Novi mehanizmi toksiĊnosti pri bakteriji Clostridium difficile · Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile. Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru,

UNIVERZA V MARIBORU

MEDICINSKA FAKULTETA

DOKTORSKA DISERTACIJA

NOVI MEHANIZMI TOKSIČNOSTI PRI BAKTERIJI

Clostridium difficile

OKTOBER, 2010 Mateja Zemljič

UNIVERZA V MARIBORU


DOKTORSKA DISERTACIJA

NOVI MEHANIZMI TOKSIČNOSTI PRI BAKTERIJI

Clostridium difficile

DOCTORAL DISSERTATION

A NEW MECHANISMS OF TOXICITY IN Clostridium

difficile

OKTOBER, 2010 Mateja Zemljič

MENTORICA: izr. prof. dr. Maja Rupnik

UDK

615.9:579.852.13(043.3)

616.98-092:577.1/.2.083.3(043.3)

Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile.

Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. II

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ......................................................................................................................... 1

1.1 PRIČAKOVANI IZVIRNI ZNANSTVENI PRISPEVKI ............................... 1

2 PREGLED OBJAV ..................................................................................................... 3

2.1 BAKTERIJA Clostridium difficile IN BOLEZNI, KI JIH POVZROČA ........ 3

2.2 BAKTERIJSKI TOKSINI KOT DEJAVNIKI VIRULENCE ......................... 4

2.2.1 Citolitični (hemolitični) bakterijski toksini ................................................... 5

2.3 Toksini, ki tvorijo pore (PFT) ........................................................................... 5

2.3.1.1.1 Od holesterola odvisni citolizini (CDC)............................................. 6

2.3.1.1.2 Toksini, ki tvorijo majhne pore (ang. "small PFT") ........................... 7

2.3.1.1.3 RTX toksini ("repeats found in each toxin") ...................................... 7

2.3.1.2 Citolitični encimi ................................................................................... 8

2.3.1.3 Toksini z neznanim mehanizmom delovanja ...................................... 11

2.3.2 Toksini bakterij iz rodu Clostridium ........................................................... 11

2.3.3 Toksini bakterije Clostridium difficile ........................................................ 12

2.3.3.1 Zgradba TcdA, TcdB in CDT .............................................................. 13

2.3.3.2 Molekularni mehanizem delovanja TcdA, TcdB in CDT ................... 15

2.3.3.3 Vloga toksinov TcdA in TcdB v patogenezi ....................................... 18

2.3.3.4 Vloga toksina TcdB v patogenezi ........................................................ 20

2.3.3.5 Vloga N-terminalne in C-terminalne domene v patogenezi ................ 20

2.4 MODELI ZA ŠTUDIJ PATOGENEZE C. difficile ....................................... 21

2.4.1 In vitro modeli za študij patogeneze C. difficile ......................................... 21

2.4.2 In vivo modeli za študij patogeneze C. difficile .......................................... 22

2.4.2.1 Ţivalski modeli za študij okuţbe s C. difficile ..................................... 22

2.4.2.2 Nevretenčarski ţivalski modeli za študij okuţbe s C. difficile ............ 23

2.5 AVTOFAGIJA IN NJENA VLOGA PRI NASTANKU CELIČNE SMRTI 24

3 MATERIALI IN METODE ...................................................................................... 26

3.1 BAKTERIJSKI SEVI IN GOJENJE BAKTERIJ .......................................... 26

3.1.1 Clostridium difficile .................................................................................... 26

3.1.2 Escherichia coli .......................................................................................... 26

3.2 CELIČNE LINIJE IN GOJENJE CELIC ....................................................... 27

3.3 PRIPRAVA REKOMBINANTNE C-TERMINALNE VEZAVNE DOMENE

TOKSINA B (rec-TcdB3VPI, 8864) ...................................................................................... 28

3.4 MERJENJE CELOKUPNE KONCENTRACIJE PROTEINOV Z METODO

BCA ........................................................................................................................ 29

3.5 DOLOČANJE CELIČNE VIABILNOSTI S TESTOM MTT ...................... 29

3.6 DOLOČANJE DELEŢA CELIC V POSAMEZNIH FAZAH CELIČNEGA

CIKLA S PRETOČNIM CITOMETROM Z UPORABO PROPIDIJEVEGA JODIDA

(PI) ........................................................................................................................ 30

3.7 METODA S FLUORESCENTNO OZNAČENIM PROTEINOM ANEKSIN-

V (AV) IN BARVILOM PROPIDIJEV JODID (PI) ZA DOLOČANJE DELEŢA

APOPTOTIČNIH CELIC S PRETOČNIM CITOMETROM .......................................... 30

3.8 SLEDENJE PROTEINOV BCL-2, BAX IN PARP Z NADS-PAGE, S

PRENOSOM PO WESTERNU IN IMUNODETEKCIJO ............................................... 31


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. III

3.9 DOLOČANJE AKTIVNOSTI IZVRŠITELJSKE KASPAZE-3 S

PRETOČNIM CITOMETROM ........................................................................................ 31

3.10 SLEDENJE APOPTOZE Z VSE-KASPAZNIM ZAVIRALCEM Z-VAD-

FMK (BENZYLOXYCARBONYL-VAL-ALA-ASP-FLUOROMETHYLKETONE) .. 32

3.11 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE PREKO TVORBE

REAKTIVNIH KISIKOVIH SPOJIN (ROS) S TESTOM MTT ..................................... 32

3.12 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE PREKO TVORBE

REAKTIVNIH KISIKOVIH SPOJIN (ROS) S PRETOČNIM CITOMETROM ........... 33

3.13 MERJENJE MITOHONDRIJSKEGA MEMBRANSKEGA POTENCIALA

(MMP) S PRETOČNIM CITOMETROM ....................................................................... 33

3.14 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE Z DIFERENCIALNIM

BARVANJEM Z BARVILOM DIHIDRORODAMIN 123 (DHR 123) ........................ 34

3.15 SLEDENJE AVTOFAGIJE Z UPORABO BARVILA AKRIDIN ORANŢNO

(AO) ZA KONFOKALNO MIKROSKOPIJO ................................................................. 34


(AO) S PRETOČNIM CITOMETROM ........................................................................... 34

3.17 SLEDENJE PROTEINOV LC3 IN KATEPSINA B ZA UGOTAVLJANJE

AVTOFAGIJE Z NADS-PAGE, S PRENOSOM PO WESTERNU IN

IMUNODETEKCIJO ....................................................................................................... 35

3.18 SLEDENJE AVTOFAGIJE Z METODO PCR V REALNEM ČASU (RT-

PCR) ........................................................................................................................ 35

3.19 SLEDENJE INHIBICIJE AVTOFAGIJE S TESTOM MTT ........................ 38

3.19.1 Določanje celične viabilnosti z inhibitorji avtofagije ................................. 38

3.19.2 Določanje celične viabilnosti po transfekciji celic za utišanje izraţaja gena

becn1 ..................................................................................................................... 38

3.20 SPREMEMBE V AKTINSKEM CITOSKELETU ....................................... 38

3.21 IMUNOFLUORESCENCA PROTEINA TESNIH STIKOV ZO-1 .............. 39

3.22 TRANSEPITELNA ELEKTRIČNA UPORNOST (TEER) CELIC T84 ...... 39

3.23 DOLOČANJE KONCENTRACIJE IL-8 PRI CELICAH HT-29 Z

IMUNSKIM TESTOM ELISA ......................................................................................... 40

3.24 UGOTAVLJANJE UČINKA SEVOV BAKTERIJE C. difficile NA

ERITROCITE ................................................................................................................... 41

3.24.1 Hemoliza β in sevi bakterije C. difficile ..................................................... 41

3.24.2 Ugotavljanje hemolitične aktivnosti supernatanta kulture na eritrocitih .... 42

3.25 NEMATOD C. elegans KOT ŢIVALSKI MODEL ZA OKUŢBO Z

BAKTERIJO C. difficile .................................................................................................. 43

3.25.1 Nematod C. elegans in pogoji vzdrţevanja ................................................ 43

3.25.2 Ugotavljanje učinka TcdB in supernatantov sevov C. difficile na C. elegans

..................................................................................................................... 44

3.25.3 Ugotavljanje učinka sevov C. difficile na C. elegans ................................. 44

3.26 STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV ............................................ 44

4 REZULTATI ............................................................................................................. 45

4.1 UČINEK TOKSINA B (TcdB) IN REKOMBINANTNE VEZAVNE

DOMENE TOKSINA B (rec-TcdB3) NA VIABILNOST CELIC .................................. 45

4.1.1 Določanje celične viabilnosti s testom MTT v prisotnosti TcdB in rec-

TcdB3 ..................................................................................................................... 45


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. IV

4.2 UČINEK TOKSINA B (TcdB) IN REKOMBINANTNE VEZAVNE

DOMENE TOKSINA B (rec-TcdB3) NA APOPTOZO .................................................. 47

4.2.1 Deleţ celic v posameznih fazah celičnega cikla in deleţ apoptotičnih celic v

subG1 fazi v prisotnosti TcdB in rec-TcdB3 ............................................................ 47

4.2.2 Določanje deleţa apoptotičnih in nekrotičnih celic z barvilom aneksin-V

(AV) in barvilom propidijev jodid (PI) v prisotnosti TcdB in rec-TcdB3 ................ 49

4.2.3 Določanje aktivnosti izvrševalne kaspaze-3 s pretočno citometrijo v

prisotnosti rec-TcdB3 ................................................................................................ 51

4.2.4 Detekcija apoptoze s sledenjem Bcl-2, Bax in cepitve PARP v prisotnosti

rec-TcdB3 ................................................................................................................. 52

4.2.5 Prisotnost vse-kaspaznega zaviralca Z-VAD-FMK (benzyloxycarbonyl-

Val-Ala-Asp-fluoromethylketone) ............................................................................ 54

4.2.6 Določanje membranskega mitohondrijskega potenciala (MMP) v

prisotnosti rec–TcdB3 ............................................................................................... 55

4.2.7 Ocena znotrajcelične oksidacije s testom MTT v prisotnosti rec-TcdB3 ... 57

4.2.8 Ocena znotrajcelične oksidacije s pretočno citometrijo v prisotnosti rec-

TcdB3 ..................................................................................................................... 58

4.2.9 Ocena znotrajcelične oksidacije s konfokalno mikroskopijo v prisotnosti

TcdB in rec-TcdB3 ................................................................................................... 59

4.3 UČINEK TOKSINA B (TcdB) NA AVTOFAGIJO ..................................... 61

4.3.1 Diferencialno barvanje morfoloških sprememb celic z akridin oranţnim

(AO) ..................................................................................................................... 61

4.3.2 Dokazovanje kislih vezikularnih organelov z uporabo pretočne citometrije ..

..................................................................................................................... 63

4.3.3 Sinteza proteinov LC3 in katepsina B ........................................................ 64

4.3.4 Izraţanje genov vpletenih v proces avtofagije ............................................ 65

4.3.5 Inhibicija avtofagije s testom MTT ............................................................ 68

4.4 UČINEK TcdB IN rec-TcdB3 NA CITOSKELET ........................................ 71

4.4.1 Reorganizacija aktina .................................................................................. 71

4.4.2 Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na protein tesnih stikov ZO-1 ........................... 73

4.4.3 Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na transepitelno električno upornost (TEER) celic

T84 ..................................................................................................................... 74

4.5 VPLIV TcdB IN rec-TcdB3 NA IZRAŢANJE IL-8 V CELICAH HT-29 .... 76

4.6 HEMOLITIČNA AKTIVNOST BAKTERIJE C. difficile ........................... 77

4.6.1 Hemoliza β in sevi bakterije C. difficile ..................................................... 77

4.6.2 Hemolitična aktivnost supernatanta kulture ................................................ 78

4.7 ŢIVALSKI MODEL NEVRETENČAR C. elegans ...................................... 81

4.7.1 Učinki TcdB in supernatantov sevov C. difficile na C. elegans ................. 81

4.7.2 Učinki sevov bakterije C. difficile na C. elegans ........................................ 81

5 RAZPRAVA IN SKLEPI ......................................................................................... 82

5.1 RAZPRAVA ................................................................................................... 82

5.1.1 Novi mehanizmi delovanja ţe znanih toksinov .......................................... 82

5.1.1.1 Celična smrt - apoptoza, nekroza ali avtofagija .................................. 83

5.1.2 C-terminalna vezavna domena toksina B vpliva na prerazporeditev

aktinskih filamentov in ZO-1 .................................................................................... 86

5.1.3 Motena regulacija imunskega sistema ........................................................ 87


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. V

5.1.4 C. difficile in hemolitična aktivnost ............................................................ 88

5.1.5 Ţivalski model nevretenčar C. elegans ....................................................... 89

5.2 SKLEPI ........................................................................................................... 89

6 POVZETEK .............................................................................................................. 91

7 VIRI .......................................................................................................................... 94

8 ZAHVALA ............................................................................................................. 109

9 PRILOGE ................................................................................................................ 110

9.1 ČLANEK KOT DEL DOKTORSKE NALOGE ......................................... 110

9.2 ŢIVLJENJEPIS ............................................................................................ 116

9.3 OSEBNA BIBLIOGRAFIJA ZA OBDOBJE 1996-2010 ............................ 117


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. VI

KAZALO SLIK

Slika 1. Toksini bakterije Clostridium difficile.. .............................................................. 15

Slika 2. Receptorska vezavna podenota (RBD) toksina reagira s celičnim receptorjem. 17

Slika 3. Učinek TcdB in rec-TcdB3 na celično viabilnost.. ............................................. 46

Slika 4. A. Razdelitev celic v posameznih fazah celičnega cikla.. ................................... 48

Slika 5. Rezultati analize pretočne citometrije. ................................................................ 50

Slika 6. Rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 aktivirata kaspazo-3.. ....................................... 52

Slika 7 Rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 sproţita izraţanje Bcl-2 (29 kDa) in Bax (23

kDa). ................................................................................................................................. 52

Slika 8. Slika filma po prenosu Western prikazuje cepitev PARP po tretiranju z rec-

TcdB3VPI in rec-TcdB8864 (100 μg/ml).. ............................................................................ 53

Slika 9. Deleţ ţivih, zgodnje in pozno apoptotočnih celic ter nekrotičnih celic po analizi

s pretočnim citometrom z metodo Aneksin-V/Propidijev jodid.. ..................................... 54

Slika 10. Vloga mitohondrijskega membranskega potenciala pri celicah tretiranih z rec-

TcdB3VPI, 8864, ki sproţijo apoptozo.. ............................................................................... 56

Slika 11. Učinek rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 v prisotnosti NAC (N-acetyl-L-cysteine)

in GST (glutathione S-transferase) na celično viabilnost.. ............................................... 57

Slika 12. Rezultati analize pretočne citometrije celic HT-29 . ......................................... 58

Slika 13. Tvorba znotrajceličnih ROS pri celicah HT-29. ............................................... 60

Slika 14. Celice obarvane z akridin oranţnim smo opazovali s konfokalnim

mikroskopom.. .................................................................................................................. 61

Slika 15. Prikaz diagramov in histogramov netretiranih celic in celic tretiranih. ............ 63

Slika 16. TcdBVPI in TcdB8864 sproţita izraţanje proteina LC3.. ..................................... 64

Slika 17. TcdBVPI in TcdB8864 sproţita izraţanje proteina katepsina B (39 kDa).. .......... 65

Slika 18 Stopnja izraţanja gena lc3 pri različnih časih inkubacije.. ................................ 66

Slika 19. Stopnja izraţanja gena becn1 pri različnih časih inkubacije.. ........................... 67

Slika 20. Učinki TcdB in zaviralcev avtofagije na celično viabilnost.. ........................... 68

Slika 21. Učinki TcdB in siRNA na celično viabilnost. ................................................... 70

Slika 22. TcdB in rec-TcdB3 povzročita reorganizacijo aktinskih niti.. .......................... 72

Slika 23. Vpliv TcdB in rec- TcdB3 na organizacijo ZO-1.. ............................................ 74

Slika 24. Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na TEER.. ................................................................ 75

Slika 25. TcdB in rekombinantna vezavna domena TcdB bakterije C. difficile sproţita

izločanje IL-8.. .................................................................................................................. 76

Slika 26. Netoksinogeni sev bakterije C. difficile C23 (levo) in toksigeni sev AT11 .. ... 78

Slika 27. Izbrani pogoji, s katerimi smo ugotavljali hemolitično aktivnost supernatantov

izbranih sevov bakterije C. difficile.. ................................................................................ 80


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. VII

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1. Toksini in encimi, ki jih izločajo citolitične bakterije in njihovi

patogenetični učinki. ......................................................................................................... 10

Preglednica 2. Sestava reakcijske mešanice za RT-PCR. ............................................... 36

Preglednica 3. Uporabljeni začetni oligonukleotidi za RT-PCR. .................................... 37

Preglednica 4. Sestava gojišča za ugotavljanje hemolitične aktivnosti bakterije

Clostridium difficile. ......................................................................................................... 41

Preglednica 5. Različni pogoji za hemolitično aktivnost supernatanta kulture. ............. 43

Preglednica 6. Rezultati zaznavanja hemolize sevov bakterije Clostridium difficile na

gojiščih, ki se med seboj razlikujejo po sestavi in občutljivosti za hemolizo. .................. 78

Preglednica 7. Različni pogoji za hemolitično aktivnost supernatanta kulture. ............. 79


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. VIII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

A450 absorbanca (negativni logaritem prepustnosti) pri valovni dolţini 450

nm

APS amonijev persulfat

AO akridin oranţno (ang. »Acridin Orange«)

AV aneksin V

Bak beljakovina pospeševalka apoptoze (ang. »Bcl-2 homologus

antagonist«)

Bax beljakovina zaviralka apoptoze (ang. »Bcl-2 associated protein x«)

Bcl-2 beljakovina pospeševalka apoptoze (ang. »B-cell lymphoma/leukemia

2«)

BCA reagent cicinhoninsko-kislinski reagent

BHI gojišče BHI (ang. »Brain Heart Infusion«)

bp bazni par

BSA goveji serumski albumin (ang. »Bovine Serum Albumin«)

cDNA komplementarna deoksiribonukleinska kislina (ang. »complementary

DNA«)

C. difficile Clostridium difficile

C. elegans Caenorhabditis elegans

CDC od holesterola odvisni citolizin (ang. »cholesterol dependent

cytolysin«)

CDT binarni toksin C. difficile

COH krvni agar (ang. »Columbia agar«)

Da Dalton (enota za molekulsko maso, ki ustreza 1/12 mase ogljikovega

atoma 12

C)

dH2O deionizirana voda

DHR 123 dihidrorodamin 123

D-MEM gojišče za celice (ang. »Dulbecco's Modified Eagle Medium«)

DNA deoksiribonukleinska kislina

DTT ditiotreitol

EDTA etilendiaminotetraocetna kislina


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. IX

EU enota za encimsko aktivnost

FBS serum govejega fetusa (ang. »Fetal Bovine Serum«)

g gram

GST glutation transferaza (ang. »glutathione S-transferase«)

HBSS (ang. »Hank's Balanced Salt Solution«)

IL-8 interlevkin 8

IPTG izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid

KA krvni agar

kbp tisoč baznih parov

l liter

JC-1 5,5',6,6'-tetrakloro-1,1,3,3'-tetraetilbenzimidazolilkarbocijanin iodid

LB-medij Luria-Bertanijev medij

LC3 zaznamovalec avtofagije (ang. »microtubule-associated protein1 light

chain 3»)

LCT veliki klostridijski toksini (ang. »Large Clostridial Toxins«)

LLO listeriolizin O

M molarnost

mg miligram

µg mikrogram

µl mikroliter

MEM NEA (ang. »Minimum Essential Medium with Non-Essential Amino Acids«)

min minuta

ml mililiter

mRNA informacijska RNA (ang. » messenger RNA«)

MMP mitohondrijski membranski potencial (ang. »Mitochondrail Membrane

Potentia«l)

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil tetrazolium bromid (ang. »(3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide«)

NAC N-acetil-L cistein (ang. »N-acetyl-L-cysteine«)

NaDS natrijev dodecil sulfat (ang. »sodium dodecyl sulfate«)

NGM gojišče za C.elegans (ang. »Nematode Growth Medium»)


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. X

obr/min število obratov v eni minuti

OCD okuţba z bakterijo Clostridium difficile

OD620 optična gostota (ang. "optical density") pri valovni dolţini 620 nm

PaLoc patogenski lokus (ang. "Pathogenicity Locus")

PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza

PARP tarčna beljakovina kaspaze 3 (ang. "poly(ADP-ribose) polymerase")

PBS fosfatni pufer s soljo (ang. "Phoshate-buffered saline")

PCR reakcija veriţnega pomnoţevanja s polimerazo (ang. "Polymerase

Chain Reaction")

pH negativni logaritem koncentracije vodikovih ionov

PFO perfringolizin O

PFT toksin, ki tvori pore (ang. "pore-forming toxin")

PI propidijev jodid (ang. "Propidium Iodide")

PMSF fenil-metil-sulfonil-fluorid (ang. "phenylmethylsulfonyl fluoride")

PVDF poliviniliden difluorid

rec-TcdB3 rekombinantna vezavna domena toksina B

Rho 123 rodamin 123

RIPA lizni pufer (ang. »RIPA Lysis Buffer»)

ROS reaktivne kisikove spojine (ang. »Reactive Oxygen Species«)

RNAza ribonukleaza

RPMI gojišče za celice (ang. »Roswell Park Memorial Institute«)

RT-PCR reakcija veriţnega pomnoţevanja s polimerazo v realnem času (ang.

»Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction»)

RTX (ang. »repeats found in each toxin«)

s sekunda

SE standardna napaka

SLO streptolizin O

TEMED N,N,N',N'-tetrametiletilen diamin

TEER transepitelijska električna upornost (ang. »Transepithelial Electrical

Resistance«)


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. XI

TcdA toksin A C. difficile

TcdB toksin B C. difficile

Tris 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol

Z-VAD-FMK benziloksikarbonil-val-ala-asp-fluorometilketon

(ang.«benzyloxycarbonyl-val-ala-asp-fluoromethylketone«)

ZO-1 protein tesnih stikov (ang. «Tight Junction-associated Polypeptide«)


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. XII

IZVLEČEK

Clostridium difficile proizvaja tri toksine. Toksin A (TcdA, enterotoksin in citotoksin) in

toksin B (TcdB, močen citotoksin) sta glavna dejavnika virulence, ki povzročata

simptome driske in kolitisa. Nekateri sevi pa tvorijo še binarni toksin CDT. Prav tako bi

določeni sevi lahko proizvajali tudi toksine, ki jih do sedaj pri tej bakteriji še ne poznamo.

Toksin A in toksin B sta enoveriţna proteina, sestavljena iz štirih funkcionalnih domen:

encimske domene na N-terminalnem delu, cisteinske proteazne domene, centralne

hidrofobne domene in vezavne domene na C-terminalnem delu proteina.

Rekombinantni protein N-terminalne encimske domene toksina B in del rekombinantne

C-terminalne vezavne domene toksina A imata lastnosti enake holotoksinu (celična smrt,

imunski odgovor). Podobno delovanje za C-terminalno vezavno domeno toksina B do

sedaj še ni bilo opisano.

V raziskavo smo vključili seve bakterije C. difficile s poznanimi in atipičnimi toksičnimi

učinki na celice. Uporabili smo TcdB referenčnega seva VPI 10463 in variantnega seva

8864 in njuni rekombinantni vezavni domeni rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864. Za in vitro

študije interakcij med črevesnimi epitelnimi celicami in bakterijskimi toksini smo

uporabili celični liniji epitelnih celic črevesja HT-29 in T84. Za proučevanje virulence

sevov bakterije C. difficile pa smo izbrali ţivalski nevretenčarski model Caenorhabditis

elegans.

Rekombinantni vezavni domeni toksina B tako kot holotoksina poškodujeta epitelij,

povzročita razpad tesnih stikov ter nekrozo oziroma apoptozo. Z vezavo na črevesne

epitelijske celice vzpodbudita celice imunskega sistema in sproţita izločanje interlevkina

8. Holotoksin B sproţi še proces avtofagije v črevesnih epitelijskih celicah.

Nekateri sevi bakterije C. difficile so hemolitični. Poznavanje mehanizmov njihovega

delovanja je tako bistvenega pomena za razumevanje bolezenskih znakov, ki jih

povzročajo.


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. XIII

Ţivalski nevretenčarski model C. elegans se je izkazal kot neprimeren ţivalski model za

preučevanje virulence, vendar je njegova uporaba šele na začetku.

Prvič smo opisali toksičnost C-terminalne domene TcdB, ki je neodvisna od modifikacije

majhnih GTPaz in zelo verjetno predstavlja pomemben del pri okuţbi z bakterijo C.

difficile. Prav tako je poznavanje mehanizma delovanja toksina B pomembno za

razumevanje njegove vloge pri celični smrti. Ker C. difficile pripada rodu z veliko in zelo

razširjeno skupino toksinov, je velika verjetnost, da sevi C. difficile proizvajajo tudi

toksine, ki celice lizirajo (hemolizini).

S poznavanjem mehanizma delovanja toksinov lahko razloţimo nekatere osnovne, pa tudi

na prvi pogled nejasne fiziološke procese.

Ključne besede: Clostridium difficile, vezavna domena, toksin B, citotoksičnost,

patogeneza, Caenorhabditis elegans


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. XIV

ABSTRACT

Clostridium difficile produces three toxins. Toxin A (TcdA, enterotoxin and cytotoxin)

and toxin B (TcdB, cytotoxin) are recognized as the main virulence factors responsible

for diarrhea and colitis. Some strains produce also binary toxin CDT. And so it is possible

that some strains produce, reports so far, unknown toxins.

Toxin A and toxin B are single chain proteins with four functional domains: N-terminal

catalytic domain, cysteine protease domain, central hydrophobic domain and C-terminal

binding domain.

Recombinant N-terminal enzymatic domain of toxin B and a part of recombinant C-

terminal repetitive domain of toxin A had comparable effects as holotoxins (cell death,

immune response). It is not known whether C-terminal repetitive domain of toxin B has

any significant effect.

In our study we included strains from bacteria C. difficile with known and atypical toxic

effect on cells. We used TcdB from reference strain VPI 10463 and variant strain 8864

and their recombinant repetitive domain rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864. Intestinal

epithelial cell lines HT-29 and T84 were used for in vitro study to elucidate the

interaction between intestinal cell lines and bacterial toxins. Caenorhabditis elegans has

been used as a host model for the study of Clostridium difficile virulence and

pathogenesis.

Both recombinant receptor-binding domains as well as holotoxins induced intestinal

epithelial cell damage that ultimately lead to cell death by necrosis or apoptosis. They

stimulated immune cells to produce interleukin IL-8 after binding on intestinal epithelial

cells. Holotoxin B also induced autophagosome formation.

Some strains from bacteria C. difficile have hemolytic activity and by studying

mechanism of their activity it will be possible to understand clinical signs of disease.


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. XV

C. elegans has been showed as inappropriate animal model for studying virulence of C.

difficile, but also the study including C.elegans as an animal model, is at the beginning.

This is the first description of glycosyltransferase independent toxicity of TcdB and these

C-terminal mediated effects may contribute in the pathophysiology of Clostridium

difficile infection. Toxin B additional effect is also important in the role of cell death.

Although many clostridial species produce toxins with hemolytic activity, C. difficile is

so far unique among the clostridia for hemolytic activity.

Such information could improve better understanding of essential and undefined

physiological process.

Key words: Clostridium difficile, repetitive domain, toxin B, cytotoxicity, pathogenesis,

Caenorhabditis elegans


Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, 2010. 1

1 UVOD

Bakterija Clostridium difficile je najpogostejši povzročitelj črevesnih okuţb v bolnišnicah.

Bolezenska znamenja so različna, od blagih drisk do hudega pseudomembranoznega

kolitisa, običajno pa se pojavljajo kot zaplet po zdravljenju z antibiotiki.

Bolezen povzročajo le toksigeni sevi, ki delajo toksin A (TcdA), toksin B (TcdB) in/ali

binarni toksin CDT. Seve, ki ne delajo nobenega od teh treh toksinov, označimo kot

netoksinogene in takšni sevi običajno ne povzročajo bolezni (Rupnik, 2001).

Toksina TcdA in TcdB sta glavna dejavnika virulence. Kljub temu njuna vloga v

patogenezi še ni popolnoma utemeljena. Odraz toksičnega delovanja so izločanje

tekočine v lumen črevesja, edem črevesne sluznice, odmiranje celic črevesnega epitelija

ter vnetni odziv z infiltracijo nevtrofilcev in aktivacijo makrofagov. Gotovo pa se sevi C.

difficile med seboj razlikujejo tudi glede na prisotost alternativnih dejavnikov virulence,

ki pa so le slabo poznani. Večina novejših študij opisuje adhezine in druge molekule v

celični steni (Pĕchinĕ in sod., 2005). Prav tako bi določeni sevi lahko delali tudi toksine,

ki jih do sedaj pri tej vrsti še ne poznamo.

S poznavanjem mehanizma delovanja toksinov smo ţeleli razloţiti nekatere osnovne, pa

tudi na prvi pogled nejasne fiziološke procese.

1.1 PRIČAKOVANI IZVIRNI ZNANSTVENI PRISPEVKI

Razumevanje alternativnega mehanizma delovanja toksina TcdB na celice preko

vezavne domene.

Razumevanje vloge vezavne domene toksina TcdB v patogenezi.

Karakterizacija hemolitične aktivnosti, ki do sedaj pri C. difficile še ni bila opisana in

je lahko vezana na delovanje ţe znanih toksinov ali novih, še neopisanih toksinov.

Razvoj novega nevretenčarskega ţivalskega modela za študij virulence C. difficile.

Z uporabljenimi variantnimi sevi, ki so bili ţe dober model za iskanje novih dejavnikov

virulence, z opazovanjem citopatskega učinka na gojenih sesalčjih celicah in



toksičnega učinka na ţivalskem modelu nevretenčarja C. elegans, bomo opredelili

dodatne mehanizme virulence, ki so posledica toksičnih učinkov pri bakteriji C.

difficile, s končnim ciljem boljšega poznavanje patogeneze ter razvoja testnih

sistemov za določanje virulence bakterije C. difficile.



2 PREGLED OBJAV

2.1 BAKTERIJA Clostridium difficile IN BOLEZNI, KI JIH POVZROČA

Bakterija Clostridium difficile je sporogena, pogojno patogena bakterija, ki je normalno

del črevesne mikrobne flore. Razvoj bolezni je odvisen od dejavnikov gostitelja ter od

virulenčnih dejavnikov bakterije, med katerimi sta najpomembnejša toksin A in toksin B,

ki onemogočata normalno absorptivnost črevesa.

Kadar se razmerje v normalni črevesni flori poruši zaradi jemanja antibiotikov,

sistemskega zdravljenja ali operativnih posegov, se poveča tveganje za okuţbo z

bakterijo C. difficile (OCD) (Rupnik in Kotnik Kevorkijan, 2009). Porušeno ravnovesje v

normalni črevesni flori in razrast bakterije lahko mineta neopazno ali pa povzročita

različno stopnjo teţav. Klinična slika se spreminja od asimptomatske kolonizacije do

blage driske ali pa do hude bolezni s pseudomembranoznim kolitisom (Bartlett in

Gerding, 2008). Če bolezen ni pravočasno zdravljena, lahko pride do dilatacije debelega

črevesa ali celo perforacije črevesa ter posledično do smrti bolnika (Rupnik in sod., 2009).

Nedavni endemični izbruhi okuţbe s hipervirulentnim sevom (C. difficile BI/NAP1/027)

so povzročili tudi do 16 % umrljivost (Pépin in sod., 2005 in McDonald in sod., 2006).

OCD je pogostejša pri starejših osebah in hospitaliziranih bolnikih, ki se zdravijo z

antibiotiki. Kljub temu, da so bolnišnične okuţbe s C. difficile še vedno velik zdravstveni

problem, pa narašča število opisanih primerov pri mlajših ljudeh, ljudeh brez predhodne

hospitalizacije in zdravljenja z antibiotiki (Chernak in sod., 2005), pri nosečnicah

(Rouphael, 2008) ter otrocih (Kim, 2008).

Spore so stalni vir okuţbe. So vsepovsod, zato C. difficile izolirajo tudi iz okolja,

ţivalskih iztrebkov, hrane (Rupnik, 2007) in so lahko vir okuţbe tako hospitaliziranih kot

nehospitaliziranih bolnikov.



