Embed Size (px)
Citation preview
Univerzitet u Beogradu
Poljoprivredni fakultet, Beograd-Zemun
Miroslav T. Nikolić
Mehanizam usvajanja gvožđa u mezofilu
lista viših biljaka
Doktorska disertacija
Beograd, 1999.
Poljoprivredni fakultet
Beograd-Zemun
Mentor: Prof. dr Ružica Džamić
Članovi komisije: Prof. dr Rudolf Kastori (Poljoprivredni fakultet, Novi Sad)
Prof. dr Radmila Stikić
Prof. dr Dragutin Veličković
Prof. dr Željko Vučinić (Centar za multidisciplinarne studije, Beograd)
Datum odbrane doktorske disertacije: ______________________
Datum promocije: ______________________
08.10.1999.
30.03.2000.
Mehanizam usvajanja gvožđa u mezofilu lista viših biljaka
Izvod
Cilj ove doktorske disertacije bio je da se prouči mehanizam usvajanja gvožđa (Fe) iz apoplasta u ćelije mezofila lista, kao i da se proveri postojanje inaktivacije Fe, kao mogućeg uzroka Fe-hloroze. U tu svrhu, izvedeni su različiti eksperimenti na suncokretu (Helianthus annuus L.), bobu (Vicia faba L.), kukuruzu (Zea mays L.) i podlogama vinove loze (Vitis ssp.). Biljke su predhodno gajene 2-4 nedelje u hranljivim rastvorima različito obezbeđenim Fe i HCO3
-. Koncentracija malata, a posebno citrata u fluidu apoplasta i eksudatu ksilema značajno se povećala pri nedostatku Fe. Odnos Fe/citrat u fluidu apoplasta bio je značajno veći kod Fe deficitarnih biljaka u poređenju sa biljkama obezbeđenim Fe. Međutim, koncentracija redukujućih supstanci u fluidu apoplasta, kao što su ukupni fenoli nije zavisila od obezbeđenosti Fe. Rezultati jasno ukazuju da je FeIII redukcija vezana za plazmamembranu neophodan preduslov za usvajanje Fe u ćelije lista, kao i da snabdevenost biljaka Fe ne utiče na pojačavanje ovih procesa. Na FeIII redukciju snažan uticaj ispoljili su svetlost, DCMU, kiseonik, kao i egzogeno dodati NADH i vanadat (inhibitor plazmamembranske H+-ATP-aze). Redukcioni kapacitet i usvajanje 59Fe iz obeleženog FeIII-citrata (prirodni Fe-helat u ksilemu i apoplastu) bili su oko 10 puta veći u odnosu na sintetičke Fe-helate (FeEDTA, FeEDDHA). Različita obezbeđenost hranljivih rastvora Fe i HCO3
- nije uticala na pH ksilema i apoplasta lista. Takođe, FeIII redukcija i usvajanje 59Fe u lisnim diskovima nisu zavisili od pH inkubacionog medijuma u okviru fiziološke pH 5.0-6.5, izmerene u fluidu apoplasta lista iz različitih tretmana. Odnos Fe/citrat veći od 1:100 nije ispoljio veći uticaj na usvajanje 59Fe, dok je pri odnosu 1:1000 usvajanje 59Fe znatno smanjeno. Rezultati prikazanih istraživanja ukazuju da se inaktivacija Fe u apoplastu lista ne može smatrati primarnim uzrokom Fe-hloroze izazvane visokom koncentracijom bikarbonata. Ključne reči: apoplast, FeIII-helatna redukcija, Helianthus annuus L., inaktivacija Fe, mezofil lista, simplast, usvajanje gvožđa, Vicia faba L., Vitis ssp., Zea mays L.
