, pri čemu deobu jedra ne prati i deoba citoplazme, te stoga ne nastaju dve ćelije, nego se obrazuje jedna embrionova kesica sa dva jedra. Svako od ova dva jedra se dalje deli mitozom, tako da nastaju četiri jedra, koja se ponovo mitotički dele, da bi se na kraju obrazovala embrionova kesica sa 8 jedara: četiri jedra se raspoređuju u mikropilarnom delu (donjem), a četiri jedra u halaznom delu (gornjem) embrionove kesice. Znači od makrospore kroz tri mitoze (kariokineze) nastaje 8 jedara jer se citoplazma ne deli.

Zatim dolazi do podele citoplazme oko ćelijskih jedara, tako da se na mikropilarnom kraju formiraju tri ćelije, od kojih je jedna jajna ćelija (n) i dve ćelije pomoćnice – sinergide (n). U halaznom delu embrionove kesice formiraju se tri ćelije antipode (n). Po jedno preostalo jedro, sa oba pola embrionove kesice, približava se središnjem delu i spaja u jedno

57

jedro tzv. centralno ili sekundarno jedro embrionove kesice koje sadrži diploidan broj hromozoma (2n), jer je nastalo spajanjem dva haploida jedra.

Ovo centralno jedro je okruženo svojom citoplazmom, tako da se može govoriti o centralnoj ćeliji embrionove kesice. Polno zrela embrionova kesica ima ukupno sedam ćelija - tri ćelije antipode, dve ćelije sinergide, jedna jajna ćelija i centralna ćelija. Ukoliko ne dođe do oplodnje jajne ćelije, embrionova kesica, a s njom i ceo semeni zametak, uginu, sem u retkim slučajevima apomiksisa (partenogeneza i dr.)

Oplodnja kod biljaka

Oplodnja predstavalja proces spajanja muške i ženske polne ćelije tj. muškog i ženskog gameta (singamija) i njihovih jedara (kariogamija) u jednu novu ćeliju – zigot, čijim deljenjem i diferenciranjem nastaje embrion iz koga se razvija nov organizam. U procesu oplođenja odvijaju se važni genetički procesi, značajni za postojanje vrste, koje se mogu definisati kao: - uspostavljanje diploidnog broja hromozoma; - obezbeđivanje materijalne veza i neprekidnosti između sukcesivnih generacija i - objedinjavanje naslednih faktora koji potiču od roditeljskih individua.

Polno razmnožavanje je zastupljeno kod vaskularnih biljaka: golosemenica i skrivenosemenica. Oplodnja kod biljaka je dvostruka. Jedna spermija se spaja sa jajnom ćelijom i daju embrion koji je diploidan. Druga spermija se spaja sa centralnom ćelijom (diploidnom centralnom ćelijom) i daje triploidno tkivo-endosprem koji služi za ishranu embriona do uspostavljanja fotosintetskog aparata.

58

Kod skrivenosemenica nastaje plod, a kod golosemenica nastaje seme.

59

Rekombinacije gena Slobodno kombinovanje i crossing-over

Mendel je u svojim dihibridnim ukrštanjima pratio istovremeno nasleđivanje dve

osobine (oblik i boku zrna). Zapazio je da se različiti oblici naslednog faktora (gena) nezavisno kombinuju u odnosu na alele drugog gena. Alel za okruglo zrno kombinuje se i sa alelom za zelenu boju i sa alelom za žutu boju. Da bi alel jednog gena mogao da se nezavisno kombinuje sa alelima drugog gena mora da se nalaze na različitim hromozomima. Danas se zna daje gen za boju semena (sa alelima za žuto i zeleno seme) smešten na 1. hromozomu, dok je gen za oblik (sa alelima za okrugao i smežuran oblik) smešten na 7. hromozomu. Jedino tako je Mendel pri dihibridnom ukrštanju za osobine oblika i boje mogao da dobije fenotipsle odnose sa kojima nas je upoznao i koje ukazuju na to da postoji slobodno kombinovanje gena koji determinišu oblik i boju. Međutim, u genomu graška postoji samo sedam hromozoma, pa je jasno da postojiveliki broj gena na svakom hromozomu. Ne može se očekivati da geni koji se nalaze na istom hromozomu u ukrštanju i stvaranju hibrida daju iste kombinacije osobina kao geni koji se ne nalaze na istom hromozomu. Ipak, Mendel je pratio sedam osobina. Danas se zna da se geni za dve osobine koje je Mendel proučavao, nalaze na prvom hromozomu, a tri gena za druge tri osobine na četvrtom hromozomu. Iako su geni koji kontrolišu različite osobine na istom hromozomu, Mendel nije dobio značajna odstupanja odnosa u F2 generaciji dihibridnog ukrštanja. Jasno je da postoji proces u kome dolazi do rekombinacije gena koji se nalaze na istom hromozomu, rekombinacije vezanih gena.

