1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

------------------------

Nguyễn Đình Chung

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT

TÍNH SINH HỌC CỦA RỄ CỦ CÂY MẠCH MÔN

(OPHIOPOGON JAPONICUS (L.f.) KER-GAWL.)

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2018

2

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ -

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Nguyễn Tiến Đạt

Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Văn Thanh

Phản biện 1: ………………………………………………………

Phản biện 2: ………………………………………………………

Phản biện 3: ………………………………………………………

Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp Học

viện họp tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam

- Thư viện Quốc gia

1

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1. Tính cấp thiết của luận án

Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính

sinh học đã được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y

học hiện đại. Giá trị của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm

thuốc chữa bệnh mà vì còn có thể dùng làm nguyên mẫu hoặc cấu

trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển nhiều dược phẩm mới.

Việt Nam được đánh giá là nước có nguồn tài nguyên dược liệu

phong phú và có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu này

nhờ vào nền y học cổ truyền lâu đời. Theo thống kê ở Việt Nam hiện

có hơn 13000 loài thực vật trong đó hơn 5000 loài được sử dụng làm

thuốc. Đây là một lợi thế để chúng ta khai thác nguồn dược liệu này

phục vụ cho cuộc sống. Trên cơ sở kết quả sàng lọc các dịch chiết

thô của một số dược liệu Việt Nam về các hoạt tính gây độc tế bào

ung thư và kháng viêm, rễ củ cây Mạch môn được lựa chọn làm đối

tượng nghiên cứu của luận án.

Mạch môn có tên khoa học là Ophiopogon japonicus (L.f.)

Ker-Gawl. được trồng nhiều nơi trong nước ta làm cảnh và làm

thuốc. Rễ củ của cây này là một dược liệu quý có mặt trong rất nhiều

bài thuốc y học cổ truyền với mục đích chữa ho long đờm, thương

tổn, ho lao, sốt, bệnh lý tiểu đường, táo bón, thổ huyết, chảy máu

cam. Các nghiên cứu trước đây về thành phần hoá học đã chỉ ra rằng

cây này có chứa các hợp chất homoisoflavonoid, steroid saponin và

polysaccharide. Đây là những thành phần có nhiều hoạt tính sinh học

đáng chú ý như kháng viêm, chống oxi hóa, gây độc tế bào, phòng và

ngăn ngừa bệnh tiểu đường… Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành

phần hoá học và hoạt tính sinh học của rễ củ cây Mạch môn

(Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl.)” được thực hiện nhằm

2

mục tiêu phát hiện được các hoạt chất có tiềm năng từ cây Mạch môn

góp phần làm rõ hơn những công dụng chữa bệnh trong y học cổ

truyền đồng thời làm tăng giá trị khoa học của cây này ở Việt Nam.

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất sạch từ rễ củ cây

Mạch môn;

Đánh giá tác dụng gây độc tế bào và hoạt tính kháng viêm dựa

trên ảnh hưởng ức chế sự sản sinh NO của các hợp chất phân

lập được.

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

Phân lập các hợp chất từ rễ củ cây Mạch môn bằng các

phương pháp sắc ký kết hợp. Xác định cấu trúc hóa học của

các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa

học;

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng viêm của

các hợp chất phân lập được;

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

Những nghiên cứu trên thế giới và trong nước về hóa học và

hoạt tính sinh học của cây Mạch môn (O. japonicus).

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mẫu thực vật

Mẫu thực vật được PGS.TS. Trần Huy Thái (Viện Sinh thái

và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam) xác định tên khoa học, tiêu bản lưu tại Viện Sinh thái và Tài

nguyên Sinh vật và Viện Hóa sinh biển.

3

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất

Việc phân lập, tinh chế các phần dịch chiết của cây được

thực hiện bằng các phương pháp: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp

mỏng điều chế (PTLC), sắc ký cột thường (CC) silica gel với các cỡ

hạt khác nhau, sắc ký cột pha đảo YMC RP-C18 và ray phân tử

Sephadex LH-20.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc của hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa

các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại: điểm nóng

chảy (Mp), độ quay cực ([α]D), phổ hồng ngoại (FT IR), phổ lưỡng

sắc tròn (CD), phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân

giải cao (HR ESI MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân: phổ một chiều

(1H NMR,

13C NMR và DEPT) và phổ 2 chiều (COSY, HSQC,

HMBC và NOESY/ROESY).

2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Hoạt tính gây độc trên 4 dòng tế bào ung thư người: tế bào ung

thư phổi kháng thuốc (A549), ung thư phổi người (LU-1), ung

thư biểu mô người (KB) và ung thư da người (SK-Mel-2).

Hoạt tính tính ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào

RAW264.7 kích thích bởi LPS.