Mechanism of Iron Uptake by the Leaf Mesophyll Cells of Higher Plants
Abstract
The objective of this Ph.D. thesis was to study the mechanism of iron (Fe) uptake from the leaf apoplast into the leaf mesophyll cells and to evaluate the proposed Fe inactivation as possible cause of Fe deficiency chlorosis. For this purpose various experiments were conducted on sunflower (Helianthus annuus L.), field bean (Vicia faba L.), maize (Zea mays L.) and grapevine rootstocks (Vitis ssp.). The plants were precultured 2-4 weeks in nutrient solutions with varied Fe and HCO3
- supply. The concentrations of malate and in particularly of citrate in the leaf apoplastic fluid and xylem exudate markedly increased under Fe deficiency, and the Fe/citrate ratio in apoplastic fluid was significantly higher in Fe deficient plants compared with Fe adequate plants. However, the concentrations of reducing substances in the apoplastic fluid such as total phenols were not effected by the Fe nutritional status. The data clearly indicate that plasma membrane-bound FeIII reduction is a prerequisite for Fe uptake into the leaf cells and that Fe nutritional status of plants does not enhance both processes. The FeIII reduction was strongly dependent on light, DCMU, oxygen and exogenous supply of NADH and vanadate (inhibitor of the plasma membrane-bound H+-ATPase). The reduction capacity and the subsequent uptake of 59Fe from radiolabeled FeIII citrate (a natural FeIII chelate form presented in xylem and leaf apoplast) were about 10 times higher than from the synthetic FeIII chelates (FeEDTA, FeEDDHA). In addition, different supply of Fe and HCO3
- to the root medium during preculture had no effect on pH of the xylem sap and leaf apoplastic fluid. Also a varied pH of incubation medium had no effect on FeIII reduction and 59Fe uptake by leaf discs in the physiological relevant pH range of 5.0-6.5 as measured in apoplastic leaf fluids of various treatments. There was no strong effect up to Fe/citrate ratio of 1:100 on 59Fe uptake, whereas at a ratio of 1:1000 59Fe uptake was substantially decreased. The results of presented study suggest that Fe inactivation in the leaf apoplast can not be considered as a primary cause of Fe deficiency chlorosis induced by high bicarbonate concentration. Key words: apoplast, Fe inactivation, FeIII chelate reduction, Helianthus annuus L., iron uptake, leaf mesophyll, symplast, Vicia faba L., Vitis ssp., Zea mays L.
Publikacije:
Nikolic, M., Römheld, V., Neumann, G. 1998. Does the leaf apoplast modulate the occurrence of
iron deficiency chlorosis in field bean (Vicia faba L.)? In: Vol. 2: Ecology and Physiology; Cultural Practices, Ed. Stamenkovic, S. Proceedings 2nd Balkan Symposium on Field Crops, Novi Sad, Yugoslavia, 16-20 June 1998, pp 35-38.
Nikolic, M., Römheld, V. 1999. Mechanism of Fe uptake by the leaf symplast: Is Fe inactivation
in leaf a cause of Fe deficiency chlorosis? Plant and Soil 215: 229-237. Nikolic, M., Römheld, V., Merkt, N. 2000. Effect of bicarbonate on uptake and translocation of
59Fe in two grapevine rootstocks differing in their resistance to Fe deficiency chlorosis. Vitis 39: 145-149.
Mami i Tati
Zahvalnost
Želeo bih da zahvalim prof. dr Ružici Džamić na razumevanju, pomoći i istraživačkoj
slobodi koje mi je pružala u toku rada na ovoj disertaciji.
Prof. dr Rudolfu Kastoriju zahvaljujem na podršci, optimizmu i korisnim savetima u svim
fazama rada.
Prof. dr Folkeru Romheldu (Volker Römheld) sa Univerziteta u Hoenhajmu (Universität
Hohenheim), koji je inicirao ovaj rad, zahvaljujem na pomoći u toku planiranja eksperimenata i
rada u radioizotopnoj laboratoriji, kao i na kritičkim diskusijama.
Prof. dr Radmili Stikić, prof. dr Dragutinu Veličkoviću i prof. dr Željku Vučiniću
zahvaljujem na čitanju rukopisa disertacije i sugestijama.
