MODELAMIENTO MATEMÁTICO Y OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO …bdigital.unal.edu.co/53725/1/danielalexandermendezreyes... · 2016-09-21 · Resumen En el presente trabajo se desarrolló

MODELAMIENTO MATEMÁTICO Y OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE

PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS EMPLEANDO LA BACTERIA

Burkholderia cepacia B27 A PARTIR DE ÁCIDOS GRASOS.

Daniel Alexander Méndez Reyes

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería

Departamento de Ingeniería Química y Ambiental,

Bogotá D.C., Colombia

2016

MODELAMIENTO MATEMÁTICO Y OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE

PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS EMPLEANDO LA BACTERIA

Burkholderia cepacia B27 A PARTIR DE ÁCIDOS GRASOS.

Daniel Alexander Méndez Reyes

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ingeniería Química

Director:

Ph.D. Carlos Arturo Martínez Riascos

Codirectora:

M.Sc. Nubia Carmenza Moreno Sarmiento

Línea de Investigación:

Biopolímeros

Grupo de Investigación:

Bioprocesos y Bioprospección

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería

Departamento de Ingeniería Química y Ambiental,

Bogotá D.C., Colombia

2016

A mis padres, quienes nunca alcanzaría a

devolver lo mucho que me dieron, y a mi

hermano que es mi sangre.

Agradecimientos

A mis padres Maria Cecilia Reyes y Arnulfo Mendez Barrios quienes pusieron la piedra

angular de quien soy y lo que llevo, a mi familia por estar ahí siempre.

Agradecer a mis profesores Carlos Martínez y Nubia Moreno, por haber creído en mí y

brindarme todo el apoyo y condiciones necesarias junto al Instituto de Biotecnología y la

Universidad Nacional para realizar y culminar este trabajo de investigación.

A la planta docente tanto del instituto de Biotecnología como del Departamento de

Ingeniería Química y Ambiental, por los conocimientos adquiridos para mi desarrollo

profesional y Académico.

A mis compañeros de laboratorio Iván Cabeza, Jeimy Macias y Diana Vergara, por su

colaboración y enseñanzas en el desarrollo de mi trabajo de investigación.

A todas las personas que directa o indirectamente aportaron en la construcción de este

trabajo de tesis, muchas gracias, un reto más superado. Gracias a todos.

Resumen

En el presente trabajo se desarrolló un modelo matemático que reproduce el

comportamiento de la bacteria Burkholderia cepacia B27 en el proceso de producción de

PHAs (Polihidroxialcanoatos) con aceite vegetal, con el fin de ser utilizado para plantear

alternativas de optimización del proceso. Los efectos de inhibición y limitación por la fuente

de carbono y nitrógeno fueron verificados con experimentos en Erlenmeyer y bioreactor,

otros fenómenos como la inhibición por producto y biomasa fueron estudiados,

encontrando que la consideración de inhibición por biomasa permite predecir los

experimentos por lote con alta concentración de sustratos. También se observó cambio en

el rendimiento biomasa-nitrógeno dependiendo de la disponibilidad de nitrógeno en el

medio de cultivo, por lo que se incluyó una función para este parámetro. El modelo

desarrollado presentó un buen ajuste para los perfiles de biomasa, producto y sustratos

(E≈ 0.85), lo que indica que el modelo propuesto explica correctamente el proceso de

producción de PHAs. Para la optimización del proceso se evaluaron diferentes estrategias

operacionales, alcanzándose concentraciones de biomasa de 15.5 g/L peso seco con

acumulación del 86 % en polímero. Como resultado de la optimización, se lograron

mejoras en el rendimiento de la producción, aproximadamente del 20 %. Finalmente, se

observa que es necesario evaluar la influencia de diversos factores (biomasa,

concentración de polímero) que impiden obtener concentraciones de biomasa mayores,

con el fin de aumentar los rendimientos y la productividad del proceso.

Palabras clave: Burkholderia cepacia, polihidroxialcanoatos, optimización modelamiento,

aceite vegetal, bioproceso.

Abstract

In the present work a mathematical model which simulate the behavior of the bacteria

Burkholderia cepacia B27 with vegetal oil as substrate for the production of

polyhydroxyalkanoates (PHA) was developed. The model was thereafter extrapolated to

fed-batch to identify various nutrients feeding regimes during the biorreactor cultivation to

improve the PHB production. The inhibition and limitation effects of carbon source and

nitrogen on growing were verified with flask experiments and biorreactor, other phenomena

as inhibition by product and biomass were studies, the results showed inhibition by biomass

allows fittest prediction for high substrate concentration experiments. Modifications on

biomass-nitrogen yield depending on nitrogen availability were also observed, since a

function for this parameter was included. The developed model shows a good fitting with

experimental data (E≈ 0.85), which means model explain the PHAs production process. In

the process optimization, several operational strategies were evaluated, the best results

reached biomass concentration of 15.5 g/L with an overall PHA content of 86 %. The

optimization improves the production in, approximately, 20 %. Finally, it is necessary make

more efforts to evaluate the influence of inhibition factors, to obtain better process

productivity.

Keywords: Burkholderia cepacia, polyhydroxyalkanoates, optimization, modelling, vegetal

oil, bioprocess.

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................ IX

Lista de figuras ............................................................................................................. XV

Lista de tablas ............................................................................................................ XVII

Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................. XVIII

Introducción .................................................................................................................. 22

1. Objetivos ................................................................................................................. 25 Objetivo General ............................................................................................ 25 Objetivos Específicos..................................................................................... 25

2. Marco Teórico ......................................................................................................... 27 Producción de polihidroxialcanoatos .............................................................. 28 Bacterias para producción de PHAs .............................................................. 30 Fuente de carbono ......................................................................................... 32 Modelos no estructurados .............................................................................. 32

2.4.1 Suposiciones para el desarrollo de modelos no estructurados ............ 34 2.4.2 Estimación paramétrica ....................................................................... 35 2.4.3 Modelos no estructurados en producción de PHAs ............................. 37 2.4.4 Aplicación de modelos matemáticos en el análisis de la produccion y optimización de PHA ...................................................... 39

Regímenes operacionales de cultivo. ............................................................ 49 2.5.1 Cultivo por lote .................................................................................... 49 2.5.2 Cultivo continuo ................................................................................... 49 2.5.3 Cultivo en lote alimentado ................................................................... 50

3. Materiales y métodos ............................................................................................. 51 Microorganismo y medio de cultivo ................................................................ 51 Tren de inóculo .............................................................................................. 51 Estudios preliminares de inhibición y limitación de sustrato ........................... 52 Experimentos en biorreactor escala laboratorio ............................................. 53 Métodos analíticos ......................................................................................... 54

3.5.1 Cuantificación de biomasa .................................................................. 54 3.5.2 Cuantificación de amonio residual ....................................................... 54

3.5.3 Cuantificación de PHA ........................................................................ 55 3.5.4 Cuantificación del aceite vegetal residual ........................................... 55

Métodos matemáticos ................................................................................... 56 3.6.1 Ajuste de parámetros del modelo ........................................................ 56 3.6.2 Verificación del modelo ....................................................................... 56 3.6.3 Optimización de las condiciones operacionales .................................. 57

4. Resultados y discusión ......................................................................................... 58 Desarrollo del modelo inicial con parámetros constantes .............................. 58

4.1.1 Análisis de limitación e inhibición en escala matraz ............................ 58 4.1.2 Ajuste del modelo en escala biorreactor (Bioflo 7 L) ........................... 63 4.1.3 Estimación teórica de consumo de aceite vegetal ............................... 63

Desarrollo del modelo con inhibición y parámetro variable ............................ 69 Optimización del proceso .............................................................................. 81

4.3.1 Régimen por pulso de sustratos.......................................................... 83 4.3.2 Régimen por alimentación constante de sustratos .............................. 85

5. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 88 Conclusiones ................................................................................................. 88 Recomendaciones ......................................................................................... 89

Bibliografía .................................................................................................................... 91

Lista de figuras

Pág.

Figura 2-1: Esquema de las vías metabólicas que generan intermediarios de para la

síntesis polihidroxialcanoatos. ........................................................................................ 29

Figura 2-2: Diagrama de flujo para la construcción de modelos matemáticos. .............. 33

Figura 2-3: Esquema de reacción simplificado de los modelos no estructurados. ......... 35

Figura 4-1: Comportamiento de la velocidad especifica de crecimiento (𝝁)

como función de la fuente de nitrógeno en condiciones de limitación (A) y exceso (B)... 60

Figura 4-2: Comportamiento de la velocidad específica de crecimiento (𝝁)

como función de la fuente de carbono en condiciones de limitación (A) y exceso (B)..... 61

Figura 4-3: Cinética en biorreactor 5 L, con concentraciones iniciales de 20 g/L

(A), 5 g/L aceite vegetal (B) y 40 g/L(C) y sulfato de amonio de 2.8 g/L. ........................ 66

Figura 4-4: Cinética en biorreactor 60 L, con concentración inicial de aceite y sulfato

de amonio de 4 g/L. ........................................................................................................ 69

Figura 4-5: Ajuste de ecuaciones de saturación de velocidad de crecimiento, para

predecir el rendimiento biomasa sulfato de amonio dependiente de la relación C/N. ..... 73

Figura 4-6: Ajuste del modelo con parámetro variable de rendimiento con aplicación

de termino de inhibición por (A) producto, (B) fracción polímero biomasa y (C)

biomasa, en régimen lote a escala 100 L con concentraciones iniciales de (1)

100 g/L A.V y 2.8 g/L S.A., (2) 140 g/L A.V y 6.6 g/L. ..................................................... 75

Figura 4-7: Ajuste del modelo con parámetro variable de rendimiento con aplicación

de término de inhibición por producto (A), fracción polímero/biomasa (B) y

biomasa (C), para corridas de 5 L con concentraciones iniciales de 5 g/L A.V

y 2.8 g/L S.A.. ................................................................................................................. 76

Figura 4-8: Datos simulados frente a datos experimentales del modelo con

parámetro variable de rendimiento con aplicación de termino de inhibición por (A)

producto, (B) fracción polímero biomasa y (C) biomasa, en régimen lote a escala

100 L con concentraciones iniciales de 40 g/L, 4 g/L. ..................................................... 78

Figura 4-9: Ajuste del modelo para experimento con pulsos de 20 g/L. ......................... 83

Figura 4-10: Ajuste del modelo para experimento con pulsos de 40 g/L......................... 84

Figura 4-11: Ajuste del modelo para experimentos con alimentación para reposición de

nutrientes. ....................................................................................................................... 85

Figura 4-11: Ajuste del modelo para experimentos con flujo de alimentación constante. 86

Lista de tablas

Pág.

Tabla 2-1: Diferentes tipos de modelos para la cinética celular. ..................................... 34

Tabla 2-2: Ecuaciones propuestas por diferentes autores para la modelación y

optimización de procesos de producción de PHAs. ........................................................ 43

Tabla 3-1: Concentraciones para los experimentos a escala matraz ............................. 53

Tabla 4-1: Parámetros y coeficiente de correlación para los modelos propuestos

para la velocidad específica de crecimiento. .................................................................. 62

Tabla 4-2: Parámetros para el modelo completo con parámetros constantes. ............... 67

Tabla 4-3: Valores de eficiencia Nash–Sutcliffe, para el modelo con parámetros

constantes. ..................................................................................................................... 68

Tabla 4-4: Concentraciones iniciales a escala Bioflo ..................................................... 69

Tabla 4-5: Rendimiento biomasa/sulfato de amonio obtenidos y relación inicial

C/N en los experimentos a escala Bioflo. ....................................................................... 72

Tabla 4-6: Parámetros reportados para los diferentes modelos propuestos para

inhibición adicional, con rendimiento biomasa/sulfato de amonio variable. ..................... 79

Tabla 4-7: Valores de eficiencia Nash–Sutcliffe, para los modelos con inhibición y

rendimiento biomasa/sulfato de amonio variable. ........................................................... 80

Tabla 4-8: Modelo matemático para producción de PHAs por B. cepacia. ..................... 81

Tabla 4-9: Cuadro comparativo de los resultados del presente trabajo frente a otros

trabajos realizados en el IBUN y externos. ..................................................................... 87

Lista de Símbolos y abreviaturas

Símbolos con letras latinas

Símbolo Término Unidad SI Definición

D Dilución 1/h

𝐹 Flujo L/h Caudal

𝐹1 Flujo 1 L/h Caudal

𝐹2 Flujo 2 L/h Caudal

𝐹𝑛 Flujo nitrógeno L/h Caudal

𝑓𝑃𝐻𝐴

Fracción - Relación producto biomasa

𝑘1, 𝑘2 𝑘3, 𝑒 Constantes - Constantes de ajuste de modelo

𝐾𝑐𝑖 Constante de inhibición por sustrato carbono

g/L -

𝐾𝑛𝑖 Constante de inhibición por sustrato nitrógeno

g/L -

𝐾𝑝𝑖 Constante de inhibición por producto

g/L

𝐾𝑠𝑝 Constante de afinidad por producto

g/L -

𝐾𝑠𝑛 Coeficiente afinidad de sustrato al nitrógeno

g/L Concentración de sustrato

en la que la bacteria empieza a crecer

𝐾𝑠𝑐 Constante de afinidad con fuente de carbono

g/L Concentración de sustrato

en la que la bacteria empieza a crecer


𝑚𝑛 Mantenimiento por fuente nitrógeno

g/g.h Gramos nitrógeno por gramos de biomasa

𝑚𝑐 Mantenimiento por fuente de

carbono g/g.h

Gramos carbono por gramos de biomasa

𝑆𝑛 Sustrato fuente de nitrógeno g/L Gramos de sulfato de amonio por litro

𝑆𝑐𝑚 Constante de sustrato inhibitorio g/L Concentración máxima de

la fuente de carbono inhibitoria

𝑆𝑚𝑆𝑛𝑆𝑐

Constante de relación nitrógeno carbono máxima de inhibición

- Valor máximo de la

relación carbono nitrógeno

𝑆𝑛𝑚 Constante de sustrato inhibitoria g/L Concentración máxima de

la fuente de nitrógeno inhibitoria

𝑆𝑛𝑓 Fuente de nitrógeno g/L Concentración sustrato en flujo de alimentación

𝑆𝑐𝑓 Fuente de carbono g/L Concentración sustrato en flujo de alimentación

𝑆𝑐 Sustrato fuente de carbono g/L g sustrato / L de medio

V Volumen L

X Biomasa g/L gramos de biomasa por litros de medio

𝑌𝑥+𝑝𝑆𝑐

Rendimiento biomasa producto por fuente de carbono

g/g gramos de biomasa y

producto por gramos de carbono

𝑌 𝑥

𝑆𝑛

Rendimiento biomasa nitrógeno g/g gramos de biomasa por gramos de nitrógeno

Símbolos con letras griegas


α, β, 𝛾 Constantes relacionadas al producto g/g, g/gh


µ Velocidad específica de crecimiento 1/h

𝜇max Velocidad específica máxima de crecimiento

1/h

Subíndices Subíndice Término

c carbono

m máxima

n nitrógeno

0 Inicial

1 Tipo de sustrato

2 Tipo de sustrato

Superíndices Superíndice Término

𝑎1, 𝑎2 Exponente, potencia

𝑚 Exponente, potencia

𝑛 Exponente, potencia

Abreviaturas Abreviatura Término

A.V. Aceite vegetal

S.A. Sulfato de amonio

Abreviatura Término

Exp. Experimental

PHA polihidroxialcanoato

Introducción

El problema ambiental generado por la acumulación de los residuos de plásticos no

biodegradables ha llegado a alcanzar los 25 millones de toneladas al año (Choi & Lee, 1997;

Murray & King, 2012; Somleva et al., 2013). Aunque los materiales plásticos se han hecho

necesarios en nuestras vidas debido a su versatilidad, propiedades mecánicas y relativo bajo

precio, la mayoría de estos productos afectan el medio ambiente por los prolongados tiempos de

degradación y acumulación en el ambiente. Lo anterior ha promovido en los últimos años el

interés creciente en el desarrollo de polímeros biodegradables que puedan remplazar a aquellos

generados por síntesis química; entre dichos polímeros se encuentran los polihidroxialcanoatos

(PHAs), los cuales poseen propiedades similares al polipropileno y se han convertido en una

alternativa potencial para combatir la contaminación por plásticos a base de petróleo. Desde su

descubrimiento en 1926, la producción de PHAs ha sido ampliamente estudiada en diferentes

microorganismos, los cuales son seleccionados para generar altos rendimientos con bajos costos

de producción a escala industrial (Bohmert et al., 2002).

Los PHAs son poliésteres de hidroxialcanoatos, termoplásticos, biodegradables, producidos por

numerosos microorganismos bajo diferentes condiciones de cultivo (Lai et al., 2013). Varios

autores han demostrado que en la mayoría de casos bajas concentraciones de amonio, fósforo o

magnesio entre otros, durante la fermentación, inducen la producción de PHAs con diferentes

características (Lee et al., 1999; Suzuki et al., 1986), sin embargo, esto dependerá de la elección

del microorganismo; así mismo, el microorganismo tendrá una alta influencia en factores como la

fuente de carbono utilizada en el proceso, las velocidades específicas de crecimiento, la tasa de

biosíntesis, la calidad y cantidad de PHA, así como en el costo de los procesos de recuperación;

(Kahar et al., 2004; Verlinden et al., 2007).

Un resultado importante de diversos estudios es que las materias primas pueden generar

alrededor del 50% de los costos de producción (Choi & Lee, 1999 y 1997). Es por esto, que

Capítulo 2. Marco teórico 23

diferentes investigadores se han dedicado a viabilizar el uso de sustratos de menor costo, así

como a la identificación de cepas con mayor eficiencia, entre ellas la Burkholderia cepecia, la cual

es capaz de consumir diversos sustratos, con buenos rendimientos (Chee et al., 2010 y 2012;

Keenan et al., 2004; Obruca et al., 2014; Pan et al., 2012; Wang & Liu, 2014; Wang et al., 2010).

De este modo B. cepacia presenta un alto potencial para su uso en la producción de PHAs.

Igualmente se han buscado materias primas renovables de bajo costo, que generen buenas

propiedades al polímero producido y que tengan rendimientos altos en el proceso, es por eso que

se ha optado por desarrollar procesos a partir de subproductos de procesos industriales. En el

procesamiento de aceites vegetales se obtienen grandes cantidades de ácidos grasos como

subproducto que pueden ser una alternativa como fuente de carbono para la producción de PHAs

(Ballistreri et al., 2001; Chee et al., 2012). Adicionalmente, a partir de ácidos grasos se pueden

obtener altos rendimientos en la producción, cercanos a 1 gramo de PHA por gramo de ácido

graso consumido. El alto rendimiento se debe a la gran cantidad de átomos de carbono que son

direccionados por el metabolismo bacteriano hacia la producción de PHAs a partir de ácidos

grasos (Akiyama et al., 2003). Lo anterior se contrasta con la producción a partir de azucares,

donde la descarboxilación en la vía glicolítica reduce drásticamente el rendimiento.

A pesar de los diferentes esfuerzos por reducir costos en la producción de PHAs, mencionados

anteriormente, a nivel comercial factores como la reducción de los precios del petróleo hacen que

la producción de estos biopolímeros no pueda competir en el mercado con los plásticos

elaborados por síntesis química (Wang et al., 2014). Es por ello que el Instituto de Biotecnología

de la Universidad Nacional (IBUN) en conjunto con la Facultad de Ingeniería ha realizado

diferentes trabajos con el fin de mejorar la eficiencia del proceso de producción de PHAs. Entre

los desarrollos realizados está la estimación de la cinética de crecimiento con Ralstonia Eutropha

ATCC 17699, (Barbosa, 2002); así mismo la evaluación de sistemas de fermentación con el fin

de determinar técnicas que incrementen los rendimientos en el proceso con flujo de alimentación

continuo e intermitente en lote alimentado (Figueroa et al., 2005), y se ha incursionado en el

desarrollo de modelos matemáticos como herramienta en el incremento de la producción de PHAs

con Burkholderia cepacia nativa (Acosta, 2007).

Siguiendo la línea de mejoramiento del proceso de producción, en el presente trabajo se

incursiona en la implementación de estrategias de Ingeniería de Sistemas de Procesos (PSE,

24 Modelamiento matemático y optimización del proceso de producción de PHAs

empleando B. cepacia B27 a partir de ácidos grasos.

Process System Engineering) lo que requiere modelos predictivos que describan el proceso para

definir las mejores condiciones operacionales. Para el desarrollo de dichos modelos, se hace

imprescindible conocer el comportamiento de la cepa de interés frente a diferentes factores

ambientales que inciden directamente en la producción del metabolito deseado, el análisis del

proceso mediante modelos matemáticos permite la definición de las condiciones más adecuadas

para la producción del polímero y así aumentar tanto la eficiencia como la productividad del

proceso; adicionalmente, el uso de modelos predictivos facilita el escalamiento de los resultados

obtenidos en laboratorio y en planta piloto a escala industrial.

Diferentes autores han propuesto alternativas con el fin aumentar la productividad en el

bioprocesos de producción de PHAs, basadas principalmente en el control de la alimentación de

la fuente de carbono y de otros nutrientes, en fermentaciones tipo fed-batch (Lai et al., 2013).

Shang et al. (2007) construyeron modelos matemáticos y definieron la mejor operación por lote

alimentado considerando alta densidad celular con la cepa R. eutropha, para la producción de

PHB; de igual forma, Johnson et al. (2009) ajustaron un modelo metabólico para las velocidades

específicas de conversión y generación de biomasa en sistemas aeróbicos en reactores por lote

secuenciales y por lote alimentado. Igualmente Faccin et al. (2012) presentaron cuatro diferentes

modelos para la predicción de datos experimentales, los resultados presentados muestran que

estos modelos pueden ser usados como herramientas para mejorar la producción en bioprocesos.

De esta forma, la optimización del proceso de producción, empleando un modelo matemático que

prediga con buena aproximación la producción de PHAs para una cepa identificada como

eficiente (Burkholderia cepacia) con un sustrato de bajo costo, es una alternativa prometedora

para lograr un proceso competitivo.

En el presente estudio, como estrategia para reducir los costos de producción, se busca modelar

y mejorar la producción de biopolímeros del tipo PHAs empleando la bacteria Burkholderia

cepacia B27, con ácidos grasos como fuente de carbono. El modelo generado será no

estructurado y no segregado, pues predecirá los cambios en las concentraciones de biomasa,

producto y substratos, sin considerar los componentes de la biomasa, y analizando la biomasa

como una población celular homogénea, donde su comportamiento se aproxima al de una célula

promedio. De este modo, la disponibilidad de un modelo predictivo validado permitirá generar

estrategias para reducir los problemas de operación y mejorar la productividad global del proceso.

1. Objetivos

Objetivo General

Modelar y optimizar el proceso de producción de PHAs utilizando la bacteria Burkholderia cepacia

B27 y ácidos grasos como fuente de carbono.

Objetivos Específicos

Identificar los principales fenómenos (limitación, inhibición, muerte celular, consumo para

mantenimiento) que inciden en el proceso de producción de PHAs por la bacteria

Burkholderia cepacia B27

Formular, ajustar y validar un modelo matemático no estructurado, no segregado para el

crecimiento y producción de PHAs en Burkholderia cepacia B27, empleando ácidos

grasos como fuente de carbono.

Seleccionar el régimen operacional más adecuado para el proceso e identificar las

variables de control para su optimización.

Estimar las condiciones operacionales óptimas para el proceso y validar

experimentalmente estos resultados.

2. Marco Teórico

La dependencia y demanda global por los plásticos derivados del petróleo, principalmente por

sus bajos costos en el proceso de producción, versatilidad, y estabilidad, ha estimulado su uso

durante décadas, posicionándolos como unos de los materiales insignia de la época

contemporánea, incrementado su demanda en países de economía crecientes como India y

China (Murray & King, 2012; Somleva et al., 2013). Es así, como la producción de plásticos

derivados del petróleo para el 2014 alcanzó 311 millones de toneladas a nivel mundial

(PlasticEurope, 2015). Ese gran volumen de producción, sumado a la alta permanencia en el

ambiente por la ausencia de enzimas producidas de forma natural que los degraden eficazmente,

dificulta la disposición final de este tipo de material y por lo tanto lo ha transformado en un

problema de contaminación cada vez más preocupante para la sociedad (Kumar & Sudesh,

2013). Una de las estrategias de valorización de los plásticos a nivel mundial está centrada en la

incineración con fines energéticos debido al alto poder calorífico de estos materiales. Sin

embargo, debido a su origen fósil, la cuantificación de las emisiones de gases de efecto

invernadero debe ser tenida en cuenta con el objeto de evaluar completamente su ciclo de vida y

el efecto de esta práctica en el calentamiento global (Eurostat, 2001; OECD, 2013).

El problema de contaminación medioambiental generado por el uso masivo de los materiales

plásticos derivados de la industria petroquímica ha suscitado gran interés en la implantación de

procesos sostenibles (Bueno et al., 2009; Delgado-Rodríguez et al., 2010; Dorado et al., 2010).

Estos procesos implican la utilización de la biomasa derivada de residuos para generar materiales

alternativos a los polímeros de origen petroquímico (Lai et al., 2013; Rehm & Steinbüchel, 2005).

Lo anterior ha promovido en los últimos años más y más estudios para viabilizar la producción

comercial de biopolímeros amigables con el medio ambiente, identificándose un gran número de



posibles fuentes de obtención a partir de proteínas (animal y vegetal), lípidos y polisacáridos,

también desde monómeros bio-derivados como es el caso de los originado a partir del maíz, los

cuales son polimerizados a través de rutas ya estandarizadas, para obtener ácido poliláctico

(PLA) que es hasta ahora uno de los biopolímeros con mayor disponibilidad en el mercado. La

gran variedad de fuentes para la obtención de biopolímeros incrementan el número de

aplicaciones en las que se pueden utilizar por las diferentes características que puedan conferir,

convirtiéndolos en candidatos potenciales para aplicaciones biomédicas por ejemplo (Bugnicourt

et al., 2014).

