Microscop a de fluorescencia de campo de luz por

Microscopıa de fluorescencia de

campo de luz por iluminacion

estructurada

Nicolas Barbosa Berrıo

Universidad de los Andes

Departamento de fısica

Director: Ph.D. Antonio Manu Forero Shelton

November, 2018

ii

Firma

Director: Antonio Manu Forero Shelton

Indice general

1. Introduccion 1

2. Conceptos de microscopıa 3

2.1. Microscopıa por fluorescencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.2. Microscopıa de hoja de luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.3. Campo de luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.4. Iluminacion estructurada y reconstruccion tridimensional . . . . . . . . 6

2.4.1. Calibracion - Localizar los microlentes . . . . . . . . . . . . . . 6

2.4.2. Calibracion - Profundidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.4.3. Stack - Objeto puntual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.4.4. Light Field - Wide Field . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.4.5. Light Field - Light Sheet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

3. Construccion del microscopio de hoja de luz 15

3.1. Galvanometros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.2. Dispositivos DMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.3. Microscopıa de campo de luz - Deteccion . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

4. Resultados 25

4.1. Galvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

4.2. DMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4.3. Comparacion de las resoluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

4.4. DMD vs Galvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4.4.1. Ventajas Galvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4.4.2. Desventajas Galvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4.4.3. Ventajas DMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4.4.4. Desventajas DMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

iv INDICE GENERAL

4.5. Planes a futuro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5. Conclusiones 43

A. Imagenes de reconstruccion 45

A.1. Galvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

A.1.1. LFWF 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

A.1.2. LFWF 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

A.1.3. LFLS 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

A.1.4. LFLS 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

A.2. DMD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

A.2.1. LFWF 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

A.2.2. LFWF 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

A.2.3. LFLS 1 - 8 espejos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

A.2.4. LFLS 2 - 8 espejos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

A.2.5. LFLS 1 - 20 espejos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

A.2.6. LFLS 2 - 20 espejos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

B. Seguridad optica 57

INDICE GENERAL v

Resumen

El objetivo general es poder visualizar especımenes en fluorescencia hasta una escala

del orden de micrometros como primera instancia y poder tener una escala temporal

muy corta para llegar a ver la dinamica de organismos vivos que se dan en el orden de

milisegundos, como por ejemplo los latidos del corazon de un pez cebra [1]. Se llevara a

cabo haciendo uso del microscopio de hoja de luz el cual tiene una resolucion espacial

alta, pero al tener que hacer un escaneo con los planos obtenidos limita un poco la

resolucion temporal. Tambien se usara el microscopio de campo de luz que tiene una

profundidad de campo mayor en comparacion, y una resolucion temporal alta, pero su

resolucion espacial no es suficiente para visualizar celulas. Combinar estos dos metodos

va a permitir aprovechar una buena resolucion espacial y una resolucion temporal aptas

para la obtencion de la escala celular y la visualizacion de la dinamica de sistemas

biologicos [2], respectivamente.

Primero se toman muestras modelo como pequenas esferas fluorescentes tanto indi-

viduales como muestras densas para poder determinar la escala que se ha conseguido

con el montaje, y despues con estas imagenes hacer una reconstruccion tridimensional

de lo que se captura por campo de luz. Las imagenes captadas en la deteccion se rea-

lizan por la fluorescencia emitida por las muestras, y es capturada por una camara de

adquisicion de imagenes a alta velocidad.

Para lograr la iluminacion estructurada existen dos metodos: el uso de galvanometros

y el uso de microespejos DMD. Este proyecto tiene como finalidad principal poder lograr

la iluminacion estructurada con los dispositivos DMD, para luego poder comparar con

la iluminacion estructurada que se logra por medio del uso de galvanometros. De esta

manera, se podra tambien comparar la reconstruccion que se obtiene en cada uno de

estos metodos e identificar las ventajas y desventajas que tienen los DMD respecto a

los galvanometros.

Abstract

The general objective is to be able to visualize specimens by fluorescence in a millili-

ter scale as a first sight and to get a very small temporal resolution to see the dynamics

of living organisms that happens very close to milliseconds, like the heart beat of a ze-

bra fish [1]. This is going to be achieved by using the light sheet microscope which has

vi INDICE GENERAL

a high spatial resolution, but since it must scan the samples with the obtained planes,

the temporal resolution is affected. Also, a light field microscope is going to be used

which has an extended depth of field in comparison and a high temporal resolution but

fail to deliver a decent spatial resolution. These two methods combined allow to get

notable spatial resolution and enough temporal resolution to get both the cellular scale

and to visualize the dynamics of the biological systems [2], respectively.

First, small fluorescent spheres are going to be used as a model in both individual

and dense samples to determine the scale that is achieved with the experimental setup

and then get a three-dimensional reconstruction of the light field images obtained. These

captured images in the detection side were made by the samples emitted fluorescence,

and it had been captured by a high-speed acquisition camera.

To get structured illumination there are two methods: using galvanometers and using

micromirrors DMD. This project is main focused to get the structured illumination

using the DMD devices, then compare it with the structured illumination that can

be get by using galvanometers. Thus, the three-dimensional reconstruction also can

be compared to identify advantages and disadvantages that the DMD devices have in

contrast with the galvanometers.

CAPITULO 1

Introduccion

El interes cientıfico de ver los objetos pequenos fuera del alcance de la resolucion

del ojo humano es lo que ha hecho que la microscopıa haya podido llegar a ser capaz

de visualizar la dinamica de los organismos vivos en el orden de milisegundos [3]. Sin

embargo, los microscopios sufren de limitaciones que en este caso en particular nos

interesa la relacion entre resolucion temporal y espacial [4]. Hay que tener en cuenta

que la difraccion limita el producto de la resolucion espacial y angular. Los objetos se

ven en una proyeccion ortografica, de manera que solo se ve su proyeccion en un plano

y desde una sola direccion. Ademas de esto, los microscopios tambien tienen muy poca

profundidad de campo. Si bien la primera limitacion es por fısica de la luz, las otras

dependen del diseno del microscopio.

La microscopıa de hoja de luz se ha convertido en una tecnica de mucha utilidad ya

que ha permitido obtener imagenes de la dinamica de sistemas biologicos que antes no

eran posibles, como visualizar especımenes en fluorescencia hasta una escala celular y

la toma de imagenes de organismos vivos. Por las contribuciones hechas fue declarado

por Nature Methods como el “Metodo del ano 2014”[2]. En este metodo de hoja de

luz un haz de laser se modifica opticamente y se convierte en un plano que es referido

como un seccionamiento optico, y ası se ilumina un plano a la vez para ir capturando

la fluorescencia que la muestra emite en esa delgada hoja, que se detecta usando una

camara de alta velocidad [5]. Ademas, la microscopıa de hoja de luz cuenta con una muy

buena resolucion espacial, pero no es ası con la resolucion temporal. Con este metodo se

ha logrado visualizar la actividad neuronal del cerebro de un pez cebra capturando mas

del 80 % de todas sus neuronas con la resolucion de una celula [6], ası como tambien la

2 Introduccion

reconstruccion del embrion de un pez cebra en sus primeras 24 horas de desarrollo [7].

Lo que podrıa ser de particular interes serıa lograr la toma de imagenes en hoja de luz

a altas velocidades.

Por otro lado, se encuentra la microscopıa de campo de luz, la cual en comparacion

con la hoja de luz tiene mas resolucion temporal, a costa de menor resolucion espacial.

Este metodo recoge la informacion de la ubicacion espacial en 2D ası como tambien

el angulo de la luz incidente, gracias a que se ubica un arreglo de microlentes en el

plano imagen de manera que los pixeles de la camara capturen el campo de luz de la

muestra [8]. Hay que tener en cuenta ademas que un microscopio de campo de luz por

iluminacion de hoja de luz requiere analizar las imagenes que se capturan para mejorar

la resolucion de estas. En el trabajo hecho por Marc Levoy et. al. [4] usan campo de

luz y logran hacer reconstruccion volumetrica para varias muestras biologicas, como el

pulmon de un embrion de raton, la boca de gusanos de seda, entre otras.

En este proyecto en particular, se combinara el uso de campo de luz con ilumi-

nacion por hoja de luz que ademas utilizara iluminacion estructurada gracias a los

dispositivos DMDs (digital micromirror device), los cuales se han usado por Dan et.

al. [9] para super resolucion sobre nano partıculas de oro (80nm de diametro) para

poder tener franjas definidas, y donde ademas llevaron a cabo la iluminacion por LED

(con baja coherencia); y tambien por Nadya et. al. [10] que iluminaron celulas BPAE

(celulas endoteliales de la arteria pulmonar bovina) usando DMDs y luego haciendo la

reconstruccion digitalmente.

