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Neue virologische Aspekte in der Transfusionsmedizin
Dr. Sylvia Emanuela Guber
Klin. Abteilung für Virologie
Allgemeines Krankenhaus Wien
Aktuelle Themen betreffend Virussicherheit in der Transfusionsmedizin
• Risikoberechnungsmodelle zur Wahrscheinlichkeit von HBV-,HCV-,HIV-Übertragung
• Prionerkrankungen: vCJD
• West-Nile Virus
• Vaccinia (Pocken-) Impfung
Risikoberechnungsmodelle :Restrisiko nach Einführung von Nukleinsäurenachweismethoden
(NAT)
Maßnahmen zur Vermeidung der Übertragung von Virusinfektionen
• Spenderselektion (freiwillige, unbezahlte Erst-,Mehrfachspender): Ausschluss von Personenkreisen mit Risikoverhalten
• Infektionsmarker: erfassen Infizierte nach der Fensterperiode– HBsAg, HCV 3rd Gen ELISA, HIV1/2 -Ak
ELISA
• NAT (seit 2.4.1999 in Österreich und 1.7.1999 in EU für HCV obligatorisch)
Risiko einer Virusinfektion/transfundierte Einheit• Sandler S.G Current Opinion in Hematology, 2002
– HBV 1:205.000– HCV 1:1.935.000– HIV 1:2.135.000
• Momentane Angabe Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland:
– HBV <1:250.000– HCV <1:700.000– HIV 1:2.000.000
Höhe des Risikos sich mit einem Blutprodukt zu infizieren
Vor Einführungder PCR Testung
Nach Einführungder PCR Testung
Hepatitis B <1:400.000 <1:500.000
Hepatitis C <1:500.000 <1:10.000.000
HIV-1/2 <1:2.000.000 <1:10.000.000
Risiko von transfusionsübertragenen Virusinfektionen bezogen auf Spenden in der
FensterperiodeCourance, New.Engl.J.Med. 335:1609-1610;1996
Diagnostische Fenster im Screening*
HIV HCV HBV
Bezogen aufSerologie
22(6-38)
70(38-94)
56(25-109)
Reduziert durch PCR 10-15 41-60 6-15
Fensterperiode nachNAT(median)
12 20 30-40
Viral load (geq/mL) 10 2-10 7 10 5-10 7 10 2-10 4
*Angaben in Tagen
Fensterperiode
– HIV: 22 (6-38) Tage– HBV(HBsAg): 56(25-109) Tage – HCV: 66 Tage (38-94) Tage
• Verkürzung durch Implementierung der NAT(Velati, Transfusion 2002):
– HIV: um 11(10-15 Tage)(Reduktion um 50%)– HCV: um 41-60 Tage (83% Reduktion)
Risikoermittlung
• Bestimmung der Virus Transmission nach Transfusion: bei den heutigen Testungen ( Serologie, NAT) sehr niedrige Fallzahl
• Mathematisches Risiko Modell– Bestimmung von Serokonversionsraten unter
Mehrfachspendern– Berücksichtigung der Fensterperiode
Serokonversionsraten unter Mehrfachspendern
• Schreiber et al., New Engl Journal of Medicine(1996):334,
1685-90 : Mehrfachspender(586.507 Spender) , 2.318.356 Spenden
• HTLV 1:641.000
• HIV 1:490.000
• HCV 1:103.000
• HBV 1:63.000
– Serokonversionsraten/100.000: HBV(9,8)>HCV(4.32)>HIV3.37
Risikoberechnungsmodelle zu HBV, HCV und HIV- Prävalenz
bei Blutspendern
• Wahrscheinlichkeit einer Übertragung einer Virusinfektion– Serokonversionsraten bei Mehrfachspendern in
einem 3-Jahresabstand (/100.000 Person -Years)
– Vorserokonversions- Fensterperiode
Höheres Restrisiko erklärbar durch
• Unerkannte Infektion: zu niedrige Viruslast um in Pool PCR erkannt zu werden
• Technische/menschliche Fehlerquellen– Falsch neg. 0,05% bzw. Probenverwechslung
• Virus-Mutanten• Immunkompetente chronische Virusträger mit
verzögerter oder fehlender Antikörperbildung ( Immunocompetent Immunosilent Carriers )
