Molekularna biologija

prokariota

II Molekularne osnove procesa:

Mehanizama reparacije oštećenja na molekulu

DNK kod prokariota

Reparacija DNK

Od vitalnog je značaja očuvati integritet nasledne informacije → kod svih organizama oštećenja na molekulu DNK se moraju ukloniti (ostali molekuli se mogu zameniti, ponovo sintetisati)

Raznovrsni reparacioni sistemi razvijeni tokom evolucije su rezultat raznovsnosti oštećenja koja nastaju na DNK

Većina reparacionih mehanizama se oslanja na komplementarnost baza i ne greši– error free

Mali broj mehanizama greši – error-prone

Održavanje života – strogi balans procesa reparacije DNK i mutageneze – dinamička ravnoteža koja učestalost mutacija održava na niskom nivou → balans očuvanja genetičke informacije i evolutivnih procesa

Mehanizmi DNK reparacije kod prokariota 1. Direktna reverzija oštećenja

Dealkilacija - demetiluje O6-metilguanin

Fotoreaktivacija – monomerizuje pirimidinske dimere

2. Eksciziona reparacija

- Ekscizija (isecanje) baza (BER) ispravlja oštećene ili neodgovarajuće baze u DNK (uracil, hipoksantin, alkilirane ili oksidovane baze)

- Ekscizija (isecanje) nukleotida (NER) ispravlja velike strukturne promene baza, pirimidinske dimere, prepoznaje distorziju heliksa

- „Mismatch repair“ (MMR) ispravlja greške u toku replikacije, pogrešno sparene baze

3. Mehanizmi tolerancije oštećenja

- rekombinacija (rekombinaciona reparacija, ispravlja prekide u DNK)

- DNK Pol II zavisan „bypass“ (premošćivanje) oštećenja, inducibilan proces

- DNK Pol IV i Pol V zavisna replikacija oštećenja, translezijska sinteza, inducibilna “error-prone” reparacija

Oštećenja DNK i reparacioni sistemi

Postoji delimično

preklapanje mehanizama:

Isti reparacioni

mehanizam ispravlja

različite tipove oštećenja

Veći broj reparacionih

sistema ispravlja jedan tip

(česta) oštećenja

Dealkilacija

Alkilirajući agensi (MMS, EMS, MNNG)

Enzim O6-metilguanin DNK metiltransferaza (produkt ada

gena) preuzima metil grupu sa O6-metilguanina, što ga

inaktivira (nije enzim po strogoj definiciji)

Neispravljen: G:C → A:T

Fotoreaktivacija

UV (254 nm) dovodi do dimerizacije pirimidina (ciklobutanski pirimidinski dimeri i 6-4 fotoprodukti)

Enzim fotoliaza sa kofaktorom FADH2

prepoznaje pirimidinski dimer i vezuje se

Kompleks apsorbuje kvant svetlosti (300-500 nm) i koristi energiju za razdvajanje dimera

Fotoliaza se oslobađa

Postoji kod mnogih bakterija, biljaka i nekih životinja (ne postoji kod placentalnih sisara)

Ekscizija baza - BER

Oksidativna deaminacija baza (C u

U), hidroksimetiluracil, 5-

metilcitozin, hipoksantin, 8-oxoG

Specifične DNK glikozilaze –

uklanjaju bazu, hidrolizuju N-

glikozidnu vezu (nastaje AP mesto)

AP endonukleaze - raskidaju

fosfodiestarsku vezu koja se nalazi 5'

(najčešće) ili 3' od AP mesta

Nukleotidi uklonjeni egzonukleazom

se zamenjuju reparativnom sintezom

(DNK Pol I) i ligacijom

Ekscizija nukleotida -

NER UvrABC endonukleaza + UvrD

helikaza

Prepoznavanje oštećenja (dimera) i

vezivanje proteinskog kompleksa

Dve incizije na oštećenom lancu (5' i

3' od mesta oštećenja)

Uklanjanje oligonukleotida (12 nt) sa

oštećenjem

Popunjavanje nastalog prekida DNK

polimerazom I i ligacija

„Transcription-coupled TC-NER”

(ispravka na transkripciono aktivnom

lancu) i globalna NER reparacija

(ispravka oštećenja na oba lanca)

Reparacija pogrešno sparenih baza - MMR Editorska funkcija DNK polimeraze zakaže:

postojanje pogrešno sparenih baza (npr. A:C)

Najčešći razlog nastanka: tautomerija baza

Obe baze su ispravne, ali pogrešno sparene

→ mora postojati signal koji lanac treba

ispravljati: Metilacija GATC sekvenci Dam

metilazom (razlikovanje roditeljskog i

novosintetisanog lanca)