Este proyecto ademas da la posibilidad de hacer a largo plazo reconstrucciones de

sistemas mas complejos. En el artıculo de Mickoleit et. al. [11] ellos logran crear un

fantoma de corazon “phantom heart”en el sentido en que replica los datos originales

de un corazon tales como la geometrıa, la dinamica temporal y el ruido que este tiene.

Allı modelaron este corazon como un cilindro conico, cuyas medidas fueron 225µm de

longitud, con 50µm de radio de entrada y 29µm de radio de salida. Ellos mismos lograron

hacer la reconstruccion del corazon de un pez cebra con el mismo tipo de iluminacion,

pero sus reconstrucciones, aunque con alta resolucion, fueron estaticas ya que usaron

optogenetica para detener brevemente el corazon y poder adquirir las imagenes.

CAPITULO 2

Conceptos de microscopıa

Para entender lo que se quiere lograr con este proyecto, hay algunos conceptos que se

abarcaran en este capıtulo. Esto va desde los conceptos de microscopıa por fluorescencia,

microscopıa por hoja de luz, por campo de luz y tambien algunas de las diferencias mas

importantes con otros metodos de hacer microscopıa comparados con los que se estan

usando en este proyecto.

2.1. Microscopıa por fluorescencia

La fluorescencia ocurre como resultado de un proceso de respuesta a un estımulo a

un fluoroforo en una determinada region de un objeto o especimen biologico. El estımulo

esta dado por un foton que puede provenir de alguna fuente lumınica como un laser, una

lampara incandescente, entre otros; y este foton hace que la energıa de los electrones

del estados base del elemento en el que estan incidiendo suban a un estado excitado

en el que duran entre 1 y 10 nanosegundos, para luego emitir la energıa de ese estado

excitado en forma de otro foton [12, 13, 14]. Este foton emitido tiene una energıa menor

que el foton original, y esto es algo clave para la microscopıa ya que se busca separar

la luz de excitacion de la fluorescencia emitida, y al ser una energıa menor la longitud

de onda es distinta y se puede conseguir entonces la separacion con el uso de un espejo

dicroico.

4 Conceptos de microscopıa

Figura 2.1: Formacion de la hoja de luz desde una vista superior (plano xz) en la quese ve la convergencia del haz a una lınea delgada. Imagen tomada y adaptada de [15]

2.2. Microscopıa de hoja de luz

La hoja de luz es la iluminacion de un plano que se obtiene a partir de modificar

opticamente un haz de luz para que la luz se colime en el plano xy (generalmente es

la vista lateral) pero converja en el plano xz (vista superior). En la figura 2.1 se puede

ver esta situacion desde la vista superior, que vendrıa siendo el plano xz. Aquı se nos

muestra que el haz converge y llega a tener una seccion muy delgada con la que se

ilumina la muestra por secciones. Esto es un seccionamiento optico que permite que

solo un plano de la muestra a la vez sea el que se esta iluminando. El hecho de que

solo un plano se este iluminando en la microscopıa de hoja de luz tiene una ventaja

inmediata respecto a la microscopıa confocal, o en general la microscopıa convencional,

puesto que en estas se ilumina toda la muestra y los fluoroforos de la muestra estan

en constante exposicion a la luz, lo que genera dano por exposicion o blanqueamiento

de las muestras (en ingles, photodamage y bleaching), en cambio en hoja de luz los

fluoroforos de la muestra fuera del plano focal de deteccion estan tambien fuera del

plano iluminado, por lo que no seran danados o blanqueados [15].

2.3. CAMPO DE LUZ 5

2.3. Campo de luz

En la microscopıa tradicional se tiene la muestra, un objetivo y un sensor o camara

para capturar la luz que emite la muestra. En campo de luz en cambio, entre el objetivo

y el sensor deben ir ubicados unos microlentes, justamente en el plano imagen del

objetivo. Estos microlentes son un arreglo de lentes diminutos, de 100 × 100µm de

dimension cada uno, en los cuales al proyectarse el plano imagen del objetivo se tendra

mas informacion de la que se podrıa obtener con una proyeccion ortografica como se

verıa en un microscopio tradicional. Cuando la muestra es un objeto puntual, la luz

emitida por esta va a llegar sobre un solo microlente. Sin embargo, si la muestra es

un objeto con una dimension y volumen mas estructurado entonces varios microlentes

van a recibir la luz que la muestra esta emitiendo, de manera que los rayos que llegan

a cada microlente tienen informacion de intensidad y de la direccion en la que esta

siendo emitida esta luz. Esto esta directamente relacionado con lo que se conoce como

la funcion plenoptica:

P (θ, φ, λ, t, Vx, Vy, Vz) (2.1)

Esta funcion describe por cada variable un parametro de los rayos de la luz que

puede dar informacion completa del objeto que los esta emitiendo. θ, φ son parametros

de intensidad de la luz vistos desde un mismo punto, al mismo tiempo y promediados

sobre las longitudes de onda del espectro visible. λ hace referencia a la longitud de onda

recibida. La variable t indica que la funcion depende del tiempo. Las variables Vx, Vy y

Vz nos dan la informacion sobre diferentes puntos de perspectiva. En otras palabras, la

funcion plenoptica reconstruye cada posible perspectiva o punto de vista en cualquier

momento, sobre cualquier posicion y con cualquier longitud de onda [16].

Gracias a la cantidad de informacion que podemos obtener de la ecuacion 2.1 y

a un software que fue desarrollado en otro proyecto, es que se logra obtener una re-

construccion tridimensional de los objetos que se estan viendo con una camara y que

aparentemente solo se ven en dos dimensiones. El detalle de la reconstruccion y todos los

parametros necesarios para llevar a cabo una reconstruccion se describe en la siguiente

seccion.


Figura 2.2: Celda llena de agua con marcador fluorescente, usado para la calibracion dela ubicacion de los microlentes

2.4. Iluminacion estructurada y reconstruccion tri-

dimensional

Para poder llegar a obtener una reconstruccion tridimensional de la muestra que

se este analizando, es necesario seguir ciertas pautas que vamos a ordenar en esta

seccion de manera que sean pasos metodicos de seguir y ası lograr la obtencion de

la imagen reconstruida tridimensionalmente. Se usara el programa de reconstruccion

desarrollado por Diego Castro en su proyecto de maestrıa que usa Matlab para realizar

las reconstrucciones.

2.4.1. Calibracion - Localizar los microlentes

El programa necesita saber la ubicacion exacta de los microlentes. Es por esto que

cada vez que se van a tomar imagenes es necesaria una imagen de calibracion que se

realiza llenando la celda con agua y luego dejando caer un poco de marcador fluores-

cente, el cual permite que el haz del laser se vea sobre el agua como se puede ver en la

figura 2.2.

2.4. ILUMINACION ESTRUCTURADA Y RECONSTRUCCION TRIDIMENSIONAL 7

Figura 2.3: Imagen de calibracion de los microlentes tomada con la camara Orca Flash4.0 Hamamatsu

Esta imagen, como se esta iluminando con un laser de 480nm, el espejo dicroico que

se esta usando refleja por debajo de 540nm, y la reflexion es justamente el camino del

campo de luz, que es donde estan ubicados los microlentes, hacia donde esta ubicada la

camara Orca Flash 4.0 Hamamatsu, y precisamente esta imagen solo se toma con esta

camara, y la imagen obtenida se puede ver en la figura 2.3.

Con la imagen obtenida podemos analizar si los microlentes son correctamente de-

tectados por el software. Esta imagen de calibracion es muy importante para la recons-

truccion tridimensional. Los microlentes que fueron correctamente detectados estan

marcados en rojo en la figura 2.4. Como podemos ver en esta, hay una region hacia el

lado derecho que no esta siendo detectada correctamente, pero por la forma en que fue

montada la camara en realidad esta seccion corresponde a la parte baja de los micro-

lentes. Esto puede deberse a una parte de la alineacion en la deteccion en la que los

microlentes o el lente de relevo no estan correctamente ubicados a la altura que deberıa

ser o con una pequena inclinacion indeseada, o incluso que el haz de iluminacion en esta

parte de la deteccion no esta llegando como deberıa a alguno de los elementos opticos.


Figura 2.4: Cırculos rojos representan los microlentes detectados correctamente por elsoftware de reconstruccion.

2.4.2. Calibracion - Profundidad

Otro tipo de calibracion necesaria para el software de reconstruccion es la calibracion

de profundidad. Esta es necesaria para que al programa se le facilite el reenfoque digital

de imagenes al saber como se ven los objetos a cierta profundidad, que es una distancia

determinada medida desde el plano focal para el objeto. En el trabajo realizado por

Edmund Y. Lam en su artıculo Computational photography with plenoptic camera and

light field capture: tutorial [17], se explica que entre dos planos (x) y (u) que estan

separados a una distancia Z, se puede encontrar un plano entre ellos llamado (x′) que

esta a una distancia αZ, como se puede ver en la figura 2.5. Esta calibracion entonces

sera util para poder determinar el factor α descrito, el cual permite entonces determinar

a partir de diferentes profundidades cual deberıa ser el mejor factor de reenfoque.