Vezani geni

Svi geni na jednom hromozomu nazivaju se vezani geni. Raspored genskih lokusa na hromozomima je linearna. Gen za jednu određenu osobinu (npr. boja ili oblik ili dužina dlake) uvek zauzima isto mesto na istom hromozomu. S obzirom na to da kod diploidnih vrsta postoje homologi hromozomi (hromozomi istog oblika, veličine koji nose gene za iste osobine) na svakom homologom hromozomu nalazi se isti redosled genskih lokusa. Ukoliko je jedinka heterozigotna za određeni lokus, na jednom homologom hromozomu nalazi se genski alel A, a na drugom homologom hromozomu genski alel a. Ukoliko je jedinka dominantno homozigotna oba homologa hromozoma nosiće po alel A, ali ukoliko je jedinka recesivno homozigotna oba homologa hromozoma nosiće po alel a.

Postoje određene osobine koje se gotovo uvek nasleđuju zajedno usled toga što se geni koji ih određuju nalaze na istom hromozomu. Geni na istom hromozomu zovu se vezani geni.

Da je sve tako jednostavno homologi hromozomi bi se u mejozi razdvojili i na taj način bi se osobine koje kodiraju vezani geni na tim hromozomima kontinuirano nasleđivale zajedno bez varijacija.

60

Verovatnoća dešavanja krosingovera

Međutim, kao što je rečeno, u profazi mejoze I postoji proces rekombinovanja

homologih hromozoma - crossing over. Blizina genskih lokusa ima odlučujući uticaj na verovatnoću odvijanja crossing-overa (sa povećanjem blizine lokusa smanjuje se verovatnoća crossing-overa). Znači geni koji se nalaze na istom hromozomu, ali su veoma udaljeni, mogu se ponašati kao da nisu vezani i ući u crossing-over (mogu se rekombinovati). Geni čiji su lokusi bliže imaju manju verovatnoću ulaska u crossing-over. U ovom slučaju, broj rekombinovanih gameta je značajno manji.

Geni koji kontrolišu neke osobine graška koje je ispitivao Mendel, nalaze se na istom hromozomu, ali su toliko fizički udaljeni da se crossing-overom skoro uvek razdvoje.

Objasnimo fenotipske odnose usled crossing-overa kroz primer. Ako pratimo pri dihibridnom ukrštanju dva gena koji imaju po dva genska alela,

prilikom ukrštanja čistih linija AABB x aabb u F1generaciji dobija se heterozigotno uniformno potomstvo kod koga se na jednom hromozomu nalazi alel A, a na njegovom homologom hromozomu alel a; dok se na drugom hromozomu nalazi alel B, a na njegovom homologom hromozomu alel b (uz pretpostavku da nema epistatičkih interakcija). Ako jedinke iz ove F1 generacije ukrstimo sa recesivnim homozigotom (test ukrštanja - ♀ AaBb x ♂ aabb) javiće se četiri moguća fenotipa u odnosu 1:1:1:1. Od ovih jedinki 25% će imati fenotip majke, 25% fenotip oca (ukupno 50% potomstva sa fenotipom roditelja), dok će 50% potomstva imate rekombinovane fenotipove - rekombinanti (kombinacija osobina jednog i drugog roditelja).

61

Primer. Biljke okruglog, žutog zrna (čiste linije) ukrstili smo sa biljkama smežuranog zelenog zrna. U F1 generaciji dobili smo uniformne biljke sa okruglim, žutim zrnom.

U testu ukrštanja - Biljke iz F1 generacije sa okruglim, žutim zrnom ukstili smo sa biljkama smežuranog, zelenog zrna i dobili 50% potomstva koje liči na roditelje (okruglo, žuto i smežurano, zeleno zrno), ali i 50% potomstva koje je rekombinacija roditelja (okruglo, zeleno zrno i smežurano, žuto zrno)

Međutim, ako pratimo nasleđivanje dva gena sa dva genska alela (A i a, kao i genske alele C i c) čiji se lokusi nalaze na jednom, istom hromozomu, dobićemo drugačije rezultate u odnosu fenotipova.

S obzirom da su geni vezani, može se očekivati da u gametogenezi kod heterozigota (AaCc)

Jedan hromozom nosi gene AC, a drugi homologi ac. Kada se u anafazi mejoze I odvoje ovi homologi hromozomi dobiće se samo dva tipa gameta (AC i ac). Navedeno ne ukazuje na postojnje rekombinovanih gameta, a samim tim nakon povratnog ukrštanja sa recesivnim homozigotima ne bi trebalo da postoje potomci sa rekombinovanim fenotipovima (fenotipovima koji su kombinacija oca i majke).