2.2 BAKTERIJSKI TOKSINI KOT DEJAVNIKI VIRULENCE

Bakterijski proteinski toksini so pomembni dejavniki virulence, ki poškodujejo celice v

gostiteljevem telesu ali ovirajo njihovo delovanje. Nekateri celice lizirajo, drugi

preprečujejo celično rast in tretji pretirano okrepijo običajna fiziološka dogajanja. Z

zaviranjem ali pa s pospeševanjem delovanja lahko ubijajo, na da bi poškodovali eno

samo celico napadenega organizma. Tetanusni toksin na primer ohromi telo, vendar ne

poškoduje prizadetih nevronov (Patrick in sod., 1995).

Zapisi za bakterijske toksine so pogosto v plazmidih in bakteriofagih. Zaradi lokalizacije

genov v prenosljivih genskih elementih se lahko sposobnost izdelovanja toksinov s

konjugacijo ali transudkcijo razširi na netoksigene bakterije iste ali sorodnih vrst (Dale,

1994).

Bakterijski toksini se med seboj razlikujejo glede na tkivno specifičnost: nekateri

prizadenejo samo določene vrste celic, drugi pa lahko poškodujejo različne celice in tkiva.

Celice nekaterih bakterijskih vrst izločajo zgolj en toksin, dostikrat pa lahko sintetizirajo

številne toksine hkrati.

Toksine delimo po: mehanizmu delovanja (i) toksini, ki tvorijo pore in (ii) toksini, ki

delujejo kot encimi, mestu delovanja (i) toksini z delovanjem na celično membrano, (ii)

toksini z znotrajceličnim delovanjem (toksini A-B) in (iii) toksini, ki se veţejo na

receptorje ter učinkih na organizem (i) nevrotoksini, (ii) enterotoksini, (iii) toksini, ki

vplivajo na strjevanje krvi, delujejo hemoragično in lokalno, (iv) toksini, ki delujejo na

citoskelet, (v) superantigeni.

S kratkim pregledom predstavljenih skupin je zajet le del obseţne tematike toksinov. V

nadaljevanju bomo natančneje opisali le nekatere skupine bakterijskih toksinov:

citolitične toksine in toksine rodu Clostridium in vrste C. difficile.



2.2.1 Citolitični (hemolitični) bakterijski toksini

Bakterijski citolitični proteini niso enotna skupina sorodnih substanc, ampak se

razlikujejo tako po strukturi kot po izvoru in mehanizmu delovanja. Glede na mehanizem

delovanja jih delimo na:

2.3 Toksini, ki tvorijo pore (PFT)

PFT so zelo pomembna skupina naravnih toksinov. Spontano se vstavljajo v membrane in

tvorijo eksogene transmembranske pore, ki omogoči prehajanje ionov in majhnih molekul.

Posledica je propad celice, največkrat zaradi koloidno-osmotskega šoka (Popoff in Geny,

2006; Alouf , 2006; Pizza in sod., 2005).

Sintetizirani so kot topni monomeri, ki se naknadno vstavljajo v membrane.

Transformacija PFT iz topne oblike v, za celico smrtonosno, membransko vezano obliko,

je podvrţena velikim konformacijskim spremembam ter agregaciji in je večstopenjski

proces. Nekateri toksini potrebujejo za vezavo na membrano specifične receptorje. Ti so

največkrat lipidi (npr. holesterol pri holesterol odvisnih citolizinih) in proteini. Receptorji

omogočajo koncentriranje toksinov na površini membrane ter njihovo hitrejšo

oligomerizacijo in insercijo.

Glede na strukturne elemente, ki tvorijo stene pore, razdelimo PFT v dve skupini:

(1) α-PFT perforirajo membrano z α-vijačnicami (Anderluh in Lakey, 2008). Pri α-PFT

se izpostavijo prej zakrite hidrofobne α-vijačnice, ki se nato vstavijo v membrane.

Procesa oligomerizacije in insercije lahko potekata sočasno (Pizza in sod., 2005).

(2) β-PFT so toksini, ki v membrano vstavljajo amfipatične β-lasnice in z njihovim

prečnim povezovanjem tvorijo stabilni transmembranski β-sodček (Anderluh in Lakey,

2008). Za β-PFT je značilno, da se hidrofobni deli, potrebni za vključitev v membrano,

oblikujejo šele po nastanku oligomerov. Pri tem vsak monomer prispeva majhen deleţ

amfipatične stukture, kar v končni fazi omogoči nastanek dovolj velikega hidrofobnega

področja za vključitev v membrano (Pizza in sod., 2005).

Glede na raznolikost med zaporedji in strukturami je jasno, da se tudi mehanizmi tvorbe

por razlikujejo. Kljub temu obstajajo nekatere podobnosti (Alouf in sod., 2006).



Toksini zavzemajo takšno obliko, da so na površini v glavnem le hidrofilni

aminokislinski ostanki, hidrofobni pa so skriti v notranjosti proteina oz. v stikih med

monomeri. Pri nekaterih bakterijskih toksinih mora pred vezavo priti do določenih

modifikacij, ki aktivirajo toksin. Nekateri toksini se izločijo v obliki preprotoksinov (npr.

termolabilni hemolizin HlyA bakterije Vibrio cholerae) (Yamamoto in sod., 1990) ali

protoksinov (npr. Cry δ-endotoksin bakterije Bacillus thuringensis) (Li in sod., 1996).

Učinki toksinov, ki tvorijo pore so različni in navadno odvisni od koncentracije toksina in

velikosti pore. Večino učinkov pri nizkih koncentracijah toksina lahko pripišemo vdoru

Ca2+

v celico, ki kot sekundarni prenašalec, lahko sproţi številne procese (npr. sproščanje

vnetnih mediatorjev) (Alouf in sod., 2006). Če so pore prevelike, lahko pride do izhajanja

večjih makromolekul. Nastanek takšnih por povzročijo npr. od holesterola odvisni

citolizini (Tweten in sod., 2001).

2.3.1.1.1 Od holesterola odvisni citolizini (CDC)

Predstavniki skupine bakterij, katerih glavni virulenčni dejavniki so od holesterola

odvisni citolizini, so eni najhujših patogenov, nevarni tudi človeku. Tvorijo eksogene

pore v membranah gostitelja (Gendeh in sod., 1997). Izločajo se kot vodotopni proteini.

Sposobni so preiti v membransko vezano obliko, ki je nato sestavni del pore. Pri tem

spremenijo konformacijo brez pomoči beljakovine, ki je potrebna za pravilno gubanje

polipeptidne verige (Lesieur in sod., 1997). Nekateri toksini potrebujejo za vezavo na

membrano specifične receptorje.

Zato potekajo danes na teh toksičnih proteinih številne raziskave. Obstaja več tehnik za

študije njihovega delovanja. Največkrat uporabljeni tehniki sta merjenje hemolitične

aktivnosti pri citolizinih (Geoffroy in sod., 1987; Dubail in sod., 2001; Giammarini in

sod., 2003) in elektronska mikroskopija (Parker in sod., 1998b; Tweten, 2001). Pogosto

uporabljeni tehniki sta tudi tehniki pretočne citometrije in masne spektroskopije

(Polekhina in sod., 2005).



Znanih je nad 20 od holesterola odvisnih citolizinov (Shatursky in sod., 1999; Tweten in

sod., 2001). Proizvajajo jih predstavniki petih rodov po Gramu pozitivnih bakterij:

Arcanobacterium, Bacillus, Clostridium, Listeria in Streptococcus (Pizza in sod., 2005;

Alouf in sod., 2006). Predstavljajo veliko skupino β-PFT. Najbolje so raziskani

perfringolizin O (Clostridium perfringens), streptolizin O (Streptococcus pyogenes),

listeriolizin O (Listeria monocytogenes) in pnevmolizin (Streptococcus pneumoniae)

(preglednica 1).

Od holesterola odvisni citolizini se izločajo kot vodotopni, enoveriţni proteini. Vsi so si

podobni po primarni strukturi in imajo ohranjeno 11 aminokislin dolgo zaporedje na C-

terminalnem delu molekule (Morgan in sod., 1996; Alouf in sod., 2006). Iz podobnosti

primarnih zaporedij lahko sklepamo na podobnost v 3D strukturi in aktivnosti.

2.3.1.1.2 Toksini, ki tvorijo majhne pore (ang. "small PFT")

Premer takšne pore je 1-1,5 nm in omogoči prehajanje ionov in majhnih molekul z

molekulsko maso pod 2 kDa (Pizza in sod., 2005; Tweten in Melton, 2006).

Glavni predstavniki so α-hemolizin (αHL), levkocidin in γ-hemolizin (γHL) bakterije

Staphylococcus aureus (Menestrina in sod., 1998; Pizza in sod., 2005), hemolizin II

bakterije Bacillus cereus, β-toksin bakterije Clostridium perfringens (Pizza in sod., 2005),

aerolizin bakterije Aeromonas hidrophila in α-toksin bakterije Clostridium septicum

(Tweten in Melton, 2006) (preglednica 1).

2.3.1.1.3 RTX toksini ("repeats found in each toxin")

RTX toksini so enoveriţni, veliki, od Ca2+

odvisni hemolizini z molekulsko maso med

100 in 120 kDa. Karakteristična značilnost RTX toksinov so ponovitve 9 aminokislin

dolgega zaporedja bogatega z glicinom in aspartatom (Pizza in sod., 2005).

Predstavniki so (1) hemolizin bakterije E.coli (Pizza in sod., 2005), (2) hemolizini

bakterije rodu Enterobacteriaceae in Pasteurellaceace, (3) hemolizin bakterije



Actinobacillus pleuropneumoniae (Pizza in sod., 2005), (4) levkotoksin bakterije

Actinobacillus actinomycetemcomitans (Kraig in sod., 1990; Piaza in sod., 2005), (5)

adenilat ciklaza hemolizin bakterije Bordetella pertussis (Pizza in sod., 2005)

(preglednica 1).

2.3.1.2 Citolitični encimi

Citolitični encimi se med seboj razlikujejo po strukturi in mehanizmu delovanja. Vsem pa

je skupno to, da razgradijo membranske lipide in poškodujejo celične membrane, porušijo

nadzor nad prehanjem snovi in povzročijo smrt celice. Njihov mehanizem delovanja je

različen prav zaradi različnih razmerij in porazdelitve gradbenih elementov membran pri

različnih celicah, na katere vplivajo. Le redko so direktno litični, ponavadi le povečajo

občutljivost membrane za lizo. Pomembni so zaradi sinergističnega delovanja s snovmi,

ki so toksične za membrane. Najpogostejši predstavniki so fosfolipaze, ki hidrolizirajo

fosfolipide v membrani in jo poškodujejo.

Najpomembnejši citolizin, ki ga izdeluje in izloča bakterija Clostridium perfringens, je

toksin alfa. Deluje na različne fosfolipide, predvsem na lecitin, zato ga imenujemo tudi

lecitinaza oziroma fosfolipaza C. V rodu Clostridium spp. izločata fosfolipazo C

Clostridium sordellii in Clostridium bifermentas (Karasawa in sod., 2003). Listeria

monocytogenes izloča nespecifično fosfolipazo C in fosfatidilinozitol-specifično

fosfolipazo C. Encima sodelujeta pri razgradnji membranskih lipidov in bakteriji

omogočata pobeg v citosol. V citosolu inducira polimerizacijo aktina, kar povzroči

izvihavanje celične membrane evkariontske celice. Tako ovita z membrano gostitelja se

vrine v sosednjo celico in jo na ta način okuţi (Goldfine in sod., 1995). Staphylococcus

aureus vsebuje fosfolipazo C oziroma sfingomielinazo C, ki hidrolizira sfingomielin v

citoplazemski membrani eritrocitov, zato ga imenujemo tudi hemolizin β (toksin β)

(Gouaux in sod., 1997; Murray in sod., 1999). Streptolizin S, ki ga izdeluje bakterija

Streptococcus pyogenes, poškoduje fosfolipide v citoplazemski membrani eritrocitov in

levkocitov (Nizet, 2002). Bakterija Corynebacterium pseudotuberculosis pa vsebuje



fosfolipazo D, ki deluje tako na sfingomielin kot na lizolecitin (Murray in sod., 1999)

(preglednica 1).



Preglednica 1. Toksini in encimi, ki jih izločajo citolitične bakterije in njihovi patogenetični učinki.

Table 1. Toxins and enzymes produced by cytolitic bacteria and their pathogenetic effects.

MEHANIZEM

DELOVANJA

TOKSIN BAKTERIJA PATOGENETIČNI

UČINKI

PFT perfringolizin O C. perfringens plinska gangrena

listeriolizin L. monocytogenes apoptoza

pnevmolizin S. peumoniae ovira kemotakso,

fagocitozo in tvorbo

protiteles,

apoptoza

streptolizin O S. pyogenes razpad eritrocitov,

citotoksično učinkuje na

nevtrofilce, trombocite in

miokard, celična smrt

majhni PFT Α-hemolizin S. aureus apoptoza limfocitov T

Γ-hemolizin S. aureus citotoksično učinkuje na

levkocite

hemolizin II B. cereus nekrotični enteritis

Β-toksin C. perfringens neurološki učinki

aerolizin A. hidrophila celična permeabilnost,

liza

Α-toksin C. septicum šok

RTX toksini

hemolizin E.coli liza eritrocitov,

levkocitov, endotelijskih

celic, humanih limfocitov

T

hemolizin Enterobacteriaceae in

Pasteurellaceace

celična permeabilnost,

liza

hemolizin A. pleuropneumoniae celična permeabilnost,

liza

levkotoksin A. actinomycetemcomitans apoptoza

bifunkcionalni adenilat

ciklaza hemolizin

B. pertussis celična permeabilnost,

liza

citolitični encimi

lecitinaza (fosfolipaza C) C. perfringens razgradi membranske

lipide in poškodujejo

celične membrane

fosfolipaza C C. sordellii in C. bifermentas razgradijo membranske

lipide in poškodujejo

celične membrane

fosfolipaza C in

fosfatidilinozitol-

specifično fosfolipazaC

L. monocytogenes razgradijo membranske

lipide in bakteriji

omogočijo vstop v citosol

fosfolipaza C oziroma

sfingomielinaza C

S. aureus razgradijo membranske

lipide (sfingomielin)

streptolizin S S. pyogenes poškoduje fosfolipide v

citoplazemski membrani

eritrocitov in levkocitov

fosfolipaza D C. pseudotuberculosis razgradi membranske

lipide (sfingomielin,

lizolecitin)

PFT: toksini, ki tvorijo pore

RTX toksini (ang. "repeats found in each toxin"): značilne so ponovitve 9 aminokislin dolgega zaporedja bogatega z

glicinom in aspartatom



2.3.1.3 Toksini z neznanim mehanizmom delovanja

V to skupino uvrščamo toksine, katerih delovanje kljub obseţnim raziskavam ni

popolnoma pojasnjeno kot npr. citolitični toksini bakterij iz rodu Vibrio, ki imajo

sposobnost povzročiti propad celic ter depolarizacijo ţivčnih in mišičnih celic (Harvey,

1990).

2.3.2 Toksini bakterij iz rodu Clostridium

Klostridiji so heterogena skupina mikrobov, ki so večinoma prisotni v zemlji, v

prebavnem traktu ţivali in ljudi. Medicinsko pomembni patogeni klostridiji izdelujejo

encime in toksine, ki povzročajo hude bolezenske znake in invazivne histotoksične

okuţbe. Toksigeni sevi C. tetani izločajo tetanusni toksin, ki deluje nevrotoksično.

Toksin je usmerjen na oddaljene cilje v osrednjem ţivčnem sistemu. Veţe se na ţivčne

celice, ki omogočajo sproščanje mišic. Nevrotoksini vrste C. botulinum so antigensko

različni toksini, označeni kot tip A, B, C, D, E, F in G. Deluje na periferne ţivčne končiče.

Iz črevesja se po krvi prenese do nevromuskularnih povezav. Pri vrsti C. perfringens

ločimo 5 serotipov (A, B, C, D in E), ki izločajo 12 vrst toksinov. θ-toksin je povzročitelj

popolne hemolize eritrocitov in nekroze mišic. Skupaj z α-toksinom oslabi migracijo

nevtrofilcev na mestu infekcije in povzroči razpad endotelijskih celic. Posledica tega so

povečana permeabilnost membrane endotelijskih celic, edem, ishemija in ustvarjanje

anaerobih pogojev v mišičnem tkivu, ki vzpodbudi hitrejše razmnoţevanje C. perfringens

(Boquet in sod., 1998; Petit in sod., 1999). Toksični C. novyi tipa A toksin α ima kardio-,

nevro-, histo- in hepatotoksične lastnosti, toksin Tcnα C. septicum deluje nekrotizirajoče

in hemolitično. C. hystoliticum, ki tvori več toksinov, povzroči odmiranje tkiva in plinsko

gangreno (Borriello in sod., 2005). Clostridium sordellii sintetizira dva toksina, letalni

toksin TcsL in hemoragični toksin TcsH (Cohen in sod., 2007). C. bifermentas proizvaja

dva hemolizinu podobna proteina (Barley in sod., 1998).

Pri C. difficile so dosedaj opisani trije toksini. Toksina A in B vrste C. difficile sta

sorodna toksinom TcsL in TcsH vrste C. sordellii ter Tcnα vrste C. novyi (Bette in sod.,

1991; Hofmann in sod., 1995). Homologen z opisanimi toksini je na novo odkrit toksin



TcpL vrste C. perfringens tip C (Amimoto in sod., 2007), a z manjkajočo ponavljajočo

vezavno domeno. Tretji toksin CDT spada v skupino klostridijskih binarnih toksinov

skupaj s toksinom C2 C. botulinom tipa C in D, jota toksinom C. perfringens tipa E in

jota toksinu podobnim vrste C. perfringens (Boquet in sod., 1998; Considine in Simpson,

1991).

Ker C. difficile pripada rodu z veliko in zelo razširjeno skupino toksinov, je velika

verjetnost, da sevi vrste C. difficile delajo še druge toksine, med njimi tudi takšne, ki

celice lizirajo (hemolizini).

2.3.3 Toksini bakterije Clostridium difficile

Kot ţe omenjeno C. difficile proizvaja tri toksine, in sicer toksin A (enterotoksin), toksin

B (citotoksin) in/ali CDT (binarni toksin).

Toksina A (TcdA) in B (TcdB) sta glavna dejavnika virulence, kar kaţejo tako

epidemiološke raziskave kot tudi poskusi na ţivalih. Odraz toksičnega delovanja so

izločanje tekočine v lumen črevesja, edem črevesne sluznice, odmiranje celic črevesnega

epitelija ter vnetni odziv z infiltracijo nevtrofilcev in aktivacijo makrofagov. Vendar seve,

ki delajo toksin A in toksin B lahko izoliramo iz bolnikov s celotnim spektrom

bolezenskih znakov, od blagih do izjemno hudih (George in sod., 1978; Viscidi in sod.,

1981). To po eni strani lahko razloţimo z dejavniki gostitelja (npr. prisotnost zaščitnih

protiteles), gotovo pa se sevi C. difficile med seboj razlikujejo tudi glede na prisotost

alternativnih dejavnikov virulence. Pĕchinĕ in sod. (2005) opisujejo adhezine in druge

molekule v celični steni.

Po drugi strani lahko imata ţe znana toksina A in B raznolike in nove načine delovanja na

gostiteljsko celico, kar še posebej velja za t.i. variantne toksine. Najbolj znani variantni

sevi, ki delajo toksine s spremenjenimi lastnostmi so sevi, ki delajo samo toksin B.

Najprej so jih opisali pri asimptomatskih dojenčkih in so veljali za nevirulentne (Depitre

in sod., 1993), kasneje pa so jih izolirali iz številnih bolnikov z OCD (Al-Barrak in sod.,



1999; Alfa in sod., 2000; Rupnik in sod., 2003, Lyras in sod., 2009). Vendar imajo lahko

tudi sevi, ki delajo oba toksina, spremenjene variantne toksine (Rupnik, 2008).

Sevi z binarnim toksinom CDT so bili v času, ko je bil ta toksin prvič opisan (Popoff in

sod., 1988) zelo redki (0,2 - 0,5 %), danes pa predstavljajo pribliţno 25 % vseh izoliranih

sevov C. difficile.

2.3.3.1 Zgradba TcdA, TcdB in CDT

Toksina A (TcdA) in B (TcdB) uvrščamo v skupino velikih klostridijskih toksinov (LCT)

z molekulsko maso med 250 in 308 kDa (von Eichel-Streiber in sod., 1996). Toksina sta

monomerna enoveriţna proteina s štirimi funkcionalnimi domenami: N-terminalno

katalitično domeno, ki glukozilira majhne GTPaze (Faust in sod., 1998; Hofmann in sod.,

1997) in predstavlja biološko aktivni del toksina, cisteinsko proteazno domeno, centralno

hidrofobno domeno, odgovorno za translokacijo in C-terminalno vezavno domeno, ki se

veţe na receptor (Frish et al., 2003; Reinert in sod., 2005). Vendar pa natančna narava

receptorjev dosedaj še ni znana.

Poznavanje kristalne strukture glukoziltransferazne domene toksina B (1-543 aminokislin,

Reinert in sod., 2005) in vezavne domene toksina A (toksinotip VI, 2582-2709

aminokislin, Ho in sod., 2005; Greco in sod., 2006) je prispevalo k razumevanju

strukture in delovanja toksinov v skupini velikih klostridijskih toksinov (LCT).

Toksina sta skupaj s tremi drugimi geni (tcdC, tcdR in tcdE) zapisana na 19,6 kb velikem

toksinskem lokusu PaLoc, ki ga najdemo samo pri toksinogenih sevih (Braun in sod.,

1996) (slika 1). PaLoc sestavljajo geni tcdA, tcdB, tcdC (negativni regulator prepisa tcdA

in tcdB) (Matamouros et al., 2007), tcdR (alternativni sigma faktor RNA polimeraze,

pozitivni regulator prepisa) (Dupuy, 2006) in tcdE (verjetno prenos toksinov iz celice)

(Tan in sod., 2001) (slika 1). Pri netoksinogenih sevih je na tem mestu zaporedje dolgo

115 bp (Braun in sod., 1996).



Tretji toksin CDT je sestavljen iz dveh proteinskih podenot in ga uvrščamo v skupino

klostridijskih binarnih toksinov (Barth in sod., 2004).

4,3 kb velik toksinski lokus CdtLoc nosi zapis za binarni toksin CDT in je sestavljen iz

genov za podenoti binarnega toksina cdtA in cdtB in regulatornega gena cdtR (Carter in

sod., 2007). Gen cdtA kodira encimsko podenoto (~50 kDa) in gen cdtB (~100 kDa)

vezavno podenoto (Perelle in sod., 1997) (slika 1).



TcdDpozitivni

regulator

TcdBcitotoksin

TcdEprenos toksinov

iz celice

TcdAenterotoksin

TcdCnegativni

regulator

encimska domena

receptorska-vezavna

domena

transmembranska

domena

CROPsW102 & DXD

substratna

specifičnost

encimska domena translokacijska in vezavna domena

Slika 1. Toksini bakterije Clostridium difficile. (a) Toksin A in toksin B sta zapisana na toksinskem lokusu,

ki ga sestavlja 5 genov. Sestavljeni so iz funkcionalnih domen in iz kombinacij manjših motivov. (b) Tretji

toksin, binarni toksin (CDT) je zapisan na toksinskem lokusu CdtLoc, ki ga sestavljajo 3 geni. Binarni

toksin sestavljata dve nepovezani proteinski podenoti, CdtB in CdtA. CdtB je vezavna komponenta in CdtA

je encimska komponenta (povzeto po Rupnik in sod., 2009).

Figure 1. Toxins produced by Clostridium dificile. (a) Two large toxins, toxin A (TcdA) and toxin B

(TcdB) are encoded on the pathogenicity locus (PaLoc), which comprises five genes. Several functional

domains and motifs have been identified. (b) A third toxin, the binary toxin (CDT) is encoded on a seperate

region of the chromosome (CdtLoc) and comprises three genes. The binary toxin is composed of two

unlinked proteins, CdtB and CdtA. CdtB has a binding function and CdtA is the enzymatic component

(Rupnik et al., 2009).

2.3.3.2 Molekularni mehanizem delovanja TcdA, TcdB in CDT

TcdA in TcdB sta monoglukoziltransferazi (Just in sod., 1995). Sproščata se iz

bakterijskih celic in se nato veţeta na tarčne celice gostitelja. Vezava TcdA na slabo

poznan receptor na mukozni strani črevesnega epitelija povzroči odprtje tesnih stikov

med celicami črevesnega epitelija. Skozi odprte tesne stike se TcdB pomakne na



bazolateralno stran epitelija, kjer se verjetno veţe na receptorje, ki leţijo na tej strani

črevesnega epitelija. Receptorska vezavna podenota (RBD) (slika 2) toksina reagira s

celičnim receptorjem gostiteljeve celice. Vezavi na receptor sledi endocitoza. Kisli pH

omogoči hidrofobni transmembranski domeni (TMD), da oblikuje pore v endosomalni

membrani (Giesemann in sod., 2006) in omogoči, da encimska podenota (CAT) tako

vstopi v citoplazmo. Prodor v celico pa aktivira proteolitično cepljenje. Cepitev

glukoziltransferazne domene je avtokatalitični proces, odvisen od gostiteljevega

citosolnega kofaktorja inozitolfosfata (InsP6) (Reineke in sod., 2007; Egerer in sod.,

2007).

Encimska podenota v citosolu tarčne celice prenaša glukozo iz UDP-glukoze na majhne

GTP vezavne proteine iz poddruţin Rho (slika 2) in Ras. Majhne GTPaze so v celici

odgovorne za kontrolo aktinskega citoskeleta, vpletene so tudi v kontrolo celične delitve,

oblikovanje stičišča na apikalni strani epitelijske celice in celične smrti.

Monoglukozilacija ohranjenega treonina (Thr-37) v efektorski regiji GTPaz onemogoči

interakcije le-teh z njihovimi efektorskimi molekulami (Ser/Thr kinaze, lipidne kinaze,

lipaze in ogrodni proteini) in prekine signalizacijo odvisno od majhnih GTPaz.

Najvidnejši učinek modifikacije GTPaz je depolimerizacija F-aktina (Jaffe in Hall, 2005),

porušenje citoskeleta in posledično zaokroţanje celic, sprememba ultrastrukture,

polarizacija jedra, izguba barierne funkcije (Voth in Ballard, 2005) ter apoptoza.

Porušenje citoskeleta je odvisno od modifikacije proteina RhoA (Just in sod., 1995;

Halabi-Cabezon in sod., 2008), motnje pri prepisovanju genov, blokada tvorbe

lamelipodij in gubanje membrane so posledica modifikacije proteina Rac1 ter blokada

tvorbe filopodij kot posledica modifikacije proteina Cdc42 (Halabi-Cabezon in sod.,

2008). Občutljivost celičnih linij je verjetno odvisna od gostote celičnih receptorjev za

posamezni toksin (Chaves-Olarte in sod., 2003).



Slika 2. Receptorska vezavna podenota (RBD) toksina reagira s, še nepoznanim, celičnim receptorjem

gostiteljske celice (1). Vezavi na receptor sledi endocitoza (2, 3). Kisli pH omogoči hidrofobni

transmembranski domeni (TMD), da oblikuje pore v endosomalni membrani (4) in omogoči, da encimska

domena (CAT) tako vstopi v ciljno celico (5). Cepitev encimske domene je avtokatalitični proces (6).

Encimska podenota v citosolu glukozilira proteine Rho (7) (povzeto po Genth in sod., 2008).

Figure 2. Schematic representation of target cell entry of the glucosylating toxins. The receptor binding

domain (RBD) binds to the (yet unknown) toxin receptor (1). The toxin-receptor complex is internalised (2)

with the toxin being in the lumen of the endosome (3). Acidification of the endosome induces refolding of

the toxin and insertion of the transmembrane (TMD) into the endosomal membrane (4). The catalytic

domain (CAT) translocates through a pore into the cytosol (5). The CAT is proteolitically cleaved off by

the cysteine protease domain (6). The refolded CAT glucosylates cellular Rho proteins (7) (Genth et al.,

2008).

Binarni toksin CDT je ADP-ribozil transferaza. Vezavna komponenta CDTb se po

proteolitski cepitvi propeptida veţe na še neidentificirani celični receptor, neznana

proteaza pa odcepi del komponente CDTb in s tem omogoči vezavo encimske podenote

CDTa ter vstop CDTa v celico (Gulke in sod., 2001). To vodi v depolimerizacijo

aktinskih mikrofilamentov po dveh mehanizmih (i) modificiran G-aktin se veţe na hitro

rastoči konec F-aktina in kot pokrovni protein prepreči nadaljno vezavo monomerov, (ii)



modificiran G-aktin ne doprinese k ravnoteţni koncentraciji G-aktina v celici, zato F-

aktin depolimerizira (Considine in Simpson, 1991). Za toksično delovanje sta potrebni

obe podenoti (Boquet in sod., 1998).

Vlogo binarnega toksina kot dodatnega virulenčnega dejavnika so raziskali Schwan in

sod. (2009). CDT in drugi binarni ADP-ribozil transferaze toksini, vključno s toksin C2

vrste Clostridium botulinum in binarnimi toksini Clostridium perfringens, povzročijo

prerazporeditev in preoblikovanje mikrotubulov na površini črevesnih epitelnih celic.

Ker je za C. spiriforme s podobnim binarnim toksinom znano, da povzroča črevesne

infekcije samo pri kuncih (Carman in sod, 1991) so Stare-Gerič in sod. (2007) seve A-B

-

CDT+

bakterije C. difficile testirali na modelu prevezane črevesne zanke kunca. Prisotna

tekočina v zankah je potrdila enterotoksično aktivnost in vlogo binarnega toksina CDT

kot dodatnega virulenčnega dejavnika.

2.3.3.3 Vloga toksinov TcdA in TcdB v patogenezi

Toksina A in B poškodujeta epitelij, ki postane bolj propusten (Riegler in sod., 1995; von

Eichel-Streiber in sod., 1996). V črevesu toksina povzročita poškodbe sluznice, povečano

sekrecijo v lumen črevesa, ki je tudi posledica delovanja toksina A na nevrone, ki

oţivčujejo črevo (Castagliuolo in sod., 2004) in vnetno reakcijo. Toksina zmanjšata

fagocitno aktivnost, povečata izločanje citokinov, delujeta kemotaktično na granulocite

(Guerrant, 1994, Bongaerts in Lyerly, 1994).

Oba toksina, TcdA in TcdB, z inaktivacijo Rho in Ras sorodnih GTPaz (RhoA, B, C,

Rac1 in Cdc42) (Aktories in Just, 1995; Just in sod., 1995; Aktories, 1997; Halabi-

Camezon in sod., 2008) vplivata na morfološke in patofiziološke spremembe na

kultiviranih celicah. Toksina imata tako citopatski učinek (celice se zaokroţijo zaradi

neučinkovitih proteinov Rho) kot tudi citotoksični učinek (celična smrt) (Huelsenbeck in

sod., 2007). GTPaze imajo ključno vlogo v apoptozi (Coniglio in sod., 2001; Coleman in

Olson, 2002; Huelsenbeck in sod., 2007) ali sodelujejo pri proapoptotičnem

(Huelsenbeck in sod., 2007) ali antiapoptotičnem dogodku kot odgovor na stres (Fritz in

Kaina, 2006). Oba toksina sproţita apoptozo v intestinalnih epitelijskih celicah



(Fiorentini in sod., 1998; Mahida in sod., 1998; Brito in sod., 2002; Liu in sod., 2003;

Carneiro in sod., 2006;), nevronih (Le in sod., 2005), endotelijskih celicah (Hippenstiel in

sod., 2002), HeLa celicah (Qa'Dan in sod., 2002) in monocitih (Warny in Kelly, 1999).

Morfološke spremembe v skrčeni apoptotski celici so zgoščen kromatin ob robu jedrne

membrane, na citoplazemski membrani se oblikujejo brstiči, celica razpade v apoptotska

telesca, obdana z membrano, ki vsebujejo citoplazmo, jedrne fragmente in organele.

Spremembe v lipidnem dvosloju citoplazemske membrane se pojavijo ţe zelo zgodaj v

procesu apoptoze.

Eden izmed zgodnejših dogodkov v procesu apoptoze je tudi upadanje mitohondrijskega

transmembranskega potenciala, ki se in vitro odraţa z izgubo celične sposobnosti za

kopičenje fluorokromov v mitohondrijih. Toksina A in B poškodujeta mitohondrijsko

membrano (Matarrese in sod., 2007). Posledica je sprostitev citokroma c iz mitohondrijev,

ki aktivira kaspaze in sproţi apoptozo.