Prione, BSEvariant Creutzfeld Jakob
Krankheit (vCJD)und
Transfusionen
Zelluläres Prionprotein: PrPc
• Phylogenetisch altes Gen (750 bp);
• Mensch: kurzer Arm des Chromosom 20
• mRNA kodiert für 254 Aminosäuren
• Synthese: rauhes ER, Modifikation im Golgi, Transport zur Zelloberfläche (Cohen 1994)
• Vorkommen von PrPc: • höchste Expressionsrate in Neuronen, Gliazellen
• In hämatopoetischen Zellen:– CD 34 + Knochenmarksstammzellen
– während der Differenzierungsphase von Lymphozyten, Monozyten
– NICHT auf Erythrozyten und Granulozyten
Prionproteine• Prion Protein(PrP): körpereigenes
Strukturprotein– PrP c: zelluläres Prionprotein
– PrP sc: konformiertes, krankmachendes Prionprotein
• PrPc und PrPsc haben gleiche Aminosäuresequenz, aber andere Konformation und Glykosilierung, weshalb sie unterschiedlich auf Proteasen reagieren– PrPc reagiert sensitiv (PrPsens)
– PrP sc ist resistent (PrP res)
PrionhypothesePathologische Prion-Proteine (PrPsc)können
gesunde Prion-Proteine(PrPc)umformen
PrP C
PrPSc
PrP C
PrPSc
PrPSc
PrPSc
PrPSc
Mutante
PrPSc
Infektion
Prion-Proteine kommen in 2 Formen vor:Das normale unschädliche Protein (PrPc, a) kann zur pathogenen Isoform (PrPSc, b) umgewandelt werden. Diese Konversion schreitet in Form einer Kettenreaktion (c) fort. Dabei bilden sich lange filamentäre Aggregate (d), die schrittweise neuronales Gewebe zerstören. PrPSc ist resistent gegenüber hohen Temperaturen, UV-Bestrahlung und starken proteolytischen Enzymen (Proteinase K).
bc
a
d
KONFORMATIONSÄNDERUNG: PrPc PrPSc
Unterschiede zwischen PrPc und PrP Sc
• Physiologisches Protein (PrP c)– Sekundärstruktur vorwiegend
alpha Helikal
– Ständiger Auf-und Abbau des Proteins
– Durch Protasen vollständig hydrolysierbar
– Synthesezeit in der Zelle (t1/2)<2h
– Halbwertszeit in infizierten Zellen >>5h
– Thermo-und drucklabil/denaturierbar
– Liegt in der Membran in monomerer Form vor
• Pathologisches PrP (PrP Sc)– Sekundärstruktur vorwiegend in
Betafaltblattsruktur
– Konzentration in den Zellen
– Proteinase K resisitent
– Synthesezeit in der Zelle (t1/2) ~15h
– Halbwertszeit in infizierten Zellen>>24h
– sehr stabil gegenüber äußeren Einflüssen
– Neigung zur Aggregation
Prionerkrankungen
• Prionerkrankungen bei Tieren
– Scrapie
– Bovine Spongiforme Encephalopathie (BSE)
– Feline spongiforme Encepalopathie bei Katzen
– Transmissible mink encephalopathie (TME)bei Nerzen
• Transmissible spongiforme Encephalopathien(TSE) beim Menschen
– Kuru
– Gerstmann Sträussler Scheinker Syndrom (GSS)
– Fatale familiäre Insomnie (FFI)
– Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJK)
– variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJK)
Humane Prionen-assoziierte Erkrankungen
– Kuru– Creutzfeld Jakob Erkrankung (CJD)
• Iatrogen• Infektion (nvCJD)• Sporadisch• Familiär
– Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS)– Fatale familiäre Insomnie (FFI)
• Inkubationszeiten:
• Kuru: 5-35 Jahren (seit 1985 kein Auftreten von Kuru mehr bei Personen<35 Jahre)
• CJD: 7-30 Jahre• vCJD: dzt. Ca 10 Jahre
Transportweg für PrPsc
• Aufnahme von PrP sc aus Darmlumen ( M-Zellen)• Weitertransport via N. Vagus B-Lymphozyten