Vezani geni najčešće pokazuju delimičnu vezanost jer tokom mejoze nastaje barem jedna hijazma što ukazuje da je na tom mestu došlo do crossing-overa, odnosno do razmene genetičkog materijala. Usled crossing-overa rezultati u praksi kod povratnog ukrštanja su obično negde između očekivanih rezultata pri kompletnoj vezanosti gena i rezultata kada geni nisu vezani. Praksa je pokazala da ukoliko se u povratnom ukrštanju stvori manje od 50% rekombinovanih fenotipova, genski lokusi su vezani i došlo je do crossing-overa. Ukoliko se u povratnom ukrštanju dobiju 50% jedinke koje su fenotipski iste roditelji i 50% rekombinovanih fenotipova genski lokusi nisu vezani i došlo je do slobodnog ukrštanja.

Važno je napomenuti da ukoliko se neke fenotipske osobine uvek ispoljavaju zajedno to ne mora da bude posledica vezanosti gena. Postoje plejotropni geni - geni koji određuju više osobina. Tako kod mačke bele boje dlake i svetlo plavih očiju veoma često se javlja i gluvoća. Ovde samo jedan, plejotropan gen određuje sve tri osobine.

Proces rekombinacije kod eukariota Rekombinacije predstavljaju stvaranje novih kombinacija genotipova. Proces

rekombinacije kod eukariota odvija se prevashodno u mejozi. Produkt mejoze naziva se rekombinant. Kod eukariota postoje dva različita mehanizma mejotske rekombinacije: crossing-over i slobodno kombinovanje.

U slučaju slobodnog kombinovanja geni koji određuju različite osobine se ne nalaze na istom hromozomu. U anafazi mejoze I hromozomi se odvajaju i stvaraju nove kombinacije

62

fenotipova. Spajanjem genoma dva gameta (amfimiksis) ostvaruju se nove kombinacije gena koje doprinose genetičkoj i fenotipskoj varijabilnosti.

Crossing-over se kod eukariota odvija u pahitenu profaze mejoze I i predstavlja razmenu gena između homologih hromozoma ili između sestrinskih hromatida jednog hromozoma. Svaki uparen homologi hromozom ima po dve hromatide tako da će ovi parovi u pahitenu biti predstavljeni kao tetrade - sa po četiri hromatide. U pahitenu dolazi do sparivanja homologih hromozoma i postaviljanja nesestrinskih hromatida jedne naspram druge. Struktura koja fizički spaja homologe hromozome nazvana je sinaptonemski kompleks (proteini i RNK).

Tokom pahitena, enzim endonukleaza stvara prekid (seče veze) između pojedinih nukleotida u hromatidama (tetradama). Na taj način se sa jedne hromatide odvoji određena sekvenca DNK. Na drugoj hromatidi endonukleaze takođe odvoje na isti način sekvencu DNK. Ove sekvence se razmenjuju između tetrada-hromatida (crossing-over) tako što određeni proteini prebacuju-nose ove sekvence DNK između hromatida. Razmenjene sekvence DNK povezuje enzim DNK ligaza.

Razmenjeni segmenti sada između sebe uspostavljaju vodonične veze. Tako nastaje specifična struktura u obliku slova X koja povezuje nesestrinske hromatide. Ove krstolike strukture uzmeđu homologih hromozoma su nazvane hijazme i prvi put su detektovane kod vodozemaca. Hijazme označavaju mesta na kojima se izvršio crossing-over i najbolje se vide u diplotenu.

Takođe, razmena se obavlja uvek između lanaca DNK iste polarnosti (oba lanca na kojima je napravljena sekvenca DNK su ili 3'→5' ili 5'→3'smera). Razmena se vrši i između homologih hromatida i između sestrinskih hromatida. S obzirom da sestrinske hromatide sadrže identičnu sekvencu DNK (jer su nastale u S fazi replikacijom molekula DNK) razmena - crossing-over između sestrinskih hromatida ostaje nezapažena.

U slučaju kada se oba dominantna alela nalaze na istom homologom hromozomu, a recesivni aleli na drugom, onda to predstavlja seriju spajanja i takav genotip se označava AB/ab. Postoji i serija razdvajanja kod koje su dominantni i recesivni aleli raspoređeni na oba homologa hromozoma. Genotipska konstitucije se označava kao Ab/aB.

Kada geni nisu vezani genotip se piše: AaBb Kada su geni vezani genotip se piše: AB/ab kod serije spajanja, Ab/aB kod serije razdvajanja Tipovi gameta kod serije: spajanja razdvajanja

63

Broj dobijenih fenotipova u testu ukrštanja kod serije spajanja i razdvajanja je isti.