Toksina sproţita tudi nekrozo, ki jo spremljajo izguba ATP, produkcija prostih kisikovih

radikalov, izguba membranske integritete, ki ne omogoča več ohranjanja celične

homeostaze, in aktivacija kalpaina/katepsina (Voth in Ballard, 2005; Kim in sod., 2006;

Huelsenbeck in sod., 2007). V patogenezi OCD ima nekroza morebiti večji pomen kot

apoptoza. Celica in njeni organeli nabreknejo, celična membrana poči in vsebina se izlije

v okolje. Sproţi se imunski odziv kar povzroči vnetje (Genth in sod., 2008).

Toksina A in B prav tako povzročata bolezen pri ţivalih, ki so model za bolezen pri

človeku kot je opisano v nadaljevanju.



2.3.3.4 Vloga toksina TcdB v patogenezi

Prvi poskusi na ţivalih so dokazovali pomen toksičnega delovanja obeh toksinov ali

izoliranega toksina A, medtem ko toksin B ni bil toksičen in je bolezen povzročil šele v

kombinaciji s toksinom A (Lyerly in sod., 1985). Riegler in sod. (1995) so na pripravkih

človeškega debelega črevesa dokazali, da oba toksina poškodujeta epitelij in povzročita,

da postane bolj prepusten, ter da toksin B učinkuje celo pri niţjih koncentracijah kot

toksin A. Na pomen toksina B pri infekciji kaţejo tudi sevi, ki delajo samo ta toksin in so

lahko viruletni za ţivali in človeka (Borriello in sod., 1992).

Lyras in sod. (2009), ki so primerjali divji tip z mutantami brez toksina A ali brez toksina

B, so potrdili, da je toksin B zelo pomemben dejavnik virulence.

2.3.3.5 Vloga N-terminalne in C-terminalne domene v patogenezi

Rekombinantni protein s 546 aminokislinami N-terminalnime encimske domene toksina

B ima enake lastnosti kot holotoksin, ker glukozilira iste GTPaze, uporablja isti substrat

in povzroča značilne citopatske učinke. Rekombinantni protein s prvimi 468 oziroma 516

aminokislinami encimske domene toksina B pa ni več citotoksičen (Hofmann in sod,

1997).

Na pomen rekombinantne domene toksina B so opozorili tudi Qa'Dan in sod. (2002).

Rekombinatna katalitična domena toksina B deluje na celice citotoksično in sproţi proces

apoptoze, ki je lahko od kaspaze odvisna ali neodvisna.

Po opravljenih študijah ponavljajoče vezavne domene toksinov bakterije C. difficile tako

kot druge vezavne domene enterotoksinov (npr. kolera toksin) niso odgovorne več samo

za vezavo ne receptorje. C-terminalna vezavna domena toksina A, uporabljena kot

adjuvans oziroma nosilni protein za mukozno imunizacijo, sproţi imunski odgovor na

antigen (Castagliuolo in sod., 2004; Pavliakova in sod., 2000). Prav tako del

rekombinantne vezavne domene toksina A stimulira imunske celice (Brun in sod., 2008)

ter z vezavo aktivira endotelijske celice, ki sproščajo citokine in adhezijske molekule, ki

inducirajo migracijo levkocitov in adhezijo in vitro (Yeh in sod., 2008).



Podobno delovanje za C-terminalno vezavno domeno ni opisano.

2.4 MODELI ZA ŠTUDIJ PATOGENEZE C. difficile

Primeren organizem za raziskave mora imeti naslednje lastnosti: biti mora evkariontski

organizem, imeti mora zelo dobro preučen metabolizem, na določenem nivoju primerljiv

z metabolizmom in funkcijami višjih organizmov, biti dostopen v velikih količinah in

varen za delo.

2.4.1 In vitro modeli za študij patogeneze C. difficile

Celične kulture so najbolj pogost in vitro model za študije mikroorganizmov na črevesno

površino. Med njimi so največkrat uporabljene celične linije Caco-2 in HT-29. Celice se

diferencirajo in so zelo podobne človeškim celicam tankega črevesa (Toumola in

Salminen, 1998). Za študij mikrobnega učinka na membransko permeabilnost,

mehanizme transcitoze in celične invazije se uporabljajo polarizirane celične kulture

(Caco-2). Prednost sesalskih celičnih kultur v primerjavi z eksperimenti in vivo je tudi

izvajanje poskusa v kontroliranih pogojih (konstantnost in stabilnost celične linije,

manjša moţnost infekcije), stroški so niţji in poskusi manj etično sporni.

Pri celicah, tretiranih s C. difficile toksini, opazimo različne morfološke spremembe,

odvisno od tarčnih GTPaz v celici, ki jih običajni in variantni toksini prepoznajo. Pri

različnih kultiviranih celicah lahko opazujemo porušenje citoskeleta in zaokroţanje celic,

poleg tega pa še spremembe ultrastrukture, polarizacijo jedra ali fragmentacjo jedra,

izgubo barierne funkcije epitelija (Nusrat in sod., 2001; Riegler in sod., 1995), apoptozo

(He in sod., 2000; Qa'Dan in sod., 2002; Kim in sod., 2006; Carneiro in sod., 2006;

Matarrese in sod., 2007) ter sproščanje različnih citokinov iz imunskih celic (Savidge in

sod., 2003).

Adhezija toksinov na humane črevesne epitelijske celice spodbudi izločanje ključnega

mediatorja imunskega sistema, kemotaktičnega citokina interlevkina 8 na bazolateralni

strani celic, ki stimulira celice imunskega odziva. Ta spodbudi dendritične celice, sproţi

migracijo nevtrofilcev in monocitov, ki fagocitirajo bakterije in nadaljnjo izločanje



provnetnih citokinov, aktivacijo celic TH ter aktivacijo nuklearnega faktorja kappa B (NF-

κB).

Oba toksina lahko sproţita izločanje citokinov v humanih monocitih, nevtrofilcih in

epitelijskih celicah (Flegel in sod., 1991; Main in sod., 2003; Kim in sod., 2006).

2.4.2 In vivo modeli za študij patogeneze C. difficile

2.4.2.1 Ţivalski modeli za študij okuţbe s C. difficile

Hrček je standardni ţivalski model za C. difficile in se uporablja predvsem v študijah

učinkov izoliranih toksinov (Lyerly in sod., 1985, 1988), virulence (Wilson in sod., 1985;

Rolfe, 1991; Sambol in sod., 2001) in zaščite pred okuţbo (Libby in sod., 1982; Wilson

in Sheagren, 1983; Toothaker in Elmer, 1984; Sambol in sod., 2002; Fekety in sod.,

1993; Merrigan in sod., 2003).

V študijah enterotoksičnega učinka izoliranih toksinov oziroma supernatantov različnih

sevov bakterije C. difficile se kot ţivalski model navadno uporablja kunce (Lyerly in sod.,

1982; Justus in sod., 1982; Borriello in sod., 1992; Lyerly in sod., 1992). Enterotoksičen

učinek in vivo se testira na prevezani zanki črevesa (Lyerly in sod., 1982; Justus in sod.,

1982; Borriello in sod., 1992; Lyerly in sod., 1992). Akumulacija tekočine v zanki,

hemoragija in histološke spremembe so odraz toksičnega delovanja.

Za laboratorijski testni ţivalski model za preučevanje OCD pri ljudeh so uporabili tudi

morske prašičke, miši in podgane (Keel in Songer, 2006), ki pa niso bile tako občutljive

kot kunci (Steele in sod., 2010).

Delovanje toksinov je predvsem lokalno, kjer povzročijo hudo lokalno tkivno poškodbo.

Toksini pa lahko delujejo na oddaljena tkiva, kamor pridejo po krvnem obtoku.

Sistemsko delovanje toksina potrjujejo poskusi na modelu embrijev zebric (Danio rerio).

Aplikacija TcdB je povzročila kardiomiopatije, motnje kardiovaskularnega sistema in

smrt embrijev. Z aplikacijo inhibitorja kaspaze-3 so zaustavili proces apoptoze oziroma

zmanjšali motnje kardiovaskularnega sistema. Proučevali so tudi povezanost črevesne



infekcije, ki je posledica delovanja enterotoksina TcdA s kardiotoksičnim učinkom TcdB.

Zelo verjetno je, da poškodba črevesja s TcdA sprosti TcdB v krvni obtok, ki se veţe na

perikard (Hamm in sod., 2006).

Prisotnost toksinov v blatu, telesnih tekočinah in serumu ter IL-8 kot imunski odziv na

okuţbo s C. difficile so dokazali Steele in sod. (2010). Za ţivalski model spremljanja

akutne in kronične oblike OCD so izbrali gnotobiotične prašičke. Kljub sistemski okuţbi

so pri eksperimentalno okuţenih prašičkih C. difficile izolirali le v črevesu.

2.4.2.2 Nevretenčarski ţivalski modeli za študij okuţbe s C. difficile

Poskusi na vretenčarjih so dragi, teţko jih je izvajati v kontroliranih pogojih, stroški

vzdrţevanja opreme za biološke poskuse in stroški vezani na vzdrţevanje ţivali v

obdobjih, ko poskusi ne potekajo, presegajo dohodke namenjene raziskovalnemu delu,

predvsem pa so vretenčarski ţivalski modeli etično sporni. V mikrobiologiji se zato

uveljavljajo novi ţivalski modeli kot so niţji vretenčarji, in sicer embriji zebric (Danio

rerio), ki so bili opisani tudi za študije učinkov C. difficile (Hamm in sod., 2006), larve

sviloprejk (Bombyx mori), nematodi (Caenorhabditis elegans), vinske mušice

(Drosophila melanogaster) in amebe.

Zaradi poznanega genoma, enostavnih pogojev za rast in hitrega razmnoţevanja bi bil za

ugotavljanje toksičnosti najbolj primeren nevretenčar C. elegans. Na nevretenčarju C.

elegans ţelimo testirati seve C. difficile, ki delajo oba toksina (A+B

+ sevi), le toksin TcdB

(A-B

+ sevi) ali nobenega od toksinov (A

-B

-CDT

-sevi) in seve, ki delajo binarni toksin

CDT, ne pa tudi obeh toksinov, da bi določili virulenčni potencial toksinov.

Razumevanje celičnega odziva na nivoju celične populacije kot tudi ţivalski modeli so

pomembni pri študijah patogeneze in preţivelosti C. difficile v okolju, s tem pa tudi pri

preprečevanju okuţb.



2.5 AVTOFAGIJA IN NJENA VLOGA PRI NASTANKU CELIČNE SMRTI

Toksin A in toksin B s svojim delovanjem sproţita celično smrt, ki je lahko rezultat

apoptoze ali nekroze kot smo pisali v podpoglavju 2.2.3.3. Nekroza je posledica

fizikalnih poškodb in ni genetsko nadzorovana, medtem ko je apoptoza genetsko

nadzorovan celični odgovor na specifične razvojne draţljaje ali draţljaje iz okolja (Vaux

in sod., 1996). Z apoptozo in nekrozo je tesno povezana avtofagija. Lahko jo sproţi ali

prepreči. Do sedaj še ni ugotovljeno, ali toksina A in B lahko sproţita avtofagno celično

smrt.

Avtofagija je pomemben obrambni proces celice, pri katerem kisle vakoule z dvojno

membrano, avtofagosomi, zbirajo znotrajcelično vsebino (poškodovani organeli ali

makromolekule) in jo po fuziji z lizosomi razgradijo. To pomeni, da je avtofagija

bistvenega pomena za preţivetje, diferenciacijo, razvoj in homeostazo. Njena vloga je

prilagojena za zaščito organizmov proti raznolikim boleznim, vključno z okuţbami,

rakom, nevrodegeneracijo, staranjem in srčnimi boleznimi. Avtofagija usmerja patogene,

ki bivajo v citosolu ali v fagosomih v endolizosomalno pot razgradnje (Trombetta in

Mellman, 2005). Prehranski status, hormonski dejavniki in drugi pokazatelji, kot so

temperatura, koncentracija kisika in gostota celic, so pomembni pri nadzoru avtofagije.

Zato je potrebno dobro razumevanje fizioloških funkcij avtofagije in njene vloge pri

preprečevanju bolezni oziroma pri povzročitvi, če avtofagija uide iz nadzora (Levine in

Kroemer, 2008).

Kot vsak proces ima tudi avtofagija svoje pomanjkljivosti. Rakave celice jo lahko

izkoristijo za svoje preţivetje. Ob stradanju, ki ga povzroči slabša prekrvavitev tumorja,

se sproţi avtofagija in podaljša ţivljenjsko vlogo rakavih celic. Ob zdravljenju s

citostatiki se iz mitohondrijev sproţijo prosti radikali, z avtofagijo se rakaste celice

zaščitijo pred apoptozo. Rešitev bi bila ustaviti proces avtofagije med zdravljenjem.

Bakterije in virusi lahko preprečijo zlitje avtofagosoma z lizosomom in tako avtofagosom

postane prostor, kjer se celični mikrobi prehranjujejo in razmnoţujejo (Levine in

Kroemer, 2008).



Nepravilno delovanje avtofagije se kaţe v različnih boleznih. Ljudje, ki bolehajo za

Chronovo boleznijo, imajo okvarjen avtofagosomni sistem, ki ne more obvladovati

namnoţevanja črevesnih mikroorganizmov. Pri nevrodegenerativnih boleznih

(Alzheimerjeva bolezen, spongiformna encefalopatija, Parkinsonova bolezen in

Huntingtonova bolezen) se zaradi okvarjene avtofagije v nevritih kopičijo nefunkcionalne

avtofagne vakoule, ki motijo delovanje nevrona (Rubinsztein in sod., 2007, Williams in

sod., 2006). Kopičenje avtofagosomov so ugotovili tudi pri bolnikih s srčnoţilnimi

boleznimi (preobremenitve srca, ishemija, bolezni koronarnih arterij, povišan krvni tlak,

bolezni srčnih zaklopk in kongestivno srčno popuščanje). Avtofagija s starostjo ni več

tako učinkovita in človeški organizem postaja bolj dovzeten za bolezni in staranje.

Povsod, kjer je celična degeneracija rezultat nekega obolenja, je lahko sproţenje ali

zaviranje celične smrti pot k ozdravljenju.



3 MATERIALI IN METODE

Za poznavanje mehanizma delovanja in pomen toksinov smo uporabili čisti holotoksin B

(TcdB) referenčnega laboratorijskega seva VPI 10463 (A+B

+) in variantnega seva 8864

(A-B

+) (tgcBIOMICS, Mainz, Nemčija) ter rekombinatni vezavni domeni holotoksina B

(rec-TcdB3).

3.1 BAKTERIJSKI SEVI IN GOJENJE BAKTERIJ

3.1.1 Clostridium difficile

Vsi uporabljeni sevi bakterije Clostridium difficile so bili identificirani s klasičnimi in

molekularnimi postopki (Rupnik in sod., 1998; http://www.mf.uni-mb.si/Mikro/tox/) in

so trajno shranjeni v zbirki sevov Oddelka za raziskovalno dejavnost, Centra za

mikrobiologijo, Zavoda za zdravstveno varstvo Maribor pri – 80°C.

Seve bakterije Clostridium difficile, ki smo jih uporabili za hemolizni test in na modelu

nevretenčarja Caenorhabditis elegans, smo s cepilno zanko nanesli na površino

selektivnega trdnega gojišča za izolacijo posameznih kolonij. Plošče smo anaerobno

inkubirali pri 37°C 72 ur. Tipično kolonijo smo s trdnega gojišča prenesli v epruvete s 5

ml obogatitvenega tekočega gojišča in inkubirali 5 dni pri 37°C, kadar smo za poskus

uporabili supernatant seva. Po kultivaciji smo vsebino premešali na vrtinčniku, ločili

supernatant od peleta, tako da smo kulturo bakterije C.difficile centrifugirali (12000

obr/min, 10 min) in supernatant prefiltrirali skozi membranski poliacetni filter s porami

premera 0,22 µm (Millipore) ter tako pred vsakim poskusom pridobili ustrezno količino

osnovne kulture za nadaljnje delo.

3.1.2 Escherichia coli

Za transformacijo smo uporabili bakterijo Escherichia coli BL21(DE3). Sev BL21(DE3)

je izpeljava seva B bakterije E. coli. V gen int ima vstavljen fragment DNA, ki nosi gen

za RNA polimerazo faga T7, promotor lacUV5 in lacI (kodira represor gena lac, ki

nadzira promotor lacUV5). Tako sev BL21(DE3) omogoča visoko raven izraţanja

rekombinantnih proteinov, ki so zapisani na vektorjih s promotorjem T7. Poleg tega sta

pri tem sevu okvarjena gena lon in ompT, ki kodirata proteaze, ki bi lahko razgradile



rekombinantne proteine. Sintezo ekspresijskega proteina smo sproţili z dodatkom IPTG-

ja (Sigma, ZDA) v gojišče, ki omogoči prepis T7 RNA polimeraze.

Za vsako posamezno transformacijo smo porabili 100 μl suspenzije kompetentnih celic

E.coli BL21(DE3).

Nepatogeno bakterijo Escherichia coli OP50 smo uporabili kot hrano za nevretenčarski

model C. elegans. Za rast bakterije smo koliformne kolonije cepili na agar LB ali v

tekoče gojišče LB (Sigma, ZDA) in inkubirali aerobno pri 37°C preko noči.

3.2 CELIČNE LINIJE IN GOJENJE CELIC

Za in vitro študije interakcij med črevesnimi epitelnimi celicami in bakterijskimi toksini

smo uporabljali celični liniji humanih črevesnih epitelnih celic T84 in HT-29. Te celične

linije, ki smo jih dobili iz ameriške zbirke tipskih kultur (American Type Culture

Collection, ATCC), so obdrţale strukturne in funkcionalne lastnosti posameznih tipov

črevesnih epitelnih celic. Celična linija T84 se v fazi konfluentne rasti spontano

diferencira v absorbcijskim celicam podobne celice, medtem ko celice HT-29 v tej fazi

izraţajo lastnosti absorbcijskih in sluz producirajočih celic. Slabost celične linije HT-29

je, da ponavadi absorbcijske in sluz producirajoče celice predstavljajo le okoli 5 % vseh

celic, ostalo so pa nediferencirane celice. Za celice T84 je značilen polariziran fenotip.

Delo s celičnimi kulturami je vedno potekalo v sterilnih pogojih, v brezprašni komori.

Celice smo vzdrţevali v dopolnjenem gojišču D-MEM [10 % FBS, 1 % MEM NEA, 1 %

natrijev piruvat, penicilin (100 U/ml) in streptomicin (100 μg/ml); Gibco-Invitrogen,

Kalifornija, ZDA] v CO2 inkubatorju pri 37°C v aerobnih razmerah s 5 % CO2 in zračno

vlago. Za gojenje smo uporabljali različne posodice za gojenje celičnih kultur.

Stekleničke s površino 75 cm2 smo zaradi velike površine uporabljali za razmnoţevnaje

celic, za poskuse pa manjše gojitvene posodice, kot so 6-, 12- in 96 jamske ploščice.

Celice smo presejali enkrat tedensko. Da smo celice odlepili od podlage, smo jih najprej

sprali z RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen, Kalifornija, ZDA), nato pa medcelične povezave

prekinili z 0,25 % tripsin-EDTA (Gibco-Invitrogen, Kalifornija, ZDA). Celice smo

resuspendirali v gojišču D-MEM in jih prešteli.



3.3 PRIPRAVA REKOMBINANTNE C-TERMINALNE VEZAVNE DOMENE

TOKSINA B (rec-TcdB3VPI, 8864)

Za izolacijo proteina (CDB3, 1751-2366 aa) rec-TcdB3VPI (74,080 kDa) toksina B seva

VPI 10463 in rec-TcdB38864 (73,104 kDa) seva 8864 bakterije C. difficile smo uporabili

ekspresijski sistem pGEX-2T z označevalnikom glutation-S-transferazo (GST). Za

pomnoţevanje gena za protein smo uporabili oligonukleotidne začetnike CDB3C,

CDB3N(5'-AGATCTCTTATGTCAACTAGTGAAGA-3',

5'- GGATCCCTATTCACTAATCACTAATT-3') pod pogoji pomnoţevanja s PCR

(denaturacija, 94°C, 10 s; naleganje, 48°C, 30 s; podaljševanje 68°C, 3 min; 30-krat)

(Hofmann in sod., 1997). Uspešnost kloniranja smo preverili z restrikcijo ter z

določanjem nukleotidnega zaporedja vnesenega fragmenta DNA izločili potencialne

mutacije, do katerih bi lahko prišlo zaradi napak polimeraze Taq.

Plazmid (0,1 μg/μl) smo transformirali v bakterijo Escherichia coli BL21(DE3). Zmes

smo 30 minut inkubirali na ledu, izvedli toplotni šok (37°C, 2 min), inkubirali na ledu,

dodali tekoče gojišče LB in stresali (37°C, 1 ura, 200 obr/min). 100 μl suspenzije smo

razmazali na agar LB z dodanim ampicilinom (100 μg/ml, Applichem, GmbH, Nemčija).

Naslednji dan smo prešteli število zraslih kolonij ter preverili ustreznost transformacije

kolonij s PCR in agarozno gelsko elektroforezo. Celice smo namnoţili v prekonočni

kulturi LB z ustreznim antibiotikom. Transformirane bakterije smo gojili pri 37°C do

OD600= 0,6-1, dodali IPTG (0,1 mM IPTG) in kultivirali preko noči. Supernatant smo

ločili od celičnega lizata po cetrifugiranju (4°C, 10 min, 4000 obr/min). Bakterijski pelet

smo resuspendirali z litičnim pufrom (50 mM TRIS-HCl, pH=8, 200 mM KCl, 1 mM

EDTA, pH=8, 1 % Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mg/ml lizocima, 1 mM PMSF; Sigma,

ZDA). Resuspendirane celice smo izmenično dvakrat inkubirali (-80°C/37°C, 20 min),

sonicirali (3 x 20 s) in centrifugirali (4°C, 45 min, 13000 obr/min), da smo očistili

supernatant bakterijskih membranskih in ostalih proteinov. Delno očiščen vzorec z

zamenjanim pufrom (1 M Tris-HCl, pH=8, 5 M NaCl) smo nadalje očistili z afinitetno

kromatografijo (Glutathione Sepharose 4B, Amersham Bioscience, New Yersey, ZDA) z

zaporednim spiranjem s pufrom in metodo izvajali po navodilih proizvajalca. Zaradi

prepoznavnavnega mesta za trombin v proteinskem konstruktu med fuzijskim (GST) in



rekombinatnim (CDB3) proteinom smo dodali trombin (Amersham Bioscience, New

Yersey, ZDA) in pustili reakcijo teči preko noči. Faze čiščenja rekombinatnih proteinov

in uspešnost rezanja s trombinom smo spremljali z elektroforezo NaDS-PAGE.

3.4 MERJENJE CELOKUPNE KONCENTRACIJE PROTEINOV Z METODO BCA

Koncentracijo proteinov smo merili z metodo BCA. Uporabili smo BCA Protein Assay

Kit (Pierce, Rockford, ZDA). Komplet vsebuje BCA reagent A in BCA reagent B. Kot

standard smo uporabili goveji serumski albumin (BSA, Sigma, ZDA). Umeritveno

premico smo uporabili z osmimi koncentracijami standarda BSA. Za meritve smo

uporabili 96 jamske mikrotitrske ploščice z ravnim dnom. 10 μl vzorca in standarda smo

nanesli v duplikatu. V vsako luknjico smo dodali 200 μl mešanice reagentov A in B (v

razmerju 50:1), ploščico pokrili s pokrovčkom in inkubirali 30 minut pri 37°C. Po

inkubaciji smo s čitalcem za mikrotitrske ploščice izmerili absorbanco pri valovni dolţini

492 nm. Iz povprečnih vrednosti absorbance in znanih koncentracij BSA smo izrisali

umeritveno krivuljo in izračunali enačbo regresijske premice s programom Excel. Iz

izmerjenih vrednosti absorbance vzorcev in iz enačbe regresijske premice smo izračunali

koncentracijo proteinov.

3.5 DOLOČANJE CELIČNE VIABILNOSTI S TESTOM MTT

Celice HT-29 z gostoto 1,0 x 104/100 μl gojišča smo nasadili v 96 jamske mikrotitrske

ploščice. Celice smo inkubirali v CO2 inkubatorju (37°C, 5 % CO2 ) samo v gojišču

(negativna kontrola) in v prisotnosti TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) ter rec-TcdB3VPI in

rec-TcdB38864 (25-100 μg/ml) 24, 48, 72 in 120 ur. Po inkubaciji smo dodali 10 μl MTT

(5 mg/ml-1

v 1 x PBS, Sigma, ZDA) in nadalje inkubirali 4 ure v CO2 inkubatorju, da je

potekla tvorba kristalov formazana. S 100 μl 10 % SDS v 0,1 M HCl smo raztopili

kristale in po inkubaciji preko noči pri sobni temperaturi izmerili absorbanco pri valovni

dolţini 620 nm z optičnim čitalcem (Tecan instruments, ZDA).



3.6 DOLOČANJE DELEŢA CELIC V POSAMEZNIH FAZAH CELIČNEGA

CIKLA S PRETOČNIM CITOMETROM Z UPORABO PROPIDIJEVEGA

JODIDA (PI)

Za analizo celičnega cikla smo potrebovali 1,5 x 105/ml

celic HT-29. Celice smo najprej

prešteli s svetlobnim mikroskopom in jih v kompletnem gojišču nasadili v 6 jamske

ploščice, ki smo ga po 24 urah odstranili in celice inkubirali nadaljnjih 24 ur v gojišču

RPMI 1640 brez seruma, da smo celice časovno uskladili. Celice smo inkubirali samo v

gojišču (negativna kontrola) in v prisotnosti TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) ter rec-

TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) v CO2 inkubatorju (37°C, 5 % CO2 ) 24, 48, 72

in 120 ur. Po inkubaciji smo celice, ţe odlepljene od podlage in odlepljene po

tripsinizaciji, zbrali v epruvete za pretočni citometer (BD Biosciences, Kanada),

centrifugirali (4°C, 8 min, 1400 obr/min), sprali z 1 x PBS, utrdili z ledeno hladnim 70 %

etanolom in inkubirali najmanj 30 minut na ledu. Po centrifugiranju smo celice inkubirali

z RNazo (100 g/ml v 1 x PBS, Sigma, ZDA) 60 minut pri 37°C, dodali PI (100 μg/ml v

1x PBS, Sigma, ZDA) in inkubirali v temi pri sobni temperaturi 30 minut. Tako označene

celice smo analizirali s pretočnim citometrom (FACSCalibur, BD Biosciences, ZDA) in z

računalniškim programom (WinMDI Version 2.9).

3.7 METODA S FLUORESCENTNO OZNAČENIM PROTEINOM ANEKSIN-V

(AV) IN BARVILOM PROPIDIJEV JODID (PI) ZA DOLOČANJE DELEŢA

APOPTOTIČNIH CELIC S PRETOČNIM CITOMETROM

To smo določali s kompletom Annexin V-FLUOS Apoptosis Detection Kit (Roche,

GmbH, Mannheim, Nemčija) in izvajali test po navodilih proizvajalca.

Celice HT-29 s koncentracijo 1,5 x 105/ml smo nasadili v 6 jamske ploščice ter inkubirali

samo v gojišču (negativna kontrola) in v prisotnosti 50 ng/ml TcdBVPI in TcdB8864 ali 100

μg/ml rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 za 24 ali 72 ur. Po inkubaciji smo celice zbrali v

epruvete za pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 min, 1400 obr/min), dodali vezavno

raztopino AV/PI in inkubirali pri sobni temperaturi 15 minut. Tako označene celice smo

analizirali s pretočnim citometrom (Coulter Cytomics FC500, Beckman, ZDA) s

spremljanjem fluorescenčne emisije v območju 488-525 nm za fluorescenčno označen



FITC-AV in 560-680 nm za PI. Za vsako barvilo smo za vzbujanje fluorescence

uporabljali navedeno valovno dolţino (λex) ter spremljali spremembe v intenziteti

fluorescence pri maksimumih, specifičnih za posamezna barvila (λem).

3.8 SLEDENJE PROTEINOV BCL-2, BAX IN PARP Z NADS-PAGE, S

PRENOSOM PO WESTERNU IN IMUNODETEKCIJO

Celice HT-29 (1,5 x 105/ml) smo inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola) ter z rec-

TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 24, 72 ali 120 ur. Po končani inkubaciji smo

odpipetirali gojišče, sprali z 1 x PBS in postrgali adherentne celice. Po centrifugiranju

(4°C, 10 min, 7500 obr/min) smo resuspendirali celični pelet v pufru RIPA (150 mM

NaCl, 1 % NonidetR P40, 0,5 % natrijev deoksiholat, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl,

pH=8), ki smo mu neposredno pred uporabo dodali proteazni inhibitor (1 %, Merck,

Darmstadt, Nemčija), PMSF (10 mg/ml, Sigma, ZDA) in leupeptin (100 μg/ml, Sigma,

ZDA) in inkubirali na ledu 45 minut. Celokupni celični protein (supernatant) smo ločili

od peleta po centrifugiranju (4°C, 20 min, 13000 obr/min) in shranili na -20°C do

priprave vzorca za NaDS-PAGE, za prenos po Westernu in imunodetekcijo. Celokupno

koncentracijo proteina smo izmerili z metodo BCA (podpoglavje 3.4) in nanesli 20 μg

denaturiranih (100°C, 10 min) proteinskih vzorcev na 12 % poliakrilamidni gel. Gel smo

ločili od podlage in prenesli na membrano PVDF (Bio-Rad, Kalifornija, ZDA). Sledilo je

inkubiranje membrane s primarnimi poliklonskimi protitelesi [Bcl-2 (0,4 μg/ml, Santa

Cruz Biotechnology, Santa Cruz, ZDA), Bax (0,4 µg/ml, GeneTex, Irvine, ZDA, PARP

(0,5 µg/ml, Cell Signaling Technology, Massachusettes, ZDA)] in s sekundarnimi

protitelesi (specifičnimi za primarna poliklonska protitelesa) z vezano hrenovo

peroksidazo. Membrano smo prilepili v kaseto za razvijanje. Film Kodak Biomax MR-1

(Sigma, ZDA) smo izpostavili kemiluminiscentni svetlobi za 10 sekund do 20 minut. Čas

izpostavitve smo prilagajali intenziteti lis in tako optimizirali razločnost lis.

3.9 DOLOČANJE AKTIVNOSTI IZVRŠITELJSKE KASPAZE-3 S PRETOČNIM

CITOMETROM


TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 72 ur. Po inkubaciji smo celice zbrali v epruvete



za pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 min, 1400 obr/min), resuspendirali celice v

pufru CytofixTM

(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, ZDA) za 20 minut in jih po

tem sprali z raztopino Perm/WashTM

(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, ZDA).

Celice smo 30 minut inkubirali s FITC označenim kaspaza-3 poliklonskim protitelesom

(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, ZDA). Po inkubaciji smo celice še enkrat sprali

in analizirali s pretočnim citometrom (Coulter Cytomics FC500, Beckman, ZDA).

3.10 SLEDENJE APOPTOZE Z VSE-KASPAZNIM ZAVIRALCEM Z-VAD-FMK

(BENZYLOXYCARBONYL-VAL-ALA-ASP-FLUOROMETHYLKETONE)

To smo določali s kompletom Annexin V-FLUOS Apoptosis Detection Kit (Roche,

GmbH, Mannheim, Nemčija) in izvajali test po navodilih proizvajalca.

Celice HT-29 s koncentracijo 1,5 x 105/ml smo nasadili v 6 jamske ploščice in inkubirali

samo v gojišču (negativna kontrola), v prisotnosti 100 μg/ml rec-TcdB3VPI in rec-

TcdB38864 ter 50μM Z-VAD-FMK za 72 ur. Po inkubaciji smo celice zbrali v epruvete za

pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 min, 1400 obr/min), dodali AV/PI vezavno

raztopino in inkubirali pri sobni temperaturi 15 minut. Tako označene celice smo

analizirali s pretočnim citometrom (Coulter Cytomics FC500, Beckman, ZDA) s

spremljanjem fluorescenčne emisije v območju 488-525 nm za fluorescenčno označen

FITC-AV in 560-680 nm za PI. Za vsako barvilo smo za vzbujanje fluorescence

uporabljali navedeno valovno dolţino (λex) ter spremljali spremembe v intenziteti

fluorescence pri maksimumih, specifičnih za posamezna barvila (λem).

3.11 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE PREKO TVORBE REAKTIVNIH

KISIKOVIH SPOJIN (ROS) S TESTOM MTT

Za oceno ROS s testom MTT smo nasadili HT-29 celice (1,0 x 104/100 μl) v 96 jamske

mikrotitrske ploščice in jih po 24 urah inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola), z

rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml), z NAC (5 mM, Sigma, ZDA) in GST (200

μM, Sigma, ZDA) v CO2 inkubatorju (37°C, 5 % CO2 ) 72 ur. Po inkubaciji smo dodali

10 μl MTT (5 mg/ml-1

v 1 x PBS) in nadaljevali po ţe opisanem protokolu (podpoglavje

3.5).