Dr Ginteru Nojmanu (Günter Neumann) sa Univerziteta u Hoenhajmu, zahvaljujem na
pomoći pri HPLC određivanju organskih kiselina.
Želeo bih da zahvalim kolegama sa Instituta za ishranu biljaka, Univerziteta u Hoenhajmu:
Heiki (Hekie Rogalla), Hejdi (Heidrun Pfeffer), Aliju (Ali Seyed Esna-Ashari), Oliveru (Oliver
Strasser), Bulentu (Bülent Emin-Erenoglu), Volfgangu (Wolfgang Hördt), Franku (Frank
Dannel) i ostalima koji su svojom pomoći i ljubaznošću doprineli da moj boravak u Hohenhajmu
bude posebno prijatan.
Takođe, zahvaljujem Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD) na dodeljenoj
stipendiji.
I na kraju, želeo bih da zahvalim mojim roditeljima Miroslavi i Tomislavu Nikolić na
svemu što su učinili za moje vaspitanje i školovanje.
Skraćenice ATP - adenozintrifosfat BPDS - 4,7-di(4-fenilsulfonat)-1,10-fenantrolin (batofenantrolindisulfonska kiselina) BSA - goveđi serum albumin CCCP- karbonilcianid-m-hlorfenilhidrazon CDTA - cikloheksandiamin DCCD - N,N’ -dicikloheksilkarbodiamin DCMU - 3-(3,4-dihlorfenil)-1,1-dimetilurea DMF- N,N’ -dimetilformamid DTT - ditiotreitol EDDHA - etilendiamin-di(o-hidroksifenilsirćetna kiselina) EDTA - etilendiamintetrasirćetna kiselina Ferrozine - 3-(2-piridil)-5,6-difenil-1,2,4-triazinsulfonska kiselina FITC - fluorescinizotiocijanat FRE1 - ferireduktazni sitem 1 FS - fotosistem HEPES - N-(2-hidroksietil)piperazin-N’-(2-etansulfonska kiselina) HPLC - tečna hromatografija visokog stepena razdvajanja MES - 2-(N-morfolino)-etansulfonska kiselina NADH - nikotinamidadenindinukleotid NADPH - nikotinamindadenindinukleotidfosfat PEP - fosfoenolpiruvat PVP - polivinilpirolidin ST - suva težina SvT - sveža težina TCA - trikarbonske kiseline Tris - Tris(hidroksimetil)aminometan
Sadržaj
1 Uvod .................................................................................................................... 1
2 Pregled literature ............................................................................................... 3 2.1 Uloga gvožđa kod viših biljaka .................................................................................................... 3 2.2 Usvajanje Fe preko korena .......................................................................................................... 4 2.3 FeIII redukcija u korenu ................................................................................................................ 5 2.4 Transport Fe kod biljaka ............................................................................................................. 6 2.5 FeIII redukcija i usvajanje Fe simplastom lista .......................................................................... 7 2.6 Fe-hloroza izazvana bikarbonatima ............................................................................................ 9 2.7 Inaktivacija gvožđa u apoplastu lista ........................................................................................ 10
3 Cilj rada ........................................................................................................... 13
4 Materijal i metode ........................................................................................... 14 4.1 Biljni materijal ............................................................................................................................ 14 4.2 Sastav hranljivog rastvora i uslovi gajenja biljaka ................................................................. 14 4.3 Gajenje biljaka ............................................................................................................................ 15
4.3.1 Bob ......................................................................................................................................... 15 4.3.2 Kukuruz .................................................................................................................................. 15 4.3.3 Suncokret ............................................................................................................................... 15 4.3.4 Podloge vinove loze ............................................................................................................... 16
4.4 Ispitivanja ksilema i apoplasta lista .......................................................................................... 16 4.4.1 Sakupljanje fluida apoplasta lista ........................................................................................... 16 4.4.2 Markeri citoplazmatične kontaminacije fluida apoplasta ...................................................... 17 4.4.3 Sakupljanje eksudata ksilema ............................................................................................... 17 4.4.4 Merenja pH u ksilemu i apoplastu lista .................................................................................. 17 4.4.5 Određivanje organskih kiselina .............................................................................................. 18 4.4.6 Određivanje ukupnih fenola ................................................................................................... 18 4.4.7 Određivanje Fe u fluidu apoplasta i eksudatu ksilema .......................................................... 18
