Mnohobuněčnost a diferenciace buněk

Jana Fleischmannová

Vývoj mnohobuněčného organismu

Vývoj mnohobuněčného organismu

1. Dělení (cleavage)2. Pattern formation - zajišťuje, že budou

orgány založeny na správných místech3. Organogeneze4. Růst

Dělení

Velmi rychlé dělení buněk, bez tvorby nové cytoplazmyRelativně velká zygota se dělí na mnoho mnohem menších buněk – blastomerVzniká blastula

Gastrulace

• Reorganizace blastomer do dvou nebo tří zárodečných listů• Entoderm• Mesoderm• Ektoderm

Gastrulace

Vznik tkání a orgánů

• Ectoderm:– Epidermis a její deriváty (vlasy, nehty),

nervový systém• Mesoderm:– svaly, kardiovaskulární soustava, kosti,

krev, dermis, gonády, vylučovací soustava• Endoderm:– trávící soustava, plíce, žlázy

Organogeneze

• Migrace a kombinace buněk z jednotlivých zárodečných listů• Epitelio-mesenchymální interakce• Kožní deriváty, trávící trakt, zuby, plíce

Embryologie

preformacionisté

Buněčná teorie – Schleiden, Schwann

Weismann barrierGermline cells contain information that passes to each generation unaffected by experience and independent of the somatic (body) cells.

Historie

Deskriptivní embryologie

Cell fate mapping

Experimentální embryologie

• Spemannův organizer• Spemann, Mangold• Transplantace, recombinační experimenty,

farmakologické ovlivnění vývojových procesů

• Xenopus laevis, kuřecí embryo, myš – explantátové kultury

Vývojová genetika

• Studium vlivu mutací na vývoj organismu• Cílená mutageneze - homologická

rekombinace• Genetický skrýning• Modelové organismy• Caenorhabditis elegans, Drosophila

melanogaster, Danio rerio, Mus musculus

Základní buněčné procesy během vývoje

• Buněčná proliferace• Buněčná specializace

(diferenciace)• Buněčné interakce• Buněčný pohyb(migrace)• Buněčná smrt (apoptóza)

Základní principy vzniku mnohobuněčnosti

Regulace těchto procesů probíhá na úrovni regulace transkripce

• Všechny buňky těla nesou stejnou genetickou informaci (genom)

• Základem diferenciace odlišnosti v genech, které jsou exprimovány

Regulace genové exprese

• Extracellulární faktory• Růstové faktory, živiny, množství kyslíku,

teplota• Intracellulární faktory• Změny struktury chromatinu • Zpřístupnění nebo znepřístupnění genu

pro transkripci

Regulace genové exprese

• Provozní (house-keeping) geny• Exprimovány konstantně• Nutné pro základní buněčné pochody• Inducibilní geny• Exprimované v přítomnosti specifických

transkripčních faktorů

Regulace genové exprese

• Klíčová úloha transkripčních faktorů• Vazba specifických úseků DNA a iniciace

transkripce

Transkripční faktory

• DNA vazebná doména• Oligomerizační doména• Regulační doména: AktivačníReprimační• další

Zinkové prsty

bHLH

bZIP

homeodoména

Transkripční faktory kontrolují vývojhomeoboxové geny

Homeoboxové geny

• Homeobox 180 bp obsahující DNA vazebnou homeodoménu

• Původně popsány u octomilky• Pak objeveny savčí homology• Mutace způsobují homeotickou

trasformaci

Ultrabithorax (Ubx) určuje identitu halter

Ubx mutant

Poruchy funkce homeoboxových genů

Poruchy funkce transkripčních faktorů

• Spojeno s vývojovými defekty u člověka

• Synpolydactyly• HOXD13•Hand-foot-genital syndrome• HOXA11-13• Radioulnar synostosis• HOXA11

Transkripce je regulována

extracellulárními signály

Regulace transkripce genů

změnou struktury

chromatinu

Remodelace chromatinu• Postranslační modifikace histonů• „Histonový kód“• Acetylace• metylace• Ubikvitinace• Fosforilace• ATP-zavislá remodelace• Acetylace typická pro transkripčně aktivní geny• Deacetylace – inaktivace- gene silencing -

umlčování

Enzymy účastnící se remodelace chromatinu

• Modifikátory histonů - nemění pozici nukleozomů• Chromatin remodelační enzymy - hydrolýza ATP = aktivní remodelace- mění pozici nukleozomů, zpřístupňují

nebo znepřístupňují regulační sekvence DNA

- Multiproteinové komplexy

Remodelace chromatinu

Remodelace chromatinu

Vývojové defekty spojené remodelací chromatinu

• Rett syndrom - mutace v MeCP2• Rubinstein-Taybi syndrom- mutace v genu CREBBP - koactivátor transkripce