MutS protein prepoznaje pogrešno sparen

bazni par

MutH endonukleaza prepoznaje

hemimetilovanu GATC sekvencu

Formira se MutS/MutL/MutH kompleks

MutH endonukleaza iseca nemetilovanu

GATC sekvencu

Lanac se degraduje egzonukleazama (dužina

fragmenta i do 2000 nt)

DNK Pol III popunjava prekid

DNK ligaza povezuje lanac

Postreplikativna rekombinaciona reparacija

Mehanizam za toleranciju oštećenja:

popunjavanje jednolančanih prekida u novosintetisanom lancu (daughter-strand gaps - DSG)

RecA zavisan mehanizam za ispravku:

jednolančanih prekida (single-strand breaks – SSB i DSG)

dvolančanih prekida (double-strand breaks - DSB)

Translezijska sinteza - TLS

Inducibilni mehanizam uključen u

toleranciju oštećenja

Replicira lanac koji sadrži

oštećenje

Jedan je od niza odgovora ćelije

na oštećenje DNK (SOS odgovor)

Biološki smisao SOS odgovora je

povećanje kapaciteta reparacije i

preživljavanja

TSL povećava preživljavanje, ali i

genetičku varijabilnost

Model SOS indukcije kod E. coli

LexA represor sprečava ekspresiju gena SOS regulona

Zaustavljanjem replikacije na oštećenju formira se signal za SOS indukciju (ssDNK).

RecA protein se vezuje za ssDNK i aktivira se (RecA*)

RecA* ima koproteaznu ulogu, pomaže autokatalitičku razgradnju LexA represora

Povećava se ekspresija inhibitora ćelijskih deoba i nekih proteina koji učestvuju u NER i rekombinacionoj reparaciji

Eksprimiraju se polB (Pol II), dinB (Pol IV), i umuDC operon (Pol V)

Pol V TLS RecA* omogućava post-translacionu

obradu UmuD proteina u aktivnu

formu UmuD’

Kompleks UmuD’2C je DNK Pol V

koja vrši translezijsku sintezu

Pol V nema editorsku funkciju

(egzonukleaznu funkciju), ne može

da ukloni pogrešan nukleotid

Replizom (Pol III) se zaustavlja na

oštećenju

Zamena replizoma mutazomom (Pol

V)

Translezijska sinteza, ugrađivanje

nekomplementarnih nukleotida

naspram oštećenja

Ponovno uspostavljanje replikacije

Pol II i Pol IV reparativni mehanizmi

Pol II:

ima editorsku funkciju

omogućava nastavak

replikacije nekoliko minuta

posle njenog zaustavljanja

na oštećenju

„replication restart“

mehanizmom “chickenfoot”

Pol IV

nema editorsku funkciju –

reparacija error-prone

replicira AP mesta i velike

adukte, npr. indukovane sa

derivatima B(a)P

ne može da ugrađuje nukleotide

naspram pirimidinskih dimera

Pol II replication restart

Regresija replikativne viljuške

pomoću RecA + RecFOR

kompleksa

Pol II kopira neoštećeni

novosintetisani lanac –

struktura “chickenfoot”

RecG vraća replikativnu

viljušku na početnu poziciju

PriA omogućava nastavak

replikacije pomoću Pol III

Mutageneza

Nastanak i vrste mutanata

Izolovanje mutanata

Fenotipska i genotipska promenljivost

Fenotipska promenljivost – adaptacija na

uslove u kojima se jedinke nalaze, zahvata sve

jedinke u populaciji, ne nasleđuje se

Genotipska promenljivost – promena u

genotipu, zahvata retke jedinke u populaciji i

nasleđuje se

Genetička varijabilnost

Postojanje genetičke varijabilnosti u populaciji je neophodno

za adaptaciju na izmenjene uslove sredine, opstanak i

evoluciju živih organizama.

Mehanizmi genotipske promenljivosti

Mutacije – promene u broju i redosledu nukleotida u

molekulu DNK

Rekombinacije – stvaranje nove kombinacije gena

prenosom dela genetičke informacije iz jedne ćelije u drugu

(horizontalni transfer gena)

Transpozicije – premeštanje jednog ili više gena sa jednog

mesta na drugo ili sa jednog replikona na drugi (sa

plazmida na hromozom ili obrnuto, sa jednog palzmida na

drugi isl.)

