OMÜ - Akademik Veri Yönetim Sistemi - Anasayfa · Web viewKurupelit Kampüsü 55139 SAMSUN Tel: +90 362 312 19 19 Faks: +90 362 457 60 91 [email protected] Fen-Edebiyat Fakültesi

T.C.ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ

Fen-Edebiyat Fakültesi

Moleküler Biyoloji ve Genetik

Adli Biyoloji

Adli Genetik Laboratuvarlarının Özellikleri

ve Deney Sonuçlarına Etki Eden Faktörler

3. Hafta

Kurupelit Kampüsü 55139 SAMSUN Tel: +90 362 312 19 19 Faks: +90 362 457 60 91 [email protected] www.omu.edu.tr


Olay yerinden elde edilen biyolojik örneklerin saptanmasında kullanılan majör komponentlerin belirlenebilmesi için mikroskobik, kimyasal, immünolojik ve enzimatik yöntemlerden faydalanılmaktadır. Doğrulama testleri biyolojik materyalin orijinini belirlemede kullanılan tek veya kombine metotlar olarak uygulanabilmektedirler. Biyolojik materyalin tanımlanması aşamasında örneğe ya da içerdiği bir maddeye spesifik reaksiyon vermektedirler. Yanlış pozitiflik yok denemez; fakat tarama testlerine oranla çok daha düşüktür. Dezavantajı; tarama testlerine göre daha pahalı olması, ilave cihaz gerekebilmesi ve analiz süresinin daha uzun olmasıdır.

KanBilinmeyen bir kan lekesini identifiye etmek için, tarama testleri ile

pozitif bir sonuç elde edildiğinde çeşitli doğrulama testleri uygulanmaktadır. Bu testler; mikroskobik, spektroskopik, immünolojik ve kromatografik metotlar olarak sınıflandırılabilmektedir. Mikroskobik yöntemlerin en basiti, sıvı kanda doğrudan kan hücrelerinin saptanmasıdır. Kırmızı ve beyaz hücrelerin görsel olarak identifikasyonu numunenin kan olduğunun kanıtıdır. Fakat diğer daha popüler konfirmasyon testleri, mikroskobik tekniklerin gelişimi sayesinde hücre identifikasyonu ile yer değiştirmiştir. Bu alanda en sık kullanılan yöntem TEM’dir. Çok küçük ya da seyreltilmiş lekeler bile bu metotla saptanabilmektedir. Belli kimyasal reaktiflerle muamele edilen kan lekeleri mikroskop altında izlenebilen bir kristallenme reaksiyonu göstermektedirler. Kristallenme testleri için en popüler iki test, Teichman ve Takayama testleri olarak bilinmektedir. Teichman testi, bir halojenür ve glasiyal asetik asit varlığında kurutulmuş bir lekenin ısıtılması suretiyle hematin oluşması temeline dayanmaktadır. Takayama testi ise alkali koşullar altında, piridin ve glukoz varlığında hemokromojen oluşması prensibine dayanmakta ve mikroskop altında somon pembesine benzer kristaller görülmektedir

SemenMeni saptanması için en güvenilen ve en çok kullanılan metot, sperm

hücrelerinin mikroskobik yöntemle identifikasyonudur. Proteinaz K solüsyonu kullanımı sonrasında epitel hücreleri denatüre olduğundan, bu solüsyondan etkilenmeyen sperm daha fazla görünür hâle gelmektedir. Mikroskobik tekniklerin en önemli dezavantajı meni vericisinde doğal



nedenler sebebiyle azospermi olduğu durumlardır. Sperm aranan meni örneği için en popüler kimyasal doğrulama yöntemi prostat spesifik antijen (PSA) ya da yaygın kullanılan adıyla P30 testidir. Bu yöntem ile kontamine örneklerde, yıkanmış kumaşlarda ve çürümüş cesetlerde çalışılabilmektedir. Özellikle azospermik erkeklerin meni örneklerinde diğer sperm tespit yöntemleri ile sonuç alınamayan vakalarda pozitif reaksiyon elde edilebilmektedir. Sperm tespiti için diğer kullanımı olan metotlar; immünoelektroforez, ELISA ve radyolojik olarak işaretli Protein A içeren immunoassay teknikleri ya da membran aspirasyon testi olarak bilinen metotlardır. Son yıllarda antijen-antikor reaksiyonuna dayalı olan çok daha hızlı ve kullanımı kolay olan test kitleri kullanıma sunulmuştur.