4.5 Ispitivanje mehanizma FeIII redukcije u listu ........................................................................... 18 4.5.1 Priprema lisnih segmenata ..................................................................................................... 18 4.5.2 Merenje FeIII redukcije ........................................................................................................... 19
4.6 Ispitivanje usvajanja 59Fe simplastom lista .............................................................................. 19 4.6.1 Merenje usvajanja 59Fe od strane lisnih diskova .................................................................... 19 4.6.2 Merenje usvajanja 59Fe od strane intaktnih listova ................................................................ 20
4.7 Usvajanje i translokacija 59Fe od korena do lista ..................................................................... 21 4.7.1 Primena 59FeEDDHA ............................................................................................................. 21 4.7.2 Određivanje sadržaja 59Fe u korenu i lisovima ...................................................................... 21
4.8 Analiza Fe u listu ......................................................................................................................... 21 4.8.1 Određivanje Fe u simplastu i apoplastu lista ......................................................................... 21 4.8.2 Određivanje ukupnog i “aktivnog” Fe u listu ........................................................................ 22
4.9 Određivanje hlorofila ................................................................................................................. 22 4.10 Statistička obrada podataka .................................................................................................... 22
5 Rezultati ........................................................................................................... 23 5.1 Uloga apoplasta u usvajaju Fe simplastom lista ...................................................................... 23
5.1.1 Citoplazmatična kontaminacija fluida apoplasta lista boba ................................................... 23 5.1.2 Uticaj ishrane Fe na pH i koncentraciju K+ u apoplastu lista boba ........................................ 24 5.1.3 Uticaj ishrane Fe na sadržaj organskih kiselina i redukujućih supstanci u fluidu apoplasta lista boba ............................................................................................................................................. 25
5.1.4 Uticaj ishrane Fe na koncentraciju Fe u fluidu apoplasta lista boba ...................................... 26 5.1.5 Uticaj ishrane Fe i forme FeIII-helata u apoplastu lista na FeIII redukciju i usvajanje Fe simplastom lista boba ......................................................................................................................... 27
5.2 FeIII redukcija u listu .................................................................................................................. 28 5.2.1 Hemijska i enzimska FeIII redukcija u listu ............................................................................ 28 5.2.2 Vremenski tok FeIII redukcije u listu ...................................................................................... 29 5.2.3 Michaelis-Mentenova kinetika FeIII redukcije u listu ............................................................ 30 5.2.4 Uticaj pH inkubacionog medijuma ........................................................................................ 32 5.2.5 Uticaj svetlosti i DCMU ........................................................................................................ 35 5.2.6 Uticaj NADH i metaboličkih inhibitora ................................................................................. 37 5.2.7 Uticaj kiseonika ..................................................................................................................... 39 5.2.8 Uticaj nedostatka Fe ............................................................................................................... 39
5.3 Usvajanje Fe simplastom lista .................................................................................................... 40 5.3.1 Uloga FeIII redukcije u usvajnju 59Fe simplastom lista .......................................................... 40 5.3.2 Uticaj odnosa Fe/citrat ........................................................................................................... 41 5.3.3 Uticaj pH ................................................................................................................................ 41 5.3.4 Uticaj nedostatka Fe ............................................................................................................... 42 5.3.5 Usvajanje 59Fe lisnim diskovima i intaktnim listovima ......................................................... 44
