Mestrado Elizabet

•

BIBllGHOfâcu\\\nuc de Ciêf1C\1S r~[\n3cêü\\CaSUniversidade de São Paulo

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOFACULDADE DE CItNCIAS FARMACtUTICAS

Curso de Pós-graduação em

Ciência dos Alimentos

EFEITO DO INIBIDOR DE c< - AMILASE DO FEIJÃO(Phaseolus vulgaris L.) EM ANIMAIS NORMAIS E

DIABÉTICOS

ELlZABETE WENZEL DE MENEZES

Dissertação para obtençãodo graa de

MESTREOrientador: Pro'. Or. FRANCO M. LAJOlD

São Paulo

1985

AGRAVECIMENTOS

- Ao P~o6. V~. F~anco M. Lajolo pela e6iciente o~ientaç~o e de

d..i..caç~o com que conduz..i..u no.6.6o.6 e.6tudo.6.

- A CAPES pela bol.6a de e.6tudo conced..i..da du~ante o cU~.60 de

pÕ.6-g~aduação.

- A OEA e a FINEP pelo.6 auxllio.6 6..i..nance..i..~o.6 a e.6.6e t~abalho.

- A todo pe.6.6oal do Vepa~tamento de Al..i..mento.6 e Nut~..i..ção Expe~~

mental.

A U~.6ula Ma~..i..a Lan6e~ Ma~quez e Flãv..i..o F..i..na~di F..i..lho pela ami

zade e val..i..o.6a.6 .6uge.6tõe.6.

- Ao P~o6. V~. Angelo Ra6ael Ca~p..i..nell..i.. - Vepa~tamento de F..i...6..i..olog~a e B..i..o61.6..i..ca IICB-USP) pela colabo~ação na dete~m..i..na

ção da ..i..n.6ul..i..na .6ê~..i..ca.

rBI3tlUlEca

fanu\~~.le .In r';\"i':" r.""!l,r.5"jiC~~ .Ui.;,U U{j \;!~i:JtS t :i;li!r,I~\;;j.t ",S

Universidada de São Paulo

S U M ~ R I O

pago

- INTRODUÇ~O

2 - OBJETIVOS

. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

............................................. 6

3 - MATERIAL 7

3.1 - Feijão 7

3 . 2 - Am i 1a s e sal i va r 7

3.3 - Reagentes 7

3.4 - Animais......................................... 8

3.5 - Ração para manutenção de animais diabeticos ..... 8

4 - MtTODOS 9(

4.1 - FTsico-QuTmicos e BioquTmicos .. 9

4.1.1 - Obtenção do inibidor de a-ami1ase 9

4.1.2 - Atividade da a-amilase 10

4.1.3 - Atividade do inibidor de a-ami1ase 12

4.1.4 - Atividade proteo1Ttica no intestino 12

4.1.5 - Atividade do inibidor de tripsina 12

4.1.6 - Determi nação da proteTna 13

4.1.7 - Determinação da glicose 13

4 . 1 . 8 - De te rm i na ç ã o do ami do r e s i dua 1 1 3

4.1.9 - Determinação da insulina 13

4.1.10 - Determinação dos ácidos graxos não ester.,i

ficado no soro 14

4.2 - Biológicos: ensaio com animais 14

4.2.1 - Esquema experimental 14

pa g .

4.2.2 - Ob te nção do soro 154.2.3 - Obtenção dos 6rgios 154.2.4 - Preparação dos homogenatos de pâncreas,

intestino e est5mago 154.2.5 - Indução da diabetes.................... 16

4.3 - Ani 1i se es ta tis ti ca 16

5 - RESULTADOS

5.1 - Ação em animais normais

18

18

5.1 .1 - Efei to de doses crescentes do IA sobrea glicemia e digestão do amido 18

5.1 .2. - Efei to do IA sobre os nivei s seri cos deglicose, insulina, icidos graxos e dige~

tão do ami do 215.1 .3 - Efei to do IA, i sento de contaminaçio com

inibidor de tripsina, sobre a glicemiae di ges tão do ami do 21

5.1.4 - Efei to do IA sobre a secreção e produçãoda a-amilase pancreática .. ... ..... ..... 28

a) Na presença de contaminação com inibldor de tripsi~a na preparação do IA.. 28

b) Na ausência de contaminação com inibldor de tripsina na preparação do IA.. 28

5.2 - Ação em animais diabê~icos: efeito do IA sobreos niveis sêricos de glicose, insulina, ácidosgraxos e digestão do amido..................... 35

6 - DISCUSSJX:O 39

6.1 - Efeito do IA sobre a digestão do amido e outrosparâmetros relativos ao metabolismo da glico-se em animais normais 39

6.2 - IA e controle da a-amilase pancreática 46

6.3 - Efeito do IA em animais diabêticos 50

pago

7 - CONCLUSOES .•.•••.•.•.•.•.•.•.•.•.•.•...•.......•.•... 52

8 - REFERtNCIAS BIBLIOGRJi:FICAS 54

- SUMMARY •.•.•.•.•.•.•.•.•...•••.•.•...•.•.........•.•. 63

- LISTA DE FIGURAS E TABELAS........................... 64

1 - INTRODUÇAO

Dentre os inibidores enzimáticos contidos naturalmente

nos alimentos, os inibidores de proteases (tripsina e quimotrip

sina) são amplamente citados pela literatura cientifica, tanto

f~· .... (60) - b' 1-' (25) .-no aspecto lSlco-qulmlco como na sua açao 10 oglca ; Ja,

os inibidores de a-amilase (IA), somente nos ultimas 15 anos

receberam maior importância por parte dos pesquisadores.

Os inibidores de a-ami1ase (IA) começaram a ser cita

dos na literatura por BOWMAN(8), a partir de 1945, que verifi -

cou a presença de um inibidor hidrosso1uve1 e termo1ãbel no fei

jão. Outros autores citam que as primeiras investigações sobre

os inibidores de a-ami1ase foram realizadas por CHRZASZCZ(12).

Posteriormente, surgiram informações sobre a presença. . ( 24 ) b- 1 (20 ,27)de IA em outras fontes como: mlcrorganlsmos , tu ercu os ,

. (20,27,63) 1 . (20,50) b t d l' .cerealS e egumlnosas ; em como es u os pre lm~

nares sobre os mecanismos de ação sobre enzimas

gens(64) .

de vãrias ori

Sob o aspecto estrutural desses inibidores verifica

mos que aqueles provenientes do trigo, já tem suas caracteristi

cas fisico-quimicas relativamente elucidadas, inclusive com es

trutura primãria estabe1ecida(39), mas com relação ao inibidor

do feijão (IA), pouco ainda e sabido.

-2-

As técnicas de isolamento e caracterização parcial do

IA do feijão "branco" e "vermelho" (Phaseolus vulgaris) foram es

tabelecidas(51,57,56) sendo também, estudados alguns aspectos do

mecanismo de complexação entre a a-amilase e o IA do feijão "ver

melho,,(69).

Segundo LAJOLO e FINARDI(43) o IA do feijão preto (Pha-

seolus vulgaris) foi isolado e purificado por extração aquosa,

precipitação fracionada por etanol seguida da cromatografia em

DEAE-celulose e Sephadex G-100, obtendo-se uma purificação de lS ve

zes com um rendimento de 32%.

Esses mesmos autores(44), verificaram que é uma glico

proteina com peso molecular de 53.000 Daltons, ponto isoelétri

co de 4,35 e coeficiente de sedimentação (S~O,w) de 4~35. Como

residuos de açucares foram encontrados manose, xilose, galacto-

se e glicosamina e o IA mostrou-se resistente a proteõlise.

Tambem, foram realizados estudos sobre parâmetros ciné

ticos do IA(67) e sobre o efeito de modificações quimicas na a

-amilase pancreática, na formação do complexo com IA(6S).

Do ponto de vista nutricional existem controvérsias so

bre eficiência do inibidor de a-amilase na digestão do amido.

PULLS e KEUP(5S) utilizando o IA do trigo verificaram

em humanos, ratos e caes diminuição na digestão do amido levan

do em consequência a uma hipoglicemia e hipoinsulinemia pos-pan

drial. Tambem FRERICHS e col. (23) utilizando o mesmo inibidor

verificaram efeito semelhante em humanos normais, obesos e obe-

sos diabeticos. Entretanto, devido a labilidade desse inibidor

do trigo ã tripsina e pepsina, acredita-se que seu uso clinico

prolongado não tenha efeito significativo na digestão do amido(21).