3.12 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE PREKO TVORBE REAKTIVNIH

KISIKOVIH SPOJIN (ROS) S PRETOČNIM CITOMETROM

Za oceno znotrajcelične oksidacije preko tvorbe reaktivnih kisikovih spojin s pretočnim

citometrom smo uporabili fluorescenčno barvilo 2,7-diklorodihidrofluorescein diacetat

(H2DCFDA, Molecular Probes, ZDA) in hidroetidin (HE, Molecular Probes, ZDA).



za pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 min, 1400 obr/min), resuspendirali celice v

pufru HBSS (Gibco-Invitrogen, Kalifornija, ZDA) s HE (2,5 M) in H2DCFDA (0,1 M)

in inkubirali 30 minut pri 37°C. Po inkubaciji smo celice centrifugirali, resuspendirali v

pufru HBSS in pogledali s pretočnim citometrom (Coulter Cytomics FC500, Beckman,

ZDA) s spremljanjem fluorescenčne emisije v območju 585 nm in 530 nm za HE in

H2DCFDA. Za vsako barvilo smo za vzbujanje fluorescence uporabljali navedeno

valovno dolţino (λex) ter spremljali spremembe v intenziteti fluorescence pri

maksimumih, specifičnih za posamezna barvila (λem).

3.13 MERJENJE MITOHONDRIJSKEGA MEMBRANSKEGA POTENCIALA

(MMP) S PRETOČNIM CITOMETROM



za pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 minut, 1400 obr/min) in resuspendirali v

pufru HBSS z JC-1 (1 M, Gibco-Invitrogen, Kalifornija, ZDA). Celice smo nadalje

inkubirali 10 minut pri 37°C, centrifugirali, resuspendirali v pufru HBSS in analizirali s

pretočnim citometrom (Coulter Cytomics FC500, Beckman, ZDA) s spremljanjem

fluorescenčne emisije v območju 488 nm.



3.14 OCENA ZNOTRAJCELIČNE OKSIDACIJE Z DIFERENCIALNIM

BARVANJEM Z BARVILOM DIHIDRORODAMIN 123 (DHR 123)

Celice HT-29 (1,0 x 104/100 l) smo nasadili na objektna stekla. Celice smo najprej

preinkubirali z 10mM DHR 123 (Sigma, ZDA) 30 minut pri 37°C in nato inkubirali samo

v gojišču (negativna kontrola), s TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) za 12, 24 in 48 ur ali z

rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 g/ml) za 48 in 72 ur. Po inkubaciji smo celice

fiksirali v 4 % raztopini paraformaldehida v 3 x PBS 20 minut, sprali s pufrom 1 x PBS,

prekrili s snovjo proti zbleditvi signala (0,02 M natrijev borat, 90 % glicerol, 3 % N-

propil galat) in jih pritrdili na objektnik. Tako pripravljene preparate smo pregledali s

konfokalnim mikroskopom Leica TCS-NT/SP2.


(AO) ZA KONFOKALNO MIKROSKOPIJO

HT-29 celice (1,0 x 105/ml) smo nasadili na objektna stekla in inkubirali samo v gojišču

(negativna kontrola), s TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) 24 in 48 ur ali z rec-TcdB3VPI in

rec-TcdB38864 (100 g/ml) 48 in 72 ur. Po inkubaciji smo medij D-MEM zamenjali z

medijem D-MEM z AO (0,5 l/ml, Sigma, ZDA). Celice smo inkubirali 15 minut pri

37°C, sprali s pufrom HBSS in fiksirali v 4 % raztopini paraformaldehida v 3 x PBS 20

minut, prekrili s snovjo proti zbleditvi signala (0,02 M natrijev borat, 90 % glicerol, 3 %

N-propil galat) in jih pritrdili na objektnik. Tako pripravljene preparate smo pregledali s

konfokalnim mikroskopom Leica TCS-NT/SP2.


(AO) S PRETOČNIM CITOMETROM

Celice HT-29 (1,0 x 105/ml) smo nasadili na objektna stekla ter jih inkubirali samo v

gojišču (negativna kontrola) in s TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) 24 in 48 ur. Po

inkubaciji smo celice zbrali v epruvete za pretočni citometer, centrifugirali (4°C, 8 min,

1400 obr/min) in resuspendirali celice v D-MEM z AO (0,5 l/ml). Celice smo inkubirali

15 minut pri 37°C, centrifugirali, resuspendirali v pufru HBSS in analizirali s pretočnim



citometrom (Coulter Cytomics FC500) s spremljanjem fluorescenčne emisije v območju

500 nm in 526 nm za AO. Za barvilo smo za vzbujanje fluorescence uporabljali navedeno

valovno dolţino (λex) ter spremljali spremembe v intenziteti fluorescence pri

maksimumih, specifičnih za posamezna barvila (λem).

3.17 SLEDENJE PROTEINOV LC3 IN KATEPSINA B ZA UGOTAVLJANJE

AVTOFAGIJE Z NADS-PAGE, S PRENOSOM PO WESTERNU IN

IMUNODETEKCIJO

Celice HT-29 (1,5 x 105/ml) smo inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola), s

TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) 12, 24 in 48 ur. Po končani inkubaciji smo odpipetirali

gojišče, sprali z 1 x PBS in postrgali adherentne celice. Po centrifugiranju (4°C, 10 min,

7500 obr/min) smo resuspendirali celični pelet v pufru RIPA, ki smo mu neposredno pred

uporabo dodali proteazni inhibitor (1 %), natrijev ortovanadat (1mM, Sigma, ZDA) in

natrijev fluorid (10 mM, Sigma, ZDA) in inkubirali na ledu 45 minut. Celokupni celični

protein (supernatant) smo ločili od peleta po centrifugiranju (4°C, 20 min, 13000

obr/min) in shranili na -20°C do priprave vzorca za NaDS-PAGE, za prenos po Westernu

in imunodetekcijo. Koncentracijo proteina smo izmerili z metodo BCA (podpoglavje

3.4). 20 μg denaturiranih (100°C, 10 min) proteinskih vzorcev smo nanesli na 12 ali 15 %

poliakrilamidni gel. Gel smo ločili od podlage in prenesli na PVDF membrano (Bio-Rad,

Kalifornija, ZDA). Sledilo je inkubiranje membrane z LC3 ali katepsin B primarnim

protitelesom (1 µg/ml, Sigma, ZDA) in za primarno protitelo specifičnim sekundarnim

protitelesom. Membrano smo prilepili v kaseto za razvijanje. Film Kodak Biomax MR-1

(Sigma, ZDA) smo izpostavili kemiluminiscentni svetlobi za 5 do 30 minut. Čas

izpostavitve smo prilagajali intenziteti lis in tako optimizirali razločnost lis.

3.18 SLEDENJE AVTOFAGIJE Z METODO PCR V REALNEM ČASU (RT-PCR)

Celice HT-29 (4 x 105/ml) smo inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola) ter s

TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) 6, 12, 24 in 36 ur. Po inkubaciji smo celice sprali z 1 x

PBS, postrgali adherentne celice in jih prenesli v 1,5 ml mikrocentrifugirke. Celice smo

centrifugirali (4°C, 8 min, 2500 obr/min), da smo ločili celice od pufra. Za izolacijo

mRNA smo uporabili komplet SV Total RNA Isolation System (Promega, ZDA) in delali



po navodilih proizvajalca. Z metodo RT-PCR smo ugotavljali izraţanje genov na nivoju

mRNA, zato je bila vključena predstopnja obratne transkripcije, v kateri smo z reverzno

transkriptazo prepisali izolirano mRNA v cDNA, izhodiščni material za pomnoţevanje z

reakcijo RT-PCR. Za vsako reakcijo smo pripravili reagente v obliki skupne reakcijske

mešanice, ki smo jo razdelili v luknjice mikrotitrske ploščice s 96 jamicami, po 20 μl v

vsako luknjico. Pred reakcijo smo v vsako luknjico dodali še 5 μl cDNA. Mikrotitrsko

ploščico s pripravljeno standardno krivuljo in vzorci smo zatisnili z optično prepustno

folijo in jo prenesli v ABI Prism 7000 detektor za zaporedje (Applied Biosytems,

Anglija) in vzpostavili temperaturno-časovni protokol pomnoţevanja (preglednica 2).

Preglednica 2. Sestava reakcijske mešanice za RT-PCR.

Table 2. Composition of RT-PCR mixture.

gen in reakcijska mešanica 1 x 20 μl program RT-PCR

gadph

TaqMan® (Applied Biosystems,

Anglija)

12,5 μl

stopnja 1: 50°C 2 min


95°C 15 s

stopnja 3: 95°C 15 s

60°C 1 min 40x

P1 hGADPH F (10 pmol/l) 0,3 μl

P2 hGADPH R (10 pmol/l) 0,3 μl

sonda hGADPH (100 μM,

Applied Biosystems, Anglija )

6-FAM-ATGGCCTTCCGTGTCCCCACTG-TAMRA

1 μl

ddH2O 5,9 μl

lc3/ becn1

SYBR®Green

(Applied Biosystems, Anglija) 12,5 μl


95°C 15 s

stopnja 3: 60°C 45 s 35x

P1 MAP1 F/hBECN1 F

(10 pmol/l)

0,3 μl

P2 MAP1 R/hBECN1 R

(10 pmol/l)

0,3 μl

ddH2O 6,9 μl

cDNA (dodamo pred reakcijo) 5,0 μl



Preglednica 3. Uporabljeni začetni oligonukleotidi za RT-PCR.

Table 3. Appropriate primer pairs for RT-PCR.

OZNAKA ZAČETNEGA

NUKLEOTIDA

ZAPOREDJE ZAČETNIH

NUKLEOTIDOV

VIR

hGADPH F 5'-tgaacgggaagctcactgg-3' Colell in sod., 2007

hGADPH R 5'-ggtccaccactgacacgttg-3'

MAP1 F 5'-catgagcgagttggtcaaga-3' He in sod., 2003

MAP1 R 5'-ccatgctgtgctggttca-3'

hBECN1 F 5'-ggatggtgtctctcgcagat-3' Katayama in sod., 2007

hBECN1 R 5'-ttggcactttctgtggacat-3'

Pri relativni kvantifikaciji s standardno krivuljo smo izhodišćno koncentracijo tarčnega

dela gena pri vseh vzorcih odčitali iz standardne krivulje. Vrednosti preiskovanih vzorcev

smo delili z vrednostmi kontrolnih vzorcev. Količino tarčnega gena v preiskovanih

vzorcih smo nato izrazili kot relativno vrednost glede na količino tarčnega gena v

notranjem standardu ter tako normalizirali izraţanje prisotno pod normalnimi rastnimi

pogoji. Vzdrţevalni gen gadph smo uporabili za notranjo kontrolo. Na ta način smo

izničili še razlike v količini celokupne cDNA in izračunali n-kratno

povečanje/zmanjšanje prepisa preiskovanih genov glede na tretiran vzorec.

Podatki o intenziteti fluorescence, ki smo jih dobili po končani analizi z metodo RT-PCR

so bili pridobljeni iz ciklov RT-PCR med eksponentnim pomnoţevanjem reakcije PCR,

torej pri optimalnih pogojih in v zanesljivem razmerju med intenziteto fluorescence in

začetno količino tarčnega gena v vzorcih. Po končani reakciji RT-PCR smo osnovne

podatke o intenziteti fluorescence obdelalli s programom SDS 2.1 (Applied Biosystems,

Anglija). Le-ta je avtomatično beleţil osnovne podatke o intenziteti fluorescence kot

kopičenje pomnoţkov med vsakim ciklom reakcije RT-PCR ter prikazal v krivulji

pomnoţevnja (intenziteta fluorescence je v razmerju s številom ciklom). Ko smo

pregledali in morebiti popravili vse ustrezne nastavitve, smo dobljene rezultate prenesli v

program Microsoft Excel. Vzorcem, ki smo jih naredili v dveh ali treh ponovitvah, smo

izračunali povprečno vrednost in standardno deviacijo (lc3/hgadph oziroma

becn1/hgadph) ter jih predstavili v grafih.



3.19 SLEDENJE INHIBICIJE AVTOFAGIJE S TESTOM MTT

3.19.1 Določanje celične viabilnosti z inhibitorji avtofagije

Za oceno celične viabilnosti smo nasadili celice HT-29 (1,0 x 104/100 μl) v 96 jamske

mikrotitrske ploščice in jih po 24 urah inkubirali samo v gojišču (negativna kontrola), s

TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml), z vortmaninom (20 μM, Sigma, ZDA), 3-metiladeninom

(1 mM, Sigma, ZDA) in bafilomicinom A1 (200 nM, Sigma, ZDA) v CO2 inkubatorju pri

37°C 48 ur. Po inkubaciji smo dodali 10 μl MTT (5 mg/ml v 1xPBS) in nadaljevali po ţe

opisanem protokolu (podpoglavje 3.5).

3.19.2 Določanje celične viabilnosti po transfekciji celic za utišanje izraţaja gena

becn1

Za oceno celične viabilnosti transfeciranih celic v prisotnosti holotoksina TcdBVPI, 8864

smo prav tako uporabili test MTT. Celice smo transfecirali za utišanje izraţanja gena

becn1 po protokolu proizvajalca Reverse Transfection of StealthTM

RNAi or siRNA using

LipofectamineTM

2000 in 96 well plate format (Invitrogen, Kalifornija, ZDA) preden smo

dodali TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml). Kontrolne celice po transfekciji niso bile

izpostavljene TcdB. Po 24 in 48 urni inkubaciji smo dodali 10 μl MTT (5 mg/ml v 1 x

PBS) in nadaljevali po ţe opisanem protokolu (podpoglavje 3.5).

3.20 SPREMEMBE V AKTINSKEM CITOSKELETU

Celice HT-29 (3 x 104/100 μl) smo gojili v standardnih razmerah na objektnih stekelcih,

ki smo jih poloţili v 12 jamsko ploščico. Po inkubaciji celic s TcdBVPI in TcdB8864 (50

ng/ml) ter rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) smo odstranili medij, sprali z 1 x

PBS in fiksirali 10 minut v 4 % raztopini paraformaldehida v 3 x PBS. Po fiksaciji smo

celice spirali z 1 x PBS, povečali prepustnost celične membrane z 0,2 % raztopino triton

X-100 in blokirali nespecifično barvanje ozadja s 30 minutno inkubacijo v 2 % raztopini

BSA. Celice smo po tem inkubirali s FITC označenim faloidinom (50 μg/ml, Sigma,

ZDA) v 0,5 % raztopini BSA 1 uro. Po končani inkubaciji smo celice temeljito sprali,

prekrili s snovjo proti zbleditvi signala (0,02 M natrijev borat, 90 % glicerol, 3 % N-



propil galat) in jih pritrdili na objektnik. Tako pripravljene preparate za

imunofluorescenčno dokazovanje proteinov citoskeleta smo pregledali s konfokalnim

mikroskopom Leica TCS-NT/SP2.

3.21 IMUNOFLUORESCENCA PROTEINA TESNIH STIKOV ZO-1

Celice T84 (3 x 104/100 μl) smo gojili v standardnih razmerah na objektnih stekelcih, ki

smo jih poloţili v 12 jamsko ploščico. Po inkubaciji s TcdBVPI (50 ng/ml) ter rec-

TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) smo odstranili medij, sprali z 1 x PBS in fiksirali

10 minut v 4 % raztopini paraformaldehida v 3 x PBS. Po fiksaciji smo celice spirali z 1 x

PBS, povečali prepustnost celične membrane z 0,2 % raztopino triton X-100 in blokirali

nespecifično barvanje ozadja s 30 minutno inkubacijo v 2 % raztopini BSA. Celice smo

po tem inkubirali s primarnim poliklonskim protitelesom ZO-1 (0,2 µg/ml, Invitrogen,

Kalifornija, ZDA) v 0,5 % raztopini BSA 1 uro. Po končani inkubaciji smo celice

temeljito sprali in inkubirali s FITC označenim sekundarnim protitelesom (0,1µg/ml,

Invitrogen, Kalifornija, ZDA) še 1 uro. Celice smo sprali z 1 x PBS, prekrili s snovjo

proti zbleditvi signala (0,02 M natrijev borat, 90 % glicerol, 3 % N-propil galat) in jih

pritrdili na objektnik. Tako pripravljene preparate za imunofluorescenčno dokazovanje

proteina tesnega stika smo pregledali s konfokalnim mikroskopom Leica TCS-NT/SP2.

Vzporedno z označevanjem ustreznih antigenov smo naredili tudi negativne kontrole, kjer

smo izpustili inkubacijo s primarnimi protitelesi, ostali protokol pa je bil nespremenjen.

3.22 TRANSEPITELNA ELEKTRIČNA UPORNOST (TEER) CELIC T84

Da bi ugotovili učinek toksina na skladnost epitela, smo celice T84 (6 x 104/600 μl) gojili

v 12 jamskih ploščicah na filterskih vstavkih. Transepitelno električno upornost smo

merili z Millicell-ERS Volt/Ohm metrom (Millipore) in pripadajočim parom elektrod.

Eno elektrodo smo pomočili v gojišče nad filtrom s plastjo celic, drugo pa v gojišče v

predel pod filtrom ter merili upornost celične plasti oziroma razliko v napetosti med

apikalno (zgornjo) in bazolateralno (spodnjo) površino celic. TEER praznega filtra smo

odšteli od TEER plasti kot prikazuje enačba: R [Ωcm2] = (Rv-Rf) [Ω]*P [cm

2]



[R= upornost plasti celic, Rv = upornost plasti celic in filtra, Rf = upornost praznega filtra

(brez celic), P = površina filtra].

Celice smo gojili v 12 jamskih ploščicah na filtrskih vstavkih. TEER smo merili od

nasaditve celic do 12 dneva starosti. Gojišče smo menjali vsaki drugi dan in pred

stimulacijo smo celicam prav tako zamenjali gojišče. Gojišče D-MEM smo odstranili iz

predela pod filtrom in iz celic na filtru. Celice smo izpostavili toksinom v časovnem

intervalu (1, 2, 3, 4, 7, 12, 24, 36, 48, 72 ur), tako da smo nanesli nad filter v 0,6 ml D-

MEM 50 ng/ml TcdB3VPI in TcdB38864 ter 100 μg/ml rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864.

Negativno kontrolo so predstavljale celice, ki niso bile izpostavljene toksinom. TEER

vrednosti plasti celic, ki so bile izpostavljne TcdB in rec-TcdB3 smo primerjali s TEER

vrednostjo negativne kontrole. Poskus smo izvedli v dveh ponovitvah s tremi paralelkami.

3.23 DOLOČANJE KONCENTRACIJE IL-8 PRI CELICAH HT-29 Z IMUNSKIM

TESTOM ELISA

Celice smo gojili v 96 jamskih ploščicah in inkubirali 24 in 72 ur s TcdBVPI, 8864 (50

ng/ml) in rec-TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml). Negativno kontrolo so predstavljale celice, ki

jih nismo inkubirali s holotoksinom oziroma z rekombinantnim proteinom. Poskus smo

opravili v dveh paralelkah. Po inkubaciji smo supernatante prenesli v 1,5 ml

mikrocentrifugirke in centrifugirali 10 minut, da bi jih pri morebitni usedlini ločili od

supernatantov, in supernatante shranili na -20°C za kasnejše meritve koncentracij IL-8.

Za merjenje IL-8 smo uporabili komplet Interleukin 8 (ImmunoTools, GmbH, Nemčija)

in delali po navodilih proizvajalca. Absorbanco pri valovni dolţini 450 nm smo izmerili s

čitalcem mikrotitrskih ploščic (Tecan instruments). Iz povprečnih vrednosti optične

gostote izmerjenih pri standardih IL-8 znanih koncentracij, smo izrisali umeritveno

premico in izračunali enačbo regresijske premice s programom Excel. Iz izmerjenih

vrednosti optične gostote vzorcev in iz enačbe regresijske premice smo izračunali

koncentracijo IL-8.



3.24 UGOTAVLJANJE UČINKA SEVOV BAKTERIJE C. difficile NA

ERITROCITE

3.24.1 Hemoliza β in sevi bakterije C. difficile

Pri naključno testiranih sevih AT11, AT25, AT30, C23, ZZV07-584 in ZZV07-585 smo

opazili cono hemolize na trdnem gojišču Schaedler, diferencialnem gojišču z ovčjo krvjo.

Te seve smo zato testirali na različnih trdnih diferencialnih gojiščih (preglednica 4), da bi

potrdili njihovo hemolitično aktivnost in optimizirali metodo. Po tri dnevni anaerobni

inkubaciji pri temperaturi 37°C smo ocenili in izmerili cono hemolize (hemolizo smo

opredelili kot hemoliza β zaradi bistrosti cone). Kontaminacijo smo izključili s

toksinotipizacijo (Rupnik in sod., 1998; http://www.mf.uni-mb.si/Mikro/tox/)

hemolitične kolonije.

Preglednica 4. Sestava gojišča za ugotavljanje hemolitične aktivnosti bakterije C. difficile.

Table 4. Structure of media for testing hemolytic activity from bacteria C. difficile.

kolonija izbranega seva

bakterije C. difficile

diferencialno gojišče

KA

(5 % ovčja kri)

pepton 15,0 g/L

jetrni ekstrakt 2,5 g/L

kvasni ekstrakt 5,0 g/L

NaCl 5,0 g/L

agar 13,0 g/L

COH

(5 % konjska kri)

politon 10,0 g/L

hidrolizirani ţivalski in

rastlinski proteini

10,0 g/L

mioton 3,0 g/L

koruzni škrob 1,0 g/L

NaCl 5,0 g/L

agar 13,0 g/L

KA za ET

(5 % goveja kri)

kazein 10,0g/L

ţivalsko tkivo 10,0 g/L


dekstroza 1,0 g/L

NaCl 5,0 g/L

NaHSO3 0,1 g/L

hemin 0,1 g/L

vitamin K1 0,01 g/L

agar 15,0 g/L

Schaedler

(5 % ovčja kri)

kazein 8,2 g/L

ţivalsko tkivo 2,5 g/L

soja 1,0 g/L

dekstroza 5,8 g/L


NaCl 1,7 g/L

Tris aminometan 3,0 g/L

hemin 0,01 g/L

K2HPO4 0,8 g/L

L-cistin 0,4 g/L

vitamin K1 0,01 g/L

agar 13,5 g/L

pH 7,4 ± 0,1 pH 7,3 ± 0,1 pH 7,0 ± 0,2 pH 7,6 ± 0,1

pogoji inkubacije:

37°C, 3 dni, anaerobno



3.24.2 Ugotavljanje hemolitične aktivnosti supernatanta kulture na eritrocitih

Ovčje eritrocite, ki so bili shranjeni v konzervansu za eritrocite (Alseverjev reagent; 4,2 g

NaCl, 8 g Na3C6H5O7 x 2H2O, 0,55 g C6H8O7 x H2O, 20,5 g D-glukoza, 1000 ml vode)

pri 4°C, smo uporabili za optimizacijo metode. Eritrocite smo pripravili tako, da smo jih

centrifugirali pri 2500 obratih na minuto, 5 minut. Supernatant smo zavrgli, usedlino pa

trikrat sprali z 0,85 % fiziološko raztopino. Po spiranju s fiziološko raztopino smo

usedlino sprali še v pufru za eritrocite (0,1 M Tris, 0,1 M cistein, 0,85 % NaCl, pH =7,6).

Pred testiranjem hemolitične aktivnosti smo spreminjali: odstotek eritrocitov (0,5 %, 1 %,

2 %), sestavo eritrocitnega pufra (0,1 M Tris, 0,1 M cistein, 0,85 % NaCl, pH =7,6 ali

5 mM Tris, 5 mM cistein, 0,85 % NaCl, pH =7,6 ali PBS) in temperaturo inkubacije

supernatanta (22°C ali 37°C).

Ko smo izbrali ustrezni odstotek eritrocitov, pufer in temperaturo inkubacije supernatanta,

smo pod različnimi pogoji ugotavljali hemolitično aktivnost supernatanta kulture

(preglednica 5).

Hemolitično aktivnost smo testirali pri supernatantih sevov AT11, AT25, AT30, C23,

ZZV07-584 in ZZV07-585 in jih primerjali s hemolitično aktivnostjo supernatanta

bakterije Clostridium perfringens tip C.

Za ugotavljenje hemolitične aktivnosti smo odpipetirali supernatant testiranega seva in

suspenzijo eritrocitov v 1,5 ml mikrocentrifugirko in inkubirali pri izbranih pogojih. Z

dodajanjem holesterola (prosti holesterol lahko inhibira aktivnost), proteinaze K

(encimsko aktivno sevi, ki lahko izločajo depolimerizacijske encime) ali cisteina (nujen

za lizo membrane) smo po učinku na eritrocite ţeleli ugotoviti molekularni mehanizem

delovanja supernatantov (preglednica 5). Po končani inkubaciji smo z mikročitalcem

izmerili absorbanco na mikrotitrni plošči, kjer smo v jamico odpipetirali 100 µl

suspenzije. Preostanek suspenzije smo centrifugirali (5min, 4000 obr/min), da smo

ocenili še motnost supernatanta in nastali pelet (hemoliza).



Za negativno kontrolo je sluţil vzorec brez dodanega supernatanta, samo s sterilno vodo.

Supernatant bakterije Clostridium perfringens tip C pa smo uporabili za pozitivno

kontrolo.

Preglednica 5. Različni pogoji za hemolitično aktivnost supernatanta kulture.

Table 5. Different conditions of supernatant hemolytic activity.

supernatant kulture in

POGOJI OPTIMIZACIJE A B C D E F G H I J

holesterol (1 mg/ml v EtOH, Sigma) - - - - - - - - + +

proteinaza K (0,01 mg/ml, Sigma) + - - - + - - + + -

cistein (5 mM, pH=7,6, Sigma) + + + + - - - - + +

inkubacija pri T=22°C, 30 min + - + + + + + + + +

inaktivacija pri T=95°C, 2uri + - - + - - + + + -

eritrociti + + + + + + + + + +

inkubacija pri T=37°C, 1 ura + + + + + + + + + +

centrifugiranje (5 min, 4000 obr/min) + + + + + + + + + +

3.25 NEMATOD C. elegans KOT ŢIVALSKI MODEL ZA OKUŢBO Z BAKTERIJO

C. difficile

3.25.1 Nematod C. elegans in pogoji vzdrţevanja

Naš modelni organizem je bil mikroskopsko majhen večcelični evkariot C. elegans.

C. elegans smo gojili na agarju NGM [2,5 g peptona, 3 g NaCl, 17 g agarja, 1000 ml

vode, 25 ml 1M KH2PO4 (pH=6), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml holesterola (5

mg/ml v EtOH], z nepatogeno bakterijo Escherichia coli OP50, s katero se nematodi

prehranjujejo, pri temperaturi 22°C. Razvoj C. elegans poteka od jajčeca, preko larve

(L1-L4) do odraslega nematoda 3 do 7 dni. Na sveţi agar NGM s prekonočno kulturo E.

coli OP50 smo C. elegans prenašali vsak peti dan in na agar NGM brez E. coli pred

pripravo poskusa.



3.25.2 Ugotavljanje učinka TcdB in supernatantov sevov C. difficile na C. elegans

Učinek na C. elegans smo testirali pri holotoksinu TcdBVPI in TcdB8864 in supernatantih

sevov VPI, 630 (A+B

+CDT

- seva), R12078 (A

+B

+CDT

+sev) in C23 (A

-B

-CDT

-sev) ter ga

primerjali z učinkom tekočega gojišča NGM in BHI.

Za poskus smo uporabili 12 jamske ploščice. 10 do 30 nematodov vseh razvojnih oblik

smo prenesli v 500 μl tekočega gojišča s TcdBVPI, 8864 s končno koncentracijo 5 μg/ml, v

500 μl sterilnega supernatanta kulture in v 500 μl tekočega gojišča (negativna kontrola)

za 24, 48 in 72 ur. Po inkubaciji smo suspenzije odpipetirali v 1,5 ml mikrocentrifugirke,

centrifugirali (22°C, 30 s, 3300 obr/min), sprali trikrat zaporedoma s pufrom M9 (6 g

Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl, 0,25 g MgSO4*7H2O, 1000 ml vode) in nematode

prenesli na trdno gojišče NGM. C. elegans smo še nadalje spremljali 24, 48 in 72 ur.

3.25.3 Ugotavljanje učinka sevov C. difficile na C. elegans

Učinek na C. elegans smo testirali pri sevih VPI, 630 (A+B

+CDT

- seva), R12078

(A+B

+CDT

+sev) in C23 (A

-B

-CDT

-sev). Spore izbranih sevov smo inokulirali na trdno

gojišče NGM in inkubirali pod anaerobnimi pogoji pri temperaturi 37°C tri dni. Nato smo

prenesli 50 do 100 nematodov na trdno gojišče NGM s sevi C. difficile in jih opazovali 12

dni.

3.26 STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV

S programom SPSS 15.0 smo rezultate statistično ovrednotili in označili za statistično

pomembno odstopanje od kontrole pri P< 0,05.



4 REZULTATI

4.1 UČINEK TOKSINA B (TcdB) IN REKOMBINANTNE VEZAVNE DOMENE

TOKSINA B (rec-TcdB3) NA VIABILNOST CELIC

4.1.1 Določanje celične viabilnosti s testom MTT v prisotnosti TcdB in rec-TcdB3

Preverjali smo citotoksičnost rekombinantne vezavne domene rec-TcdB3 na rakavi

celični liniji HT-29 in s tem določili koncentracijo in čas, pri kateri deluje rec-TcdB3

toksično. Viabilnost izbrane celične linije smo spremljali pri koncentracijah 25, 50 in 100

μg/ml. Celice so bile nespremenjene pri koncentraciji 25 μg/ml. Prve učinke smo opazili

pri koncentraciji 50 μg/ml, statistično značilni učinek rekombinantnih vezavnih domen na

HT-29 pa pri koncentraciji 100 μg/ml po 72 urni inkubaciji.

Preverjali smo tudi mejo citotoksičnosti s holotoksinom B pri koncentracijah 50, 100 in

200 ng/ml in izbrali koncentracijo 50 ng/ml, pri kateri deluje TcdB citotoksično.

Primerjali smo izmerjene spremembe metabolične aktivnosti na rakavi celični liniji HT-

29 v prisotnosti rekombinantne vezavne domene rec-TcdB3 s holotoksinom B (slika 3).



kon

trola

Tcd

BV

PI

Tcd

B8

86

4

via

bil

nost

cel

ic (

%)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

Tcd

BV

PI

rec-

Tcd

B3

VP

I

Tcd

B8

86

4

rec-

Tcd

B3

886

4

rec-

Tcd

B3

VP

I

rec-

Tcd

B3

886

4

24 ur 48 ur 72 ur 120 ur

*** *** *** ** ** *** ******

Slika 3. Učinek TcdB in rec-TcdB3 na celično viabilnost. Celice HT-29 smo tretirali s 50 ng/ml TcdBVPI ali

TcdB8864 in 100μg/ml rec-TcdB3VPI ali rec-TcdB38864. Deleţ viabilnih celic smo ugotavljali po 24, 48, 72

in 120 urah s testom MTT. V histogramih je prikazana standardna napaka treh neodvisnih eksperimentov. P

vrednost nam pove, ali je razlika statistično značilna ali ne (*p<0.05, p**<0.01, ***p<0.001). * označuje

statistično pomembno odstopanje od kontrole.

Figure 3. Effect of TcdB or rec-TcdB3 treatment on cell viability. HT-29 cells were treated with 50 ng/ml

of TcdBVPI or TcdB8864 and 100μg/ml of rec-TcdB3VPI or rec-TcdB38864. The percentage of viable cells was

determined after 24 hours, 48 hours, 72 hours and 120 hours exposure by MTT assay. Data are expressed as

mean SEM of at least three independent experiments. A P value of <0.05 was considered statistically

significant (*p<0.05, p**<0.01, ***p<0.001). An asterisk indicates a statistically significant difference

from the control.

Razvidne so razlike med holotoksinom in rekombinantno vezavno domeno. Deleţ

viabilnih celic med obema rekombinantnima domenama je enak. V primerjavi s TcdB VPI,

8864 pa je za toksičen učinek rekombinantnih domen potreben daljši čas in višja

koncentracija.



4.2 UČINEK TOKSINA B (TcdB) IN REKOMBINANTNE VEZAVNE DOMENE

TOKSINA B (rec-TcdB3) NA APOPTOZO

Deleţ apoptotičnih celic v celičnih vzorcih smo določali z dvema metodama pretočne

citometrije: analizo celičnega cikla in AV/PI. Z izbranima metodama pretočne citometrije

smo pridobili podatke o deleţu celic v različnih fazah celičnega cikla in deleţu

apoptotičnih oziroma nekrotičnih celic.