Para realizar este tipo de calibracion, basta con tener 3 imagenes (aunque entre mas

imagenes se tenga se determina mejor el factor de reenfoque) de la siguiente manera:

para una micro esfera de poliestireno fluorescente de 1µm de diametro se busca el foco,

de manera que se vea lo mas pequena e intensa posible, y se toma la imagen en campo

de luz (con la camara Hamamatsu). Despues de esto, la muestra se debe mover una


Figura 2.5: Imagen de los planos (x) y (u), en los que se quiere reenfocar en un plano(x′) por un factor α. Imagen tomada de [17]

distancia especifica hacia adelante del foco y otra distancia hacia atras del foco; esto se

hace con el uso del micromanipulador, que permite mover las muestras conectadas al

capilar y el paso mınimo que puede dar el micromanipulador es de 250nm. En la figura

2.6 se ve la representacion de esta situacion, donde la imagen de la mitad es la imagen

tomada en el foco del objeto puntual, y las otras dos imagenes son los planos a dos

distancias escogidas fuera del plano focal.

Las distancias escogidas para hacer esta calibracion fueron de 10µm, de manera que

si tomamos como referencia cuando la micro esfera esta totalmente enfocada, estamos

tomando una imagen a −10µm y a +10µm.

2.4.3. Stack - Objeto puntual

La captura de imagenes haciendo un stack no es algo que se tenga que hacer cada

vez que se van a utilizar muestras, o cada vez que se va a comenzar un experimento,

por lo tanto no hace parte de las calibraciones de rutina pero sı se logra calibrar algo

con esto y es el tamano de la hoja de luz. Sin embargo, esta solo se modifica si se hace

algun cambio en el camino de iluminacion, y es por esto que no se hace tan seguido.

Para realizar un stack se deben seguir pasos similares a los de la calibracion de

profundidad que se mencionaron anteriormente, pues para la micro esfera fluorescente

se tomaron 3 imagenes: −30µm, 0 (en foco) y +30µm. En este caso se necesita hacer

toma de imagenes en la proyeccion ortografica, es decir con la camara Blackfly, pero las

imagenes tomadas se hacen cada distancia mınima que puede dar el micromanipulador,

que corresponde a 250nm. Por supuesto, un recorrido cada esa distancia en nanometros


-x +x 0

Figura 2.6: Tres planos en los que se toma una imagen para obtener una calibracion yel factor de reenfoque. 0 corresponde al plano focal.

es un recorrido amplio en micrometros, de manera que en general al hacer un stack se

obtienen alrededor de 100 imagenes en las que se ve claramente todo el recorrido de la

micro esfera fluorescente, desde un punto donde se ve muy grande que es cuando esta

desenfocada (por ejemplo, cuando esta en −30µm), para ir enfocandose y llegar a verse

como un objeto puntual (0µm), hasta cuando nuevamente se desenfoca y vuelve a verse

un objeto grande (+30µm). Se puede imaginar esto como un cono, y justamente es lo

que se obtiene, como se vera en seguida.

Con las imagenes obtenidas, y con ayuda de FIJI, el programa de codigo abierto que

se usa para el analisis de imagenes cientıficas, podemos enfocarnos en una seccion de

las imagenes en donde se encuentra la micro esfera para luego unir todas las imagenes

que se obtuvieron en dicha region y ası ver que se forma una especie de cono, como se

puede ver en la figura 2.7. Para esta imagen se puede realizar una grafica del perfil de

intensidad y aquı mirar el ancho de esta grafica en su punto medio, lo que se conoce

en ingles como Full Width at Half Maximum (FWHM). Esto nos da el rango de niveles

por encima de la mitad del maximo de la intensidad, lo que nos indica el intervalo en

donde la micro esfera recibio mayor cantidad de luz, que va a ser justo en la region

donde se ubicaba la hoja de luz.


Figura 2.7: Stack de 1 micro esfera de poliestireno fluorescente uniendo las imagenescon FIJI

2.4.4. Light Field - Wide Field

En esta seccion, a diferencia de todas las demas, se necesita tomar unicamente una

sola imagen. El concepto de Light Field - Wide Field hace referencia la iluminacion por

hoja de luz en un campo amplio, es decir que la hoja de luz no va a estar iluminando

solamente un plano sino todo el rango del que dispone que depende de los galvos. Estos

galvos son unos espejos que gracias a un voltaje aplicado por medio de una FPGA giran

un cierto angulo y se mantienen en este hasta que se aplique un voltaje diferente. La

FPGA se controla desde el computador por un software desarrollado en LabView que

permite que los galvos se muevan en un intervalo de 40◦ variando entre los angulos desde

−20◦ hasta 20◦. Tambien permite ajustar el paso que se quiere hacer entre angulos y el

intervalo de tiempo de espera entre un angulo y el siguiente.

Como se menciono anteriormente, las imagenes que se toman aca deben ser con

todo el rango disponible. La forma de lograrlo es configurar el programa que mueve los

galvos para que haga pasos grandes (permite maximo de a 5◦) y que el intervalo de

tiempo sea muy corto (por ejemplo 10ms). Se configura tambien para que haga unas

200 repeticiones para ası mantener los galvos moviendose de un lado al otro muy rapido

en todo el rango que les es posible, de manera que las muestras que vayan a estar en

las celdas van a tener una iluminacion en un campo amplio y completa, para que ası

la camara vea como si se estuviera iluminando completamente la celda con un haz que


llene en la totalidad la pupila de los objetivos.

Si la toma de estas imagenes se realiza con el DMD, lo unico que hay que hacer

es poner todos los espejos encendidos para que toda la luz que les esta llegando a

estos dispositivos se refleje sobre la muestra, y como estos dispositivos tienen unas

dimensiones de 15mm por 21mm, lo que es suficiente para llenar la pupila trasera del

objetivo e iluminar la muestra en su totalidad.

2.4.5. Light Field - Light Sheet

L

Figura 2.8: Iluminacion estructurada por franjas. ` corresponde al tamano de la hojade luz, y L al rango total en el que se va a analizar la imagen.

Finalmente, se obtienen imagenes de iluminacion estructurada por franjas. La idea

general es iluminar diferentes secciones en un rango amplio de la imagen con franjas del

grosor de la hoja de luz. En la imagen 2.8 se puede ver la representacion esquematica

de esta iluminacion, pues para un objeto (o varios) que tiene una profundidad L, se

puede iluminar en diferentes secciones con franjas determinadas, las cuales van a tener

un grosor ` que corresponde al tamano de la hoja de luz. La obtencion de una imagen

con la iluminacion de esta primera seccion de la muestra nos brinda informacion de las

franjas que fueron iluminadas en esta, y por supuesto la informacion faltante es necesaria

conseguirla desplazando las franjas y capturando una nueva imagen con las franjas en

esta siguiente posicion. En la figura 2.9 se puede ver la representacion esquematica de lo

que se acaba de describir, en donde las franjas se deben ir desplazando hasta completar

toda la imagen para poder obtener informacion completa para la muestra que se este

analizando.


Para este tipo de imagenes es donde tiene sentido haber conseguido una calibracion

de la profundidad que se menciono anteriormente en este capıtulo. Recordemos que

la muestra que se esta viendo en las figuras 2.8 y 2.9 en realidad es una muestra

tridimensional y estas figuras estan representando su profundidad, ası que el software

que va a hacer la reconstruccion necesita saber a que distancia se estan tomando las

franjas pero previamente necesita conocer cual es el factor de reenfoque que se va a

usar dependiendo de las diferentes profundidades que tiene cada una de las franjas en

las imagenes.

Figura 2.9: Iluminacion estructurada por franjas


Conseguir esta iluminacion con el uso de galvos es gracias al software de LabView

que permite mover estos dispositivos. Una calibracion previa es necesaria para saber

cuanto es 1◦ de los galvos y su equivalencia en desplazamiento dado en micras sobre la

muestra. Ası, se puede ajustar que el galvo de saltos e ilumine solo ciertas regiones para

poder hacer las franjas descritas y que oscile entre estas para que sean solo esas regiones

las que tienen una mayor intensidad de iluminacion. Con la camara, se debe ajustar una

exposicion suficientemente larga para que se vea que se iluminaron diferentes secciones

y a diferentes profundidades. Toda esta informacion debe ser captada por la camara

para luego configurar las siguientes franjas y repetir el proceso.