-3-

Posteriormente, MACRI e cols. (49) utilizando IA do tri

go encapsulado verificaram em ensaios cr5nicos com galinhas. hi

pertrofia no pâncreas sem qualquer redução na taxa de crescimen

to. A partir dai, sureriram que as modificações adaptativas do

pancreas seriam controladas pelo nivel de a-amilase do intestino.

GRANUN e ESKELANO(27) verificaram efeitos semelhantes

aos de MACRI(47) com relação ao crescimento de galinhas, mas os

tecidos pancreáticos opostamente apresentaram-se com caracteris-

ticas normais.

Já, FOLSCH e cals. (22) utilizando IA de origem micro-

biana, verificaram, em ratos, efeitos contrários aos de MACRI

1 (49) b d" . - d' .e co s. o servaram uma lmlnulçao no peso os anlmalS e no

conteudo de a-amilase no pâncreas, sugerindo que o mecanismo de

secreçao da a-amilase não seria regulado por um

feedback negativo, como sugerido por esses autores.

mecanismo de

Os inibidores de origem microbiana, também foram uti

lizados em humanos normais, diabéticos e obesos tendo-se eviden

ciado que são capazes de causar redução na glicemia põs-pran-

d ' 1(16,21)1 a .

Com relação ao IA do feijão JAFFE e LETTE(36) obtiveram

i ndi retamente i nformações sobre sua ação "i n vi tro 11 e "i n vi vo ",

observando que os animais que receberam variedades de· feijão com

pouca hemaglutinina, também apresentaram uma diminuição no cres-

cimento, sugerindo que esse efeito poderia ser decorrente da pr~

sença do IA e de inibidor de tripsina (IT) na amostra.

Já, SAVAIANO e cols.(61) afirmaram que o IA do "feijão

vermelho" (~~seolus vulgaris), não afeta a digestão do amido,

pois em ensaios crônicos com ratos este inibidor não alterou a

-4-

taxa de crescimento dos animais.

Entretanto, LAJOLO e cols. (45) utilizando IA do feijãu

preto ~Phaseolus vulgaris) verificaram comprometimento na diges

tão do amido e diminuição na glicemia põs-pandrial em ratos que

receberam o IA com amido por sonda gástrica; alem disso em en

saios semi-crônicos e, em condições de restrição calõrica, houve

diminuição na taxa de crescimento dos animais. E oportuno, ref~

rir que esse inibidor isolado por LAJOLO e cols. e resistente

a proteases(19).

Com base na literatura já citada sobre a ação "in vi

tro,,(51) e "in vivo,,(36) do IA, nos EUA, foram lançados no merca

do cerca de 100 diferentes tipos de preparações ã base de feijão,

denominadas "starch blockers", as quais, teriam efeito de bloqu~

ar a digestão do amido e consequentemente causar emagrecimento.

Em 1983, vários autores(7,10,26,32) verificaram que os

"starch blockers" comerciais não tinham qualquer efeito sobre a

digestão e absorção do amido em humanos. Esses autores sugeriam

que esta ineficiência poderia ser decorrente de alguns fatores,

tais como: o pâncreas, geralmente, secreta uma quantidade em ex-

cesso de a-amilase para digerir o amido, ou o tempo de intera

çao do IA e enzima não e suficiente para bloquear a enzima, tam

bem foi considerada a possibilidade de digestão e inativação de~

se inibidor pelas proteases pancreãtice- bem como pela pepsina .

Ent r e ta nto, f o i obs e r va do por ens a i os" i n vitro " (29, 47)

que esses "starch blockers" continham baixa concentração de IA,

teores elevados de inibidores de proteases, lectinas e outras pr~

teinas não permitindo portanto conclusões seguras sobre a sua

eficiência ou não.

-5-

Em vista, portanto, dos resultados contraditórios da

literatura acreditamos ser de interesse cientlfico esclarecer o

efeito do IA do feijão sobre a digestão do amido e parâmetros li

gados ao metabolismo da glicose.

-6-

2 - OBJETIVOS

Estudar o efeito do inibidor de a-amilase, isolado do

feijão (Phaseolus vulgaris L.), sobre a digestão do amido e sobre

parâmetros do metabolismo da qlicose em animais normais e

diabeticos, bem como verificar seu efeito sobre a secreção e pro

dução de a-amilase pancreãtica.

-7-

3 - MATERIAL

3.1 - Feijão

Estudamos sementes de feijão preto~ Phaseolus vulgaris

L.~ da variedade brasileira Rico-23~ provenientes do Instituto

Agronômico de Campinas - SP.

3.2 - Amilase salivar

A a-amilase (1 ~4-a-D-glucan glucanohydrolase EC3.2.1.1)

foi obtida de saliva humana~ purificada por precipitação fraci~

nada com acetona. O precipitado foi dissolvido em tampão fosf~

to 0,1 M pH 6,9 e armazenado a -laoc ate o momento do uso.

3.3 - Reagentes

Albumina serica bovina, tripsina, glicose-oxidase, p~

roxidase, BAPA (Benzoilarginina-para-Nitroanilida)~ Streptozot~

cina, ~cido 3,5 di-Nitrossalicilico~ B-mercaptoetanol foram ob

tidos da Sigma Chemical Company; DEAE-celulose da Whatman Lime

ted; os demais reagentes utilizados foram de grau analitico.

-8-

3.4 - Animais

Foram utilizados ratos machos (Rattus norvegicus, varo

albinus), da linhagem "Wistar ll, obtidos a partir de colõnias man

tidas no bioterio da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP,

com rações comerciais.

3.5 - Ração para manutenção de animais diabeticos

A ração utilizada continha: 25% proteina (Proteimax

70), 8% õleo de soja, 4% mistura salina, 1% mistura vitamini-

ca, 1% fibra (microcel), 3% metionina e farinha de mandioca

q.s.p. 100%. As misturas salina e vitaminica foram preparadas con

forme as necessidades de ratos( 35).

A composição por análise foi a seguinte: umidade (10%),

proteina (24,1%), extrato etereo (8,7%), cinza (4,2%),

(11,8%) e carboidratos (41,2%) por diferença.

fibra

-9-

4 - MtTODOS

4.1 - Fisico-Qu;micos e Bioqu;micos

4.1.1 - Obtenção do inibidor de a-amilase

Utilizamos dois tipos de preparações de IA.

Uma primeira foi obtida essencialmente como .descrito

(42) - - -por LAJOLO ate a fraçao IIDEAEII-celulose ll• Porem para redu-

zir o teor de contaminação com o inibidor de tripsina incluiu-se

uma fase adicional intermediãria de purificação com celite: ben

tonite segundo HANOVAR(33). O esquema final adotado foi o se

guinte: extração aquosa (20% de farinha de feijão), acidifica

çao (pH = 5,0) e aquecimento (70 0 e por 15 min.). Posteriormente

foi adicionada uma mistura de celite :bentonite (1:1), na propo..!:.

çao de 10% do peso inicial da farinha, mantendo-se a mistura sob

agitação por 4 horas a 60 e; seguindo-se de centrifugação a 4080

x g por 20 min, precipitação fracionada com etanol (50-70% de sa

turação) e separação em DEAE-celulose. A fração ativa foi cole

tada, precipitada com etanol até 70% de saturação, centrifugada

a 10.400 x g por 30 min e o IA assim obtido ressuspenso em agua

para ser administrado aos animais.

Após verificar que mesmo teores residuais de IT in-

fluiam nos resultados biológicos, resolvemos introduzir uma segunda

-10-

fase adicional para maior remoção desse inibidor, o que foi con-

seguido com o uso do 8-mercaptoetanol.

Isso foi possTvel ,porque o 8-mercaptoetanol não afe

ta o perfil eletroforetico do IA, indicando que pontes de dissul

- - . (19)feto nao sao lmportantes na sua estrutura . Esse reagente p~

rem e capaz de dissociar pontes de dissulfetos essenciais para

a manutenção da atividade do inibidor de tripsina(37).