En contraste, los polihidroxialcanoatos (PHAs) son poliésteres biogénicos que pueden ser

acumulados en cultivos microbianos los cuales han tenido una considerable atención durante las

pasadas tres décadas (Escapa et al., 2012), principalmente por su reconocido ciclo de

degradación, que los hace amigables con el medio ambiente (Koller et al., 2013). Lo anterior ha

conducido a que se presenten como una posible alternativa para reemplazar algunos plásticos

de origen petroquímico, ya que poseen propiedades similares a estos (Rodríguez-Contreras et

al., 2013; Sudesh, 2013; Sudesh et al., 2000) con excelentes propiedades mecánicas y químicas,

además de la biocompatibilidad, por lo que su uso es reconocido en diferentes campos de

aplicación (Nicolò et al., 2014).

Producción de polihidroxialcanoatos

Los PHAs de origen bacteriano son una única familia de polímeros sintetizados como alternativa

de almacenamiento energético por más de 300 especies de bacterias Gram-negativas y Gram-

positivas así como un gran rango de bacterias de la familia archea (Qi et al., 1998). Sintetizada

como inclusiones citoplasmáticas insolubles, en presencia de exceso de carbono cuando otros

nutrientes esenciales como oxígeno, fosforo o nitrógeno son limitados, estos materiales

poliméricos pueden ser acumulados en elevadas concentraciones desde que no alteren

sustancialmente el equilibrio osmótico de la bacteria (Anderson & Dawes, 1990), el polímero

producido tiene propiedades hidrofóbicas, insolubilidad en agua y estabilidad en el aire

indefinidamente, también son termoplásticos o elastómeros, no tóxicos y poseen una alta pureza

dentro de la célula (Filomena et al., 2000) además los polímeros resultantes son piezoeléctricos

y biocompatibles. Por otro lado, la especificidad de la polimerasa (o PHA sintasa) influye en el


tipo de monómeros que serán incorporados en el polímero por el metabolismo de la bacteria

(Chen, 2009), otros factores que afectan el tipo de monómero que forma el polímero son: tipo de

microorganismos (Gram-negativos o Gram-positivas), componentes en el medio de fermentación,

condiciones y tipo de fermentación (lote, lote alimentado, continua) y los procesos posteriores de

recuperación (Keshavarz & Roy, 2010).

Una amplia variedad de microrganismos se ha venido reportando durante años para la producción

de PHAs, entre las cuales se encuentran bacterias Gram- negativas y Gram-positivas, como

Bacillus spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp., Aeromonas hydrophila, Rhodopseudomonas

palutris, Echerichia coli, Burkholderia sacchari, Halomonas boliviensis y Rhalstonia eutropha entre

otros (Kahar et al., 2004; Patniak, 2009; Verlinden et al., 2007). Estos microorganismos pueden

tener una o varias de las rutas metabólicas para la producción de PHAs, entre las más conocidas

se encuentran la ruta por Entner-Doudoroff, la síntesis de novo de ácidos grasos y la -oxidación

de ácidos grasos (Doi & Abe, 1990; Doi, Kitamura, & Abe, 1995) las cuales se resumen en la

Figura 2-1.

Figura 2-1: Esquema de las vías metabólicas que generan intermediarios para la síntesis de polihidroxialcanoatos. Adaptado de Aldor & Keasling (2003).

phaA – cetotioasa

phaB – cetoacil-CoA reductasa

phaC – PHA sintasa

phaG – ACP-Co transacilasa

phaJ – Enoil-CoA reductasa (r) específica

1 – Ceto reductasa

2 - Epimerasa

β-oxidación de

ácidos grasos

Biosíntesis de

ácidos grasos

Carbohidratos Ácidos Grasos



Estas tres rutas sintetizan la 3-hidroxiacil CoA con la cual se generan los PHAs mediante la PHA

sintasa (Rehm & Steinbüchel, 2005). De esta forma, el uso de cada sustrato dependerá de la

cepa seleccionada, haciendo que esta decisión sea fundamental para la implementación del

proceso, así como para las características finales del polímero.

Aunque en laboratorio se han obtenido buenos resultados en la generación de PHAs, la

producción a escala comercial demanda costos de materias primas de alrededor del 50% del

costo global de producción (Choi & Lee, 1997, 1999), propiciando la búsqueda de materias primas

de bajo costo. Muchas fuentes de carbono renovable han sido implementadas para producir

PHAs, entre las cuales se encuentran fuentes de carbono de primera generación como granos,

azúcar de remolacha y de caña, almidones y aceites comestibles así como las de segunda

generación como melazas, residuos lignicelulósicos, suero, biodiesel, residuos del biodiesel como

glicerol, y residuos grasos (S. Y. Lee, 1996, 2000). Además de otros carbohidratos como la xilosa,

galactosa, glicerol, borra del café (Annuar et al., 2007; Keenan et al., 2004; Obruca et al., 2014),

siendo las anteriores fuentes de carbono, buenas alternativas de reducción en el costo de

producción, para aumentar la viabilidad de la producción de los polímeros biodegradables.

Bacterias para producción de PHAs

El Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia en conjunto con la Facultad

de Ingeniería ha realizado diferentes trabajos con el fin de mejorar la eficiencia del proceso de

producción de PHAs. Entre las alternativas propuestas está la evaluación de diferentes cepas

como Pseudomonas putida, Burkholderia cepacia 2G57 (Suárez, 1997), y Ralstonia Eutropha

ATCC 17699 (Barbosa, 2002) esta última obtenida a través de aislamientos consecutivos de

microorganismos con alta capacidad de producción del polímero (Moreno & Serrato, 2004;

Moreno et al., 2004) logrando los mejores resultados de producción de PHA reportados hasta

entonces (0.22 g/l) (Garzón & Moreno, 2005). Por otro lado, se han realizado trabajos dirigidos a

la amplificación del gen de la PHA sintasa, el cual es de gran importancia por ser el principal gen

que promueve la producción de PHA en la mayoría de microorganismos. Dicha amplificación

permite una mejor identificación para la selección de bacterias hiperproductoras (Revelo, 2005).

Así mismo, se han realizado pruebas con diversas fuentes de carbono como ácido octanóico,

fructosa y glucosa (Moreno et al., 2004).


La Burkholderia cepacia es una bacteria Gram-negativa que puede utilizar gran variedad de

fuentes de carbono para producir PHAs de cadena corta incluyendo los homopolímeros

polihidroxibutirato y polihidroxivalerato bajo estrategias específicas de alimentación (Keenan et

al., 2004), además ha demostrado adaptación en el consumo de varios compuestos tóxicos (Pan

et al., 2012) así como extractos hidrolizados de madera (Wang & Liu, 2014), aceites vegetales

(Chee et al., 2010) y hasta borra de café (Obruca et al., 2014). Esta versatilidad para consumir

diferentes sustratos la ha convertido en candidata para procesos de recombinación con la

Aeromonas caviae (Chee et al., 2012), demostrando la posibilidad de mejora genética y el

potencial de esta bacteria para los procesos de producción de PHAs.

La bacteria empleada en este trabajo pertenece al Phylum: Proteobacteria; Clase: β-

Proteobacteria; Orden: Burkholderiales; Familia: Burkholderiaceae; Genero: Burkholderia;

Especie: cepacia; Sub especie: B27.

Es una bacteria Gram negativa, bacilo no fermentador, aerobio estricto, mesófila crece en rangos

de temperatura de 30-35 °C, organismo quimioorganotrófico, Oxidasa y Catalasa (+). B. cepacia

puede encontrarse en diferentes ambientes, como suelo, agua, y plantas en una variedad de

regiones geográficas, fuentes animales y muestras clínicas diferentes. En el proceso de

mejoramiento de la cepa, se generó la sobreproducción de PHA en mutantes de la cepa

Burkholderia cepacia 2G57 (BC_2G57), previamente aislada de suelos colombianos.

Inicialmente, se obtuvo la secuencia del genoma para BC_2G57, anotado respecto al genoma de

referencia de Burkholderia cenocepacia J2315, y los genes que codifican PHA fueron

identificados y localizados en la cepa BC_2G57. A partir de la cepa Burkholderia sp 2G57 se

realizó un proceso de mutación y selección de la cepa de mayor acumulación de

polihidroxialcanoatos. Se utilizó la cepa B27 y se mejoraron sus condiciones de crecimiento y

acumulación del biopolímero, evaluando la temperatura (25 – 35 °C), la fuente de carbono (aceite

vegetal (A.V.) y ácido oleico) y su concentración (10 – 40 g/L), así como la aireación del

fermentador (1-2,5 vvm) manteniendo los parámetros y el medio de cultivo evaluados para la cepa

2G57, encontrando que para una temperatura de 32 °C, 15 g/L de ácido oleico y 2 vvm de

aireación se obtienen concentraciones máximas de 10,8 g/L y 7,9 g/L de biomasa y PHA,

respectivamente, equivalente a 73 % de acumulación. La productividad del cultivo fue de 0,27 y

0,19 g/L-h de biomasa y PHA respectivamente. (Moreno et al; 2015).



Fuente de carbono

El bajo nivel de producción de PHA de cadena media, el cual posee mejores propiedades

físicoquimicas, junto al limitado uso de sustratos por las diferentes especies de bacterias

productoras, limitan la producción de este tipo de polímero. Se ha observado que cuando una

bacteria es alimentada con ácidos grasos, estos pasan hacia la ruta biosintética de la beta-

oxidación para producir PHAs; en consecuencia la cadena de ácido graso únicamente pierde 2

átomos de carbono por cada ciclo, aumentando los rendimientos a partir de este tipo de fuente

de carbono (Liu et al., 2011; Chung et al., 2011), lo anterior ha demostrado que los rendimientos

de PHA a partir de aceites vegetales son superiores con respecto a otros sustratos evaluados

como sacarosa, con el cual se obtienen rendimientos de 0.32 g de polímero por g de carbohidrato

(Nonato et al., 2001). El rendimiento del proceso con el uso de aceites es aproximadamente 1 g

de polímero por g de ácido graso (Akiyama et al., 2003).

En la literatura se encuentra algunas publicaciones donde se han empleado utilizan ácidos grasos

insaturados tales como ácido oleico (C18:1), aceite de soya, maíz, oliva y palma, para producir

polímeros de cadena media con cadenas laterales de monómeros insaturados, lo que reduce en

gran medida la necesidad de mejorar las propiedades mecánicas de los polímeros resultantes y

aumenta el aprovechamiento de este tipo de fuentes de carbono de cadena larga (da Cruz

Pradella, Ienczak, Delgado, & Taciro, 2012; Fukui & Doi, 1998; Gumel, Annuar, & Heidelberg,

2012; Kahar et al., 2004).

Modelos no estructurados

Los diferentes modelos matemáticos tienen una importancia generalizada en diferentes campos

y disciplinas, ya que son capaces de traducir fenómenos reales en conceptos abstractos,

permitiendo predecir la realidad con ciertos niveles de confianza; sin embargo, estos modelos

tienden a estar contenidos en un proceso cíclico de mejora, en el cual el viejo modelo es

rechazado por un nuevo postulado (Harder & Roels, 1982), como se presenta en la Figura 2-2.

Por lo tanto, la utilidad de los modelos para correlacionar los datos provenientes de mediciones

reales y proveer una forma concisa de pensar acerca del sistema o proceso, permite predecir

cualitativamente el funcionamiento de un proceso el cual debe estar claramente definido en un


rango de validez en el que puede predecir, esto quiere decir, que las condiciones en las que

pueden aplicarse un modelo son limitadas a un intervalo que debe ser claramente definido (Harder

& Roels, 1982).

Figura 2-2: Diagrama de flujo para la construcción de modelos matemáticos. (Harder & Roels, 1982).

A pesar de lo anterior, los modelos matemáticos son una herramienta de gran utilidad para reducir

la cantidad de ensayos experimentales en el diseño u optimización de un proceso. De esta forma,

los modelos matemáticos pueden brindar un acercamiento más conciso sobre el proceso o

sistema, lo que puede dar una guía al diseño de experimentos que conduzca a aislar los

parámetros más importantes para comprender la naturaleza del sistema, con el fin de estimar los

parámetros más acertados que arrojen modelos de mayor confiabilidad (Fredrickson et al., 1970).

Además, el uso de modelos simples como los no estructurados permite un acercamiento a la

teoría biológica del comportamiento del microorganismo sin una complejidad abrumadora, por lo

que su aplicación es recomendable para etapas iniciales de una investigación donde se desee

indagar el modelamiento de los procesos realizados por microorganismos. Así mismo se debe

tener en cuenta que un mecanismo altamente específico (modelos estructurados) no debería ser

postulado sin evidencia empírica, lo que requiere más tiempo y ensayos experimentales. Por otro



lado, la modificación de un modelo simplificado con nueva evidencia empírica es más simple y

conduce a modelos de gran utilidad y al igual que todos los modelos, se gana una comprensión

más acertada del mecanismo biológico en estudio y se crea un marco conceptual, el cual debe

ser validado, lo que conduce necesariamente a una nueva experimentación del mismo para

mejorarlo. Por último, aunque exista la posibilidad de que aparezca un nuevo número de

propiedades del sistema biológico de interés, la construcción de un modelo simple hace que las

suposiciones complejas sean innecesarias (Williams, 1967).

2.4.1 Suposiciones para el desarrollo de modelos no estructurados

Frente a la gran complejidad y las necesidades referentes a la predicción del comportamiento de

los microorganismos, la formulación de algunas suposiciones frente a la gran complejidad del

microorganismo, su crecimiento y reproducción, nos permite llegar a modelos simples, pero de

gran utilidad en el diseño de fermentadores, así como en la predicción del comportamiento celular.

Una de las consideraciones consiste en representar todos los microorganismos como un único

individuo, esta suposición se soporta por el hecho de que cuando el microorganismo se duplica,

este duplica igualmente todos los componentes cuantificables de la población celular; la segunda

suposición es que la masa de la población celular está distribuida uniformemente en el cultivo

tomándose como un cultivo homogéneo (Lee, 1994). La Tabla 2-1 muestra las consideraciones

relacionadas a los modelos no estructurados no segregados y su diferenciación frente los

estructurados segregados.

Tabla 2-1: Diferentes tipos de modelos para la cinética celular.

según la

población

según los componentes celulares

no estructurado estructurado

no segregado

los microorganismos son representados por un único componente, el cual está

distribuido uniformemente en el cultivo

múltiples componentes celulares distribuidos uniformemente en el cultivo, los

cuales interactúan unos con otros

segregado

los microorganismos son representados por un único

componente, pero este forma una mezcla heterogénea

microorganismos compuestos por diferentes componentes, los cuales forman

una mezcla heterogénea


Fuente (Tsuchiya et al., 1966).

Aunque los modelos no estructurados simplifican el problema real, no significa que no sean

importantes en procesos de producción, su importancia radica en que las ecuaciones propuestas

tienen un sentido físico acertado y se toma al microorganismo, no tanto como un organismo

complejo, si no como una especie reactante sencilla (Almudena et al., 1999). El esquema que

incorpora la mayoría de modelos no estructurados se basa en parte en el esquema mostrado en

la Figura 2-3.

.

Figura 2-3: Esquema de reacción simplificado de los modelos no estructurados. Fuente (Almudena et al., 1999)

2.4.2 Estimación paramétrica

El modelamiento del comportamiento cinético de los microrganismos es una estrategia para

alcanzar un conocimiento fundamental en los bioprocesos. Para el modelamiento es importante

la recolección de datos experimentales que permitan la estimación de parámetros antes de

cualquier uso o aplicación del modelo, lo que conlleva al problema clásico de la estimación

paramétrica. Mientras que los datos obtenidos de la simulación con un modelo existente se

generan de cálculos matemáticos y carecen de ruido u otro tipo de error, los datos usados para

la elaboración del modelo, por ser experimentales, pueden contener errores debido a la limitación

en observación y en los instrumentos, lo que afecta la capacidad del modelo (S. Liu, 2013).

En ocasiones donde no es posible tener acceso al conocimiento teórico fundamental del

microorganismo, lo que sucede frecuentemente, se pueden generar dificultados en el

modelamiento, lo que puede ser en parte resuelto, con el uso de datos experimentales que



permiten identificar relaciones o tendencias entre las diferentes variables y buscar soluciones a

la ausencia de conocimiento teórico. Además, en un proceso de optimización el modelo

matemático se convierte en pieza fundamental, ya que provee la predicción de una nueva entrada

o proceso de control sin haber sido probado en la práctica. Para un modelo matemático se debe

antes que nada determinar si las variables tienen alguna relación con el modelo, entonces se

determina cuán buena es dicha relación; aun así, el modelo matemático debe ser determinado a

partir del conjunto de datos experimentales lo que nos introduce al problema clásico del análisis

de correlación, o también llamado análisis de regresión o ajuste de la curva.

Los tres tipos de análisis: estimación paramétrica, regresión y correlación están interrelacionados.

La regresión o ajuste de curva, consiste en la selección de un modelo matemático en el cual se

aplica la estimación paramétrica para determinar los coeficientes desconocidos. El modelamiento

matemático es conocido como regresión del modelo. Por otro lado, la correlación, una

terminología más conocida entre estos tres tipos de análisis, consiste en determinar si las

variables están relacionadas o correlacionadas, es entonces cuando la regresión o ajuste de la

curva es aplicado para encontrar la mejor relación para asociar las variables. Por el hecho de que

las tres terminologías son un poco confusas debido a su relación en la solución de estimaciones

paramétricas, frecuentemente se usa el término de correlación o ajuste de curva. Por ejemplo, en

una situación en la que se pueden conseguir buenos ajustes a un conjunto de datos

experimentales con diferentes funciones, se puede caer en la confusión de aceptar una buena

correlación en lugar de un modelo matemático que se apoye en un factor físicamente sustentado.

Ya que los datos experimentales contienen un error, el modelo con mejor ajuste no

necesariamente representa una buena relación entre el modelo y los datos.

La regresión por minimización de la varianza de los datos experimentales contra la predicción del

modelo es uno de los métodos extendidamente adoptados, este acercamiento en general se

presta para problemas de regresiones no lineales, donde el problema de regresión es

esencialmente un problema de optimización: minimizar la varianza de los datos alrededor del

modelo de regresión; cambiando los parámetros de regresión, en este sentido, no necesitamos

otras técnicas especiales para ejecutar el análisis de regresión (Liu, 2013).


2.4.3 Modelos no estructurados en producción de PHAs

Los modelos matemáticos son herramientas útiles para optimizar y controlar la formación de

producto microbiano así como para comprender su metabolismo, además permiten revelar

aspectos de la fisiología microbiana, mostrando interpretaciones razonables del trabajo

experimental, resultando en el mejoramiento del conocimiento para alcanzar modelos

matemáticos con predicciones cercanas a la realidad y por tanto al proceso (Lee et al., 1985;

Nielsen et al., 1989).

Los modelos cinéticos no estructurados fueron formalmente denominados de “caja negra”, en

etapas iniciales, estos modelos matemáticos se enfocaron en la relación entre sustrato, biomasa

y producto; una de las técnicas frecuentemente utilizadas consiste en realizar experimentos con

medios de cultivo con fuente de carbón como sustrato limitante, mientras que los demás

componentes se encuentran en exceso. Para este tipo de experimentos la ecuación de Monod

para relacionar la velocidad de producción de biomasa con la concentración de sustrato ha sido

frecuentemente incluida en las ecuaciones diferenciales de balance de masa de biomasa,

sustrato limitante y producto (PHA), ya que sustenta el efecto limitante que puede tener un

sustrato frente a la velocidad en que la bacteria se reproduce. Este tipo de aproximación puede

ser aplicada en casos donde la producción de PHA se encuentra asociada al crecimiento (Novak,

2015).

La posterior consideración de otros sustratos como limitantes para el crecimiento tuvo cierto

efecto en las expresiones matemáticas para la velocidad de crecimiento de biomasa y producción

de PHAs. En estos casos la velocidad especifica de crecimiento de la biomasa se expresó como

una relación doble de la ecuación de Monod, un término para cada sustrato (Megee et al.,

1972),tanto para mezclas de diferentes tipos de fuente de carbono, así como de nitrógeno

(Dhanasekar et al., 2003). Sin embargo, este tipo de modificaciones a pesar de ser útiles a la hora

de explicar los fenómenos de limitación no son suficientes para alcanzar un modelo cinético válido

y acorde al comportamiento de la bacteria.

Por otro lado, la introducción de nuevas especies y cepas modificadas genéticamente con

comportamiento específico en su metabolismo para la biosíntesis de PHA, así como la aplicación

de sustratos de bajo costo en la búsqueda de reducir los costos de producción, han propiciado la



búsqueda de mejores acercamientos en la construcción de modelos no estructurados; es el caso

del efecto de inhibición de los sustratos el cual ha sido un factor de importancia introducido en las

ecuaciones cinéticas, con el fin de adaptar los modelos matemáticos al comportamiento biológico.

Diferentes términos de inhibición han sido reportados, como los propuestos por Aiba et al. (1968)

y Moser (1985), en general, las aplicaciones de este tipo de efectos inhibitorios está influenciadas

por:

- La inhibición por fuentes de carbono orgánico (glicerol), efecto del pH (ácidos orgánicos),

efectos generados por la presión osmótica (azucares), y efectos de supresión del

catabolismo (comúnmente encontrado en cultivos con múltiples sustratos).

- Los factores que dan comienzo a la acumulación de PHA en las fases finales del medio

de cultivo son la limitación de nitrógeno o fósforo. Altas concentraciones de dichos

compuestos actúan como inhibidores para la producción de PHA, por lo que un adecuado

suministro de los mismos hace predominante la generación de más biomasa en lugar de

PHA.

La tercera adaptación realizada en los modelos no estructurados fue la introducción de la

velocidad de consumo de fuente de carbono para energía de mantenimiento. Para dicho propósito

la relación definida por Guthke para la ecuación de Monod es aplicada usualmente (Moser, 1985).

Además, en experimentos bajo condiciones aerobias, se ha reconocido la influencia del oxígeno

disuelto en la velocidad específica de crecimiento, así como en la formación de componentes

metabólicos intracelulares como NADH, NADPH Y FADH2, los cuales son esenciales en la

reducción de precursores de PHA (Acetoacetil-CoA) afectando así la velocidad de producción de

PHA. Es así como algunos autores han hecho mejoras en modelos de baja estructuración,

incluyendo el factor de oxígeno disuelto dentro de los modelos (Tohyama et al., 2002).

Finalmente, la introducción del término de inhibición por producto en los modelos matemáticos se

basa en que los gránulos generados por la célula participan en una fracción significativa de la

masa celular; por lo tanto, el producto ocupa un alto porcentaje del volumen intracelular limitando

su reproducción. Adicional a esto, se ha observado que algunas cepas detienen la producción de

PHA cuando la fracción media del polímero sobrepasa cierto valor. Teniendo en cuenta las

posibles restricciones en la biosíntesis de PHA algunos autores han implementado el término de


inhibición por producto para la velocidad específica de crecimiento, lo cual pueden ser descrito

por la ecuación logística de acuerdo a Aiba et al. (1968) y la ecuación de Luong (Luong, 1985,

1987).

2.4.4 Aplicación de modelos matemáticos en el análisis de la producción y optimización de PHA

La aplicación de la modelación de la cinética de microorganismos en procesos de optimización

de PHA se pueden apreciar en trabajos como el de Horvat et al. (2013). En ese trabajo la

producción de PHA parcialmente asociada al crecimiento fue elegido como estrategia de

modelamiento, de esa manera el modelo de Luedeking-Piret’s fue seleccionado como

herramienta para describir el fenómeno de producción de PHA parcialmente asociada al

crecimiento. Además, la velocidad especifica de crecimiento fue relacionada de acuerdo a (Megee

III et al., 1972; Mankad & Bungay, 1988) adaptado a la limitación de dos sustratos (nitrógeno y

carbono). La primera etapa del régimen de biorreactores en cascada fue modelada de acuerdo al

principio de nutrición balanceada en un sistema de producción continuo de biomasa; la segunda

fue modelada como un proceso de sustrato controlado, mientras que las siguientes tres etapas

fueron ajustadas para una producción de PHB bajo alimentación continua de fuente de carbono

con limitación de nitrógeno. La simulación resultante por aplicación del modelo matemático con

optimización computacional indicó que la productividad de PHB puede ser incrementada con el

ajuste en el factor de dilución, así como en la concentración de nitrógeno y de la fuente de carbono

en la alimentación.

Recientemente Mozumder et al. (2014) contribuyeron con un modelo mecanístico que describe

la producción de PHB de forma similar al trabajo publicado por Horvat et al. (2013), en este caso

un cultivo puro de C. necátor DSM 545 fue modelado y validado bajo dos sustratos glucosa y

glicerol proveniente de la producción de biodiesel. En este caso la bacteria produce PHB de forma

no asociada al crecimiento, y la producción se estimula con bajas concentraciones de nitrógeno.

Sin embargo, la síntesis de PHB asociada al crecimiento fue observada, aunque se inhibió por la

presencia de nitrógeno. Para el modelo, se incluyó el crecimiento de biomasa, PHB y la inhibición

no-linear por el producto además se tuvo en cuenta cuatro procesos principales, Crecimiento de

biomasa por carbono, crecimiento de biomasa utilizando el PHB, producción de PHB y energía



de mantenimiento. El modelo matemático desarrollado fue simulado satisfactoriamente para la

producción de PHB y los comportamiento dinámicos relacionados al crecimiento de biomasa

heterotrófica para las dos fases del sistema de cultivo puro (Mozumder et al., 2014).

Por otro lado, diferentes modelos se han propuesto considerando diferentes cepas, sustratos,

cinéticas y propiedades de cultivo. Raje & Srivastava (1998) han investigado la producción

continua de PHA por C. necátor B4383 en un cultivo con limitación de nitrógeno. Para definir la

velocidad específica de crecimiento (µ), los autores utilizaron una combinación linear de la

cinética de Monod y el término sigmoidal propuesto por Hill (Hill, 1910), adicionalmente se

adicionó una corrección de inhibición en el modelo con el término de Luong el cual contiene la

relación C/N y la generación de producto PHA. Luego de algunos años Patwardhan & Srivastava

(2008) aplicaron un modelo idéntico para la cepa Ralstonia eutropha.