4

2.3. Phân lập các hợp chất từ rễ củ cây Mạch môn Ophiopogon

japonicus

Bột khô rễ củ mạch môn

O. japonicus (2.4kg)

Ngâm với MeOH (5L×3 lần)

Cất loại dung môi

Cặn MeOH tổng

(360 g)

Chiết với CHCl3 (3L×3 lần)

OJC1.2

Cặn CHCl3 (8,6g)

OJW

Dịch nước

Diaion HP-20 CC,

Nước/Methanol (100:0-0:100)

OJW 1.3 OJW 1.5 OJW 1.4

100:0 75:25 0:100

Hình 3. Sơ đồ chiết phân đoạn rễ củ Mạch môn

OJC21.7

(264,9 mg)

YMC RP-18 CC,

Acetone:nước (1.5:1)

Cặn CHCl3

OJC1.2 (8,6 g)

Silica gel CC,

n-Hexane:EtOAc (100:0-0:100)

OJC17.1

(2,46 g)

OJC17.3

(986 mg) OJC17.4 OJC17.5 OJC17.9 … …

Silica gel CC,

n-Hexane:EtOAc (20:1)

Hợp chất OJ-5

(69,5 mg)

OJC21.1 OJC21.4

(116,4 mg)

OJC21.9

(50,5 mg)

YMC RP-18 CC,

Acetone:nước (2:1)

Hợp chất OJ-4

(18,2 mg)

Silica gel CC,

n-Hexane:acetone (8:1)

Hợp chất OJ-2

(20,8 mg)

… …

c

…

Hình 4. Sơ đồ phân lập các hợp chất OJ-2, OJ-4 và OJ-5 từ cặn chloroform

5

YMC RP-18 CC,

Acetone:Nước (1.5:1)

OJC 17.3 (986 mg)

Silica gel CC,

n-Hexane:EtOAc (9:1)

OJC19.1

(351,9 mg)

OJC19.2

(60 mg)

OJC19.3

(197 mg) OJC19.4

YMC RP-18 CC,

Acetone:Nước (1:1)

Hợp chất OJ-7

(125.7 mg)

OJC20.1

(70,9 mg) OJC20.2

(162,3 mg)

YMC RP-18 CC,

Acetone:Nước (2:1)

Hợp chất OJ-9

(46.3 mg)

YMC RP-18 CC,

Acetone:Nước (1:1)

Silica gel CC,

n-Hexane:acetone (7:1)

Hợp chất OJ-6

(40.4 mg)

Hợp chất OJ-8

(31.5 mg)

Kết tinh, Rửa tủa bằng n-

Hexane:CH2Cl2 (3:1)

Hình 5. Sơ đồ phân lập từ hợp chất OJ-6 đến OJ-9 từ phân đoạn OJC17.3

OJW1.5 (11,8 g)

Silica gel CC,

CHCl3:MeOH (100:0-0:100)

OJW2.1

(200 mg)

OJW2.4

(455 mg)

OJW2.5

(585 mg)

OJW2.6

(3,6 g) OJW2.9 …

c

…

1. Silica gel CC, n-Hexane:EtOAc (12:1)

2. Silica gel CC,

n-Hexane:CH2Cl2:Acetone (15:1:0.1)

Hợp chất OJ-1

(30,1 mg)

Silica gel CC,

CH2Cl2:MeOH(10:1

)

OJW9.1 OJW9.2

(1,39 g)

OJW9.3

(868 mg)

1. Sephadex LH-20 CC, Methanol:Nước (1:1)

2. YMC RP-18 CC, Methanol:Nước (1:2)

Hợp chất OJ-12

(45,7 mg)

Sephadex LH-20 CC,

Methanol:Nước (1:1)

Hợp chất OJ-15

(365,7 mg)

Hình 6. Sơ đồ phân lập hợp chất OJ-1, OJ-12 và OJ-15 từ phân đoạn OJW1.5

6

OJW2.4 (455 mg)

YMC RP-18 CC,

MeOH:Nước (1:1)

OJW 4.1 OJW4.2

(49,3 mg)

OJW 4.3 OJW 4.4

(152,5 mg)

Silica gel CC,

CH2Cl2:Acetone (10:1 và 6:1)

Hợp chất OJ-3

(20 mg)

Sephadex LH-20 CC,

Methanol:Nước (1:1)

Hợp chất OJ-11

(15,5 mg)

Hợp chất OJ-10

(35,5 mg)

Hình 7. Sơ đồ phân lập các hợp chất OJ-3, OJ-10 và OJ-11 từ phân đoạn

OJW2.4

OJW2.5

(585 mg)

YMC RP-18 CC,

Methanol : Nước (1:1)

OJW12.1 OJW12.4

(40 mg) OJW12.5

OJW12.6

(26,6 mg)

Sephadex LH-20 CC,

Methanol:Nước (1.5:1)

Hợp chất OJ-13

(13,9 mg)

Silica gel CC,

CH2Cl2:Methanol (20:1)

Hợp chất OJ-14

(10,1 mg)

…

Hình 8. Sơ đồ phân lập các hợp chất OJ-13 và OJ-14 từ phân đoạn OJW2.5

7

2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất

Phần này trình bày thông số vật lý và các dữ kiện phổ của các

hợp chất phân lập từ O. japonicus.

2.5. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập đƣợc

2.5.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp

chất

Bảng 14. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp

chất trên các dòng tế bào ung thư người (IC50, μM)

Hợp chất LU-1 KB SK-Mel-2 A549

OJ-1 10,90 8,86 14,01 -

OJ-2 >30 >30 >30 -

OJ-3 >30 >30 29,00 -

OJ-4 >30 >30 >30 -

OJ-5 >30 >30 >30 -

OJ-6 0,66 0,51 0,66 6,26

OJ-7 17,14 >30 28,29 -

OJ-8 27,66 >30 >30 -

OJ-9 >30 >30 >30 -

OJ-10 >30 >30 20,38 -

OJ-11 >30 >30 >30 -

OJ-12 >30 >30 >30 -

OJ-13 >30 >30 >30 -

OJ-14 >30 >30 >30 -

OJ-15 >30 28,84 24,29 -

Ellipticine 0,43 0,51 0,27 -

Camptothecin - - - 12,4

Ellipticine và camptothecin: các đối chứng dương sử dụng trong thực nghiệm.