Figura 2.10: Modelo de imagen para cargar al DMD y tener la iluminacion estructuradapor franjas

Si se realiza esta iluminacion estructurada por franjas con el uso de los dispositivos

DMD, es mucho mas sencillo en el sentido de que solo es cargar una imagen al DMD

que tenga franjas definidas. En la figura 2.10 se puede ver que tipo de imagen es la que

se necesita, que son lıneas blancas y negras de cierto grosor definido en donde lo blanco

seran los espejos encendidos y lo negro los espejos apagados. Por supuesto, la imagen

que se carga no tiene el grosor que se esta viendo en la figura 2.10 puesto que 1 pixel

corresponde a 1 micro espejo y estos miden 7, 56µm. La imagen que se usa para cargar

es entonces con franjas blancas de un grosor mucho menor al que se esta visualizando

en este documento.

CAPITULO 3

Construccion del microscopio de hoja de

luz

En este capıtulo se quiere dar a conocer los metodos de construir un microscopio

de hoja de luz que se usaron para el proyecto. Ademas se quiere tambien dar una

explicacion acerca del campo de luz, que es el metodo que se usara para detectar

imagenes y ası lograr reconstruirlas.

Microscopıa de hoja de luz

En este proyecto se trabajaron dos metodos para crear la hoja de luz. El primero

es haciendo uso de galvanometros, los cuales por medio de un voltaje, hacıan girar

unos espejos pequenos, y estos permitıan tener una funcion de voltaje contra angulo. El

segundo metodo es haciendo uso de los dispositivos DMD, los cuales son un arreglo de

espejos que permiten encenderse independientemente con tan solo cargar una imagen

a estos por medio de un programa que el mismo fabricante facilita para su respectivo

uso.

3.1. Galvanometros

En el montaje experimental se uso un Laser Oxxius de 488nm de longitud de onda.

Este laser tiene un diametro de 2mm, lo cual es un diametro demasiado pequeno para la

iluminacion de las muestras que se usaran. Primero que todo el haz debe estar alineado

16 Construccion del microscopio de hoja de luz

en todo el camino de la iluminacion hasta donde se deberıan ubicar las muestras. En la

figura 3.1 se puede ver esquematicamente que es el camino que se desea seguir con el

laser.

Figura 3.1: Esquema del montaje experimental de la iluminacion

Para la alineacion del laser primero se deben cuadrar las alturas de algunos iris a

la deseada, que para este montaje esta determinada por la base en que se monta el

laser, la cual le otorga una altura al haz de 91,4mm. Los iris son elementos opticos que

permiten ajustar su apertura desde 1,3mm hasta 36mm, dependiendo del fabricante y

del tipo de iris que se use. El intervalo de apertura mencionada corresponde a los tipos

de iris que se usaron en el laboratorio para este proyecto.

Se deben poner entre uno y dos iris para lograr trazar la lınea que se desea, y la

cantidad necesaria va a depender de si el camino del haz es muy amplio. Con estos se

logra hacer que el laser no se desvıe en ninguna direccion sino que siga una lınea recta

guiada por los huecos de la mesa; en especial, se quiere evitar que se desvıe cuando

se hace pasar por elementos opticos como lente y espejos. Esto se logra viendo que el

haz esta pasando de manera satisfactoria por los dos iris que se ubicaron a distancias

considerables. Si es necesario, un medidor de potencia optica puede ser requerido para

optimizar y conseguir el maximo de intensidad al cuadrar los espejos.

Se debe hacer que el haz del laser viaje desde su fuente hasta el punto de iluminacion

de la muestra, que estara ubicado despues del objetivo de 10X que esta en la figura ??,

3.1. GALVANOMETROS 17

en la que se puede ademas observar que hay varios espejos montados. La lınea recta

del haz desde el laser hasta despues del objetivo 10X se debe lograr solamente con

los espejos. Una parte complicada de esta alineacion fue el uso de los galvanometros.

Estos son unos espejos conectados a un motor que permiten darle un cierto angulo

dependiendo del voltaje que se les aplique. Ademas, por la forma en que estan hechos,

estos galvos le dan un poco de altura al haz original, con lo que de 91,4cm pasamos

a tener 95,1cm. Buscar el voltaje necesario para que el haz siguiera en lınea recta a

pesar de haber cambiado de altura fue lo que mas trabajo costaba en esta parte de la

alineacion. Una vez lograda la alineacion de esta manera, se dejan los iris que se usaron

en cada lınea y se procede a montar los lentes que se van a usar, uno por uno, esto con

el fin de que al montar un lente se mantenga la alineacion ya que podrıan desviar el

haz por estar mal posicionados o rotados ligeramente. Ası se controla que el haz no se

este desviando y en dado caso se puede ir haciendo las correcciones pertinentes.

Especıficamente, lo primero que se hizo despues de tener la alineacion de solo espejos

fue que se procedio a aumentar el tamano del haz de manera que toco recurrir a lo que

se conoce como un expansor de haz, Beam expander en ingles. El Beam expander se

construye a partir de la teorıa de optica geometrica de un telescopio [18]:

M =f2f1. (3.1)

Se usaron dos lentes plano convexos posicionados con sus caras planas enfrentadas,

como se puede ver en la figura 3.2. Para lograr la magnificacion, primero debe estar el

lente con la distancia focal corta, que en este caso se uso un lente de f = 8mm. Y el

segundo lente tiene que ser de una distancia focal mayor, que en este caso se uso una

distancia focal de f = 40mm; esto con el fin de que la ecuacion de magnificacion ((3.1))

sea de aumento (mayor a 1). Ası que, de acuerdo con esta ecuacion, la magnificacion

obtenida para este caso deberıa ser de 5, y ademas el haz sale colimado (ver figura

3.2) Por supuesto, se iba verificando que al montar este Beam Expander no se hubiera

danado la alineacion inicial, y en dado caso corregirla.

Para la obtencion de una hoja de luz, el elemento esencial en el montaje es el lente

cilındrico. Este tipo de lentes tiene una cara similar a la forma de un cilindro, de manera

que si se mira desde una perspectiva es convexo, mientras que si se gira 90◦ se ve recto.

Este lente debe estar montado como se ve en la figura 3.3 que muestra esquemati-

camente la optica geometrica que se cumple aquı. La idea del montaje es que desde la


Figura 3.2: El haz entra por el lado A., y sale magnificado por el lado C. El punto B.es donde coincide el plano focal de ambos lentes.

Figura 3.3: Esquema de la optica geometrica con los elementos usados en este montajeexperimental. a) Vista desde arriba en la que el lente cilındrico permite que la colimaciondel haz continue. b) Vista lateral en donde el lente cilındrico hace que el haz converja.

3.2. DISPOSITIVOS DMD 19

Figura 3.4: Imagen de hoja de luz. Iluminacion: camino azul. Deteccion: camino verde.Tomada de [19]

perspectiva de arriba (3.3 a)) el haz que llega al lente siga colimado como venıa, luego

pase por el fθ y el lente de tubo de 250mm consiguiendo una magnificacion de 4,15, y

por ultimo converja despues de haber pasado por el objetivo 10X.

Cambiando la perspectiva por la vista lateral (3.3 b)), el lente cilındrico se va a

ver convexo, de manera que va a hacer que el haz converja y tenga una magnificacion

de 1,206, para luego formar otro telescopio con el lente de tubo y el objetivo 10X,

cuya magnificacion es 0,08, para que finalmente despues de por el objetivo 10X salga

colimado de este. Como se dijo inicialmente, el objetivo de construir un microscopio de

hoja de luz requiere que visto desde arriba se vea que el haz converge, ya que esto estarıa

determinando el grosor de lo que ahora llamaremos nuestra hoja de luz, mientras que si

se colima en la vista lateral se obtiene un plano. Para ilustrar mejor esta situacion, nos

remitimos a la figura 3.4, que es una de las imagenes que usan Huisken y Stainier [19]. En

esta podemos observar la hoja que ilumina una muestra en un capilar, y se ve claro que

las muestras estarıan siendo iluminadas en un solo plano y que el objetivo de deteccion

verıa justamente la parte mas delgada. Esto tambien se conoce como seccionamiento

optico.

3.2. Dispositivos DMD

Una diferencia fundamental de la iluminacion realizada con los DMD respecto a

los galvanometros es que estos ultimos permiten la iluminacion de un solo plano a la

vez como se vio en la figura 3.4, pero si se quieren iluminar varios planos los galvos se

deben poner a mover mediante software para lograr lo que se conoce como iluminacion

estructurada. Sumado a esto, la camara debe tener un tiempo de exposicion mayor para

poder captar todos los planos iluminados que se consiguen con el movimiento de los


galvos.