Nessa segunda fase procedeu-se da seguinte maneira:

a fração coletada ap5s passagem em OEAE-celulose foi tamponada

com fosfato O,lM pH=6,9, incubada com 8-mercaptoetanol (1%) por

30 min a 37 0 C e posteriormente dialisada por 24 horas contra agua

destilada.

Na primeira preparação o tratamento com celite: bento-

nite reduziu de mais de 80% a contaminação de IT na preparaçao

de IA. Por outro lado, o tratamento adicional com 8-mercaptoet~

nol não alterou o rendimento do IA mas reduziu em 99,9% a ativi

dade do IT.

Na Tabela 1 são mostrados esses resultados indicados p~

ra uma dose de 80 UIA (que foi a dose comumente usada nas experi

encias com animais).

4.1.2 - Atividade da a-amilase

Foi determinada através da reação com ácido 3,5 dini

trossalicilico e amido como substrato, segundo BERNFELO(6) adap

tado por LAJOLO(42); sendo que uma Unidade Internacional de a

-amilase (UA) equivale a liberação de 1 )Jmol de maltose/min a 370 C.

Tabela 1 - Efeito do tratamento com celite/bentonite e s-mercaptoetanol na remoçio do inibi

dor de tripsina.

Inibidor Proteina Ativ. Inib. At i v . I ni b . Ativ.a-amilase Tripsina Hemaglutinante

Fração

mg mg UIA UIT % ARG %

Extrato Bruto Aquoso 40 336 80 105.600 100 1/346 100

* fração utilizada nas experiências de itens (5.1.3) e (5.1.4b)

o

o

o

o

13

0,1100

13.77580

8028

4241

40

c/Cel. Bent.

c/Cel. Bent.

S-mercaptoetanol*

DEAE-Celulose**

** fração utilizada nas demais experiências.

-1 2-

A atividade da a-amilase no pancreas foi expressa por grama de

tecido (UA/g) e no intestino como atividade total presente no in

testino delgado (UA/intestino).

4.1.3 - Atividade do inibidor de a-amilase

Empregou-se o método adaptado por LAJOLO(42). Estabe

leceu-se que uma unidade inibidora de a-amilase (UIA) correspon

de a inibição total de 10 Unidades Internacionais de a-amilase

(UA), após 20 minutos de incubação a 37 0 C em tampão fosfato

0,02M pH = 6,9.

4.1.4 - Atividade proteolitica no intestino

Foi determinada, usando-se o método de KAKADE (38), com

o BAPA como substrato. Uma unidade de tripsina (UT) corres~onde

ao aumento de 0,01 unidades de absorbancia em 410 nm/10 ml de

mistura de reação. A atividade proteolitica no intestino foi e~

pressa como atividade de tripsina total presente no intestino del

gado (UT/intestino).

4.1.5 - Atividade do inibidor de tripsina

Para avaliação da atividade anti-tríptica na amostra

de IA, verificamos a redução da velocidade de ação da tripsina

-1 3-

bovina sobre o BAPA, na presença de inibidor de tripsina, confo~

me o metodo de KAKADE(38). O teor do inibidor de tripsina foi

expresso em unidades de tripsina inibida (UTI).

4.1.6 - Determinação da proteina

- (48) ~Usou-se sempre o metodo de LOWRY . O teor de prote2.

na no pâncreas foi expresso por grama de tecido (mg/g pâncreas)

e no intestino como proteina total presente no intestino delga-

do (mg/intestino).

4.1.7 - Determinação da glicose

A glicose no soro e urina foi determinada com glicose

oxidase e peroxidase, segundo a técnica descrita por BERGMEYER e

BERNT( 5 ).

4.1.8 - Determinação do amido residual

O amido residual no estõmago e intestino foi dosado pe

la tecnica de BERNFELD(6 ), após tratamento descrito por LAJO

LO(42). A quantidade de amido foi calculada multiplicando-se a

concentração de gl icose por 0,9: considerando-se % de recuperação

da tecnica.

4.1.9 - Determinação da insulina

A insulina serica foi determinada pelo método de radio

imunoensaio, segundo MORGAN e LAZARO~' (52) modificado por PUPO e MAR

REIRO( 59).

-14-

4 . 1 . 1O - Oe t e rm i na ção de á c i dos gr axos nao es t e r i f i ca -

dos no soro.

Foram avaliados pelo metodo colorimetrico descrito por

FALHOLT(17) e referidos no texto simplesmente como ácidos graxos.

4.2 - Biológicos: ensaios com animais

4.2.1 - Esquema experimental

Os ensaios com ratos foram de curta duração (0,5 ate

4 horas) e realizados com animais pesando por volta de 100g (no!

mais) ou de 300 g (diabeticos). Antes dos ensaios os animais

foram alojados em gaiolas individuais e mantidos em jejum por

18 horas, recebendo somente água "ad libitum". Então, amido so-

zinho (180 mg amido em 2 ml solução fisiológica/100g) ou amido

com doses variãveis de IA(10 até 80 UIA/100g) foram administradas por

sonda gástrica. Após tempos variãveis de 0,5; 1; 2; 3 até 4 ho

ras, conforme a experiencia, amostras de sangue e órgãos foram

obtidos conforme descrito respectivamente nos itens

4.2.3.

4.2.2 e

Em todos os experimentos constituiu-se um grupo "je-

jum" que recebeu por sonda apenas solução fisiológica, os valo

res obtidos com esse grupo foram tomados como tempo "zero".

-15-

4.2.2 - Obtenção do soro

Para determinação da glicemia - o sangue foi coletado

em aliquotas de 100 ]J1 da veia caudal, e o soro obtido apos a

precipitação das proteinas com ãcido perc1órico 0,34N e centrifu-

gado a 278 x g por 15 mino

Para determinação de insulina e ácidos graxos - o san-

gue foi obtido por punção cardiáca e após a retração do coagu

lo foi centrifugado a 495 x g por 20 mino

4.2.3 - Obtenção dos orgaos

Com os animais anestesiados por eter, -o pancreas foi

retirado e limpo de tecido adiposo. As extremidades do estôma

go (esôfago - pi10ro) foram amarradas e o órgão removido junta

mente com o intestino delgado. O conteudo do estômago ou do in-

testino delgado foram coletados atraves de lavagens com tampão

fosfato 0,02M pH = 6,9 gelado. Após a remoção os órgãos e teci

dos foram congelados em nitrogênio liquido e armazenados a -20 0C

ate anãlise.

4.2.4 - Preparação dos homogenatos de pâncreas, intes

tino e estômago

O pâncreas foi descongelado, homogeneizado (ultra turex

por 1 min) em tampão fosfato 0,02M pH = 6,9 gelado, centrifugado

sob refrigeração a 4080 x g por 10 mino No sobrenadante

-16-

foi

determinada a atividade da a-amilase e o teor de proteínas.

O conteudo intestinal foi descongelado e centrifuga

do sob refrigeração a 1110 x g por 20 min; no sobrenadamente de

terminou-se a atividade da a-amilase, da tripsina e o teor de

proteina e, no precipitado o amido residual. O mesmo tratamen

to foi realizado no estômago sendo determinado o amido residual

no precipitado.

4.2.5 - Indução da diabetes

A diabetes foi induzida por Streptozotocina administr~

da pela veia caudal na proporção de 45 mg/Kg peso corporal, se

gundo a tecnica descrita por CHORVATHOVA(ll). Para reduzir a

mortalidade os animais receberam 4U insulina/Kg peso corporal

nos três primeiros dias após a injeção.

Ate o momento do experimento os animais receberam a

dieta descrita no item 3.5.

Após o 89 dia da indução já apresentavam caracteristi

cas do desenvolvimento da diabetes, como se pode ver na Tabela 2,

(valor medio de 20 animais por grupo).

