Nuovi sviluppi della citogenetica medica in pediatria

Prof. Graziano Pescia

APSI Lugano, 5 dicembre 2002

5 dicembre 2002

.5 dicembre 2002

PrologoGenomaGenoma e e cromosomicromosomi

Le anomalie citogenetichecostituzionalitipi, origine

e meccanismi

24 molecole

6pg d ’ADN ⇒170 cm

3 Miliardi di pb

46 Mila geni 97%3% Junk DNA (robaccia)15% ripetitivo

L’ADN : 23 chromosomi, 31’400 geni loc, 3 ’000 Mb

8,07,8

6,56,2

5,95,6

5,24,7

4,4 4,4 4,4 4,4

3,5 3,3 3,23,0 2,8

2,6

2,0 2,2

1,5 1,7

5,0

1,8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

3 ’000

1 ’500

No di geni/cromosoma% ADN/cromosoma (HHG)

5 dicembre 2002

Anomalie citogeneticheN = 9 ’060

Aneuploidie

TrisomieMonosomie

Mosaico

TraslocazioniInversioni

Duplicazioni (Micro)

Delezioni (Micro)

Telomeriche

Numeriche StrutturaliFunzionali

UPDImprinting

Del-Dup-UPD-Siti fragili N = 2 ’336

Origine delle Anomalie Citogenetiche (%)

Errori mitotici (Mosaico, UPD) 3

Totale 100

TotaleErrori 8 (Meiosi I>II) 89 97meiotici

5 dicembre 2002

MI Non-disgiunzione

Non-disgiunzione

∅

MII

∅

∅ ∅

LA MEIOSI (>95%)

Mosaico

1

↓

3

↓

5

↓

7

1/2

3/4

15/16

31/32

63/64

0.20.40.60.81

% di cellule trisomiche

Zigote Trisomico

Anaphase lag

2 3

↓3↓↓3

Disomia uniparentale = UPD

0.20.40.60.81

1

↓

3

↓

5

↓

7

% di cellule trisomiche

Trisomia

Rescue

Disomia uniparentale paterna

P M

P

M MP

P

P

P

P

P

P

P

L ’imprinting (meiosi)

Metilazione della citosina → inattivazione del gene

CH

3

CH

3

CH

3

La noda

!

S

M

G1G2

CDK

Cyclines

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⊗⊗

⊗

MITOSI⊗ Check point 1

Ok dimensioni cellulaOk integrità ADN

⊗ Check point 2Ok replicazione ADNOk dimensioni cellula

Correttura errori

⊗ Check point 3Centromeri-Fuso

5 dicembre 2002

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5 dicembre 2002

!Errori

Replicazioneanomalie strutturali

Ripartizioneanomalie numeriche

MalformazioniTumori

⊗ Check point 3Centromeri-Fuso

⊗ Check point 2Correttura errori rep

.5 dicembre 2002

Atto primoDelittoDelitto e e castigocastigo

Conseguenzefeto-placenta-neonatoneonato

Dati epidemiologici :gameti, zigoti e via dicendo

Conseguenze pediatriche degli squilibri costituzionali

Malformazioni

Dismorfismo

RCIU

5 dicembre 2002

Handicapmentale

Mortalità

Morbidità

Malformazioni congenite

Deaths in full-term neonates 48%

Pediatric intensive care admissions 39%

Pediatric hospital admissions 21%

Am J Hum Gent, 63, 1153, 1998

5 dicembre 2002

Handicap mentale : 2-3% di cui∼ 15% con anomalia cromosomica >3-4 Mb

Delezionitelomeriche

Delezioniinterstiziali

+∼ 10% <3-4 Mb

5 dicembre 2002

Totale ∼ 25%

Frequenzadelle anomalie cromosomiche

Ovociti25%

Spermatozoi2%

Zigoti >30%Aborti spontanei >50%

Neonati <0.3%

handicappate25%

Coppie sterili5-10%

Persone

20000

60000

100000

140000124 ’000

CONCEPIMENTI

28 ’000

50 ’000ABORTI

27 ’600

74 ’000NASCITE

400 cromosomi

2001 L ’Odyssea della specieCH : 74 ’000 nascite

←− 40 ← ←− 20 ← ← 0 ←

5 dicembre 2002

AneuploidieTrisomie Monosomie

1a78910111213141516171819202122XY

89

13

18

21XY

XY

Rilevanza

pediatrica

Embrione

feto

.5 dicembre 2002

Atto secondo

Le Le novitnovitàà

FISH & Chipse pot pourri …

Metodologia

Génétique médicale

Cariotipo con bandeggio G(500 bande) : 47,XY, Trisomia 21 liberaRisoluzione ∼ 3-4 MbCorrispondente a ∼ 20 geni