2.5.2. Tác dụng tính ức chế sản sinh NO

Bảng 15. Tác dụng tính ức chế sản sinh NO (IC50, μM)

Hợp chất

OJ-1 OJ-2 OJ-3 OJ-4 OJ-5 OJ-6 OJ-7 OJ-8

IC50 (μM)

11,4 29,1 >30 >30 >30 22,5 19,3 >30

Hợp chất

OJ-9 OJ-10 OJ-11 OJ-12 OJ-13 OJ-14 OJ-15 Card.*

IC50 (μM)

>30 >30 >30 >30 >30 >30 >30 2,80

* Cardamonin: đối chứng dương

8

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1. Các hợp chất phân lập đƣợc từ rễ củ Mạch môn

Hình 9. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ rễ củ Mạch môn

9

3.1.1. Hợp chất OJ-1:(2R)-(4-methoxybenzyl)-5,7-dimethyl-6-hydro

xyl-2,3-dihydrobenzofuran (Hợp chất mới)

Hình 10. Cấu trúc của hợp chất OJ-1 và các tương tác HMBC chính

Hình 12. Phổ 1H NMR của hợp chất OJ-1

Hợp chất OJ-1 thu được dưới dạng bột màu vàng. Công thức

phân tử của nó được xác định là C18H20O3 trên cơ sở sự xuất hiện pic

ion phân tử tại m/z 283,1365 [M – H]‒ (tính toán lý thuyết cho công

thức C18H19O3, 283,1334) trên phổ khối lượng phân giải cao HR-

ESI-MS .Trên phổ 1H NMR của hợp chất OJ-1 xuất hiện tín hiệu đặc

trưng của vòng thơm dạng A2B2 [δH 7,19 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2' và

6') và 6,86 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3' và 5')], một tín hiệu singlet của

proton thơm [δH 6,67 (1H, s, H-4)], một proton của nhóm methin liên

kết với oxy [δH 4,86 (1H, m, H-2)], một nhóm methoxy [δH 4,86 (1H,

m, H-2)], hai nhóm methylen [δH 3,07 (1H, dd, J = 8,5, 15,0 Hz, H-

10

3a), 2,82 (1H, dd, J = 7,5, 15,0 Hz, H-3b), 3,02 (1H, dd, J = 7,0, 14,0

Hz, H-7'a), 2,84 (1H, dd, J = 6,5, 14,0 Hz, H-7'b)] và hai nhóm

methyl thế trên vòng thơm [δH 2,12 (3H, s, CH3-5) và 2,05 (3H, s,

CH3-7)].

Hình 13. Phổ 13

C NMR của hợp chất OJ-1

Phân tích dữ liệu phổ 13

C NMR kết hợp với phổ DEPT nhận

thấy có sự xuất hiện của 18 tín hiệu cacbon, bao gồm 2 methyl

cacbon [δC 9,15 (C-5) và 16,4 (C-7)], 2 methylen [δC 35,5 (C-3) và

42,0 (C-7')], một methoxy [δC 55,6 (4'-OCH3)], một methin gắn oxy

[δC 85,1 (C-2)], 5 methin của vòng thơm [δC 123,9 (C-4), 131,4 (C-2'

và 6'), và 114,7 (C-3' và 5')], 3 cacbon của vòng thơm liên kết với

oxy [δC 153,8 (C-6), 158,0 (C-7a) và 159,7 (C-4')] và 4 cacbon

không liên kết với hydro [δC 118,0 (C-3a), 117,3 (C-5), 108,1 (C-7)

và 131,2 (C-1')]. Những dữ liệu phổ ở trên gợi ý cấu trúc của hợp

chất OJ-1 là một hợp chất mới có khung 2-benzyl-2,3-

dihydrobenzofuran [1,2].

11

Bảng 3. Số liệu phổ 1H và

13C NMR (CD3OD, δ ppm) của OJ-1

Vị trí TLTK [2] δCa δH

b, dạng pic (J = Hz)

2 85,3 85,1 4,86, m

3 34,4 35,8 3,07, dd (8,5, 15,0);

2,82, dd (7,5, 15,0)

3a 118,4 118,0 -

4 121,3 123,9 6,67, s

5 118,4 117,3 -

6 152,2 153,8 -

7 104,4 108,1 -

7a 158,4 158,0 -

1' 130,4 131,2 -

2' 129,3 131,4 7,19, d (8,5)

3' 113,9 114,7 6,86, d (8,5)

4' 158,4 159,7 -

5' 113,9 114,7 6,86, d (8,5)

6' 129,3 131,4 7,19, d (8,5)

7' 40,9 42,0 3,02, dd (7,0, 14,0);

2,84, dd (6,5, 14,0)

5-Me - 16,4 2,12, s

6-Me 56,4 (OMe) -

7-Me 60,5 (OMe) 9,15 2,05, s

4'-OMe 55,1 55,6 3,78, s

a125 MHz,

b500 MHz. Tham khảo hợp chất 6,7-dimethoxy-2-(4-methoxylbenzyl)-2,3-

dihydrobenzofuran theo tài liệu [2].