TükürükKan ve meni için kullanılan metotların çoğu tükürük için de

kullanılabilmektedir. Alvarez tarafından, tükürük örneklerindeki bazı markırlar için DNA ve mRNA izolasyon metotları tanımlanmıştır. Juusola ve Ballantyne tarafından, kan ve semen tespitinde olduğu gibi tükürük için de RTPCR metodu önerilmiştir. Bu yöntemde tükürük için spesifik gen olan statherin ve HTN3 tespiti temel alınmıştır. Araştırmacılar tarafından, ilerleyen süreçte teknik için patent geliştirilmiştir. Quarino tarafından, tükürük lekelerini saptamak için monoklonal anti-insan tükürük amilaz antikorunun kullanımıyla bir ELISA metodu geliştirilmiştir. Tükürük amilazı 405 nm’deki absorpsiyonu ile örnekten kantitatif olarak saptanabilmekte ve burada absorpsiyon ve amilaz aktivitesi arasında direkt ilişki bulunmaktadır. Sonuçlara göre; tükürük örneklerinin %100’ü ve diğer vücut sıvılarının ancak %13’ü absorpsiyon göstermiştir. Karl Reich ve ark. tarafından, tükürük varlığının kofirmasyonu için hızlı, doğru ve yüksek hassasiyetli bir metot olarak lateral akış test stribi geliştirilmiştir. Bu teknikte, monoklonal ya da poliklonal olabilen insan tükürük amilazına karşı 9 antikor kullanılmıştır. Bu test türe spesifiktir ve çok farklı örnek tiplerine uygulanabilmektedir.

Son yıllarda araştırma konusu olan ve pek çoğu henüz rutin kullanıma girmemiş tekniklerin hemen hemen hepsi konfirmasyon yöntemleri üzerinedir. Bu alanda yapılan son çalışmalarda üç yöntem ön plana çıkmaktadır. Bunlar; floresan spektroskopisi, raman spektroskopisi ve mesajcı ribonükleik asit (mRNA) çalışmalarını temel alan yöntemlerdir.

Son yıllarda yapılan araştırmalarda şüpheli lekenin orijininin belirlenmesi için floresans spektroskopisinin güvenilir ve hassas bir



teknik olduğu ileri sürülmektedir. Bu tekniğin uygulanması sırasında biyolojik örnek herhangi bir kimyasal reaktif ile muamele edilmediğinden, reajen hasarı olmaz. Fakat biyolojik örneğin UV ışığa maruziyetinden kaynaklanan fotodegradasyon olasılığı sebebiyle, tekniğin yıkıcı olmama özelliği tartışmalıdır. İdrardaki lipitler, proteinler, nükleik asitler veya kandaki hem ya da kurumuş meni gibi vücut sıvılarındaki çoğu komponent floresan özellik göstermektedir. Sıvıların her biri bireysel kompozisyonlara sahiptir ve onların kimyasal parmak izi olarak emisyon spektrumunda karakteristik özellikleri bulunmaktadır. Örneğin; 260 nm dalga boyunda kan, meni, tükürük ve idrardaki emisyon spektrumu birbirinden farklıdır. Bu teknik lekeli bir materyaldeki çok büyük bir alanı çok hızlı bir şekilde taraması ve hassas olması sebebiyle idealdir

Raman spektroskopisi, uygulama sırasında biyolojik örneğe zarar vermeyen ve olay yeri incelemesinde örneğin; orijinin belirlenmesi için son yıllarda önerilen biyoanalitik tekniklerden biridir. Raman spektroskopisi, floresans spektroskopisi ile karşılaştırıldığında, daha düşük bir hassasiyete sahip olmasına rağmen kimyasal ve biyokimyasal olarak çok daha yüksek spesifikliğe ve ayırım gücüne sahip olduğu bulunmuştur. Bu tekniğin temeli partikül saçma tekniğiyle; katı, sıvı ve gaz örneklere lazer ışınımı gönderilmesi esasına dayanmaktadır. Örnek hazırlama basamağı içermemesi ya da bu basamağın çok kısa olması ve test edilen materyal için pikogram düzeyinde materyalin yeterli olması büyük avantajdır. Her bir farklı vücut sıvısının Raman spektrumu, içerdiği spesifik biyolojik komponentlere bağlı olarak farklı pikler içermektedir. Yöntem üzerinde çalışan araştırıcılar, raman mikrospektroskopisinin kan, semen, tükürük, vajinal sekresyon ve ter gibi vücut sıvılarının ayrımında oldukça başarılı olduğunu, ancak yöntem üzerinde biraz daha çalışılması gerektiğini ifade etmişlerdir.