Međutim, postoji razlika u frekvenciji roditeljskih i rekombinovanih fenotipova. U slučaju serije spajanja veća je frekvencija roditeljskih fenotipova u odnosu na rekombinovane (40:40:10:10). Dok je kod serije razdvajanja obrnut slučaj (rekombinovani fenotipovi prema roditeljskim 80:20). Serija spajanja i seriju razdvajanja i brojni odnos potomaka vinske mušice u odnosu na boju trbuha i boju lutke posla test ukrštanja

Serija spajanja Serija razdvajanja

Rekombinacije kod bakterija Nukleoid predstavlja cirkularni molekul DNK, glavni hromozom (ponekad i jedini)

kod bakterija. Bakterije su haploidni organizmi (pored nukleoida, mogu imati i epizome i plazmide) tako da se mutacije lako identifikuju na nivou fenotipa. Tokom evolucije razvijena su tri načina prenošenja genetskog materijala iz jedne bakterijske ćelije u drugu: transformacija, transdukcija i konjugacija.

Transformacija predstavlja proces prenošenja „ogoljene“ DNK iz ćelije donora (davaoca) u ćeliju recipijenta (primalaca). DNK donora se najpre vezuje za receptorna mesta na površini bakterije primaoca. Potrebno je da recipijent na svojoj površini ima specifični protein sposoban da prihvati molekul DNK. Takav protein pomaže ulazak DNK u bakteriju. Enzimskom degradacijom jedan lanac ubačene DNK se degradira, tako da ostaje samo jednolančana DNK. Deo ili cela jednolančana DNK se zatim ugrađuje u hromozom recipijenta. Ovim se stvara heterodupleks - dvolančana DNK u kojoj nisu sve baze komplementarne. Nakon replikacije i deobe ćelije nastaju dva soja bakterije - jedna sa DNK recipijenta a druga sa DNK donora.

Transdukcija predstavlja prenošenje gena jedne bakterije u drugu, posredstvom virusa (bakteriofaga). Bilo koji deo DNK donora se ugrađuje u virusnu česticu tokom njenog sazrevanja. Pri tome, celokupna DNK virusa može da se zameni bakterijskom ili su prisutne zajedno u virusu. Najčešće se deo bakterijske DNK ugrađuje u virusni hromozom i ovo je specijalizovana transdukcija jer se prenosi samo deo hromozoma bakterije donora (umereni fagi). Pri ovoj transdukciji se u hromozom recipijenta ugrađuje celokupna DNK umerenog

64

faga tako da bakterija postaje parcijalno diploidna za regione hromozoma koje je primila od donora.

Konjugacija je proces prenošenja naslednog materijala iz jedne u drugu ćeliju kod bakterija preko posebnog-konjugacionog mostića. Transfer DNK je jednosmeran, iz donora u ćeliju recipijenta. Ćelije donora posebnim nastavcima (F pili) prenose DNK.

MUTACIJE

Prilikom replikacije DNK dolazi do grešaka u frekvenciji od 10-8 do 10-9. Imino forma adenina se može vezati za citozin, što u narednom udvajanju izaziva promenu A:T u C:G par. Tako se i enolna forma timina vezuje za guanin, sa istim rezultatom. Tkođe, do grešaka u replikaciji DNK dolazi i zbog formiranja timinskih dimera (T:T). Mehanizmi ispravljanja grešaka nastalih u replikaciji DNK su reparacija i supresija gena. Tipovi reparacije su fotoreparacija (fotoreaktivacija) usmerena na razdvajanje timinskih dimera i reparacija resintezom u kojoj se iseca pogrešno sintetisani segment i sintetiše se novi.

Međutim, uprkos izuzetnoj preciznosti procesa replikacije DNK i postojanja mehanizama reparacije (popravke) DNK, povremeno se odigravaju “greške” ili promene u strukturi naslednog materijala. Sve nasledne promene u genetičkom materijalu nazivaju se mutacije. Termin mutacija odnosi se ne samo na promene genetičkog materijala, već i na sam proces koji dovodi do date promene. Izvestan nivo mutacija potreban je da obezbedi nastanak novih genskih alela, povećanje varijabilnosti i pojavu genetičkih novina. Organizam sa ispoljenim novim fenotipom označen je kao mutant.

Najzastupljeniji fenotip u prirodnim populacijama organizma nazivamo divlji tip. Mutacije u različitim vremenskim etapama dovode do formiranja novih alela koji se razlikuju od alela divljeg tipa. Crvena boja očiju vinske mušice je najzastupljenija boja očiju u prirodi i takve mušice su divlji tip za crvenu boju očiju. Svi ostali aleli su mutirani oblici divljeg alela.