4.2.1 Deleţ celic v posameznih fazah celičnega cikla in deleţ apoptotičnih celic v

subG1 fazi v prisotnosti TcdB in rec-TcdB3

Celična membrana je v odvisnosti od faze celičnega cikla različno prepustna za

propidijev jodid (PI). Z barvanjem s PI (podpoglavje 3.6) smo ugotovili, v kateri fazi

celičnega cikla ter v kakšnih deleţih se nahajajo celice tretirane s holotoksinoma

TcdBVPI,8864 in rekombinatnima proteinoma rec-TcdB3VPI, 8864 (slika 4).



0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

G1

S

G2/M

A

24 ur 48 ur 72 ur 120 ur

razp

ored

itve

celic

v r

azlič

nih

faza

h ce

ličn

ega

cikl

a (%

)

subG1

Tcd

BV

PI

Tcd

B88

64

kont

rola

kont

rola

kont

rola

rec-

Tcd

B3 V

PI

Tcd

BV

PI

Tcd

B88

64

rec-

Tcd

B3 88

64

rec-

Tcd

B3 V

PI

rec-

Tcd

B3 88

64

kont

rola

subG

1 fa

za (a

popt

otič

ne ce

lice)

(%)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

kont

rola

kont

rola

kont

rola

kont

rola

TcdB

VPI

TcdB

VPI

TcdB

8864

TcdB

8864

rec-

TcdB

3 VPI

rec-

TcdB

3 VPI

rec-

TcdB

3 8864

rec-

TcdB

3 8864

24 ur

* ** * *** ** ** **

48 ur 72 ur 120 ur

B

Slika 4. A. Razdelitev celic v posameznih fazah celičnega cikla. Celice smo obdelali in obarvali z barvilom

PI ter opravili analizo s pretočnim citometrom. B. Deleţ celic v subG1 fazi celičnega cikla. V histogramih

je prikazana standardna napaka dveh neodvisnih eksperimentov. P vrednost nam pove, ali je razlika

statistično značilna ali ne (*p<0.05, p**<0.01, ***p<0.001). * označuje statistično pomembno odstopanje

od kontrole.

Figure 4. Panel A. Distribution of cells in the various phases of the cell cycle. Cells were fixed and stained

with propidium iodide (PI) and analyzed by flow cytometry. Panel B. Percentage of cells in SubG1 phase.

Data are mean SEM of two separate experiments with duplicate determinations. A P value of < 0.05 was

considered statistically significant (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). An asterisk indicates a statistically

significant difference from the respective time-matched control.



Celice so v različnih fazah celičnega cikla različno produktivne. Kontrolni sistem

celičnega cikla se odziva na različne zunanje in notranje celične signale in če niso

zagotovljeni vsi pogoji, se napredovanje celičnega cikla v določenih točkah lahko

zaustavi. Po dobljenih rezultatih, v primerjavi z netretiranimi celicami (kontrola), TcdB

in rec-TcdB3 vplivata na zaporedje dogodkov, s pomočjo katerih celica vstopi v novo

fazo celičnega cikla. Največji deleţ tretiranih celic je v G1 fazi, kar je običajno, ker je to

najdaljša faza celičnega cikla. Zniţan deleţ celic v S fazi posledično vpliva na povečanje

deleţa celic v G2/M fazi, kjer se celice delijo. Visok deleţ celic v G2/M fazi zabeleţimo

po tretiranju celic s TcdB kot tudi z rec-TcdB3. Zaustavljen celični cikel v G2/M fazi

blokira delitveno vreteno, povzroči depolimerizacijo mikrotubulov, ki so del celične

delitve in obnove. Inhibicija povzroči celično smrt. Celice v subG1 fazi označimo kot

pozno apoptotične celice.

V subG1 fazi celičnega cikla je po tretiranju s TcdBVPI 19 % celic in po tretiranju s

TcdB8864 17 % ter 11 % po tretiranju z rec-TcdB3VPI in 5 % po tretiranju z rec-TcdB38864.

Deleţ celic v subG1 fazi sorazmerno naraste z daljšim časom inkubacije, hkrati pa se

zniţa deleţ celic v G2/M fazi. Po rezultatih lahko predpostavljamo, da je zaradi delovanja

toksinov TcdB in rec-TcdB3 nadzor rasti G1 faze, uvajanja S faze in delitve celic v G2/M

fazi porušen, kar vodi v povečanje števila pozno apoptotičnih celic (subG1).

4.2.2 Določanje deleţa apoptotičnih in nekrotičnih celic z barvilom aneksin-V (AV)

in barvilom propidijev jodid (PI) v prisotnosti TcdB in rec-TcdB3

S FITC označen aneksin-V se ob prisotnosti Ca2+

ionov veţe na fosfatidilserin, ki je

prisoten na notranji strani celične membrane. Ko celica sproţi apoptozo, se fosfatidilserin

prenese na zunanjo stran membrane, na katerega se veţe s fluorokromom označen

aneksin-V. Barvilo PI vstopi samo v celice s poškodovano celično membrano.

S to metodo smo določili deleţ ţivih celic (AV-, PI

-), zgodnje apoptotičnih (AV

+, PI

-),

pozno apoptotičnih (AV+PI

+) in nekrotičnih celic (AV

-PI

+).



Annexin VAnnexin V Annexin V

PI

PI

PI

kontrola rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864

kontrola TcdBVPI TcdB8864

Annexin V Annexin V

PI

PI

PI

Annexin V

A

B

0

20%

40%

60%

80%

100%

72 ur24 ur

Tcd

BV

PI

kon

trola

razm

erj

e c

eli

c (

%)

žive celice

zgodnje apoptotične celice

pozne apoptotične celice

nekrotične celice

Tcd

B88

64

rec-T

cd

B3

VP

I

rec-T

cd

B3

88

64

kon

trola

Slika 5. Rezultati analize pretočne citometrije spremenjene membrane celic HT-29 tretiranih s TcdBVPI in

TcdB8864 (50 ng/ml) (A) ali rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) (B) v izbranem času.

Zgoraj: Prikaz diagramov z metodo Aneksin-V/Propidijev jodid s pretočnim citometrom. Spodnji levi

kvadrant (B3/L3) predstavlja deleţ ţivih celic (AV-, PI

-), spodnji desni kvadrant (B4/L4) predstavlja deleţ

zgodnje apoptotičih celic (AV+, PI

-), zgornji levi kvadrant (B1/L1) predstavlja deleţ nekrotičnih celic (AV

-,

PI+) in zgornji desni kvadrant (B2/L2) predstavlja deleţ pozno apoptočnih celic (AV

+, PI

+).

Spodaj: Deleţ ţivih, zgodnje in pozno apoptotočnih celic ter nekrotičnih celic smo prikazali grafično po

analizi s pretočnim citometrom. Rezultati so povprečje dveh neodvisnih poskusov.

Figure 5. Flow cytometry analysis of membrane alteration in HT-29 cells treated with TcdBVPI and

TcdB8864 (50 ng/ml) or rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864 (100 μg/ml) for the indicated times.



Upper panels. Representative flow cytometry biparametric analysis of Annexin-V-FITC versus PI signal.

Bottom left quadrant represents live cells (AV-, PI

-), bottom right quadrant represents early apoptotic cells

(AV+, PI

-), top left quadrant represents necrotic cells (AV

-, PI

+). top right quadrant represents late apoptotic

cells (AV+, PI

+).

Lower panel: Percentage of alive, early and late apoptotic as well as necrotic cells based on flow cytometric

analysis. Data are representative of two independent experiments with similar results.

Z metodo AV/PI smo določili obliko celične smrti in ugotovili, da je po inkubaciji s

TcdBVPI visok deleţ aneksin-V pozitivnih celic (30 % zgodnje in 11,6 % pozno

apoptotičnih celic) in niţji deleţ nekrotičnih celic (19,8 %). Po inkubaciji s TcdB8864 je v

nasprotju s TcdBVPI višji deleţ nekrotičnih celic (19,8 %) in niţji deleţ aneksin-V

pozitivnih celic (14,4 % zgodnje in 10,3 % pozno apoptotičnih celic). Rekombinantna

proteina imata podoben učinek kot holotoksina. Po inkubaciji z rec-TcdB3VPI je kot pri

TcdBVPI več zgodnje apoptotičnih celic (13,4 %) kot nekrotičnih celic (8,0 %), medtem

ko je po inkubaciji z rec-TcdB38864 enako kot pri TcdB8864 več nekrotičnih celic (16,9 %)

in manj zgodnje apoptotičnih celic (11,0 %).

4.2.3 Določanje aktivnosti izvrševalne kaspaze-3 s pretočno citometrijo v

prisotnosti rec-TcdB3

Z ugotavljanjem aktivnosti kaspaze-3 lahko določimo, če se sproţi proces apoptoze po

notranji ali zunanji poti, saj je kaspaza-3 skupna obema potema in je končna molekula v

kaskadi kaspaz. Kaspaza-3 se ob aktivaciji cepi na dve podenoti. S FITC označenim

monoklonskim protitelesom, ki se veţe le na eno podenoto, smo potrdili aktivnost

kaspaze-3 (slika 6).




R R R

Slika 6. Rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 aktivirata kaspazo-3. Celice HT-29 smo inkubirali z obema

rekombinantnima proteinoma 72 ur. Z monoklonskim FITC označenim protitelesom smo z analizo

celičnega cikla s pretočnim citometrom dokazovali aktivnost kaspaze-3.

Figure 6. Caspase-3 induced activity by rec-TcdB3VPI and recTcdB38864. HT-29 cells were incubated in the

presence of the two recombinant protein and 72 h of treatment, cells were harvested, and stained with an

anti-human active caspase-3 fragment monoclonal antibody conjugated with FITC, and analysed by flow

cytometry.

Oba rekombinantna proteina po 72 urah inkubacije aktivirata kaspazo-3, kar pomeni, da

lahko sproţita od kaspaze odvisno pot.

4.2.4 Detekcija apoptoze s sledenjem Bcl-2, Bax in cepitve PARP v prisotnosti rec-

TcdB3

Kot kazalec celične smrti smo uporabili tudi razmerje stopnje izraţanja proteinov

Bax/Bcl-2, ki je količnik med relativnim izraţanjem proapoptotskega proteina Bax in

relativnim izraţanjem antiapoptskega proteina Bcl-2 v posamezni celični kulturi.

kontrola rec-TcdB3VPI

Bcl-2 / 24 ur

Bcl-2 / 72 ur

Bcl-2 / 120 ur

Bax / 24 ur

Bax / 72 ur

Bax / 120 ur

β-aktin

β-aktin

β-aktin

β-aktin

β-aktin

β-aktin

rec-TcdB38864 kontrola rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864

Slika 7. Prisotnot proteinov Bcl-2 (29 kDa) in Bax (23 kDa). Slika filma po prenosu Western prikazuje

stopnjo upadanja signala Bcl-2 in stopnjo naraščanja signala Bax pri različnih časih. Celice HT-29 smo



tretirali s 100 μg/ml rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 in ločili protein iz čistega celičnega lizata na 12 % SDS

poliakriamidni gel.

Figure 7. Presence of Bcl-2 (29 kDa) and Bax (23kDa) proteins. Representative Western blots showing the

time-dependent down-regulation of Bcl-2 and up-regulation of Bax. HT-29 cells were treated with 100

μg/ml rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864 and the protein from the whole cell lysate was separated on a 12 %

SDS plyacryamide gel.

Celice tretirane z rec-TcdB3VPI, 8864 so vstopile v apoptozo, ki je sorazmerna z razmerjem

Bax/Bcl-2 (slika 7). Višje izraţanje proapoptotskega proteina Bax in posledično višje

razmerje Bax/Bcl-2 opazimo pri obeh rekombinantnih vezavnih proteinih. Ker smo

izbrali rakave celice HT-29, zaznamo prisotnost obeh proteinov tudi pri kontrolnih

celicah, a je razmerje med proteinoma Bax/Bcl-2 v korist antiapoptotskega proteina Bcl-2,

ki deluje tako, da omogoča celično preţivetje.

Cepitev PARP, ki v celici sodeluje pri obnovi molekule DNK, izkoriščamo pri eni od

metod sledenja apoptoze. S protitelesom, ki prepozna samo cepljeno obliko PARP smo

lahko sledili napredovanju apoptoze v celicah. Razviti prenos po Westernu je na sliki 8.

PARP-1 (poli(ADP)-riboza polimeraza), ki je jedrni substrat za kaspaze, je razcepljen in

označuje začetek apoptoze.

rec-TcdB8864

72 ur

rec- TcdB3VPI

72 ur

116 kDa

85 kDa

Slika 8. Slika filma po prenosu Western prikazuje cepitev PARP po tretiranju z rec-TcdB3VPI in rec-

TcdB8864 (100 μg/ml). Celice smo tretirali z rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 72 ur in ločili celoten celični

protein na 12 % SDS poliakrilamidni gel, prenesli na PVDF membrano in inkubirali s proti-PARP

protitelesom.

Figure 8. Representative Western blot showing the cleavage of PARP after treatment with rec-TcdB3VPI

and rec-TcdB8864 (100 μg/ml). Cells were treated with rec-TcdB3VPI and rec-TcdB8864 for 72 h and

total cellular protein was separated on a 12 % SDS polyacrylamide gel, transferred to a PVDF membrane,

and immunoblotted with anti-PARP antibody.



Potrdili smo, da rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 sproţita apoptozo zaradi encimske

razgraditve PARP-1 preko aktivirane kaspaze-3.

4.2.5 Prisotnost vse-kaspaznega zaviralca Z-VAD-FMK (benzyloxycarbonyl-Val-

Ala-Asp-fluoromethylketone)

Z dosedaj opisanimi metodami smo ugotovili, da oba rekombinantna proteina sproţita

apoptozo, ki je od kaspaze odvisna (slika 6). Regulatorji apoptoze kontrolirajo aktivnost

kaspaz, ki so glavni izvršitelji apoptoze in preprečijo prehod celic v apoptozo. Vse-

kaspazni zaviralec apoptoze Z-VAD-FMK deluje kot učinkoviti ireverzibilni inhibitor

brez dodatnih citotoksičnih učinkov, zato smo ţeleli potrditi njegov zaviralni učinek pri

celicah tretiranih z rec-TcdB3.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

žive celice

zgodnje apoptotične celice

pozne apoptotične celice

nekrotične celice

kon

trola

+ z

VA

D

kon

trola

rec-

Tcd

B3

VP

I+z

Z-V

AD

rec-

Tcd

B3

VP

I

rec-

Tcd

B3

VP

I+z

Z-V

AD

rec-

Tcd

B3

886

4

razm

erje

med

cel

icam

i bre

z in

z Z

-VA

D-F

MK

(%

)

Slika 9. Deleţ ţivih, zgodnje in pozno apoptotočnih celic ter nekrotičnih celic po analizi s pretočnim

citometrom z metodo Aneksin-V/Propidijev jodid. Celice smo tretirali 72 ur z rec-TcdB3VPI in rec-

TcdB38864 (100 μg/ml) in hkrati z vse kaspaznim inhibitorjem Z-VAD-FMK (50 μM) tako tretirane celice z

rekombinantnim proteinom kot tudi netretirane celice (negativna kontrola).

Figure 9. Percentage of alive, early and late apoptotic as well as necrotic cells based on flow cytometric

analysis of Annexin-V-FITC versus PI signal. Cells were treated for 72 h with rec-TcdB3VPI and rec-



TcdB38864 (100 μg/ml) and at the same time control cells and with rec-TcdB3 incubated cells were trated

with pan- caspase inhibiotor Z-VAD-FMK (50 μM).

Spremljali smo deleţ ţivih celic, zgodnje in pozno apoptotičnih celic in nekrotičnih celic.

Pri z rec-TcdB3 tretiranih celicah, ki smo jim dodali vse-kaspazni zaviralec se je povečal

deleţ ţivih celic, in sicer iz 80,2 % na 86,8 % pri celicah tretiranih z rec-TcdB3VPI in iz

53,1 % na 70,6 % pri celicah tretiranih z rec-TcdB38864. Sorazmerno se je zniţal deleţ

zgodnje in pozno apoptotičnih celic ter nekrotičnih celic. S tem smo potrdili, da je celična

smrt, ki jo sproţita rekombinantna proteina od kaspaz odvisna.

4.2.6 Določanje membranskega mitohondrijskega potenciala (MMP) v prisotnosti

rec–TcdB3

Z izgubo fosfolipidne asimetrije z izpostavitvijo fosfatidilserina na eksoplazemski strani

celične membrane se spremenijo pogoji prenosa za prehod ionov skozi membrano. Vpliv

rec-TcdB3 na elektrokemijski gradient smo zato določili z merjenjem membranskega

mitohondrijskega potenciala s pretočnim citometrom (slika 10).




AG

RE

GA

TI

MONOMER

AG

RE

GA

TI

AG

RE

GA

TI

MONOMER MONOMER

A

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

spre

mem

ba m

embr

ansk

ega

mito

hond

rijs

kega

pot

enci

ala

(%)


B

Slika 10. Vloga mitohondrijskega membranskega potenciala pri celicah tretiranih z rec-TcdB3VPI, 8864, ki

sproţita apoptozo. Prikaz diagramov (A) in histograma (B) MMP po barvanju z JC-1 (10 μg/ml) pri celicah

HT-29, tretiranih z rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 72 ur. Deleţ depolariziranih mitohondrijev

prikazujeta kvadrant B4 (A) in histogram (B).

Figure 10. Role of mitochondrial membrane potencial in rec-TcdB3VPI, 8864 induced apoptosis in living

cells. Biparametric and grafic analysis (A, B) of MMP after staining with JC-1(10 μg/ml) in HT-29 cells

treated with rec-TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml) for 72 h. The percentage of cells with depolarized mitochondria

in quadrant B4 (A) and in histogram (B) is reported.

V zgodnji fazi apoptoze se lahko spremeni tudi mitohondrijska membranska prepustnost

(mt). mt smo merili z zelo specifičnim in občutljivim fluorescenčnim barvilom JC-1

(5,5', 6,6'-tetrakloro-1,1,3,3'-tetraetilbenzimidazolilkarocijanin iodid). JC-1 se kopiči v

mitohondrijih zdravih celic v obliki skupkov (diagram A, kvadrant B2). Ob začetku

apoptoze se mitohondrijski potencial spremeni, JC-1 se ne more več kopičiti v

mitohondrijih in ostane v citoplazmi v obliki monomera (slika 10; diagram A, kvadrant

B4). Pri netretiranih celicah (kontrola) se tvorijo številni JC-1 skupki (visok mt),



medtem ko se pri celicah, tretiranih z rec-TcdBVPI, 8864 v mitohondrijih tvori manj JC-1

skupkov (nizek mt) in posledično več monomerov.

4.2.7 Ocena znotrajcelične oksidacije s testom MTT v prisotnosti rec-TcdB3

Biokemični procesi, v katerih nastajajo nevarne ROS so v celicah običajni. ROS

odstranjujejo ali sodelujejo pri odstranjevanju primarni antioksidativni obrambni sistemi,

sekundarni pa vključujejo sisteme za popravljanje ali odstranjevanje poškodovanih

molekul. Sekundarni antioksidativni sistemi prevzamejo vlogo, ko primarni niso več

dovolj učinkoviti. Pomembnejša komponenta sekundarne obrambe je glutation, ki

reducira disulfidne mostičke v beljakovinah.

Celice HT-29 smo inkubirali z NAC in GST, da bi potrdili tvorbo reaktivnih kisikovih

spojin (ROS), ki bi lahko sproţile celično smrt v obliki apoptoze (slika 11).

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140% ***

kont

rola

rec-

Tcd

B3 V

PI

rec-

Tcd

B3 88

64

NA

C i

nre

c-T

cdB

3 8864

NA

C i

nre

c-T

cdB

3 VP

I

GS

T i

nre

c-T

cdB

3 VP

I

GS

T i

nre

c-T

cdB

3 8864

Glu

tath

ione

S-t

rans

fera

se

(GS

T)

N-a

cety

l-L

-cys

tein

e (N

AC

)

viab

ilno

st c

elic

(%

)

Slika 11. Učinek rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 v prisotnosti NAC (N-acetyl-L-cysteine) in GST

(glutathione S-transferase) na celično viabilnost. Celice HT-29 smo tretirali z rec-TcdB3VPI in rec-

TcdB38864 (100 μg/ml), z NAC (5 mM) in GST (200 μM) ločeno in skupaj. Odstotek viabilnih celic smo

ugotavljali po 72 urah s testom MTT. V histogramih je prikazana standardna napaka treh neodvisnih



eksperimentov. P vrednost nam pove, ali je razlika statistično značilna ali ne (*p<0.05, p**<0.01,

***p<0.001). * označuje statistično pomembno odstopanje od kontrole.

Figure 11.. Effect of rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 in the presence of NAC (N-acetyl-L-cysteine) and GST

(glutathione S-transferase) on cell viability. HT-29 cells were treated with rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864

(100 μg/ml), with NAC (5 mM) and GST (200 μM) separated or together. The percentage of viable cells

was determined after 72 hours exposure by MTT assay. Data are expressed as mean SEM of at least

three independent experiments. A P value of <0.05 was considered statistically significant (*p<0.05,

p**<0.01, ***p<0.001). An asterisk indicates a statistically significant difference from the control.

Deleţ viabilnih celic, ki so bile tretirane hkrati z rec-TcdB3VPI, 8864 in NAC oziroma z rec-

TcdB3VPI, 8864 in GST nam pove, da so celice še sposobne ohranjanja celične homeostaze.

4.2.8 Ocena znotrajcelične oksidacije s pretočno citometrijo v prisotnosti rec-

TcdB3

Celice HT-29 tretirane z rec-TcdB3 smo inkubirali z NAC, da bi potrdili tvorbo

reaktivnih kisikovih spojin (ROS) tudi s pretočnim citometrom. Za detekcijo

superoksidnega aniona (O2-) in hidroperoksidnega radikala (HO2

-) smo uporabili dve

fluorescentni barvili, hidroetidin (HE) in 2'-7'-diklodihidrofluorescein (H2-DCFDA)

(slika 12).

kontrola N-acetyl-L-cysteine (NAC)

+ rec-TcdBVPI

rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864N-acetyl-L-cysteine (NAC)

+ rec-TcdB8864

Annexin V Annexin V Annexin V Annexin V Annexin V

PI

72 ur

Slika 12. Rezultati analize pretočne citometrije celic HT-29 v prisotnosti rec-TcdB3VPI, rec-TcdB38864 ali z

NAC (N-acetyl-L-cysteine) z metodo AV/PI.

Celice HT-29 smo tretirali z rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) in z NAC (5 mM) ločeno in skupaj.

Deleţ ţivih, zgodnje in pozno apoptotičnih celic ter nekrotičnih celic smo ugotavljali po 72 urah s

pretočnim citometrom. V diagramu so v levem spodnjem kvadrantu (E3) ţive celice (AV-PI

-), v desnem



spodnjem kvadrantu (E4) so zgodnje apoptotične celice (AV

+PI

-), v levem zgornjem kvadrantu (E1) so

nekrotične celice (AV-PI

+) in v desnem zgornjem kvadrantu (E2) so pozno apoptotične celice (AV

+PI

+).

Figure 12. Representative flow cytometry biparametric AV/PI analysis of HT29 cells in the presence with

rec-TcdB3VPI, rec-TcdB38864 or with NAC (N-acetyl-L-cysteine).

Cells were treated with rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864 (100 μg/ml) and with NAC (5 mM) separated or all

together. Percentage of alive, early and late apoptotic cells as well as necrotic cells were analysed after 72 h

by flow cytometry. Bottom left quadrant (E3) represents live cells (AV-PI

-), bottom right quadrant (E4)

represents early apoptotic cells (AV+PI

-), top left quadrant (E1) represents necrotic cells (AV

-PI

+) and top

right quadrant (E2) represents late apoptotic cells (AV+PI

+).

Deleţ ţivih celic, nekrotičnih, zgodnje in pozno apoptotičnih celic, ki so bile tretirane

hkrati z rec-TcdB3VPI, 8864 in NAC se ujema z deleţem celic, ki so bile tretirane samo z

rec-TcdB3VPI, 8864. Tudi z drugo metodo smo potrdili, da so celice še sposobne ohranjanja

celične homeostaze in da je tvorba ROS zelo majhna.

4.2.9 Ocena znotrajcelične oksidacije s konfokalno mikroskopijo v prisotnosti

TcdB in rec-TcdB3

ROS se nenehno proizvajajo v celici kot posledica aerobne presnove. Natančno merjenje

ROS je bistvenega pomena za oceno redoks stanja celice. Zato smo preverili razmerje

med oksidativnim stresom in smrtjo celice, ki jih tretiramo z rec-TcdB3 še z

diferencialnim barvanjem z uporabo barvila dihidrorodamin 123 (DHR 123) (slika 13).



KONTROLA

rec-TcdB3VPI

/ 48 ur rec-TcdB3VPI

/ 72 ur rec-TcdB38864

/ 48 ur rec-TcdB38864

/ 72 ur

TcdBVPI

/ 12 ur TcdBVPI

/ 24 ur TcdBVPI

/ 48 ur

TcdB8864

/ 12 ur TcdB8864

/ 24 ur TcdB8864

/ 48 ur

Slika 13. Tvorba znotrajceličnih ROS pri celicah HT-29 po izpostavitvi s TcdBVPI, 8864 (50 ng/ml) za 12, 24

in 48 ur ter z rec-TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml) za 48 in 72 ur. Dihidrorodamin 123 (DHR 123, 10 mM) je

oksidiral v svetlo fluorescenten rodamin 123 (Rho 123) z nastankom znotrajceličnih reaktivnih kisikovih

spojin.

Figure 13. Formation of intracellular ROS after stimulation of HT-29 cells with TcdBVPI, 8864 for 12, 24 and

48 h as well as with rec-TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml) for 48 and 72 h. Oxidation of dihidrorhodamine 123

(DHR 123, 10 mM) to the fluorescent compound rhodamine 123 (Rho 123) was used to detect the

production of oxygen metabolites.

Nefluorescenten DHR 123 postane svetlo fluorescenten po oksidaciji v Rho 123 pri

celicah, ki smo jih tretirali tako s TcdBVPI, 8864 kot tudi z rec-TcdB3VPI, 8864. Fluorescenca

barvila se povečuje sorazmerno z nastankom znotrajceličnih oksidacijskih spojin. Na

osnovi fluorescence barvila, ki narašča vzporedno s časom inkubacije vidimo, da TcdB

vpliva na tvorbo znotrajceličnih radikalov. Tudi z rec-TcdB3 tretirane celice v primerjavi

z netretiranimi celicami fluorescirajo, a fluorescenca barvila se s časom inkubacije ne

povečuje, ostane enaka.



Na osnovi rezulatov konfokalne mikroskopije ne moremo izključiti moţnosti, da rec-

TcdB3 tvori proste radikale, prav tako ne moremo potrditi, da je celična smrt povezana s

tvorbo prostih radikalov.

4.3 UČINEK TOKSINA B (TcdB) NA AVTOFAGIJO

Stopnjo avtofagije smo spremljali s tremi neodvisnimi testi in primerjali rezultate.

Uvodni poskus je temeljil na diferencialnem barvanju morfoloških sprememb celic po

tretiranju s TcdB in z rec-TcdB3. Celice, ki smo jih inkubirali z rec-TcdB3 so bile enake

kontrolnim celicam, zato smo v poskus avtofagije vključili samo TcdB (slika 14).

4.3.1 Diferencialno barvanje morfoloških sprememb celic z akridin oranţnim (AO)

KONTROLA rec-TcdB3VPI

/ 48 in 72 ur rec-TcdB38864

/ 48 in 72 ur

TcdBVPI

/ 12 ur TcdBVPI

/ 24 ur TcdBVPI

/ 48 ur

TcdB8864

/ 12 ur TcdB8864

/ 24 ur TcdB8864

/ 48 ur

Slika 14. Celice obarvane z akridin oranţnim smo opazovali s konfokalnim mikroskopom. Akridin oranţno

prosto prehaja skozi celično membrano in se kopiči v kislih strukturah (fluorescentno svetlo rdeče). Na sliki

vidimo kisle vezikularne organele v citoplazmi celic, ki smo jih tretirali s TcdBVPI, 8864 (50 ng/ml) 24 in 48



ur. Kontrolne celice in celice, ki smo jih tretirali z rec-TcdB3VPI, 8864 48 in 72 ur (100 μg/ml) nimajo kislih

vezikularnih organelov in ostanejo neobarvane.

Figure 14. Cell staining with acridine orange were obtained with confocal microscopy Acridin orange

moves freely to cross membrane and acumulates in acidic compartments where it seen as fluorescence

bright red. As shown in picture staining with acridin orange showed accumulation of acidic vesicular

organelles in the cytoplasm of cells exposed to TcdBVPI, 8864 (50 ng/ml) for 24 and 48 h. Uncoloured control

cells and cells exposed to rec-TcdB3VPI, 8864 for 48 and 72 h (100 μg/ml) exhibited no acidic vesicular

organelles .

Celice, ki smo jih inkubirali s TcdB vsebujejo kisle vezikularne organele, ki so značilne

za avtofagijo.



4.3.2 Dokazovanje kislih vezikularnih organelov z uporabo pretočne citometrije

kontrola TcdBVPI , 24 ur TcdBVPI , 48 urTcdB8864 , 24 ur TcdB8864 , 48 ur

B

A

C

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

ko

ntr

ola

Tcd

BV

PI

24

ur

Tcd

BV

PI

48

ur

Tcd

B8

864

24

ur

TcdB

886

4

48

ur

akri

din

ora

nžno

po

ziti

vne

celi

ce (

%)

D

Slika 15. Prikaz diagramov in histogramov netretiranih celic in celic tretiranih s TcdBVPI in TcdB8864 (50

ng/ml) 24 in 48 ur po barvanju z barvilom akridin oranţnim.

Figure 15. Biparametric and grafic analysis of untreated cells and cells exposed to TcdBVPI and TcdB8864

for 24 and 48 h (50 ng/ml) after staining with acridin orange.



Na diagramu (slika 15) smo ustvarili regijo in izbrali celice za analizo (A). Z uporabo

izbrane regije smo odstranili celični debris. V histogramih B, C in D (slika 15) smo

prikazali število vezikularnih organel v celicah.

Na osnovi rezultatov sklepamo, da imajo celice, ki jih tretiramo s TcdB, veliko

vezikularnih vakuol. Oblikovanje le-teh se ujema s slikami konfokalne mikroskopije

(slika 14). Število vakuol se zelo poveča po 48 urah inkubacije tako pri celicah, ki jih

inkubiramo s TcdBVPI (56,2 %) kot s TcdB8864 (37,4 %).

4.3.3 Sinteza proteinov LC3 in katepsina B

LC3 (ang. microtubule-associated protein 1 light chain 3) je protein membrane

avtofagosoma. Tvori dve obliki, to sta LC3-I (citosolna oblika) in LC3-II (membranska

oblika). Razmerje LC3-II/LC3-I je povezano s številom nastalih avtofagosomov.

TcdBVPI TcdB 886

12 ur 12 ur24 ur 24 ur48 ur 48 ur

LC3-I

LC3-II

18kDa

12kDa

kontrola

Slika 16. TcdBVPI in TcdB8864 sproţita izraţanje proteina LC3. Slika filma po prenosu Western prikazuje

naraščanje signala LC3-II pri različnih časih. Celice HT-29 smo tretirali s 50 ng/ml TcdBVPI in TcdB8864 in

ločili protein iz čistega celičnega lizata na 12 % SDS poliakrilamidni gel.

Figure 16. TcdBVPI and TcdB8864 induce expression of LC3. Representative Western blots showing the

time-dependent up-regulation of LC3-II. HT-29 cells were treated with 50 ng/ml TcdBVPI and TcdB8864 and

the protein from the whole cell lysate was separated on a 12 % SDS plyacrylamide gel.

Razlike v razmerje LC3-II/LC3-I opazimo pri celicah tretiranih s TcdBVPI, 8864. Pri

poskusih uporabljamo HT-29 celično linijo, ki so po izvoru rakave celice. Zaradi tega

smo prav tako pri kontrolnih netretiranih celicah zaznali obe obliki proteina LC3. V

primerjavi s tretiranimi celicami, pa je signal obeh oblik proteina LC3 enako močan

(slika 16).



kont

rola

TcdB

VPI

TcdB

886

TcdB

VPI

TcdB

VPI

TcdB

886

TcdB

886

12 ur 48 ur24 ur

Slika 17. TcdBVPI in TcdB8864 sproţita izraţanje proteina katepsina B (39 kDa). Slika filma po prenosu

Western prikazuje izraţen protein katepsin B pri različnih časih. Celice HT-29 smo tretirali s 50 ng/ml

TcdBVPI in TcdB8864 in ločili protein iz čistega celičnega lizata na 12 % SDS poliakrilamidni gel.