La idea fundamental de esta seccion es buscar la iluminacion estructurada de varios

planos a la vez sin necesidad de tener una mayor exposicion ni de tener que desarrollar

un software complejo para tal fin. Aquı es donde entran en juego los microespejos DMD

(Digital Micromirror Device). Estos dispositivos son un arreglo de microespejos que se

pueden orientar individualmente para que la luz que les incide se refleje solo con los

espejos que se hayan escogido. En otras palabras, si con los espejos se escoge formar

cualquier figura (cuadrado, lınea, cırculo), la luz reflejada deberıa formar en principio

exactamente la misma figura. En particular, se usa el DMD formando franjas de lıneas

verticales.

Los dispositivos DMD se han usado por Dan et. al. [9] en super resolucion sobre

nano partıculas de oro (80nm de diametro) para poder tener franjas definidas, y don-

de ademas llevaron a cabo la iluminacion por LED (con baja coherencia); y tambien

por Nadya et. al. [10] que iluminaron celulas BPAE (celulas endoteliales de la arteria

pulmonar bovina) usando DMDs y luego hicieron la reconstruccion digitalmente.

DMD

Lente de tubo

f = 400mmObjetivo 10X

NA = 0.25

LED

Filtro pasa bandas

H

h

Objetivo 60X

NA = 1.1

Muestra

Figura 3.5: Vista lateral del esquema del montaje experimental con alturas de H =118,5mm y h = 95,5mm.

Para usar los DMD, el esquema del montaje experimental implementado se puede

ver en las figuras 3.5 y 3.6, que es la forma en que el microscopio de hoja de luz debe ser

montado. Se comienza con un LED que ilumina en un intervalo amplio (comparado con

un laser) desde 405nm hasta 505nm aproximadamente. Al frente de este debe ir un filtro

3.2. DISPOSITIVOS DMD 21

pasa bandas que hace que el intervalo de iluminacion se reduzca considerablemente, de

manera que solo ilumina entre 483nm y 493nm. Despues el haz va a ir hacia un espejo

que hara reducir la altura a la que estaba originalmente, y de este espejo llegara al

dispositivo DMD. Como se puede ver en la figura 3.5, hasta el espejo todo corresponde

a una altura H = 118,5mm.

Objetivo 10X

NA = 0.25

Lente de tubo

f=400mm

Muestra

LED

Filtro pasa bandasDMD

Espejo

Figura 3.6: Vista superior del esquema del montaje experimental de la iluminacion conlos DMD

Con respecto al DMD, este debe estar montado en un soporte que se solicito fabricar

en el taller de mecanica de la universidad, y ademas debe estar totalmente vertical. La

luz incidente que llega a este dispositivo debe estar a un angulo de ϕ = 45◦ respecto

a la vertical del DMD como se ve en la figura 3.7a), y esta a su vez debe estar a un

angulo de θ = 24◦ respecto a la normal de los microespejos como se puede ver en la

figura 3.7b); esto para que la luz que se refleja vaya justamente en la direccion de la

normal [20], ya que estas son las condiciones que el fabricante impone para asegurar la

maxima reflexion posible en estos dispositivos, que corresponde a un 88 % de reflexion

de la luz incidente. Como se menciono antes, el haz consigue una nueva altura y esa

nueva altura h es igual a 95,5mm que no cambia mas en todo el montaje y que ademas

corresponde a una altura muy cercana a la conseguida gracias a los galvanometros, en la

que su diferencia no va a ser apreciable pues los DMD iluminan una region mas amplia

y la altura mencionada es solo la altura de su centro.


a)

DMD

b)

Espejoφ

h

θφ

Figura 3.7: a) Vista frontal del DMD en el que se incide la luz a un angulo de ϕ = 45◦

respecto a la vertical b) Vista diagonal del DMD en el que se evidencia que ademasdebe haber un angulo θ = 24◦ respecto a la normal del DMD

3.3. Microscopıa de campo de luz - Deteccion

Para la parte de la deteccion se puede ver esquematicamente el montaje que se llevo

a cabo en la figura 3.8. Como se puede ver, se hace uso de dos camaras: Hamamatsu y

BlackFly (BF), esto para poder ver secciones de campo de luz y ortograficas, respecti-

vamente. La forma en que se separan los caminos es usando un espejo dicroico, el cual

permite transmitir parte de la fluorescencia de la muestra hacia la camara BlackFly

cuya longitud de onda λ > 560nm es apenas la cola del espectro de emision de la

fluorescencia verde que emiten las muestras, mientras que la gran mayorıa de la fluo-

rescencia se emite en λ < 560nm y esta es la longitud de onda que se refleja y que es

util para la deteccion por campo de luz (usando la camara Hamamatsu).

En la deteccion, los otros elementos que no se habıan usado eran los microlentes y

el lente de relevo. Los microlentes son un arreglo de lentes con una distancia focal de

2000µm, que es bastante pequena, y que lo ideal es que el lente de f = 150mm que esta

antes de ellos, logren hacer imagen sobre estos para que se iluminen diferentes secciones

de ellos para que tengamos una informacion extra que con otros lentes no tendrıamos,

como el angulo que da cierta perspectiva para la imagen dos dimensional que se esta

transmitiendo al camino de deteccion. Al ser una distancia tan corta, los microlentes

3.3. MICROSCOPIA DE CAMPO DE LUZ - DETECCION 23

Figura 3.8: Esquema del montaje experimental de la deteccion

idealmente deberıan tener su plano imagen en el sensor de la camara Hamamatsu,

pero estos sensores generalmente estan mas adentro que la distancia focal tan corta

que manejan los microlentes. La solucion es el lente de relevo, que logra transportar el

plano imagen de los microlentes al sensor de la camara y que ademas no tiene ninguna

magnificacion ni nada por el estilo.

El lente de relevo esta montado con un tubo sobre la camara, de manera que no es

probable que la altura no sea la adecuada, aunque no se descarta que tenga una ligera

inclinacion sobre el tubo en el que esta montado. Por otro lado, los microlentes estan

ubicados sobre una montura 6-Axis Locking Kinematic Optic Mount de ThorLabs la

cual cuenta con 6 grados de libertad para ser ajustado, por lo que los microlentes son

bastante susceptibles a orientacion, inclinacion y posicion.


CAPITULO 4

Resultados

Las imagenes obtenidas tanto por galvos como por DMD se analizan para ver si es

posible llevar a cabo su reconstruccion y tambien ver lo fiable que resultan las recons-

trucciones hechas en esta seccion.

Los problemas presentados durante este proyecto estan relacionados con el montaje

optico que se requerıa. La alineacion del haz de iluminacion es de vital importancia para

evitar cualquier desviacion del haz o incluso aberracion sobre las imagenes ya que esto

afecta demasiado en el momento en que las reconstrucciones se van a llevar a cabo. Si

se tenıa aberracion, se veıa en la camara en el momento de capturar las imagenes, que

estas no eran las mejores imagenes, pues solamente con una micro esfera fluorescente se

podıa observar que la iluminacion no era uniforme o que cuando salıan del plano focal

no salıan viendose isotropicas, lo que indicaba que algo estaba mal.

Las muestras utilizadas como objetos modelo eran micro esferas de poliestireno fluo-

rescentes de 1µm de diametro, las cuales fluorescen cuando se iluminan con luz verde

(aproximadamente 480nm de longitud de onda). Estas eran diluidas en una concentra-

cion de agarosa preparada al 1 % (por 10mg de agar, se usa 1mL de agua destilada).

La concentracion usada de micro esferas fluorescentes correspondıa a 2µL por 1,5mL

de agar si se querıa una muestra en la que se pueda encontrar una sola microesfera en

un plano, o a 20µL por 1,5mL de agar si se querıa una muestra muy densa de micro

esferas, de manera que en practicamente cualquier region del agar que se analizara se

verıan siempre al menos 3 micro esferas fluoresciendo, aunque no necesariamente en

los mismos planos. Para preparar el agar con las micro esferas ademas era necesario

calentarlo hasta los 80◦C que corresponden a la temperatura de su punto de fusion, que

26 Resultados

cuando se enfrıa se “gelifica” de manera que va a tener una consistencia suficientemente

dura para que pueda mantenerse dentro de un tubo capilar. En esta parte habıa que

tener especial cuidado con la preparacion del agar pues la concentracion al 1 % es muy

importante para que no quede muy aguado ni muy solido, sino que se logre la consis-

tencia gelatinosa con la que es adecuado trabajar. El tubo capilar se montaba luego en

uno de los soportes del micromanipulador y ası es que las muestras se podıan mover

con la precision otorgada por el micromanipulador.