Cấu trúc của hợp chất OJ-1 đã được xác nhận dựa trên phân

tích dữ liệu phổ hai chiều. Trên phổ tương tác xa HMBC nhận thấy

có sự tương tác của proton thơm H-4 với cacbon C-3, C-3a, C-5, C-

6, và C-7a; từ proton của nhóm methyl CH3-5 với cacbon C-4, C-5,

và C-6; và từ proton của nhóm methyl CH3-7 với cacbon C-6, C-7 và

C-7a. Những tương tác này đã khẳng định cho sự có mặt của khung

dihydrobenzofuran với nhóm thế hydroxyl tại vị trí C-6 và hai nhóm

methyl tại vị trí C-5 và C-7. Vị trí của nhóm methoxy đã được xác

định tại vị trí C-4' trên cơ sở tương tác HMBC giữa proton của nhóm

12

methoxy và cacbon C-4'. Bằng cách phân tích chi tiết các tương tác

nhận được trên phổ HMBC cho phép khâu nối các mảnh cấu trúc lại

với nhau và xác định được toàn bộ cấu trúc phẳng của hợp chất OJ-1

như đã được mô tả trong hình.

Tính toán 2R

Thực nghiệm

Hình 17. Phổ ECD của hợp chất OJ-1

Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2 của OJ-1 được xác định dựa

vào phương pháp tính toán lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn

(ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa trên sự phụ thuộc giữa

thời gian và mật độ lý thuyết [3]. Trên phổ ECD của hợp chất OJ-1

xuất hiện hiệu ứng cotton dương tại 224 nm cho cấu hình 2R ở vị trí

C-2, phù hợp với mô hình tính toán. Trên cơ sở phân tích dữ liệu

phổ, hợp chất mới OJ-1 được xác định là (2R)-(4-methoxybenzyl)-

5,7-dimethyl-6-hydroxyl-2,3-dihydrobenzofuran.

3.1.2. Hợp chất OJ-7: Homoisopogon B

Hình 55. Cấu trúc của hợp chất OJ-7 và các tương tác HMBC chính

13

Hình 57. Phổ 1H NMR của hợp chất OJ-7

Hợp chất OJ-7 đã được phân lập dưới dạng bột màu vàng.

Công thức phân tử được xác định là C19H22O4 trên cở sở dữ liệu phổ

khối phân giải cao HR-ESI-MS (m/z 315,1602 [M + H]+, tính toán lý

thuyết cho công thức C19H23O4, 315,1596). Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân 1H NMR thể hiện những đặc trưng hấp thụ tại δH 4,06 (1H, dd,

J = 2,0, 11,0 Hz) và 3,83 (1H, dd, J = 6,0, 11,0 Hz) gắn cho proton

H-2, δH 2,25 (1H, m) của proton H-3; δH 2,80 (1H, dd, J = 5,5, 16,0

Hz) và 2,44 (1H, dd, J = 6,5, 16,0 Hz) của proton H-4; δH 2,64 (1H,

dd, J = 9,0, 14,0 Hz) và 2,52 (1H, dd, J = 6,5, 14,0 Hz) được gắn cho

proton H-9. Thêm vào đó, trên phổ 1H NMR cũng xuất hiện những

tín hiệu tại δH 6,38 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3'), 6,40 (1H, d, J = 2,5, 8,0

Hz, H-5'), và 6,98 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6') gợi ý cho sự có mặt của

nhóm thế 1,2,4 trên vòng thơm B. Hai tín hiệu singlet của proton

thơm tại δH 6,76 (1H, s, H-5) và 6,34 (1H, s, H-8) đã được phát hiện,

gợi ý cho sự có mặt của 4 nhóm thế trên vòng A.

Từ phổ 13

C NMR và DEPT, mười chín tín hiệu cacbon đã

được ghi nhận bao gồm: một nhóm methyl [δC 15,3 (6-CH3)], 2

nhóm methoxy [δC 55,2 (7-OCH3) và 55,3 (4'-OCH3)], 3 nhóm

14

methylen [δC 69,2 (C-2), 30,2 (C-4) và 31,0 (C-9)], một nhóm methin

δC 33,2 (C-3), 5 methin của vòng thơm [δC 131,4 (C-5), 98,9 (C-8),

102,0 (C-3'), 106,1 (C-5'), và 131,5 (C-6')] và 7 cacbon thơm không

liên kết với hydro [δC 112,4 (C-4a), 119,1 (C-6), 156,7 (C-7), 152,7

(C-8a), 118,0 (C-1'), 155,0 (C-2') và 159,3 (C-4')]. Những dữ liệu

trên đã gợi ý rằng hợp chất OJ-7 là một homoisoflavane [5].

Hình 58. Phổ

13C NMR của hợp chất OJ-7

Trên phổ hai chiều tương tác xa HMBC đã thu được tín hiệu

tương tác giữa proton của nhóm methyl tại δH 2,10 (3H, s) với C-5

(δC 131,4), C-6 (δC 119,1) và C-7 (δC 156,7), và tín hiệu từ proton

của nhóm methoxy tại δH 3,74 đến C-7 và từ δH 3,73 tới C-4' (δC

159,3). Các kết quả này đã xác định vị trí của nhóm methyl và

methoxy trên khung homoisoflavane tại C-6, C-7 và C-4', tương ứng.