spielen eine wichtige Rolle (sezernieren Lymphotoxin-ß, das follikulär dendritische Zellen stimuliert)
• Aufnahme auf dem Blutweg: Bindungskapazität zu Plasminogen (Zirkulation der Prionen mit Lymphozyten im Blutkreislauf oder Anreicherung im lymphatischen Gewebe)
Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
• 10-15% genetisch bedingt; 250 Fälle: iatrogen überrtagbar; Rest sporadische CJD; familiäre CJD: Codon 200( Lys gegen Glu)bzw. Polymorphismus im Codon 178 des Prionproteingens
• Prävalenz: 1/ 1 Million Einwohner/Jahr, weltweit 5000/6000 CJD Fälle
• Inkubationszeit der iatrogenen Form:7-30 Jahre
• Erkrankungsbeginn 6. Dekade (50-75 Jahre)
• Prodromie: Angst, Insomnie
• 1.Psychiatrische Symptome: Fortschreitende Demenz, Neurologische Symptome: 87% Myoklonien, 84% zerebelläre Symptome; pyramidale und extrapyramidale Störungen und Akinesen
Unterschiede zwischen CJD und vCJD
• CJD:– Alter bei Ausbruch:55-70
Jahre
– Erste Symptome: Demenz, Myoklonus
– Verlauf:rasch voranschreitend
– Überlebenszeit: 4-6 Monate
– EEG:pathognomisch
– PrP Genotyp (Codon 129):homozygot (Val/Val oder Met/Met)
– PrP Bandenmuster im Westernblot:Typ 1, 2
– Typ3(iatrogen)
– PrP Sc Ablagerungen: synaptisch
• vCJD:– Alter bei Ausbruch: median 27
Jahre
– Erste Symptome: psychiatrische Auffälligkeiten
– Verlauf: schleichend: zerebelläre Ataxie, Dysästhesien, später Demenz, Myoklonus
– EEG: allgemeinverändert
– Überlebenszeit: 13 ( 7,5 -22) Monate
– PrP Genotyp (Codon 129): immer Methioninhomozygot
– PrP Bandenmuster im Westernblot:Typ 4
– Ablagerungen:floride Plaques
TSE-Infektionsrisiko durch von Blutprodukte
• Versuche in Tierexperimenten (Brown et.al, Manuelidis et al.)
• Annahme eines Restrisiko einer Übertragungvon vCJD durch Bluttransfusionen:
• für England mit 1: 66.000
• für Frankreich 1: 120.000 (Agence francaise de securite sanitaire des produit de sante 2000)
• Bislang ist beim Menschen noch kein Fall einer durch Transfusion ausgelösten CJD beschrieben worden!
Von Blutspende ausgeschlossen:
• Gesperrt sind Personen, nach Erhalt von – Wachstumsfaktoren – Dura mater Implantate– Cornealtransplantaten erhalten
• Personen in deren Familien CJD, GSS, FFI aufgetreten ist
• Sperre von Spendern bei Aufenthalt bei mehr als 6 Monaten in Großbritannien
West-Nile Virus
• Flavivirus
• 1999 : erste Fälle von West Nile Virus in New York
• von dort ausgehend Verbreitung von Oststaaten auf über 40 Bundesstaaten der USA
FLAVIVIRIDAE
• Genus Flavivirus– Gelbfieber
– Dengue Viruses1-4
– Mammalian Tick borne Encephalitis FSME(TBE, CEE;RSSE)
– Seabird tick borne encephalitis
– Japan Encephalitis Virus:West-Nile Virus, St.Louis Encephalitis
– Kokobera, Ntaya, Entebbe, Spontwendi, Modoc, Rio Bravo Viren
• Genus Pestivirus– BVDV( bovine viral diarrhoea virus), border disease of sheep,
hog cholera, swine fever
• Genus Hepacivirus:– HCV ( Hepatitis C-Virus)
– GB Viruses: HGV
Viren aus dem Japanische Encephalitis Komplex
• Cacipacore: Süd Amerika• Kourtango Virus: Afrika• Japan B Encephalitis Virus: Asien, Ozeanien,
Australien• Murray Valley V.,Alfuy V., Kunjin Viren:
Australien• St. Louis Encephalitis V.: Nord- und Südamerika• West-Nile Encephalitis Virus: Afrika, Asien,
Süd Europa, Nordamerika (seit 1999!)