Para realizar las reconstrucciones retomamos entonces lo que se describio en el

capıtulo 2 que son los siguientes requisitos:

1. Calibracion para localizar los microlentes

2. Calibracion para profundidad

3. Stack de un objeto puntual

4. Imagenes en Light Field - Wide Field

5. Imagenes en Light Field - Light Sheet

4.1. Galvos

Calibracion - Equivalencia entre micras y grados

Sabiendo que los galvos se ajustan mediante un voltaje, fue necesario encontrar el

voltaje para alinear el haz de luz de manera que la luz siguiera una lınea recta como se

describio en el capıtulo 3. Sin embargo, tambien era necesario saber que tanta distancia

se podrıa mover el haz para cuando se deseara iluminar alguna otra region. Para esto,

fue necesario ubicar una camara directamente al frente del objetivo 10X montada sobre

un tornillo micrometrico de manera que se pudiera desplazar en el eje de propagacion

del haz y de manera fina para localizar el punto donde se veıa la hoja de luz (una lınea)

sobre la camara. Fue necesario un filtro de densidad neutra para disminuir la intensidad

del haz y que no fuera nocivo para el sensor de la camara.

Una vez obtenida la lınea, se procedıa a capturar la imagen. Despues se podıa mover

los galvos cierta cantidad de grados con el software necesario para tal fin capturando

siempre las imagenes para ver la nueva posicion de la lınea, y para tener un mejor valor

se tomaron imagenes de lıneas en 5 posiciones. Por ultimo, un programa sencillo de

matlab ubicaba las posiciones en pixeles de las imagenes en donde habıa un maximo

4.1. GALVOS 27

de intensidad, y despues realizaba una regresion lineal para ası, con los parametros

adecuados de los tamanos de los pixeles (3,45µm para la BlackFly que se uso ahı),

obtener la equivalencia entre micras y grados. Este valor obtenido fue:

1◦ = 50, 98µm (4.1)

Calibracion para localizar los microlentes

Como se menciono en el capıtulo 2, se requerıa una imagen para que el programa de

reconstruccion tuviera la ubicacion de los microlentes. En la figura 4.1 se puede ver las

imagenes obtenidas para esta parte de la calibracion, donde a la derecha es la imagen

obtenida por la camara Hamamatsu y a la izquierda en rojo se indican los microlentes

que han sido detectados satisfactoriamente por el software de reconstruccion que si bien

no detecto todos los microlentes correctamente, es de las imagenes de calibracion que

mejor los ha detectado a pesar de que en un extremo se ve que no hay color rojo, lo

que indica que no fueron detectados los microlentes de esa region. Esta limitacion no

es tan grave pues las muestras generalmente se tratan de ubicar en el centro del campo

de vision, de manera que el software puede ajustar el tamano de la imagen para que

la region en la que los microlentes que no fueron detectados sea ignorada. Como estas

imagenes de calibracion son solo para la ubicacion de los microlentes, se toman una vez

por experimento y sirven para la calibracion tanto de Galvos como de DMD.

Cuadro 4.1: Imagenes de calibracion. Imagen izquierda es la imagen capturada con lacamara Hamamatsu. Imagen derecha es el reconocimiento por software de los micro-lentes.

28 Resultados

Calibracion de profundidad

Con este tipo de calibracion se lograban obtener los valores mınimos y maximos

del factor de reenfoque α que se describio en el capıtulo 2 2.5, ası como el paso que

habıa entre estos valores (∆α), los cuales nos eran utiles despues para realizar las

reconstrucciones. En los galvos en particular, se obtuvieron los siguientes valores:

αmin = 1,1

αmax = 3,76 (4.2)

∆α = 0,11

Stack de un objeto puntual - Tamano de la hoja de luz

Al realizar el Stack para la micro esfera fluorescente, se tomaron alrededor de 100

imagenes las cuales se unieron con el programa FIJI para obtener algo como se ve en

la figura 4.1. Con esto ademas se podıa obtener un perfil de intensidades que es lo que

grafico en la figura 4.2. En esta se puede ver que la intensidad maxima corresponde a

255, cuya mitad es de 127,5. FIJI permite hacer un acercamiento suficiente como para

ver cual es el intervalo de distancia en el que se tiene la mitad de la maxima intensidad,

ya que aquı nos interesa el Full width at half maximum (FWHM), y en este nos da que

es exactamente 1, 75µm que es entonces el grosor que se obtiene de la hoja de luz.

Figura 4.1: Stack de 1 micro esfera de poliestireno fluorescente uniendo las imagenescon FIJI

4.1. GALVOS 29

Figura 4.2: Grafica del perfil de la hoja de luz, de intensidad contra distancia (µm). Seuso FIJI para realizar esta grafica.

LFWF

Se procuro que las regiones escogidas para hacer la toma de datos en “Wide Field”

y en “Light Sheet” (LS) fueran siempre las mismas para poder comparar tanto la ilu-

minacion como la reconstruccion llevada a cabo sobre la misma imagen. Las muestras

usadas para estas imagenes debıan tener una densidad tal que en una misma imagen

se lograran ver mas de 5 micro esferas, que no necesariamente debıan estar en el mis-

mo plano, de manera que si habıa una micro esfera en foco, las demas podıan estar

desenfocadas adelante o atras de la que inicialmente enfocada.

En el apendice A se pueden ver las mejores imagenes reconstruidas por recuadros.

Esto se muestra ası ya que la reconstruccion da como resultado un archivo de stack,

el cual se compone de varias imagenes por las cuales es posible desplazarse para lograr

percibir la profundidad que tienen.

LFLS

La calibracion realizada en los galvos permitıa saber que 1◦ ≈ 50µm, lo cual nos

permitıa realizar simples reglas de 3 para saber las distancias y el angulo que se deseaba

mover los galvos para que se iluminaran en las regiones deseadas. En un intervalo de

50µm y con 3 franjas de iluminacion fue que se realizo la iluminacion estructurada por

hoja de luz. Tomando la micro esfera en foco como el origen (0 µm), se ilumino en

−25µm, en −8µm y en 9µm a lo largo del eje de deteccion. Como se vio en el capıtulo

30 Resultados

2, la idea de esta iluminacion estructurada es ir complementando la imagen de manera

que en las capturas que se realicen siempre se este iluminando una region distinta.

Cabe mencionar que los galvos mientras se estan moviendo mueven el haz consigo

y aunque en las posiciones en las que se desea que la iluminacion se lleve a cabo es

mas intensa, la regiones “oscuras” no van a ser del todo oscuras precisamente por el

movimiento continuo que tienen que hacer los galvos mientras oscilan.

Ver el apendice A para ver algunas de las imagenes que se lograron reconstruir.

4.2. DMD

Inicialmente se trato de hacer el montaje descrito en el capıtulo 3 3.2, el cual usaba

un led en vez Sin embargo, el led es necesario que sea colimado, que de hecho no es para

nada sencillo de hacer pues hasta el mismo fabricante advierte que por la naturaleza

de la luz del LED no es posible obtener una colimacion muy buena, sino que hay que

obtener la iluminacion no convergente y menos divergente posible, que de por sı ya

nos asegura que va a diverger por mas que tratemos de colimarlo. En la figura 4.3 se

puede ver la iluminacion al espejo mas cercano a los DMD. A pesar de verse bastante

iluminada la imagen, el haz diverge como nos lo advierten y fue la mejor “colimacion”

que se obtuvo, y al reflejarse tanto en este espejo como en los DMD, la intensidad de la

luz se reduce bastante. Esto no permitio que la iluminacion con DMD se lleve a cabo

con exito, pues a las muestras les llegaba una intensidad de luz insignificante que a

simple vista no era posible ver en la celda como la iluminacion por laser como se veıa

en la figura 2.2.

Las camaras no detectaban suficiente fluorescencia emitida debido a la poca intensi-

dad de luz que les llegaba a las muestras bajo estas condiciones, ya que como se puede

ver en la figura 4.4 la camara contrasta demasiado el ruido sobre la muestra iluminada

detectada, que se puede ver difıcilmente que hay dos micro esferas fluorescentes en la

parte de arriba de la imagen capturada, pero la senal detectada debe tener una inten-

sidad superior para poder tener un mayor contraste y ası que el ruido no se vea como

se esta viendo en esta imagen, ya que practicamente toda la imagen capturada esta

iluminada uniformemente. Es por esto que se decidio optar por una forma alternativa

de iluminar los DMD.

A partir del montaje de los galvos, dos espejos nos permiten desviar el haz de

manera que el DMD tambien sea iluminado con el laser. En la figura 4.5 se puede ver

4.2. DMD 31

Figura 4.3: Imagen de la iluminacion con LED en el espejo mas cercano a los DMD

Figura 4.4: Imagen de una micro esfera fluorescente iluminada con LED con la maximaintensidad del LED.

