Microbiologa Agropecuaria

CARRERA DE BIOLOGA. Tercer AoMicroscopaUniversidad Central "Marta Abreu" de Las VillasMsc: Annarella Chea Gonzlez.

MicroscopaSumario:Generalidades del microscopio.Tipos de microscopios.Partes del microscopio ptico.Pasos a seguir para su uso.Parmetros pticos.Mantenimiento del microscopioConclusiones.

1.0 GeneralidadesEl microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones nfimas, entre ellos la clula, base de la vida. Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de formacin de imgenes pticas aumentadas a travs de lentes convergentes, permiten la observacin de pequeos detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibiran.Surge en el siglo XVII los microscopios compuestos, utilizados por el holands Antonie van Leewenhock en el estudio de la microfauna de los estanques y charcas, unidas a las de Robert Hooke, establecieron la microscopia como poderosa herramienta cientfica. Zacharias y Hans Janssen construyeron en los aos 1590's el primer microscopio registrado.

2.0 Tipos de MicroscopiosOpticoConfocal Electrnico de Transmisin Electrnico de Barrido Microscopa de campo prximo - De barrido efecto tnel - De fuerzas atmicasMicroscopio estereoscpico

Tipos de Micoscropio pticoCampo claro :La muestra se observa ms oscura que el campo que la rodea.Campo oscuro: Posee un condensador paraboloide, hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparacin.

De contraste de fase: Se basa en modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la preparacin.

De fluorescencia: La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energticas, tratar el material biolgico con flurocromos facilita la observacin al microscopio .

La muestra se observa ms oscura que el campo que lo rodea.Microscopio de campo claro

La muestra se observa brillantemente iluminada sobre un fondo oscuro.Microscopio de campo oscuro

Microscopio de contraste de fases Se observa una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. El material denso aparece brillante, mientras que las partes de la clula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras.Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.

Microscopio ptico de fluorescencia

Una molcula que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta.

Microscopio compuesto modificado con una fuente de radiaciones ultravioletas y un filtro.

Se usan colorantes que emiten luz visible cuando se bombardean con rayos UV.

Microscopio confocal

Se usa para estudiar la estructura de los materiales biolgicos.Emplea un sistema de iluminacin con rayo lser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo.Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo lser a travs del espcimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo mvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolucin. Este mtodo tiene la ventaja de que se pueden tomar imgenes de la muestra en cortes muy finos.Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definicin mxima a la imagen.Es posible tambin crear imgenes mltiples a diferentes profundidades dentro del espcimen y realizar reconstrucciones tridimensionales.

En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrnico a base de lentes electrostticas, ese mismo ao Knoll y Ruska dan a conocer los primeros resultados obtenidos con un microscopio electrnico Siemens, construido con lentes magnticas. As nace el microscopio electrnico, en 1936 ya se ha perfeccionado y se fabrican microscopios electrnicos que superan en resolucin al microscopio ptico. Utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catdicos, en el cual debe mantenerse el vacio. Microscopio Electrnico

Permiten estudiar la estrutura celular.La resolucin y el aumento son mayores.Los virus, y los objetos ms pequeos, como las macromolculas solamente pueden verse a travs del microscopio elctronico.El Microscopio electrnico consta de: * Un filamento de tungsteno (ctodo) que emite electrones. * Condensador o lente electromagntica, que concentra el haz de electrones. * Objetivo o lente electromagntica, que ampla el cono de proyeccin del haz de luz. *Ocular o lente electromagntica, que aumenta la imagen. *Proyector o lente proyectora. que ampla la imagen. * Pantalla fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano.

Aplicaciones

Microscopio Electrnico de Transmisin Utiliza un chorro de electrones en lugar de luz visible para definir el objeto.Requiere que se aumente el contraste por sombreado metlico utilizando un metal pesado.

Pasos para la preparacin de rutina de los especimenes en la microscopia electrnica de transmisin Fijacin con glutaraldehdo.Lavado con un buffer.Fijacin con tetrxido de osmio. Fijar piezas de tejidos no mayores de 1mm 3Microfotografa electrnica de Transmisin de paredes celulares.