5.4 Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na moguću inaktivaciju Fe u listu ....................................... 44 5.4.1 Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na pojavu Fe-hloroze kod boba ........................................... 44
5.4.1.1 Sadržaj hlorofila ............................................................................................................................. 44 5.4.1.2 Sadržaj ukupnog Fe ....................................................................................................................... 44 5.4.1.3 Sadržaj Fe u simplastu i apoplastu lista ......................................................................................... 45 5.4.1.4 pH eksudata ksilema i fluida apoplasta lista .................................................................................. 46 5.4.1.5 Koncentracija Fe i organskih kiselina u eksudatu ksilema i fluidu apoplasta lista ....................... 46
5.4.2 Uticaj bikarbonata na FeIII redukciju i usvajanje 59Fe u listu boba ........................................ 47 5.4.3 Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na pojavu Fe-hloroze kod lozne podloge SO4 ..................... 48
5.4.3.1 pH eksudata ksilema i fluida apoplasta lista .................................................................................. 48 5.4.3.2 Koncentracija Fe u eksudatu ksilema ............................................................................................ 49 5.4.3.3 Sadržaj ukupnog i “aktivnog” Fe ................................................................................................... 50 5.4.3.4 FeIII redukcija u listu ...................................................................................................................... 51 5.4.3.5 Uticaj bikarbonata na usvajanje 59Fe korenom i translokaciju 59Fe do listova .............................. 52
6 Diskusija ........................................................................................................... 56 6.1 FeIII redukcija u apoplastu i usvajanje Fe simplastom lista .................................................... 56 6.2 Inaktivacija Fe u apoplastu lista kao mogući uzrok Fe-hloroze ............................................. 65
7 Zaključak ......................................................................................................... 72
8 Literatura ......................................................................................................... 74
Gold is for the mistress – silver for the maid –
Copper for the craftsman, cunning at his trade.
“Good!” said the Baron, sitting in his hall,
“But Iron – Cold Iron – is master of them all”.
Rudyard Kipling, Cold Iron
Uvod
1
1 Uvod
Gvožđe (Fe) je neophodan elemenat za sve žive sisteme, pa i više biljake. Njegova
osnovna metabolička funkcija zasniva se na mogućnosti da stvara helatne komplekse, kao i u
reverzibilnoj promeni oksidacionog stanja između FeIII i FeII. Učešće Fe u razvoju hloroplasta i
biosintezi hlorofila čini da se kao najočigledniji vizuelni simptom njegovog nedostatka javlja
hloroza na mladim listovima. Fe-hloroza je široko rasprostranjena kod biljaka gajenih na
krečnim zemljištima i sigurno pretstavlja svetski problem u gajenju mnogih biljnih vrsta. Iako je
Fe-hloroza dugo godina predmet intenzivnih proučavanja, do danas je nedovoljno poznata
fiziološka osnova ovog problema. Od svih hranljivih elemenata, jedino Fe ne pokazuje uvek
korelaciju između koncentracije u biljnim tkivima i stepena nedostatka, što je još uvek enigma za
biljne fiziologe (Mengel, 1994).
Usvajanje gvožđa preko korena kod dikotiledonih i monokotiledonih biljnih vrsta vrsta
(osim trava) zahteva prethodnu redukciju FeIII-helata, pre transporta Fe2+ u ćelije korena.
(Chaney et al., 1972). U epidermalnim ćelijama korena, nedostatak gvožđa indukuje
plazmamembranski vezan reduktazni sistem koji je sposoban da redukuje FeIII-helate, a što je
praćeno prenosom elektrona kroz plazmamembranu sa NADH ili NADPH iz citosola do
ekstracelularnih FeIII-helatnih jedinjenja. Ova indukovana reduktaza predstavlja glavnu
karakteristiku takozvane strategije I za adaptaciju biljaka na nisku pristupačnost Fe u zemljištu i
intenzivno je proučavana tokom protekle dekade (Bienfait, 1988; Moog & Brüggemann, 1994;
Marschner & Römheld, 1994). Sa druge strane, kod biljaka takozvane strategije II (trave), FeIII
redukcija na plazmamembrani epidermalih ćelija korena ima mali značaj za usvajanje Fe. Koren
ovih biljaka oslobađa neproteinske aminokiseline (fitosiderofore), koje sa Fe u zemljištu grade
komleks FeIII-fitosiderofora, koji se usvaja kroz plazmamembranu preko specifičnog
transportnog sistema (Römheld, 1991).