4.3 - Análise estatística

A comparação entre medias foi realizada usando-se te~

te IIt ll student, segundo FEOERE(18). Nas tabelas e figuras os

resultados estão representados com os respectivos

drão.

desvio-pa -

-17-

Tabela 2 - Efeito da Streptozotocina (4,5 rng/100g peso) na indu

ção de diabetes*

Grupo Diabêticos Controle

Glicemia (mg %) 331 :t 46 a 75 :t 5b

Glicose Urina (g/24hs) +1,5-0,6

Vo I. Uri na (ml /24hs) 105 :t 37 a 7 :t 3b

Ing. Liquido (ml/2 4 hs' 123 :t 44 a 31 :t 5b

Cons. Ração (g/24hs) 25 :t 7a 16 :t 4b

Aumento de peso ( 9 )+ +14 :t 5-28 - 15

Insulina (IlV/rnl) 42 :t l6 a 70 :t Sb

"Ac. Graxos (m Mol/l) 0,864 :t O,10 a 0,766 :t 0,15 b

Ativ. a-amilase pa n- + a 1625 :t 266 b180 - 29

creãtica (UA/g pâncreas)

*oltavo dia após a injeção

a f b (P ~ 0,001)

-18-

5 - RESULTADOS

5.1 - Ação em animais normais

Experiências com animais normais foram realizadas pri

meiramente com o IA tratado até DEAE-celulose, contendo 13% de

;nibidor de tripsina (IT); apõs verificarmos que essa contamina

ção interferia no conteudo das proteases presentes no intestino

delgado passamos a utilizar o IA tratado ate s-mercaptoetanol, o

qual continha somente 0,1% de IT.

5.1.1 - Efeito de doses crescentes do IA sobre a gl ic!

mia e digestão do amido

Os resultados dos experimentos, visando verificar o

efeito de doses crescentes do IA sobre a digestão do amido, es

tão representados nas Tabelas 3 e 4; os animais receberam, atra

ves de sonda gãstrica quatro doses de inibidor la; 20; 40 e

60 UIA/100g peso corporal,acrescidas de 180 mg amido/100g peso

O sangue foi retirado da veia caudal após O; 1/2, 1,2 e 3 horas da

administração e na 3a. hora os animais foram sacrificados. O ex

trato de inibidor administrado corresponde ã fração DEAE~celulo

se (Tabela 1) contendo respectivamente 5,2; 10,3; 21,0 e 31,0 mg

IA nas doses de la; 20; 40 e 60 UIA. Cada grupo continha 6 ani

ma i s .

Tabela 3 - Efeito de doses crescentes de inibidor de a-amilase sobre a glicemia

a ~ b f c f d (P ~ 0,05)

O grupo jejum apresentou um valor medio de 60 ~ 6 mg

~

I

79 ~ 7b

3h

+86 - 8

80 ~ 6

81 ~ 11

+85 - 8a

2h

59 ~ 10 d

80 ~ 11 c

85 ~ 7b

85 ~ 11b

93 ~ 10 a

Ih

53 ~ 7d

78 ~ 21 b

6 2 ~ 8c

56 ~ 17 d

107 ~ 10 a

G1icose sérica (mg%)

0,5 h

+89 - 9

a

57 ~ 11 c

52 ~ 11 c

55 ~ 11 c

68 ~ 14 b

233

223

248

221

235

AmidoAdmin.

(mg)

E = Experimental (10, 20, 40 ou 60 UIA com Amido)

9

(g)

Peso

123 ~

131 ~ 5

130 ~ 10

138 ~ 5

124 ~ 8

ElO

E40

E20

E60

Controle

Grupo

Controle (Amido)

Tabela 4 - Efeito de doses crescentes de inibidor de «-ami1ase sobre a digestão do amido no

t r a t o ga s t ro - i nt e s t i na 1 .

Peso Amido Tempo Amido Residual (mg)Grupo Ingerido

( g ) (mg) ( h ) Estômago *Intestino Total %

Jejum 116 :!: 7 O + + O 6 :!:- 0,2 - 0,2 0,3 - 0,1 0,3,

Controle 130 :!: 10 233 3 + + 3,4 :!: 1 ,6 a1,8-1,1 1,6 - 0,9 1 ,2

ElO 123 :!: 9 221 3 + + 17,8 :!: 5,9 b 7,810,6 - 5,8 7,0 - 2,2

E20 124 :!: 8 223 3 + + 24,4 :!: 8 4b14,7 - 6,0 9,7 - 4,2 , 1O,7

E40 138 :!: 5 248 3 + + 36,2 :!: 12,Ob23,3 - 8,4 13,0 - 6,1 14 ,4

E60 131 5 235 3 + 2O, 1 :!: 6,7 44,8 ± 13,7 b20,2 - 9,2 18,8

Controle (Amido)

a f b (p: 0,001)

* % do ingerido

E Experimental (10, 20, 40 e 60 UIA com amido)

I

NC)

I

-21-

5.1.2 - Efeito do IA sobre os nlveis sericos de 91ico

se, i nsul i na, ãc i dos 9r axos e di ges tão do ami do

Neste experimento, foram utilizadas 80 UIA acrescidas

de amido (180 mg/100g peso corporal), sendo os animais sacrifi

cados em diferentes tempos após a administração (O; 1/2; 1; 2 e

4 horas). O extrato de inibidor administrado corresponde ã fra

çao DEAE-ce1u10se (Tabela 1) contendo 41 mg IA na dose de 80 UIA.

As Figuras 1, 2, 3 e a Tabela 5 demonstram os efeitos

do impendimento da digestão do amido, proporcionados pelo IA, so

bre o metabolismo da glicose. Cada grupo continha 6 animais.

5.1.3 - Efeito do IA, isento de contaminação com inibi

dor de tripsina, sobre a glicemia e digestão

do amido

Neste experimento foram utilizados 80 UIA acrescidas

de amido (180 mg/l00g peso corporal), sendo os animais sacrific~

dos em tempos diferentes após a admi ni stração (O, 1, 2 e 4 horas) .

O extrato de inibidor administrado corresponde ã fração s-merca~

toetano1 (Tabela 1) conteudo 40 mg de IA na dose de 80 UIA.

Nas Tabelas 6 e 7 verificamos o efeito do inibidor so

bre a glicemia e a digestão do amido. ~ada grupo continha 6 ani-

mais.

-22-

Figura 1 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre a glicemia,

apos a administração de amido por sonda gástrica .

Os resultados estão representados com os respec-

43

Tempo Choras)

2

Experimental (80 UIA com Amido)

1o

40

Controle (Amido)

....o

120 I- o..À Controle

OVI

• ExperimentalICL....

OOo'

"" 100r VI~ ....

CL.-C'lE'"'au ao-....

'11)

li')

11)

'"ou-

60<)

tivos desvio-padrão.

4321o

-23-

rica, após a administração de amido por sonda gâs-

trica.

.-.- o

50~ o o..... Controleo. O

O T VI • Experimental

I VI .0.""- o...E-::::> 40, /1::J

\ T!o ..'::

'~V')

oc:--::J

'"c:

20

Figura 2 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre a insulina se-

Tempo <horas)

tivos desvio-padrão.

Os resultados estão representados com os respec-

Controle (Amido) Experimental (80 UIA com Amido)

-24-

vos desvio-padrão.

Os resultados estão representados com os respectl

4

Â Controle

• Experimental

32


Tempo (horas)

1o

0.600

Controle (Amido)

,..1.400~ oo

VI~

I I1.200

,-..--CTUJ

:J'-' lOOO'"o)(

c~

t:>u~

Figura 3 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre o nivel serico

de ácidos graxos, após a administração de amido por

sonda gástrica.

Tabela 5 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre a digestão do amido no trato gastro-intesti

na 1 .