Otro ejemplo de construcción de modelos no estructurados es presentado por Wang et al. (2010)

y Yu et al. (2002). En ambos trabajos se consideró la cepa C. necátor ATTC 17699 y como fuente

de carbono ácidos grasos volátiles, específicamente ácidos propiónico, acético y butírico. Para la

elaboración del modelo, se aplicó la cinética de Monod en la velocidad de crecimiento, que fue

complementada con un término del efecto de la toxicidad de los ácidos sobre la actividad celular;

así mismo se aplicó el término de Luedeking-Piret para la descripción de la velocidad de

producción de PHA. El modelo fue probado con cada ácido graso y la mezcla de los mismos.

En otro estudio, Shahhosseini (2004) realizó la investigación de cultivo por lote alimentado con la

especie Ralstonia eutropha ATTC 17697 con fructosa y amonio. En el modelo propuesto se

incluye el término de Monod para la descripción de µ con respecto a la relación carbono/nitrógeno;

igualmente se propone el término de limitación descrito por la ecuación de Luong, previamente

mencionada por Yu et al. (2002). El modelo también incorpora la dependencia de la velocidad de

producción sobre la concentración de biomasa y velocidad de crecimiento.

Otro tipo de modelo, donde se tiene en cuenta el efecto de los sustratos predominantes en la

producción de PHA es el propuesto por Khanna & Srivastava (2006a) donde se aplica para los

sustratos de fructosa y nitrógeno la expresión sigmoidal propuesta por Hill (Hill, 1910), corregida

con el efecto doble de inhibición por ambos sustratos basado en la ecuación de Luong. La


producción de PHA fue descrita con la ecuación de Luedeking-Piret y el consumo de los sustratos

limitantes consideró el mantenimiento celular, además no se incluyó la inhibición por producto.

De igual manera, para un proceso por lote alimentado con la bacteria R. eutropha ACM 1296,

Patnaik (2006) aplicó el argumento de la relación C/N en la velocidad específica de crecimiento,

con la dependencia de dos sustratos.

Otro caso donde se incluye la influencia de dos sustratos en el modelo cinético es el propuesto

por Shang et al. (2007) con R. eutropha NCIMB 11599 bajo limitación de fosfato como iniciador

de la acumulación de PHB. La velocidad específica de crecimiento fue expresada con la doble

limitación inducida por los sustratos (fósforo y carbono) con dos términos de Monod, y la velocidad

de producción de PHB fue caracterizada combinando los términos de Andrews (que considera

inhibición por glucosa en altas concentraciones), Jerusalimsky (iniciador de acumulación PHA) y

logístico (inhibición por producto causada por bloqueo estérico). Por último, se observó que las

altas concentraciones de glucosa inhiben la síntesis de PHB.

A continuación, se resumen algunos de los modelos no estructurados mencionados anteriormente

y otros que se han indagado como soporte teórico para la elaboración del presente trabajo.


Tabla 2-2: Ecuaciones propuestas por diferentes autores para la modelación y optimización de procesos de producción de PHAs.

Referencias Velocidad especifica de

crecimiento 𝜇

𝑑𝑋

𝑑𝑡

𝑑𝑆

𝑑𝑡

𝑑𝑁

𝑑𝑡

𝑑𝑃

𝑑𝑡

Mulchandani

et al. (1989) {𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗

𝑆𝑐

𝑆𝑐 + 𝐾𝑠𝑐}

∗ {1 −(𝑆𝑐)2

(𝑆𝑐𝑚)𝑛}

𝜇 ∗ 𝑋 −𝑘4 ∗

𝑑𝑋

𝑑𝑡− 𝑘5 ∗ 𝑋 −𝑘3 ∗

𝑑𝑋

𝑑𝑡 𝑘1 ∗

𝑑𝑋

𝑑𝑡+ 𝑘2

∗ 𝑋

Dhanasekar

et al. (2003) {𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗

𝑆𝑐

𝑆𝑐 + 𝐾𝑠𝑐}

𝜇 ∗ 𝑋

∗ (1

−𝑋

𝑋𝑚)

−1

𝑌𝑋𝑆

∗𝑑𝑋

𝑑𝑡−1

𝑌𝑃𝑆

∗𝑑𝑃

𝑑𝑡− 𝑘1

∗ 𝑋

_

∝∗

𝑑𝑋

𝑑𝑡+ 𝛽 ∗ 𝑋

Shahhosseini

(2004) 𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗

𝑆𝑛𝑆𝑐

𝑆𝑛𝑆𝑐 + 𝐾𝑆𝑛

𝑆𝑐

∗ 1

−(𝑆𝑛𝑆𝑐)

𝑚

(𝑆𝑐𝑚/𝑆𝑛𝑚)𝑚

𝜇 ∗ 𝑋

−𝐹

𝑉

∗ 𝑋

−𝑘4 ∗𝑑𝑋

𝑑𝑡− 𝑘5 ∗ 𝑋 +

𝐹

𝑉

−𝑑𝑉

𝑉 ∗ 𝑑𝑡∗ 𝑆𝑐


𝑑𝑡

+𝐹𝑛𝑉

−𝑑𝑉

𝑉 ∗ 𝑑𝑡

∗ 𝑆𝑛

𝑘1 ∗𝑑𝑋

𝑑𝑡+ 𝑘2

∗ 𝑋 −𝐹

𝑉∗ 𝑃

44 Modelamiento matemático y optimización del proceso de producción de PHAs empleando B. cepacia B27 a

partir de ácidos grasos.

Patnaik

(2006) 𝜇𝑚 ∗

𝑆𝑛𝑆𝑐

𝑆𝑛𝑆𝑐 + 𝐾𝑆𝑛

𝑆𝑐

∗ 1

−(𝑆𝑛𝑆𝑐)

𝑚

(𝑆𝑐𝑚/𝑆𝑛𝑚)𝑚

𝜇 ∗ 𝑋

−𝐹

𝑉

∗ 𝑋


𝑑𝑡− 𝑘5 ∗ 𝑋 +

𝐹

𝑉

−𝑑𝑉

𝑉 ∗ 𝑑𝑡∗ 𝑆𝑐


𝑑𝑡

+𝐹𝑛𝑉

−𝑑𝑉

𝑉 ∗ 𝑑𝑡

∗ 𝑆𝑛


𝑑𝑡+ 𝑘2

∗ 𝑋𝐹

𝑉∗ 𝑃

Shang et al.

(2007) {𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗

𝑆𝑐

𝑆𝑐 + 𝐾𝑠𝑐1∗𝐾1 ∗ 𝑆𝑐2𝑆𝑐2 + 𝐾𝑠𝑐2

} 𝜇 ∗ 𝑋

𝐹 ∗ 𝑆𝑐 −1

𝑌𝑋𝑆𝑐

∗𝑑𝑋

𝑑𝑡−

1

𝑌 𝑃𝑆𝑐

∗𝑑𝑃

𝑑𝑡− 𝑌𝑚 ∗ 𝑋 𝑘𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜/𝑋

∗ 𝜇 ∗ 𝑋

𝛽𝑚1

∗𝑆𝑐

𝑆1 + 𝑘𝑆 +𝑆𝑐2

𝐾𝑠𝑐

∗𝑘2

𝑘3 + 𝑆𝑛∗ (1

−𝑃

𝑃𝑚𝑎𝑥)

Gahlawat &

Srivastava

(2013)

{𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗𝑆𝑐

𝑆𝑐 + Ksc

∗(𝑆𝑛)𝑛1

𝑆𝑛𝑛1 + 𝐾𝑛𝑛1}

∗ {1 −(𝑆𝑛)𝑎

(𝑆𝑛𝑚)𝑎} ∗ {

𝐾𝑐𝑖

𝐾𝑐𝑖 + 𝑆𝑐}

(𝜇

− 𝐷)

∗ 𝑋

−(𝜇

𝑌𝑋𝑆

+𝑚𝑐) ∗ 𝑋 + 𝐷

∗ (𝑆𝑐𝑓 − 𝑆𝑐)

−(𝜇

𝑌 𝑋𝑆𝑛

+𝑚𝑛) ∗ 𝑋

+ 𝐷 ∗ (𝑆𝑛

− 𝑆𝑛𝑓)

−𝑘1 ∗ 𝜇 ∗ 𝑋 − 𝐷

∗ 𝑃


Heinzle &

Lafferty

(1980)

{𝜇𝑚𝑎𝑥1 ∗𝑆𝑛

𝑆𝑛 + 𝐾𝑠𝑛1+ 𝜇𝑚𝑎𝑥2

∗(𝑆𝑛𝐾𝑠𝑛2

)𝑛

1 + (𝑆𝑛𝐾𝑠𝑛2

)𝑛}

𝜇 ∗ 𝑋 −1

𝑌𝑋𝑆𝑐

∗ 𝜇 ∗ 𝑋 - 𝜇

𝑌𝑃𝑋

∗ 𝜇 ∗ 𝑋

+𝐾𝑖

𝐾𝑖 + S

∗ (−𝑘1 ∗ 𝑃

+ 𝑘2 ∗ 𝑋)

Raje &

Srivastava

(1998)




)𝑛


)𝑛}

∗

{

1 −(𝑆𝑛𝑆𝑐)𝑚

(𝑆𝑚𝑆𝑛𝑆𝑐

)

𝑛

}

𝜇 ∗ 𝑋

−𝐹

𝑉

∗ 𝑋

−(𝛼 ∗𝑑𝑋

𝑑𝑡+ 𝛽 ∗

𝑑𝑃

𝑑𝑡+ 𝛾

∗ 𝑋) +𝐹1𝑉𝑆𝑐𝑓 −

𝐹

𝑉𝑆𝑐

−𝑑 ∗𝑑𝑋

𝑑𝑡+𝐹1𝑉

∗ 𝑆𝑛𝑓

−𝐹

𝑉𝑆𝑛

{𝑘1

∗ (𝑋 − 𝑋𝑚𝑖𝑛)

− 𝑘2 ∗ 𝑃)}

∗𝐾𝑠𝑛

𝐾𝑠𝑛 + 𝑆𝑛

+ 𝑒 ∗𝑑𝑋

𝑑𝑡−𝐹

𝑉

∗ 𝑃

46 Modelamiento matemático y optimización del proceso de producción de PHAs empleando B. cepacia B27 a

partir de ácidos grasos.

Patwardhan

& Srivastava

(2004)




)𝑛


)𝑛}

∗

{

1 −(𝑆𝑛𝑆𝑐)𝑛

(𝑆𝑚𝑆𝑛𝑆𝑐

)

𝑛

}

𝜇 ∗ 𝑋 −(𝑘1 ∗

𝑑𝑋

𝑑𝑡+ 𝑘2 ∗

𝑑𝑃

𝑑𝑡+ 𝑘3

∗ 𝑋) +𝐹2𝑉∗ 𝑆𝑐𝑓 −

𝐹

𝑉𝑆𝑐

−𝑌 𝑋𝑆𝑛∗𝑑𝑋

𝑑𝑡

+𝐹1𝑉∗ 𝑆𝑛𝑓

−𝐹

𝑉𝑆𝑛

{𝑘4

∗ (𝑋 − 𝑋𝑚𝑖𝑛)

− 𝑘5 ∗ 𝑃)}

∗𝐾𝑠𝑛

𝐾𝑠𝑛 + 𝑆𝑛

+ 𝑘6 ∗𝑑𝑋

𝑑𝑡

−𝐹

𝑉∗ 𝑃

Khanna &

Srivastava

(2006)

{𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗𝑆𝑐𝑛1

𝑆𝑐𝑛1 + 𝐾𝑠𝑐𝑛1

∗𝑆𝑛𝑛2

𝑆𝑛𝑛2 + 𝐾𝑠𝑛𝑛2}

∗ {1 −(𝑆𝑐)𝑎1

(𝑆𝑐𝑚)𝑎1}

∗ {1 −(𝑆𝑛)𝑎2

(𝑆𝑛𝑚)𝑎2}

𝜇 ∗ 𝑋

−𝐹

𝑉

∗ 𝑋

−(𝛼 ∗ 𝜇 + 𝛾) ∗ 𝑋 +𝐹1𝑉∗ 𝑆𝑐𝑓

−𝐹

𝑉𝑆𝑐

−(𝜇

𝑌 𝑋𝑆𝑐2

+𝑚𝑛) ∗ 𝑋 +𝐹2𝑉

∗ 𝑆𝑐𝑓2 −𝐹

𝑉𝑆𝑛

𝜇 ∗ 𝑋

𝑌 𝑋𝑆𝑛

−𝑚𝑛

∗ 𝑋 +𝐹2𝑉

∗ 𝑆𝑛𝑓

−𝐹

𝑉𝑆𝑛

𝑘1𝑑𝑋

𝑑𝑡+ 𝑘2 ∗ 𝑋

−𝐹

𝑉∗ 𝑃

Donde D corresponde a la dilución, 𝐹 a flujos de alimentación, los sub índices corresponden al número del flujo

(𝐹1, 𝐹2) de alimentación, 𝐹𝑛 flujo de alimentación que contiene únicamente fuente de nitrógeno. 𝑓𝑃𝐻𝐴

fracción de

polímero en biomasa. 𝐾𝑖, 𝐾𝑛𝑖, 𝐾𝑐𝑖, 𝐾𝑝𝑖 constante de inhibición por nitrógeno, carbono y producto. 𝑆𝑛𝑚, 𝑆𝑐𝑚, 𝑆𝑚𝑆𝑛𝑆𝑐

concentración máxima inhibitoria por nitrógeno, fuente de carbono, relación concentración fuente de nitrógeno y carbono.


𝐾𝑠𝑝, 𝐾𝑠𝑛, 𝐾𝑠𝑐, constante de afinidad por producto, nitrógeno y fuente de carbono. 𝑚𝑐, 𝑚𝑛 constante de mantenimiento por

fuente de carbono y fuente de nitrógeno. 𝑆𝑛, 𝑆𝑐 concentración de sustrato fuente de amonio y fuente de carbono. 𝑆𝑛𝑓 y

𝑆𝑐𝑓 concentración de fuente de nitrógeno y carbono en los flujos de alimentación. V volumen del reactor X, biomasa


rendimiento fuente de carbono biomasa y producto. 𝑌 𝑥

𝑆𝑛 rendimiento fuente de amonio y biomasa. 𝑌𝑃

𝑆 rendimiento

sustrato producto. α, β, 𝛾 constantes relacionadas al producto. 𝑎1, 𝑎2, 𝑛2, 𝑛1, e constantes que relacionan la concentración

inhibitoria de sustratos. 𝑘1, 𝑘2…𝑘𝑛, constantes relacionadas al producto, 𝜇max velocidad especifica de crecimiento máxima.


Regímenes operacionales de cultivo.

2.5.1 Cultivo por lote

En la operación por lote, todos los componentes esenciales para el crecimiento del

microorganismo y el inóculo son adicionados al principio del proceso de fermentación sin

adicionar posteriormente más medio de cultivo al biorreactor; por consiguiente, las

concentraciones de los componentes no son controladas, por lo tanto, las variaciones en la

concentración en el biorreactor de los diferentes sustratos están sujetas al consumo de los

microrganismos. Los productos tanto intracelulares como extracelulares, así como la biomasa

son recolectados solamente al final del proceso. Por otro lado, el control de pH, temperatura,

oxígeno disuelto y espuma es mantenido durante el periodo de fermentación. Teniendo en cuenta

lo anterior, los únicos parámetros de optimización en este tipo de proceso es la composición inicial

del medio así como parámetros de control, como pH y temperatura (Lim & Shin, 2013).

2.5.2 Cultivo continuo

La operación en continuo consiste en la inyección, de forma continua, de corrientes de

alimentación que contienen los nutrientes necesarios para el microrganismo, mientras que una

corriente de salida conteniendo biomasa, productos y residuos son removidos, también

continuamente. Es necesario reconocer que en el estado estacionario las velocidades de flujo

tanto de salida como de entrada son iguales, lo que mantiene el volumen del reactor constante,

así como los valores de la concentración de los nutrientes. El procesamiento en este régimen

posee algunas desventajas, lo que lo hace poco dominante en las operaciones industriales,

principalmente por la posibilidad de contaminación con otros microorganismos, así como por los

procesos de mutación que pueden darse por los largos periodos en los que se debe mantener el

bioproceso, además es frecuente que en operaciones en estado estacionario los rendimientos

sean inferiores a los de procesos en estado dinámico (Lim & Shin, 2013).



2.5.3 Cultivo en lote alimentado

El cultivo en lote alimentado es una clase de operación semi lote, en la que los nutrientes

necesarios para el crecimiento celular y la formación de producto son alimentados

intermitentemente o continuamente por medio de una o más corrientes de alimentación durante

el transcurso de una operación por lote. El medio o cultivo es usualmente cosechado parcial o

totalmente al final del proceso, en el caso de recolección parcial del medio de cultivo, se debe a

que el remanente servirá como inóculo para una siguiente corrida. Este proceso puede ser

repetitivo en un mismo reactor un gran número de veces, si las células mantienen su viabilidad y

productividad. Es importante aclarar que el proceso no tiene corrientes de salida en el rector, por

lo que el volumen se incrementa durante el transcurso del mismo hasta alcanzar, la mayoría de

veces, el volumen máximo del reactor, en este punto se puede implementar un periodo de

operación por lote, para que los nutrientes sean totalmente consumidos y se alcance el máximo

provecho en biomasa o producto (Lim & Shin, 2013).

El cultivo en lote alimentado es una operación dinámica, y las velocidades de alimentación y las

concentraciones de los nutrientes limitantes pueden ser ajustadas tanto para mantener

concentraciones constantes de los nutrientes, como para lograr perfiles de concentración

optimizados o para alcanzar concentraciones máximas de producto, lo que hace de este modo

de operación una alternativa interesante para diferentes biorreacciones.

3. Materiales y métodos

Microorganismo

El microorganismo empleado en el presente trabajo fue la cepa Burkholderia cepacia B27.

Dicha bacteria se obtuvo a partir de una estrategia de mutación al azar mediante un

transposón de la Ralstonia eutropha y Burkholderia sp 2G57 proveniente del Valle del

Cauca la cual fue aislada y caracterizada en los trabajos realizados por Moreno & Serrato

(2004) y Revelo (2005); después de las mutaciones se seleccionaron las cepas con mayor

acumulación de PHA. Las cepas obtenidas por este método alcanzaron en procesos de

fermentación una acumulación de PHA entre 53 % y 83 % en comparación con la 2G57.

La cepa que presentó la mayor acumulación de PHA en 2,5 L utilizando las condiciones

básicas de la cepa 2G57 hacen parte del grupo de las Burkholderia cepacia, la cual fue

luego denominada como Burkholderia cepacia B27

Para garantizar que las cepas no sufrieran mutaciones genéticas en el transcurso del

trabajo, y la concentración de biomasa fuera lo más homogénea posible durante la

preparación del inóculo, fue necesaria la elaboración de un stock de trabajo que constó de

70 crioviales cada uno con 800 µL. Las bacterias fueron reproducidas en medio LB

(Becerra, 2013) con un 30 % de glicerol como crioconservante y congeladas a una

temperatura de –20 ºC.

Tren de inóculo y medio de cultivo

Para los diferentes ensayos realizados en el presente trabajo, se establecieron dos tipos

de trenes de inóculo, uno para los experimentos a escala matraz y por otro lado el

correspondiente a los desarrollados en biorreactor a escala laboratorio (todos los medios

fueron esterilizados a 120 ºC por 30 minutos). Para el primero 500 µL de criovial son

agregados a 45 mL de medio LB contenido en un matraz de 250 mL que es agitado a 200

rpm y 32 ºC durante 24 horas, luego de este tiempo el medio es inoculado en un matraz

52 Modelamiento matemático y optimización del proceso de producción de PHAs empleando B. cepacia B27 a partir de ácidos grasos.

de 1000 mL con 200 mL de medio LB y se incubó con las mismas características

anteriormente mencionadas; finalmente se distribuyó 15 mL del medio inoculante en cada

matraz para los experimentos en esta escala. Para la preparación del tren de inóculo en el

biorreactor se tomaron 500 µL del criovial se adicionó a 45 mL de medio LB en un matraz

de 250 mL que es agitado a 200 rpm y 32 ºC durante 24 horas, luego este es transvasado

a otro matraz conteniendo 450 mL de medio de cultivo y 2000 mL de volumen total. La

información completa sobre la composición del medio de cultivo esta condensado en el

Anexo A. cabe aclarar que dicho medio ya viene optimizado del trabajo resultante del

proyecto 29552 Convocatoria Colciencias 523 de 2011 “USO DE PLÁSTICOS VERDES

(POLIHIDROXIALCANOATOS) PARA LA FABRICACIÓN RENTABLE DE EMPAQUES

COMPLETAMENTE BIODEGRADABLES REQUERIDOS EN LA INDUSTRIA”.

Estudios preliminares de inhibición y limitación de sustrato

Los experimentos iniciales tuvieron como objetivo estudiar el comportamiento a escala

matraz bajo condiciones de sustrato diferentes; estos experimentos se llevaron a cabo en

Erlenmeyer de 500 mL con un volumen de medio de cultivo de 150 mL, el volumen del

medio para esta parte del trabajo fue establecido con base en experimentos previos de

espacio de cabeza, los cuales mostraron que la velocidad especifica de crecimiento no se

ve afectada con el cambio de volumen de medio de 250 mL a 150 mL, volúmenes inferiores

afectan la agitación y tienden a evaporar más rápido el medio induciendo al error de la

biomasa cuantificada. Para los ensayos se asumió como sustratos limitantes aceite vegetal

(A.V) comercial mazorca de oro (Grasco Ltda. Mezcla de aceite de maíz y de soya) y sulfato

de amonio (S.A.) grado alimenticio, ya que son los componentes principales en la

producción de biomasa y generación de PHA. El aceite vegetal fue seleccionado por su

bajo precio comparado con un ácido graso; a pesar de que también se indago en un residuo

del proceso de producción de aceite, este se descartó por las características físicas, las

cuales eran complejas de manejar en el biorreactor por su estado semisoalido, además de

aumentar más la variabilidad. Se evaluaron diferentes concentraciones de aceite vegetal

en un rango de 0.5 a 170 g/L, con concentración constante de sulfato de amonio (2.8 g/L)

y los demás componentes del medio de cultivo (Anexo A). De igual forma para el estudio

del efecto del sulfato de amonio sobre la biomasa se estableció un rango de

concentraciones desde 0.2 hasta 10 g/L de sulfato de amonio, con concentración constante

Capítulo 3. Materiales y métodos 53

de aceite vegetal de 20 g/L, así como los demás componentes del medio. Los

experimentos en matraz fueron realizados bajo condiciones de temperatura constante, 32

ºC, con agitación de 200 rpm.

Las fermentaciones se desarrollaron por 30 horas, con muestras cada 6 o 12 horas. Se

cuantificó la concentración de biomasa en cada muestra por triplicado y se determinó la

velocidad específica de crecimiento máxima para cada experimento. En la Tabla 3-1 se

muestran las diferentes concentraciones empleadas en los experimentos en escala

matraz.

Tabla 3-1: Concentraciones para los experimentos a escala matraz

Concentraciones de aceite

vegetal (g/L)

Concentrac

iones de

sulfato de

amonio

(g/L)

Concentraciones de sulfato de

amonio (g/L)

Concentr

ación

aceite

vegetal

(g/L)

0.5 2.8 0.2 20

2 2.8 0.4 20

4 2.8 0.8 20

8 2.8 1 20

12 2.8 1.4 20

14 2.8 1.8 20

16 2.8 2.3 20

20 2.8 2.8 20

30 2.8 3.2 20

60 2.8 6.2 20

70 2.8 8 20

80 2.8 10 20

100 2.8

130 2.8 -

140 2.8 -

160 2.8 -

170 2.8 -


Experimentos en biorreactor escala laboratorio

Los ensayos para la obtención de la cinética microbiana fueron realizados en escala

laboratorio con operación por lote, en un BioFlo CelliGen 115 Brunswick (Eppendorf AG,

Germany) de 7 L de volumen total, con suministro de aire proveniente de compresor

industrial. En los experimentos se utilizó 4,5 L de medio estéril (Anexo A) con 500 mL de

inóculo. El pH del medio fue mantenido en 7 ± 0.5, empleando NaOH 3N, y la temperatura

en 32 ºC. El flujo de oxígeno fue mantenido en 2 vvm con el fin de asegurar que no fuera

una limitante dentro del proceso sin control de OD y los periodos de fermentación oscilaron

entre 72 y 96 horas. Se tomaron muestras de cada 6 o 14 horas.

El monitoreo de la pureza del medio fue realizado con tinción de gram (Anexo B-5) y

crecimiento directo sobre agar nutritivo con siembra directa.

Métodos analíticos

Para obtener la información del ajuste del modelo matemático, en los diferentes

experimentos fue necesario medir la concentración de biomasa, amonio residual, PHAs y

aceite vegetal residual.

3.5.1 Cuantificación de biomasa

La concentración de biomasa fue determinada por el método gravimétrico sugerido por

Yang et al. (2006). En Falcon de 15 mL previamente pesados se adicionan muestras de 5

mL de medio de cultivo estos son centrifugados a 9000 g (Hermle Z380) durante 10 min.

Luego se descarta el sobrenadante y se resuspende el precipitado con agua destilada

hasta alcanzar el volumen inicial, se realiza el lavado dos veces más. Luego el precipitado

obtenido es secado en horno durante 24 horas a 80 ± 5 °C hasta alcanzar un peso estable

para luego ser pesado (Yang et al., 2006).

3.5.2 Cuantificación de amonio residual

La concentración de amonio residual en el medio de cultivo fue estimada por el método de

Berthelot o azul indofenol, descrito por Gumel et al., (2012). En el cual el ion amonio

reacciona con hipoclorito y fenol, generando un compuesto coloreado que se registra a

640 nm. Se toman 0.150 mL de muestra a partir del sobrenadante del medio de cultivo


obtenido por centrifugación (9000 g por 10 min) el cual es diluido con 5 mL de agua

destilada (el factor de dilución depende de la cantidad de amonio en la muestra ya que el

método es fiable para concentraciones inferiores a 4 mg/L. Luego de la reacción, la

coloración es cuantificada con un espectrofotómetro Genesys 10s UV-Vis (Thermo Fisher

scientific, USA). El amonio residual es cuantificado por medio de una curva de calibración

con concentraciones de amonio conocidas (Anexo B-4).