Usvojeno Fe se iz korena do lista transportuje ksilemom, uglavnom u obliku kompleksa
FeIII-dicitrata (Tiffin, 1972). Iako je u listu utvrđena fotohemijska redukcija FeIII-citrata pod
uticajem kratkotalasne svetlosti (Bennett et al., 1982), pretpostavlja se da je enzimski katalisana
FeIII redukcija ključna za usvajanje Fe2+ iz apoplasta u ćelije mezofila lista (Böttger et al., 1991).
Međutim, za razliku od korena, pročavanja FeIII-helatne redukcije u listu su na samom začetku
(Brüggemann et al., 1993; de la Guardia & Alcántara, 1996) i dosadašnja saznanja o mehanizmu
usvajanja Fe u ćelije mezofila lista su oskudna. Jedna od najvažnijih fizioloških uloga apoplasta
vezana je za usvajanje jona, transport i skladištenje hranljivih elemenata (Gringon & Sentenac,
Uvod
2
1991), ali uloga apoplasta lista u usvajanju Fe od strane simplasta još uvek nije dovoljno
poznata.
Potvrđeno je da bikarbonati (HCO3-), kao pH-puferi utiču na povećanje pH u rizosferi i
apoplastu korena i inhibiraju mobilizaciju i usvajanje Fe u korenu (Römheld & Marschner,
1986a). Osim toga, postoji pretpostavka da visoka snabdevenost korena bikarbonatima i
nitratima može da smanji fiziološku pristupačnost Fe u listu, preko povećanja pH u apoplastu
lista, što je nazvano inaktivacijom Fe (Mengel, 1994). Jedno od objašnjenja moguće inaktivacije
gvožđa u apoplastu lista je da visoka koncentracija bikarbonata izaziva povećanje pH apoplasta
lista, što bi, slično korenu, imalo za posledicu inhibiciju FeIII-helatne reduktaze i usvajanja
gvožđa u ćelije. U tom slučaju, pri visokoj pH apoplasta moglo bi da dođe do raspadanja
kompleksa FeIII-citrat i taloženja Fe u obliku FeIII-hidroksida i fosfata ili njegovog čvrstog
vezivanja u ćelijskom zidu (Bienfait & Scheffers, 1992). Međutim, do sada postoji veoma malo, i
to kontroverznih podataka, o uticaju HCO3- na promenu pH ksilema i apoplasta lista, što čini
ovaj problem izuzetno aktuelnim za dalja proučavanja.
Pregled literature
3
2 Pregled literature
2.1 Uloga gvožđa kod viših biljaka
Gvožđe (Fe) kao prelazni elemenat ima sposobnost da relativno lako menja oksidaciono
stanje (FeIII + e- ⇔ FeII) i da gradi oktaedralne komplekse sa različitim ligandima (Marschner,
1995). Ova promenljivost u oksidacionim stanjima je u osnovi specijalne uloge gvožđa u
biološkim redoks sistemima. Visok afinitet gvožđa prema različitim ligandima (npr. organskim
kiselinama ili neorganskim fosfatima) čini da joni Fe3+ ili Fe2+ nemaju značaja u transportu Fe na
manja i veća rastojanja kod biljaka. Uprkos tome, u aerobnim sistemima mnogi nisko-
molekularni Fe-helati, a posebno slobodno gvožđe (Fe3+ ili Fe2+) su vrlo efikasni u produkciji
reaktivnih kiseoničnih vrsta kao što su O2, H2O2, O2• - i OH•
(Halliwell & Gutteridge, 1986), kroz
Fentonovu (2) i Haber-Weissovu (3) reakciju.
Fe3+ + O2•
- → Fe2+ + O2 (1)
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + OH• (2)
O2• - + H2O2 → O2 + OH- + OH• (3)
Oksido-redukcione reakcije gvožđa unutar heminskih i neheminskih proteina od izuzetnog su
značaja za transport elektrona i antioksidantnoj zaštiti biljne ćelije (Marschner, 1995).