-------------

Peso Amido Tempo Amido Residual (mg)Grupo Ingerido

( g ) (mg) ( h ) Estômago *Intestino Total %

Jejum 101 ± 5 - O 0,9 ± 0,2 1 ,7 ± 0,4 2,6 ± 0,6

Cl / 293 ± 11 167 1/2 + + 61 , O :!: 18, Oa22,0 - 18,0 39,0 - 10,0 35

El / 2 95 :!: 15 171 1/2 + 6,4 :!: 4 ,2 107,0 ± 14,5 b101,0-15,0 61

Cl 93 ± 14 167 1 12 O :!: 1 ,4 4 6 :!: 2,0 17,0 :!: 1 ,5 a 9, ,

El 100 ± 15 180 1 + 7,3 ± 4 , 1 75,0:!:11,Ob68,0 - 13,0 40

C2 101 :!: 14 182 2 9 2 :!: 3,0 5,0 ± 0,6 14 O :!: 5 2a 6, , ,

E2 101 + 7 182 2 + 22,0 :!: 46,0 :!: 12,Ob- 23,0 - 13,0 3,0 24

C4 90 :t 17 162 4 O 8 :t O, 1 1 ,8 ± 0,2 2 6 ± O 2a O, , ,

E4 94 :t 14 169 4 19 O :t 7 , 2 12, O ± 8,4 31,0 :!: 12 , Ob 17,

._--_._-

Controle (Amido) Experimental (80 UIA com Amido)

a t- b (P :~ 0,001)

*% do ingeridoI

NUlI

Glicemia (mg %)G r u p o

Oh 1/2h 1h 2h 4h

Controle 47 ~ 7 73 ~ 6a 83 ~ 22 a 76 ~ 10a 58 ~ 9

E 47 ~ 7 43 ~ 2b 49 ~ 5b 57 ~ 6b 49 ~ 5(com amido)

E(sem amido) 47 ~ 7 49 ~ gb 42 ~ 6b 43 ~ 5b 46 ~ 8

IN0'\I

sobre

E = Experimental (80 UIA com Amido e 80 UIA sem Amido)Controle (Amido)

a f b (P ~ 0,001)

Tabela 6 - Efeito do inibidor de a-amilase,isento de inibidor de tripsina.a glicemia.

IN........I

+2,9 - 0,63 1"9

E = Experimental (80 UIA com amido)

*% do i ngeri do

Os grupos experimental com 80 UIA sem amido apresentaram de 1-4hs, valor médio de

c = Controle (Amido)

a ; b (P ~ 0,001)

Tabela 7 - Efeito do inibidQr de a-amilase, isento de inibidor de tripsina, sobre a diges-tão do amido no trato gastro -intestin~l,

Peso AmidQ Tempo Amido Residual (mg)Grupo Ingerido

( g) (mg) (h) Estõmago *Intestino Total %

Jejum 94 ± 5 O + + 3,2 ! 1•O- 2.3 - 1,0 1,0 - 0,1

Cl 88 ! 5 158 1 + + 28,0 ! 42,Oa 167,5 - 7,7 21,0 - 4,0

El 90 ± 5 162 1 + + 85,0 ± 11 ,Ob 5110,0 - 3,8 75,0 - 9,9

C2 87 ± 2 157 2 + + 11,0 ± 0,4a 55,9-1,4 5,0 - 0,4

E2 89 ± 5 160 2 + + 33,0 ± 11 ,Ob 192,1 - 1,0 31,0 -11,0

C4 88 ! 4 158 4 + + 4,3 ± 0,8a 12,8 - 1,0 1,5 - 0,7

E4 89 ± 6 160 4 + + 18,0 ± 6,Ob 93,3 - 3,3 14,4 - 2,7

-28-

5.1.4 - Efeito do IA sobre a secreção e produção da

a-amilase pancre~tica

a) Na presença de contaminação com inibidor de tripsina na

preparação do IA

As determinações da atividade a-pancreática, da pro

teína por grama de pâncreas (Tabela 8); da atividade da a-amila

se, proteína total e atividade da tripsina presente no intestino

(Tabela 9 e 10) foram realizadas nos grupos de animais que rece

beram 80 UIA (item 5.1.2), sendo que o extrato de IA administra

do correspondeu ã fração DEAE- celulose (Tabela 1).

b) Na ausência de contaminação com inibidor de tripsina na

preparação do IA

As determinações da atividade a-amilase pancre~ti-

ca, da pr ote; na por gr ama de pãnc r eas (T abel a 11); da a t i vi da de da

a-ami1ase, proteína total e atividade da tripsina presente no in

testino (Tabela 12 e 13) foram real izadas nos grupos de animais

que receberam 80 UIA (item 5.1.3), sendo que o extrato de IA ad

ministrado correspondeu ã fração s-mercaptoetano1 (Tabela 1).

IN\DI

4h

99 ± 17

2h1h

96± 7c 95 ± 12

60 ± 18d 11 2 ± 10 101 ± 19

Oh

Proteina (mg/g pâncreas)

103 ± 18

103 ± 18

4h2h1h

164 ± 43 ~ 204 ± 43 216 ± 65

190 ± 56 b 205 ± 68 195 ± 20

Experimental (80 UIA com amido)

G f- d (P ~ 0,01)

Oh

At i v. a - amil a se (U A/ 9 pânc re as) x 10-2

224 ± 51

-na no pancreas.

Grupo

Experimental 224 ± 51

Controle

Tabela 8 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre a atividade da a-amilase e teor de prote;-

Controle (Amido)

a f b (P ,< 0,05)

Tabela 9 - Efetto do inibidor de a-amilase pancreitica e sobre proteina total presentes nointestino.

IWoI

4h

9 "!: 2a

28 ! 2b

2h

25 ! 4b

13 "!: 2a

1h

16 :!: 4c

13 "!: 3a

Protefna Total (mg Prot/intestino)

Oh

9 ! 1

9 ! 1

4h2h1h

75"!: 7b 538:!: 83 c 938! 135b

390! 73 a 413! 24 a 291"!: 63 a

Experimental (80 UIA com amido)

a I- c (P ~ 0,02)

Ativ. a-amilase total (UA/intestino)

Oh

265 ! 7

265 ! 7

Grupo

Experimenta1

Controle

Controle (Amido)

a f b (P ~ 0,001)

IW

4h

400 ! 125b

2083 ! 370 a

2h

390! 95 b

2112 ! 280 a

1h

240! 70 b

1951 ! 377 a


Oh

2002 ! 671

2002 :t 671

GrupoAtiv. Tripsina Total (UT/lntestino)

Experimental

Controle

Controle (Amido)

a f b (P ~ 0,001)

Tabela 10 - Efeito do inibidor de a-ami1ase sobre a atividade da tripsina no

intestino.

IWNI

4h

99 ! 17

91 -t 14

102 ~ 9

2h1h

89 ! 18 83! 9

96! 7 95! 12

Proteína (mg/g páncreas )

Oh

103 ! 18

103 ! 18

103 ~ 18 107 ~ 6 110 ~ 4

4h2h

204 ~ 43 a 216 -t 65 a

188 ~ 20b 198 ~ 36b

178 ~ 46b 183 ~ 24b

1 h

164 -t 43 a

198 ~ 23b

197 ! 65b

E = Experimental (80 UIA com Amido e 80 UIA sem Amido)

Ativ. a-amilase (UA/g Pâncreas) x 10- 2

Oh

224 ! 51

224 ! 51

224 ! 51

Grupo

E{sem amido)

E{com amido)

Controle

Controle (Amido)

a f b (P ~ 0,04)

Tabela 11 - Efeito do inibidor de a-amilase isento,de inbidor de tripsina, sobre a atividadeda a-amilase e teor de protelna no pâncreas.

Tabela 12 - Efeito do inibidor de a-amilase, isento de inibidor de tripsina, sobre a atividade daa-amilase pancreática e sobre proteina total presentes no intestino.

Ativ. a-amilase Total (UA/lntestino) Proteína Total (mg Prot./lntestino)Grupo

Oh 1h 2h 4h Oh 1h 2h 4h

Controle 265 ~ 7 390 ~ 73 a- 413 ~ 24a 291 ~ 63 a 9 ~ 1 13 ~ 3a 13 ~ 2a 9 ~ 2a

a f b (P ,< 0,001)

IWWI

21 ~ 3b 14 ~ 2b

23 ~ 4P 13 ~ 3b

22 ~ 1b

21 ~ 2b

9 ~ 1

9 ~ 1

E = Experimental (80 UIA com Amido e 80 UIA sem Amido)

51 ~ 9b 165 ~ 47 b 322 ~ 98

87 ~ 23b 102 ~ 31 b 226 ~ 57b265 ~ 7

265 ~ 7

E(sem amido)

E(com amido)

Controle (Amido)

IW.J::>I

4h

2083 ::t 370 a

2242 ~ 118b

2138 ~ 504

2h

2278 ~ 400

211 2 ::t 289

2280 ::t 240

1h

Ativ. Tripsina Total (UT/Intestino)

2080 ::t 589

1951 ::t 377

1978::t 179

E = Experimental (80 UIA com Amido e 80 UIA sem amido)

Oh

2002 ::t 671

2002 ::t 671

2002 ::t 671

Grupo

E(sem amido)

ECcom amido)

Controle

Controle (Amido)

a f b (P $ 0,04)

J~be1a 13 - Efeito do inibidor de a-amilase, isento de inibidor de tripsina, sobre a ati

vidade da tripsina no intestino.