Le novità in citogenetica umana

CGHFISH

SKY5 dicembre 2002

La legge di complementarità

5 dicembre 2002

C-GLegami idrogeno

Legami covalenti

A-T

A

G

C

T

T

G

C

T

A

A

A-TT-A

G-C

G-C

T-A

A-T

C-G

G-C

T-A

A-T

C-G

G-C

T-A

T-A

A-TT-A

G-C

G-C

T-A

A-T

C-G

G-C

T-A

A-T

C-G

G-C

T-A

T-A

Principio della FISH

1. Denaturazione termica In Situ

A T G T G A

T A C A C

TA

CA

CT

A T G T G A A

A T G T G* * * * *

A T G T G* * * * *

A T G T G* * * * *

A T G T G* * * * *

2. Ibridazione

3. Osservazione con FluorescenzaSonde

Trisomia 21 Mosaico

Cancro vescicaSperma

HER-2

Cancro al seno

FISH interfasica

Tipi di FISH metaphasica

Centromero Telomeri

Locus Painting

5 dicembre 2002

Varietà di FISH metafasica

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 X Y

Telomerica

Painting

Locus

5 12 2002

Cariotipo spettrale24 colori

SKY

Comparative Genomic Hybridization

Ibridazione con ADN del paziente solo

Ibridazione con ADN normale solo

Miscugliopaziente + normale

MetafasiNormale

.5 dicembre 2002

Atto terzoSindromiSindromi dada

MicrodelezioniSRSSMSDGS

« Nuove » anomalie cromosomiche

Strutturaliµdel interstiziali µdel telomeriche

Funzionali : UPD5 dicembre 2002

Sindrome di Williams (1962), OMIM #194050

»Facies d'elfo »Cardiopatia congenita (SASV)Ritardo mentale/psicomotorio (QI 55-60)Sensibilità rumori, musicaGrande sociabilità

> 99% des casi : delezione 7q11Frequenza : 1/15 ’000Rischio : 50% (figli, Am J Med Genet 1993 47,468-70),

1% (fratelli-sorelle)5 dicembre 2002

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 X Y

FISH metafasica (delezione 7q11)

5 dicembre 2002

Sindrome di Smith-Magenis (1962), OMIM # 182290

Dismorfia non specificaMani corte/brachidattiliaRitardo mentale/psicomotorio (QI 55-60)Fenotipo comportamentale (polyembolokoïamanie)Disturbi del sonno

> 99% des casi : delezione 17p11.2

Frequenza : 1/25 ’0005 dicembre 2002

Sindrome di Smith Magenis

Génétique médicale

delezione 17p11.2

5 dicembre 2002

Sindrome di DiGeorge (1968), OMIM #188400Shprintzen, Velo-Cardio-Facciale, CATCH 22

Cardiopatia congenita (80%)Disturbi del linguaggioImmunodeficienza (80%)Ipocalcemia (16-60)Dismorfia (eterogeneità +++)Psicosi

> 99% des casi : delezione 22q11.2Frequenza : 1/3 ’000

FISH locus-specifica (delezione 22q11)Génétique médicale

22q11 deleta

22q11 normale

MicrodelezioniInterstiziali Subtelomeriche

7 Williams8 Trico Rino Falangeale

11 Beckwith

13 Retinoblastoma

15 PWA S16 Rubinstein Taybi17 Miller Dicker

20 Alagille

22 DiGeorge

124679111213141516202122

124679111213141516202122

1 1p36

14 q32.3

.5 dicembre 2002

Atto quarto

Tradimento a Mendel

DisomiaDisomia uniparentaleuniparentaleImprintingImprinting

SRS, PWAS

Anomalie cromosomiche funzionaliUPD : Fenotipo

Mosaico Imprinting

Eccezioni alle leggi di Mendel

Placenta± Feto

MaternoPaterno

5 dicembre 2002

Sindrome di Russel-Silver (1954), OMIM # 180860

DismorfiaFaccia triangolareBassa statura/nanismoAsimmetria corporea/emitrofiaRitardo della crescita intrauterinaEtà ossea ritardataClinodattilia del quinto dito

< 10% des casi : UPD7matFrequenza : > 150 casi pubblicati

5 dicembre 2002

"La Monstrua" vestida "La Monstrua" desnuda

CARREÑO DE MIRANDA, Juan (1614-1685) Eugenia Martínez Vallejo

Sindrome di Prader Willi (1956), OMIM #176270

Ipotonia ++/DismorfiaRitardo psicomotorio /mentaleObesità generalizzataMani e piedi piccoliPubertà ritardata/IpogonadismoFrequenza : 1/10 000