Cấu hình tuyệt đối tại C-3 cũng được xác định là R trên cơ sở hiệu

ứng cotton âm tại bước sóng 230 nm và hiệu ứng cotton dương tại

bước sóng 285 nm trên phân tích phổ CD và so sánh với tài liệu tham

khảo trước đó công bố cấu hình tuyệt đối cho hợp chất (3R)-6,4'-

dihydroxy-8-methoxyhomoisoflavan ([θ]282 +1080 và [θ]217 -2072)

15

[5]. Theo đó, cấu trúc hợp chất mới OJ-7 đã được xác định là (3R)-

4',7-dimethoxy-2'-hydroxy-6-methylhomoisoflavane và là một hợp

chất mới được gọi tên homoisopogon B.

Bảng 9. Số liệu phổ 1H và

13C NMR (CDCl3, δ ppm) của OJ-7

Vị trí TLTK [4] δCa δH

b dạng pic (J = Hz)

2 69,9 69,2 4,06, dd (2,0, 11,0)

3,83, dd (6,0, 11,0)

3 34,1 33,2 2,25, m

4 30,3 30,2 2,80, dd (5,5, 16,0)

2,44, dd (6,5, 16,0)

4a 113,8 112,4 -

5 130,5 131,4 6,76, s

6 107,8 119,1 -

7 155,3 156,7 -

8 103,0 98,9 6,34, s

8a 154,7 152,7 -

9 37,3 31,0 2,64, dd (9,0, 14,0)

2,52, dd (6,5, 14,0)

1' 132,6 118,0 -

2' 115,1 155,0 -

3' 145,0 102,0 6,38, d (2,5)

4' 145,5 159,3 -

5' 116,6 106,1 6,40, dd (2,5, 8,0)

6' 120,4 131,5 6,98, d (8,0)

6-CH3 - 15,3 2,10, s

7-OCH3 55,2 3,74, s

4'-OCH3 56,0 55,3 3,73, s a125 MHz, b500 MHz. Tham khảo hợp chất 7-hydroxy-3-(3-hydroxy-4-methoxybenzyl)chroman theo tài liệu [4].

16

3.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc

3.2.1 Hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư

Kết quả theo bảng cho thấy đối với dòng tế bào LU-1 có 4

hợp chất thử nghiệm mang hoạt tính tốt là OJ-1, OJ-6, OJ-7 và OJ-

8, trong đó OJ-6 thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC50 = 0,66

µM. Trong khi đó ở dòng tế bào ung thư biểu mô KB có 3 chất thể

hiện hoạt tính tốt là OJ-1, OJ-6 và OJ-15, trong đó OJ-1 có hoạt

tính mạnh nhất với giá trị IC50 = 0,51 µM. 6 hợp chất gồm OJ-1, OJ-

3, OJ-6, OJ-7, OJ-10 và OJ-15 lại có tác dụng gây độc tế bào ung

thư da (SK-Mel-2).

Điều đáng chú ý là hợp chất homoisopogon A (OJ-6) có tác

dụng rất mạnh trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 rất

thấp trong khoảng 0,51 đến 0,66 µM. Đây là hợp chất có khung

homoisoflavanone khá phổ biến trong chi Ophiopogon và được

chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm. Trong

nghiên cứu này, lần đầu tiên tác dụng gây độc tế bào ung thư của hợp

chất thuộc nhóm này ở nồng độ thấp được công bố. Trong nhóm chất

homoisoflavane một hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế trung bình

trên cả ba dòng tế bào ung thư là homoisopogon B (OJ-7) với giá trị

IC50 từ 17,14 đến 32,94 µM. Trong khi đó, homoisopogon C (OJ-8)

ức chế tế bào LU-1 với giá trị IC50 = 27,66 µM. Mối liên quan giữa

cấu trúc và tác dụng gây độc tế bào của các homoisoflavonoid đã

được nghiên cứu và công bố. Theo đó, nhóm 4'-methoxy được xem

là nhóm quyết định, có ảnh hưởng đến tác dụng độc tế bào của lớp

chất này. Trong nghiên cứu này, các homoisoflavonoid có nhóm thế

methoxy ở C-4' đã thể hiện hoạt tính mạnh trên ít nhất một dòng tế

bào ung thư. Trong khi đó, hợp chất homoisopogon D (OJ-9) với sự

17

có mặt của nhóm methylenedioxy ở C-3'/C-4' không thể hiện hoạt

tính ở cả ba dòng tế bào ung thư được nghiên cứu.

Trong số các hợp chất benzofuran thử nghiệm, chỉ duy nhất

OJ-1 có tác dụng gây độc tế bào. Hợp chất này có cấu hình tuyệt đối

ở C-2 được xác định là R, trong khi đó các chất còn lại ở dạng

racemic hoặc thêm nối đôi đều không có hoạt tính. Điều này gợi ý

vai trò quan trọng của cấu hình 2R trong khung 2-benzylbenzofuran.