3.5.3 Cuantificación de PHA

Para la cuantificación del polímero, se parte del procedimiento de cuantificación de

biomasa sin el paso de secado, buscando que la biomasa sin residuos del medio de cultivo

pueda ser digerida y el PHA cuantificado. El precipitado obtenido se resuspende en agua

destilada con 0.55 (mL/g biomasa) de solución de dodecil sulfato sódico (SDS) al 20 % y

digeridos a 90 ºC durante 1 hora, luego las muestras son centrifugadas a 9000 g por 5 min,

resuspendidas en agua destilada y centrifugadas bajo las mismas condiciones dos veces,

para remover los residuos de SDS y biomasa. Finalmente, los tubos Falcon son colocados

a secar a 80 ± 5 °C durante 24 horas y pesados.

3.5.4 Cuantificación del aceite vegetal residual

El aceite vegetal residual fue cuantificado con el método descrito por Kahar et al. (2004).

Se toma 2 mL de muestra del medio de cultivo y se adicionan en un tubo de ensayo

conteniendo 5 mL de hexano; se mezclan con vortex durante 1 min, después se toma 1

mL de la capa de hexano resultante y se transfiere a un tubo previamente pesado para

luego ser rotaevaporado a 78 ºC hasta que la fase de hexano se evapore, finalmente el

tubo es pesado. La concentración de aceite vegetal fue estimada como la cantidad de

aceite extraída por el solvente.

3.5.5 Estimación de aceite vegetal por balance de masa

Debido a las dificultades con la cuantificación del aceite, principalmente por el grado de

saturación máxima a la que puede llegar el solvente (hexano) con el aceite para removerlo

del medio, se estimó un balance teórico de la cantidad de aceite consumido, la cual fue

luego verificada teniendo en cuenta la cantidad de biomasa generada a bajas


concentraciones de fuente de carbono en el reactor, donde el crecimiento de la bacteria se

detiene totalmente por la ausencia de carbono en el medio. (ver sección 4.1.3).

Métodos matemáticos

3.6.1 Ajuste de parámetros del modelo

El ajuste de parámetros para los modelos a escala erlenmeyer fue obtenido por medio de

la función fminsearch de Matlab, donde se buscó reducir la suma de la diferencia

cuadrática entre los valores predichos y experimentales (ecuación 3-1) hasta encontrar los

parámetros que satisfagan la condición.

𝑺𝑫𝑪 = ∑ (𝒚𝒊 − 𝒇(𝒙𝒊))𝟐𝒏

𝐢=𝟏 (3-1)

donde 𝑦𝑖 son los datos experimentales, 𝑓(𝑥𝑖) son los datos generados por el modelo y 𝑛 el

número de datos experimentales.

Los parámetros de las ecuaciones del modelo matemático a escala Bioflo 7 L fueron

estimados por la minimización de la suma de las diferencias cuadráticas (SDC) entre los

datos experimentales y los datos suministrados por el modelo (Ecuación 3-1). El programa

de búsqueda para la estimación de los parámetros cinéticos fue desarrollado en Matlab®.

El ajuste de parámetros para el modelo fue obtenido por medio de la función fminsearch,

la cual se basa en la optimización no lineal sin restricciones, reduciendo el valor de SDC

al mínimo. Para la búsqueda de los parámetros del modelo cinético el sistema de

ecuaciones diferenciales fue resuelto por un programa de integración numérica basado en

el método Runge-Kutta Method de 4º orden. El programa de optimización para la búsqueda

directa del mínimo de la función multivariable (función objetivo) se basaron en el algoritmo

propuesto por (Anexo D-1) Kaur et al.,(2012); Patwardhan & Srivastava (2008).

3.6.2 Verificación del modelo

Para evaluar la validez del modelo matemático frente a los datos experimentales, se estimó

la precisión de los datos simulados por el modelo con el método de coeficientes de

eficiencia Nash–Sutcliffe (Nash & Sutcliffe, 1970; Mozumder et al., 2014), el cual describe

cuantitativamente cuan acertados son los datos simulados y en este sentido evalúa que

tan bueno es el poder predictivo del modelo:


𝑬 = 𝟏 −∑ (𝒚𝒕−𝒚𝒕

𝒎)𝟐𝑻𝒕=𝟎

∑ (𝒚𝒕−�̅�)𝟐𝑻

𝒕=𝟎

(3-2)

donde 𝑦𝑡corresponde a los datos experimentales 𝑦𝑡𝑚 a los datos modelados y �̅� al promedio

de los datos experimentales.

El rango de la eficiencia de Nash–Sutcliffe va desde −∞ hasta 1. Una eficiencia de 1 (E=1)

corresponde a un ajuste perfecto de los datos estimados por el modelo con respecto a los

datos experimentales. Una eficiencia de 0 (E=0) indica que la predicción del modelo es tan

acertada como la media de los datos observados, mientras que una eficiencia menor a

cero (E<0) indica que la media de los datos experimentales tiene una mejor predicción que

el mismo modelo. En esencia, entre más cercano el valor E a 1 el modelo es más exacto.

3.6.3 Optimización de las condiciones operacionales

Para el proceso de optimización de las condiciones operacionales, se establecieron dos

tipos de alimentación, flujo de alimentación y pulso. Así mismo, se establecieron

concentraciones de sustratos constantes durante la aplicación del flujo de alimentación,

tanto para el amonio como para el aceite vegetal, además, se manejaron de manera

proporcional las concentraciones de todos los elementos del medio de alimentación

evitando el agotamiento de alguno de los componentes.

Como función objetivo se definió maximizar la concentración de PHA al final del proceso

de 72 h y las ecuaciones diferenciales que definen la cinética de la bacteria conformaron

las restricciones; otras restricciones fueron el caudal máximo hasta el cual puede ser

alimentado el reactor (1.8 L), y el volumen máximo de trabajo del reactor 5 L.

El código para la optimización se desarrolló en Matlab y se encuentra en el Anexo D.

4. Resultados y discusión

Para el modelamiento matemático se consideró inicialmente una estructura estándar para

lo cual, a partir de los experimentos en matraz, se identificaron los fenómenos de limitación

e inhibición y se generaron estimativas iniciales para los parámetros respectivos, y

posteriormente se ajustó el modelo con los datos de biorreactor. El análisis de las

observaciones de la dinámica en la biorreacción y del ajuste del modelo llevo a sugerir

modificaciones en el mismo, que llevaron a un modelo con parámetros variables.

Desarrollo del modelo inicial con parámetros constantes

4.1.1 Análisis de limitación e inhibición en escala matraz

Con el fin de analizar el comportamiento fenomenológico de la cepa de estudio, los

experimentos a escala matraz nos muestran un indicativo del efecto de la concentración

de los sustratos principales (aceite vegetal y sulfato de amonio) sobre la velocidad

específica de crecimiento.

Varios autores han establecido que los sustratos limitantes e inhibitorios en la producción

de PHAs son la fuente de carbono y nitrógeno (Khanna & Srivastava, 2006; Mozumder et

al., 2014; Mulchandani et al., 1989; Patnaik, 2005) aunque algunos trabajos sólo

mencionan la ausencia de la fuente de nitrógeno como el iniciador de la producción de

PHA y principal factor para la generación de biomasa (Heinzle & Lafferty, 1980; Horvat et

al., 2013). Lo anterior debido principalmente a que la fuente de carbono es el recurso de

la bacteria para la producción del polímero y el nitrógeno es un nutriente esencial en

crecimiento de biomasa, por lo que el control del nitrógeno u otros nutrientes en el proceso

(fósforo por ejemplo) promueve la producción de PHA, dependiendo del tipo de bacteria y

sus preferencias (Verlinden et al., 2007).

Resultados y discusión 59

Con base en lo anterior se realizaron experimentos con variación de nitrógeno o aceite

vegetal dejando los demás componentes constantes. A partir de los datos experimentales

obtenidos de los ensayos realizados con la fuente de nitrógeno en condiciones de

limitación (Figura 4-1A), se pudo observar una tendencia del cambio de la velocidad

específica de crecimiento a partir de la variación de concentración, con un comportamiento

similar al de la ecuación de Monod (Ecuación 4-1), la cual fue igualmente aplicada para el

fenómeno de limitación por fuente de carbono (Figura 4-2 A).

𝝁 = 𝝁𝒎 ∗𝑺

𝑺+𝑲𝑺 (4-1)

Donde 𝜇𝑚 es la velocidad específica de crecimiento máxima cuando 𝑆 ≫ 𝐾𝑆 y la

concentración de los demás nutrientes es constante, 𝐾𝑆 es el valor de la concentración de

sustrato limitante en la que la velocidad específica de crecimiento es la mitad de su valor

máximo y 𝑆 la concentración de sustrato en el medio. En la literatura para modelos de caja

negra, el modelo de Monod ha sido ampliamente estudiado para explicar fenómenos de

limitación de sustrato en las bacterias productoras de PHA (Novak, 2015).

Por otro lado, el efecto inhibitorio de los sustratos fue representado por la ecuación

propuesta por Luong (1987) (Ecuación 4-2) para inhibición por sustratos, la cual ajusta muy

bien para los dos sustratos (aceite vegetal y sulfato de amonio) (Figuras 4-1B y 4-2B).

Autores como Annuar & Tan (2006) han reportado el efecto inhibitorio de las

concentraciones de amonio en Pseudomona putida PGA1, indicando que a

concentraciones del ion amonio superiores a 0.1 g/L se empieza a reducir la velocidad

específica de crecimiento de la bacteria; dicho fenómeno ha sido reportado anteriormente

por Suzuki et al. (1986b), quienes probaron 6 tipos de sales de amonio para el crecimiento

de Pseudomonas sp. K en metanol, establecieron la concentración óptima del ion amonio

en 0.2 g/L y una severa inhibición cuando este alcanza concentraciones sobre 1.0 g/L,

debido al efecto toxico que puede tener. Para el presente trabajo caso se encontró una

inhibición completa del crecimiento cuando la concentración de sulfato de amonio sobre

pasa los 9.1 g/L.

𝜇 = 𝜇𝑚 (1 − (𝑆

𝑆𝑚)𝑎

) (4-2)

donde 𝑆𝑚 es la concentración que genera inhibición total del crecimiento.


Figura 4-1: Comportamiento de la velocidad especifica de crecimiento (𝝁) como función de la fuente de nitrógeno en condiciones de limitación (A) y exceso (B), las líneas continuas representan los valores ajustados, y los puntos los datos experimentales.

A

B


Figura 4-2: Comportamiento de la velocidad específica de crecimiento (𝝁) como función de la fuente de carbono en condiciones de limitación (A) y exceso (B), las líneas continuas representan los valores ajustados y los puntos son los datos experimentales.

A

B


Con los fenómenos identificados, el modelo propuesto para la generación de biomasa en

el tiempo fue:

𝑑𝑋

𝑑𝑡= [𝜇max ∙ (

𝑆𝑐

𝐾sc + 𝑆𝑐) ∙ (

𝑆𝑛

𝐾sn + 𝑆𝑛) ∙ (1 − (

𝑆𝑐

𝑆𝑐𝑚)𝑎1

) ∙ (1 − (𝑆𝑛

𝑆𝑛𝑚)𝑎2

)] ∙ 𝑋 (4-3)

donde 𝐾sc y 𝐾sn son las constantes de afinidad para el aceite vegetal y sulfato de amonio

respectivamente, 𝑎1 y 𝑎2 son parámetros cinéticos adimensionales, 𝑋 es la concentración

de biomasa, 𝑆𝑐𝑚 y 𝑆𝑛𝑚 son las concentraciones máximas donde se inhibe el crecimiento

de la bacteria para la fuente de carbono y nitrógeno respectivamente.

A partir de los cuatro grupos de experimentos se generaron los valores iniciales de los

parámetros presentados en la Tabla 4-1, junto al coeficiente de determinación R2 para cada

ecuación

Tabla 4-1: Parámetros y coeficiente de correlación para los modelos propuestos para la velocidad específica de crecimiento.

parámetro valor parámetro valor parámetro valor R2

𝜇𝑚𝑎𝑥 0.071 h-1 𝐾sc 0.035 g/L 0.93

𝜇𝑚𝑎𝑥 0.056 h-1 𝑆𝑐𝑚 168 g/L 𝑎1 4.76 0.94

𝜇𝑚𝑎𝑥 0.053 h-1 𝐾sn 0.048 g/L 0.97

𝜇𝑚𝑎𝑥 0.041 h-1 𝑆𝑛𝑚 10.08 g/L 𝑎2 4.81 0.98

El comportamiento de la velocidad especifica de crecimiento de la bacteria mostro la alta

incidencia de los sustratos prominentes de sulfato de amonio y aceite vegetal, al

observarse estados de total inhibición con ambos sustratos bajo concentraciones

especificas (168 g/L A.V. y 10 g/L S.A.), así como estados limitación de la velocidad de

crecimiento cuando estos se encuentran a bajas concentraciones. Además el trabajo en

Erlenmeyer nos da una mirada global sobre las preferencias de la bacteria y su

comportamiento en la velocidad de crecimiento, que es esencial para establecer los

modelos matemáticos como se ha realizado en diversos trabajos (Kaur et al., 2012; Raje

& Srivastava 1998; Gahlawat & Srivastava 2013; Khanna & Srivastava 2005, 2008;

Gahlawat & Srivastava 2012; Patwardhan & Srivastava 2004).


4.1.2 Ajuste del modelo en escala biorreactor (Bioflo 7 L)

Aunque los modelos matemáticos obtenidos a escala matraz mostraron un buen ajuste, se

hace necesario reestimar los parámetros del modelo cuando se establece un proceso a

una escala mayor, principalmente por las condiciones diferenciadas que un biorreactor

tiene sobre un Erlenmeyer, tales como agitación, aireación, control de pH que promueven

no sólo nuevos efectos de turbulencia y transferencia de masa (Doran, 2013), como

también condiciones operacionales diferentes. Por lo anterior se llevaron a cabo

experimentos para definir la cinética bacteriana de la Burkholderia cepacia B27 los cuales

se realizaron durante 72 horas, tiempo en el que se alcanza la fase estacionaria de la

bacteria bajo condiciones de sustrato inicial de 20 g/L de aceite vegetal y 2.8 g/L de sulfato

de amonio, establecidas en trabajos anteriores del grupo de investigación como las

mejores concentraciones para la bacteria en operación por lote para producción de

biomasa y PHA.

La Figura 4-3A muestra la cinética obtenida de la B. cepacia B27 bajo condiciones óptimas,

donde las concentraciones máximas de biomasa y PHA obtenidas al final de las 72 h fueron

de 15.4 g/L y 14.0 g/L, respectivamente, con un contenido de PHA del 86 % en peso seco.

Además se puede observar una fuerte correlación entre la producción de PHA y biomasa,

lo que conduce a proponer un modelo de generación de producto completamente asociada

al crecimiento de biomasa, como lo reporta igualmente Gahlawat & Srivastava (2013).

Durante este proceso de fermentación 18.5 g/L de aceite vegetal fueron metabolizados a

partir de la concentración inicial de 20 g/L, dejando como aceite residual una concentración

de 1.5 g/L. Por otra parte, la velocidad máxima de producción de PHA alcanzada fue de

0.84 g/h con un rendimiento de 0.79 g PHA /g aceite vegetal los cuales son mayores a los

reportados por otros autores con diferentes sustratos y bacterias (Gahlawat & Srivastava,

2013; Khanna & Srivastava, 2006; López-Cuellar et al., 2011).

4.1.3 Estimación teórica de consumo de aceite vegetal

Como se mencionó en la metodología, la cuantificación del aceite presento algunas

dificultades relacionadas a la saturación del hexano para extraer el aceite a cuantificar;

ademas, la generación de una emulsión dificultó el proceso de medición en la extracción

del sobrenadante, como se menciona en la metodología. Por lo anterior, se propone un


calculo teórico del consumo de aceite con respecto a biomasa que de soporte al

rendimiento estimado experimentalmente, el cual se obtuvo del ensayo con limitación de

fuente de carbono inicial (5 g/L), el cual detiene la produccion de biomasa con

concentraciones de sulfato de amonio suficientes en el medio, lo que en teoria nos

mostraria la cantidad de biomasa generada, consumida la totalidad de la fuente de

carbono.

Para facilitar el cálculo, el aceite vegetal fue represento por el ácido láurico (C12H24O2),

como es sugerido por (Jie, Harwood, & Gunstone, 2007). El cálculo se realizó de la

siguiente manera, en promedio el rendimiento de biomasa con respecto a nitrógeno es

aproximadamente 3.14 g.X por electron, cuando NH3 es usado como fuente de nitrogeno

(Shuler & Kargi, 1992), el número de electrones disponibles por O2 es cuatro teniendo en

cuenta el catabolismo aeróbico del ácido láurico el cual se expresa como:

C12H24O2 + 17O2 → +12CO2 + 12H2O

El número de electrones disponibles por 1 mol de acido láurico es 68. El rendimiento de

biomasa por electrón disponible entonces es 68(3.14)=213.52 g X/mol ácido láurico, o en

términos de rendimiento 1.07 g.X/g ácido láurico (8.373 C-mol biomasa/ mol de acido

laurico). Con base en esto se comprueba que el rendimiento estimado experimentalmente

tiene un valor cercano al teorico de (1.17 g X/g aceite vegetal), el rendimiento estimado

experimentalmente es entonces apliciado a la estimacion de consumo de sustrato el cual

es reportado como dato experimental en el presente trabajo (Annuar & Tan, 2006).

Para la adecuada elaboración del modelo se tuvieron que establecer las siguientes

suposiciones:

- El aceite vegetal y el sulfato de amonio son los únicos sustratos limitantes que afectan

el crecimiento de biomasa y la producción de polímero. Por lo tanto, el proceso no tendrá

ningún efecto limitante de cualquier otro componente dentro del proceso por lote o, en

otras palabras, estos componentes están en exceso.

- El aceite vegetal es la única fuente de carbono para mantenimiento y crecimiento de la

célula.

- La temperatura (32 ºC) y pH (7) del medio de cultivo permanecen constantes durante el

periodo de fermentación.


La construcción del modelo matemático se realizó con base en los datos experimentales

de la cinética bacteriana en lote junto con los valores iniciales de los parámetros obtenidos

de los experimentos en Erlenmeyer. Esto permitió que el programa de optimización

empiece con buenos los valores iniciales para la búsqueda de los valores de los

parámetros de la cinética (Ecuación 4-3). Así mismo se establecieron límites superiores e

inferiores para los parámetros, lo que facilita la búsqueda de los valores óptimos y la

identificación del mínimo global.

Si bien la formulación y ajuste de un modelo matemático a partir de una única condición

inicial para la fermentación por lote es un procedimiento frecuentemente empleado, en el

presente trabajo se buscó ajustar el modelo a diferentes condiciones iniciales, modificando

la relación carbono nitrógeno para lograr que el modelo sea flexible en un mayor rango de

aplicaciones. Para ello, el modelo fue ajustado a los experimentos con concentración inicial

de aceite vegetal de 20 g/L, 40 g/L y 5 g/L (Figura 4-3B y C) y con concentración de sulfato

de amonio de 2.8 g/L para los tres casos.

A


Figura 4-3: Cinética en biorreactor 5 L, con concentraciones iniciales de aceite vegetal 20

g/L (A), 5 g/L (B) y 40 g/L(C) y sulfato de amonio de 2.8 g/L. Datos experimentales: ()

nitrógeno, (●) aceite vegetal (C*10), (x) PHA, (+) biomasa. Modelo: ( ) biomasa, ( ) aceite vegetal (C*10), ( ) sulfato de amonio, ( ) PHA.

El modelo que representa el consumo de aceite vegetal se basó en el balance de masa de

la fuente de carbono necesaria para la generación de biomasa y PHA, así como para los

procesos de mantenimiento (Ecuación 4-4), el cual también ha sido utilizado por diferentes

autores para simular el consumo de diferentes sustratos tanto gaseosos (H2, O2 y CO2) así

como azucares (sacarosa y fructosa) (Faccin et al., 2012; Gahlawat & Srivastava, 2013;

Heinzle & Lafferty, 1980; Mulchandani et al., 1989).

𝑑𝑆𝑐

𝑑𝑇= −[(

1


∗ 𝜇) +𝑚𝑐] ∗ 𝑋 (4-4)

B

C


donde 𝑌 𝑥

𝑆𝑐 es el rendimiento aceite vegetal con respecto a la biomasa activa y el PHA

intracelular y 𝑚𝑐 es el coeficiente de mantenimiento para aceite vegetal.

Así mismo, se propone que el consumo de nitrógeno estaría destinado a la generación de

nueva biomasa y al mantenimiento celular, este último representado en la recuperación de

proteínas intracelulares y ciclos fútiles, Ecuación 4-5, e igualmente reportado por diferentes

autores para describir el consumo de amonio (Khanna & Srivastava, 2008; Gahlawat &

Srivastava, 2013).

𝑑𝑆𝑛

𝑑𝑡= − [(

1

𝑌 𝑥𝑆𝑛

∗ 𝜇) +𝑚𝑛] ∗ 𝑋

(4-5)

donde 𝑌 𝑥

𝑆𝑛 es el factor de rendimiento de sulfato de amonio en la producción de biomasa,

𝑚𝑛 es el coeficiente de mantenimiento para nitrógeno.

Por último, se estableció que la generación de PHA se encuentra directamente asociada

con el crecimiento y aumento de la biomasa en el proceso por lote. Esto debido a que el

PHA se incrementa proporcionalmente con la biomasa y una vez esta llega a la etapa

estacionaria del proceso, el PHA no se incrementó (Figura 4-3), lo que elimina la posibilidad

de que exista una producción no asociada al crecimiento de biomasa, por esto se propone

la Ecuación 4-6 donde una constante alfa, corresponde a la constante de producción de

PHA dependiente de la producción de biomasa.

𝑑𝑃

𝑑𝑇= [∝∗ 𝜇] ∗ 𝑋 (4-6)

donde ∝ corresponde a la constante de proporcion de produccion de PHA respecto a la

biomasa. Los parámetros obtenidos para el modelo se pueden observar en la Tabla 4-2.

Tabla 4-2: Parámetros para el modelo completo con parámetros constantes.

parámetro valor parámetro valor parámetro valor

𝜇𝑚𝑎𝑥 0.355 h-1 𝐾sc 4.190 gA.V./L 𝐾sn 2.234 gS.A./L

∝ 0.983 gPHA/g 𝑆𝑛𝑚 15.6 g/L 𝑆𝑐𝑚 199 g/L

𝑎1 1.23 𝑎2 0.314


0.885 gX/gA.V. 𝑌 𝑥

𝑆𝑛 11.501 gX/gS.A.

𝑚𝑐 0.0016

gX/gA.V.h

𝑚𝑛 0.0035 gX/gS.A.h


Para evaluar el ajuste del modelo obtenido y validar que tan bueno es, se pueden observar

los resultados de la estimación del número E en la Tabla 4-3. En esta se puede apreciar

que los ajustes fueron satisfactorios, aunque se propone verificar la predicción del modelo

en condiciones diferentes.

Tabla 4-3: Valores de eficiencia Nash–Sutcliffe, para el modelo con parámetros constantes.

Experimento Biomasa Producto Sulfato de amonio Aceite vegetal

40 g/L Aceite vegetal 0.92 0.87 0.98 0.98

20 g/L Aceite vegeta 0.96 0.97 0.96 0.99

5 g/L Aceite vegeta 0.96 0.77 0.94 0.96

Por otro lado, se realizó una validación con un experimento en reactor de 100 L con

volumen de trabajo de 60 L y concentraciones iniciales de 40 g/L para aceite vegetal y 4

g/L de sulfato de amonio, este experimento busco identificar la capacidad del modelo para

predecir y simular la cinética de la bacteria bajo esta nueva condición operacional. Los

resultados muestran que, aunque hasta las 30 horas el modelo se ajusta bastante bien a

los datos experimentales (Figura 4-4) después de dicho tiempo, el modelo predice un

comportamiento distinto al de los datos experimentales.


Figura 4-4: Cinética en biorreactor 60 L, con concentración inicial de aceite vegetal 40g/L

y sulfato de amonio de 4 g/L. Datos experimentales: () nitrógeno, (•) aceite vegetal*10, (x)

PHA, (+) biomasa. Modelo: ( ) biomasa, ( ) aceite vegetal*10, ( ) sulfato de amonio, ( ) PHA. Para el error en la predicción se proponen las siguientes hipótesis: la primera se enfoca en

las condiciones de agitación y aeración son distintas, por lo cual el modelo no es capaz de

predecir los datos luego de que el fluido contiene cierta cantidad de biomasa. Los altos

valores para la biomasa, el producto o la fracción biomasa producto generen inhibición en

el crecimiento de la bacteria. Debido a que se tuvieron factores limitantes para la medición

de OD en este trabajo, se opta por estudiar la segunda hipótesis por medio del ajuste de

nuevos términos de inhibición en el modelo matemático.

Desarrollo del modelo con inhibición y parámetro variable

Teniendo en cuenta los resultados del ajuste del modelo anteriores, se buscó encontrar

indicios del por qué la bacteria tuvo el comportamiento de desaceleración a partir de la

hora 30. (Figura 4-4) en condiciones donde el sustrato es suficiente para continuar con un

crecimiento prolongado. Para esto se realizaron diferentes pruebas en lote con diferentes

concentraciones iniciales (Tabla 4-4), buscando descartar el efecto inhibitorio y limitante

de los sustratos (aceite vegetal, sulfato de amonio) en el crecimiento. Con los datos

obtenidos se modificó el modelo buscando la predicción del comportamiento de la bacteria

en un rango más amplio de condiciones, además de establecer un posible nuevo factor de

inhibición en el crecimiento de la bacteria.