Microscopio electrnico analtico de transmisin de alta resolucin JEOL-2000 FXII Permite observaciones de hasta 0,28 nm. de resolucin.Puede focalizar el haz de electrones hasta 2 nm. de dimetro y trabaja con voltajes de aceleracin variables de 20 a 200 kV.Lleva acoplado un sistema computerizado de anlisis de energa de rayos X dispersados eXL-10 de LINK ANALYTICAL que permite determinar la composicin qumica de la microregin sobre la que se focaliza el haz electrnico.Aumentos entre 5 000X y 1 000 000X

Microscopio Electrnico de BarridoBombardea la superficie del espcimen con un rayo de electrones.Produce imgenes con una profundidad aparentemente tridimensional.Tcnica verstile para la visualizacin y el anlisis de las caractersticas microestructurales de muestras slidas(elevada resolucin es 2nm y campo de resolucin) .Tcnica de inters en campos como :Medicina, Biologa, Ciencias de Materiales, Metalurgia, Arqueologa, etc.

Microfotografa electrnica de Barrido de paredes celulares.

Microscopio de fuerzas atmicasInstrumento mecnico- ptico que detecta fuerzas a nivel atmico (del orden de los nanoNewton) a travs de la medicin ptica del movimiento sobre la superficie.

Obtiene imgenes tridimensionales de la superficie de muestras(Sin preparacin especial de las muestras).

Lleva acoplado un microscopio ptico( permite la visualizacin del conjunto punta-muestra y poder situar la punta sobre una zona determinada de la muestra).Distingue detalles en la superficie de la muestra con una amplificacin de varios millones( Resolucin de menos de 1nm).AplicacionesAnlisis de:Cristales de aminocidos. ADN y ARNComplejos Protena - cidos nucleicos. Cromosomas.Membranas celulares.Protenas y ppticos

Cristales moleculares.Polmeros y biomaterialesComponentes de las membranas de la clula.

Microscopio de barrido efecto tnelForma parte de los instrumentos llamados 'nanoscopios( visualiza objetos del tamao de nanmetros (10 a la menos nueve metros).Inventado en 1981 por G. Binning y H. Rhrer, (IBM, Zurich) (galardonados con el Premio Nobel de Fsica en 1986 por su invencin).

Dispone de una aguja tan afilada que en su extremo slo hay un tomo.La punta se sita sobre el material y se acerca hasta la distancia de 1 nanmetro (10 a la menos 9 metros).Una corriente elctrica dbil genera una diferencia de potencial de 1 voltio. Al recorrer la superficie de la muestra, la aguja reproduce la topografa atmica de la muestra. AplicacionesImgenes atmicas de molculas de ADN.Mover tomos individuales.Mapas precisos de superficies de metales o de semiconductores, cada tomo puede distinguirse de su vecino.

Microscopio estereoscpicoVisin tridimensional de los objetos, para observaciones que requieren pequeos aumentos

3.0 Partes del micoscropio ptico

Partes del microscopio ptico.SISTEMA MECANICOPeBrazoTuboLugar donde se deposita la preparacin.PlatinaBase sobre la que se apoya el microscopio.Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo inferior se adapta al pie. Forma cilndrica En su extremidad superior se colocan los oculares.(Es ennegracido internamnete para evitar los reflejos de luz).

Platina:Presenta un orificio en el eje ptico del tubo que permite el paso de los rayos luminosos a la preparacin,puede ser fija, en cuyo caso permanece inmvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. EscalaPinza

SISTEMA MECANICO

Revlver Pieza giratoria en los cuales se enroscan los objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos .

SISTEMA DE MecnicoTornillo micromtricoTornillo macromtricoFreno.Aproxima el enfoque,permite un enfoque rpido de la preparacin.Se logra el enfoque exacto y ntido de la preparacin Tornillos de enfoque

SISTEMA PTICOOculares:Los oculares estn constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un tubo corto .Objetivos: Producen aumento de las imgenes de los objetos y organismos.Partes del microscopio ptico.Sistema de lentes

SISTEMA PTICOObjetivosPartes del microscopio ptico.Estn colocados en el revolver.Tienen un sistema de amortiguacin.Un anillo coloreado indica los aumentos.Poseen un aumento de 4x, 10x, 40x y 100x aumentos.Sistema de lentes:

SISTEMA PTICOObjetivosPartes del microscopio ptico.Sistema de lentes:Rojo4xAmarillo10xBlanco100x(Inmersin)Azul40xamortiguacin

SISTEMA PTICOPartes del microscopio ptico.Sistema de lentes:Estn colocados en la parte superior del tubo.Poseen un aumento de 10x, 15x y 20x.Oculares

SISTEMA PTICOObjetivosPartes del microscopio ptico.ACEITE DE INMERSINSistema de lentes:Hoy no son de madera de cedro, sino sintticos.Los hay de baja, media y alta viscosidad.Su empleo es imprescindible con el objetivo de inmersin (100x).