U biljkama postoje dve glavne grupe proteina koji sadrže Fe: hem proteini (npr. citohrom,
katalaza, peroksidaza, nitrat reduktaza, leghemoglobin, itd.) i Fe-S proteini (npr. feredoksin,
superoksid dismutaza, nitrit reduktaza, sulfat reduktaza, akonitaza, nitrogenaza, itd.) koji
učestvuju u mnogim metaboličkim procesima (Römheld & Marschner, 1991; Marschner, 1995).
Osim enzima koji sadrže Fe, postoje i mnogi drugi enzimi (lipoksigenaza, 3-aminolevulinat
sintetaza, itd.) kod kojih Fe ima ulogu aktivatora (Marschner, 1995).
Nizak sadržaj hlorofila (hloroza) u mladim listovima, kao najočigledniji vidljivi simptom
nedostatka Fe, izazvan je inhibicijom nekoliko Fe-zavisnih sekvenci u biosintezi hlorofila.
Zajednički prethodnik u sintezi hlorofila i hema jeste d-aminolevulinska kiselina (ALA), čija je
sinteza kontrolisana od strane Fe (Miller et al., 1982, 1995; Pushnik & Miller, 1989). Gvožđe je
takođe potrebno i za sintezu protohlorofilidmonometil estra iz Mg-protoporfirina IX (Spiller et al.,
1982). Koproporfirinogen oksidaza je protein koji sadrži Fe (Chereskin & Castelfranco, 1982), a
Pregled literature
4
konvezija koprofirinogena do protoporfirina IX, takođe zahteva prisustvo gvožđa (Hsu & Miller,
1969).
2.2 Usvajanje Fe preko korena
Gvožđe je vrlo zastupljen elemenat u zemljinoj kori. Ukupni sadržaj Fe u većini zemljišta je
oko 3.2% (Murad & Fischer, 1988). Međutim, samo mali deo gvožđa u zemljištu pristupačan je za
više biljke. U dobro aerisanim zemljištima, u okviru pH od 4 do 8, Fe se pretežno nalazi u obliku
FeIII-oksida i hidroksida, tako da je koncentracija slobodnih Fe3+ i Fe2+ jona ekstremno mala (ispod
10-10 M) (Lindsey & Schwab, 1982). Na povećanje rastvorljivosti Fe u zemljištu, pored redoks
potencijala zemljišta i pH zemljišnog rastvora, utiču još i koncentracija nisko-molekularnih
jedinjenja nastalih pri degradciji organske materije, kao što su fulvo kiseline (Römheld &
Marschner, 1986a), kao i koncentracija mikrobioloških siderofora koje predstavljaju produkte
mikoriznih gljiva i nekih bakterija (Powell et al., 1982). Ove materije sposobne su da sa
neorganskim Fe stvaraju stabilne i dobro rastvorljive organske komplekse (Fe-helate) (Uren, 1984).
U dobro aerisanim zemljištima sa nižim sadržajem organske materije koncentracija helatnog gvožđa
u zemljišnom rastvoru je takođe vrlo niska (10-8 do 10-7 M), što je ispod potrebnih količina za
adekvatan rast biljaka (Römheld & Marschner, 1986a). Da bi se prilagodile na nisku pristupačnost
gvožđa u zemljištima, više biljke su razvile specifične adaptivne mehanizme za mobilizaciju i
usvajanje Fe, što im omogućava da obezbede dovoljnu količinu gvožđa potrebnu za njihov
metabolizam (Römheld, 1987).