Tabla 4-4: Concentraciones iniciales a escala Bioflo 7 L

Ensayo Concentraciones iniciales Relación inicial

carbono nitrógeno (C/N) Aceite (g/L) Sulf. Amonio (g/L)

Exp 1 40 4.56 35.39

Exp 2 40 4.14 38.98

Exp 3 140 6.6 85.58

Exp 4 100 2.88 140.09

Exp 5 40 1.96 82.34


Exp 6 20 4.97 16.24

Exp 7 20 2.36 34.19

Exp 8 5 2.87 7.03

Exp 9 20 2.28 35.39

Luong et al. (1988) reportaron que la tasa de crecimiento de biomasa es afectada tanto por

la acumulación de PHA como por la disponibilidad de sustrato. Este fenómeno es

considerado para la complementación del modelo, y para modelarlo se evalúa la

incorporación de un término de inhibición por la concentración de producto (Ecuación 4-7)

o la fracción del mismo (Ecuación 4-8). En ambos casos, los términos de inhibición y

limitación por los sustratos predominantes (aceite vegetal y sulfato de amonio) se

mantienen en el modelo. Este tipo de fenómeno ha sido propuesto por autores para cultivos

heterotróficos en cultivo mixto con acetato como fuente de carbono, así mismo para

cultivos puros con la bacteria C. necator DSM 545 con glicerol y glucosa como fuente de

carbono, generando buenas aproximaciones a los fenómenos de inhibición por producto

(Mozumder et al., 2014; Dias et al., 2005).

𝑑𝑋


𝑆𝑐

𝐾sc + 𝑆𝑐) ∙ (

𝑆𝑛

𝐾sn + 𝑆𝑛) ∙ (1 − (

𝑆𝑐

𝑆𝑐𝑚)𝑎1

)

∙ (1 − (𝑆𝑛

𝑆𝑛𝑚)𝑎2

) . (1 − (𝑃

𝑃𝑚)𝑎3

)] ∙ 𝑋

(4-7)

donde 𝑃 es la concentración de producto y 𝑃𝑚 es la concentración máxima de producto a

la cual la biomasa se ve inhibida, 𝑎3 es una constante adimensional para el efecto de

inhibición en la velocidad específica de crecimiento.

𝑑𝑋


𝑆𝑐

𝐾sc + 𝑆𝑐) ∙ (

𝑆𝑛

𝐾sn + 𝑆𝑛) ∙ (1 − (

𝑆𝑐

𝑆𝑐𝑚)𝑎1

)

∙ (1 − (𝑆𝑛

𝑆𝑛𝑚)𝑎2

) ∙ (1 − (𝑓𝑃𝐻𝐴𝑓𝑃𝐻𝐴𝑚

)𝑎3

)] ∙ 𝑋

(4-8)

donde 𝑓𝑃𝐻𝐴 es la fracción PHA/biomasa y 𝑓𝑃𝐻𝐴𝑚 es la fracción máxima de

producto/biomasa a la cual el crecimiento de biomasa es totalmente inhibido, 𝑎3 es una


constante adimensional que relaciona la relación la fracción de producto con la fracción de

producto máxima y el efecto de la inhibición en la velocidad especifica de crecimiento.

Por otro lado, se propone el efecto de inhibición provocado por la biomasa ya que en ciertos

casos una alta densidad de biomasa puede afectar negativamente la velocidad de

crecimiento de la misma. Esta puede ser descrita por el modelo logístico de crecimiento

por autoinhibición de crecimiento poblacional (Verhulst, 1838; Mulchandani et al., 1989).

𝑑𝑋


𝑆𝑐

𝐾sc + 𝑆𝑐) ∙ (

𝑆𝑛

𝐾sn + 𝑆𝑛) ∙ (1 − (

𝑆𝑐

𝑆𝑐𝑚)𝑎1

) ∙ (1 − (𝑆𝑛

𝑆𝑛𝑚)𝑎2

)

∙ (1 − (𝑋

𝑋𝑚)𝑎3

)] ∙ 𝑋

(4-9)

donde 𝑋𝑚 es la concentración máxima a la que la biomasa puede llegar, 𝑎3 es el

coeficiente de inhibición celular, cuyo valor depende de la especie de bacteria, las

propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo y las condiciones operacionales (Luong

et al., 1988).

Para las tres opciones de inhibición que se está considerando (por producto, por fracción

producto/biomasa y por biomasa) se usa la misma nomenclatura para la constante

adimensional porque estos términos de inhibición son alternativas y nunca se consideraron

simultáneamente. Específicamente para la opción de inhibición por biomasa, Ecuación 4-

9, 𝑎3 = 1, indica una relación lineal entre la velocidad específica de crecimiento y la

concentración de biomasa, correspondiente a la cinética de crecimiento logístico. Sin

embargo, alguno autores han encontrado experimentalmente descenso no lineal de la

velocidad específica de crecimiento con el incremento de la biomasa (Strehaiano et al.,

1983). Cuando 𝑎3 > 1 el comportamiento del crecimiento tiende a estar entre un patrón

exponencial y logístico (Mozumder et al., 2014).

Por otra parte, se analizó la cinética bacteriana de la B. cepacia B27, con especial atención

en el rendimiento. En este análisis se observó que para la generación de biomasa a partir

de la fuente de carbono, no se presentan diferencias cuando se modifica la relación

carbono/nitrógeno (C/N): 0.86 gX/g A.V. para C/N = 7.03; 0.83 gX/gA.V para C/N = 35.39,

y 0.83 gX/gA.V para C/N = 82.34. Estos valores son superiores a los presentados por otros

autores (Gahlawat & Srivastava, 2012; Khanna & Srivastava, 2005b; López-Cuellar et al.,


2011), lo que sugiere que la conversión de la fuente de carbono a biomasa tiene poca

variabilidad en la cepa de estudio dependiendo de la relación C/N.

Al contrario de lo que sucede con la transformación de la fuente de carbono en biomasa,

en el rendimiento obtenido para la formación de biomasa con respecto al consumo de

amonio se observan cambios importantes dependiendo de la relación C/N: el rendimiento

biomasa/nitrógeno, aumenta cuando la relación carbono/nitrógeno aumenta, como se

puede apreciar en la Tabla 4-5 y en la Figura 4-5.

Tabla 4-5: Rendimiento biomasa/sulfato de amonio obtenidos y relación inicial C/N en los experimentos a escala Bioflo 7 L.

Relación carbono nitrógeno inicial (C/N)

Rendimiento biomasa sulfato de amonio

(𝑌 𝑥

𝑆𝑛)

38.98 2.78

85.58 2.54

140.09 2.91

82.34 3.04

16.24 2.09

34.19 1.9

7.03 1.95

35.39 2.14

Con base en el comportamiento observado se opta por proponer un término variable de

rendimiento biomasa/sulfato de amonio, dependiente de la relación C/N en la ecuación del

consumo de sulfato de amonio (Ecuación 4-5).

Esta propuesta se soporta en el variación importante y consistente en el rendimiento

biomasa/sulfato de amonio el cual fue calculado como la cantidad de biomasa generada

por sulfato de amonio consumido hasta la máxima cantidad obtenida de biomasa (Figura

4-5), a pesar de que las razones metabólicas para la diferencia en este rendimiento no son

aún claras y los factores que afectan el crecimiento bacteriano son numerosos y poco

comprendidos (Franck et al., 1999), y de que otros autores argumentan que, generalmente,

es difícil obtener una reproducibilidad consistente y precisa experimentalmente del


rendimiento biomasa amonio de un proceso en lote, debido a las condiciones de

variaciones fisiológicas y de cultivo (Annuar & Tan, 2006).

Figura 4-5: Ajuste de ecuaciones de saturación de velocidad de crecimiento, para predecir el rendimiento biomasa sulfato de amonio dependiente de la relación C/N. (•) Datos experimentales, ( ) datos simulados.

Existen autores que mencionan que las velocidades de consumo de amonio pueden

incrementarse a medida que la concentración de amonio se incrementa, esto se sustenta

en que el amonio es una especie iónica que no puede ser difundida libremente a través de

la membrana celular, la intervención de una proteína transportadora activa específica es

la que probablemente participe en el mecanismo de consumo de nitrógeno, por lo tanto,

una alta concentración del ion amonio requiere de la síntesis de más proteína

transportadora, lo que resulta en un consumo más rápido por parte del microorganismo

(Annuar & Tan, 2006), este efecto fue observado en los experimentos con concentraciones

altas de sulfato de amonio , entre 4 y 5 g/L, y baja relación C/N, en estos experimentos el

amonio fue consumido de manera rápida, si se compara con los experimentos con

concentraciones inferiores de sulfato de amonio (Anexo C).

Por lo anterior, se planteó un modelo matemático que permite ajustar el consumo de

amonio y de esta forma simular mejor el comportamiento de la bacteria, haciendo más


confiable la predicción para etapas posteriores de optimización del proceso. Este

planteamiento toma como referencia los resultados de autores como (Liew et al., 2013)

quienes estudiaron diferentes aproximaciones para modelar el efecto de la condiciones del

proceso (agitación y aeración) sobre la cinética de crecimiento bacteriano, y aplica el

concepto de cinética de Herbert, donde los parámetros de los modelos para las

velocidades de producción y consumo son variables y fueron ajustados con ecuaciones

lineales que modifican los parámetros dependiendo de las condiciones del proceso.

Para nuestro caso, la ecuación propuesta para describir el cambio del rendimiento biomasa

sulfato con respecto a la relación C/N, fue seleccionada con la herramienta de búsqueda

de ecuaciones del programa Curve Expert Professional 2.3.0, empleando los datos

expuestos de la Tabla 4-5. Como resultado del ajuste se proponen la ecuación de

saturación de velocidad de crecimiento para describir el fenómeno de consumo de sulfato

de amonio con respecto a la relación C/N (Ecuación 4-10).

𝑌 𝑥𝑆𝑛=

𝑑 ∙ (𝐶𝑁)

(𝑏 + (𝐶𝑁))

(4-10)

donde 𝑑 y 𝑏 son constantes adimensionales.

El ajuste de los nuevos parámetros para las ecuaciones de inhibición por producto o por

fracción de producto en la biomasa e inhibición por biomasa (Ecuaciones 4-7, 4-8 y 4-9)

fueron realizados con los datos experimentales obtenidos de los ensayos en Bioflo, con las

condiciones iniciales de C/N presentadas en la Tabla 4-4. Además, se incluyeron en los

modelos la ecuación para estimar el rendimiento biomasa/nitrógeno (Ecuaciones 4-10)

para evaluar que combinación genera el mejor ajuste.

Los datos experimentales muestran el efecto de la inhibición por los sustratos como el

aceite vegetal, la cual se ve reflejada en la simulación de la cinética con concentraciones

iniciales de A.V. de 100 g/L, donde el término respectivo afecta la velocidad de crecimiento

de la bacteria sustancialmente Figura (4-6) ratificando la importancia de los fenómenos de

limitación e inhibición y por consiguiente la necesidad de los términos respectivos para

lograr un modelo con buena predicción.


Figura 4-6: Ajuste del modelo con parámetro variable de rendimiento con aplicación de termino de inhibición por (A) producto, (B) fracción polímero biomasa y (C) biomasa, en régimen lote a escala 100 L con concentraciones iniciales de (1) 100 g/L A.V y 2.8 g/L S.A., (2) 140 g/L A.V y 6.6 g/L S.A. Datos experimentales () sulfato de amonio, (•) aceite

vegetal*10, (x ) producto PHA, () biomasa datos simulados: ( ) biomasa, ( ) aceite

vegetal*10, ( ) sulfato de amonio, ( ) PHA.

Así mismo, se observó el buen ajuste del modelo cuando se presenta el efecto limitante

que tiene la fuente de carbono sobre la cantidad de biomasa obtenida, como se puede

observar en la Figura (4-7).

A.2 A.1

B.1 B.2

C.1

C.2


Figura 4-7: Ajuste del modelo con parámetro variable de rendimiento con aplicación de término de inhibición por producto (A), fracción polímero/biomasa (B) y biomasa (C), para corridas de 5 L con concentraciones iniciales de 5 g/L A.V y 2.8 g/L S.A. Datos

experimentales () sulfato de amonio, (•) aceite vegetal /10, (x ) producto PHA, () biomasa

datos simulados: ( ) biomasa, ( ) aceite vegetal, ( ) sulfato de amonio, ( ) PHA.


Realizando la comparación del modelo que solamente considera los términos de

crecimiento de biomasa influenciado por los sustratos orgánicos (Ecuación 4-3) frente a la

ecuación con el término de inhibición por generación de producto, se observa una mejor

predicción de los datos experimentales, por ejemplo, para la fermentación en 60 L Figura

(4-4 y 4-6.

Por otra parte, se pudo constatar que la acumulación del polímero no requiere de

condiciones de limitación de nitrógeno, esto podría ser debido a que el microorganismo es

capaz de tomar el PHA intracelular junto con los sustratos orgánicos que lo rodean para el

crecimiento de biomasa en presencia de nitrógeno (Luong et al., 1988). Además,

realizando la comparación del modelo que solamente considera los términos de

crecimiento de biomasa influenciado por los sustratos orgánicos (Ecuación 4-3) frente a la

ecuación con el termino de inhibición por biomasa, se observa una mejor simulación de los

datos experimentales, por ejemplo, con la fermentación en 60 L (Figura 4-4 y 4-8C). Es

claro entonces que no se puede ignorar el termino de inhibición por productoY biomasa en

la cinética de la B. cepacia B27.

Estos resultados confirman que el efecto de la concentración de la biomasa puede ser un

factor importante en la inhibición del crecimiento. Por un lado, es poco probable que la

limitación de oxigeno fuera una de las razones por las cuales se redujera el crecimiento de

la bacteria ya que con flujo de 2 vvm y agitación a 240 rpm, se espera haya oxígeno disuelto

suficiente. Así mismo, la posibilidad de que ocurra limitación por nutrientes es descartada,

pues en experimentos con concentraciones iniciales de 40 g/L A.V. y 4 g/L S.A, la biomasa

no sobrepasa los 14 g/L.


Figura 4-8: Datos simulados frente a datos experimentales del modelo con parámetro variable de rendimiento con aplicación de termino de inhibición por (A) producto, (B) fracción polímero biomasa y (C) biomasa, en régimen lote a escala 100 L con concentraciones iniciales de 40 g/L, 4 g/L. Datos experimentales () sulfato de amonio, (•)

aceite vegetal*10, (x ) producto PHA, () biomasa datos simulados: ( ) biomasa, ( )

aceite vegetal*10, ( ) sulfato de amonio, ( ) PHA.

A

B

C


Además, la inhibición en el crecimiento se verificó en los repetidos experimentos

reportados en el presente trabajo, además de un ensayo realizado donde se incrementó

en un 50 % todos los componentes del medio (no reportado), previniendo algún efecto de

limitación por otros componentes como elementos traza, fósforo o sulfato de magnesio, sin

embargo, en este ensayo tampoco se lograron concentraciones de biomasa superiores al

valor límite de 14 g/L. Lo anterior nos lleva a pensar que la concentración de biomasa no

podría ser mejorada por la adición de nutrientes al cultivo, por ello la aplicación del modelo

descrito por Mulchandani et al. (1989) que representa el efecto negativo de la alta densidad

celular sobre la velocidad de producción de biomasa es incluida en el modelo cinético

(Ecuación 4-9) (Mozumder et al., 2014).

Los parámetros resultantes del ajuste para cada ecuación se pueden observar en la Tabla

4-6. Así mismo los resultados de la eficiencia (𝐸) para la validación del modelo se pueden

observar en la tabla 4-7.

Tabla 4-6: Parámetros reportados para los diferentes modelos propuestos para inhibición adicional, con rendimiento biomasa/sulfato de amonio variable.

Parámetros Unidades Parámetro para los modelos

Inhibición por producto

Inhibición por fracción producto

Inhibición por Biomasa

μmax 1/h 0.07 0.07 0.07

𝐾sc gA.V./L 1.23c 0.24 3.35

𝐾sn gS.A./L 0.02 0.026 0.036

𝑆𝑐𝑚 gS.A./L 191.32 179.25 191.32

𝑆𝑛𝑚 gA.V./L 15.47 15.47 15.47

𝑃𝑚 gPHA/L 9.59 - 14.62

𝑋𝑚 gX/L - - -

𝑓𝑃𝐻𝐴𝑚 - 11.4 -

𝑎1 - 2.51 1.47 2.60

𝑎2 - 4.73 5.138 10.23

𝑎3 - 1.31 0.62 1.163

α gPHA/gX 0.92 0.94 0.92

𝑚𝑐 gX/gA.V.h 0.0016 0.0016 0.0016

𝑚𝑛 gX/gA.V.h 0.0015 0.0015 0.0015


𝑌 𝑥𝑆𝑛

gX/gS.A.h Ecuación Ecuación Ecuación

𝑌𝑥+𝑃𝑆𝑐

gX+P/gS.A.h 0.89 0.89 0.89

𝑑 - 9.32 4.38 9.32

𝑏 molC/molN 0.1314 4.54 0.1314

Los resultados obtenidos de la estimación de la eficiencia Nash–Sutcliffe (E) (Tabla 4-7)

muestran que los parámetros seleccionados simulan de manera satisfactoria el

comportamiento cinético de la B. cepacia B27, en el rango de condiciones operacionales

consideradas. Entre los términos de inhibición propuestos (producto, fracción

biomasa/producto, biomasa) el que relaciona el fenómeno inhibitorio de la cantidad de

biomasa con la desaceleración del crecimiento, fue el que permitió un mejor ajuste del

modelo. No obstante, aquellos ajustes con eficiencia menor a 0.5, que evidencia un ajuste

regular, pueden estar influenciados por las variaciones fisiológicas y condiciones de cultivo

(Annuar & Tan, 2006).

Tabla 4-7: Valores de eficiencia Nash–Sutcliffe, para los modelos con inhibición y rendimiento biomasa/sulfato de amonio variable.

Tipo de

modelo

Inhibición por producto Inhibición por fracción

producto

Inhibición por biomasa

Ensayo X PHA S.A. A.V. X PHA A.V. S.A. X PHA A.V. S.A.

Exp 1 0.91 0.95 0.91 0.99 0.81 0.93 0.86 0.99 0.97 0.99 0.97 0.99

Exp 2 0.93 0.96 0.93 0.99 0.88 0.91 0.87 0.99 0.97 0.97 0.97 0.99

Exp 3 0.78 0.90 0.82 0.93 0.37 0.65 0.43 0.84 0.78 0.89 0.84 0.90

Exp 4 0.98 0.91 0.98 0.99 0.77 0.88 0.74 0.97 0.97 0.85 0.98 0.99

Exp 5 0.39 0.29 0.34 0.99 0.29 0.08 0.22 1.00 0.35 0.25 0.30 1.00

Exp 6 0.85 0.90 0.85 0.96 0.69 0.83 0.68 0.97 0.92 0.79 0.92 0.94

Exp 7 0.75 0.66 0.78 0.99 0.77 0.86 0.76 0.99 0.73 0.60 0.76 0.99

Exp 8 0.81 0.85 0.91 0.98 0.72 0.63 0.77 0.96 0.80 0.86 0.90 0.99

Exp 9 0.18 0.36 0.23 0.99 0.16 0.30 0.11 0.99 0.19 0.36 0.23 0.99

Se realizó un análisis de sensibilidad simple, modificando ± 20 % del valor de cada

parámetro y verificando el impacto sobre el valor de la eficiencia (𝐸) en los experimentos

donde se realizó el ajuste.


Con la prueba de sensibilidad se pudo constatar que el parámetro con más influencia sobre

la simulación del proceso es el correspondiente a la inhibición por fuente de carbono (𝑆𝑐𝑚)

y ∝ junto con los términos de inhibición por biomasa, producto y fracción de producto. Esto

nos permitió corroborar que el termino de inhibición en la velocidad especifica de

crecimiento fue necesario para el proceso de modelación y la obtención de un buen ajuste

con respecto a los datos experimentales.

Finalmente, el modelo matemático propuesto para la producción de PHAs por B. cepacia

B27 empleando aceite vegetal como fuente de carbono y sulfato de amonio se presenta

en la Tabla 4-8.

Tabla 4-8: Modelo matemático para producción de PHAs por B. cepacia B27.

𝑑𝑋


𝑆𝑐

𝐾sc + 𝑆𝑐) ∙ (

𝑆𝑛

𝐾sn + 𝑆𝑛) ∙ (1 − (

𝑆𝑐

𝑆𝑐𝑚)𝑎1

) ∙ (1 − (𝑆𝑛

𝑆𝑛𝑚)𝑎2

) ∙ (1 − (𝑋

𝑋𝑚)𝑎3

)] ∙ 𝑋

𝑑𝑆𝑐

𝑑𝑇= −[(

1


∗ 𝜇) +𝑚𝑐] ∗ 𝑋

𝑑𝑆𝑛

𝑑𝑡= − [(

1

𝑌 𝑥𝑆𝑛

∗ 𝜇) +𝑚𝑛] ∗ 𝑋 donde 𝑌 𝑥

𝑆𝑛=

𝑑 ∙ (𝐶𝑁)

(𝑏 + (𝐶𝑁))

𝑑𝑃

𝑑𝑡= [∝∗ 𝜇] ∗ 𝑋

Optimización del proceso

El modelo generado para el proceso en lote fue extrapolado para cultivo en lote alimentado,

para lo cual se debe incluir los términos de dilución por el flujo de alimentación. Las

ecuaciones del modelo en lote alimentado son los siguientes:


𝑑𝑋


𝑆𝑐

𝐾sc + 𝑆𝑐) ∙ (

𝑆𝑛

𝐾sn + 𝑆𝑛) ∙ (1 − (

𝑆𝑐

𝑆𝑐𝑚)𝑎1

) ∙ (1 − (𝑆𝑛

𝑆𝑛𝑚)𝑎2

)

∙ (1 − (𝑋

𝑋𝑚)𝑎3

)] ∙ 𝑋 − 𝐷𝑋

(4-11)

𝑑𝑆𝑐

𝑑𝑡= − [(

1


∗ 𝜇) +𝑚𝑐] ∗ 𝑋 −

𝐹1𝑉(𝑆𝑐𝑓 − 𝑆𝑐) (4-12)

𝑑𝑆𝑛

𝑑𝑡= − [(

1

𝑌 𝑥𝑆𝑛

∗ 𝜇) +𝑚𝑛] ∗ 𝑋 −

𝐹2𝑉(𝑆𝑛𝑓 − 𝑆𝑛) (4-13)

𝑑𝑃

𝑑𝑡= [∝∗ 𝜇] ∗ 𝑋 − 𝐷𝑃 (4-14)

𝑑𝑉

𝑑𝑡= 𝐹1 + 𝐹2

(4-15)

donde 𝐹1 y 𝐹2 son los flujos de alimentación, y 𝐷 es la tasa de dilución (𝐹 𝑉⁄ ).

Para el análisis de la operación por lote alimentado, inicialmente se estableció la

alimentación del biorreactor con un único flujo donde se mezcla la fuente de carbono

(aceite vegetal) y nitrógeno (sulfato de amonio), en altas concentraciones con los demás

componentes a igual proporción de las estimada en el nitrógeno, (Anexo A) es decir, si se

aplica 4 veces más la concentración de amonio los demás componentes deberán

aumentarse a dicha proporción, esto con el fin de mantener la concentración de todos los

nutrientes necesarios para el crecimiento de la bacteria.

Cuando se realiza la mezcla de los componentes surgen algunos inconvenientes

relacionados a la emulsión que se genera por el contenido de aceite en la mezcla. El primer

inconveniente es el flujo por la manguera de alimentación, donde se empiezan a separar

dos fases, lo que no permite una homogénea concentración de los nutrientes que se

suministran al biorreactor. Para solucionar esto, se experimentó con alimentación por

pulsos y alimentación de los nutrientes de forma separada.


4.3.1 Régimen por pulso de sustratos

Los experimentos de optimización se corrieron bajo los criterios iniciales de cultivo óptimo

en que se observó la mayor velocidad específica de crecimiento (20 g/L aceite vegetal 2.8

g/L sulfato de amonio) con un volumen inicial de 3 L. Luego se consideró la adición del

primer pulso a las 24 horas y otro a las 48 horas del experimento, donde la bacteria aún

se encuentra en fase exponencial y no ha consumido la totalidad de los nutrientes.

La concentración aplicada de los dos pulsos fue la correspondiente a la óptima, esto con

el fin de no alterar significativamente el estado de la bacteria y renovar el medio con más

sustrato. Como resultado, el ajuste es adecuado (Figura 4-9), y vuelve a observarse un

efecto inhibitorio, el cual se presume es causado por la concentración de biomasa presente

en el cultivo, según el modelo sugerido para la optimización (Tabla 4-8).

Figura 4-9: Ajuste del modelo para experimento con pulsos de 20 g/L A.V. 2.8 S.A. Datos

experimentales: () sulfato de amonio, (•) aceite vegetal, (x ) producto PHA, () biomasa

datos simulados: ( ) biomasa, ( ) aceite vegetal, ( ) sulfato de amonio, ( ) PHA.

Con la intención de verificar mejor el efecto inhibitorio sugerido en el proceso de

optimización, se elaboró otro tipo de pulso, con concentración de 40 g/L A.V. y 4 g/L S.A.

en la fuente de alimentación a los mismos tiempos de aplicación que el anterior (Figura 4-

10), en este caso, a pesar de esperar un aumento significativo de la biomasa por la


cantidad de sustratos suministrados, la velocidad específica de crecimiento de la bacteria

es baja y la simulación corresponde de forma adecuada a los datos experimentales.

Figura 4-10: Ajuste del modelo para experimento con pulsos de 40 g/L A.V. 4 g/L S.A..

Datos experimentales: () sulfato de amonio, (•) aceite vegetal, (x ) producto PHA, ()

biomasa datos simulados: ( ) biomasa, ( ) aceite vegetal, ( ) sulfato de amonio, ( ) PHA.

El proceso de optimización, aunque infructífero para el bioproceso, deja entrever que la

bacteria tiene algunas limitaciones en el crecimiento con el uso de sustratos oleosos como

fuente de carbono. Otros autores por el contrario, han obtenido aumentos significativos de

la cantidad de biomasa producida a medida que se aumenta la concentración de la fuente

de carbono, da Cruz Pradella et al. (2012) con fuente de carbono a base de aceite de soya

y la bacteria Cupriavidus necátor DSM 545 obtuvo concentraciones de biomasa de 25, 51

y 81 g/L de biomasa con concentraciones de 10, 20 y 40 g/L de aceite de soya inicial

respectivamente en un proceso por lote alimentado, además de suponer que

probablemente la inhibición por producto este afectando el crecimiento de la bacteria. Así

mismo, en un estudio con la cepa recombinada PHB-4/pJRDEE32d13 creada a partir de

la cepa de Ralstonia eutropha H16, con el gen PHA sintasa de Areomonas caviae y la cepa

nativa de Ralstonia eutropha H16 fue estudiada con aceite de soya como fuente de

carbono. En estos casos lo que se pretendió fue reponer por medio de pulsos los sustratos

que la bacteria iba consumiendo, como resultado se obtuvieron altas concentraciones de

biomasa (118-128 g/L), con contenido de PHA entre el 71-76 % p/p (Kahar et al., 2004).