Delezione PAT 15q11-q13 pat >70%UPDmat 25%Anomalie dell ’imprinting 5%

Sindrome di Angelman (1965), OMIM #105830

IpotoniaMicrocefaliaEEG anomalo - Convulsioni epilessiaRitardo mentale graveAssenza del linguaggio

Delezione MAT 15q11-q13 mat > 70% UPDpat 5% Anomalie imprinting 10% UBE3A

Frequenza : 1/12 000

t

t

A

t PW24 PW

5 dicembre 2002

Lancet, II/1991, 638

PWS

AS

PWS

AS

PWS

AS

PWS

AS

L ’imprinting

La noda La noda

Delezione paternaPWS

AS

PWS

AS

PWS

AS

PWS

AS

PW

PWS

AS

PWS

AS

PWS

AS

Delezione maternaPWS

AS

SA

Trisomia 15 d ’origine materna

UPDmat Prader Willi Normale

Rescue

Trisomia 15 d ’origine paterna

Rescue

UPDpat Angelmann Normal

UPDPaterna Materna

Fenotipo

6 Transient Neonatal DM

11 BWS

14 RCIU non spec.

15 PWS

124679111213141516202122

124679111213141516202122

Silvr Russel S 7

RCIU non spec 14

AS 15

RCIU Non-spec 16

.

Oltre al quadro clinico e alle analisi genetiche la diagnosi delle Sindromi da UPD può richiedere la dimostrazione formale del contributo genetico di unosolo genitore.

Epilogo

Novità: Zusammenfassung

Tecniche Cliniche

Ibridazioni molecolari

FISH, SKY, CGH

« Nuove » sindromi

µDel, UPD, Impronta

ELSI

Il trionfo dei geni

Cariotipo ?

5 dicembre 2002

Dismorfia sola

Dismorfia+RM

SI

NO

.

J ’espère que vous me saurez gré non tant pour les choses que je vous ai dites, mais plutôt pour celles que j ’ai volontairement omises afin de vous laisser le plaisir de les découvrir ou, mieux, de les inventer vous-mêmes.

René Descartes

Fine

galacidalacidesoxyribonucleicacid

GrazieMerci

Anomalie Citogenetiche Costituzionali

TOTALE ANOMALIE 9060

DELEZIONI DUPLICAZIONI 2077

UPD SITI FRAGILI 259

5 dicembre 2002

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

DS Borgaonkar, 8th Ed, 1997

Normale Traslocazione Pachitene

PWS

5 dicembre 2002

« Le dernier cri » : la CGH

ADN normaleADN paziente

MetafasiNormale

Rosso vincenteTrisomia

Verde vincenteMonosomia

Anomalie Citogenetiche Costituzionali

UPD SITI FRAGILI 259

DELEZIONI DUPLICAZIONI 2077

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

TOTALE ANOMALIE 9060

INVERSIONI TRASLOCAZIONI 5403

5 dicembre 2002DS Borgaonkar, 8th Ed, 1997

FŒTUS →Mitosi NASCITA PUBERTA → →

Mitosi

Inizio Meiosi

Stop Meiosi

Ripresa Meiosi

Inizio Meiosi

Folliculi

GP2

Fine Meiosi

Stop Mitosi

T(9;11)

Sindrome di Beckwith-Wiedemann (1954),OMIM # 130650

OnfaloceleMacroglossiaGigantismoOrganomegaliaTumori embrionaliIpoglicemeia neonatale< 20% des casi : patUPD11

Frequenza : > 1/10 ’0005 dicembre 2002

DiagnosiSindrome di Beckwith-Wiedemann

Génétique médicale

patUPD11

5 dicembre 2002

Pachitene

PWS DelPWS

5 dicembre 2002

Zygote Trisomique

Non-disjonction

Zygote Disomique

Anaphase lag

2 3

Mosaïcisme : 2 mécanismes3%

3

↓3↓3↓3

↓2↓2↓2 1

LA MITOSE

L’ADN frammentato : % genoma aploide/cromosoma

30 Mb et 31’400 geniNo di geni per cromosoma

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

24 molecole

6pg d ’ADN ⇒170 cm

3 Miliardi di pb

46 Mila geni 97%3% Junk DNA (robaccia)15% ripetitivo

Anomalie citogeneticheN = 9 ’060

Aneuploidie

TrisomieMonosomie

Mosaico

TraslocazioniInversioni

Duplicazioni (Micro)

Delezioni (Micro)

Telomeriche

Numeriche StrutturaliFunzionali

UPDImprinting

Del-Dup-UPD-Siti fragili N = 2 ’336

Origine delle Anomalie Citogenetiche (%)

Errori mitotici (Mosaico, UPD) 3

Totale 100

TotaleErrori 8 (Meiosi I>II) 89 97meiotici

5 dicembre 2002

L ’imprinting (meiosi)

Metilazione della citosina → inattivazione del gene

CH

3

CH

3

CH

3

La noda

!