Figure 17. TcdBVPI and TcdB8864 induce expression of cathepsin B (39 kDa). Representative Western blots

showing the time-dependent expression of protein cathepsin B. HT-29 cells were treated with 50 ng/ml

TcdBVPI and TcdB8864 and the protein from the whole cell lysate was separated on a 12 % SDS

plyacrylamide gel.

Katepsin B je prisoten pri netretiranih kot tretiranih celicah s toksinom (slika 17). Razliko

v jakosti signala smo opazili pri celicah, ki so bile tretirane s TcdBVPI, 8864 po 48 urah.

4.3.4 Izraţanje genov vpletenih v proces avtofagije

Z metodo obratnega prepisa ter veriţne reakcije s polimerazo smo preiskovali izraţanje

genov lc3, becn1 in hgadph pri celicah v osnovnem celičnem mediju ali v prisotnosti

TcdBVPI, 8864 za 6, 12, 24 in 36 ur. Kot kazalca avtofagije smo uporabili stopnjo izraţanja

genov lc3 in becn1. Dodali smo hišni gen hgadph, katerega izraţanje je, glede na

literaturo, stabilno ne glede na okoljske pogoje. Rezultate smo ovrednotili in jih

predstavili na grafu (sliki 18 in 19).



0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10lc

3/ hgadph

ko

ntr

ola

, 6

ur

ko

ntr

ola

, 1

2 u

r

ko

ntr

ola

, 2

4 u

r

ko

ntr

ola

, 3

6 u

r

TcdB

VP

I, 12

ur

Tcd

BV

PI, 6

ur

TcdB

VP

I, 24

ur

Tcd

BV

PI, 3

6 u

r

Tcd

B8

864

, 6

ur

TcdB

886

4, 1

2 u

r

TcdB

886

4, 2

4 u

r

Tcd

B88

64

, 3

6 u

r

A

Slika 18 Stopnja izraţanja gena lc3 pri različnih časih inkubacije. Izraţanje gena smo določili z RT-PCR.

Pokazane so povprečne vrednosti razmerja lc3/hgadph. Uporabili smo podatke dveh neodvisnih poskusov v

dveh vzporednih ponovitvah.

Figure 18. Level of time-dependent expression from gene lc3. RT-PCR was used for gene expression.

Average lc3/hgadph ratio values are shown. Data from two independent experiments in parallel repetitions

are used.

Na sliki 18 so prikazane numerične vrednosti pomnoţenih genov lc3 in hgadph.

Statistično pomembne razlike v izraţanju izbranega gena pri različnih časih izpostavitve

celic TcdB ni. V primeru gena lc3 je bila stopnja izraţanja najvišja pri 36 urah pri celicah

tretiranih z obema toksinoma in pri 12 urah samo pri s TcdB8864 tretiranimi celicami. Pri

ostalih časih je bila stopnja izraţanja gena lc3 dokaj izenačena, celo niţja pri 24 urah s

TcdB8864 tretiranimi celicami kot pri kontroli.



bec

n1

/ hg

adp

h

kont

rola

, 6 u

r

kont

rola

, 12

ur

kont

rola

, 24

ur

Tcd

BV

PI, 6

ur

kont

rola

, 36

ur

Tcd

BV

PI, 1

2 u

r

Tcd

BV

PI, 2

4 u

r

Tcd

BV

PI, 3

6 u

r

Tcd

B8

864

, 6 u

r

Tcd

B88

64

, 12

ur

Tcd

B88

64

, 24

ur

Tcd

B88

64

, 36

ur

B

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Slika 19. Stopnja izraţanja gena becn1 pri različnih časih inkubacije. Izraţanje gena smo določili s RT-

PCR. Pokazane so povprečne vrednosti razmerja becn1/hgadph. Uporabili smo podatke dveh neodvisnih

poskusov v dveh vzporednih ponovitvah.

Figure 19. Level of time-dependent expression from gene becn1. RT-PCR was used for gene expression.

Average becn1/hgadph ratio values are shown. Data from two independent experiments in parallel

repetitions are used.

Na sliki 19 so prikazane numerične vrednosti pomnoţenih genom becn1 in hgadph.

Statistično pomembne razlike v izraţanju izbranega gena pri različnih časih izpostavitve

celic TcdB tudi ni. V primeru gena becn1 je bila stopnja izraţanja najvišja pri 12 urah pri

celicah tretiranih s TcdBVPI in pri 6 urah pri celicah tretiranih TcdB8864. Pri 12 in 24 urah

s TcdBVPI, 8864 tretiranimi celicami je bila niţja stopnja izraţanja v primerjavi s kontrolo.

Pri 36 urah je bila stopnja izraţanja gena becn1 pri celicah tretiranih s TcdB izenačena z

netretiranimi celicami.



V našem eksperimentu smo celotno izolacijo ter obdelavo RNA izvajali istočasno in

enako za netretirane kot tretirane celice.

4.3.5 Inhibicija avtofagije s testom MTT

Če smo ţeleli ugotoviti odnos med TcdBVPI ali TcdB8864 in avtofagijo, smo morali

uporabiti zaviralce avtofagije, kot so vortmanin, 3-metiladenin in bafilomicin A1.

Zaviralci avtofagije so pokazatelji neposrednega odnosa med zaviranjem nastanka

avtofagnih vakuol in zmanjšano oziroma povečano sposobnostjo preţivetja celic.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

kon

trol

a

vort

man

in, 48

ur

3-m

etil

aden

in, 48 u

r

bafi

lom

icin

A1, 48

ur

votm

anin

, T

cdB

VP

I, 4

8 u

r

3-m

etil

aden

in, T

cdB

VP

I, 48 u

r

bafi

lom

icin

A1, T

cdB

VP

I, 48 u

r

vort

man

in, T

cdB

8864

, 48 u

r

3-m

etil

aden

in, T

cdB

8864

, 48 u

r

bafi

lom

icin

A1, T

cdB

8864

, 48 u

r

Tcd

BV

PI,

48 u

r

Tcd

B8

864,

48 u

r

viab

iln

ost

celi

c (%

)

Slika 20. Učinki TcdB in zaviralcev avtofagije na celično viabilnost. Celice HT-29 smo tretirali s 50 ng/ml

TcdBVPI ali TcdB8864 in z vortmaninom (20 μM), 3-metiladeninom (1 mM) ali bafilomicinom A1 (200 nM)

posebej in skupaj. Odstotek viabilnih celic smo ugotavljali po 48 urah s testom MTT. V histogramih je

prikazana standardna napaka treh neodvisnih eksperimentov. Sposobnost celičnega preţivetja netretiranih

celic smo ocenili kot 100 %.



Figure 20. Effect of TcdB and autophagy inhibitors on cell viability. HT-29 cells were treated with 50

ng/ml TcdBVPI or TcdB8864 and with worthmannin (20 μM), 3-methyladenine (1 mM) and baphylomycin

A1 (200 nM). The percentage of viable cells was determined after 48 hours exposure by MTT assay. Data

are expressed as mean ± SEM of at least three independent experiments. The viability of the untreated cells

was regarded as 100 %.

Avtofagija ni glavni del procesa inducirane citotoksičnosti in z zaviralci avtofagije

TcdBVPI, 8864 ne sproţita apoptoze (slika 20). Celice smo inkubirali 48 ur, saj smo v tem

času s pretočnim citometrom zaznali največ vakuol (slika 14).

Z uporabo siRNA smo utišali gen becn1 in njegovo izraţanje preverili z RT-PCR. Deleţ

viabilnih celic pa ocenili s testom MTT. Tako smo preverili vlogo beklina1 v celicah HT-

29 v prisotnosti TcdBVPI, 8864 in dobili dodaten vpogled v odnos med avtofagijo in

apoptozo.



0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

via

bil

no

st c

elic

(%

)

ko

ntr

ola

TcdB

VP

I, 2

4 u

r

siR

NA

, 2

4 u

r

siR

NA

, 4

8 u

r

TcdB

VP

I, 4

8 u

r

Tcd

B8

864

, 2

4 u

r

Tcd

B8

864

, 4

8 u

r

siR

NA

in T

cdB

VP

I, 2

4 u

r

siR

NA

in T

cdB

VP

I, 4

8 u

r

siR

NA

in

Tcd

B8

864

, 2

4 u

r

siR

NA

in T

cdB

8864

, 4

8 u

r

*** ** ** ***

Slika 21. Učinki TcdB in siRNA na celično viabilnost. S transfekcijo celic HT-29 smo prenesli siRNA (100

nM) za utišanje gena becn1. Celice smo tretirali s 50 ng/ml TcdBVPI ali TcdB8864 po 48 urah za 24 in 48 ur.

Deleţ viabilnih celic smo preverili s testom MTT. V histogramih je prikazana standardna napaka treh

neodvisnih eksperimentov. P vrednost nam pove, ali je razlika statistično značilna ali ne (*p<0.05,

p**<0.01, ***p<0.001). * označuje statistično pomembno odstopanje od kontrole. Sposobnost celičnega

preţivetja netretiranih celic smo ocenili kot 100 %.

Figure 21. Effect of TcdB and siRNA on cell viability. HT-29 cells was transfected for delivery of siRNA

to knockdown gene becn1. After 48 h cells were treated with 50 ng/ml of TcdBVPI or TcdB8864 for 24 and

48 h. The percentage of viable cells was determined by MTT assay. Data are expressed as mean ± SEM of

at least three independent experiments. A P value of <0.05 was considered statistically significant (*p<0.05,

p**<0.01, ***p<0.001). An asterisk indicates a statistically significant difference from the control. The

viability of the untreated cells was regarded as 100 %.

Citotoksični učinek se ne razlikuje med celicami, ki smo jih tretirali samo s holotoksinom

in celicami, ki smo jih tretirali s holotoksinom po transfekciji (slika 21).



4.4 UČINEK TcdB IN rec-TcdB3 NA CITOSKELET

Interakcije med molekulami aktina so v celici zelo dinamične. Porušenje aktinskega

citoskeleta povzroči lahko depolarizacijo mitohondrijske membrane, povečano tvorbo

ROS, aktivacijo kaspaz in celično smrt.

4.4.1 Reorganizacija aktina

Razporeditev fluorescenčno označenih aktinskih filamentov pri celicah tretiranih s

TcdBVPI in rec-TcdB3VPI, 8864 smo preverili s konfokalno mikroskopijo (slika 22).



KO

NT

RO

LA

Tcd

BV

PI

rec-

Tcd

B3 V

PI

rec-

Tcd

B3 88

64

APIKALNO BAZALNO

Slika 22. TcdB in rec-TcdB3 povzročita reorganizacijo aktinskih niti. Organizacija F-aktina pri kontrolnih

celicah in celicah, ki smo jih izpostavili TcdBVPI (50 ng/ml) in rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml).

Slike konfokalne mikroskopije kaţejo pravilno razporeditev F-aktina pri kontrolnih celicah na apikalni in

bazalni strani. Inkubacija s TcdBVPI (24 ur) povzroči uničenje in razkroj F-aktina tako na apikalni kot na

bazalni strani celic HT-29. Podobne učinke vidimo pri celicah, ki smo jih inkubirali z rec-TcdB3VPI in rec-

TcdB38864 (72 ur).



Figure 22. TcdB and rec-TcdB3 induced reorganization of actin filaments. F-actin distribution in control

cells or after TcdBVPI (50 ng/ml) and rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864 (100 μg/ml) exposure. Confocal

microscopic analysis reveals normal F-actin distribution in control epithelial monolayers at apical and basal

site. Incubation with TcdBVPI (24 h) induced disruption and disorganzation of F-actin in both the apical and

basal poles of HT-29 cells. Similar effects were observed following exposure to rec-TcdB3VPI and rec-

TcdB38864 exposure (72 h).

TcdB in obe rekombinantni domeni povzročita reorganizacijo aktinskih filamentov pri

celični liniji HT-29.

4.4.2 Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na protein tesnih stikov ZO-1

Rekombinantni vezavni domeni vplivata na razporeditev in strukturo proteina ZO-1. V

neobdelanih celicah je flourescenčni signal omejen na periferno območje citoplazme. V

primerjavi s kontrolnimi celicami je signal izrazitejši in večina signala je razpršena po

citoplazmi ali na večje skupke v citoplazmi (slika 23). Opazna je sprememba v velikosti

in obliki celice, ki bi lahko bila pogojena tudi z reorganizacijo aktinskih nitk.



KONTROLA TcdBVPI

rec-TcdB3VPI rec-TcdB38864

Slika 23. Vpliv TcdB in rec- TcdB3 na organizacijo ZO-1. Monosloj celic T84 smo inkubirali s TcdBVPI

(50 ng/ml) 24 ur in z rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 72 ur. TcdBVPI in rec-TcdB3VPI, 8864

vplivata na premestitev ZO-1.

Figure 23. Distribution of ZO-1 is influenced by TcdB in rec- TcdB3. T84 monolayers were incubated with

50 ng/ml TcdBVPI for 24 h or 100 μg/ml rec-TcdBVPI and rec-TcdB8864 for 72 h. TcdB and rec-TcdB3VPI, 8864

toxins exposure induced the displacement of ZO-1.

4.4.3 Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na transepitelno električno upornost (TEER) celic

T84

Z merjenjem TEER smo preverili, ali celice tretirane s TcdB in rec-TcdB3 poškodujejo

epitelij (slika 24).



0 0 ur 1 ura 2 uri 3 ure 4 ure 7 ur 24 ur

TE

ER

(%)

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

TcdBVPI

TcdB8864

A

0 0 ur 12 ur 24 ur 36 ur 48 ur 72 ur

TE

ER

(%)

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

rec-TcdB3VPI

rec-TcdB38864

B

Slika 24. Vpliv TcdB in rec-TcdB3 na TEER. Celice smo izpostavili TcdBVPI, 8864 (50 ng/ml) (A) in rec-

TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml) (B). Kontrolne celice niso bile izpostavljene toksinom. TEER smo merili 1, 2, 3,

4, 7, 12, 24, 36, 48, 72 ur po končani inkubaciji celic T84 s TcdBVPI, 8864 in rec-TcdB3VPI, 8864. Meritev smo

ocenili kot 100 % TEER kontrolnih celic ob vsakem času inkubacije.



Figure 24. Influence of TcdB in rec-TcdB3 on TEER. T84 were exposed to TcdBVPI, 8864 (50 ng/ml) (A) and

rec-TcdB3VPI, 8864 (100 μg/ml) (B). TEER was measured after a recovery time of 1, 2, 3, 4, 7, 12, 24, 36, 48,

72 h. The electrical resistance measurement indicate the level of tight junction integrity and is expressed as

a percentage of the resistance measurement in the untreated monolayer at a given time point.

Tako TcdBVPI, 8864 kot rec-TcdB3VPI, 8864 zniţata TEER.

4.5 VPLIV TcdB IN rec-TcdB3 NA IZRAŢANJE IL-8 V CELICAH HT-29

Zanimalo nas je, če TcdBVPI, 8864 in rec-TcdB3VPI, 8864 spodbudijo sintezo IL-8. Uporabili

smo dva različna inkubacijska intervala, 24 in 72 ur, pri netretiranih celicah in celicah, ki

smo jih tretirali s TcdB in rec-TcdB3. Koncentracije IL-8 (ng/ml) so prikazane na sliki 25.

kon

trol

a

Tcd

BV

PI

Tcd

B88

64

Tcd

BV

PI

Tcd

B88

64

IL-8

(n

g/m

l)

0

2

4

6

8

10

12

rec-

Tcd

B3 V

PI

kon

trol

a

rec-

Tcd

B3 V

PI

rec-

Tcd

B3 8

864

** *

*** *

24 ur 72 urre

c-T

cdB

388

64

Slika 25. TcdB in rekombinantna vezavna domena TcdB bakterije C. difficile sproţita izločanje IL-8.

Konfluentni monosloj celic HT-29 smo inkubirali s TcdBVPI in TcdB8864 (50 ng/ml) ter z rec-TcdB3VPI in

rec-TcdB38864 (100 μg/ml) 24 in 72 ur. V histogramih je prikazana standardna napaka dveh neodvisnih

eksperimentov s trikratno ponovitvijo. P vrednost nam pove, ali je razlika statistično značilna ali ne

(*p<0.05, p**<0.01, ***p<0.001). * označuje statistično pomembno odstopanje od kontrole.



Figure 25. TcdB and recombinant binding domain from C. difficile induce IL-8 release. HT-29 confluent

monolayers were incubated with TcdBVPI and TcdB8864 (50 ng/ml) or with rec-TcdB3VPI and rec-TcdB38864

(100 μg/ml) for 24 hours and 72 hours. Results are presented as mean ± SEM of two separate experiments

with triplicate determinations. A P value of < 0.05 was considered statistically significant (*p<0.05,

**p<0.01, ***p<0.001).

Koncentracije IL-8 so bile minimalne, ko celice niso bile izpostavljene TcdB ali rec-

TcdB3. Epitelne celice HT-29 so se najbolj odzvale ob prisotnosti rekombinantnega

proteina, ker sintetizirajo več IL-8 kot ob prisotnosti TcdB, ki pa je v obratnem

sorazmerju s citotoksičnim učinkom. Koncentracija IL-8 je bila povečana ob prisotnosti

TcdB, vendar nismo zaznali splošnega trenda povečanja količine IL-8. Če primerjamo

količino IL-8 v celicah HT-29, ki so bile izpostavljene TcdB ali rec-TcdB3 72 ur in

količino IL-8 v celicah, ki so bile izpostavljene samo celičnemu mediju, ugotovimo, da so

razlike v koncentraciji IL-8 statistično značilne (p<0.05) (slika 25).

Inkubacija celic TcdB oziroma rec-TcdB3 vpliva na povečanje sinteze IL-8.

4.6 HEMOLITIČNA AKTIVNOST BAKTERIJE C. difficile

4.6.1 Hemoliza β in sevi bakterije C. difficile

Pri izbranih sevih (podpoglavje 3.24) smo opazovali hemolizo na diferencialnih agarjih,

ki se med seboj razlikujejo po sestavi (tabela 6). Sevi delajo ozek pas hemolize na trdnem

gojišču Schaedler (slika 26). Poraslim kolonijam bakterijskega seva smo izmerili cono

hemolize in za nadaljnje testiranje uporabili tiste s premerom hemolize 2 mm. S

toksinotipizacijo smo potrdili izbrani sev bakterije C. difficile in pripravili supernatant

kulture.



Preglednica 6. Rezultati zaznavanja hemolize sevov bakterije C. difficile na gojiščih, ki se med seboj

razlikujejo po sestavi in občutljivosti za hemolizo.

Table 6. Results from hemolytic perception by strains from bacteria C. difficile, growing on media with

different structure and sensitivity for hemolysis.

gojišče KA COH KA za ET Schaedler

izbrani sevi bakterije

C. difficile

AT 11 - - - ++

AT 25 - - - +

AT 30 - - - +

C23 - - - +

ZZV07-584 - - - +

ZZV07-585 - - - +

- (brez cone hemolize), + (cona hemolize, 2r = 0,8 do 1 mm), ++ (močna cona hemolize, 2r = 2 mm)

- (no hemolysis), + (hemolysis), ++ (strong hemolysis)

Slika 26. Netoksinogeni sev bakterije C. difficile C23 (levo) in toksigeni sev AT11 (desno) tvorita na

agarju po Schaedlerju pas hemolize (2r=2mm). Čisti kulturi smo inkubirali 3 dni pri anaerobnih pogojih in

37°C.

Figure 26. Nontoxinogenic C. difficile strain C23 (left) and toxigenic strain AT11 (right) with hemolysis

zone on Schaedler agar (2r=2mm). Pure cultures were incubated for 3 days anaerobically at 37°C.

4.6.2 Hemolitična aktivnost supernatanta kulture

Test vpliva temperature, eritrocitov in dodatkov (holesterol, proteinaza K, cistein) na

hemolitičnost je prikazan v preglednici 7. Z uvodnimi optimizacijskimi poskusi smo

pridobili osnovne informacije o medsebojni odvisnosti zgoraj naštetih dejavnikov za

nadalnji postopek testiranja hemolize.



Preglednica 7. Različni pogoji za hemolitično aktivnost supernatanta kulture.

Table 7. Different conditions of supernatant hemolytic activity.

supernatant kulture in

POGOJI OPTIMIZACIJE A B C D E F G H I J

holesterol (1 mg/ml v EtOH, Sigma) - - - - - - - - + +

proteinaza K (0,01 mg/ml, Sigma) + - - - + - - + + -

cistein (5 mM, pH=7,6, Sigma) + + + + - - - - + +

inkubacija pri T=22°C, 30 min + - + + + + + + + +

inaktivacija pri T=95°C, 2uri + - - + - - + + + -

eritrociti + + + + + + + + + +

inkubacija pri T=37°C, 1 ura + + + + + + + + + +

centrifugiranje (5 min, 4000 obr/min) + + + + + + + + + +

hemolitičnost DA DA DA DA NE NE NE NE DA DA

Na izbranem grafu (slika 27) smo pokazali vpliv cisteina in temperature na hemolitičnost

pod pogoji, ki so najboljše vplivali na rezultate izmerjene hemolitične aktivnosti pri

testiranih supernatantih kulture.



200 obr/min, 3 min200 obr/min, 3 min200 obr/min, 3 min200 obr/min, 3 mincentrifugiranje

1 ura / 37° C1 ura / 37° C1 ura / 37° C1 ura / 37° Cinkubacija

125μl 2 % suspenzije

ovčjih eritrocitov


ovčjih eritrocitov


ovčjih eritrocitov


ovčjih eritrocitov

eritrociti

2 uri / 95° C2 uri / 95° C--inkubacija

125μl-125μl-cistein

125μl125μl125μl125μlsupernatant

DCBA

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6A

450

AT11 AT25 AT30 C23 ZZV07-584 ZZV07-585 - kontrola + kontrola

A

B

C

D

Slika 27. Izbrani pogoji, s katerimi smo ugotavljali hemolitično aktivnost supernatantov izbranih sevov

bakterije C. difficile. Primerjalne vrednosti testiranih sevov, z uporabljenim pufrom 5 mM TRIS-om, 5 mM

cisteinom in 0,85 % NaCl-om (pH = 7,6) in 2 % suspenzijo eritrocitov, pod pogoji A, B, C, D z negativno

in s pozitivno kontrolo po izmerjeni A450.

Figure 27. Hemolytic activity of supernatans from choosen strains of C. difficile under different conditions.

Under conditions A, B, C, D values of tested strains, in 5 mM TRIS, 5 mM cystein and 0,85 % NaCl buffer

(pH = 7.6) and 2 % erythrocite suspension, were compaired with negative and positive control after A450.

Iz pozitivnih rezultatov z dodanim cisteinom lahko sklepamo na pomen cisteina pri

hemolitični aktivnosti.



4.7 ŢIVALSKI MODEL NEVRETENČAR C. elegans

Pri C. elegans smo po inkubaciji s sporami baketrije C. difficile ali po inkubaciji s

supernatantom kulture opazovali spremembo gibanja, odziv ob dotiku in morfološke

spremembe črevesja pod svetlobnim mikroskopom.

4.7.1 Učinki TcdB in supernatantov sevov C. difficile na C. elegans

Gibanje in obnašanje C. elegans , ki smo jih izpostavili holotoksinu B in supernatantom

toksigenih sevov 630, VPI in R12078 je bilo nespremenjeno in enako kot pri nematodih,

ki smo jih izpostavili osnovnemu mediju NGM ali BHI, kot tudi supernatantu

netoksinogenega seva C23.

Da bi zagotovili čim večjo zanesljivost testa, so bili nevretenčarji izpostavljeni

supernatantom kulture in osnovnemu mediju v sedmih neodvisnih ponovitvah.

4.7.2 Učinki sevov bakterije C. difficile na C. elegans

12 dni smo opazovali 50 do 100 nematodov na agarju NGM s sporami bakterije C.

difficile. Zabeleţili smo 40 % mrtvih nematodov, ki so bili izpostavljeni sporam

hipervirulentnega seva R12078, 10 do 20 % mrtvih nematodov, ki so bili izpostavljeni

sporam sevov 630 in VPI. Na agarju NGM s sporami netoksinogenega seva C23 so bili

vsi nematodi ţivi.



5 RAZPRAVA IN SKLEPI

5.1 RAZPRAVA

Toksina TcdA in TcdB bakterije C. difficile sta najpomembnejša virulenčna dejavnika za

OCD. Toksično delovanje toksinov je posledica modifikacije majhnih GTPaz, na katere

deluje encimska N-terminalna domena.

Po opravljenih študijah lahko sklepamo, da do sedaj odkriti mehanizem delovanja TcdA

in TcdB ni edini, ampak da obstajajo še drugi mehanizmi delovanja toksina TcdA in

predvsem toksina TcdB.

Pri toksinu TcdB ima rekombinantni protein N-terminalni katalitični del enake lastnosti

kot cel protein. Da bi preučili vlogo domen, predvsem pa, da bi določili funkcijo

rekombinantnega vezavnega proteina C-terminalne domene toksina B, smo ugotavljali

učinke rekombinatne vezavne domene toksina B referenčnega seva VPI 10463 in

variantnega seva 8864 ter ju primerjali s holotoksinom.

Prvič smo pokazali, da C-terminalna vezavna domena toksina TcdB vpliva na različne

celične dogodke pomembne za razvoj bolezenskih znakov, kot so toksičnost, epitelijska

barierna disfunkcija in produkcija interlevkina-8.

Delo je tudi prva raziskava o delovanju holotoksina B, ki sproţi avtofagocitozo.

5.1.1 Novi mehanizmi delovanja ţe znanih toksinov

Virulenca se med bakterijskimi sevi razlikuje in je odvisna od celotnega spektra

virulenčnih dejavnikov, ki so pri določenemu sevu prisotni. Predpostavljamo, da so

mehanizmi toksičnosti pri visokovirulentnih sevih C. difficile posledica tako delovanja ţe

znanih toksinov kot tudi delovanja novih toksinov.



Eksponentno narašča število bakterijskih toksinov, ki z vezavo na receptorje

mitohondrijske membrane povzročijo apoptozo in med temi tudi toksin TcdB kot pro-

apoptotični faktor sproţi proces apoptoze z vezavo na receptorje mitohondrijske

membrane v intestinalnih celicah (Matarrese in sod., 2007). Prav zato je bilo za nadaljnje

raziskovanje pomembno, ali TcdB lahko deluje kot pro-apoptotični faktor na gostiteljeve

celice z vezavo C- terminalne receptorske vezavne podenote na celični receptor ter, ali je

ta lastnost pri variantnem sevu s TcdB močneje izraţena.

5.1.1.1 Celična smrt - apoptoza, nekroza ali avtofagija

V populaciji celic je apoptoza neusklajena. Pri enih se sproţi prej kot pri drugih in tudi

časovni razpon za izvršitev procesa je od celice do celice različen. Pri nekaterih traja le

30 minut, pri drugih pa celo nekaj dni (Collins in sod., 1997; Willingham, 1999).

Toksini s svojim delovanjem posegajo v določene fiziološke procese celic. Ena izmed

moţnih mehanizmov toksičnosti je njegov vpliv na apoptozo. Apoptozo v sesalski celici

sproţijo različni zunajcelični ali znotrajcelični signali (Lockshin in Zakeri, 2004).

Toksina TcdBVPI in TcdB8864 sproţita apoptozo (Fiorentini in sod., 1998; Mahida in sod.,

1998; Warny in Kelly, 1999; Brito in sod., 2002; Hippenstiel in sod., 2002; Qa'Dan in

sod., 2002; Liu in sod., 2003; Le in sod., 2005; Carneiro in sod., 2006) ali nekrozo (Voth

in Ballard, 2005; Kim in sod., 2006; Huelsenbeck in sod., 2007). Podobno smo opazili pri

rekombinantni C-terminalni domeni. Apoptotične celice so bile številnejše po tretiranju s

celim toksinom TcdBVPI. Medtem ko smo visok odstotek nekrotičnih celic opazili po

tretiranju s TcdB8864 in rec-TcdB38864 kot tudi z rekombinantnim proteinom rec-TcdB3VPI

(slika 5). Oba rekombinantna proteina po 72 urah inkubacije aktivirata kaspazo-3, kar

pomeni, da lahko sproţita od kaspaze odvisno pot. Zaradi encimske razgraditve PARP-1

(slika 8) preko aktivirane kaspaze-3 smo dodatno potdili aktivnost kaspaze-3.

Ključna vprašanja o vlogi mitohondrija v apoptozi in nekrozi ostajajo. Vloga

mitohondrijev pri celični smrti je povezana s kontrolo mitohondrijske morfologije.



Mitohondriji so tudi glavni proizvajalci ROS in so glavne tarče za oksidativno poškodbo.

ROS se sproščajo med normalnim celičnim metabolizmom. V normalnih razmerah rasti

so endogeni antioksidativni obrambni sistemi dovolj učinkoviti, da obdrţijo količino ROS

na neškodljivi ravni. Kadar pride do porušenja ravnoteţja med tvorbo ROS in

antioksidantov nastopi oksidativni stres (Betteridge, 2000).

Toksin TcdB kot pro-apoptotični faktor sproţi proces apoptoze z vezavo na receptorje

mitohondrijske membrane v intestinalnih celicah in povzroči hiperpolarizacijo ali

depolarizacijo mitohondrijske membrane (Matarrese in sod., 2007).

Pomembni ključni dejavniki, ki urejajo MMP vključujejo kalcij in prisotne reaktivne

kisikove spojine (ROS). Prisotnost reaktivnih kisikovih spojin smo zato preverili pri

celicah tretiranih z rec-TcdB3VPI, 8864.

Po dobljenih rezultatih kot so nizek membranski potencial (slika 10), neaktivnost kaspaze

9, minimalna produkcija ROS (slika 11-13) sklepamo, da rekombinantni vezavni domeni

rec-TcdB3VPI, 8864 ne sproţita apoptoze ali nekroze preko mitohondrijev.

Ker poznamo dva procesa nadzorovane celične smrti, apoptozo in avtofagijo, smo zato v

raziskovalnem delu ţeleli preveriti vpliv holotoksina B in njegove rekombinantne

domene na še drugem strogo nadzorovanem biološkem procesu. Nedavne raziskave

namreč kaţejo na ključno vlogo avtofagije pri številnih različnih boleznih (Levine in

Kroemer, 2008).

Avtofagija je proces, v katerem celica odstranjuje izrabljene celične strukture in proste

radikale, ki poškodujejo celico. Povezana je z apoptozo, lahko jo prepreči ali sproţi.

Celice jo lahko izkoristijo za svoje preţivetje in se zaščitijo pred apoptozo.

Celice s številnimi kislimi vakuolami, lizosomi in avtofagosomi so zelo dovzetne za

avtofagijo. S pretočnim citometrom in konfokalno mikroskopijo smo opazili številne

vakuole v celicah, ki so bile tretirane s holotoksinoma (slika 14).

Z nadaljnjimi poskusi (slika15-21) smo zato ugotavljali, ali holotoksina sproţita

avtofagijo kot primarno obliko celične smrti.



Z mikrotubuli povezan protein lahke verige 3 (LC3) je glavni sestavni del avtofagosoma

in se uporablja kot poseben marker za avtofagijo (He in sod., 2000). Pretvorba LC3 v

obliki LC3 I in LC3 II ter njuno razmerje se uporablja za spremljanje avtofagocitoze. Z

metodo Western blot smo potrdili prisotnost proteina LC3 (slika 16). Z RT-PCR smo

preverili tudi izraţanje gena lc3 (slika 18).

Nedavna raziskava je potrdila pomembno vlogo lizosoma pri regulaciji apoptoze.

Lizosomi vsebujejo prebavne encime in sodelujejo pri celični prebavi. Encimi lizosoma

lahko poškodujejo membrano lizosoma in vsebina lizosoma se izlije v citosol, kar sproţi

apoptozo (Boya in Koemer, 2008). Ugotavljali smo, ali TcdB sproţi izločanje katepsina

B in s tem njegovo sodelovanje pri celični smrti. Katepsin B je odgovoren za lokalno

rušenje membrane, kar je eden izmed zgodnjih morfoloških znakov aktivne celične smrti.

Predpostavljamo, da je katepsin B (slika 17) lahko udeleţen v procesu avtofagije, ki

celice ščiti pred apoptozo, če le-te niso preveč poškodovane oziroma vzpodbudi apoptozo

zaradi posledično aktiviranih vseh znotrajceličnih mehanizmov. Prav tako ne smemo

izključiti moţnosti, da je katepsin B ostal v lizosomih, njegova prisotnost je lahko

posledica poškodovane membrane lizosoma med pripravo celega celičnega lizata in ne

zaradi poškodovane membrane lizosoma, ki jo povzročita toksina.