En otro intento por mejorar el proceso, se realizó un ensayo con el fin de reponer los

nutrientes que consume la bacteria durante la fermentación, similar a lo propuesto por

Kahar et al. (2004). El medio de cultivo inicia con un volumen de 4.2 L, a la hora 26 se le

reponen los nutrientes consumidos por la bacteria, según predicción del modelo, en este

punto se adicionó 500 mL de medio de cultivo con concentraciones 28 g/L de S.A. y 216

g/L de A.V. de forma separada en un solo pulso. Como se puede observar en la Figura 4-

11.

Figura 4-11: Ajuste del modelo para experimentos con alimentación para reposición de

nutrientes. Datos experimentales: () sulfato de amonio, (•) aceite vegetal*10, (x ) producto

PHA, () biomasa datos simulados: ( ) biomasa, ( ) aceite vegetal*10, ( ) sulfato

de amonio, ( ) PHA.

Para este caso, el proceso presentó una mayor cantidad de biomasa al final, 18 g/L, 20%

más que el obtenido en lote, sin embargo, se tiene que comprobar con experimentos

futuros, si la adición de altas concentraciones de nitrógeno en el medio o la adición

diferenciada en el cultivo, es la herramienta clave para obtener mayores cantidades de

biomasa al final del proceso y por consiguiente mayores concentraciones del polímero en

cuestión.

4.3.2 Régimen por alimentación constante de sustratos

También se realizó ensayos en régimen de alimentación, donde se maneja una velocidad

de flujo constante durante un periodo de 24 h, el cual es obtenido por el algoritmo


desarrollado (Anexo D). Para este experimento se utilizó un volumen inicial de 4 L, y la

fuente de alimentación con concentraciones de 150 g/L de aceite vegetal y 21 g/L de S.A.,

se introdujo la mezcla con previa agitación a 0.0054 L/h a las 24 h de fermentación durante

24 horas, luego 0.0027 L/h a las 48 h durante 24 horas.

Figura 4-12: Ajuste del modelo para experimentos con flujo de alimentación constante.

Datos experimentales: () sulfato de amonio, (•) aceite vegetal, (x ) producto PHA, ()

biomasa datos simulados: ( ) biomasa, ( ) aceite vegetal, ( ) sulfato de amonio, ( ) PHA.

Aunque el proceso fue modelado con el efecto inhibitorio de la concentración de biomasa,

se sospecha del efecto de coproductos que pueden ser generados en los procesos

enzimáticos que emplea la bacteria para asimilar los ácidos grasos como fuente de

carbono, ya que comparado, por ejemplo con los trabajos de Kahar et al. (2004) y

Mozumder et al. (2014), se esperaría que el efecto inhibitorio por biomasa ocurriera en

concentraciones elevadas (75–150 g/L) en el proceso de producción de PHA. Además

Kahar et al. (2004), dentro de la discusión, exponen algunos problemas en el crecimiento

de la R. eutropha, relacionados con ensayos usando ácido linoleico como fuente de

carbono. Sustentando que en el proceso la liberación de una alta cantidad ácidos grasos

en la producción de PHA entre los cuales se encuentra el ácido linoleico puede influir en

la reducción del crecimiento de la bacteria, recomendando el uso de aceite de palma con

menor contenido de ácido linoleico.


A pesar de no obtener una alta cantidad de biomasa en regímenes por pulso o por

alimentación, el potencial de la bacteria B. cepacia B27 frente a otras cepas, radica en su

capacidad de acumulación del polímero, como se puede observar en la Tabla 4-9, el

porcentaje de acumulación de polímero esta en uno de los más altos, comparados entre

sustratos similares de aceite y sustratos de cadena corta como sacarosa. Se debe estudiar

mejor la bacteria y su interacción directa con los sustratos, para así entender los motivos

de algunos fenómenos aquí mencionados.

Tabla 4-9: Cuadro comparativo de los resultados del presente trabajo frente a otros trabajos realizados en el IBUN y externos.

Criterio Presente trabajo

(Acosta, 2007)

da Cruz Pradella et al. (2012)

Kahar et al. (2004)

(López-Cuellar et al., 2011)

Microorganismo Burkholderia cepacia B27

B. cepacia 2G57

Cupriavidus necator DSM 545

Ralstonia eutropha H16 ATCC17699,

W. eutropha ATCC 17699

Fuente de carbono

Mezcla de aceite de soya y maíz (mazorca de oro grasco)

Sacarosa Aceite de soya

Aceite de soya

Aceite de canola

Alimentación pulso Lote alimentado

Lote Pulso Lote alimentado

X (g/L) 18.5 21.93 83 126

PHA (g/L) 15.91 6.2 67.23 95.76 18.27

% acumulación 86 28.27 81 76 89


0.89 0.07 0.83 0.76 0.68

Productividad (g/L.h)

0.85 0.21 2.5 1.76 0.46

5. Conclusiones y recomendaciones

Conclusiones

- La evaluación de los efectos de los sustratos (aceite vegetal y sulfato de amonio)

en escala erlenmeyer mostró grandes rasgos de la fenomenología inhibitoria y

limitante sobre la velocidad específica de crecimiento de la bacteria, lo que indica

las restricciones de la bacteria para el régimen de procesamiento por lote. Además,

los parámetros obtenidos con esos experimentos fueron un buen punto de partida

para obtener los valores iniciales de los parámetros, lo que nos permitió desarrollar

el modelo matemático expuesto.

- Se desarrolló un modelo matemático cuyo ajuste teniendo en cuenta el efecto

inhibitorio y limitante de los sustratos, fue satisfactorio hasta cierto punto, lo que

llevo a considerar otros fenómenos para el modelo, que permitieran una mejor

simulación de los resultados experimentales.

- La variabilidad en la velocidad de consumo de fuente de nitrógeno, es un factor a

tener en cuenta en el modelamiento, especialmente en bacterias donde se puede

ver afectado el crecimiento o producción de biomasa por este sustrato. Por lo que

una primera aproximación con el parámetro de rendimiento biomasa nitrógeno

variable es positivo en esta fase de desarrollo.

- Se determinó que la inhibición por concentración de biomasa en la bacteria

Burkholderia cepacia B27, tiene una gran relevancia en la simulación del modelo

matemático, mejorando significativamente el ajuste para la mayoría de

experimentos en escala Bioflo, sin embargo, se debe profundizar sobre lo que

puede realmente estar afectando la bacteria.

- La concentración máxima de biomasa obtenida fue de aproximadamente 15 g/L,

durante una fermentación por lote de 72 h. A pesar de los esfuerzos con suministro

Bibliografía 89

de sustratos para mejorar dicho valor, la bacteria sólo llego hasta los 18 g/L. Por lo

que se ratifica la incidencia de algún factor inhibitorio sobre el crecimiento de la

bacteria.

Recomendaciones

- Tener un mayor conocimiento sobre el sustrato suministrado para la producción del

polímero con la bacteria, ya que, al ser una mezcla de aceites de maíz y soya, no

hay certeza de las concentraciones de los ácidos grasos que lo componen.

- Evaluar el efecto del sulfato de amonio y desarrollar un análisis más detallado del

por qué la bacteria tiene dicho comportamiento de consumo acelerado o

desacelerado del nitrógeno en diferentes condiciones.

- Determinar si efectivamente existe alguna influencia inhibitoria por parte de la

biomasa, o si la evolución del cultivo y de las propiedades reológicas tienen un

impacto negativo sobre la transferencia de oxígeno que altera la velocidad

específica de crecimiento de la bacteria.

- Trabajar en la búsqueda de mejores ajustes para ensayos con alimentación

continua o pulso, ya que el comportamiento de la bacteria frente a condiciones

nuevas como aumento de concentración de nitrógeno, afecta significativamente el

proceso y por tanto el control del mismo.

- Se propone realizar un modelo con mayor especificidad sobre las rutas metabólicas

que posee la bacteria, con el fin de comprender mejor el desarrollo metabólico en

las diferentes etapas de abundancia o escases de los sustratos, así como por

variación de la relación carbono/nitrógeno que modifican drásticamente el

comportamiento bacteriano.

Bibliografía

Acosta, M. (2007). Establecimiento de un modelo matemático a escala laboratorio del

proceso de producción de un polímero tipo polihidroxialcanoato (pha), utilizando la

cepa nativa Burkholderia Cepacia (Tesis de maestria). Universidad Nacional de

Colombia sede Bogotá.

Aiba, S., Shoda, M., & Nagatani, M. (1968). Kinetics of product inhibition in alcohol

fermentation. Biotechnology and Bioengineering, 10(6), 845-864.

http://doi.org/10.1002/bit.260100610

Akiyama, M., Tsuge, T., & Doi, Y. (2003). Environmental life cycle comparison of

polyhydroxyalkanoates produced from renewable carbon resources by bacterial

fermentation. Polymer Degradation and Stability, 80(1), 183-194.

http://doi.org/10.1016/S0141-3910(02)00400-7

Aldor, I. S., & Keasling, J. D. (2003). Process design for microbial plastic factories:

metabolic engineering of polyhydroxyalkanoates. Current Opinion in Biotechnology,

14(5), 475-483. http://doi.org/http://dx.doi.org/10.1016/j.copbio.2003.09.002

Almudena, A. M., García-Ochoa, S. F., & Santos, V. E. (1999). Desarrollo de modelos

cinéticos para bioprocesos: aplicación a la producción de xantano. Universidad

Complutense de Madrid.

Anderson, A. J., & Dawes, E. A. (1990). Occurrence, metabolism, metabolic role, and

industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiological reviews, 54(4),

450-472. http://doi.org/0146-0749/90/040450-23$02.00/0

Annuar, M. S. ., & Tan, I. K. P. (2006). Ammonium uptake and growth kinetics of

Pseudomonas putida PGA1. Asia Pacific Journal of …, 14(1), 1-10. Recuperado a

partir de http://eprints.um.edu.my/5373/

Annuar, M. S. M., Tan, I. K. P., Ibrahim, S., & Ramachandran, K. B. (2007). Production of

Medium-Chain-Length Poly(3-hydroxyalkanoates) from Crude Fatty Acids Mixture by

Pseudomonas putida. Food and Bioproducts Processing, 85(2), 104-119.

http://doi.org/http://dx.doi.org/10.1205/fbp06017


Ballistreri, A., Giuffrida, M., Guglielmino, S. P. P., Carnazza, S., Ferreri, A., & Impallomeni,

G. (2001). Biosynthesis and structural characterization of medium-chain-length poly(3-

hydroxyalkanoates) produced by Pseudomonas aeruginosa from fatty acids.

International Journal of Biological Macromolecules, 29(2), 107-114.

http://doi.org/10.1016/S0141-8130(01)00154-4

Barbosa, M., Espinosa, A., Malagón, D., & Moreno, N. (2002). Producción de

polihidroxialcanoatos (PHAs) empleando Ralstonia eutropha ATCC 17697.

UNIVERSITAS SCIENTIARUM, 10(1), 45-54.

Bohmert, K., Balbo, I., Steinbuchel, A., Tischendorf, G., & Willmitzer, L. (2002). Constitutive

Expression of the beta -Ketothiolase Gene in Transgenic Plants. A Major Obstacle for

Obtaining Polyhydroxybutyrate-Producing Plants. PLANT PHYSIOLOGY, 128(4),

1282-1290. http://doi.org/10.1104/pp.010615

Bueno, P., Yañez, R., Caparrós, S., & Díaz, M. J. (2009). Evaluating environmental

parameters for minimum ammonium losses during composting of trimming residues.

Journal of the Air & Waste Management Association (1995), 59(7), 790-800.

Recuperado a partir de http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-

69849084894&partnerID=40&md5=2000a2c4b810cda595aced332e57ef0e

Bugnicourt, E. (2014). Polyhydroxyalkanoate (PHA): Review of synthesis, characteristics,

processing and potential applications in packaging. Express Polymer Letters, 8(11),

791-808. http://doi.org/10.3144/expresspolymlett.2014.82

Chee, J.-Y., Lau, N.-S., Samian, M.-R., Tsuge, T., & Sudesh, K. (2012). Expression of

Aeromonas caviae polyhydroxyalkanoate synthase gene in Burkholderia sp. USM

(JCM15050) enables the biosynthesis of SCL-MCL PHA from palm oil products.

Journal of Applied Microbiology, 112(1), 45-54. http://doi.org/10.1111/j.1365-

2672.2011.05189.x

Chee, J.-Y., Tan, Y., Samian, M.-R., & Sudesh, K. (2010). Isolation and Characterization of

a Burkholderia sp. USM (JCM15050) Capable of Producing Polyhydroxyalkanoate

(PHA) from Triglycerides, Fatty Acids and Glycerols. Journal of Polymers and the

Environment, 18(4), 584-592. http://doi.org/10.1007/s10924-010-0204-1

Chen, G.-Q. (2009). A microbial polyhydroxyalkanoates (PHA) based bio- and materials

industry. Chemical Society Reviews, 38(8), 2434. http://doi.org/10.1039/b812677c

Choi, J., & Lee, S. Y. (1997). Process analysis and economic evaluation for Poly(3-

hydroxybutyrate) production by fermentation. Bioprocess Engineering, 17(6), 335-342.

Bibliografía 93

http://doi.org/10.1007/s004490050394

Choi, J., & Lee, S. Y. (1999). Factors affecting the economics of polyhydroxyalkanoate

production by bacterial fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology, 51(1),

13-21. http://doi.org/10.1007/s002530051357

Chung, A.-L., Jin, H.-L., Huang, L.-J., Ye, H.-M., Chen, J.-C., Wu, Q., & Chen, G.-Q. (2011).

Biosynthesis and Characterization of Poly(3-hydroxydodecanoate) by β-Oxidation

Inhibited Mutant of Pseudomonas entomophila L48. Biomacromolecules, 12(10),

3559-3566. http://doi.org/10.1021/bm200770m

da Cruz Pradella, J. G., Ienczak, J. L., Delgado, C. R., & Taciro, M. K. (2012). Carbon

source pulsed feeding to attain high yield and high productivity in poly(3-

hydroxybutyrate) (PHB) production from soybean oil using Cupriavidus necator.

Biotechnology Letters, 34(6), 1003-1007. http://doi.org/10.1007/s10529-012-0863-1

Delgado-Rodríguez, M., Ruiz-Montoya, M., Giraldez, I., Cabeza, I. O., López, R., & Díaz,

M. J. (2010). Effect of control parameters on emitted volatile compounds in municipal

solid waste and pine trimmings composting. Journal of environmental science and

health. Part A, Toxic/hazardous substances & environmental engineering, 45(7), 855-

862. Recuperado a partir de http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-

77954663404&partnerID=40&md5=78ff801abe4a8a0c09f59db961c30155

Dhanasekar, R., Viruthagiri, T., & Sabarathinam, P. L. (2003). Poly(3-hydroxy butyrate)

synthesis from a mutant strain Azotobacter vinelandii utilizing glucose in a batch

reactor. Biochemical Engineering Journal, 16(1), 1-8. http://doi.org/10.1016/S1369-

703X(02)00176-6

Dias, J. M. L., Serafim, L. S., Lemos, P. C., Reis, M. a M., & Oliveira, R. (2005).

Mathematical modelling of a mixed culture cultivation process for the production of

polyhydroxybutyrate. Biotechnology and Bioengineering, 92(2), 209-222.

http://doi.org/10.1002/bit.20598

Doi, Y., & Abe, C. (1990). Biosynthesis and characterization of a new bacterial copolyester

of 3-hydroxyalkanoates and 3-hydroxy-.omega.-chloroalkanoates. Macromolecules,

23(15), 3705-3707. http://doi.org/10.1021/ma00217a027

Doi, Y., Kitamura, S., & Abe, H. (1995). Microbial Synthesis and Characterization of Poly(3-

hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate). Macromolecules, 28(14), 4822-4828.

http://doi.org/10.1021/ma00118a007

Dorado, A. D., Lafuente, F. J., Gabriel, D., & Gamisans, X. (2010). A comparative study


based on physical characteristics of suitable packing materials in biofiltration.

Environmental Technology, 31(2), 193-204.

http://doi.org/10.1080/09593330903426687

Doran, P. M. (1995). Fluid Flow and Mixing. En Bioprocess Engineering Principles (pp. 129-

163). Elsevier. http://doi.org/10.1016/B978-012220855-3/50007-9

Escapa, I. F., García, J. L., Bühler, B., Blank, L. M., & Prieto, M. a. (2012). The

polyhydroxyalkanoate metabolism controls carbon and energy spillage in

Pseudomonas putida. Environmental Microbiology, 14(4), 1049-1063.

http://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2011.02684.x

Eurostat. (2001). Waste management options and climate change. Luxembourg: Office for

Official Publications of the European Communities. Recuperado a partir de

http://ec.europa.eu/environment/waste/studies/pdf/climate_change.pdf

Faccin, D. J. L., Corrêa, M. P., Rech, R., Ayub, M. A. Z., Secchi, A. R., & Cardozo, N. S. M.

(2012). Modeling P(3HB) production by Bacillus megaterium. Journal of Chemical

Technology & Biotechnology, 87(3), 325-333. http://doi.org/10.1002/jctb.2713

Figueroa, C., Rodríguez, D. M., & Diana. (2005). Evaluación de un sistema de fermentación

por lote alimentado para la producción de un biopolímero tipo poli-b-hidroxialcanoato

(PHA) a partir de un aislamiento nativo (Tesis de pregrado). Facultad de Ingenieria.

Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, Bogotá.

Filomena, M., Rodrigues, D. A., Jose, E., & Steinbu, A. (2000). Studies on

polyhydroxyalkanoate ( PHA ) accumulation in a PHA synthase I-negative mutant of

Burkholderia cepacia generated by homogenotization, 193.

Fredrickson, A. G., Megee, R. D., Tsuchiya, H. M., Control, D., & Fermentors, C. (1970).

Mathematical models for fermentation processes. Advances in applied microbiology,

(12), 419–465. http://doi.org/10.1016/S0065-2164(08)70413-1

Fukui, T., & Doi, Y. (1998). Efficient production of polyhydroxyalkanoates from plant oils by

Alcaligenes eutrophus and its recombinant strain. Applied Microbiology and

Biotechnology, 49(3), 333-336. http://doi.org/10.1007/s002530051178

Gahlawat, G., & Srivastava, A. K. (2012). Estimation of fundamental kinetic parameters of

polyhydroxybutyrate fermentation process of azohydromonas australica using

statistical approach of media optimization. Applied Biochemistry and Biotechnology,

168(5), 1051-1064. http://doi.org/10.1007/s12010-012-9840-3

Gahlawat, G., & Srivastava, A. K. (2013). Development of a mathematical model for the

Bibliografía 95

growth associated Polyhydroxybutyrate fermentation by Azohydromonas australica

and its use for the design of fed-batch cultivation strategies. Bioresource technology,

137(0), 98-105. http://doi.org/10.1016/j.biortech.2013.03.023

Garzón, J. M., & Moreno, A. A. (2005). Evaluación del coeficiente volumétrico de

transferencia de oxígeno kla como criterio de escalamiento en la producción de un

biopolímero tipo poli-β-hidroxialcanoato (PHAs) con cepas nativas (Trabajo de

pregrado). Facultad de ingenieria. Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá,

Bogotá.

Gumel, A. M., Annuar, M. S. M., & Heidelberg, T. (2012). Biosynthesis and Characterization

of Polyhydroxyalkanoates Copolymers Produced by Pseudomonas putida Bet001

Isolated from Palm Oil Mill Effluent. PLoS ONE, 7(9), e45214.

http://doi.org/10.1371/journal.pone.0045214

Harder, A., & Roels, J. (1982). Microbes and Engineering Aspects. Microbes and

Engineering Aspects (Vol. 21). Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg.

http://doi.org/10.1007/3-540-11019-4

Heinzle, E., & Lafferty, R. M. (1980). A Kinetic Model for Growth and Synthesis of Poly-/3-

Hydroxybutyric Acid (PHB) in Alcaligenes eutrophus H 16. Applied Microbiology and

Biotechnology, 11, 8-16. http://doi.org/10.1007/BF00514072

Hill, A. V. (1910). The heat produced in contracture and muscular tone. The Journal of

physiology, 40(5), 389-403. http://doi.org/10.1113/jphysiol.1910.sp001377

Horvat, P., Vrana Špoljarić, I., Lopar, M., Atlić, A., Koller, M., & Braunegg, G. (2013).

Mathematical modelling and process optimization of a continuous 5-stage bioreactor

cascade for production of poly[-(R)-3-hydroxybutyrate] by Cupriavidus necator.

Bioprocess and Biosystems Engineering, 36(9), 1235-1250.

http://doi.org/10.1007/s00449-012-0852-8

Jie, M. S. F. L. K., Harwood, J. L., & Gunstone, F. D. (2007). Synthesis. En The Lipid

Handbook with CD-ROM, Third Edition (pp. 355-414). CRC Press.

http://doi.org/10.1201/9781420009675.ch5

Johnson, K., Kleerebezem, R., & van Loosdrecht, M. C. M. (2009). Model-based data

evaluation of polyhydroxybutyrate producing mixed microbial cultures in aerobic

sequencing batch and fed-batch reactors. Biotechnology and Bioengineering, 104(1),

50-67. http://doi.org/10.1002/bit.22380

Kahar, P., Tsuge, T., Taguchi, K., & Doi, Y. (2004). High yield production of


polyhydroxyalkanoates from soybean oil by Ralstonia eutropha and its recombinant

strain. Polymer Degradation and Stability, 83(1), 79-86.

http://doi.org/http://dx.doi.org/10.1016/S0141-3910(03)00227-1

Kaur, G., Srivastava, A. K., & Chand, S. (2012). Mathematical modelling approach for

concentration and productivity enhancement of 1,3-propanediol using Clostridium

diolis. Biochemical Engineering Journal, 68, 34-41.

http://doi.org/10.1016/j.bej.2012.07.004

Keenan, T. M., Tanenbaum, S. W., Stipanovic, A. J., & Nakas, J. P. (2004). Production and

Characterization of Poly-β-hydroxyalkanoate Copolymers from Burkholderia cepacia

Utilizing Xylose and Levulinic Acid. Biotechnology Progress, 20(6), 1697-1704.

http://doi.org/10.1021/bp049873d

Keshavarz, T., & Roy, I. (2010). Polyhydroxyalkanoates: bioplastics with a green agenda.

Current Opinion in Microbiology, 13(3), 321-326.

http://doi.org/10.1016/j.mib.2010.02.006

Khanna, S., & Srivastava, A. K. (2005). Statistical media optimization studies for growth

and PHB production by Ralstonia eutropha. Process Biochemistry, 40(6), 2173-2182.

http://doi.org/10.1016/j.procbio.2004.08.011

Khanna, S., & Srivastava, A. K. (2006a). Computer simulated fed-batch cultivation for over

production of PHB: A comparison of simultaneous and alternate feeding of carbon and

nitrogen. Biochemical Engineering Journal, 27(3), 197-203.

http://doi.org/10.1016/j.bej.2005.08.006

Khanna, S., & Srivastava, A. K. (2006b). Optimization of nutrient feed concentration and

addition time for production of poly(β-hydroxybutyrate). Enzyme and Microbial

Technology, 39(5), 1145-1151. http://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2006.02.023

Khanna, S., & Srivastava, A. K. (2008). A Simple Structured Mathematical Model for

Biopolymer (PHB) Production. Biotechnology Progress, 21(3), 830-838.

http://doi.org/10.1021/bp0495769

Koller, M., Niebelschütz, H., & Braunegg, G. (2013). Strategies for recovery and purification

of poly[(R)-3-hydroxyalkanoates] (PHA) biopolyesters from surrounding biomass.

Engineering in Life Sciences, 13(6), 549-562. http://doi.org/10.1002/elsc.201300021

Lai, S.-Y., Kuo, P.-C., Wu, W., Jang, M.-F., & Chou, Y.-S. (2013). Biopolymer production in

a fed-batch reactor using optimal feeding strategies. Journal of Chemical Technology

& Biotechnology, 88(11), n/a-n/a. http://doi.org/10.1002/jctb.4067

Bibliografía 97

Lee, S. B., Seressiotis, A., & Bailey, J. E. (1985). A kinetic model for product formation in

unstable recombinant populations. Biotechnology and Bioengineering, 27(12), 1699-

1709. http://doi.org/10.1002/bit.260271211

Lee, S. Y. (1996). Plastic bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate

production in bacteria. Trends in Biotechnology, 14(11), 431-438.

http://doi.org/10.1016/0167-7799(96)10061-5

Lee, S. Y. (2000). Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotechnology and Bioengineering,

49(1), 1-14. http://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0290(19960105)49:1<1::AID-

BIT1>3.0.CO;2-P

Lee, S. Y., Choi, J., & Wong, H. H. (1999). Recent advances in polyhydroxyalkanoate

production by bacterial fermentation: mini-review. International Journal of Biological

Macromolecules, 25(1-3), 31-36. http://doi.org/10.1016/S0141-8130(99)00012-4

Liew, E. W.-T., Nandong, J., & Samyudia, Y. (2013). Multi-scale models for the optimization

of batch bioreactors. Chemical Engineering Science, 95, 257-266.

http://doi.org/10.1016/j.ces.2013.03.036

Lim, H. C., & Shin, H. S. (2013). Fed-Batch Cultures. Fed-Batch Cultures: Principles and

Applications of Semi-Batch Bioreactors. Cambridge: Cambridge University Press.

http://doi.org/10.1017/CBO9781139018777

Liu, Q., Luo, G., Zhou, X. R., & Chen, G.-Q. (2011). Biosynthesis of poly(3-

hydroxydecanoate) and 3-hydroxydodecanoate dominating polyhydroxyalkanoates by

β-oxidation pathway inhibited Pseudomonas putida. Metabolic Engineering, 13(1), 11-

17. http://doi.org/10.1016/j.ymben.2010.10.004

Liu, S. (2013). Parametric Estimation. En Bioprocess Engineering (pp. 281-322). Elsevier.

http://doi.org/10.1016/B978-0-444-59525-6.00007-X

López-Cuellar, M. R., Alba-Flores, J., Rodríguez, J. N. G., & Pérez-Guevara, F. (2011).