SISTEMA PTICOSistema de Iluminacin:Fuente de luzCondensadorPartes del microscopio ptico.DiafragmaLente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

SISTEMA PTICOFuente de luzPartes del microscopio ptico.Suele ser una lmpara halgena de intensidad graduable.Se enciende y apaga con un interruptor.En el exterior puede tener un filtro.Sistema de Iluminacin:lmparaInterruptor graduacin de la luzFiltro

SISTEMA PTICOCondensadorPartes del microscopio ptico.Concentra la luz de la lmpara en un punto de la preparacin.Sistema de Iluminacin:condensadorDiafragma o irisDentro del condensador.Al cerrarse mejora el contraste, pero empeora la resolucin.diafragma

4.0 Pasos a seguir para su uso.

Conectar el microscopio a la corriente elctrica.Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente.(Si se recogio correctamente ya debe estar en esas condiciones).Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. Encender la fuente de luz con la intensidad mnima y se va aumentando poco a poco.Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias.

Pasos a seguir para su uso.

6. Para realizar el enfoque: Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico( Mirando directamente y no a travs del ocular, se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin y daar ambos).

Mirando, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino.

7. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 5.

Pasos a seguir para su uso.

8. Empleo del objetivo de inmersin:

Bajar totalmente la platina.

Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite.

Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de 40x.

Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz.Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin.

Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.

Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

Pasos a seguir para su uso.

Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo.

Finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. Se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin.

Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio. - Apagar el equipo y desconectarlo de la corriente.

AumentoPoder de resolucinLmite de resolucinNmero de campoProfundidad de campoContraste5.0 Parmetros pticos.

Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular.40 x10 x400x5.1 Aumento

Es la capacidad del instrumento para dar imgenes distintas de puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto. Depende de: la long. de onda () y de la apertura numrica (AN).5.2 Poder de resolucinRAN0.61 Es la capacidad de reunin de la luz de objetivo, tambin se encuentra grabada en la manga del lente.

Es la distancia mnima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales.El Lmite de Resolucin es la inversa del Poder de Resolucin, de manera que cuanto mayor sea ste, menor ser el Lmite de Resolucin.5.3 Lmite de resolucinLmite de ResolucinPoder de Resolucin1

Es el dimetro de la imagen observada a travs del ocular, expresado en milmetros.5.4 Nmero de campoEspesor de la preparacin enfocada en cualquier momento.5.5 Profundidad de campo

Diferencia de absorcin de luz entre el objeto y el medioPuede aumentarse con las tinciones.5.6 Contraste

6.0 Mantenimiento del microscopioEl microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran daarlo .( Guardado en estuche, campana y otros).Las partes mecnicas deben limpiarse con un pao suave.( Humedecer el pao con Xilol si se ha trabajado con aceite de inmersin).La limpieza de las partes pticas requiere precauciones especiales. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los dedos.Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posicin ms baja, para evitar que tropiece con alguno de los objetivos .Guardar en lugares secos, para evitar que la humedad favorezca la formacin de hongos. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador).El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular.Mantener seca y limpia la platina del microscopio

7.0 ConclusionesEl Microscopio es: un instrumento que se utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos minsculos o detalles muy pequeos de los mismos. El microscopio simple o lente de aumento es el ms sencillo de todos y consiste en realidad en una lupa que agranda la imagen del objeto observado.Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio.Cada lente hace converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sita cerca del objeto que se quiere estudiar.La imagen es observada por la segunda lente, llamada ocular, que acta sencillamente como una lupa. Zacharias y Hans Janssen construyeron en los aos 1590's el primer microscopio registrado.En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrnico a base de lentes electrostticas.Los virus, y los objetos ms pequeos, como las macromolculas solamente pueden verse a travs del microscopio elctronico.

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