Razgradnja celičnih proteinov preko avtofagosomne-lizosomske poti je pomembna in

poteka pod nadzorom, a je lahko pomanjkljiva v tumorskih celic.

Avtofagijo sproţi tudi prekomerno izraţen beklin1, ki se veţe na PI3KC3 ali Bcl-X (L),

da se oblikujejo kompleksi beklin 1-PI3KC3 ali beklin1-Bcl-X (L), ki so neodvisni drug

od drugega (Wang, 2008). Beklin 1 ima zato pomembno vlogo pri usklajevanju

znotrajcelične signalizacije. Z RT-PCR smo zato preverili izraţanje gena becn1 (slika

19).

Opazili smo, da so bile kontrolne celice (celice brez prisotnosti toksina) bolj dovzetne za

izraţanje avtofagnih genov lc3 in becn1. Prav tako nismo potrdili avtofagije s testom

MTT (slika 20, 21), kjer smo z inhibitorji avtofagije in transfekcijo testiranih celic ţeleli

sproţiti apoptozo kot dokaz, da celice ne morejo vključiti avtofagije, če inhibiramo njeno



funkcijo. Za te razlike je moţnih več vzrokov, kljub temu da smo poskuse vedno izvajali

na enak način in pri enakih pogojih. Biokemijsko stanje celic se morda razlikuje v

posameznih pasaţah. Prav tako je mogoče, da antiapoptotični protein Bcl-2 sodeluje s

ključnim proteinom avtofagije, beklinom1. Vendar pa je malo znanega o funkcionalnem

pomenu tega sodelovanja. Pattingre in sodelavci (2005) so pokazali, da Bcl-2 ne deluje le

kot antiapoptotični, ampak tudi kot avtofagosomni zaviralni protein preko svojega

sodelovanja z beklinom1. Ta funkcija Bcl-2 lahko pomaga ohranjati avtofagijo na ravneh,

ki so zdruţljivi za preţivetje celice, ne pa za smrt celice.

Zelo verjetno pa je, da lahko avtofagija v pozni fazi spodbudi nekatere signale, da

sproţijo mitohondrijsko membransko in lizosomsko permeabilizacijo (slika 14, 15), ki so

hkrati vključeni v celično smrt.

5.1.2 C-terminalna vezavna domena toksina B vpliva na prerazporeditev aktinskih

filamentov in ZO-1

Citoskelet povezuje kakovostno različna območja v celici in predstavlja ogrodje za

specifično mikrolokalizacijo sporočilnih molekul v celici. Odziv, ki ga povzroči določen

signal v celici, je zato kompleksen in lahko vključuje spremembe v celični polarnosti,

spremembe pri oblikovanju citoplazemskih podaljškov, pri vzpostavljanju in prekinjanju

proteinsko-proteinskih povezav. Zaradi tega se mu pripisuje pomembna vloga pri prenosu

sporočila v celici in za funkcionalno povezavo med aktinskim filamentom in proteini

tesnega stika.

Toksini prehajajo iz apikalne na bazolateralno stran enterocitov trancelularno (skozi

celico) ali paracelularno (med celicami), kar povzroči razdor tesnih stikov celice in padec

transepitelijske električne upornosti (TEER). TEER je merilo za prepustnost tesnih stikov

celic in integriteto monosloja ter pogost način spremljanja vpliva bakterijskih toksinov na

epitelne celice v pogojih in vitro.

Holotoksin B zniţa TEER (Lawrence in sod., 1997) in vpliva na strukturo in funkcijo

proteinov tesnih stikov (Nusrat in sod., 2001). Posledica tega sta prerazporeditev

aktinskih filamentov in porušenje tesnih stikov med celicami.



Z opravljenimi poskusi na monosloju epitelijskih intestinalnih celicah T84 smo pokazali,

da tudi rekombinantni domeni rec-TcdB3VPI in rec-TcdB38864 ireverzibilno spremenita

transepitelijsko upornost (TEER) (slika 24). Ob prisotnosti holotoksinov kot tudi

rekombinantih vezavnih domen toksina B je prišlo do zniţanja TEER, kar je posledica

prerazporeditve aktinskih filamentov in porušenja tesnih stikov med celicami.

Tesni stiki vzpostavljajo in vdrţujejo tkivno bariero med različnimi sistemi v organizmu.

Transmembranski protein ZO-1 sodeluje pri povezavah med sosednjimi celicami ter

celicami in zunajceličnim matriksom. Veţe se na aktinski citoskelet. Prisotnost TcdB in

rec-TcdB3 povzroči reorganizacijo aktina (slika 22) v celicah in spremembe v

razporeditvi ZO-1 (slika 23) ter zmanjša povezanost ZO-1 z F-aktinom, ki je osrednjega

pomena za njegovo delovanje. V celicah, ki so bile izpostavljene TcdBVPI in rec-

TcdB3VPI, 8864 se je ZO-1 preoblikoval v tanjše in nepravilne strukture, ki se razlikujejo od

pravilne razporeditve ZO-1 v kontrolnih celicah.

5.1.3 Motena regulacija imunskega sistema

Epitelne celice delujejo kot prva obrambna linija, kjer se sproţi lokalni imunski odziv. Ta

odziv vključuje tudi povečano sintezo vnetnih citokinov, predvsem interlevkina 8 (IL-8).

Dobro poznano je, da tako toksin B kot A sproţita izločanje IL-8 iz intestinalnih celic

(Savidge et al., 2003). Povečana sinteza IL-8 je bila opisana pri pacientih s kolitisom

(Steiner et al., 1997).

Pokazali smo, da obe rekombinantni vezavni domeni TcdB sproţita imunski odgovor.

Podoben učinek je bil opisan za rekombinantni protein N-terminalne encimske domene

toksina A (Yeh et al., 2008).

Preverili smo, če v celicah lahko spodbudimo in zaznamo izločanje interlevkina 8. Merili

smo koncentracijo IL-8 po stimulaciji z rekombinantnima vezavnima domenama kot s

holotoksinoma. Zanimala nas je predvsem razlika v količini IL-8. Videli smo, da so

celice izdelale manj IL-8, ko so bile inkubirane s holotoksinom (slika 25). Rezultate bi



lahko pojasnili z visoko citotoksičnostjo TcdBVPI, 8864 ţe znotraj 24 ur, medtem ko je

toksičnost pri rec-TcdB3VPI, 8864 najbolj opazna po 72 urah (slika 3).

S temi poskusi smo dokazali, da sta imunski odgovor in izločanje IL-8 lahko posledica

dodatnega mehanizma preko katerega deluje C-terminalna vezavna domena. Zato je zelo

verjetno povezana z vnetjem, diarejo in nekaterimi drugimi bolezenskimi znaki črevesja v

patofiziologiji OCD.

5.1.4 C. difficile in hemolitična aktivnost

Bakterije iz rodu Clostridium pogosto delajo več različnih toksinov, sevi Clostridium

perfringens npr. lahko izdelujejo kar 12 različnih toksinov. Posamezni toksini te vrste so

znani kot hemolizini, njihov učinek namreč ocenjujemo na sposobnost lize rdečih krvničk.

Pri C. difficile so zaenkrat opisani trije toksini, a nobeden od njih ni bil povezan s

hemolitično aktivnostjo. Naši rezultati kaţejo (slika 26), da so med sevi bakterije C.

difficile takšni, ki celice lizirajo.

Med uporabljenimi sevi smo naredili selekcijo sevov, ki povzročijo lizo eritrocitov in

optimizirali laboratorijske pogoje za izraţanje hemolitične aktivnosti. S preizkušanjem

različnih testnih sistemov za analizo hemolize smo izbrali tistega (slika 27), s katerim

lahko zanesljivo določamo hemolitično aktivnost testiranih sevov.

Ţelimo ugotoviti, da je hemoliza posledica delovanja novega toksina, ki bi bil lahko glede

na mehanizem delovanja ali encimska beljakovina, fosfolipaza, ki hidrolizira fosfolipide

v citoplazemski membrani in jo tako poškoduje, ali strukturna beljakovina, ki se vgradi v

citoplazemsko membrano in oblikuje pore (preglednica 7). Z izolacijo proteinske frakcije

s hemolitično aktivnostjo iz supernatanta bakterijskih kultur bomo poskušali ovrednotiti

njihovo funkcijo in ugotoviti od česa je odvisna, analizirati biokemijske lastnosti proteina

in ugotoviti specifičnost vezave.

Razlog, da so bili ti toksini do sedaj neodkriti je lahko izjemno nizka prevalenca med sevi,

ki trenutno kroţijo v humani in ţivalski populaciji. Prav tako preliminarni poizkusi

kaţejo, da je izraţanje hemolitične aktivnosti pri posameznem sevu variabilno.



5.1.5 Ţivalski model nevretenčar C. elegans

Po začetnih opaţanjih vloge toksinov v patogenezi pri hrčkih se je začelo iskanje enakih

sprememb še pri drugih organizmih, in sicer so kot model vključili zebrice (Qa'Dan in

sod., 2002). Naš modelni organizem je bil mikroskopsko majhen večcelični evkariont C.

elegans, ki se je izkazal kot neprimeren za študije virulenčnega potenciala pri toksigenih

sevih.

Ker so dosedaj raziskovali virulentnost pri bakteriji Staphylococcus aureus (Wu in sod.,

2009) in bakteriji Pseudomonas aeruginosa (Tan in sod., 1999), in vivo dobljene rezultate

z uporabo ţivalskega modela nevretenčarja C. elegans teţko primerjamo z literaturo.

5.2 SKLEPI

Večina testov je zasnovanih na predpostavki, da je neprekinjena, nepoškodovana celična

membrana znak za ţivo celico.

Predpostavlili smo moţnost reverzibilne avtofagije, ki jo sproţita TcdBVPI in TcdB8864, ki

celicam omogoči daljšo zaščito pred celično smrtjo.

Rekombinantni vezavni domeni rec-TcdB3VPI,8864 z vezavo na intestinalne epitelijske

celice delujeta toksično in pri celicah sproţita apoptozo oziroma nekrozo, vplivata na

reorganizacijo aktinskih filamentov in protein tesnih stikov ter vzpodbudita imunski

odziv.

Vezavna domena toksina B ima lahko odločilno vlogo na številne učinke funkcionalnih

domen toksina pri uspešni mikrobni infekciji.

Med sevi bakterije C. difficile so nekateri toksigeni kot tudi netoksinogeni sevi, ki

povzročijo lizo eritrocitov in imajo hemolitično aktivnost.



Preizkusili smo model nevretenčarja C. elegans za študij toksičnih učinkov izoliranega

toksina B (TcdBVPI, 8864) oziroma supernatantov različnih sevov C. difficile in virulence

sevov C. difficile.



6 POVZETEK

Večina toksigenih sevov C. difficile sintetizira toksin A (TcdA) in/ali toksin B (TcdB), ki

sta glavna dejavnika virulence.

Glavni mehanizem trenutno znanega delovanja toksina TcdA in TcdB je vezan na

encimsko funkcijo katalitične N-terminalne domene, ki z modifikacijo in inaktivacijo

majhnih GTP vezavnih proteinov povzroči depolimerizacijo F-aktina, porušenje

citoskeleta in zaokroţanje celic, medtem ko je vezavna domena odgovorna za vezavo na

celične receptorje in vnos v celico.

Po drugi strani lahko imata ţe znana toksina TcdA in TcdB raznolike in nove načine

delovanja na gostiteljsko celico, kar še posebej velja za t.i. variantne toksine. Pri teh sevih

sta gena tcdA in tcdB spremenjena in sevi s spremenjenimi toksinskimi geni so ţe

pripomogli k novim pogledom na vlogo toksinov v patogenezi in pri določanju toksičnih

predelov toksina B.

Glavni cilji, ki smo si jih postavili, so bili (i) ugotoviti prisotnost do sedaj neznanih

dejavnikov virulence (toksinov) pri C. difficile, (ii) ugotoviti moţne nove mehanizme

delovanja toksinov TcdA in TcdB pri ţe znanih variantnih sevih (toksinotipih), (iii)

natančneje določiti vlogo C- terminalne vezavne domene toksina B v patogenezi in

ugotoviti, ali so lastnosti rekombinantne vezavne domene pri variantnem sevu močneje

izraţene ter (iv) preveriti ali je nevretenčarski ţivalski model primeren za študij virulence.

Uporabili smo rekombinantno vezavno domeno rec-TcdB3 dveh različnih sevov

(referenčni laboratorijski C. difficile sev VPI 10463 in variantni sev 8864).

Rekombinantni protein smo pripravili v GST-2 ekspresijskem sistemu in kot kontrolo

uporabljali holotoksine TcdB referenčnega seva VPI 10463 in variantnega seva 8864.

Za in vitro študije interakcij med črevesnimi epitelnimi celicami in bakterijskimi toksini

smo uporabili rakavi celični liniji epitelnih celic črevesja T84 in HT-29, ki imajo

ohranjene strukturne in funkcionalne lastnosti posameznih tipov črevesnih epitelnih celic.



Z različnimi metodami pretočne citometrije smo spremljali celični cikel celice, celično

viabilnost in obliko celične smrti ter tako pridobili čimveč informacij o karakteristikah

celic T84 in HT-29.

Pokazali smo, da imata rekombinantna proteina podoben učinek na celično smrt kot

holotoksina. V celicah sproţita apoptozo, ki je od kaspaze odvisna, oziroma nekrozo.

Spremenjen elektrokemijski gradient preko mitohondrijske membrane je eden od

zgodnjih dogodkov med apoptozo. Z oceno znotrajcelične oksidacije pa nismo potrdili,

ali je celična smrt povezana s tvorbo prostih kisikovih spojin in neposredno z

mitohondriji.

Holotoksina TcdBVPI in TcdB8864 aktivirata še tretjo obliko celične smrti, to je avtofagijo.

Tukaj opisujemo avtofagijo kot prvo zaščito celice pred delovanjem holotoksina. Glede

na to, da sta toksina močna citotoksina, ki celice zelo poškodujeta in sproţita apoptozo

oziroma nekrozo. Z metodo RT-PCR nismo potrdili pričakovanega vpliva TcdB na

izraţanje izbranih genov, ki sodelujejo v avtofagiji.

S konfokalno mikroskopijo, z merjenjem transepitelne električne upornosti in primerjavo

z znanim učinkom holotoksinov na citoskelet smo pokazali, da tudi rec-TcdB3VPI, 8864

vplivata na prerazporeditev aktinskih filamentov in transmembranski protein ZO-1, ki

sodeluje pri povezavah med sosednjimi celicami in zunajceličnim matriksom.

Prav tako rekombinantni vezavni domeni spodbudita sproščanje vnetnega citokina IL-8,

ki modulira imunski odgovor. Dolgotrajna prisotnost rec-TcdB3 zato lahko ima za

posledico kaskado vnetnih odzivov in sproščanje še drugih mediatorjev vnetja.

Nekateri sevi bakterije C. difficile povzročijo hemolizo, razpad membrane eritrocitov in

posledično sproščanje hemoglobina ter ostalih komponent eritrocitov v okolje.

Karakterizirali smo jih na diferencialnem krvnem agarju, kjer so hemolitični sevi

povzročili lizo eritrocitov, kar smo opazili kot območje zbistritve okrog kolonij, in z

merjenjem hemolitične aktivnosti.



Molekularni in fiziološki mehanizmi, ki so vpleteni v procese morfoloških sprememb

celice v prisotnosti toksina B in rekombinantne vezavne domene toksina B ostajajo

predmet nadaljnjih raziskav. Tudi za hemolitične seve, ki so ţe pripomogli k novim

pogledom na vlogo toksinov v patogenezi in pri določanju novih virulentnih dejavnikov,

je pomembno pravilno ovrednotenje rezultatov hemolitične aktivnosti sevov. Na osnovi

naših rezultatov lahko sklepamo, da je nematod C. elegans neprimeren za študije

virulenčnega potenciala variantnih sevov. Vendar so za dokaz potrebne še dodatne

klinične študije na nevretenčarskem ţivalskem modelu.



7 VIRI

Al-Barrak A., Embil J., Dyck B., Olekson K., Nicoll D., Alfa M., Kabani A. 1999. An outbreak of toxin A

negative, toxin B positive Clostridium difficile-associated diarrhea in a Canadian tertiary-care hospital.

Canada Communicable Disease Report, 25:65-69.

Alfa M.J., Kabani A., Lyerly D., Moncrief S., Neville L.M., Al-Barral A., Harding G.H.K., Dyck B.,

Olekson K., Embil J.M. 2000. Characterization of a toxin A-negative, toxin B-positive strain of Clostridium

difficile responsible for nosocomial outbreak of Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical

Microbiology, 38:206-2714.

Alouf J.E. 2006. Paradigms and classification of bacterial membrane-damaging toxins. V:The Source Book

of Bacterial Protein Toxins (Alouf J.E. and Popoff M.R., eds), Elsevier Academic press, Amsterdam,

26:507-515.

Alouf J.E., Billington S.J., Jost B.H. 2006. Repertoire and general features of the family of cholesterol-

dependent cytolysins.V: The Source Book of Bacterial Protein Toxins (Alouf J.E., Popoff M.R., eds),

Elsevier Academic press, Amsterdam, 36:643-654.

Amimoto K., Noro T., Oishi E., Shimizu M. 2007. A novel toxin homologous to large clostridial cytotoxins

found in culture supernatant of Clostridium perfringens type C. Microbiology, 153(Pt 4):1198-206.

Anderluh G., Lakey J.H. 2008. Disparate proteins use similar architectures to damage membranes. Trends

in Biochemical Sciences, 33(10):482-490.

Aktories K., Just I. 1995. Monoglucosylation of low-molecular-mass GTP binding Rho proteins by

clostridial cytotoxins. Trends Cell Biology, 5:441-443.

Aktories K. 1997. Rho proteins: Targets for bacterial toxins. Trends in Microbiology, (5): 282-288.

Barth H., Aktories K., Popoff M.R., Stiles B.G. 2004. Binary bacterial toxins: biochemistry, biology, and

applications of common Clostridium and Bacillus proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews,

68(3):373-402.

Barloy F., Lecadet M.M., Delecluse A. 1998. Cloning and sequencing of three new putative toxin genes

from Clostridium bifermentans CH18. Gene, 211:293-299.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Amimoto%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Noro%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oishi%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shimizu%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.sciencedirect.com/science/journal/0966842X



Bartlett J.G., Gerding D.N. 2008. Clinical Recognition and Diagnosis of Clostridium difficile Infection.

Clinical Infectious Diseases, 46:S12–S18.

Bette P., Oksche A., Mauler F., von Eichel-Streiber C., Popoff M.R., Habermann E. 1991. A comparative

biochemical, pharmacological and immunological study of Clostridium novyi alpha-toxin, C. difficile toxin

B and C. sordellii lethal toxin. Toxicon, 29(7): 877-887.

Betteridge D.J. 2000. What is oxidative stress? Metabolism, 49(2 Suppl 1):3-8.

Bongaerts G.P., Lyerly D.M. 1994. Role of toxins A and B in the pathogenesis of Clostridium difficile

disease. Microbial Pathogenesis, 17(1):1-12.

Borriello S.P., Wren B.W., Hyde S., Seddon S.V., Sibbons P., Krishna M.M., Tabaqchali S., Manek S.,

Price A.B. 1992. Molecular, immunological, and biological characterization of a toxin A-negative, toxin B-

positive strain of Clostridium difficile. Infection and Immunity, 60:4192-4199.

Boquet P., Munro P., Fiorentini C., Just I. 1998. Toxins from anaerobic bacteria: specifity and molecular

mechanism of action. Current Opinion in Microbiology, 1:66-74.

Braun V., Hundsberger T., Leukel P., Sauerborn M., von Eichel-Streiber C. 1996. Definition of the single

integration site of the pathogenicity locus in Clostridium difficile. Gene, 181(1-2): 29-38.

Boya P., Kroemer G. 2008. Lysosomal membrane permeabilization in cell death. Oncogene, 27:6434-6451.

Britto G.A.C., Fujji J., Carneiro B.A., Lima A.A.M., Obrig T., Guerrant R.L. 2002. Mechanism of

Clostridium difficile toxin A-induced apoptosis in T84 cells. Journal of Infectious Diseases, 186:1438-1447.

Brun P., Scarpa M., Grillo A., Palu G., Mengoli C., Zecconi A., Spigaglia P., Mastrantonio P., Castagliuolo

I. 2008. Clostridium difficile TxAC314 and SLP-36kDa enhance the immune response toward a

coadministered antigen. Journal of Medical Microbiology, 57:725-731.

Carman R.J, Wilkins T.D. 1991. In vitro susceptibility of rabbit strains of Clostridium spiroforme to

antimicrobial agents. Veterinary Microbiology, 28(4):391-7.

Carneiro B.A., Fujii J., Britto G.A., Alcantara C., Oria R.B., Lima A.A., Obrig T., Guerrant R.L. 2006.

Caspase and Bid involvement in Clostridium difficile toxin A-induced apoptosis and modulation of toxin A

effects by glutamine and alanyl-glutamine in vivo and in vitro. Infection and Immunity, 74:81-87.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bongaerts%20GP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lyerly%20DM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carman%20RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wilkins%20TD%22%5BAuthor%5D



Carter G.P., Lyras D., Allen D.L., Mackin K.E., Howarth P.M., O'Connor J.R., Rood J.I. 2007. Binary

toxin production in Clostridium difficile is regulated by CdtR, LytTR family response regulator. Journal of

Bacteriology, 189(20): 7290-7301.

Castagliuolo I., Sardina M., Brun P., DeRos C., Mastrotto C., Lovato I., Palu G. 2004. Clostridium difficile

toxin A carboxyl-terminus peptide lacking ADP-ribosyltransferase activity acts as a mucosal adjuvant.

Infection and Immunity, 72:2827-2836.

Chart H., Jenkins C., Smith H.R., Hedges D., Rowe B. 1998. Haemolysin production by strains of

Verocytotoxin-roducing Escherichia coli. Microbiology, 144:103-107.

Chaves Olarte E., Freer E., Parra A., Guzman-Verri C., Moreno E., Thelestam M. 2003. R-Ras

glucosylation and transient RhoA activation determine the cytophatic effect produced by toxin B variants

from toxin A-negative strains of Clostridium difficile. The Journal of Biological Chemistry, 278:7956-7963.

Chernak E., Johnson C.C., Weltman A., McDonald L.C., Wiggs L., Killgore G., Thompson A., LeMaile-

Williams M., Tan E., Lewis F.M. 2005. Severe Clostridium difficile-associated disease in population

previously at low risk-four states. Journal of the American Medical Association, 295(1):25-27.

Cohen A.L, Bhatnagar J., Reagan .S, Zane S.B., D'Angeli M.A., Fischer M., Killgore G., Kwan-Gett T.S.,

Blossom D.B., Shieh W.J., Guarner J., Jernigan J., Duchin J.S., Zaki S.R., McDonald L.C. 2007. Toxic

shock associated with Clostridium sordellii and Clostridium perfringens after medical and spontaneous

abortion. Obstetrics and Gynecology, 110(5):1027-33.

Coleman M.L., Olson M.F. 2002. Rho GTPase signaling pathway in the morphological changes associated

with apoptosis. Cell Death and Differentiation, 9:493-504.

Colell A., Ricci J.E, Tait S., Milasta S., Maurer U., Bouchier-Hayes L., Fitzgerald P., Guio-Carrion A.,

Waterhouse N.J., Li C.W., Mari B., Barbry P., Newmeyer D.D., Beere H.M., Green D.R. 2007. GAPDH

and autophagy preserve survival after apoptotic cytochrome c release in the absence of caspase activation.

Cell, 129(5):983-97.

Collins J.A., Cshandl C.A., Young K.K., Vesely J., Willingham M.C. 1997. Major DNA fragmentation is a

late event in apoptosis. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45(7):923-934.

Coniglio S.J., Jou T.S., Symons M. 2001. Rac1 protects epithelial cells against anoikis. Journal of

Biological Chemistry, 276:28113-28120.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cohen%20AL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bhatnagar%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reagan%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zane%20SB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22D'Angeli%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fischer%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Killgore%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kwan-Gett%20TS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Blossom%20DB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shieh%20WJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guarner%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jernigan%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Duchin%20JS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zaki%20SR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McDonald%20LC%22%5BAuthor%5D



Considine R.V., Simpson L.L. 1991. Cellular and molecular actions of binary toxins possessing ADP-

ribosyltransferase activity. Toxicon, 29(8):913-936.

Dale J.W. 1994. Molecular genetics of bacteria. Chichester: John Wiley and Sons.

Depitre C., Delmée M., Avesani V., L'Haridon R., Roels A., Popoff M.R., Corthier G. 1993. Serogroup F

strains of Clostridium difficile produce toxin B but not toxin A. Journal of Medical Micobiology, 38:434-

441.

Dubail I., Autret N., Beretti J., Kayal S., Berche P., Charbit A. 2001. Functional assembly of two

membrane-binding domains in listeriolysin O, the cytolysin of Listeria monocytogenes. Microbiology, 147,

2679-2688.

Dupuy B., Raffestein S., Matamouros S., Mani N., Popoff M.R., Sonenshein A.L. 2006. Regulation of

toxin and bakteriocin gene expresion in Clostridium difficile by interchangeable RNA polymerase sigma

factors. Molecular Microbiology, 60(4):1044-1057.

Egerer M., Giesmann T., Jank T., Fullner Satchell K.J., Aktories K. 2007. Auto-catalytic cleavage of

Clostridium difficile toxins A and B depends on cysteine protease activity. Journal of Biological Chemistry,

282(35):25314-25321.

Faust C., Ye B., Song K.P. 1998. The enzymatic domain of Clostridium difficile toxin A is located within

its N-terminal region. Biochemical and Biophysical Research Communications, 251:100-105.

Fekety, R., Shah, A.B. 1993. Diagnosis and treatment of Clostridium difficile colitis. JAMA, 269:71-75.

Fiorentini C., Fabbri A., Falzano L., Fattorossi A., Matarrese P., Rivabense R., Donelli G. 1998.

Clostridium difficile toxin B induces apoptosis in intestinal cultered cells. Infection and Immunity,

66:2660-2665.

Flegel W.A., Muller F., Daubener W., Fisher H.G., Hadding U., Northhoff H. 1991. Cytokine response by

human monocytes to Clostridium difficile toxin A and toxin B. Infection and Immunity, 59:3659-3666.

Frish C., Gerhard R., Aktories K., Hofmann F., Just I. 2003. The complete receptor-binding of Clostridium

difficile toxin A is required for endocytosis. Biochemical and Biophysical Research Communications,

300:706-711.



Fritz G., Kaina B. 2006. Rho GTPases: promising cellular targets for novel anticancer drugs. Current

Cancer Drug Targets, 6:1-14.

George W.L., Sutter V.L., Goldstein E.J., Ludwig S.L., Finegold S.M. 1978. Etiology of antimicrobial-

agent-associated collitis. Lancet, 1(8068):802-803.

Gendeh G.S., Young L.C., de Medeiros C.L., Jeyaseelan K., Harvey A.L., Chung M.C. 1997. A new

potassium channel toxin from the sea anemone Heteractis magnifica: isolation, cDNA cloning, and

functional expression. Biochemistry, 36 (38):11461-11471.

Genth H., Dreger S.C., Huelsenbeck J., Just I. 2008. Clostridium difficile toxins: More than mere inhibitors

of Rho proteins. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 40:592-597.

Geoffroy C., Mengaud J., Alouf J.E., Cossart P. 1990. Alveolysin, the Thiol-Activated Toxin of Bacillus

alvei, Is Homologous to Listeriolysin O, Perfringolysin O, Pnemolysin, and Streptolysin O and contains a

Single Cysteine. Journal of Bacteriology, 172:7301-7305.

Giammarini C., Andreoni F., Amagliani G., Casiere A., Barocci S. in Magnani M. 2003. High level

expression of the Listeria monocytogenes listeriolysin O in Escherichia coli and the preliminary

characterization of the purified protein. Protein expression and purification, 28(1):78-85.

Giesemann T., Jank T., Gerhard R., Maier E., Just I., Benz R., Aktories K. 2006. Cholesterol-dependent

pore formation of Clostridium difficile toxin A. Journal of Biological Chemistry, 281(16):10808-1.

Greco A., Ho J.G., Lin S.J., Palcic M.M, Rupnik M., Ng K.K.S. 2006. Carbohydrate recognition by

Clostridium difficile toxin A. Nature Structural and Molecular Biology, 13:460-461.

Goldfine H., Knob C., Alford D., Bentz J. 1995. Membrane permeablization by Listeria monocytogenes

phosphatidylinositol-specific phospholipase C is independent of phospholid hydrolysis and cooperative

with listeriolysin O. Proceedings of the National Academy of Science, 99:2979-2983.

Gouaux E., Hobaugh M., Song L. 1997. Alpha-hemolysin, gamma-hemolysin and leukocidin from

Staphylococcus aureus: distant in sequence, but similar in structure. Protein Science, 6:2631-2635.

Guerrant R.L. 1994. Lessons from diarrheal diseases: demography to molecular pharmacology. The Journal

of Infectious Disease, 169(6):1206-18.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Giesemann%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jank%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gerhard%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maier%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Just%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Benz%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Aktories%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guerrant%20RL%22%5BAuthor%5D



Gulke I., Pfeifer G., Liese J., Fritz M., Hofmann F., Aktories K., Barth H. 2001. Characterization of the

enzymatic component of the ADP-ribosytransferaze toxin CDTa from Clostridium difficile. Infection and

Immunity, 69:6004-6011.

Halabi-Cabezon I., Huelsenbeck J., May M., Ladwein M., Rottner K., Just I., Genth. Prevention of the

cytopathic effect induced by Clostridium difficile toxin B by active Rac1. FEBS Letters, 582:3751-3756.

Hamm E.E., Voth D.E., Ballard J.D. 2006. Identification of Clostridium difficile toxin B cardiotoxicity

using a zebrafish embryo model of intoxication. Proceedings of the National Academy of Science, 103

(38):14176-14181.

Harvey A.L. 1990. Presynaptic effects of toxins. International Review of Neurobiology, 32:201-39.

He D., Hagen J., Pothoulakis C., Chen M., Medina N.D., Warny M., LaMont J.T. 2000. Clostridium

difficile toxin A causes early damage to mitochondria in cultered cells. Gastroenterology, 119:139-150.

He H., Dang Y., Dai F., Guo Z., Wu J., She X., Pei Y., Chen Y., Ling W., Wu C., Zhao S., Liu J.O.,Yu L.

2003. Post-translational modifications of three members of the human MAP1LC3 family and detection of a

novel type of modification for MAP1LC3B. Journal of Biological Chemistry, 278:29278-29287.

Hippenstiel S., Schmeck B., N'Guessan P.D., Seybold J., Krüff M., Preissner K., von Eichel-Streiber C.,

Suttorp N. 2002. Rho protein inactivation induced apoptosis of cultured human endothelial cells. American

Journal of Physiology Lung Cell Molecular Physiology, 283:L830-L838.

Ho J.G., Greco A., Rupnik M., Ng K.K. 2005. Crystal structure of receptor binding C-terminal repeats from

Clostridium difficile toxin A. Proceedings of the National Academy of Science, 102:18373-18378.

Hofmann F., Herrmann A., Habermann E., von Eichel Streiber C. 1995. Sequencing and analysis of the

gene encoding the α-toxin of Clostridium novyi proves its homology to toxins A and B of Clostridium

difficile. Molecular and General Genetics, 247: 670-679.

Hofmann F., Busch G., Prepens U., Just I., Aktories K. 1997. Localization of the glucosyltransferase

activity of Clostridium difficile toxin B to the N-terminal part of the holotoxin. Journal of Biological

Chemistry, 272:11074-11078.

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22He+H.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Dang+Y.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Dai+F.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Guo+Z.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Wu+J.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22She+X.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Pei+Y.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Chen+Y.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Ling+W.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Wu+C.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Zhao+S.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Liu+J.O.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Yu+L.%22

http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M303800200



Huelsenbeck J., Dreger S., Gerhard R., Barth H., Just I., Genth H. 2007. Difference in the Cytotoxic Effects

of Toxin B from Clostridium difficile Strain VPI 10463 and Toxin B from Variant Clostridium difficile

Strain 1470. Infection and Immunity, 75(2):801–809.

Jaffe A.B., Hall A. 2005. Rho GTPases: biochemistry and biology. Annual Review of Cell and

Developmental Biology, 21:247-69.