Production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) with canola oil as carbon source.

International Journal of Biological Macromolecules, 48(1), 74-80.

http://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2010.09.016

Luong, J. H. T. (1985). Kinetics of ethanol inhibition in alcohol fermentation. Biotechnology

and Bioengineering, 27(3), 280-285. http://doi.org/10.1002/bit.260270311

Luong, J. H. T. (1987). Generalization of monod kinetics for analysis of growth data with

substrate inhibition. Biotechnology and Bioengineering, 29(2), 242-248.

http://doi.org/10.1002/bit.260290215


Luong, J. H. T., Mulchandani, A., & Leduy, A. (1988). Kinetics of biopolymer synthesis: A

revisit. Enzyme and Microbial Technology, 10(6), 326-332.

http://doi.org/10.1016/0141-0229(88)90010-5

Mankad, T., & Bungay, H. R. (1988). Model for microbial growth with more than one limiting

nutrient. Journal of Biotechnology, 7(2), 161-166. http://doi.org/10.1016/0168-

1656(88)90062-4

Megee III, R. D., Drake, J. F., Fredrickson, A. G., & Tsuchiya, H. M. (1972). Studies in

intermicrobial symbiosis. Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus casei.

Canadian Journal of Microbiology, 18(11), 1733-1742. http://doi.org/10.1139/m72-269

Moreno, L., & Serrato, M. (2004). Biosíntesis de polímeros biodegradables del tipo poli-b-

hidroxialcanoatos (PHAs) a partir de cepas nativas (Tesis de maestría). Universidad

Nacional de Colombia sede Bogotá.

Moreno, N., Revelo, D., Aristizabal, F. A., Montoya, D., Espinoza, A., Gutierrez, I., …

Suárez, D. (2004). Aislamiento y caracterización de microorganismos con alta

capacidad de almacenamiento de poliésteres tipo polihidroxialcanoatos (PHAs).

(Tesis de pregrado). Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, Bogotá.

Moser, A. (1985). Kinetics of batch fermentations. En Biotechnology (H.J. Rehm, pp. 243-

283). Weinheim.

Mozumder, M. S. I., Goormachtigh, L., Garcia-Gonzalez, L., De Wever, H., & Volcke, E. I.

P. (2014). Modeling pure culture heterotrophic production of polyhydroxybutyrate

(PHB). Bioresource Technology, 155, 272-280.

http://doi.org/10.1016/j.biortech.2013.12.103

Mulchandani, A., Luong, J. H. T., & Groom, C. (1989). Substrate inhibition kinetics for

microbial growth and synthesis of poly-?-hydroxybutyric acid by Alcaligenes eutrophus

ATCC 17697. Applied Microbiology and Biotechnology, 30(1), 11-17.

http://doi.org/10.1007/BF00255990

Murray, J., & King, D. (2012). Climate policy: Oil’s tipping point has passed. Nature,

481(7382), 433-435. http://doi.org/10.1038/481433a

Nash, J. E., & Sutcliffe, J. V. (1970). River flow forecasting through conceptual models part

I — A discussion of principles. Journal of Hydrology, 10(3), 282-290.

http://doi.org/10.1016/0022-1694(70)90255-6

Nicolò, M. S., Franco, D., Camarda, V., Gullace, R., Rizzo, M. G., Fragalà, M., …

Guglielmino, S. P. P. (2014). Integrated microbial process for bioconversion of crude

Bibliografía 99

glycerol from biodiesel into biosurfactants and phas. Chemical Engineering

Transactions, 38, 187-192. http://doi.org/10.3303/CET1438032

Nielsen, J., Emborg, C., Halberg, K., & Villadsen, J. (1989). Compartment model concept

used in the design of fermentation with recombinant microorganisms. Biotechnology

and Bioengineering, 34(4), 478-486. http://doi.org/10.1002/bit.260340407

Nonato, R., Mantelatto, P., & Rossell, C. (2001). Integrated production of biodegradable

plastic, sugar and ethanol. Applied Microbiology and Biotechnology, 57(1-2), 1-5.

http://doi.org/10.1007/s002530100732

Novak, M. (2015). Mathematical Modelling as a Tool for Optimized PHA Production.

Chemical and Biochemical Engineering Quarterly, 29(2), 183-220.

http://doi.org/10.15255/CABEQ.2014.2101

Obruca, S., Benesova, P., Petrik, S., Oborna, J., Prikryl, R., & Marova, I. (2014). Production

of polyhydroxyalkanoates using hydrolysate of spent coffee grounds. Process

Biochemistry, 49(9), 1409-1414. http://doi.org/10.1016/j.procbio.2014.05.013

Obruca, S., Petrik, S., Benesova, P., Svoboda, Z., Eremka, L., & Marova, I. (2014).

Utilization of oil extracted from spent coffee grounds for sustainable production of

polyhydroxyalkanoates. Applied Microbiology and Biotechnology, 98(13), 5883-5890.

http://doi.org/10.1007/s00253-014-5653-3

OECD. (2013). POLICIES FOR BIOPLASTICS IN THE CONTEXT OF A BIOECONOMY.

France: Organisation for Economic Co-operation and Development. Recuperado a

partir de

http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?cote=DSTI/STP/B

IO(2013)6/FINAL&docLanguage=En

Pan, W., Perrotta, J. A., Stipanovic, A. J., Nomura, C. T., & Nakas, J. P. (2012). Production

of polyhydroxyalkanoates by Burkholderia cepacia ATCC 17759 using a detoxified

sugar maple hemicellulosic hydrolysate. Journal of Industrial Microbiology &

Biotechnology, 39(3), 459-469. http://doi.org/10.1007/s10295-011-1040-6

Patnaik, P. R. (2005). Perspectives in the Modeling and Optimization of PHB Production by

Pure and Mixed Cultures. Critical Reviews in Biotechnology, 25(3), 153-171.

http://doi.org/10.1080/07388550500301438

Patnaik, P. R. (2006). Dispersion optimization to enhance PHB production in fed-batch

cultures of Ralstonia eutropha. Bioresource Technology, 97(16), 1994-2001.


10

0

Modelamiento matemático y optimización del proceso de producción de PHAs empleando B. cepacia B27 a partir de ácidos grasos.

Patniak, P. R. (2009). Genetic Algorithmic Optimization of PHB Production by a Mixed

Culture in an Optimally Dispersed Fed-batch Bioreactor. Bioautomation, 13(3), 27-46.

Patniak, P. R., & Patnaik, P. R. (2009). Genetic Algorithmic Optimization of PHB Production

by a Mixed Culture in an Optimally Dispersed Fed Batch Reactor. Bioautomation,

13(3), 27-46. Recuperado a partir de

http://www.clbme.bas.bg/bioautomation/2009/vol_13.3/files/13.3_2.2.pdf

Patwardhan, P. R., & Srivastava, A. K. (2004). Model-based fed-batch cultivation of R.

eutropha for enhanced biopolymer production. Biochemical Engineering Journal,

20(1), 21-28. http://doi.org/10.1016/j.bej.2004.04.001

Patwardhan, P., & Srivastava, A. K. (2008). Fed-batch cultivation of Wautersia eutropha.

Bioresource Technology, 99(6), 1787-1792.


PlasticEurope. (2015). Plastics – the Facts 2015 An analysis of European plastics

production, demand and waste data. Recuperado a partir de

http://www.plasticseurope.org/documents/document/20121120170458-

final_plasticsthefacts_nov2012_en_web_resolution.pdf

Qi, Q., Steinbüchel, A., & Rehm, B. H. . (1998). Metabolic routing towards

polyhydroxyalkanoic acid synthesis in recombinant Escherichia coli (fadR): inhibition

of fatty acid beta-oxidation by acrylic acid. FEMS microbiology letters, 167(1), 89-94.

http://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1998.tb13212.x

Raje, P., & Srivastava, A. K. (1998). Updated mathematical model and fed-batch strategies

for poly-β-Hydroxybutyrate (PHB) production by Alcaligenes eutrophus. Bioresource

Technology, 64(3), 185-192. http://doi.org/10.1016/S0960-8524(97)00173-9

Rehm, B. H. A., & Steinbüchel, A. (2005). Polyhydroxyalkanoate (PHA) Synthases: The

Key Enzymes of PHA Synthesis. En Y. Doi & A. Steinbüchel (Eds.), Biopolymers

Online. Weinheim, Germany: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.

http://doi.org/10.1002/3527600035.bpol3a06

Revelo, D. (2005). Diseño de iniciadores y validación de una metodología molecular para

la selección de bacterias de diferentes géneros acumuladoras de

polihidroxialcanoatos (PHAs). (Tesis de Maestría). Universidad Nacional de Colombia

sede Bogotá.

Rodríguez-Contreras, A., Koller, M., Miranda-de Sousa Dias, M., Calafell-Monfort, M.,

Braunegg, G., & Marqués-Calvo, M. S. (2013). High production of poly(3-

Bibliografía 101

hydroxybutyrate) from a wild Bacillus megaterium Bolivian strain. Journal of Applied

Microbiology, 114(5), 1378-1387. http://doi.org/10.1111/jam.12151

Shahhosseini, S. (2004). Simulation and optimisation of PHB production in fed-batch

culture of Ralstonia eutropha. Process Biochemistry, 39(8), 963-969.


Shang, L., Fan, D. Di, Kim, M. Il, Choi, J. D. R., & Chang, H. N. (2007). Modeling of poly(3-

hydroxybutyrate) production by high cell density fed-batch culture of Ralstonia

eutropha. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 12(4), 417-423.

http://doi.org/10.1007/BF02931065

Shuler, M., & Kargi, F. (1992). Bioprocess engineering: basic concepts. Prentice Hall.

Somleva, M. N., Peoples, O. P., & Snell, K. D. (2013). PHA Bioplastics, Biochemicals, and

Energy from Crops. Plant Biotechnology Journal, 11(2), 233-252.

http://doi.org/10.1111/pbi.12039

Strehaiano, P., Mota, M., & Goma, G. (1983). Effects of inoculum level on kinetics of

alcoholic fermentation. Biotechnology Letters, 5(2), 135-140.

http://doi.org/10.1007/BF00132173

Suárez, J. C. (1997). Biosíntesis y caracterización de polímeros biodegradables PHAs (poli

–β-hidroxialcanoatos), mediante bacterias del género Pseudomonas. (Tesis de

pregrado). Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, Bogotá.

Sudesh, K. (2013). Introduction. En Polyhydroxyalkanoates from Palm Oil: Biodegradable

Plastics (pp. 1-2). Springer Berlin Heidelberg. http://doi.org/10.1007/978-3-642-

33539-6_1

Sudesh, K. (2013). Polyhydroxyalkanoates from Palm Oil: Biodegradable Plastics.

(Springer, Ed.) SpringerBriefs in Microbiology.

Sudesh, K., Abe, H., & Doi, Y. (2000). Synthesis, structure and properties of

polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Progress in Polymer Science, 25(10),

1503-1555. http://doi.org/10.1016/S0079-6700(00)00035-6

Suzuki, T., Yamane, T., & Shimizu, S. (1986a). Kinetics and effect of nitrogen source

feeding on production of poly-?-hydroxybutyric acid by fed-batch culture. Applied

Microbiology and Biotechnology, 24(5), 366-369. http://doi.org/10.1007/BF00294591

Suzuki, T., Yamane, T., & Shimizu, S. (1986b). Mass production of poly-β-hydroxybutyric

acid by fully automatic fed-batch culture of methylotroph. Applied Microbiology and

Biotechnology, 23, 322-329. http://doi.org/10.1007/BF00294591

10

2


Tohyama, M., Patarinska, T., Qiang, Z., & Shimizu, K. (2002). Modeling of the mixed culture

and periodic control for PHB production, 10, 157-173.

Tsuchiya, H. M., Fredrickson, a. G., & Aris, R. (1966). Dynamics of Microbial Cell

Populations. Advances in Chemical Engineering, 6, 125-206.

http://doi.org/10.1016/S0065-2377(08)60275-6

Verhulst, P. F. (1838). Notice sur la loi que la population suit dans son accroissement. Curr.

Math. Phys, 10, 113+. Recuperado a partir de

http://www.scopus.com/record/display.url?eid=2-s2.0-

79955971037&origin=inward&txGid=zA1wRQNr3-qw0mse7ttLxJX%3a4

Verlinden, R. A. J., Hill, D. J., Kenward, M. A., Williams, C. D., & Radecka, I. (2007).

Bacterial synthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoates. Journal of Applied

Microbiology, 102(6), 1437-1449. http://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03335.x

Wang, J., Yue, Z.-B., Sheng, G.-P., & Yu, H.-Q. (2010). Kinetic analysis on the production

of polyhydroxyalkanoates from volatile fatty acids by Cupriavidus necator with a

consideration of substrate inhibition, cell growth, maintenance, and product formation.

Biochemical Engineering Journal, 49(3), 422-428.

http://doi.org/http://dx.doi.org/10.1016/j.bej.2010.02.005

Wang, Y., & Liu, S. (2014). Production of (R)-3-hydroxybutyric acid by Burkholderia cepacia

from wood extract hydrolysates. AMB Express, 4(1), 28.

http://doi.org/10.1186/s13568-014-0028-9

Wang, Y., Yin, J., & Chen, G. Q. (2014). Polyhydroxyalkanoates, challenges and

opportunities. Current Opinion in Biotechnology, 30, 59-65.

http://doi.org/10.1016/j.copbio.2014.06.001

Williams, F. M. (1967). A model of cell growth dynamics. Journal of theoretical biology, 15,

190-207.

Yang, J., Huang, J., & Ni, J. (2006). Mathematical modeling of the batch fermentation of

Zoogloea sp. GY3 used for synthesizing polyhydroxyalkanoates. Journal of Chemical

Technology & Biotechnology, 81(5), 789-793. http://doi.org/10.1002/jctb.1447

Yu, J., Si, Y., Keung, W., & Wong, R. (2002). Kinetics modeling of inhibition and utilization

of mixed volatile fatty acids in the formation of polyhydroxyalkanoates by Ralstonia

eutropha. Process Biochemistry, 37(7), 731-738.


Bibliografía 103

A. Anexo: Preparación medios de cultivo

Reactivos

Componentes Cantidad Unidades

KH2PO4 2.65 g/L

Na2HPO4 3.39 g/L

(NH4)2SO4 2.8 g/L

MgSO4 0.3 g/L

Tween 80 0.25 mL/g Aceite

Micronutrientes 2 mL/L

Fuente de carbono 20 g/L

Anti espumante 1.5 mL/mL Tween80

Elementos traza micronutrientes g/L

FeSO4 2

CaCl2 2

CoCl2 * 6H2O 0.2

CuCl2 * 2H2O 0.01

NiCl3 * 6H2O 0.2

MnCl2 * 4H2O 0.03

ZnSO4 * 7H2O 0.1

H3BO3 0.3

NaMoO4* 2H2O 0.03

Procedimiento preparación medio de cultivo

1. En un recipiente se adicionan los componentes KH2PO4, Na2HPO4, (NH4)2SO4, y

MgSO4.

2. Se diluyen en agua destilada con agitación y se adiciona al mismo tiempo los

micronutrientes.

3. Diluida las sales se ajusta el pH del medio con NaOH.

4. Se adiciona el aceite vegetal, tween 80, el antiespumante y se homogeniza la

mezcla; luego se transvasa al reactor o Erlenmeyers.

5. Se esteriliza el medio durante 30 min a 121 ºC

10

4


Procedimiento preparación micronutrientes

1. Preparar una solución de concentración 1 N de HCl.

2. Adicionar los micronutrientes en un recipiente a las concentraciones establecidas y

agregar la solución de HCl 1N para que la solución de micronutrientes quede con

una concentración de 0.2 %(v/v) con respecto al HCl

3. Agitar y conservar a 3 ºC frio.

B. Anexo: Protocolos experimentales

B-1. Preparación de stock de trabajo

Reactivos

- NaCl

- Extracto de levadura

- Triptosa.

- Glicerol

Materiales

- Erlenmeyer de 2000 mL

- Crioviales de 2 mL, estériles

- Micropipeta 1000 mL

- Puntas micropipeta estéril

- Tubos tipo Falcon estériles

Medio de cultivo

Compuesto Concentración (g/l)

NaCl 10

Triptosa 10

Extracto de levadura 5

Procedimiento

1. Preparación del LB: se utilizó un Erlenmeyer de 2000 mL se mezcla la triptosa,

cloruro de sodio y el extracto de levadura, posteriormente llevar el aforo a 1000 mL.

2. Se llevó el LB a esterilización

3. Se inoculó 0,5 mL de la cepa B27 original.

4. Se dejó en agitación 200 rpm y a 32 °C durante 48 horas.

5. Se tomaron muestras periódicas para análisis de pureza, en agar nutritivo.

10

6


6. Se cuantifica la cantidad de biomasa en Falcon y se mezcla 1:1 el LB con biomasa

y glicerol.

7. Se agitó con vortex la mezcla resultante en cada Falcon y se adiciono 1 mL por

cada criovial.

B-2. Determinación de la concentración de biomasa

Reactivos

- Muestra del caldo de fermentación

- agua destilada estéril

Materiales

- Tubos Falcon de 15 mL

Procedimiento

1. Pesar tubos Falcon en balanza analítica

2. Tomar 5 mL de muestra del caldo de fermentación en los tubos Falcon.

3. Centrifugar a 9000 g durante 10 minutos.

4. Descartar el sobrenadante

5. Adicionar al pellet 5 mL de agua destilada y resuspender la biomasa con ayuda de

vortex.

6. Centrifugar a 9000 g por 10 min.

7. Descartar sobrenadante.

8. Reconstituir la biomasa con 5 mL de agua destilada.



11. Secar a 75 ºC durante 24 horas

12. Pesar el tubo Falcon con el pellet seco, cuantificar.

Nota 1: Si se observa que el medio de cultivo en el proceso de centrifugación el medio no

tiende a dejar un sobrenadante claro, se recomienda diluir el medio de cultivo con agua

destilada antes del primer centrifugado, para facilitar la precipitación de la biomasa. Si se

necesita determinar también la concentración de sustratos remanentes en el medio de

B. Anexo: Protocolos experimentales 107

cultivo tales como amonio, se debe conservar el sobrenadante que resulta de la primera

centrifugación.

B-3. Determinación de la concentración de polímero PHA

Reactivos

- Muestra del caldo de fermentación

- agua destilada estéril

- SDS (detergente) al 20%

Materiales

- Tubos Falcon de 15 mL

Procedimiento

13. Pesar tubos Falcon en balanza analítica

14. Tomar 5 mL de muestra del caldo de fermentación en los tubos Falcon.

15. Centrifugar a 9000 g durante 10 minutos.

16. Descartar el sobrenadante

17. Adicionar al pellet 5 mL de agua destilada y resuspender la biomasa con ayuda de

vortex.






23. Con el peso calculado de biomasa del anexo B, se determina la cantidad de SDS

aplicado al tubo de Falcon para el proceso de extracción y separación de biomasa.

24. Se adicionan 0.55 (% v/p biomasa)

25. Se agita en vortex con 2 ml de agua destilada.

26. Se lleva a proceso de digestión en baño termostatado a 90 ºC durante 1 hora.



29. Reconstituir el pellet con 5 mL de agua destilada.

10

8







35. Secar a 75 ºC durante 24 horas

36. Pesar el tubo Falcon con el pellet seco, cuantificar.

Nota 1: Si se observa el medio de cultivo muy espeso, se recomienda diluir el medio de

cultivo con agua destilada antes del primer centrifugado, para facilitar la precipitación de la

biomasa. Si se necesita determinar también la concentración de sustratos remanentes en

el medio de cultivo tales como amonio, se debe conservar el sobrenadante que resulta de

la primera centrifugación.

B-4. Determinación de amonio mediante la técnica de berthelot y curva

de calibración

Preparación de soluciones

- Solución de fenol 11.1% (11.1 g de fenol/ 100 mL de etanol al 95 %).

- Solución de nitroprusiato (0.5 g de nitroprusiato/100 mL agua destilada y almacenar

en botella ambar).

- Citrato alcalino (adicionar 200 g citrato trisodico + 10 g de hidróxido de sodio en

700 mL de agua destilada y aforar a 1000 mL).

- Hipoclorito de sodio, solución comercial al 5.25 %.

- Solución oxidante (10 mL de citrato alcalino + 2.5 mL de hipoclorito de sodio

comercial 5.25 % que se debe preparar justo antes de adicionar; no se debe

almacenar).

- Solución madre se Sulfato de amonio 10 mg/L (en agua destilada)


Procedimiento

1. Tomar un volumen de 100 μl del sobrenadante obtenido a partir de la

centrifugación y diluirlo en 4900 μl de agua destilada en un tubo de ensayo.

Atención: con esto se logra una dilución 1:50 que puede ser insuficiente en

ciertos casos, ver la nota aclaratoria al final del protocolo para determinar la

mejor dilución.

2. Adicionar al tubo anterior a 200 μl de fenol, 200 μl de nitroprusiato y 500 μl de

solución oxidante.

3. Agitar los tubos e incubar a temperatura ambiente por una hora en un lugar

iluminado. Se debe desarrollar un color azul aguamarina cuya intensidad será

proporcional a la concentración de amonio en la muestra.

4. Leer a 640 nm.

Preparación del blanco

Es la solución contra la cual se comparan las muestras, se adicionan 5000 μl de agua

destilada a un tubo de ensayo y se continua desde el paso 2. El blanco se debe preparar

al tiempo con las muestras para evitar errores experimentales adicionales.

Advertencia: El fenol penetra la piel rápidamente, en particular cuando está líquido,

causando lesiones severas que pueden ser fatales. Es corrosivo sobre los tejidos

corporales, causando severas quemaduras químicas y debido a sus propiedades de

anestésico local, las quemaduras cutáneas pueden ser indoloras. Usar siempre guantes y

gafas para su manipulación y trabajar en un lugar con buena ventilación.

Curva de calibración

Para la elaboración de la curva de calibración se prepara una solución madre de sulfato

de amonio de 10 mg/L a partir de la cual se preparan en tubos de ensayo las soluciones

descritas en la siguiente tabla:

Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

0


Solución madre de

sulfato de amonio (

mL)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2

Agua destilada (mL) 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4 3.8 3.6 3.4 3.2 3

Volumen final (mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Concentración

(mg/L) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6 4

Una vez se tienen las soluciones anteriores en los tubos de ensayo, se continua

con el procedimiento desde el paso 2 y se grafica la absorbancia contra la

concentración de cada muestra. Se hace la regresión lineal correspondiente y se

obtiene así la ecuación de absorbancia (y) en términos de la concentración (x).

Cada vez que se preparen los reactivos hay que elaborar una nueva curva de calibración.

La ecuación despejada para la curva obtenida con los reactivos actuales es:

Concentración (NH4)2SO4 (mg/L) = ((Absorbancia /0.0073) + 0.0217)*Factor de dilución

Nota 1: El límite de detección de la técnica aquí descrita es 4 mg/l, por lo tanto, debe

procurarse que la concentración de la muestra a leer se encuentre por debajo de este valor,

y = 0,2178x - 0,0073R² = 0,9955

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 1 2 3 4 5

Ab

s (6

40

nm

)

Concentracion sulfato de amonio (mg/l)

Curva de calibracion amonio

Series1

Lineal (Series1)


de lo contrario será necesario hacer una dilución. Dada la sensibilidad de la técnica, las

diluciones que se deben realizar son muy altas por lo que es necesario emplear

micropipetas calibradas que permitan tomar los volúmenes correctos. Adicionalmente, es

importante tener en cuenta que la cantidad de reactivos empleada fue establecida para un

volumen de muestra de 5 mL, por lo tanto, sea cual sea la dilución que se haga del

sobrenadante se debe obtener un volumen final de 5 mL o de lo contrario ajustar los

volúmenes requeridos de los reactivos y validarlos determinando la concentración de una

muestra patrón cuya cantidad de sulfato de amonio es conocida. Ejemplo: Se sabe que la

concentración inicial de sulfato de amonio en el medio de cultivo es de 1 g/l, por lo tanto,

es necesario diluirla por lo menos 250 veces para tener una muestra cuya concentración

será aproximadamente 4mg/l. Se debe entonces tomar 0.2 mL del sobrenadante y

adicionar 4.8 mL de agua destilada para completar un volumen de 5 mL y continuar con el

procedimiento desde el paso 4. Cabe resaltar, que se elaboró la curva de calibración en

cada semana en la que se cuantificaban nuevas muestras.

B-5. Tinción de Gram

Reactivos

- Solución Violeta de Gram.

- Solución de Lugol.

- Solución Alcohol–acetona, 50-50.

- Solución Safranina o fucsina de Gram.

- Solución salina NaCl (0.8%).

Procedimiento

Preparación de la muestra:

1. En una lámina porta-objeto limpia y desengrasada, se adiciona con ayuda del asa

microbiológica redonda, una gota del medio de cultivo; se esparce sobre la lámina

porta-objeto y se seca flameando con el mechero.

11

2


2. Luego que la muestra se encuentre completamente seca, se adicionan los reactivos

mostrados en la siguiente tabla, respetando el orden y los tiempos establecidos:

Procedimiento para la tinción de gram

Reactivo Tiempo (s) Solución Violeta de Gram 60 Lavar con agua Solución Lugol. 60 Lavar con agua Solución alcohol-acetona 15 Lavar con agua Solución Safranina 60 Lavar con agua y dejar secar al ambiente

C. Anexo: Datos de cinéticas microbianas

C-1. Escala matraz

1. Resultados a escala matraz: evaluación del comportamiento de la velocidad

especifica de crecimiento en diferentes concentraciones de aceite vegetal.