Mutacije predstavljaju osnovni izvor genetičkih novina u populacijama i obezbeđuju nastanak novog (sirovog) materijala, pri čemu se kroz proces prirodne selekcije vrši favorizovanje mutacija koje su u skladu sa ekološkim uslovima u određenom vremenskom periodu.

Mutacije imaju dva efekta, da održavaju život i da izazivaju negativne posledice. One su jedan od izvora genetičke varijabilnosti tokom evolucije i organizmi se ne bi mogli prilagoditi na različite uslove spoljašnje sredine, bez njih. Sa druge strane, mutacije izazivaju mnoge štetne efekte koji su naročito prisutni kod ljudi u vidu raznih bolesti.

Mutacije kod vinske mušice sa kojima je radio Tomas Morgan

65

Mutacije su poslužile kao značajan alat za genetičku analizu mnogih organizama

tokom razvića genetike. Još su Tomas Morgan i njegovi saradnici pocetkom 20. veka proučavali veliki broj mutacija kod vinske mušice koje su bile vidljive fenotipski.

U odnosu na uzrok mutacije mogu biti spontane i indukovane. Najčešće je nemoguće utvrditi da li je mutacija spontana ili indukovana pri razmatranju individualnih mutacija. Potrebno je da se mutacije posmatraju na nivou populacije.

Frekvencija indukovanih mutacija je 1000-10000 puta veća od spontanih mutacija. Mutacije mogu izazvati fizički (temperatura, jonizujuće i nejonizujuće zračenje) i hemijski agensi (akridini, alkilni agensi, dezaminirajući agensi, slobodni radikali, bazni analozi, i td). Ovi agensi se namerno dadaju u životnu sredinu jedinke ili slučajno dolazi do povećane koncentracije istih.

Ukoliko se posmatra veličina genetskog materijala zahvaćenog mutacijom razlikuju se genske i hromozomske mutacije. Genske mutacije (tzv. tačkaste mutacije) se odvijaju unutar jednog gena i najčešće su usled zamene jednog nukleotidnog para (eventualno 2-3 nukleotida pored tog para). Pored toga, moguće su male unutar genske delecije, insercije, i td. Hromozomske mutacije obuhvataju veće segmente naslednog materijala - delove hromozoma, čitave hromozome ili garniture hromozoma.

Prema mestu dešavanja, mutacije mogu biti: - Mutacije u strukturnim genima; - Mutacije u regulatornim genima; - Mutacije u genima za tRNK i rRNK.

Genske mutacije Kod genskih mutacija dolazi do promena u strukturi DNK, na nivou od jednog ili više

nukleotida, čime se menja struktura proteina kodiranog datim genom, odnosno ako je reč o kodiranju enzima menja se proces koji sintetiše enzim.

Mutacije gena se dešavaju i na somatskom i na reproduktivnom nivou.

66

Somatske i germinativne (gametske) mutacije

Somatske nastaju tokom razvoja organizma u tkivima iz kojih ne nastaju polne ćelije i ne prenose se na potomstvo (osim kod biljaka koje se razmnožavaju vegetativnim putem ili reznicama). U zavisnosti od faze razvoja kada se dešavaju, dobijamo mutantne sojeve ćelija ili mutantna tkiva i organe. Promene mogu biti mozaičnog tipa, tako da deo organa pokazuje mutaciju, a deo ne. Somatske mutacije u genima koji regulišu deobu ćelije obično stoje u korenu onkogeneze, pa su svi mutageni agensi istovremeno i kancerogeni. Na reproduktivnom nivou nastaju germinativne mutacije. Ove mutacije se manifestuju u tkivima iz kojih nastaju polne ćelije, pa se prenose na potomstvo i najčešće izazivaju štetne efekte.

Prema obimu mutiranih nukleotida genske mutacije mogu biti: -Tačkaste mutacije - promene u jednom baznom paru; - Vanfazne mutacije (eng.frameshift) - veće promene u strukturi koje mogu biti: · Inseracije -ubačen niz nukleotida; · Delecije - nedostaje niz nukleotida; · Inverzije - zamenjuje se redosled jednog niza nukleotida.

Genske mutacije prema obimu mutiranih nukleotida

Tačkaste mutacije

Vanfazne mutacije se vrlo brzo isključuju iz populacija jer izazivaju veće promene u fenotipu i genotipu individue. S toga na nivou populacija najčešće zatičemo tačkaste mutacije.

Postoje dva tipa tačkastih mutacija u odnosu na promenu baze: -Transverzije nastaju kada se mutacionom zamenom promeni purin u purin, odnosno

pirimidin u pirimidin (A→G ili G→A, odnosno T→C ili C→T)

67

-Tranzicije nastaju kada se mutacionom zamenom promeni purin u pirimidin, odnosno pirimidin u purin (A→T ili T→A, G→C ili C→G, odnosno A→C ili C→A, G→T ili T→G).