32 Resultados

Figura 4.5: Esquema del montaje para la iluminacion dual para Galvos y DMD. Laslıneas verdes coinciden con las alturas de la iluminacion usada en el montaje de losGalvos. Las lıneas moradas significan un cambio de altura, necesaria para cumplir quela luz incidente al DMD sea diagonalmente desde arriba.

esquematicamente la modificacion que se hizo al montaje de los galvos para que la

iluminacion por laser se pudiera hacer de las dos maneras sin afectar un montaje del

otro. Como se puede ver en esta figura, se monto un espejo despues del Beam expander

en una montura abatible de manera que si el espejo esta abajo, el montaje va a ser

iluminado con galvos, y si esta arriba, la iluminacion sera con los DMD. De esta forma

se logro desviar el haz para que llegara a un espejo que esta un poco alejado del montaje

y que este sea el que va a subir el haz para ası poder iluminar el camino marcado en

la figura 4.5 en morado, pues era muy importante recordar que la iluminacion al DMD

debe realizarse con una luz incidente formando un angulo de 45◦ respecto a la diagonal

y de 24◦ respecto a la normal, como se explico en el capıtulo 3 (3.2). En esta figura

ademas, se marcaron lıneas verdes indicando que esas alturas coinciden con el montaje

de los galvos que se uso, de manera que la luz va a llegar a la misma altura al objetivo

10X que es el que va a iluminar la muestra. Por supuesto, era necesario una montura

abatible mas que se indica en la figura que fue montada cerca al objetivo 10X de manera

que cuando se baje funcionan los DMD, y cuando se sube funcionan los galvos.

En la figura 4.6 se puede ver como se ve en el laboratorio el espejo que sube el haz

y lo lleva al DMD y ademas se puede observar como se ve la iluminacion de los DMD.

4.2. DMD 33

Figura 4.6: Montaje de la iluminacion en donde el DMD esta en funcionamiento. Ref:Apendice B, seguridad optica.

Calibracion de profundidad

Se llevo a cabo la calibracion de los DMD en profundidad teniendo todos los espejos

encendidos, despues una sola lınea de 20 espejos y una lınea de 8 espejos. La intensidad

utilizada del laser tuvo que aumentarse debido a que entre menos espejos la muestra

era iluminada con una intensidad menor, lo que aumentaba el ruido en la imagen de las

muestras. Ası, si todos los espejos estaban encendidos era posible obtener una imagen

con poco ruido con la misma intensidad del laser que se utilizaba con los galvos, que

rondaba los 3mW . Al usar la lınea de 20 espejos era necesario subir la intensidad hasta

15mW , mientras que una lınea de 8 espejos necesitaba mas de 30mW para que el ruido

no fuera importante.

Para los DMD, se obtuvieron los siguientes valores:

αmin = 1,03

αmax = 2,95 (4.3)

∆α = 0,09

34 Resultados

Stack de un objeto puntual - Tamano de la hoja de luz

Los micro espejos del DMD al tener un tamano de 7,56µm × 7,56µm, podemos

hacer un calculo sencillo para saber que tamano de hoja de luz estarıamos esperando

al elegir cierta cantidad de espejos. Para obtener algo que sea facil para la iluminacion,

consideremos 8 espejos:

8 ∗ 7, 56µm = 60,48µm,

y considerando la demagnificacion hecha por el objetivo de iluminacion, se tiene:

60,48µm

20= 3,024µm, (4.4)

lo cual nos indica que para 8 espejos se debe tener una hoja de luz de ≈ 3µm de grosor.

Figura 4.7: Stack de 1 micro esfera iluminada con 8 espejos del DMD, haciendo reduc-cion de ruido con un filtro gaussiano

Se realizo entonces el stack para una micro esfera fluorescente y a la union de las

imagenes se le redujo el ruido usando un filtro gaussiano del programa FIJI, esto con

el fin de tener un mejor suavizado y que el perfil de intensidad se vea mejor definido.

En la figura 4.7 se puede ver la union de estas imagenes y en la figura 4.8 se puede ver

el perfil de intensidad que se obtuvo para este caso, y un detalle importante a destacar

es que el FWHM de este perfil de intensidad es de 3,25µm, lo que da un valor muy

cercano con el calculo que se realizo al considerar la demagnificacion que el objetivo

provocarıa sobre la iluminacion de las muestras en la ecuacion (4.4).

4.3. COMPARACION DE LAS RESOLUCIONES 35

Figura 4.8: Perfil de intensidad de 8 espejos iluminados con el laser

LFWF

Las regiones de las muestras densas en donde se tomaron imagenes para los galvos,

tambien se usaron para los DMD. Gracias al montaje que se realizo, bastaba con girar

las monturas abatibles en las que se habıan montado los espejos para que el laser sirviera

para ambos montajes.

Ver apendice A para ver las imagenes de reconstruccion.

LFLS

En la iluminacion estructurada por franjas se escogieron tambien las mismas posi-

ciones que para los galvos, solo que en los DMD se esta mas seguro que las regiones

oscuras son realmente oscuras, pues nada tiene que oscilar sino que se encienden solo

los espejos escogidos y el haz se refleja en estos para formar una iluminacion con el

patron de espejos encendidos. En este caso, 8 espejos se escogıan como encendidos y 43

como apagados, de manera que sea comparable con lo que se realizo con los galvos para

ası tambien obtener una region oscura de aproximadamente 17µm entre las regiones

iluminadas.

En la tabla 4.2 se pueden ver una de las mejores reconstrucciones realizadas, la cual

se llevo a cabo con DMD escogiendo franjas de 8 espejos encendidos.

36 Resultados

Cuadro 4.2: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando DMD.


Cuadro 4.3: Stacks de las reconstrucciones tridimensionales para imagenes obtenidascon los Galvos (izquierda) y el DMD (derecha).

4.3. Comparacion de las resoluciones

Las reconstrucciones llevadas a cabo permiten comparar la resolucion obtenida para

“Wide Field” y para “Light Sheet”. Este ultimo es en el que queremos hacer enfasis, ya

que la iluminacion estructurada es un metodo que no ha sido usado y que esperamos

obtener una mejor resolucion que la reconstruccion usando iluminacion “Wide field”.

Para esto se realiza un perfil de intensidad cerca del plano focal (lo que definimos como

el origen 0µm) y con un ajuste gaussiano logramos obtener los parametros de esta

funcion ası como tambien su desviacion estandar σ.

En la figura 4.3 podemos ver unos de los stacks obtenidos en las reconstrucciones

hechas con imagenes obtenidas tanto por los galvos como por el DMD en iluminacion

estructurada. Se esperarıa entonces que se viera un stack por franjas ya que ası fue

como la muestra se ilumino, pero en los galvos esto no se ve claro. Para la imagen del

DMD es facilmente reconocible las franjas de iluminacion, mientras que en los galvos

no hay diferencia alguna con una imagen tomada por “Wide Field”. El hecho de poder

escoger las franjas en el DMD nos da una mejor precision de los planos que se han

escogido para iluminar, mientras que los galvos al tener que oscilar para ir de un plano

al otro implica que las regiones que deberıan ser oscuras no siempre lo son.

38 Resultados

Cuadro 4.4: Ajuste Gaussiano para el perfil de intensidad de las reconstrucciones en“Wide Field” (derecha) y “Light sheet” (izquierda) para el DMD.

De manera que el resultado del ajuste gaussiano se realiza para las imagenes obte-

nidas por DMD, y estos se pueden ver en la tabla 4.4.

Gracias a los ajustes gaussianos, el parametro σ es de mucha utilidad pues permite

calcular el FWHM siguiendo la relacion que podemos encontrar en WolframMathWorld

[21], la cual nos dice que para una funcion gaussiana, el FWHM se puede calcular como:

FWHM = 2√

2 ln 2 · σ ≈ 2,3548σ, (4.5)

de manera que, segun los parametros dados por FIJI que se pueden ver en la figura 4.4

para el modelo de la funcion gaussiana, d corresponde a la desviacion estandar σ. Ası,

para los stacks obtenidos por DMD se obtiene:

σ(µm) FWHM (µm)Wide Field 88.32 207.97Light Sheet 60.83 143.24

Estos resultados nos muestras que la resolucion en “Light sheet” o iluminacion

estructurada por franjas es mejor que la resolucion de la iluminacion completa. En la

misma region, el perfil de intensidad tiene un valor menor. En la figura 4.5 podemos

ver a simple vista que para las mismas regiones de los stacks de la reconstruccion, el

FWHM de las imagenes de la izquierda (correspondientes a “Wide field”) es un poco

mas grande que las de las imagenes de la derecha (correspondientes a “Light sheet”).