West-Nile Virus
• 50 nm, Lipidhülle; 35 nm Kapsid
• Genom: ss(+) RNA; 11029 nt
• 35 nm Kapsid
• Proteine– C (core)– E (envelope) – M (membrane)– NS (nicht Stuktur)
Geographische Verbreitungvon WNV vor 1999
• Afrika:Uganda,
• Asien: Indien, Indonesien, Israel
• Australien,
• Europa:– Rumänien,
– Rußland,
– Südfrankreich,
Jährliche Todesfälle durch West-Nile Virus in den Vereinigten Staaten (Quelle: CDC )
USA( CDC) 1999 2000 2001 2002KlinischeFälle
62 21 66 3475
Todesfälle 7 2 9 201
Canada 2002KlinischeFälle
51
Todesfälle 2
West-Nile Virus in Vögelnund Stechmücken (Culex)
West-Nile Virus• Größe: 50 nm, Kapsidgröße 35 nm, umhüllt
Genom:+ssRNA aus 11029 Nukleotiden, – 2 lineages
• geographische Verbreitung: – Provinz West-Nile Uganda (Erstbeschreibung 1937)
– Afrika, Asien (Indien, Indonesien, Israel)
– Europa: Südfrankreich, Rumänien, Italien
• Übertragung von ornithophilen Mückenarten: (Culex univittatus,Culex pipiens); vor allem Rabenvögel sind sehr empfänglich(Virusreservoir)
Klinik von WNV:
• Virämiebeginn:1-2 Tage nach Mückenstich, Dauer: 6-11 Tage
• Inkubationszeit: 3-14 Tage
• Klinik: 20-30% der Infizierten zeigen 3-6 Tage andauernde klinische Symptome;1/150 bis 1/200 der Infizierten erkrankt schwer
• Todesfälle unter alten Menschen und Immunsupprimierten
– Kopf- und Augenschmerzen,
– Lymphknotenschwellung, Lymphozytopenie
– Ausschlag
– Desorientiertheit
– Muskelschwäche, Polymyelitis, schlaffe Lähmungen, Paralyse
– Meningitis – Encephalitis (1/1000)
Transmission von WNV
• Virämiebeginn:1-2 Tage nach Mückenstich
• Virämiedauer: 6-11 Tage
• Risiko einer Transmission über Blutkonserven:
– 1:5000 während des Ausbruch
Diagnostik von WNV
• NAT: RT-PCR, Taqman, NASBA
• WNV- IgM, IgG ELISA
• HHT
• Neutralisationstest
• Sobald Antikörper gegen WNV auftreten, ist keine Nukleinsäure mehr nachweisbar!
Therapie und Prophylaxe von WNV
• Therapieaspekte:– Ribavirin inhibiert in Zellkultur die
Virusreplikation und – Interferon in Testung
• Vaccine in Entwicklung
Inaktivierung von WNV
• Solvent/Detergent -Verfahren wirksam• Pepsin Behandlung von Pferde IgG:4log
Inaktivierung• Methylenblau-photoinaktivierung: 6 log Stufen• PEN-110 (Inactine)• Amotosalen (S-59)/UVA (PK):>5.7 log
• FRALE (S303 Frangible Anchor linked effektor treatment of read cells)inactivates> 6 log
Bedeutung von WNV in Transfusionsmedizin und Transplantation
• Fallbericht 1: Multi-Organspender erhielt 60 Konserven: 4 Empfänger an WNV erkrankt (1 Fall letal)
• Fallbericht 2: EK- Empfänger erkrankte an WNV-Encephalitis; Virus in Plasma nachgewiesen
• Fallbericht 3: EK postpartal verabreicht: WNV-Infektion bei der Mutter/ Virus über Muttermilch übertragen: Säugling blieb gesund entwickelte aber IgM-Ak; PK des selben Spenders war LTx Patient verabreicht worden.