Atomi vodonika u azotnim bazama mogu da se pomeraju s jedne baze u drugu i izazivaju tautomerne promene. Keto forme timina ili guanina, kao i amino forme adenina i citozina ponekad prelaze u tautomerne (i manje stabilne) enol i imino oblike. Transverzije i tranzicije su mutacije nastale kao posledica tautomernih promena baš u vreme replikacije DNK.

Tautomerija - stabilne amino i keto forme se menjaju u nestabilne imino i enolne

forme

Tačkaste mutacije mogu dovesti do promene kodona za jednu aminokiselinu u kodon za istu aminokiselinu (mutacije istog smisla), ali može doći i do promene kodona za drugu aminokiselinu (mutacije promenjenog smisla). Tačkaste mutacije mogu dovesti i do promene kodona za jednu aminokiselinu u stop kodon (besmislene mutacije) kada potpuno prestaje sinteza bilo koje aminokiseline.

Tačkaste mutacije prema smislu promene

68

Hromozomske mutacije Aberacije

Hromozomske mutacije (aberacije) predstavljaju promene u strukturi ili broju

hromozoma. Govoreći uopšteno, gubitak dela naslednog materijala po pravilu je štetnijij od “viška” hromozomskog materijala. Hromozomske aberacije se odnose ili na narušavanje normalne strukture hromozoma ili na promenu broja hromozoma u ispitivanoj ćeliji. S toga razlikujemo dva osnovna tipa hromozomskih aberacija: numeričke i strukturne.

U numeričke mutacije ubrajamo haploide i dihaploide, euploide i aneuploide. Haploidi biljaka nastaju iz neoplođene jajne ćelijedajući haploidni embion, dok se

endosperm razvija iz oplođene ili neoplođene centralne ćelije, pa može biti diploidan i triploidan. Najčešće se mogu indukovati polenom drugih biljaka, a kod kukuruza postoje posebne linije induktori. Retke su biljke kod kojih je moguće razviti haploide. Podvostručivanjem broja hromozoma haploida se dobijaju dihaploidi.

Haploidi životinja nastaju partenogenezom iz neoplođene jajne ćelije. Kod viših životinja je pojava haploida, kao i poliploida izuzetno retka.

Organizmi, odnosno ćelije mogu imati i veći broj hromozoma od diploidnog. To je veoma čest slučaj u biljnom svetu, gde jedna polovina od svih poznatih rodova sadrži poliploidne vrste, dok je kod životinja to retkost. Poliploidi su neki beskičmenjaci, ribe, daždevnjaci, žabe i gušteri. Među pticama nije prisutna, a od sisara je pronađen jedan poliploidan pacov iz Argentine.

Ove promene u broju hromozoma (numeričke aberacije) obično se opisuju kao varijacije u stepenu plodnosti organizma. Razlikujemo sledeće numeričke aberacije - euploide i aneuploide.

Euploidi ili poliploidi su organizmi kod kojih je osnovni (haploidni - n) set hromozoma uvećan za dva i više puta. Uvećan broj hromozoma predstavlja posledicu nerazdvajanja homologih hromozoma ili sestrinskih hromatida tokom ćelijske deobe i može nastati prirodnim putem ili pod uticajem hemikalija (pomoću kolhicina koji je citostatik i ne dozvoljava formiranje niti deobnog vretena, što dovodi do dupliranja hromozomskog seta). Seriju euploida čine: diploid 2n, triploid 3n, tetraploid 4n, heksaploid 6n, itd.

Dalja podela euploida (poliploida) može se izvršiti na osnovu porekla genoma (osnovnog seta hromozoma) koji je prisutan u tri i više doza. Autopoliploidi predstavljaju organizme kod kojih uvećan broj hromozoma vodi poreklo od jedne vrste, tj. od jednog kariotipa.

69

Prirodni autotetraploidi su krompir, kafa, kikiriki i lucerka, dok su indukovani raž,

detelina, grožđe, rotkvica, spanać i bundeva. Nastaju udvostručenjem broja hromozoma diploidnih vrsta, prirodnim ili indukovanim putem.

Prirodni autotriploidi su banana, neke sorte jabuke, topola, a indukovani šećerna repa

i lubenica. Mogu nastati spajanjem diploidnih i haploidnih gameta, ukrštanjem autotetraploida i diploida, ili iz materijala sa nepravilnom deobom. Za autotriploide je karakteristična visoka sterilnost s obzirom na nepravilnosti u razdvajanju homologih hromozoma u mejozi, tokom formiranja polnih ćelija (gameta).

a) b) Mejoza kod triploida. (a) Formiranje univalenta. Dva od tri homologa hromozoma stvaraju sinapsu (vezu), a formirani univalent odlazi na suprotni pol tokom anafaze. (b) Formiranje trivalenta. Sva tr i homologa hromozoma se povezuju, stvarajući tr ivalent, koji se tokom anafaze pomera ka jednom od polova.