Tüm vücut sıvılarının identifikasyonunda dokuya spesifik mRNA yöntemlerinin kullanılabilmesine yönelik son yıllarda sayıları gittikçe artan sayıda bilimsel makale yayımlanmıştır. Yöntem üzerinde çalışan araştırıcılar; mRNA’ların dokuya spesifik eksprese olmaları, değişik dokulara ait mRNA belirteçlerinin aynı anda çalışılabilmesi ve az miktardaki biyolojik örneğin analiz için yeterli olması gibi avantajlarından dolayı yöntemin geleneksel testlere alternatif olabileceğini ileri sürmüşlerdir. RNA’nın bu formu hücredeki DNA’dan ribozomlara protein bilgisi taşımaktadır. RNA izolatları üzerinde mRNA’nın ekspresyonunu gerçekleştirmek leke kimliğine ilişkin bilgi elde etmeyi sağlamakta ve sonrasında yapılan DNA analizi donörün kimliğini açığa çıkarmaktadır. Son yıllarda Avrupa DNA Profili Grubu [European DNA Profiling



Group (EDNAP)] bünyesinde, vücut sıvılarının tanımlanması için mRNA spesifik markırları üzerinde ortak çalışmalar gerçekleştirilmeye başlanmıştır. Bu kapsamda yürütülen çalışmalar sonucunda, EDNAP tarafından kan, semen ve tükürük için spesifik mRNA markırları belirlenmiş ve multipleks sistemler oluşturulmuştur.

Biyolojik Delillerin Kimliklendirilmesi Sırasında Karşılaşılan Sorunlar

Amplifikasyon Sırasında Karşılaşılan Sorunlar PCR reaksiyonunun bileşenleri çok önemlidir. Amplifıkasyonun en

uygun şekilde gerçekleşmesi için, her bileşen, belirli derişimde önceden belirlenen miktarda ve doğru zamanda eklenmelidir. Hatta özel çoğalma koşulları (denatürasyon, bağlanma ve uzama sıcaklıkları, bu sıcaklıklarda gerçekleşecek reaksiyonların süresi ve çoğalma döngülerinin sayısı) geliştirme ve geçerlilik testleri sırasında artefaktların varlığını en aza indirecek şekilde ayarlanmalıdır. Bu amaçlarla ticari kitler ile yapılan doğruluk testlerinde, kitin her içeriğinin konsantrasyonu ve döngü parametrelerindeki sıcaklık ve süreler için en uygun koşullar hazırlanmış ve önerilmiştir. Tüm bu parametreler optimize edilmesine rağmen bazı faktörler, PCR’ın güvenilirliğinin yani amplifıkasyon işlemi sırasında elde edilen ürünün orijinal DNA'yı ne kadar yansıttığının sorgulanmasına sebep olmaktadır.

Bunlardan biri primerin hibridizasyonu sırasında meydana gelen düşük özgüllüktür. Bu durumda istenmeyen ürünler oluşabilir ve bunlar amplifıkasyonun ilerleyen basamaklarında yeni kalıp olarak kullanılır. Hibridizasyon özgüllüğünde primerlerin uzunluğu ve dizini önemlidir. Bunun yanı sıra bağlanma sıcaklığı da ayrı bir önem taşır. Hatalı amplifıkasyonda yanlış bağlanma DNA dizininin özel bir bölümünde ve anlamlı bir oranda meydana gelebilir. Bu durum kalitatif güvenirliliğini etkilemektedir. Amplifikasyonun kalitesi hedef dizinin uzunluğuna bağlıdır. Kısa dizinler (100- 200 bç) amplifikasyonda iyi sonuç verir.

İkincisi tercihli amplifikasyondur. Bu, aynı reaksiyonda diğerinden daha çok tercih edilen bir alelin çoğaltılmasıdır. Böylece heterozigot bir kişi homozigot olarak görülür. Bu durum alel düşmesi (allelic drop out) olarak isimlendirilir. DNA'yı bir arada tutan kimyasal bağlardan G:C arasındakilerin daha güçlü olması, bunları denatüre etmek için biraz daha yüksek sıcaklığa ihtiyaç duymasına sebep olur. Eğer iki alelden biri, ortalamadan daha fazla G.C oranı içeriyorsa, denatürasyon sıcaklığı biraz



daha düşük olduğunda tamamen denatüre olmaz. Tamamlanmamış denatürasyon, amplifikasyon sırasında primerleri engeller ve G:C bakımından zengin olan alelin geri kalmasına sebep olur.