Vorkehrung zur Verhinderung von WNV durch Transfusionen
• identifizierte virämische Spender bzw. Spender nach WNV Infektion bzw. nach Verabreichung von Blutprodukten
– für 28 Tage (USA)
– für 56 Tage ( Canada: Canadian Blood Services (CBS)) vom Blutspenden gesperrt
Transfusionsmedizinische Relevanz von West-Nil Encephalitis
• Im Jahr 2002 in den USA– 15 Transfusionsassoziierte WNME Fälle
– 4 Todesfälle (3 gesichert auf WNV zurückzuführen)
• SD-Behandlung von Plasmaprodukten • Europa: Vorkommen von WNV, anderer
Genotyp, nicht so pathogen. Maßnahmen für Spender, die Reisen in der höchsten saisonalen Aktivität (August, Sept) in die USA unter-nommen haben?
Poxviridae• Variola: linear doppelsträngige DNA, 130.000 bp
• Vacciniavirus:190.000 bp (Vaccinia Stamm Kopenhagen 191 636 bp)
Humanpathogene Vertreter der Orthopoxviridae
• Unterfamilie Chordopoxvirinae: – Genus Orthopoxvirus
• Variola (Variola vera)
• Vaccinia virus
• Kuhpocken
• Affenpocken
• Kamelpockenviren– Genus Parapoxviren
• Orfvius (Ecthyma contagiosum)
• Stomatitis Papulosa-Virus
• Pseudokuhpockenvirus( Melkerknoten)
– Genus Molluscipoxvirus :• Molluscum contagiosum (Dellwarzen)
– Genus Yatapoxvirus:• Tanapoxvirus
Pocken
• Pockeneradikation– 1967 begonnen– Elimination von Variola maior (1975) und
minor (1977) – 1980 von WHO deklariert
• Neue Bedrohung durch Bioterrorismus
• Hohe Mortalität
Klinischer Verlauf:
• Inkubationszeit:7-19 (10-14)Tage• Klinik:
– Fieber,nach 2-4 Tagen:Exanthem Ausschlag: semikonfluierende Variante, konfluierende Variante;
– Fieberbeginn bis Heilung: 21 Tage,Infektionszeitpunkt bis Heilung: 6 Wochen (später Schorfabfall)
• Letalität: – Variola maior : 30%
– Variola Minor: 5%
Österreichischer Pockenalarmplan
• Gefahrenstufe 0: Noch kein Pockenfall; Möglichkeit des Pockeneinsatz als Biowaffe
• Gefahrenstufe1:1. Pockenfall außerhalb Europas
• Gefahrenstufe 2: 1. Pockenfall in Europa
• Gefahrenstufe 3: 1. Pockenfall in Österreich
Vaccinia Impfstoffe• 1776 Edward Jenner: Kuhpockenderivat
• Lebendimpfung
• Bislang Impfung in Österreich bis 1979– Dryvac® (NYCBH- Wyeth, 2.5 x105 PFU):Impfstoff auf Tierhaut
gezüchteter Impfstoff : dzt. in den USA eingesetzt
– In Zellkultur gezüchtete Impfstoffe
• ACAM 2000 (NYCBH- Baxter; 108 PFU) : in Zellkultur gezüchtete Viren
• MVA-BN(Modified Vaccinia Ankara- Bavarian Nordic )und Elstree-BN
• 3rd Gen. Impfstoffe dzt in Entwicklung(i.m. Einsatz)
Impfnebenwirkungen:• Lokalisation von Nebenpocken (Häufigkeit:
1: 2000) bei Autoinokulation: Auge (Hornhauttrübung!!),Nase, Gesicht, Mund, Genital, Rektum
• Impfulkus
• Ekzema vaccinatum(CAVE Neurodermitis)
• Vaccinia generalisata
• Vaccinia progressiva
• postvaccinale Encephalitis
Impfung und Blutspende
• FDA: Nach einer Vaccinia Impfung darf bis zu 21 Tage nach Abheilen des Schorfs keine Blutspende erfolgen
• Sollten bei dem Geimpften durch Kontakt mit dem Pustelinhalt (Autoinokulation) Komplikationen aufgetreten sein ist von einer Blutspende bis 14 Tage nach Abklingen der Symptome eine Blutspende abzulehnen