70

Kod alopoliploida, prisutni genomi vode poreklo od više različitih vrsta, što predstavlja posledicu prirodne ili planske hibridizacije (ukrštanja). Kao primer za prirodno nastalu alopoliploidnu vrstu može se uzeti heksaploidna hlebna pšenica (Triticum aestivum ssp. vulgare L.) sa genomskom konstitucijom ABD, nastala spontanim ukrštanjem Aegilops speltoides, Triticum urartu i Aegilops tauschii. U prirodne alopoliploide spadaju i durum pšenica (Triticum durum L.), ovas (Avena sativa L.), pamuk (Gossypium hirsutum L.), duvan (Nicotiana tabacum L.), šećerna trska (Saccharum officinarum L.), šljiva (Prunus domestica L.), jagoda (Fragaria grandiflora L.) i dr.

Heksaploidni (6x) ili oktoploidni (8x) tritikale sa genomskom konstitucijom ABR, odnosno ABDR može predstavljati primer alopoliploidne vrste nastale planskom hibridizacijom durum (AB) ili hlebne pšenice (ABD) i raži (R).

Hromozomi koji pripadaju genomima različitih vrsta mogu ispoljavati određenu sličnost i za njih se kaže da su homeologi. Između ovih hromozoma retko dolazi do parenja, tako da se tokom mejoze razdvajanje homeologih hromozoma odvija posebno, slično izvornim diploidnim vrstama. Ako su parni polivalenti mogu formirati parove hromozoma koji se pravilno podele u mejozi na bivalente. Ređe se dešava da formiraju nebalansirane gameti koje su sterilne, tako da jedan gamet sadrži trivalent a drugi univalent. Sterilnost biljaka se iskorišćava u poljoprivredi. Divlja diploidna banana ima 2n=22 hromozoma i proizvodi semena koja su jako tvrda i nisu podobna za jelo. Triploidna banana ima 3n=33 hromozoma, sterilna je jer ne proizvodi semena, razmnožava se vegetativno, i koristi u komercijalnoj proizvodnji.

Za svaku vrstu je karakterističan optimalni stepen ploidnosti. Tetraploidi su maksimalni stepen ploidnosti koji tolerišu kukuruz i pamuk, dok su triploidi optimalni za šećernu repu. Najvišim stepenom ploidije odlikuju se malina, kupina i jagoda. Neophodno je naglasiti da su posledice poliploidije uvećanje zapremine jedra zbog povećanog broja hromozoma, veće dimenzije ćelije i pojedinih organa (listovi, cvetovi, polen, plodovi, zrna), period cvetanja je produžen, izraženije su nepravilnosti tokom mejoze praćene smanjenjem fertilnosti, promene u hemijskim osobinama (sadržaj proteina, šećera, vitamina i dr.).

Kod aneuploida, za prisutne setove hromozoma je karakterističan nedostatak ili višak određenog broja hromozoma, tako da ukupan broj ne predstavlja prost umnožak osnovnog, haploidnog broja. Razlog aneuploida može biti gubitak hromozoma usled gubitka centromera, a acentrik nestaje u mitozi ili mejozi ili Robertsonove translokacije na velikim hromozomima, dok se mali hromozomi gube u mejozi i mitozi ili nerazdvajanje homologih hromozoma u mejozi i mitozi. Efekti aneuploidije su uglavnom negativne za jedinku jer menjaju fenotip drastično. Kod mnogih životinja i biljaka su to letalne mutacije. Kod drugih aneuploda se dešavaju promena u genskoj dozi određenih gena što vodi promenema genskih produkata koji obično ne utiče na normalno razviće jedinki sa izmenjenim fenotipom.

Ukoliko su aneuploidije vezane za polne hromozom aneuploidije vezane za X hromozom su bolje tolerantne za preživljavanje nego aneuploidije vezane za autozomne hromozome pošto kod sisara ženske jedinke imaju samo jedan aktivan X hromozom, dok je drugi inaktivan.

71

Serija aneuploida sastoji se od: disomik (dihaploid) 2n, monosomik 2n - 1, dvostruki monosomik 2n - 1 - 1, nulisomik 2n - 2, trisomik 2n + 1, dvostruki trisomik 2n + 1 + 1, tetrasomik 2n + 2.