Üçüncüsü, stokastik dalgalanmalardır (stochastic fluctuations). Bu durum, DNA'nın çok seyreltik derişimlerinde (DNA yaklaşık 100 pg’nin altında ise) örnekleme hatalarından kaynaklanan farklılıklar olarak tanımlanmaktadır. Amplifikasyon için sadece bir kısım DNA çekiti başka bir tüpe aktarıldığında bu tip hatalar meydana gelir. Tüm örnekte birkaç hücreden gelen DNA bulunuyorsa, çekit içinden PCR tüpüne aktarılan örnekte kromozom çiftleri eşit olarak bulunmayabilir. Bunun sonucu olarak, iki alelden sadece birinin belirlenmesi, aslında heterozigot olan bir kişiyi homozigot olarak tiplemeye yol açabilir.

Dördüncüsü, bazların yanlış eşleşmesine bağlı amplifikasyonun etkilenmesi durumudur. Yanlış eşleşme, primerin bağlandığı yere yakın ya da primerin bağlandığı bölgenin iç tarafında gerçekleşiyorsa, primerin bağlanma etkinliğini azaltarak amplifıkasyonun kalitesini düşürür.

DNA’nın Degredasyonu Tüm organizmaların DNA içermesi nedeni ile, insan dışı canlılara ait

DNA içerikleri tarafından kontamine edilen delillerin sorun yaratacağı düşünülebilir. Özellikle, bakteri, mantar gibi mikro organizmaları içeren örnekler, bitki ya da hayvan kaynaklı DNA kadar, fizyolojik sıvılarda ve toprakta da bulunabilir. Ancak insana ait olmayan DNA bir sorun yaratmaz, çünkü adli amaçlı kullanılan DNA testleri insana (en azından en yüksek primata) özgüdür. PCR işleminde kullanılan primerler insan DNA’sına spesifiktir. Fakat, DNA'ya zarar veren enzimleri (nukleazlar) üreten mikro organizmaların kontaminasyonu söz konusu ise, bunlar insan DNA'sının degradasyonuna sebep olacağı için, PCR sonrası sonuç alınamamasına neden olur[36;37].

Kontaminasyon PCR işleminin çok az miktardaki DNA’yı amplifiye edebilme özelliği,

yeterli özen gösterilmediği takdirde bir dezavantaja dönüşebilir. İncelenen örneğin içine başka bir DNA kaynağının transfer olması kontaminasyon anlamına gelmektedir. DNA kontaminasyonunu engellemek için onaylanmış laboratuvar protokolleri kullanılmalıdır. Kontaminasyonun gerçekleşmesi durumunda, incelenen materyalin DNA



profilinin çıkarılamamasına sebep olabilir. Bu durumda suçlunun lehine bir sonuç doğurur.

Kontaminasyonun Nedenleri Delil niteliği taşıyan bir biyolojik materyal aşağıda anlatılan

durumlarda kontamine olabilir. 1. Olay yerinde bulunan ve genomik DNA içeren delillerin toplanması

sırasında; Farklı biyolojik materyallerin usulune uygun toplanmaması nedeni ile

birbirini kontamine etmesi. Olay yerinde bulunan kişilerin gerekli önlemleri almaması veya özeni göstermemesi nedeniyle kendi DNA’ları ile kontaminasyona sebep olmaları

2. Laboratuvarda biyolojik materyalin analize hazırlanması ve/veya analizi sırasında örneklerin birbirleriyle kontaminasyonu

3. Laboratuvar personelinin kendi DNA’sı ile biyolojik mateyali kontamine etmesi

4. Bir önceki PCR işlemi sırasında amplifiye olan DNA’nın, bir sonraki örneğe kontaminasyonu.


Documents

OMÜ - Akademik Veri Yönetim Sistemi - Anasayfa · Web viewKurupelit Kampüsü 55139 SAMSUN Tel: +90 362 312 19 19 Faks: +90 362 457 60 91 [email protected] Fen-Edebiyat Fakültesi