Just I., Selzer J., Wilm M., von Eichel-Streiber C., Mann M, Aktories K. 1995. Glucosylation of Rho

proteins by Clostridium difficile toxin B. Nature, 375:500-503.

Justus P.G., Martin J.L., Goldberg D.A., Taylor N.S., Bartlett J.G., Alexander R.W., Mathias J.R. 1982.

Myoelectric effects of Clostridium difficile: motility-altering factors distinct from its cytotoxin and

enterotoxin in rabbits. Gastroenterology, 83(4):836-843.

Karasawa T., Wang X., Maegawa T., Michiwa Y., Kita H., Miwa K., Nakamura S. 2003. Clostridium

sordellii Phospholipase C: Gene Cloning and Comparison of Enzymatic and Biological Activities with

Those of Clostridium perfringens and Clostridium bifermentas Phospholipase C. American Society for

Microbiology, 71:641-646.

Katayama M., Kawaguchi T., Berger M.S. and Pieper R.O. DNA damaging agent-induced autophagy

produces a cytoprotective adenosine triphosphate surge in malignant glioma cells. Cell Death and

Differentiation, 2007:548–558.

Keel M.K., Songer J.G. 2006. The comparative pathology of Clostridium difficile-associated disease.

Veterinary Pathology, 43:225-240.

Kim J.M., Lee J.Y., Yoon Y.M., Oh Y.K., Youn J., Kim Y.J. 2006. NF-kappa B activation pathway is

essential for the chemokine expression in intestinal cells stimulated with Clostridium difficile toxin A.

Scandinavian Journal of Immunology, 63:453-460.

Kim J., Smathers P.P., Leckerman K.H., Coffin S., Zaoutis T. 2008. Epidemiological features of

Clostridium difficile-associated disease among inpatients at children's hospitals in the United States, 2001-

2006. Pediatrics, 122(6):1266-1270.

Kraig E., Dailey T., Kolodrubety D. 1990. Nucletide sequence of the leukotoxin gene from Actinobacillus

actinomycetemcomitans: homology to the alpha-hemolysin/leukotoxin gene family. Infection and Immunity,

58:920-929.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jaffe%20AB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hall%20A%22%5BAuthor%5D



Lawrence J.P, Brevetti L., Obiso RJ., Wilkins T.D., Kimura K., Soper R. 1997. Effects of epidermal growth

factor and Clostridium difficile toxin B in a model of mucosal injury. Journal of Pediatric Surgery,

32(3):430-433.

Le S.S., Loucks F.A., Udo H, Richardson-Burns S., Phelps R.A., Bouchard R.J., Barth H., Aktories K.,

Tyler K.L., Kandel E. R., Heidenreich K.A., Linseman D.A. 2005. Inhibition of Rac GTPase triggers a c-

Jun and Bim-dependent mitochondrial apoptotic cascade in cerebellar granule neurons. Journal of

Neurochemistry, 94:1025–1039.

Lesieur C., Vecsey-Semjen B., Abrami L., Fivaz M., Gisou van der Goot F. 1997. Membrane insertion: The

strategies of toxins. Molecular Membrane Biology, 14(2), 45-64.

Levine B., Kroemer G. 2008. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell, 132: 27-42.

Li J., Koni P.A., Ellar D.J. 1996. Structure of the mosquitocidal delta-endotoxin CytB from Bacillus

thuringiensis sp. kyushuensis and implications for membrane pore formation. Journal of Molecular Biology,

257(1):129-52.

Libby J.M., Wilkins T.D. 1982. Production of antitoxins to two toxins of Clostridium difficile and

immunological comparison of the toxins by cross-neutralization studies. Infection and Immunity, 35:374-

376.

Liu T.S., Musch M.W., Sugi K., Walsh-Reitz M.M., Ropeleski M.J., Hendrickson B.A., Pothoulakis C.,

LaMont J.T., Chang E.B. 2003. Protective role of HSP72 against Clostridium difficile toxin A-induced

intestinal epithelial cell dysfunction. American Journal of Physiology Cell Physiology, 284:C1073-C1082.

Lockshin R.A., Zakeri Z. 2004. Apoptosis, autophagy, and more. The International Journal of Biochemistry

and Cell Biology, 36(12):2405-19.

Lyerly D.M., Barroso L.A., Wilkins T.D., Depitre C., Corthier G. 1992. Characterization of a toxin A-

negative, toxin B-positive strain of Clostridium difficile. Infection and Immunity, 60:4633-4639.

Lyerly D.M., Krivan H.C., Wilkins T.D. 1988. Clostridium difficile: its disease and toxins. Clinical

Microbiology Reviews, 1(1):1-18.

Lyerly D.M., Saum K.E., MacDonald DK., Wilkins T.D. 1985. Effects of Clostridium difficile toxins given

intragastrically to animals. Infection and Immunity, 47(2):349-352.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Li%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Koni%20PA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ellar%20DJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lockshin%20RA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zakeri%20Z%22%5BAuthor%5D



Lyerly D.M., Lockwood D.E., Richardson S.H., Wilkins, T.D. 1982. Biological activities of toxins A and B

of Clostridium difficile. Infection and Immunity, 35(3): 1147-1150.

Lyras D., O'Connor J.R., Howarth P.M., Sambol S.P., Carter G.P., Phumoonna

T., Poon R., Adams

V.,

Vedantam G., Johnson S., Gerding D.N., Rood

J.I. 2009. Toxin B is essential for virulence of Clostridium

difficile. Nature, 458: 1176-1179.

Mahida Y.R., Galvin A., Makh S., Hyde S., Sanfilippo L., Borriello S.P., Sewel J.L. 1998. Effect of

Clostridium difficile toxin A on human colonic lamina propria cells: early loss of macrophages followed by

T-cell. Infection and Immunity, 66:5462-5469.

Main E.R., Jackson S.E., Regan L. 2003. The folding and design of repeat proteins: reaching a consensus.

Current Opinion in Structural Biology, 13: 482-489.

Matamourus S., England P., Dupuy B. 2007. Clostridium difficile toxin expresion is inhibited by the novel

regulator TcdC. Molecular Microbiology, 64(5): 1274-1288.

Matarrese P., Falzano L., Fabbri A., Gambardella L., Frank C., Geny B., Popoff M.R., Malorni W.,

Fiorentini C. 2007. Clostridium difficile toxin B causes apoptosis in epithelial cells by thrilling

mitochondria. Involvement of ATP-sensitive mitochondrial potassium channels. The Journal of Biological

Chemistry, 282(12):9029-41.

McDonald L.C., Owings M., Jernigan D.B. 2006. Increasing rates of Clostridium difficile infection among

patients discharged from US short-stay hospitals, 1996-2003. Emerging Infectious Diseases, 12(3):409-415.

Menestrina G., Ferreras M., Höper F., Dalla Serra M., Colin D.A., Prevost G. 1998. The interaction of

Staphylococcus aureus bi-component γ-hemolysins and leucocidins with cells and lipid membranes.

Biochimica et biophysica acta, 1414:108-126.

Merrigan M.M., Sambol S.P., Johnson S., Gerding D.N. 2003. Prevention of fatal Clostridium difficile-

associated disease during continous administration of clindamycin in hamsters. Journal of Infectious

Diseases, 188(12):1922-1927.

Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover T.C., Yolken R.H. 1999. Manual of clinical microbiology.

7th

ed. American Society for microbiology, Washington.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Matarrese%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Falzano%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fabbri%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gambardella%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Frank%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Geny%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Popoff%20MR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Malorni%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fiorentini%20C%22%5BAuthor%5D



Nizet V. 2002. Streptococcal β-hemolysins:genetics and role in disease pathogenesis. Trends in

Microbiology, 10:12.

Nusrat A., von Eichel-Streiber C., Turner J.R, Verkde P., Madara J.I., Parkos CA. 2001. Clostridium

difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight

junction proteins. Infection and Immunity, 69(3):1329-1336.

Pattingre S., Tassa A., Qu X., Garuti R., Liang X.H., Mizushima N., Packer M., Schneider M.D., Levine

B.2005. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell, 122(6):927-39.

Patrick S., Larkin M.J. 1995. Immunological and molecular aspects of bacterial virulence. Chichester: John

Wiley and Sons.

Pavliakova D., Moncrief J. S., Lyerly D.M., Schiffmann G., Bryla D.A., Robbins J.B., Schneerson R. 2000.

Clostridium difficile recombinant toxin A repeating units as a carrier protein for conjugate vaccines: studies

of pneumococcal type 14, Escherichia coli K1, and Schigella flexneri type 2a polysaccharides in mice.

Infection and Immunity, 68:2161-2166.

Pĕchinĕ S., Janoir C., Collignon A., 2005. Variability of Clostridium difficile surface proteins and specific

serum antibody responce in patients with Clostridium difficile associated disease. Journal of Clinical

Microbiology, 43(10): 5018-5025.

Pépin J., Valiquette L., Cossette B. 2005. Mortality attributable to nosocomial Clostridium difficile–

associated disease during an epidemic caused by a hypervirulent strain in Quebec. Canadian Medical

Association Journal, 173(9): 1037–1042.

Perelle S., Gilbert M., Bourlioux P.C., Popoff M.R. 1997. Production of a complete binary toxin (actin-

specific ADP ribosyltransferaze) by Clostridium difficile CD 196. Journal of Clinical Microbiology, 65(4):

1402-1407.

Petit L., Gibert M., Popoff M. 1999. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in

Microbiology, 7(3):104-10.

Pizza M., Masignani V., Rappuoli R. Bacterial toxins. 1997. V: Aktories K. (ed.), Bacterial toxins, tools in

cell biology and pharmacology, Chapman & Hall, Weinhheim; str. 299-340.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pattingre%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tassa%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Qu%20X%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Garuti%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Liang%20XH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mizushima%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Packer%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schneider%20MD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Levine%20B%22%5BAuthor%5D





Polekhina G., Giddings K.S., Tweten R.K., Parker M.W. 2005. Insight into the action of the superfamily of

cholesterol-dependent cytolysins from studies of intermedilysin. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, 102(3):600-605.

Popoff M.R., Rubin E.J., Gill D.M., Boquet P. 1988. Actin-specific ADP-ribosyltransferase produced by a

Clostridium difficile strain. Infection and Immunity, 56:2299-2306.

Popoff M.R., Geny B. 2006. Bacterial protein toxins and lipids:pore formation or toxin entry into cells.

Biology of the Cell, 98: 667-678.

Qa'Dan M., Ramsey M., Daniel J., Spyres L.M., Safiejko-Mroczka B., Ortiz-Leduc W., Ballard J.D. 2002.

Clostridium difficile toxin B activates dual caspase-dependent and caspase-independent apoptosis in

intoxicated cells. Cell Microbiology, 4:425-434.

Reineke J., Tenzer S., Rupnik M., Koschinski A., Hasselmayer O., Schrattenholz A., Schild H., von Eichel-

Streiber C. 2007. Autocatalytic cleavage of Clostridium difficile toxin B.Nature, 446:415-419.

Reinert D.J., Jank T., Aktories K., Shulz G.E. 2005. Structural basis for the function of Clostridium difficile

toxin B. Journal of Molecular Biology, 351:973-981.

Riegler M., Sedivy R., Pothoulakis C., Hamilton G., Zacherl J., Bischof G., Cosentini E., Feil W., Schiessel

R., LaMont J.T., Wenzl E. 1995. Clostridium difficile toxin B is more potent than toxin A in damaging

human colonic epithelium in vitro. Journal of Clinical Investigation, 95:2004-2011.

Rolfe R.D. 1991. Binding kinetics of Clostridium difficile toxins A and B to intestinal brush border

membranes from infant and adult hamster. Infection and Immunity, 59(4):1223-1230.

Rouphael N.G., O'Donell J.A., Bhatnagar J., Lewis F., Polgreen P.M., Beekmann S., Guarner J., Killgore

G.E., Coffman B., Campbell J., Zaki S.R., McDonald L.C. 2008. Clostridium difficile-associated diarrhea:

An emerging threat to pregnant women. American Journal of Obstetrics and Gynecology, 198(6):635e1-

635e6.

Rubinsztein D.C., Gestwicki J.E., Murphy L.O., Klionsky D.J. 2007. Potential therapeutic applications of

autophagy. Nature Reviews Drug Discovery, 6:304–312.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/journals/6653





Rupnik M., Avesani V., Janc M., von Eichel-Streiber C., Delmee M. 1998. A novel toxinotyping scheme

and correlation of toxinotypes with serogroups of Clostridium difficile isolates. Journal of Clinical

Microbiology, 36(8): 2240-2247.

Rupnik M. 2001. How to detect Clostridium difficile variant strains in routine laboratory. Clinical

Microbiology and Infection, 7(8): 417-420.

Rupnik M., Grabnar M., Gerič B. 2003. Binary toxin producing Clostridium difficile strains. Anaerobe,

9(6): 289-294.

Rupnik M. 2007. Clostridium difficile toxinotypes. Maribor, Medicinska fakulteta. http://www.mf.uni-

mb.si/Mikro/tox/ (3.sept.2009): 8 str.

Rupnik M. 2008. Heterogeneity of large clostridial toxins: Importance of Clostridium difficile toxinotypes.

FEMS Microbiology Reviews, 32(3):541-555.

Rupnik M., Kotnik Kevorkijan B. 2009. Clostridium difficile: ali postaja pogostejši tudi v Sloveniji?

JAMA-SI,17(3):107-109.

Rupnik M., Wilcox M.H., Gerding D.N. 2009. Clostridium difficile infection: New developments in

epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology, 7(7):526-536.

Sambol S.P., Tang J.K., Merrigan M.M., Johnson S., Gerding D.N. 2001. Infection of hamster with

epidemiologically important strains of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases, 183:1760-

1766.

Sambol S.P., Merrigan M.M., Tang J.K., Johnson S., Gerding D.N. 2002. Colonization for the prevention

of Clostridium difficile disease in hamsters. The Journal of Infectious Diseases, 186(12):1781-1789.

Savidge T.C., Pan W.H., Newman P., O‘Brien M., Anton P.M., Pothoulakis C. 2003. Clostridium difficile

toxin B is an inflammatory enterotoxin in human intestine. Gastroenterology, 125:413-420.

Schwan C., Stecher B., Tzivelekidis T., van Ham M., Rohde M., Hardt W.D., Wehland J., Aktories K. 2009.

Clostridium difficile toxin CDT induces formation of microtubule-based protrusions and increases

adherence of bacteria. PLoS Pathogen 5(10):e1000626-1000626.

http://www.mf.uni-mb.si/Mikro/tox/

http://www.mf.uni-mb.si/Mikro/tox/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schwan%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stecher%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tzivelekidis%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Ham%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rohde%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hardt%20WD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wehland%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Aktories%20K%22%5BAuthor%5D



Shatursky O., Heuck A.P., Shepard L.A., Rossjohn J., Parker M.W., Johnson A.E., Tweten R.K. 1999. The

mechanism of membrane insertion for a cholesterol-dependent cytolysin: A nove paradigm for pore

forming toxins. Cell 99:293-299.

Stare Geric B., Delmée M., Rupnik M. 2007. Variant forms of the binary toxin CDT locus and tcdC gene in

Clostridium difficile strains. Journal of Medical Microbiology, 56:329-335.

Steele J., Feng H., Parry N., Tzipori S. 2010. Piglet models for acute or chronic Clostridium difficile illness

(CDI). Journal of Infectious Disease, 201(3):428-434.

Steiner T.S., Flores C.A., Pizzaro T.T., Guerrant R.L. 1997. Fecal lactoferrin, interleukin1-beta, and

interleukin-8 are elevated in patients with severe Clostridium difficile colitis. Clinical and Diagnostic

Laboratory Immunology, 4(6):719-722.

Tan M.W., Rahme L.G., Sternberg J.A., Tompkins R.G. 1999. Pseudomonas aeroginosa killing of

Caenorhabditis elegans used to identify P. aeruginosa virulence factors. Proceedings of the National

Academy of Science, 96:2408-2413.

Tan K.S., Wee B.Y., Song K.P. 2001. Evidence for holin function of tcdE gene in the pathogenicity of

Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology, 50(7):613-619.

Toothaker R.D., Elmer G.W. 1984. Prevention of clindamycin-induced mortality in hamsters by

Saccharomyces boulardii. Antimicrobial Agents and Chemotherapeutics, 26(4):552-556.

Trombetta E.S., Mellman I. 2005. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual Review of

Immunology, 23:975-1028.

Tuomola E.M., Salminen S.J. 1998. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2

cell cultures International Journal of Food Microbiology, 41 (1):45-51.

Tweten R.K., Parker M.W., Johnson A.E. 2001. The cholesterol-dependent cytolysins. Current Topics in

Microbiology and Immunology, 257:15-33.

Tweten R.K., Melton J. 2006. Clostridium septicum pore-forming α-toxin.V:The Source Book of Bacterial

Protein Toxins (Alouf J.E., Popoff M.R., eds), Elsevier Academic press, Amsterdam, 34:623-630.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Trombetta%20ES%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mellman%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.sciencedirect.com/science/journal/01681605



Vaux D.L., Strasser A. 1995. The molecular biology of apoptosis. Proceedings of the National Academy of

Science 93: 2239-2244.

Viscidi R., Willey S., Bartlett J.G. 1981. Isolation rates and toxigenic potential of Clostridium difficile

isolates from various patient populations. Gastroenterology, 81(1):5-9.

von Eichel-Streiber C., Boquet P., Sauerborn M., Thelstam M. 1996. Large clostridial cytotoxins-a family

of glycosyltransferases modifying small GTP-binding proteins. Trends in Microbiology, 4(10):375-382.

Voth D.E., Ballard J.D. 2005. Clostridium difficile Toxins: Mechanism of Action and Role in Disease.

Clinical Microbiology Reviews, 18(2):247-263.

Wang J. 2008. Beclin 1 bridges autophagy, apoptosis and differentiation. Autophagy, 4(7):947-948.

Warny M., Kelly C.P. 1999. Monocytic cell necrosis is mediated by potassium depletion and caspase-like

proteases. American Journal of Physiology, 276:C717-C724.

Williams A., Jahreiss L., Sarkar S., Saiki S., Menzies F.M., Ravikumar B., Rubinsztein D.C. 2006.

Aggregate-prone proteins are cleared from the cytosol by autophagy: therapeutic implications. Current

Topics in Developmental Biology, 76:89–101.

Willingham M.C. 1999. Cytochemical methods for detection of apoptosis. Journal on Histochemistry and

Cytochemistry, 47(9):1101-1109.

Wilson K.H., Sheagren J.N. 1983. Antagonism of toxigenic Costridium difficile by nontoxigenic C. difficile.

The Journal of Infectious Diseases, 147(4):733-736.

Wilson K.H., Sheagren J.N., Freter R. 1985. Population dynamics of ingested Clostridium difficile in the

gastrointestinal tract of the Syrian hamster. The Journal of Infectious Diseases, 151(2):355-361.

Wu K., Conly J., McClure J.A., Elsayed S., Louie T., Zhang K. 2009. Caenorhabditis elegans as a host

model for community-asociated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology

Infection, 16:245-254.

Yamamoto K., Ichinose Y., Shinagawa H., Makino K., Nakata A., Iwanaga M., Honda T., Miwatani T.

1990.Two-step processing for activation of the cytolysin/hemolysin of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yamamoto%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ichinose%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shinagawa%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Makino%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nakata%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Iwanaga%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Honda%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miwatani%20T%22%5BAuthor%5D



nucleotide sequence of the structural gene (hlyA) and characterization of the processed products. Infection

and Immunity, 4106-4116.

Yeh C.Y., Lin C.N., Chang C.H., Lin C.H., Lien H.T., Chen J.Y., Chia J.S. 2008. C-terminal repeats of

Clostridium difficile toxin A induce production of chemokine and adhesion molecules in endothelial cells

and promote migration of leukocytes. Infection and Immunity, 76:1170-1178.



8 ZAHVALA

Iskrena hvala mentorici prof. dr. Maji Rupnik za priloţnost, za izčrpno znanje, ki sem ga

lahko deleţna, za pomoč pri iskanju odgovorov na številna vprašanja in za izoblikovanje

mojih ciljev. Hvala za nesebično vodenje, razumevanje in skrb za razvoj moje poti v svet

znanosti.

Najlepša hvala prof. dr. Gregorju Anderluhu za natančen in učinkovit pregled

doktorskega dela, za delo v laboratoriju, usmeritve in sodelovanje.

Doc. dr. Saši Lipovšek bi se prav tako zahvalila za natančen in učinkovit pregled

doktorskega dela. Hvala za prijazne in vzbodbudne besede in za nova pričakovanja.

Hvala prof. dr. Ignaziu Castagliuolu za delo v laboratoriju na Oddelku za histologijo,

mikrobiologijo in medicinsko tehnologijo Univerze v Padovi. Z veseljem sem zbirala in

gradila novo znanje, delovne in ţivljenjske izkušnje. Hvala za sodelovanje pri nastajanju

večine tega dela.

Vsem zaposlenim na Centru za mikrobiologijo Zavoda za zdravstveno varstvo Maribor bi

se rada zahvalila za vrnjeno prijaznost, mikrobiološke nasvete, pomoč in sproščeno

razpoloţenje.

Katji in Mojci hvala za napolnitev zaloge energije, za drobne, a zelo koristne delovne

nasvete.

Tomaţ, hvala za zbiranje poučnih računalniških informacij in pomoč pri oblikovanju

naloge.

Sandra, Valerija, Tomaţ, Jure, Aleksander, Sara, Mateja, Beata in Niall, hvala za

druţenje in raziskovalno ustvarjanje. Lepo je prihajati vsak dan na Oddelek za

raziskovalno dejavnost, poleg dela samega, prav zaradi vas. Hvala za zaupanje, smeh,

sproščeno vzdušje, pripravljenost pomagati, za pripombe, za kritične pogovore, nova

premišljevanja in nove izzive.

Hvala Ines za pomoč pri celicah in ţivalskih modelih kot tudi Nataši za druţenje in

pestrost pri mojih prvih delovnih začetkih.

HVALA moji druţini in prijateljem. Za velikodušno poslušanje količine mojega

govorjenja, da doţiveto radost in srečo lahko delim z vami, da vedno znova verjamete

vame, mi dajete prostor in svobodo, da sem to, kar sem.



9 PRILOGE

9.1 ČLANEK KOT DEL DOKTORSKE NALOGE













9.2 ŢIVLJENJEPIS

OSEBNI PODATKI

Ime in priimek: Mateja Zemljič

Datum rojstva: 24.03.1980

Naslov: Borštnikova 100, 2000 Maribor

ZAPOSLITEV

mlada raziskovalka na Oddelku za raziskovalno dejavnost, na Centru za mikrobiologijo na Zavodu za

zdravstveno varstvo Maribor pri mentorici prof. dr. Maji Rupnik

asistentka za predmetno področje mikrobiologija na Medicinski fakulteti Univerze v Mariboru

IZOBRAZBA

2006-2010: Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, podiplomski študij Biomedicinska tehnologija

Univerze v Mariboru

1999-2006: Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta, doktorica veterinarske medicine

1995-1999: Prva gimnazija Maribor, gimnazijski maturant

NAGRADE

Prešernova nagrada za delo Dokazovanje virusa mačje imunske pomanjkljivosti (FIV) in virusa mačje

levkoze (FeLV) s testom ELISA in metodo veriţne reakcije s polimerazo (pcr) (2005)

ZNANJA

tuji jeziki:

angleščina-aktivno

nemščina-pasivno

italijanščina-pasivno

računalništvo:

Word, Excel, internet, elektronska pošta

PEDAGOŠKO DELO

2010/2011: Izvedba vaj pri predmetu Mikrobiologija za študente 2.letnika dodiplomskega študija "Splošna

Medicina" na Medicinski fakulteti Univerze v Mariboru

2009/2010: Izvedba vaj pri predmetu Mikrobiologija za študente 2.letnika dodiplomskega študija "Splošna

Medicina" na Medicinski fakulteti Univerze v Mariboru

IZOBRAŢEVANJE V TUJINI

27.10.2009 – 7.11.2010: izobraţevanje na Univerzi na Dunaju, Oddelku za mikrobiologijo in

imunobiologijo

01.07.2008 – 11.6.2009: izobraţevanje na Univerzi v Padovi, Oddelku za histologijo, mikrobiologijo in

medicinsko tehnologijo

3.12. – 9.12.2006: delovni obisk na Centre for Biomolecular Sciences, School of Molecular Medical

Sciences, University of Nottingham



9.3 OSEBNA BIBLIOGRAFIJA ZA OBDOBJE 1996-2010

MATEJA ZEMLJIČ [28598]

Osebna bibliografija za obdobje 1996-2010

ČLANKI IN DRUGI SESTAVNI DELI

1.01 Izvirni znanstveni članek

1. TOZON, Nataša, NEMEC, Alenka, ZEMLJIČ, Mateja, ZAKOŠEK, Maja, BARLIČ-

MAGANJA, Darja. High prevalence of feline immunodeficiency virus (FIV) and feline

leukemia virus (FeLV) in Slovenia. Acta vet. (Beogr.), 2008, vol. 58, no. 2/3, str. 191-201.

[COBISS.SI-ID 2946170]

2. ZIDARIČ, Valerija, ZEMLJIČ, Mateja, JANEŢIČ, Sandra, KOCUVAN, Aleksander,

RUPNIK, Maja. High diversity of Clostridium difficile genotypes isolated from a single

poultry farm producing replacement laying hens. Anaerobe (Lond. Engl.), 2008, issue 6,

vol. 14, str. 325-327. [COBISS.SI-ID 651807]

3. AVBERŠEK, Jana, JANEŢIČ, Sandra, PATE, Mateja, RUPNIK, Maja, ZIDARIČ,

Valerija, LOGAR, Katarina, VENGUŠT, Modest, ZEMLJIČ, Mateja, PIRŠ, Tina,

OCEPEK, Matjaţ. Diversity of Clostridium difficile in pigs and other animals in Slovenia.

Anaerobe (Lond. Engl.), 2009, vol. 15, no. 6, str. 252-255, doi:

10.1016/j.anaerobe.2009.07.004. [COBISS.SI-ID 3096186]

tipologija 1.08 -> 1.01

4. ZEMLJIČ, Mateja, RUPNIK, Maja, SCARPA, Melania, ANDERLUH, Gregor, PALÙ,

Giorgio, CASTAGLIUOLO, Ignazio. Repetitive domain of Clostridium difficile toxin B

exhibits cytotoxic effects on human intestinal epithelial cells and decreases epithelial

barrier function. Anaerobe (Lond. Engl.), 2010, vol. 16, issue 5, str. 527-532.

http://dx.doi.org/10.1016/j.anaerobe.2010.06.010, doi: 10.1016/j.anaerobe.2010.06.010.


1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci

5. ZIDARIČ, Valerija, RUPNIK, Maja, AVBERŠEK, Jana, ZEMLJIČ, Mateja,

JANEŢIČ, Sandra, PIRŠ, Tina, OCEPEK, Matjaţ. Prevalence and diversity of

Clostridium difficile in poultry, pigs and calves. V: 9th biennial congress of the anaerobe

society of the Americas, 2008. Anaerobe 2008. Long Beach: Anaerobe society of the

Americas, 2009, session XIV, str. 12. [COBISS.SI-ID 2976122]

6. ZIDARIČ, Valerija, JANEŢIČ, Sandra, ZEMLJIČ, Mateja, RUPNIK, Maja.

Clostridium difficile genotypes isolated from animals. V: BARLIČ-MAGANJA, Darja

(ur.), RASPOR, Peter (ur.). 4th Congress of the Slovenian Microbiological Society with

http://cobiss.izum.si/scripts/cobiss?command=DISPLAY&base=COBIB&RID=2946170


http://dx.doi.org/10.1016/j.anaerobe.2009.07.004








International Participation, Portoroţ, November 2008. Microbiology for today : book of

abstracts = zbornik povzetkov. Ljubljana: Slovensko mikrobiološko društvo: = Slovenian

Microbiological Society, 2008, str. 125. [COBISS.SI-ID 660255]

7. ZEMLJIČ, Mateja, RUPNIK, Maja, SCARPA, Melania, BRUN, Paola, PALU,

Giorgio, CASTAGLIUOLO, Ignazio. N-terminal repetitive domain of Clostridium

difficiele toxin B exhibits cytopathic effects on human intestinal epithelial cells. V:

GOLIČNIK, Marko (ur.), BAVEC, Aljoša (ur.). Joint Congress of the Slovenian

Biochemical Society and the Genetic Society of Slovenia with International Participation,

Otočec, September 20-23, 2009. Book of abstracts. Ljubljana: Slovenian Biochemical

Society: Genetic Society of Slovenia, 2009, str. 151. [COBISS.SI-ID 26105817]

8. ZEMLJIČ, Mateja, RUPNIK, Maja, SCARPA, Melania, BRUN, Paola, PALU,

Giorgio. Repetitive domain of Clostridium difficile toxin B exhibits cytopathic effectson

human intestinal epithelial cells. V: GOLIČNIK, Marko (ur.), BAVEC, Aljoša (ur.). Joint

Congress of the Slovenian Biochemical Society and the Genetic Society of Slovenia with

International Participation, Otočec, September 20-23, 2009. Book of abstracts. Ljubljana:

Slovenian Biochemical Society: Genetic Society of Slovenia, 2009, str. 152.


9. ZEMLJIČ, Mateja, RUPNIK, Maja, SCARPA, Melania, BRUN, Paola, PALÙ,

Giorgio, CASTAGLIUOLO, Ignazio. Biological effects of C-terminal repetitive domain

of Clostridium difficile toxin B. V: 6th ClostPath International Conference, Rome, 19-23

October 2009, Istituto Superiore di Sanitá, Hall Pocchiari. Clostridia : the impact of

genomics on disease control, str. 108 (P50). [COBISS.SI-ID 512095032]

MONOGRAFIJE IN DRUGA ZAKLJUČENA DELA

2.12 Končno poročilo o rezultatih raziskav

10. ZEMLJIČ, Mateja, ZAKOŠEK, Maja. Dokazovanje virusa mačje imunske

pomanjkljivosti (FIV) in virusa mačje levkoze (FeLV) s testom ELISA in metodo verižne

reakcije s polimerazo (PCR) = Feline immunodeficiency virus (FIV) and feline leukemia

virus (FeLV) detectionby ELISA and polymerase chain reaction (PCR). Ljubljana:

[Mateja Zemljič, Maja Zakošek], 2005. 82 f., ilustr., tab. [COBISS.SI-ID 2463354]

SEKUNDARNO AVTORSTVO

Urednik

11. RUPNIK, Maja (ur.), JANEŢIČ, Sandra (ur.), ZEMLJIČ, Mateja (ur.). Abstract

book : www.mf.uni-mb/mikro/icds2010. Maribor: Zavod za zdravstveno varstvo, cop.

2010. 181 str. ISBN 978-961-90895-3-8. [COBISS.SI-ID 65519105]









NERAZPOREJENO

12. BRAČKO, Judita, PURG, Karmen, ŠTUKOVNIK, Vita, ZAKRAJŠEK, Jure,

ZEMLJIČ, Mateja, ŢALIK, Estera. Primerjava strukture naslovov v dnevnikih (Delo,

Večer), tedniku 7D in mesečniku Moj pes, (I. gimnazija, Maribor, Raziskovalne naloge).

Maribor: [s. n.], 1996. 43 f., graf. prikazi. [COBISS.SI-ID 4982792]

13. ŠTUKOVNIK, Vita, ZEMLJIČ, Mateja. Stilno zaznamovane besede v naslovih

dnevnika Večer in tednika Nedeljski dnevnik, (I. gimnazija, Maribor, Raziskovalne

naloge). Maribor: [s. n.], 1997. 98 f., graf. prikazi, obrazci. [COBISS.SI-ID 6174728]

14. MAUKO, Bojana, ZEMLJIČ, Mateja. Samostalniški in pridevniški zaimki v

mariborskem pogovornem jeziku : slovenski jezik : raziskovalna naloga. Maribor: Prva

gimnazija, 1998. 23 f., graf. prikazi. [COBISS.SI-ID 7529992]

Vir bibliografskih zapisov: Vzajemna baza podatkov COBISS.SI/COBIB.SI






UNIVERZA V MARIBORU


IZJAVA DOKTORSKEGA KANDIDATA

Podpisana Mateja Zemljič, vpisna številka 30803375

izjavljam,

da je doktorska disertacija z naslovom

Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile

rezultat lastnega raziskovalnega dela,

da so rezultati korektno navedeni in

da nisem kršil-a avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih.

Podpis doktorske kandidatke:

Documents

Novi mehanizmi toksiĊnosti pri bakteriji Clostridium difficile · Zemljič M. Novi mehanizmi toksičnosti pri bakteriji Clostridium difficile. Doktorska disertacija. Univerza v Mariboru,