Promene u broju ili redosledu nukleotida u

molekulu DNK

Mutacije su redak i slučajan događaj i uglavnom

imaju negativan efekat

Mali broj mutacija omogućava evolutivne

promene

Mutacije

Tipovi mutacija

Tačkaste mutacije - zamene baznog para (tranzicije

ili transverzije) i promene okvira čitanja

Delecije - gubitak baznih parova

Adicije - dodavanje baznih parova

Insercije - umetanje većeg broja baznih parova

Inverzije - isecanje dela DNK i umetanje u obrnutom

smeru

Duplikacije - oblik adicija kod kojih su dodati

nizovi baza identični

Zamene baznog para - efekat na strukturu proteina

Vanfazne - frameshift mutacije

Upravne mutacije i reverzije

Upravne (forward) mutacije – u divljem soju, gubitak funkcije

Reverzije (povratne mutacije) – nove mutacije koje uspostavljaju

fenotip divljeg soja

Prave reverzije – nova mutacija je na istom mestu gde i prethodna, wt stanje

se uspostavlja i na genotipskom nivou

Supresije – nova mutacija je na drugom mestu ali poništava efekat prethodne,

na fenotipskom nivou se uspostavlja wt stanje

Intragenske supresije – nova mutacija u istom genu, npr. frameshift

Intergenske supresije – nova mutacija u drugom genu, npr. supresija

nonsense mutacije pomoću supresorskih tRNK

Spontane mutacije

Greške u replikaciji izazvane tautomerijom baza

“Proklizavanje” DNK Pol III na monotonim nizovima nukleotida

Replikacija ili „error prone“ reparacija endogenih oštećenja DNK (oksidativna oštećenja, depurinacija, itd)

Glavni mehanizmi u ćeliji koji kontrolišu nivo spontanih mutacija:

Selekcija baza i editorska funkcija DNK Pol III

Reparacija pogrešno sparenih baza – MMR

Redak događaj, u proseku 10-10 nukleotida

Indukovane mutacije

Izazvane brojnim hemijskim, fizičkim i biološkim agensima,

mutagenima, koji mogu izazvati različita oštećenja u

molekulu DNK i povećati stopu mutacija

Glavni mehanizmi nastanka indukovanih mutacija:

Zamena purinske ili pirimidinske baze (bazni analozi)

Hemijska promena baze koja izaziva pogrešno sparivanje

(alkilacija, oksidativna deaminacija)

Interkalacija (EtBr, akridin oranž)

Hemijska promena baze koja izaziva potpuni gubitak

sposobnosti sparivanja (pirimidinski dimeri, adukti)

Mutagen Dejstvo Tip mutacija

Bazni analozi

5-Bromouracil

2-aminopurin

Analog T, sparuje se sa G

Analog A, sparuje se sa C

AT→GC, GC →AT

AT→GC, GC →AT

Modifikacija baza

Azotasta kiselina HNO2

Hidroksilamin NH20H

Deaminacija A u H i C u U

Reaguje sa C

AT→GC i GC →AT

GC →AT

Alkilirajući i cross

linking agensi

Metil metan sulfonat MMS

Mitomicin C

Metiluje G (G me-T)

Povezuju lance u dsDNK

GC →AT

Tačakste, delecije

Interkalirajući agensi

Akridini

Etidijum bromid EtBr

Ubacuju se između 2 bp

Male insercije i delecije

Zračenja

Ultravioletno UV-254 nm

Jonizujuća (X-)

Formiranje dimera

pirimidina

Slobodni radikali, prekidi

lanaca

U toku ispravke može doći

do tačkastih mutacija ili

delecija

Fiksacija mutacija

Proces od nastanka oštećenja do

nastanka mutacije

Potrebne dve replikacije za

fiksaciju mutacija

U prvoj replikaciji naspram

oštećenja dolazi do ugrađivanja

nekomplementarnog nukleotida

u novi lanac DNK

U drugoj replikaciji dolazi do

kopiranja templeta sa pogrešnim

nukleotidom i stvara se mutirana

DNK

Posledice delovanja mutagena

Ispravka oštećenja reparacionim mehanizmima koji ne greše

Replikacija oštećenja ili ispravka oštećenja reparacionim

mehanizmima koji greše - indukcija mutacija

Smrt ćelije

Manje od 1/1000 oštećenja će biti fiksirano u mutaciju

Jedinke kod kojih je došlo do mutacija i

koje se fenotipski razlikuju od roditelja

Mutanti u morfologiji

Mutanti u ishrani (auksotrofi)

Mutanti rezistentni na antibiotike

Mutanti u reparaciji DNK

Uslovni mutanti

Mutanti

Izolovanje mutanata

U morfologiji

Zasejavanjem na bogate podloge i posmatranjem morfologije kolonija

pr. Serratia marcescens (crvene kolonije nemutirane, mali br. belih

kolonija – mutanti)