-35-

5.2 - Ação em animais diabéticos: efeito do IA sobre os ni

veis séricos de glicose, insulina, ãcidos graxos e di

gestão do amido

A diabet~foi induzida com Streptozotocina, com uma

eficãcia de 80% no método, sendo que após o 89 dia da indução os

animais apresentavam alterações decorrentes ao desenvolvimento da

diabetes: hiperglicemia, hipoinsu1inemia, glicosuria, po1iuria ,

polidpsia, polifagia e diminuição no peso corporal (Tabela 2).

Os animais com cerca de 300-350 mg% de glicemia foram

agrupados, permanecendo 16 horas em jejum ate a administração do

inibidor, 80 UIA acrescidos de amido (180 mg/lOOg peso corporal),

e apõs 1 e 4 hor a s f or am:s ac r i f i cados . O ext r a t o de i ni bi do r ad

ministrado corresponde a fração DEAE-ce1u10se (Tabela 1).

Na Figura 4 e nas Tabelas 14 e 15 demonstramos os

efeitos do impedimento da digestão do amido, proporcionados pelo

IA, sobre o metabolismo da glicose em animais diabéticos.

Cada grupo continha 8 animais.

pectivos des~;u ;~drão.

Os resultados estão representados com os res-

....ooOVIa.

4

Â Contrate I

• Experimental

3

Experi menta 1 (80 UIA com Amido)

Te-po l horas1

2

-36-

~

"O~Q..Ao

1o

Controle (Amido)

240

400

I~

: 360~ooc:iV,a.

~(,,)--~

-. 320cnGJ(/)

o(,,)

'--~ 280

Figura 4 - Efeito dQ inibidor de a-amilase sobre a glicemia de

animais diabiticos, apSs a administraçio de amido por

sonda gãstrica.

T0bela 14 - Efeito do inibidor de a-ami1ase sobre a digest~o do amido em animais diabêticos

Peso Amido Tempo Amido Residual (mg)Ingerido

( ru po ( g ) (mg) ( h ) *Estômago Intestino Total %

221 :t 15 O + 2,5 :t 1 , 1 3 7 :t 1 ,2J - 1,2 - 0,6 ,

214:t 12 385 1 26,0 :t 22,0 + 153,0 :t 36,Oa 39C1

127,0 - 50,0

211 :t 19 380 1 + + 339,0 :t 64,Ob 88E1

50,0 -27,0 288,0 - 59,0

199 :t 13 358 4 + 3,5 :t 1 ,8 5 3 :t 1 ,8a 0,5C/I 1,7 - 0,4 ,

202 :t 16 364 4 + + 53,0 :t 26,Ob 14L4

2,5-1,5 50,0 - 26,0

----- _.

C = Controle (Amido) E = Experimental (80 UIA com Amido)

a f b (P ~ 0,001)

*% do i ngeri do

IW'-JI

c ! d (P ~ 0,001)

I

WcoI

+ 0,38 d

+ 0,27 c

1 ,284

0,740

+ 0,10

+ 0,10

0,864

0,864

Sb24 +

29 ~ 10 a


26 "!: 10

26 ~ 1°

Experimental

Controle

Controle (Amido)

a! b (P ~ 0,01)

-39-

(Tabela 3 e Figura 5) que qualquer uma das quatro doses uti 1 i zadas, por

Numa primeira experiencia avaliamos o efeito de do-

e outros parâ-

glicose em ani

Deve-se ressaltar que esse

metros relativos ao metabolismo' da

mais normais

6.1 - Efeito do IA sobre a digestão do amido

proporcional ã dose administrada.

Por outro lado (vide Tabela 4 e Figura 6), a nivel do

um periodo de 30 minutos, ap6s a administração, tem o efeito equl

valente de retardar o aumento da glicemia serica, retardo esse

aumento, de qualquer forma, nunca atinge o nível elevado obtido

após 1 hora para o grupo controle que recebeu somente amido. Es

ses fatos mostram que há uma redução na quantidade total de gli

cose que atinge o compartimento plasmático.

6 - DISCUSS~O

ses crescentes do IA sobre a digestão do amido. Pudemos verificar

intestino observou-se, após 3 horas, um aumento na percentagem de

amido presente, tambem proporcional ã quantidade de IA adminis

trada, mostrando a sua eficiência no bloqueio da digestão e ex

plicando a redução da glicemia.

Como mesmo a dose mais alta de 60 UIA não foi suficiente

para impedir totalmente o aumento da glicemia (Tabela 3 e Figura 5)

realizamos experiência adicional com uma dose maior, de 80 UIA, e,

nesse caso, conseguimos uma redução na glicemia eficaz atê o fi-

-40-

Figura 5 - Efeito de doses crescentes de inibidor de a-amilase

sobre a glicemia.

120

-~ 100Clt

E

•~~

'...••ou

C'

Q.5 1 2

Tempo (horas)

3

.60 UIA)

A Controle (Amido)

• 10 UIA; *20 UIA;

Experimental (Amido

A 40 UI.t\ ou

com

- 41-

Figura 6 - Efeito de doses crescentes de inibidor de a-amilase

sobre a digestão do amido no trato gastro-intestinal,

após 3 horas da administração do amido por sonda gâ~

trica.

E 60E 40E20E 10c

-lo

~

~

.--

~

~

I·

nO

10

50

40,..tilE

•~ 30.~lIJta

11:o'a

E 20c

Concentracão de I ni b idor CUIA)

c = Controle (Amido) E = Experimental (Amido com 10 UIA;

20 UIA; 40 UIA ou 60 UIA).

-42-

nal da digestão (4 horas) (Figura 1). A área diferencial entre

as curvas do grupo controle e experimental foi de cerca de 100%,

indicando que, praticamente nenhuma glicose atingiu o comparti

mento plasmático.

Efeitos semelhantes sobre o alisamento da curva glice

mica foram encontrados por LAJOLO(42), que porem, não estudou a

relação efeito x dose. Utilizando IA da mesma variedade de feijão

este autor obteve, com 11,5 mg de IA, uma área diferencial de

55%, o que corresponde a nossa dose de 20 UIA (cerca de 10,3 mg

IA), a qual causou uma redução de 61% na glicose serica.

A relação dose x efeito foi estudada também por PULLS e

KEUP(58) utilizando, porem, inibidor de 'triqo. Eles·verificaram efeitos de

redução da glicemia com 9, 36 e 144 mg IA/250 mg de amido, mas,

mesmo a maior dose não foi tão efetiva como a nossa de 80 UIA

que contem apenas 40 mg IA/180 mg amido. Assim, parece que o IA

do trigo ê menos eficaz no bloqueio da digestão do amido pelo me

nos "i n vi vo 11 •

Quando se administrou apenas amido (grupo controle) v~

rificamos que, após uma hora (Tabela 5), o amido residual no tra

to digestivo era apenas de cerca de 9% sendo, portanto, quase

que totalmente digerido nesse período. Porem, na presença de

80 UIA encontramos ap6s 1 e 4 horas, respectivamente, cerca de

40 e 24% 0~ amido residual, indicando que o IA cau-

sa um retardo significativo na digestão desse carboidrato (Figu-

ra 7).

Verificamos tambem, por outro lado, um retardo na veloci-

dade de esvaziamento gástrico, sugerido pelo teor de amido residual

no estômago que, no grupo experimental, foi bastante superior ao do gr~

~Controle

• Experimental

Tempo (horas)

Experimental (80UIA com Amido)

-43-

o' ! ! 'T IO 1 2 3 4

C:ontrole (Amido)

100

80"....

C'E'J-C::::l

\J 60."Q.l

IX

....o

40l \ ~ o~

o.Eo<I(

VI~

~

I \20

Figura 7 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre a digestão do

amido no trato gastro -intestinal.

-44-

parte confirmada pelos dados obtidos quando os animais recebe-

po controle nos tempos de 30 e 60 min (Tabela 5).

prese~-aA segunda explicação pode estar relacionada

ram o IA tratado com s-mercaptoetanol; pois nesse caso o teor de pr~

teina foi menor (de 28 mg) (Tabela 1) e o retardo foi pratica

mente inexistente (Tabela 7).

tratada com s-mercaptoetanol) (Tabela 1).