Hình 115. Tác dụng gây chết theo chương trình OJ-6 trên dòng tế bào A549

Do hợp chất homoisopogon A (OJ-6) có tác dụng gây độc tế

bào ung thư rất mạnh trong đó có dòng ung thư phổi (LU-1), hợp

chất này được tiếp tục thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư phổi

kháng thuốc (A549). Kết quả cho thấy hợp chất này ức chế mạnh sự

phát triển của tế bào A549 (IC50 = 6,27 μM) so với thuốc chữa ung

thư camptothecin (IC50 = 12,4 μM). Tiếp đến, hợp chất này được

đánh giá sâu hơn về tác dụng diệt tế bào ung thư A549 theo cơ chế

% a

po

pto

tic

cell

s

18

gây chết theo chương trình (apoptosis) bằng phương pháp trắc lưu tế

bào.

Kết quả trên Hình 115 cho thấy sau 24 giờ ủ với OJ-6 ở

nồng độ 25 μM, tỷ lệ tế bào A549 chết rụng đạt khoảng 27,5%.

Trong khi đó với OJ-6 ở nồng độ 50 μM, tỷ lệ này tăng lên đến

83,8% còn tỷ lệ sống sót của tế bào chỉ còn 16,2%. Dòng tế bào

A549 thử nghiệm trong nghiên cứu này là dòng ung thư phổi tế bào

không nhỏ (NSCLC) kháng thuốc EGFR-TKI. Hiện nay, hiện tượng

kháng thuốc EGFR-TKI ở các NSCLC đang là thách thức lớn trong

điều trị ung thư phổi. Kết quả thu được cho thấy homoisopogon A

(OJ-6) là một hợp chất kháng ung thư tiềm năng, diệt tế bào ung thư

theo cơ chế gây chết theo chương trình.

3.2.2. Tác dụng tính ức chế sản sinh NO

Các hợp chất phân lập được đã được thử hoạt tính ức chế sản

sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS.

Trong số các hợp chất phân lập được, các hợp chất là dẫn xuất của

benzofuran thể hiện hoạt tính tốt nhất. Hợp chất OJ-1 ức chế mạnh

nhất sự sản sinh NO với giá trị IC50 = 11,4 µM, trong khi hợp chất

OJ-2 thể hiện hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC50 = 29,1 µM.

Các hợp chất khác thể hiện hoạt tính ức chế yếu hoặc không có hoạt

tính. 2,3-Dihydrobenzofuran được biết đến như là một hợp chất có

tác dụng kháng viêm mạnh. Điều này đã được chứng minh và thể

hiện rằng các hợp chất có khung 2,3-dihydrobenzofuran-2-one có

khả năng kháng viêm mạnh trên thử nghiệm in vivo. Các hợp chất có

khung 5-chloro-6-cyclohexyl-2,3-dihydrobenzofuran-2-one có ý

nghĩa ức chế mạnh hơn so với chất tham khảo, diclofenac, trong tất

19

cả các thí nghiệm [6]. Thêm vào đó, các hợp chất dihydrobenzo

furan được phân lập từ hạt Prunus tomentosa đã được thử nghiệm và

thu được kết quả ức chế mạnh sự sản sinh NO trên dòng tế bào BV-2

[7]. Từ kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra rằng, các dihydrobenzofuran

từ rễ củ mạch môn là một nguồn kháng viêm từ tự nhiên rất mạnh và

nên được nghiên cứu kỹ hơn để tìm ra các nguồn kháng viêm mới

trong công nghiệp sản xuất dược phẩm.

Hai hợp chất thuộc nhóm homoisoflavonoid gồm

homoisopogon A (OJ-6) và homoisopogon B (OJ-7) cũng thể hiện

tác dụng ức chế sản sinh NO với giá trị IC50 là 22,5 và 19,3 μM,

tương ứng. Các hợp chất khác đều không thể hiện tác dụng khi ở

nồng độ thử nghiệm lớn nhất 30 μM.

KẾT LUẬN

1. Về nghiên cứu thành phần hóa học

Từ rễ củ cây Mạch môn (O. japonicus), 15 hợp chất đã được

phân lập bao gồm 9 hợp chất mới, 2 hợp chất lần đầu tiên được phân

lập từ thiên nhiên và 4 hợp chất đã biết. Các hợp chất trên thuộc

nhóm chất benzofuran (5 chất), homoisoflavonoid (4 chất), flavonoid

(2 chất), eudesmane sesquiterpenoid (3 chất) và steroidal glycoside

(1 chất). Cấu trúc hóa học của chúng được xác định gồm:

Nhóm chất benzofuran: (2R)-(4-methoxybenzyl)-5,7-

dimethyl-6-hydroxyl-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-1, chất mới), 2-(2-

hydroxyl-4-methoxy-benzyl)-5-methyl-6-methoxyl-2,3-dihydrobenz

ofuran (OJ-2, chất mới), 2-(4-hydroxy-benzyl)-5,6-dihydroxylben

zofuran (OJ-3, chất mới), 2-(4-methoxy-benzyl)-6,7-dimethoxyl-

20

2,3-dihydrobenzofuran (OJ-4, chất mới từ thiên nhiên) và 2-(4-

methoxy-benzyl)-6,7-methylenedioxy-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-5,

chất mới từ thiên nhiên).

Nhóm chất homoisoflavonoid: homoisopogon A (OJ-6,

chất mới), homoisopogon B (OJ-7, chất mới), homoisopogon C

(OJ-8, chất mới) và homoisopogon D (OJ-9, chất mới).