Rezistentnih na antibiotike

Zasejavanjem na podloge sa antibioticima (selektivne podloge –

selektivno rastu samo bakterije otporne na dati antibiotik)

Izolovanje auksotrofnih mutanata tehnikom kopiranja

bogata podloga mimimalna podloga

Izolovanje mutanata

U reparaciji DNK (primer: mutanti sa nefunkcionalnim NER mehanizmom)

„Replica plating“ tehniku koristimo da zasejemo bakterije na dve bogate

podloge, prvu tretiramo mutagenom (npr. ozračimo UV zracima), druga je

netretirana kontrola. One kolonije koje rastu samo na netretiranoj podlozi su

mutanti u reparaciji.

Uslovnih mutanata (primer: mutanti osetljivi na temperaturu)

U permisivnim uslovima mutacija se ne ispoljava na fenotipskom nivou, u

nepermisivnim se ispoljava. Replica plating tehniku koristimo da zasejemo

bakterije na dve bogate podloge, prvu gajimo u nepermisivnim uslovima,

drugu u permisivnim. One kolonije koje rastu samo u permisivnim uslovima su

uslovni mutanti.

Fenotip Vrsta promene Detekcija mutanata

Auksotrofi Odsustvo biosintetičkih puteva Ne rastu na MM

Osetljivi na

temperaturu

Promene u proteinima koji se

inaktiviraju na određenoj temp.

Ne rastu na temperaturama na

kojima roditelji rastu

Rezistentni na

antibiotike

Izmenjena propustljivost, izmenjeno

mesto vezivanja ili razgradnja

antibiotika

Rastu na antibiotskim

podlogama

Bez kapsule ili LPS Odsustvo enzima za sintezu kapsule ili

LPS

Male, grube (rough) i

nepravilne kolonije

Gubitak flagela,

nepokretni

Odsustvo enzima za sintezu flagelina Kompaktne kolonije

Gubitak pigmenta Odsustvo enzima za sintezu pigmenata Kolonije su drukčije boje ili

bezbojne

Ne fermentišu šećere Odsustvo enzima za razgradnju šećera Ne menaju pH podloge i boju

indikatora

Osetljivi na

mutagene

Odsustvo enzima za reparaciju DNK Ne rastu na podlogama koje

sadrže mutagen

Rezistentni na viruse Gubitak receptora za viruse Rastu u prisustvu virusa

Testovi za detekciju mutagena

Ames test, test na bakteriji S. typhimurium

Najpoznatiji, rutinski se koristi za ispitivanje mutagenog efekta

različitih supstanci

Osnovni princip: Bakterije gajimo u prisustvu i odsustvu test

supstance u uslovima koji dozvoljavaju uočavanje i brojanje

mutanata. Upoređivanjem broja mutanata zaključujemo da li je

test supstanca mutagena (i koliko je mutagena) ili nije.

Realizacija osnovnog principa:

Sojevi su mutanti u histidinskom operonu i ne mogu da rastu na podlozi bez

histidina

Pratimo reverzije, reverznim mutacijama nastaju ćelije koje mogu da

sintetišu histidin

Gajenjem bakterija na podlogama bez histidina (minimalna podloga)

selektujemo mutante

Upoređujemo broj mutanata koji se formira bez tretmana i nakon tretmana

test supstancom

His–

bakterije

Ne rastu

na MM

Medijum

sa

histidinom MM

His+

bakterije Reverzne mutacije

Mutagen

Ekstrahromozomalni

genetički elementi

Plazmidi i epizomi

Insercione sekvence i transpozoni

Invertibilni genetički elementi

Plazmidi Mali DNK molekuli van hromozoma, najčešće cirkularni (izuzetak su linearni

plazmidi Streptomyces i Borrelia)

Ako imaju sposobnost integracije u hromozom – epizomi

Imaju sopstveni ori, autonomno se repliciraju i regulišu broj kopija u ćeliji (F

faktor – br kopija 1-2, ColE1 – br kopija oko 50, postoje plazmidi sa ~100

kopija po ćeliji)

Mehanizam replikacije: cirkularni molekuli (θ replikacija, mehanizam

kotrljajućeg obruča); linearni molekuli (za 5’ kraj svakog lanca se vezuje

proteinski prajmer, jednolančani krajevi vezani kovalentno u strukturu

ukosnice – zaštita od ćelijskih nukleaza i obezbeđivanje prajmera)