Nos inclinamos mais pela segunda hipótese pensando na

refratariedade ã digestão do inibidor de tripsina, ainda mais que a dife

rença no teor de proteína presente no estõmago dos animais nas

duas experiências foi de apenas 20 mg.

LAJOLO(42) sugeriu que a redução da glicemia causada

pela ingestão de IA com amido é devida realmente a um impedimen

to na digestão do amido e não a um efeito inespeclfico, ou ã re-

Esse retardo pode ser explicado de duas maneiras. Po

de ser devido, segundo CRANE(14) simplesmente ã presença de pro

teina no estõmago consequente ã administração do IA (cerca de

42 mg de proteína) (Tabela 1). Essa hipõtese e pelo menos em

ça da contaminação, na preparação do IA, com inibidor de trips~

na que no caso da segunda experiência foi eliminado (preparação

dução na absorção de glicose; mas a possibilidade do IA alterar

a velocidade do trânsito qastro-intestinal não deve ser totalmen

te descartada.

Assim, parece confirmado que o IA de feijão quando pr!

sente na luz intestinal diminui a velocidade da digestão do ami-

do, atrav~s do impedimento da sua hidr5lise enzimitica, causando

em consequªncia, uma redução na glicemia p5s-prandial e que esse

efeito ê proporcional ã dose de inibidor administrada para uma

-45-

A ação "in vivo" do IA foi confirmada tambem, através de ou-

to, mais uma vez, decorrente do comprometimento da digestão do

do IA

o tratamento consistiu na incubação de ex-

tros parâmetros relacionados com o metabolismo da glicose.

Em nossos experimentos pudemos observar que o IA influe

indiretamente na liberação· de insulina (Figura 2) sendo esse efei

pr es ente no conteu do i nt es ti na 1 de ani ma i s que r ece be r am i ni bi do r

vivo", uma vez que, obtivemos significativa recuperação

amido e redução da glicemia põs-prandial (resultados obtidos com

animais diabeticos serão discutidos adiante).

tratos intestinais com EDTA (10 mg) e tripsina (0,04 mg) a 37 0 C

por 30 mino e posterior adição de cãlcio (1,1 mg), centrifugação

ã 3020 x 9 por 20 min e diãlise por 16 horas contra ãgua,seguin

do-se o doseamento do IA.

em pH inferiores a 3.

Pudemos observar que o IA do feijão não é digerido "in

quantidade fixa de amido.

Cabe ressaltar s que esse IA é resistente ã proteõlise

"in vitro"s FINARDI(19). Não havendo alterações no numero de

residuos de NH 2 e da atividade inibidora da a-amilase em pre

sença de proteases (tripsina, quimotripsina, pepsina e pronase),

embora ANDRIOLO(3) tenha verificado inativação do IA do feijão

com ou sem ami do.

Por outro lado, verificamos altos nlveis sanguineos de

ácidos graxos (Figura 3) nos animais que receberam o IA decor-

rentes da baixa glicemia levando consequentemente a uma maior mo

bilização de lipides do tecido adiposo.

Esses efeitos do IA sobre tais parâmetros são de in-

teresse no caso de individuos obesos, uma vez que, esses possuem

um elevado nivel de insulina circulante, KREISBERG(14), e que

-46-

es-

graxos do tecido adiposo fazendo pensar em possiveis aplicações

dessa substância.

Assim, a redução da digestão do amido e da hipoglice

mia põs-prandial, causada pelo IA, são suficientes ainda para

manter baixos niveis de insulina e para mobilização dos ácidos

sa exerce grande efeito lipogenico no organismo humano,

CASTLE(53) .

MüUNT-

6.2 - IA e controle da a-amilase pancreática

Com os resultados expostos ate o momento, verificamos

que o IA interfere na digestão do amido e que tal efeito parece

ser decorrente do comprometimento da a-amilase com o IA a nivel

intestinal.

Sabe-se tambem, há vãrios anos, que diferentes tipos

de dietas proporcionam uma adaptação das enzimas pancreáticas r~

lativas ao seu componente predominante. Porem, não se tem ainda

conhecimento preciso de qual o mecanismo envolvido capaz de ind~

iir mudanças na sintese e ou secreção dessas enzimas, havendo a

respeito algumas teorias(13).

Em vista disso, nos propusemos a explorar nossos resul

tados com o inibidor de a-amilase,ã luz dessas teorias.

Na primeira experiencia, quando administramos aos ani-

mais a preparação de IA ainda contaminado com inibidor de tripsi

na (IT) (Tabela 9), os resultados referentes ã secreção da a-ami

lase nos induziram a pensar em algum controle semelhante ao me-

-47-

canismo que controla a secreçao de proteases pelo pàncreas. Is-

so porque, com 2 e 4 horas verificamos um expressivo aumento na

atividade da a-amilase intestinal que poderia ser decorrente da

presença de IA ou de amido residual não digerido.

Essa idéia foi abandonada ao verificarmos que a quanti

dade de tripsina presente na luz intestinal estava substancial -

mente reduzida (Tabela 10), possivelmente devido a complexaçao

com o IT. Com o abaixamento do nivel de tripsina ocorre, como é

sabido a liberação de Colecistoquimina-Pancreozimina que agindo

no pâncreas causa a liberação inespecifica de enzimas pancreãti

cas contidas nos grânulos de zimogénios(40) e, estimula também a

sintese de proteases(30)(62).

Apesar de comprometidos pela presença de IT na prepa-

raçao de IA, esses resultados foram apresentados para alertar

com relação a necessidade de eliminação completa desse inibidor

nas experiências que procuram estudar mecanismos digestivos em

proteinas vegetais.

Quando utilizamos o IA tratado com s-mercaptoetanol

tratamento que resultou na eliminação de 99,9% do IT (Tabela 1);

verificamos que, contrariamente aos resultados anteriores, o te

or de tripsina no intestino era elevado indicando a não interfe-

rência pela contaminação de IT (Tabela 13). Nesse caso também,

contrariamente aos resultados da experiênci~ anterior o teor de

a-amilase intestinal não se modificou (Tabela 12). Justifican-

do as suspeistas discutidas anteriormente.

O grupo que recebeu só IA e o grupo que recebeu IA com

amido tambem apresentaram semelhantes teores de a-amilase intes-

tinal (Tabela 12). Como o teor de glicose sanguinea (Tabela 6)

vesse, o teor de a-amilase no grupo que tinha amido residual no

le de secreção-produção da amilase a nível intestinal. Se hou-

corrente de um estimulo inespecífico causado pela presença de

de

so

-48-

pelo menos em ensaios de curta duração não parece haver contro-

havia amido (14,4 mg) presente no grupo que recebeu IA com ami

do e não no outro (4,3 mg) após 4 horas, pode-se concluir que

nesses grupos foi o mesmo não havendo praticamente absorção

1 , d '1 - (1,153146)g lcose que pu esse estlmu ar o pancreas . " e como

intestino deveria ser maior (Tabela 7). Aparentemente como sug~

rido por NAIN e KARE(54) a secreção da a-amilase poderia ser de-

alimento no trato gastro-intestinal.

Se de um lado a liberação parece ser devida a estimulo

inespecifico, pelo menos a sintese parece ser controlada

~ , d l' -o (1,15,31,46) , l' (55,65,66)nlvelS e g lcose serlca e lnsu lna

ou pela glicose que atinge o pâncreas(2,9) decorrentes da

pelos

sérica

dige~

tão do amido ao atingir o intestino; resultados obtidos com o IA

parecem confirmar parte dessas teorias. De fato, analisando a

(Tabela 8) vemos que a nivel do pâncreas houve no grupo contro-

le um aumento na atividade de a- amilase no tempo de 2 horas e par~

lelamente aumento da glicose e insulina serica desses mesmos animais

(1 hora)(Figura 1 e 2).

No grupo onde a digestão foi bloqueada pelo IA, e nao

houve absorção de glicose a atividade da amilase permaneceu cons

tante.