DNA metylace

• DNA metylace – přidání metylové skupiny k cytosinu

• DNA metyl transferázy • Často v CpG opakováních CpG ostrůvky v

promotorových oblastech genu• Metylace brání vazbě transkripčních

faktorů

Genomový imprinting

• U určitých genů je u potomka exprimována pouze alela pocházející buď od matky nebo od otce (IGF2)

• Poruchy imprintingu – dědičná onemocnění

• IGF2 – Wilmsův nádor pokud exprimován i z maternální alely

• Různé syndromy př. PraderWilli-Angelmann

Diferenciace buněk

Vývojová signalizace

Lat e

r ál n

í inh

i bic

e

Juxtacrinní laterální inhibice

ShhWnt

Par

akr in

ní s

igna

l izac

e

Laterál

ní inh

ibice

Notch/Delta

Reciproční a laterální induktivní interakce

• Reciprocal inductive interactions involve cell populations that influence the development of each other

• Lateral inductive interactions involve signaling between developmentally equivalent cells

Embryonální indukce

• Signální centra produkují induktivní signály, na které reagují kompetentní okolní oblasti.

• Instruktivní: různé možnosti odpovědi• - gradient morfogenu, apoziční indukce• Permisivní: pouze jedna možná odpověď

Embryonální indukce

Spemann, Mangold Spemannův organizer

Embryonální indukce

Reciproční epitelio-mesenchymální interakce

Laterální inhibiceNotch-Delta signalizace

Molekulární signální dráhy

TGFbeta Shh

wnt

Delta/Notch

Molekulární signální dráhy

Signální dráhy mezibuněčná komunikace během vývoje

• Opakované používání signálů

„Add a pinch of BMP, sprinkle some Hedgehog, a touch of Wnt, and a handful of FGF and you can pattern an embryo, a limb, or an organ.“

(B.Z. Shilo, Cell, 2001)

Diferenciace buněk

Asymetrické dělení

Kmenové buňky

Vlastnosti kmenových buněk

• Totipotence, pluripotence, multipotence• Asymetrické dělení• Embryonální kmenové buňky odběr z

blastocysty• Výskyt i v dospělém organismu, zdrojem

pro obnovu tkání „stem cell niches“

Zdroje embryonálních kmenových buněk

• z nepoužitých několikadenních lidských zárodků (skládá se z několika desítek buněk) z klinik pro umělé oplodnění

• terapeutické klonování (odběr buňky z pacienta → vložení do ženského vajíčka bez jádra → zárodek → blastocysta → z blastocysty se vyjmou kmenové buňky → kultivace kmenových buněk)

Zdroje embryonálních kmenových buněk

Etické aspekty• Odběrem kmenových

buněk dojde ke zničení embrya

• Otázka od kdy je lidská bytost

• V některých zemích zakázáno Francie, Švédsko, Itálie

• ČR povoleno použití nadbytečných embryí z asistované reprodukce

• Terapeutické klonování zakázáno

Dospělé kmenové buňky• Překonání etických problémů s tvorbou embryí • Kmenové buňky z pupečníkové krve, kostní

dřeně i doalších orgánů• mezenchymální kmenové buňky se získávají

poměrně jednoduše odběrem žádané tkáně, např. punkcí kostní dřeně nebo odběrem tukové tkáně během operace. Po rozrušení mezibuněčných vazeb se mohou kmenové buňky vytřídit na přístrojích nebo se vloží do kultivačních nádob, kde se tyto buňky známé schopností adheze poměrně snadno přichytí a kultivují, zatímco ostatní zralé buňky se odmyjí

Zdroje dospělých kmenových buněk

• nika kmenových buněk – mikroprostředí, kde se nacházejí kmenové buňky, které s kmenovými buňkami interaguje a podílí se tak na regulaci jejich osudu.

• nika hematopoietických kmenových buněk – u obratlovců kostní dřeň

• tvořena subendoostealními osteoblasty, sinusoidálními endoteliálními buňkami a stromálními buňkami.

• nika kmenových buněk vlasového folikulu• intestinální nika kmenových buněk• Další – kmenové buňky ze zubní pulpy, z exfoliovaných

mléčných zubů atd.