Nhóm chất flavonoid: 8-C-methyl-3',5,5',7-tetrahydroxy-

3,4′-dimethoxyflavone (OJ-10, chất mới) và myricetin 3,4'-dimethyl

ether (3',5,5',7-tetrahydroxy-3,4'-dimethoxyflavone) (OJ-11).

Nhóm chất eudesmane sesquiterpenoid: 1α,4β,6β-

trihydroxy-5,10-bis-epi-eudesmane-6-O-β-D-glucopyranoside (OJ-

12), 1α,6β-dihydroxy-5,10-bis-epi-eudesm-4(15)-ene-6-O-β-D-

glucopyranoside (OJ-13) và 1α,6β-dihydroxy-5,10-bis-epi-eudesm-

3-ene-6-O-β-D-glucopyranoside (OJ-14).

Nhóm chất steroidal glycoside: (25R)-ruscogenin 1-O-(4-O-

sulfo)-β-D-fucopyranoside (OJ-15, chất mới).

Các hợp chất có khung 2-benzylbenzofuran rất hiếm gặp trong

đó dẫn xuất 2-benzyl-2,3-dihydrobenzofuran hầu như chưa được

phân lập từ thiên nhiên. Luận án đã phân lập và xác định được cấu

trúc hoá học của 5 hợp chất thuộc nhóm chất này. Cùng với các hợp

chất mới thuộc nhóm chất khác, đây cũng là những điểm mới nổi bật

của luận án đóng góp vào ngân hàng dữ liệu hoá học các hợp chất

thiên nhiên.

2. Về nghiên cứu hoạt tính sinh học

2.1. Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp

chất phân lập được trên dòng tế bào ung thư phổi kháng thuốc

21

(A549), ung thư phổi (LU-1), ung thư biểu mô (KB), ung thư sắc tố

(SK-Mel-2). Kết quả cho thấy hợp chất homoisopogon A (OJ-6) có

hoạt tính rất mạnh trên các dòng tế bào thử nghiệm (LU-1, KB và

SK-Mel-2) với giá trị IC50 từ 0,51 đến 0,66 µM so sánh với chất đối

chứng ellipticine. Hợp chất (2R)-(4-methoxybenzyl)-5,7-dimethyl-6-

hydroxyl-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-1) có tác dụng mạnh với giá trị

IC50 từ 8,86 đến 14,0 µM.

Đối với dòng tế bào ung thư phổi kháng thuốc (A549),

homoisopogon A (OJ-6) thể hiện tác dụng mạnh so với đối chứng

dương camptothecin. Hợp chất này thể hiện tác dụng gât chết tế bào

ung thư A549 theo cơ chế gây chết theo chương trình ở nồng độ thử

nghiệm 25 và 50 μM.

2.2. Đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa trên ảnh hưởng ức chế

sự sản sinh NO của 15 hợp chất trên tế bào đại thực bào RAW 264.7.

Trong số các hợp chất phân lập được, các hợp chất là dẫn xuất thuộc

nhóm benzofuran thể hiện hoạt tính tốt nhất. Hợp chất OJ-1 ức chế

mạnh nhất sự sản sinh NO với giá trị IC50 = 11,4 µM, trong khi hợp

chất OJ-2 thể hiện hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC50 = 29,1

µM. Hai hợp chất thuộc nhóm homoisoflavonoid là homoisopogon A

(OJ-6) và homoisopogon B (OJ-7) cũng thể hiện tác dụng ức chế

sản sinh NO với giá trị IC50 là 22,5 và 19,3 μM.

KIẾN NGHỊ

Đây là công trình nghiên cứu về Mạch môn O. japonicus, các

hợp chất phân lập thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cũng như hoạt

tính kháng viêm rất nhiều tiềm năng. Đặc biệt hợp chất

22

homoisopogon A (OJ-6) cần được nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính

sinh học theo tác dụng gây chết tế bào ung thư và kháng viêm.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Từ rễ củ cây Mạch môn (O. japonicus), 15 hợp chất đã được

phân lập bao gồm:

- 09 hợp chất mới [(2R)-(4-methoxybenzyl)-5,7-dimethyl-6-

hydroxyl-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-1), 2-(2-hydroxyl-4-methoxy-

benzyl)-5-methyl-6-me thoxyl-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-2), 2-(4-

hydroxy-benzyl)-5,6-dihydroxyl benzofuran (OJ-3), homoisopogon

A (OJ-6), homoisopogon B (OJ-7), homoisopogon C (OJ-8),

homoisopogon D (OJ-9), 8-C-methyl-3',5,5',7-tetra hydroxy-3,4′-

dimethoxyflavone (OJ-10) và (25R)-ruscogenin 1-O-(4-O-sulfo)-β-

D-fucopyranoside (OJ-15)].

- 02 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên [2-(4-

methoxy-benzyl)-6,7-dimethoxyl-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-4) và

2-(4-methoxy-benzyl)-6,7-methylenedioxy-2,3-dihydrobenzofuran

(OJ-5)] và 4 hợp chất đã biết. Các hợp chất trên thuộc lớp chất

benzofuran (05 chất), homoisoflavonoid (04 chất), flavonoid (02

chất), eudesman sesquiterpene (03 chất) và steroid glycoside (01

chất).

2. Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp

chất phân lập được trên các dòng tế bào ung thư phổi kháng thuốc

(A549), bào ung thư phổi (LU-1), ung thư biểu mô (KB), ung thư sắc

tố (SK-Mel-2). Kết quả cho thấy hợp chất homoisopogon A (OJ-6)

có hoạt tính rất mạnh trên tất cả các dòng tế bào LU-1, KB và SK-

23

Mel-2 với giá trị IC50 từ 0,51 đến 0,66 µM so sánh với chất đối

chứng ellipticine. Hợp chất này thể hiện tác dụng diệt tế bào ung thư

A549 theo cơ chế gây chết có lập trình ở nồng độ thử nghiệm 25 và

50 μM. Hợp chất OJ-1 có tác dụng mạnh với giá trị IC50 từ 8,86 đến

14,0 µM.

3. Đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa trên ảnh hưởng ức chế

sự sản sinh NO của 15 hợp chất tế bào đại thực bào RAW264.7.

Trong số các hợp chất phân lập được, các hợp chất là dẫn xuất của

benzofuran thể hiện hoạt tính tốt nhất. Hợp chất OJ-1 ức chế mạnh

nhất sự sản sinh NO với giá trị IC50 = 11,4 µM, trong khi hợp chất

OJ-2 thể hiện hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC50 = 29,1 µM.

Hai hợp chất homoisoflavonoid là homoisopogon A (OJ-6) và

homoisopogon B (OJ-7) cũng thể hiện tác dụng ức chế sản sinh NO

với giá trị IC50 là 22,5 và 19,3 μM.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Ortega, N.; Urban, S.; Beiring, B.; Glorius, F., Ruthenium NHC

catalyzed highly asymmetric hydrogenation of benzofurans.

Angewandte Chem. Int. Edition 2012, 51, 1710−1713.

2. Qi, P.; Jiang, J.; Qi, H.; Jin, Y.; Shen, Q.; Wu, Y.; Song, H.;

Zhang, W., Synthesis and antiproliferative activity of new polyoxo

2-benzyl-2,3-dihydrobenzofurans and their related compounds.

Lett. Drug Des. Dis. 2013, 10, 886−894.

3. Kwon, J.; Hiep, N. T.; Kim, D. W.; Hong, S.; Guo, Y.; Hwang, B.

Y.; Lee, H. J.; Mar, W.; Lee, D., Chemical constituents isolated

24

from the root bark of Cudrania tricuspidata and their potential

neuroprotective effects. J. Nat. Prod., 2016, 79, 1938−1951.

4. Masaoud, M.; Ripperger, H.; Porzel, A.; Adam, G., Flavonoids of

dragon's blood from Dracaena cinnabari. Phytochemistry 1995,

38 (3), 745-749.

5. Awale, S.; Miyamoto, T.; Linn, T. Z.; Li, F.; Win, N. N.; Tezuka,

Y.; Esumi, H.; Kadota, S., Cytotoxic Constituents of Soymida

febrifuga from Myanmar. J. Nat. Prod., 72 (9), 1631–1636.

6. Closse, A.; Haefliger, W.; Hausser, D.; U.Gubler, H.; Dewald, B.;

Baggiolini, M., 2,3-Dihydrobenzofuran-2-ones: A new class of

highly potent antiinflammatory agents. J. Med. Chem., 1981, 24,

1465−1471.

7. Liu, Q.-B.; Huang, X.-X.; Bai, M.; Chang, X.-B.; Yan, X.-J.; Zhu,

T.; Zhao, W.; Peng, Y.; Song, S.-J., Antioxidant and anti-

inflammatory active dihydrobenzofuran neolignans from the

seeds of Prunus tomentosa. J. Agri. Food Chem., 2014, 62, 7796–

7803.

25

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN

1. Nguyen Dinh Chung, Nguyen Phuong Thao, Ha Manh Tuan,

Nguyen Van Thanh, Nguyen Hai Dang, Nguyen Tien Dat. New

steroidal glycoside and flavonoid constituents from Ophiopogon

japonicus. Nat. Prod. Commun., 2017, 12(6), 905–906.

2. Nguyen Hai Dang, Nguyen Dinh Chung, Ha Manh Tuan,

Nguyen Tuan Hiep, Nguyen Tien Dat. Cytotoxic

homoisoflavonoids from Ophiopogon japonicus tubers. Chem.

Pharm. Bull., 2017, 65(2), 204–207.

3. Nguyen Hai Dang, Nguyen Dinh Chung, Ha Manh Tuan,

Nguyen Van Thanh, Nguyen Tuan Hiep, Dongho Lee, and

Nguyen Tien Dat. 2-Benzyl-benzofurans from the tubers of

Ophiopogon japonicus. Chem. Cent. J., 2017, 11:15.

4. Nguyen Dinh Chung, Nguyen Tien Dat, Le Thi Van Anh,

Jeong-Hyung Lee, Nguyen Hai Dang. Homoisopogon A from

Ophiopogon japonicus induced apoptosis in A549-a non small

cell lung cancer cell line. Tạp chí Sinh học 2017, 15(1), 35–39.

5. Nguyen Dinh Chung, Nguyen Hai Dang, Nguyen Van Thanh,

Nguyen Tien Dat. Eudesmane sesquiterpene glucosides from

Ophiopogon japonicus. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 2015,

53(4C), 56–62.