Os baixos teores de proteína no pancreas apos ho ra

da ingestão do IA (Tabela 8) podem ser explicados através da con

taminação com IT na amostra de IA, essa liberação de proteína

seria estimulada pela complexação da tripsina com o IT, fato jâ

confirmado pelos baixos teores de tripsina no intestino

animais (Tabela 10). Posteriormente, verificamos com 2

-49-

desses

horas

aumento no teor de proteina, esse aumento foi decorrente da sin-

tese de proteases, uma vez que a atividade da a-amilase permane

ceu constante. Já no experimento sem contaminação com inibidor

de tripsina no IA não se verificou qualquer alteração na libera

ção de proteinas pelo pâncreas (Tabela 11).

Verificamos ate o momento, através de ensaios de curta

duração, que o IA do feijão interfere na hidrólise do amido sem

afetar a secreção da a-amilase nem a slntese dessa enzima. Os

nossos dados porém, não podem ser comparados com os de autores

que baseados em ensaios crônicos sugeriram outros mecanismos so

bre a modulação da secreção e sintese da a-amilase no pâncreas.

t o caso dos resultados obtidos por :vlACRI e cols.(49) que ao ad-

ministrarem IA do trigo, por 28 dias,em galinhas, verificaram a~

mento na atividade da a-amilase pancreática e hipertrofia no pâ~

creas, sugerindo que o nivel da a-amilase no intestino controla-

ria sua sintese e secreção de forma semelhante ao mecanismo

proteases. No entanto, FOL5H e cols. (22) alimentando ratos

das

com

IA de origem microbiana, após 20 ou 60 dias, observaram diminui

ção no conteudo da a-amilase pancreática sem qualquer alteração

histolõgica no pâncreas, acreditando que a secreção e a sTntese

da a-amilase seriam controladas por um mecanismo diferente

tripsina~ o mesmo foi concluido por IHSE & LILJA(34) estudando

secreçao da a-amilase em porcos com fístula pancreática.

da

a

Portanto, com o uso do IA a curto prazo foi

verifir~r que o mecanismo que control~ a liberação e

da a-amilase pancre~tica e diferente do da tripsina.

possivel

produção

Sugerimos

-50-

assim, a realização de ensaios crônicos com o IA para poder con

firmar se esses efeitos sobre a ~-amilase persistem ou não a

longo prazo.

6.3 - Efeito do IA em animais diabéticos

Em animais diabéticos pudemos verificar um alisamento

na curva glicêmica (Figura 4), onde a ãrea diferencial entre as

curvas do grupo controle e experimental foi de praticamente 100%.

Portanto,: eomo decorrência do impedimento- da digestão do

nenhuma glicose atingiu o compartimento plasmático.

amido

~

W t oportuno comentar que o teor de amilase pancreãticaJ

~ em ratos diabeticos e cerca de 10 vezes menor do que ~em ratos

normais(4), fato também observado por nós (Tabela 2). Aparente

mente, por isso, a eficiência do IA em diabeticos pode ser ainda

maior do que aquela obtida em organismos normais.

Observamos tambem, como nos animais normais, retardo

na digestão do amido (Tabela 14) restando após 1 hora 88% do in

gerido no trato gastro-intestinal e 39% no controle em diabéticos;

nos animais normais os valores correspondentes foram de 40% de

amido residual na presença de IA e 9% no grupo controle apos o

mesmo tempo (Tabela 5). Essa diferença está de acordo portanto,

com a já discutida menor produção de ~-amilase. Esses resulta

dos merecerão estudos adicionais.

Efeitos semelhantes aos nossos, relacionados com a re-

dução da glicemia, foram encontrados por outros autores utili

zando respectivamente IA do trigo ou de mi-Cr:'-or-ganismos em huma-

BIBlIOHcafaculdade de Ciências farmacêulícasUniversidade de São Paulo

- 51 -

nos normais, diabéticos e obesos. Esses autores consideram que

o IA poderia representar um modelo de terapia da obesidade e. (16 23)controle de dlabetes ' .

Decorrente do impedimento da digestão do amido pelo

IA, pudemos observar também aumento nos nlveis de ãcidos gra-

animais

marcantes

xos (Tabela 15) de maneira semelhante verificada nos

normais (Figura 3), apesar de não haver diferenças

nos teores de insulina.

Dessa forma, o IA tem efeito sobre a digestão do ami

do em animais diabéticos como em normais, ressaltando novamen

te que, devido a deficiência da a-amilase nesses animais acredi

tamos que menores doses de IA poderiam ter os mesmos efeitos.

-52-

7 - CONCLUSOES

7.1 - O IA impede a digestão do amido em animais normais cau

sando hipoglicemia e consequentemente alterando outros

parâmetros ligado ao metabolismo da glicose (insulina e

ácidos graxos não esterificados).

7.2 - Esse impedimento da digestão do amido e decorrente do

bloqueio enzimático da a-amilase na luz intestinal.

7.3 - Existe uma relação dose x efeito. Sendo

40 mg IA/180 mg amido em animais normais a

um alisamento total da curva glicêmica.

a dose de

que causa

7.4 - Em ensaios de curta duração a redução da disponibilid~

de da a-amilase no intestino, causada por sua complexa

ção com o IA, não controla a secreção e produção da a

-amilase pancreática. Parece tambem, não haver contro

le desses parâmetros pela presença de amido residual no

trato gastro-intestinal.

-53-

7.5 - O IA afeta a digestão do amido também em animais diabe

ticos, proporcionando um alisamento total da curva gll

cêmica com 40 mg IAJ180 mg.

-54-

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-63-

S U M M A R Y

An a-amylase inhibitor purified from black beans (Pha

seolus vulgaris Lo) prevents the utilization of starch either in

normal or diabetic rats during short-time starch loading tests.

It causes hypoglycaemia and alters accordingly the serum insulin

and non esterified fatty acids levelso These effects are dose

dependent and doses higher than 31 mg of the inhibitor can promote

the complete smoothing on serum glucose levelo The existence of

starch in the presence of the inhibitor in the intestine doesn't

alter the secretion or production of a-amylase by the pancreaso

-64-

TABELAS

pag.

1 - Efeito do tratamento com celite/bentonite e s-mercap-

toetanol na remoção do inibidor de tripsina 11

2 - Efeito da Streptozotocina (4,5 mg/100g peso) na indu-

ção de diabetes 17

3 - Efeito de doses crescentes de inibidor de (X- amilase so

bre a glicemia 19

4 - Efei to de doses crescentes de i ni bidor de êI.- amilase so

bre a digestão do amido no trato gastro-intestinal ... 20

5 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre a digestão do

amido no trato gastro-intestinal 25

6 - Efeito do inibidor de a-amilase,isento de inibidor de

tripsina, sobre a glicemia 26

7 - Efeito do inibidor de a-amilase, isento de inibidor de

tripsina, sobre a digestão do amido no trato gastro -

-intestinal.......................................... 27

8 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre a atividade da

a-amilase e teor de proteina no pâncreas... 29


a-amilase pancreática e sobre proteina total presen -

tes no intestino................................... 30

-65-

pago


t r i ps i na do i nte s t i no. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3l

11 - Efeito do inibidor de a-amilase, isento de inibidor de

tripsina, sobre a atividade da a-amilase e teor de pr.Q.

terna no pâncreas 32

12 - Efeito do inibidor de a-amilase, isento de inibidor detripsina, sobre a atividade da a-amilase pancreãtica

e sobre proteina total presentes no intestino....... 33

13 - Efeito do inibidor de a-amilase, isento de inibidor

de tripsina, sobre a atividade da tripsina no intesti

no 34


amido em animais diabéticos 37

15 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre os n;veis séri-

cos de insulina e ãcidos graxos em animais diabéticos 38

-66-

FIGURAS

pago

1 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre a glicemia, após

a administração de amido por sonda gástrica .

2 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre a insulina seri

ca, apõs a administração de amido por sonda gástrica ..

3 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre o nlvel sericode ácidos graxos, após a administração de amido por

d - .son a gastrl ca .

4 - Efeito do inibidor de a-amilase sobre a glicemia de

animais diabéticos, após a administração de amido por

d - .son a gastrlca .

22

23

24

36

5 - Efeito de doses crescentes de inibidor de a-amilase so

bre a glicemia .. 40

6 - Efeito de doses crescentes de inibidor de a-amilase so

bre a digestão do amido no gastro-intestinal, após 3

horas da administração :_ amido por sonda gástrica.... 41


amido no trato gastro-intestinal 43

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Mestrado Elizabet