Cuadro 4.5: Comparacion de la resolucion de los stacks obtenidos. Imagenes de la iz-quierda: “Wide Field”. Imagenes de la derecha: “Light sheet”

40 Resultados

4.4. DMD vs Galvos

Como en este proyecto se realizo la iluminacion con dos dispositivos diferentes, aquı

se quiere resumir las ventajas y desventajas de estos dos metodos de iluminacion para

futuros proyectos que requieran de un microscopio de hoja de luz.

4.4.1. Ventajas Galvos

La intensidad de luz no se reduce significativamente, de manera que incluso el

laser con la potencia mınima es suficiente para poder iluminar muestras y capturar

imagenes, aunque no sea ideal.

No genera difraccion

4.4.2. Desventajas Galvos

Los galvos requieren de mas elementos opticos para formar la hoja de luz, tales

como el lente cilındrico y el uso de un lente fθ, con la respectiva alineacion de

estos elementos.

En general las alineaciones de un haz de luz no son nada sencillas de realizar, pero

en los galvos en particular se vuelve un poco mas tediosa ya que se debe buscar el

voltaje necesario para que el haz del laser solo se eleve verticalmente y que luego

siga un camino totalmente horizontal.

La iluminacion estructurada es bastante difıcil de lograr con los galvos puesto

que, como se menciono anteriormente, las oscilaciones se programan y se llevan a

cabo, pero el laser se mantiene encendido todo el tiempo, de manera que dificulta

obtener realmente una iluminacion estructurada apropiada.

4.4.3. Ventajas DMD

No requiere de un lente cilındrico, lente fθ y de la respectiva alineacion de estos,

lo que simplifica un poco este proceso.

La iluminacion estructurada se realiza facilmente gracias a que el software que

controla los espejos permite prender los espejos que se deseen y solo la luz se

refleja en estos. Tambien facilita la iluminacion de campo completo.

4.5. PLANES A FUTURO 41

El software que controla el DMD es mas sencillo de utilizar una vez se tienen las

imagenes de franjas

4.4.4. Desventajas DMD

Genera difraccion y hay que tener cuidado con las numerosas reflexiones que se

ven por todo el laboratorio

La intensidad del haz del laser se reduce considerablemente

La alineacion diagonal desde arriba para cumplir los requisitos de iluminacion

no es tan sencilla de realizar, especialmente porque la mayorıa de los elementos

opticos estan disenados para alineaciones en vertical u horizontal, no diagonal.

Algo importante que agregar y que no es totalmente una desventaja para los DMD es

que las imagenes de franjas requirieron un programa adicional de Matlab para generarlas

facilmente, sin el cual las franjas se debıan haber dibujado. En realidad el programa

es muy sencillo, pero si no se cuenta con cierto conocimiento para poder generar estas

imagenes por codigo, todo habrıa sido con mucho mas tiempo demandado.

Como podemos ver, los metodos usados se pueden diferenciar en estas ventajas y

desventajas. Sin embargo, como opinion y preferencia personal, el DMD es el metodo

que escogerıa para construir un microscopio de hoja de luz. Considero que la precision

de la iluminacion que se obtiene con los DMD es una ventaja muy grande para preferirlo

sobre los galvos, y ademas los resultados de las imagenes que se obtienen son mejores con

el DMD. Las desventajas del DMD son de cuidado y de constante trabajo para lograr

la iluminacion en el lugar que se desea. Lo que sı serıa un problema es que el laser usado

no tuviera intensidad ajustable, y que la intensidad por defecto sea demasiado baja;

afortunadamente este no es el caso.

4.5. Planes a futuro

Se quisiera tener la posibilidad de analizar muestras biologicas mas complejas. Las

micro esferas fluorescentes sirven como una primera aproximacion a lo que la recons-

truccion tridimensional por software logra hacer. Sin embargo, esta da lugar a que no

solo se puedan analizar muestras modelo, sino tambien organismos vivos. Los peces

cebra, por ejemplo, son uno de los seres vivos mas usados en microscopıa en especial de

42 Resultados

fluorescencia ya que su textura es transparente y muy facil de que emita fluorescencia

con la iluminacion adecuada. Serıa interesante ver como el programa da para reconstruir

no solo el animal sino tambien algunos de sus organos como el corazon, y tambien de

como su corazon se podrıa visualizar sabiendo que sus latidos son del orden de 350ms

[1].

CAPITULO 5

Conclusiones

Se desarrollo un protocolo para alinear el sistema de DMD junto con los galvos.

La hoja de luz que se logra obtener con el uso de los galvos esta mejor definida e

ilumina mejor el plano de seccionamiento optico sobre las muestras. Los DMD logran

una hoja de luz un poco mas gruesa con una lınea vertical de 8 espejos.

La iluminacion estructurada se logra mejor con el DMD puesto que los espejos pren-

didos son los que hacen posible la iluminacion por franjas, contrario al uso de los galvos

que tienen que estar en constante movimiento para lograr este tipo de iluminacion.

Ambos sistemas, tanto galvos como DMD, requieren cierta calibracion previa para

saber como determinar la distancia de profundidad a la que se va a realizar la ilumi-

nacion, en los galvos conociendo la equivalencia entre 1◦ a micras, y en el DMD la

equivalencia entre una lınea o franja de espejos a micras.

Se ha logrado la reconstruccion tridimensional de las imagenes tomadas por campo

de luz gracias al software desarrollado por el estudiante Diego Castro quien enfoco su

tesis de maestrıa a escribir el codigo de programacion para hacer esto posible.

La resolucion en los stacks de las imagenes reconstruidas de la iluminacion estruc-

turada (LFLS) mejora respecto a la iluminacion de campo completo (WF).

44 Conclusiones

APENDICE A

Imagenes de reconstruccion

En este apendice se recompilan los frames de los stacks obtenidos a partir de la

reconstruccion realizada en el software desarrollado por Diego Castro en MATLAB.

46 Imagenes de reconstruccion

A.1. Galvos

A.1.1. LFWF 1

Cuadro A.1: Frames de la reconstruccion tridimensional por “Wide Field” utilizandoGalvos.

A.1. GALVOS 47

A.1.2. LFWF 2

Cuadro A.2: Frames de la reconstruccion tridimensional por “Wide Field” utilizandoGalvos.


A.1.3. LFLS 1

Frame 1/24 Frame 2/24 Frame 3/24 Frame 4/24






Cuadro A.3: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando Galvos.

A.1. GALVOS 49

A.1.4. LFLS 2







Cuadro A.4: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando Galvos.


A.2. DMD

A.2.1. LFWF 1

Cuadro A.5: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion “Wide field”utilizando DMD.

A.2. DMD 51

A.2.2. LFWF 2

Cuadro A.6: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion “Wide field”utilizando DMD.


A.2.3. LFLS 1 - 8 espejos






Cuadro A.7: Frames de la reconstruccion tridimensional por iluminacion estructuradautilizando 8 espejos en los DMD.

A.2. DMD 53






Frame 17/18 Frame 18/18










A.2. DMD 55






Frame 17/18 Frame 18/18



APENDICE B

Seguridad optica

El laser usado fue:

LBX-488-100-CSB: 488nm Laser Diode Module

Este laser tiene dos etiquetas de clase que son indicadores del grado de peligro al

que se expone al usarlo. Estas clases estan definidas a partir de la longitud de onda, el

tiempo de exposicion y la potencia.

Especıficamente, para este laser las etiquetas de clase son las siguientes:

Cuadro B.1: Imagenes tomadas del manual del laser [22]

Como se puede ver en las etiquetas, esto nos indica que la vision directa al haz del

laser es peligrosa, e incluso puede ser nociva para la piel. De manera que, a pesar de

que la mesa esta a una altura inferior de la vista de cualquier persona, puede haber

reflexiones que lleguen a la altura de los ojos de las personas. Es por esto que se deben

tener precauciones con el equipamiento adecuado como lo son las gafas de seguridad

de laser certificadas (Certified Laser Safety Glasses). Estas gafas tienen un porcentaje

de transmision del 48 % de la luz visible, ademas de que su densidad optica (Optical

Density OD) es de 7,0+, lo que indica que transmite unicamente el 0,00001 % de la luz

58 Seguridad optica

que llega en la longitud de onda en el intervalo 180nm hasta 532nm [23]

El uso de estas gafas fue esencial durante el desarrollo de este proyecto, en especial

porque si nos fijamos en la grafica 4.6 en el capıtulo 4, podemos ver que el laser al

ser apuntado al DMD reflejaba la luz en varias direcciones. Trabajar con los galvos era

relativamente mas seguro, pero aun ası las gafas son un elemento esencial para trabajar

con cualquier laser; ademas este tenıa indicaciones de precaucion que no debıan ser

ignoradas.

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Documents

Microscop a de fluorescencia de campo de luz por