S

M

G1G2

CDK

Cyclines

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MITOSI⊗ Check point 1

Ok dimensioni cellulaOk integrità ADN

⊗ Check point 2Ok replicazione ADNOk dimensioni cellula

Correttura errori

⊗ Check point 3Centromeri-Fuso

5 dicembre 2002

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5 dicembre 2002

!Errori

Replicazioneanomalie strutturali

Ripartizioneanomalie numeriche

MalformazioniTumori

⊗ Check point 3Centromeri-Fuso

⊗ Check point 2Correttura errori rep

Conseguenze pediatriche degli squilibri costituzionali

Malformazioni

Dismorfismo

RCIU

5 dicembre 2002

Handicapmentale

Mortalità

Morbidità

Malformazioni congenite

Deaths in full-term neonates 48%

Pediatric intensive care admissions 39%

Pediatric hospital admissions 21%

Am J Hum Gent, 63, 1153, 1998

5 dicembre 2002

Handicap mentale : 2-3% di cui∼ 15% con anomalia cromosomica >3-4 Mb

Delezionitelomeriche

Delezioniinterstiziali

+∼ 10% <3-4 Mb

5 dicembre 2002

Totale ∼ 25%

Frequenzadelle anomalie cromosomiche

Ovociti25%

Spermatozoi2%

Zigoti >30%Aborti spontanei >50%

Neonati <0.3%

handicappate25%

Coppie sterili5-10%

Persone

20000

60000

100000

140000124 ’000

CONCEPIMENTI

28 ’000

50 ’000ABORTI

27 ’600

74 ’000NASCITE

400 cromosomi

2001 L ’Odyssea della specieCH : 74 ’000 nascite

←− 40 ← ←− 20 ← ← 0 ←

5 dicembre 2002

AneuploidieTrisomie Monosomie

1a78910111213141516171819202122XY

89

13

18

21XY

XY

Rilevanza

pediatrica

Embrione

feto

Le novità in citogenetica umana

CGHFISH

SKY5 dicembre 2002

La legge di complementarità

5 dicembre 2002

C-GLegami idrogeno

Legami covalenti

A-T

A

G

C

T

T

G

C

T

A

A

A-TT-A

G-C

G-C

T-A

A-T

C-G

G-C

T-A

A-T

C-G

G-C

T-A

T-A

A-TT-A

G-C

G-C

T-A

A-T

C-G

G-C

T-A

A-T

C-G

G-C

T-A

T-A

Trisomia 21 Mosaico

Cancro vescicaSperma

HER-2

Cancro al seno

FISH interfasica

Cariotipo spettrale24 colori

SKY

Comparative Genomic Hybridization

Ibridazione con ADN del paziente solo

Ibridazione con ADN normale solo

Miscugliopaziente + normale

MetafasiNormale

.5 dicembre 2002

Atto terzoSindromiSindromi dada

MicrodelezioniSRSSMSDGS

« Nuove » anomalie cromosomiche

Strutturaliµdel interstiziali µdel telomeriche

Funzionali : UPD5 dicembre 2002

MicrodelezioniInterstiziali Subtelomeriche

7 Williams8 Trico Rino Falangeale

11 Beckwith

13 Retinoblastoma

15 PWA S16 Rubinstein Taybi17 Miller Dicker

20 Alagille

22 DiGeorge

124679111213141516202122

124679111213141516202122

1 1p36

14 q32.3

.5 dicembre 2002

Atto quarto

Tradimento a Mendel

DisomiaDisomia uniparentaleuniparentaleImprintingImprinting

SRS, PWAS

UPDPaterna Materna

Fenotipo

6 Transient Neonatal DM

11 BWS

14 RCIU non spec.

15 PWS

124679111213141516202122

124679111213141516202122

Silvr Russel S 7

RCIU non spec 14

AS 15

RCIU Non-spec 16

Novità: Zusammenfassung

Tecniche Cliniche

Ibridazioni molecolari

FISH, SKY, CGH

« Nuove » sindromi

µDel, UPD, Impronta

ELSI

.

J ’espère que vous me saurez gré non tant pour les choses que je vous ai dites, mais plutôt pour celles que j ’ai volontairement omises afin de vous laisser le plaisir de les découvrir ou, mieux, de les inventer vous-mêmes.

René Descartes

Fine

galacidalacidesoxyribonucleicacid

GrazieMerci