Enzimi uključeni u relikaciju su kodirani sa hromozoma, ali plazmid

obezbeđuje informaciju za inicijaciju replikacije i pravilnu distribuciju kopija

u kćerke ćelije)

Nose genetičke informacije neesencijalne za domaćina (domaćin može da

preživi i bez plazmida, ne kodiraju esencijalne životne funkcije)

Povećavaju kompetitivnost, u specifičnim uslovima daju domaćinu selektivnu

prednost nad bakterijama koje ih ne poseduju (bolje preživljavanje)

Osobine bakterija kodirane plazmidima

Proizvodnja antibiotika (Streptomyces)

Proizvodnja bakteriocina (E.coli, Bacillus)

Konjugacija (E.coli, Staphylococcus, Streptococcus)

Rezistencija na antibiotike i teške metale (enterične

bakterije, Neisseria, Staphylococcus, Pseudomonas)

Specifični katabolički putevi (Clostridium, Rhizobium,

Pseudomonas – degradacija oktana, naftalena ili kamfora)

Faktori patogenosti (Salmonella, Staphylococcus,

Streptococcus, Agrobacterium, enteropatogene E.coli,)

Podela plazmida Prema veličini, broju kopija, sposobnosti za samostalni

transfer konjugacijom i mehanizmima replikacije

Konjugativni (veliki, mali broj kopija, repliciraju se sinhrono sa hromozomom domaćina, imaju mehanizme za distribuciju u ćerke ćelije)

Nekonjugativni plazmidi (mali, veliki broj kopija, repliciraju se nezavisno od replikacije hromoza)

Horizontalan transfer plazmida (prenos kroz populaciju sa ćelije na ćeliju: konjugacijom, nekonjugativni – transdukcijom ili transformacijom, ili ih konjugativni mobilišu

Svrstavaju se u inkompatibilne grupe u zavisnosti od gena uključenih u kontrolu replikacije (inc geni). Dva plazmida iste inkompatibilne grupe su u kompeticiji kada se nađu u istoj ćeliji domaćinu – ne mogu opstati zajedno, nakon određenog broja deoba jedan od njih se gubi.

F plazmid

Konjugacija kod E. coli

R plazmidi

R100 plazmid - 89,3 kbp

Rezistencija na streptomicin, spektinomicin, fusidinsku kiselinu, tetraciklin, hloramfenikol, sulfonamide i soli žive

Konjugativni plazmid enterobakterija

Ti plazmid iz Agrobacteruim tumefaciens

Nosi T-DNK koja se unosi u biljnu ćeliju, odlazi u nukleus i stabilno se ugrađuje u hromozome

T-DNK nosi funkcionalne biljne promotore odgovorne za pojačanu sintezu biljnih hormona, uzrokuje tumore stabla

Transformisano tkivo sintetiše opine, derivate arginina koji bakteriji služe u ishrani

Na Ti plazmidu su geni za katabolizam opina

Transpozoni

Genetički elementi koji se

premeštaju sa jednog

mesta na hromozomu na

drugo procesom

transpozicije - mesto

specifičnom

rekombinacijom (site-

specific recombination)

IS sekvence

Najjednostavnije građeni transpozoni, dužine 700-

2500 bp, kodiraju samo enzime transpozaze koji

katalizuju transpoziciju, na krajevima su invertovani

ponovci

Pravi transpozoni

Prosti: slične građe kao IS sekvence, ali pored gena

za transpozazu nose i gene za faktore virulencije ili

rezistenciju na antibiotike (Tn3, Tn7, itd)

Složeni: ograničeni IS sekvencama, a u centralnom

delu su geni za faktore virulencije ili rezistenciju na

antibiotike (Tn5, Tn10)

Najsloženiji transpozon je Mu (mju) bakteriofag.

Mehanizmi transpozicije

Konzervativna transpozicija

Isecanje transpozona sa

prvobitne pozicije i ugradnja

na novom mestu

(transpozon uklonjen sa

prvobitne pozicije)

Mehanizmi transpozicije

Replikativna transpozicija

Pojava nove kopije transpozona na drugom mestu

(transpozon postoji i na prvobitnoj poziciji)

Privremenu strukturu – kointegrat razdvaja enzim resolvaza

Efekti transpozicije

Insercione mutacije

Veliki genetički rearanžmani (delecije, inverzije)

Promene u ekspresiji gena

Invertibilni genetički elementi; fenomen fazne varijacije

kod S. typhimurium

Invertovani ponovci oko hin gena (kodira Hn protein – enzim invertazu)

Fazna varijacija – reverzibilne promene u strukturi flagela

Biološki smisao – zaštita od odbrambenih mehanizama domaćina (S.

typhimurium je patogena)