Hromozomske aberacije koje predstavljaju promene u strukturi hromozoma

mogu se podeliti na inverzije, translokacije, delecije i duplikacije.

Kod delecija ili deficija dolazi do gubitka jednog dela hromatide ili hromozoma. Nastaju spontano ili su indukovane (x zraci, hemikalije i dr.). Delecije većeg obima mogu biti otkrivene citološki, bojenjem hromozoma. Za diploidne organizme se kaže da imaju hipoploidni genom za hromozom kome nedostaje segment. Delecije mogu imati uticaja na krajnji, fenotipski izgled jedinke, naročito u slučaju gubitka većeg dela hromozoma, sa važnim genima. U tom pogledu, prema uticaju mogu se svrstati u letalne, semiletalne i vitalne.

Prema mestu na kome se javljaju, delecije mogu biti terminalne (prekid na jednom

mestu i gubi se terminalni deo) i intersticijalne (prekid na dva mesta uz gubitak unutrašnjeg segmenta hromozoma). Takođe, mogu biti homozigotne i heterozigotne, zavisno od toga da li promenama zahvaćene jedna ili obe hromatide.

Delecija na jednom homologom hromozomu dovodi do formiranja omče na drugom homologom hromozomu tokom njihovog sparivanja.

72

Heterozigotne delecije mogu izazvati stvaranje nebalansiranih količina genskih produkata ili mogu izazvati ekspresiju recesivnih gena (pseudodominansa).

Duplikacije predstavljaju strukturne promene na hromozomu kod kojih postoji dodatni, dupli segment. Taj dodatni segment može biti prikačen za jedan od hromozoma ili može postojati kao novi ili poseban hromozom ("slobodna duplikacija"). Za taj deo genoma se kaže da je hiperploidan. U zavisnosti od mesta gde se javljaju, duplikacije mogu biti u nizu, obrnutom nizu i dislocirane (na istom kraku, na drugom kraku istog hromozoma ili na drugom hromozomu).

Duplikacije mogu imati uticaja na fenotip organizma. Mogu dovesti do usložnjavanja

gena koji mogu stvarati nove produkte ili do obrazovanja abnormalne genske doze (nebalansirane količine genskih produkata) što dovodi do formiranja nenormalnog fenotipa (Bar lokus kod vinske mušice). Usled nejednakog crossing-overa ili delovanja transpozona stavaraju se dupli i trostruki Bar lokusi kod vinske mušice

73

Homozigotni i heterozigotni Bar fenotip sa brojem faceta u složenom oku

Inverzija predstavlja pojavu kod koje normalan hromozom biva isečen na dva mesta, pri čemu se isečeni segment rotira za 1800 i ponovo se prikači za ostatak hromozoma, što za posledicu ima izmenjen redosled gena u odnosu na hromozom bez inverzije. Ovakve promene u strukturi hromozoma mogu se izazvati u laboratorijskim uslovima, primenom X zraka.

Postoje dva tipa inverzija, pericentrična koja uključuje i centromeru, kao i

paracentrična kod koje centromera nije obuhvaćena segmentom. Posledica pericentrične inverzije je promena relativne dužine dva kraka hromozoma, dok kod paracentrične se to ne dešava. Usled pericentrične inverzije sa prekidom na oba hromozomska kraka, od akrocentričnog hromozoma nastaje metacentrični. U slučaju paracentrične inverzije na dugom kraku hromozoma, morfologija hromozoma se ne menja. Inverzije mogu biti i homozigotne ili heterozigotne. Kod homozigotnih identične inverzije postoje kod oba

74

homologa hromozoma, dok kod heterozigotnih jedan homologi hromozom je normalan a drugi poseduje inverziju.

Tokom mejoze I, prilikom povezivanja (sinapse) homologih hromozoma u pahitenu, kod hromozoma koji poseduju inverziju dolazi do formiranja karakteristične petlje.

Za razliku od prethodno pomenutih promena u strukturi hromozoma, kod inverzija ne

dolazi do promena u količini genetičkog materijala, tj. nema gubitka niti viška. Zbog toga, većina inverzija ne dovodi do izmena u fenotipu, osim u retkim slučajevima, kada se inverziona tačka prekida nalazi unutar važnog gena.

Translokacija predstavlja pojavu isecanja segmenta jednog hromozoma i njegovo ponovno spajanje sa drugim, nehomologim hromozomom. Može nastati spontano ili biti izazvana (zračenje, hemikalije).

Translokacija može biti prosta, kada samo jedan segment biva prenet na drugi hromozom ili recipročna, kada dva nehomologa hromozoma razmene segmente. Takođe, dele se na homozigotne i heterozigotne, zavisno od toga da li se razmena segmenata sa nehomologim hromozomima odigrala na oba ili samo na jednom homologom hromozomu.