Concentraciones para ensayo de inhibición con aceite vegetal y concentración

de sulfato de amonio constante (2.8 g/L) 200 rpm a 32 ºC

Concentración de aceite vegetal (g/L)

30 60 70 80 100 130 140 160 170

Tiempo (h) Biomasa (g/L)

0 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

6 3.0 1.2 1.4 4.0 1.7 4.3 4.4 3.5 2.2

12 5.2 4.1 1.9 3.9 4.5 6.6 4.8 3.2 1.8

24 10.0 8.1 9.3 16.8 8.1 11.6 8.5 3.6 2.0

30 12.8 11.5 10.1 9.5 10.0 12.4 10.8 3.9 2.5

Concentraciones para ensayo de limitación con aceite vegetal y concentración

de sulfato de amonio constante (2.8 g/L) 200 rpm a 32 ºC

Concentración de aceite vegetal (g/L)

0.5 2 4 8 12 14 16 20


0 1.20 1.20 1.20 1.20 1.20 1.20 1.20 1.20

6 1.63 3.10 2.23 4.07 0.85 2.70 6.50 3.60

12 2.60 2.70 5.60 3.70 2.53 4.75 5.85 6.20

24 3.40 7.37 7.33 8.50 7.20 8.60 9.95 8.40

11

4


30 4.17 8.97 9.45 10.05 9.07 11.07 11.70 10.93

2. Resultados a escala matraz: evaluación del comportamiento de la velocidad

especifica de crecimiento en diferentes concentraciones de sulfato de amonio.

Concentraciones para ensayo de inhibición con sulfato de amonio y

concentración de aceite vegetal constante (20 g/L) 200 rpm a 32 ºC.

Concentración sulfato de amonio(g/L)

3.2 6.2 8 10


0 3.2 3.2 3.2 3.2

6 6.7 10.2 11 19.96

12 10.6 10.8 11.2 12.5

24 9.9 12.16 10.8 6.5

30 15.93 12.43 11.8 7.23

Concentraciones para ensayo de limitación con sulfato de amonio y

concentración de aceite vegetal constante (20 g/L) 200 rpm a 32 ºC.

Concentración sulfato de amonio (g/L)

0.2 0.4 0.8 1 1.4 1.8 2.3 2.8


0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

6 2.73 3.73 2.4 2.1 3.43 4.13 4.1 3.33

12 5.4 3.1 6.3 4.13 4.36 3.15 5.15 6.4

24 9.4 10.26 8.7 7.5 9.86 9.95 11.3 11.15

30 11.06 9.7 11.5 8.56 11.45 11.2 11.56 11.83

C. Anexo: Datos de cinéticas microbianas 115

3. Resultados a escala matraz: velocidades específicas de crecimiento obtenidas de

las pendientes de la curva de generación de biomasa a escala matraz.

Datos de inhibición de velocidad especifica de crecimiento con aceite vegetal.

Concentración inicial (g/L) µ (h-1)

30 0.0593

60 0.057

70 0.061

80 0.049

100 0.0449

130 0.0443

140 0.0376

160 0.0056

170 0

Datos de inhibición de velocidad especifica de crecimiento con sulfato de

amonio.


2.8 0.051

3.2 0.0433

6.2 0.0344

8 0.0301

10 0.0014

Datos de limitación de velocidad especifica de crecimiento con aceite vegetal.


0.5 0.04

2 0.065

4 0.065

8 0.065

12 0.069

14 0.072

16 0.071

20 0.067

11

6


Datos de limitación de velocidad especifica de crecimiento con aceite vegetal.


0.2 0.0407

0.4 0.0518

0.8 0.051

1 0.053

1.4 0.0538

1.8 0.0524

2.3 0.0476

2.8 0.0515

0.2 0.0407

C-2. Escala Biorreactor 7 L

A continuación, se recopilan los datos recolectados experimentalmente de los ensayos a

escala biorreactor de 7 L con volumen de trabajo de 5 L 240 rpm, 2 vvm y 32 ºC, para la

construcción del modelo.

Condiciones (concentraciones óptimas de sustratos limitantes)

Ensayo 1


- Aceite vegetal: 20 g/L

- Sulfato de amonio: 2.8 g/L

- Relación C/N: 28.81

t(h) X (g/L) P (g/L) Sc (g/L) Sn (g/L)

0 1.46 0.22 20.00 2.29

6 1.83 0.58 19.56 1.74

11 3.19 1.47 17.94 1.64

23 5.70 4.34 14.94 1.23

30 7.17 6.02 13.19 0.60

35 11.23 8.68 8.34 0.42

47 13.54 13.08 5.59 0.29

53 15.91 14.88 2.75 0.30

59 15.08 14.19 3.74 0.29

71 15.09 14.32 3.73 0.27

77 15.40 13.20 3.36 0.38

Ensayo 2





0 0.12 0.58 20.00 2.90

5 1.13 0.82 18.80 2.67

19 4.60 2.35 14.65 1.54

24 4.79 2.45 14.43 0.90

29 5.49 3.47 13.59 0.61

43 11.43 7.37 6.51 0.37

48 12.37 4.97 5.39 0.09

53 13.28 5.05 4.30 0.20

67 14.86 5.92 2.41 0.77

72 13.28 6.93 4.30 0.21

11

8


Ensayo 3





0 0.90 0.53 20.00 2.37

5 1.26 0.56 19.57 1.78

19 2.19 1.50 18.45 1.36

24 3.95 2.25 16.36 1.02

29 4.22 2.74 16.03 0.60

43 6.94 2.86 12.79 0.35

48 7.19 5.80 12.49 0.09

53 8.71 6.49 10.67 0.07

67 11.11 7.51 7.81 0.23

72 10.99 7.58 7.95 0.05

Condiciones (concentraciones mínimas de sustratos limitantes aceite vegetal)

Ensayo 1





0 2.83 4.01 5.00 2.41

6 2.51 1.54 2.10 2.36

18 3.49 2.57 1.11 2.08

24 3.80 2.26 6.55 1.69

31 5.02 3.39 8.52 1.03

43 6.52 4.05 6.55 0.84

48 6.67 4.97 9.26 0.44

54 6.70 5.25 8.30 0.13

66 6.65 4.80 8.95 0.12


72 5.42 3.50 2.62 0.16

Ensayo 2





0 2.06 4.01 5.00 2.73

6 2.71 1.54 4.13 2.66

18 4.46 2.57 2.00 2.48

24 5.26 2.26 1.08 0.98

31 5.24 3.39 1.08 1.10

43 6.62 4.05 0.00 0.68

48 6.49 4.97 0.13 0.23

54 6.78 5.25 0.00 0.06

66 5.71 4.80 1.02 0.02

72 6.34 3.50 0.42 0.05

Condiciones (concentraciones mínimas de sustratos limitantes sulfato de amonio)

Ensayo 1





0 1.04 1.89 20.00 1.05

5.5 2.75 1.86 14.11 1.03

19 6.91 3.61 11.69 0.85

24 8.19 5.65 7.33 0.03

29.5 8.60 5.92 5.75 0.01

42 9.34 7.59 2.07 0.01

48 8.35 6.41 3.16 0.01

12

0


53 8.78 6.61 4.66 0.12

68 10.60 8.60 3.81 0.29

73 10.72 8.83 0.00 0.03

Ensayo 2





0 1.04 3.52 20.00 1.52

6 5.35 2.95 18.29 1.49

18 11.62 6.64 15.90 0.92

24 9.73 8.53 15.77 0.01

30 8.84 8.40 15.25 0.01

42 12.58 10.18 11.50 0.35

48 14.17 10.93 4.73 0.44

54 13.54 10.09 4.28 0.17

66 15.52 11.97 3.44 0.28

72 16.47 13.80 0.00 0.56

Condiciones (concentraciones máximas de sustratos limitantes aceite vegetal)

Ensayo 1


- Sulfato de amonio: 6.6/L



0 4.00 1.51 140.00 6.60

5 6.27 4.13 137.29 5.39

19 8.90 3.90 134.16 5.04

24 7.62 5.42 135.67 4.43


29 7.76 5.45 135.52 4.16

48 11.64 8.80 130.88 3.67

53 11.80 8.17 130.70 3.22

67 11.57 9.22 130.96 3.73

Ensayo 2





0 1.04 0.91 100.00 2.88

5 2.69 1.81 96.21 2.83

19 5.60 3.85 88.20 2.39

24 5.87 3.45 86.37 1.10

29 7.27 5.73 83.38 0.71

43 9.39 6.37 77.39 0.51

48 10.04 7.45 75.50 0.27

53 11.40 8.66 72.95 0.08

67 11.28 7.41 69.97 0.09

72 12.93 6.17 67.38 0.02

Condiciones (concentraciones altas de sulfato de amonio)

Ensayo 1


- Sulfato de amonio: 5 g/L



0 1.33 0.99 20.00 4.97

6 1.74 0.45 19.51 4.77

18 4.53 2.41 16.19 4.47

12

2


24 7.83 3.77 12.25 3.64

31 8.68 6.44 11.23 3.31

43 9.24 6.29 10.56 1.20

48 9.63 8.05 10.10 1.36

54 10.77 7.72 8.73 1.32

66 12.05 8.49 7.21 1.29

72 13.51 9.17 5.47 1.37

Condiciones (concentraciones de sustratos limitantes variables validación)

Ensayo 1





0 2.00 0.22 40.00 4.57

6 2.80 1.04 39.04 4.01

18 4.48 3.93 37.04 2.98

24 8.35 4.90 32.42 2.50

29 8.88 5.83 31.79 1.19

48 10.99 9.32 29.28 0.37

53 11.12 8.95 29.12 0.27

67 12.61 10.75 27.34 0.03

Ensayo 2





0 2.12 0.22 40.00 2.0

6 3.00 1.62 38.81 2.7


19 8.93 6.70 31.73 1.5

24 9.11 6.64 31.52 0.9

29 9.68 7.26 30.83 0.6

42 12.01 9.60 28.06 0.4

48 11.61 9.87 28.54 0.1

53 11.80 9.91 28.30 0.2

67 11.83 9.70 28.27 0.8

72 12.80 10.37 27.11 0.2

Escala biorreactor 100 L

Ensayo 1





0 1.85 1.32 40.00 4.15

5 2.32 2.13 39.62 3.61

19 5.24 3.77 36.13 1.62

24 6.93 6.08 34.12 1.05

29 10.23 7.33 30.18 0.76

43 10.82 8.19 29.48 0.28

48 12.03 10.24 28.03 0.11

53 12.19 10.21 27.84 0.14

67 12.90 11.39 26.99 0.02

72 14.02 12.63 25.66 0.11

Ensayo pulsos

Ensayo 1

- Medio inicial: aceite vegetal 20 g/L sulfato de amonio 2.8 g/L

12

4


- Concentración del medio de alimentación: aceite vegetal 20 g/L sulfato de amonio

2.8 g/L

- Volumen inicial: 3 L

- Flujo de alimentación: 1.8 L/h

- Dos pulsos 1 a las 24 h segundo a las 48 h, 1 L cada uno


0 1.70 0.55 20.00 2.32

6 3.58 0.97 17.76 1.32

20 5.78 4.03 15.13 1.01

24 6.21 2.21 14.62 0.76

28 10.97 5.59 8.94 0.89

48 13.50 6.85 5.92 0.11

53 12.28 7.07 7.37 0.04

68 10.81 8.87 9.13 0.25

77 12.70 10.94 6.87 0.10

91 14.84 12.51 4.31 0.09

97 15.49 12.73 3.55 0.08

77 12.70 10.94 6.87 0.10

Ensayo 2



2.8 g/L





0 4.58 0.86 20.00 2.85

5 1.73 1.37 23.39 2.21

19 8.91 2.48 14.83 1.96


24 10.47 3.06 12.97 1.41

29 7.07 3.54 17.03 1.14

43 11.02 7.09 12.32 0.27

48 14.14 6.77 8.59 0.27

53 13.26 10.68 9.64 0.22

67 13.96 11.19 8.80 0.76

72 15.07 11.91 7.48 0.54

Ensayo 3



4 g/L





0 3.78 0.87 20.00 2.73

6 2.23 0.20 21.85 2.63

21 8.97 4.56 13.81 1.45

24 10.05 5.23 12.52 1.04

29 5.90 2.76 17.47 0.84

44 9.67 6.28 12.98 0.20

48 12.25 9.25 9.90 0.20

53 8.58 8.53 14.27 0.16

73 11.48 7.10 10.82 0.40

78 12.12 9.58 10.05 0.20

96 14.35 11.12 7.39 0.05

Ensayo 4


12

6



24 g/L

- Volumen inicial: 4.2L


- 1 pulso a las 26 h de 500 mL


0 0.85 0.45 20.00 2.82

4 1.47 1.66 19.26 2.29

20 7.81 5.44 11.69 1.75

24 7.77 4.95 11.75 1.24

29 13.51 5.44 4.89 2.74

43 13.60 9.04 4.79 1.33

48 14.14 9.73 4.14 0.77

52 20.09 10.52 0.00 0.34

67 19.30 14.63 0.94 0.02

76 18.77 14.33 1.58 0.00

Ensayo lote alimentado

Ensayo 1



21 g/L


- Flujo de alimentación: 0.0108 L/h y 0.005 L/h, mezcla aceite medio.

- Primer flujo de alimentación a las 24 h segundo a las 48 h

-



0 0.55 0.23 20.00 2.81

5.5 0.72 1.26 19.80 2.68

19 6.19 2.94 13.27 1.90

24 7.56 3.25 11.64 0.87

29 9.41 4.74 9.43 0.39

43 11.32 8.99 7.15 0.27

48 10.59 7.58 8.02 0.31

53 8.33 7.16 10.71 0.30

67 9.40 7.00 9.44 0.30

72 10.03 8.25 8.69 0.31

77 10.19 8.01 8.50 0.34

Ensayo 2



21 g/L



- Primer flujo de alimentación a las 24 h segundo a las 48 h


0 0.55 0.23 20.00 2.81

5 2.25 1.26 17.97 2.68

19 6.19 2.94 13.27 1.90

24 7.56 3.25 11.64 0.87

29 9.41 4.74 9.43 0.39

43 11.32 11.54 7.15 0.27

48 14.59 10.58 3.25 0.31

53 12.33 10.52 5.95 0.30

67 13.25 11.01 4.85 0.30

72 13.03 10.85 5.11 0.31

12

8


Ensayo 3



21 g/L



- Primer flujo de alimentación a las 24 h segundo a las 48 h, 24 horas cada uno

-


0 0.55 0.23 20.00 2.81

5.5 0.72 1.26 19.80 2.68

19 6.19 2.94 13.27 1.90

24 7.56 3.25 11.64 0.87

29 9.41 4.74 9.43 0.39

43 11.32 8.99 7.15 0.27

48 10.59 7.58 8.02 0.31

53 8.33 7.16 10.71 0.30

67 9.40 7.00 9.44 0.30

72 10.03 8.25 8.69 0.31

77 10.19 8.01 8.50 0.34

Ensayo 4



21 g/L


- Flujo de alimentación: 0.0108 L/h, sustratos separados.

- Un flujo de alimentación a las 24 h por 24 h



0 2.54 1.25 20.00 3.25

4 6.41 3.00 15.39 3.01

20 5.70 8.50 16.23 1.55

24 9.24 9.24 12.00 0.85

29 11.16 6.69 9.72 0.77

43 15.04 8.83 5.08 0.27

48 17.36 10.33 2.33 0.27

52 14.83 9.29 5.34 0.27

63 18.28 12.36 1.22 0.27

72 16.21 12.79 3.69 0.27

76 21.33 14.48 0.00 0.27

D. Anexo: Código Matlab para optimización de parámetros y proceso

D-1. Código Matlab estimación de parámetros

function tesis

%código para la obtención de parámetros por medio de la reducción del

%valor de la sumatoria de mínimos cuadrados con la función fmincon. con 4

%ecuaciones diferenciales simultáneamente

%toma de datos y definición de constantes y variables

global tt B P S1 S2 w1 w2 w3 w4 x0 ;

data=xlsread('opt_fc20gl_prim.xlsx','A3:E14');

tt=data(:,1);%tiempo

B=data(:,3); %concentración biomasa

S1=data(:,5); %concentración fuente de carbono

S2=data(:,2); %concentración fuente de amonio

P=data(:,4); %concentración producto

x0=[B(1);S1(1);S2(1);P(1)]; %Datos iniciales integración numérica

%restricciones

%valores iniciales

inic = [0.36;1;6;1;1;1;1;1;1;1;1;1;0.005;0.005];%limites inferiores

liminf=[0.05 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0]; % vector de los límites inferiores

para la iteración

limsup=[1 10 200 100 50 50 10 20 10 10 10 20 0.005 0.005]; % vector de los

limites superiores para la iteración

% opciones para la optimización

opcion=optimoptions('fmincon','Display','iter','DiffMaxChange',30,'MaxFu

nEvals',10000,'TolX',0.001);

% opcion=optimset('display','Iter','MaxFunEvals',50000,'MaxIter',10000);

%función de optimización

[p,FVAL]=fmincon(@lverr,inic,[],[],[],[],liminf,limsup,[],opcion);

%definición de parámetros para ser optimizados, estos se resuelven en la

%función de la ecuación diferencial, que resuelve iterativamente.

mumax=p(1)

Ks=p(2)

Sm1=p(3)

Kn=p(4)

Sm2=p(5)

n1=p(6)

D. Anexo: Código Matlab para optimización de parámetros y proceso 131

n2=p(7)

a1=p(8)

a2=p(9)

Yxps11=p(10)

Yxs21=p(11)

Kp=p(12)

ms1=p(13)

ms2=p(14)

params=p(1:14);

%función para resolver la ecuación con los parámetros ya obtenidos de la

%optimización

tti=(0:1:72);

[tout,yout]=ode45(@lvrhs,tti,x0,[],params);

%script para graficar

figure(1)

hold on

plot(tout,yout(:,1),'k-',tout,yout(:,2),'k--

',tout,yout(:,3),'k:',tout,yout(:,4),'k-.','LineWidth',2);

% legend('biomasa','glucosa','nitrogeno','product')

plot(tt,B,'k+',tt,S1,'ko',tt,S2,'kv',tt,P,'kx','MarkerSize',12,'MarkerFa

ceColor','k','LineWidth',2);

% legend('Biomass','Vegetal oil','Ammonium sulfate','PHA','Biomass

exp','Vegetal oil exp','Ammonium sulfate exp','PHA

exp','Location','EastOutside')

set(gca,'FontSize',20)

hold off

% xlabel('t');

% ylabel('X(t)');

%obtención de valores de coeficiente de correlación r^2

[tout,yout]=ode45(@lvrhs,tt,x0,[],params);

R2=corrcoef(B,yout(:,1));

R2X=R2(1,2)^2

R2=corrcoef(S1,yout(:,2));

R2S1=R2(1,2)^2

R2=corrcoef(S2,yout(:,3));

R2S2=R2(1,2)^2

R2=corrcoef(P,yout(:,4));

R2P=R2(1,2)^2

% title('CINETICA','FontSize',14)

xlabel('Time (h)'), ylabel('Concentration (g/L)')

% guardar los gráficos en resolución deseada

print -dtiff final.tiff -r1000

% grafica para correlación

figure(2)

hold on

x =linspace(0,max(yout(:,1)),13);

n=1*x;

subplot(2,2,1)

plot(x,n,yout(:,1),B,'o','MarkerFaceColor','b')

xlabel('Experimental data'), ylabel('Fitted data')


axis([0 max(yout(:,1)) 0 max(yout(:,1))])

title('Biomass')

13

2


hold off

hold on


n=1*x;

subplot(2,2,2)

plot(x,n,yout(:,2),S1,'o','MarkerFaceColor','b')




title('Vegetal oil')

hold off

hold on


n=1*x;

subplot(2,2,3)

plot(x,n,yout(:,3),S2,'o','MarkerFaceColor','b')




title('Ammonium sulfate')

hold off

hold on


n=1*x;

subplot(2,2,4)

plot(x,n,yout(:,4),P,'o','MarkerFaceColor','b')




title('Product')

hold off

% set(gcf,'PaperUnits','inches','PaperPosition',[0 0 15 12])

% print -dtiff regresion.tiff -r1000

%función para la solución de la ecuación diferencial y reducción del error

%entre los datos del modelo y datos experimentales

function err = lverr(p)

global tt B P S1 S2 w1 w2 w3 w4 x0;

params = [p(1) p(2) p(3) p(4) p(5) p(6) p(7) p(8) p(9) p(10) p(11) p(12)

p(13) p(14)];

% options = odeset ('RelTol',1e-3,'AbsTol',1e-3);

% options = odeset(options,'Stats','on','Events',@events);

td=[0:1.25:89]';

[t,yout]=ode45(@lvrhs,tt,x0,[],params);

err = norm(yout(:,1)-B)^2+norm(yout(:,2)-S1)^2+norm(yout(:,3)-

S2)^2+norm(yout(:,4)-P)^2;

%funcion que contiene las ecuaciones diferenciales

function valo = lvrhs(t,yout,p)


mu=(p(1)*(yout(2)/(p(2)+yout(2)))*(yout(3)/(p(4)+yout(3)))*(1-

(yout(2)/p(3)).^p(8))*(1-(yout(3)/p(5)).^p(9)));

phi=mu*yout(1);

Xt=phi;

S1t=-(((1/p(10))*mu)+p(13))*yout(1);

S2t=-(((1/p(11))*mu)+p(14))*yout(1);

Pt=(p(12)*mu)*yout(1);

valo =[Xt S1t S2t Pt]';

D-2. Optimization De Proceso

clear all

global feed h N Z0 interv Sfc Sfn t feedmax

aux3=cputime;

% CONCENTRACIONES INICIALES

X0 = 6.3; % concentración inicial de biomasa (g/l)

P0 = 0.5; % concentración inicial de PHA (g/l)

Sc0 = 10; % concentración inicial de F.C. aceite vegetal

(g/l)

Sn0 = 1.3; % concentración inicial de F.N. sulfato de amonio

(g/l)

% PARAMETROS DO PROCESSO

V0 =4; % Volumen inicial del reactor (litros)

t0 = 24; % tiempo inicial del proceso (horas)

temptotal= 96; % tiempo total de fermentación (horas)

Sfc = 40; % concentración de sustratos alimentados (g/l)

Sfn = 4;

feedmax=1200; % limite de tasa de alimentación (g/h)

N = 3; % intervalos de discretizacion (iguales)

feed=ones(1,N)*10; % valor inicial de alimentación para optimización

% datos iniciales para la primera integración

Z0=[X0 P0 Sc0 Sn0 V0];

% intervalos de tiempo

h=(temptotal-t0)/N;

%limites inferiores y superiores para optimización

VLB=zeros(1,N);

aux2=ones(1,N);

VUB=aux2*feedmax;

OPTIONS=optimoptions('fmincon','Display','iter','DiffMaxChange',30,'MaxF

unEvals',10000,'TolX',0.001);

feed0=feed;

feed=fmincon('FUN1',feed,[],[],[],[],VLB,VUB,[],OPTIONS);

tiempo_calculo=cputime-aux3

% FUNCION PARA RESOLVER ECUACIONES DIFERENCIALES

function dY=modelo(t,Y,FLAG,feed)

global interv Sfc Sfn

% PARAMETROS DEL MODELO

mumax=0.355;

13

4


Ks=4.19;

Kn=2.23;

Kis=199;

Kin=10;

a1=1.23;

a2=0.42;

Yxps1=0.88;

Yxs2=11.50;

ms1=0.0016;

ms2=0.0035;

Kp=0.98;

c=12.9;

b=1.27;

% ASIGNACION DE VALORES A LAS VARIABLES

X=Y(1); P=Y(2); Sc=Y(3); Sn=Y(4); Vol=Y(5);

% modelo

mu=mumax*(Sc/(Ks+Sc))*(Sn/(Sn+Kn))*(1-(Sc/Kis)^a1)*(1-(Sn/Kin)^a2);

phi=mu*X;

dX = phi - X/(Sfc*Vol)*feed(interv);

dP = (Kp*mu)*X -P/(Sfc*Vol)*feed(interv);

dSc = -(((1/Yxps1)*mu)+ms1)*X + (1-Sc/Sfc)*feed(interv)/Vol;

dSn= -(((1/(c*(Sc/Sn)/(b+(Sc/Sn))))*mu)+ms2)*X + (1-

Sn/Sfn)*feed(interv)/Vol;

dV = feed(interv)/Sfc;

dY=[dX dP dSc dSn dV]';

% FUNCION OBJETIVO PARA LA OPTIMIZACION

function [F,G]=FUN1(feed)

global h N Z0 interv feedmax

% INTEGRACION POR R-KUTA

Y0=Z0;

H=[];

L=[];

feedot=[];

for interv=1:N;

ti=(interv-1)*h;

tf=interv*h;

tspan=[ti,tf];

[t,Y]=ode23s('modelo',tspan,Y0,[],feed);

% captura y ordenamiento de resultados

H=[H;Y];

L=[L;t];

% integración siguiente a la solución anterior de intervalo

aux=size(Y,1);

Y0=Y(aux,:);

feedot=[feedot;feed(interv)];

end

feedot=[feedot;feed(interv)];

fin=size(Y,1);

% función objetivo (minimizar)


F=-(Y(fin,1));

%restricción de volumen final

G=Y(fin,4)-10;

Y=H;

t=L;

%GRAFICAS DE RESULTADOS

subplot(2,2,1),plot(t,Y(:,1)),ylabel('Biomasa (g/l)'), xlabel('Tiempo

(h)') %, hold on

% plot(tsim,Xvsim,'r--'), hold off;

subplot(2,2,2),plot(t,Y(:,2)),ylabel('Producto (g/l)'), xlabel('Tiempo

(h)')

subplot(2,2,3),plot(t,Y(:,3)),ylabel('Sustrato (g/l)'), xlabel('Tiempo

(h)')

subplot(2,2,4),stairs(feedot)

ymin=0; ymax=feedmax;xmin=1; xmax=N+1;

axis([xmin xmax ymin ymax]),ylabel('flujo masico de alimentación.

(g/h)'), xlabel('intervalos');

drawnow;

E. Anexo: Publicaciones

Documents

MODELAMIENTO MATEMÁTICO Y OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO …bdigital.unal.edu.co/53725/1/danielalexandermendezreyes... · 2016-09-21 · Resumen En el presente trabajo se desarrolló