Nika kmenových buněk

Reprogramování diferencovaných buněk

Biomedicínské využití• Zdroj náhradních diferencovaných buněk pro

nefunkční tkáně, zdroj růstových faktorů pro regeneraci poškozené tkáně, genové terapie

• Léčba nádorů - hematopoetické kmenové buňky používané v klinické praxi pro léčbu některých leukémií, pro další nádory studie v různých stádiích

• Možná léčba imunodeficiencí• V budoucnu naděje pro léčbu: roztroušená

skleróza, diabetes, ochrnutí, infarkt myokardu, neorodegenerativní onemocnění

Orgánové náhrady

• Ex vivo vytvoření orgánů „na míru“ z vlastních kmenových buněk dárce

• Imunokompatibilita není riziko rejekce• Komlexní souhra kmenových buněk

biokompatibilních polymerových lešení a kokteilu vhodných diferenciačních faktorů

Udržování tkáňové homeostázy

• Nutná obnova tkání během celého života• V různé míře• neurony x epitel střevních klků• Uplatnění shodnýchbuněčných procesů

jako během vývoje• Nutná rovnováha mezi proliferací –

diferenciací – buněčnou smrtí = tkáňová homeostáza

Poruchy buněčných procesů

• Některé procesy spojené s embryonálním vývojem nejsou žádoucí během dospělého života

• Znakem nemoci př. migrace buněk při metastázách

Poruchy buněčných procesů

• Procesy nezbytné pro vývoj mohou být škodlivé v dospělosti

• teratomy

Poruchy buněčných procesů

Příliš mnoho buněk umírá

• AIDS• Neurodenerativní onemocnění– Alzheimer– Parkinson• Ischemické poškození• Poškození jater způsobené toxiny– Alkohol

Proliferativní poruchy – rakovina

Protoonkogeny

• Růstové faktory a mitogeny• Receptorové tyrosinové kinázy• Cytoplasmatické receptorové kinázy• Receptorové serin/threonin kinázy• Regulační GTPázy• Transkripční faktory• Antiapoptotické geny

Aktivace protoonkogenů• Gain-of-function dominantní mutace způsobující

– Zvýšení aktivity proteinu– Ztrátu regulace negativní zpětnou vazbou– zvýšení koncentrace proteinu zvýšenou expresí– Zvýšení stability proteinu

• Genové amplifikace• Chromosomální translokace

– Zvýšená exprese genu ve špatných buňkách nebo ve špatném čase

– Exprese konstitutivně aktivního hybridního proteinu• Virové infekce

– Aktivace protoonkogenu silným virovým promotorem, aktivujícími regulačními sekvencemi

– V genomu začleněné virové onkogeny

Růstové faktory

• Proliferace za normálních okolností závislá na vnějších biochemických signálech – růstových faktorech

• Autokrinní stimulace proliferace

• Vede k nekontrolovatelnému buněčnému dělení nezávisle na signálech z okolí

Receptory růstových faktorů

Nádorové supresory• Geny spojující buněčný

cyklus poškození DNA• Geny spojující poškození

DNA s apoptózou • Geny které se uplatňují při

mezibuněčné adhezi, blokují ztrátu kontaktní inhibice a blokují tvorbu metastází

• Loss-of-function mutace, recesivní LOH – loss of heterozygozity

• I dědičné mutace

P53 - the guardian of the genome

• Mutován u více než 50 % nádorů• Při poškození DNA hraje klíčovou úlohu v

zastavení buněčného cyklu, opravě DNA a spuštění programované buněčné smrti v případě, že poškození nelze opravit, udržování genomové stability

p53

Vícestupňový proces

• Iniciace• Promoce • Progrese

• Vliv karcinogenů• Genotoxické – poškození DNA• Negenotoxické – podporují růst jiných

mechanismem než je změna DNA, př. hormony

Proces karcinogeneze

HyperplasieBenigní nádorMaligní nádor

Akumulace mutací Genomová nestability

Analogie s normálním vývojem

• Migrace – tvorba metastáz u maligních nádorů

Nádorové kmenové buňky• Podobné vlastnosti jako normální kmenové buňky • tumorigenicita – schopnost diferencovat do všech typů

buněk daného nádoru• Dávají vznik novým nádorům během procesu tvorby

metastáz • Mohou vést k relapsu onemocnění• Terapie cílené na jejich odstranění

Děkuji za pozornost!