U biljnom carstvu identifikovana su dva različita mehanizma (strategije) za mobilizaciju Fe u
rizosferi i usvajanje Fe u korenu (Marschner & Römheld, 1994). Pri nedostaku gvožđa dikotiledone
i monokotiledone biljke, sa izuzetkom trava, ispoljavaju strategiju I (Römheld & Marschner, 1986a;
Römheld, 1987; Brown & Jolley, 1988, 1989; Bienfait, 1989; Marschner & Römheld, 1994). Kod
biljaka strategije I odgovor korena na nedostatak gvožđa obuhvata četiri adaptivne reakcije: (a)
povećanje aktivnosti ili aktivacija FeIII reduktaze vezane za palzmamembranu (Chaney et al., 1972;
Bienfait et al., 1983; Römheld & Marschner, 1986a); (b) povećnje neto otpuštenih protona
(Venkat Raju & Marschner, 1972; Landsberg, 1981; Römheld & Marschner, 1981; Römheld et
al., 1984); (c) odavanje redukujućih i/ili helatirajućih supstanci (uglavnom fenola ili organskih
kiselina) (Olsen et al., 1981; Römheld & Marschner, 1983; Chaney & Bell, 1987; Jolley &
Brown, 1987) i (d) formiranje bočnih korenova, korenovih dlačica i rizodermalnih transfernih
ćelija (Römheld & Marschner, 1981; Römheld & Kramer, 1983; Chaney et al., 1992; Landsberg,
Pregled literature
5
1994). Ovi adaptivni mehanizmi korena (strategija I) detaljnije su opisani u nekoliko revijalnih
radova (vidi: Marschner & Römheld, 1986a; Marschner et al., 1986; Römheld, 1987; Bienfait,
1989; Welkie & Miller, 1993; Marschner & Römheld, 1994). Kod biljaka strategije II, gde
spadaju trave (taksonomski red Poales), odgovor korena na nedostatk gvožđa uključuje dva tipa
adaptivnih reakcija: (a) povećano izlučivanje eksudata korena, takozvanih fitosiderofora (Takagi
et al., 1984) koji vrše helatizaciju neorganskog FeIII u rizosferi i (b) usvajanje kompleksa FeIII-
fitosiderofora preko specifičnog transportnog sistema na plazmamembrani ćelija korena
(Römheld & Marschner, 1986b; Römheld, 1987; Römheld & Marschner, 1990; Ma et al., 1993).
2.3 FeIII redukcija u korenu
Trans-plazmamembranska redoks aktivnost može se definisati kao transport elektrona sa
unutar ćelijskih (intercelularnih) donora kao što su redukcioni ekvivalenti NADH ili NADPH do
van ćelijskih (ekstracelularnih) akceptora (Crane et al., 1985) preko različitih flavoproteinskih
oksido-reduktaza u plazmamembrani. Kao što je već pomenuto, u korenu dikotiledonih i
monokotiledonih biljnih vrsta (osim trava) redukcija FeIII-helata je neophodan preduslov za
usvajanje gvožđa u ćelije korena (Chaney et al., 1972). Redoks sistem potreban za ovu redukciju
identifikovan je na plazmamembrani ćelija korena kod mnogih biljnih vrsta (Bienfait et al., 1983;
Buckhout et al., 1989; Brüggemann et al., 1990; Schmidt et al., 1990; Holden et al., 1991; Cohen
et al., 1997). Bienfait (1985) je pretpostavio da u korenu biljaka postoje dva različita tipa
plazmamembranski vezanih redoks sistema, koje je nazvao “standard” (osnovni, konstitutivni) i
“turbo” (indukovani) sistem.
Standardni sistem predstavlja konstitutivnu trans-plazmamembransku reduktazu u svim
biljnim tkivima, koja može da redukuje spoljašnje akceptore elektrona sa visokim redoks
potencijalom (veštački fericijanid ili in vivo kiseonik) i čija aktivnost ne zavisi od sadržaja Fe u
biljkama (Bienfait & Lüttge, 1988). Glavna fiziološka uloga ovog redoks sistema bila bi u
generisanju visoko reaktivnih jedinjenja kao što su reaktivne kiseonične vrste (Böttger i Lüthen,
1986) i askorbatni slobodni radikali (Asard et al., 1995) ili redukcija FeIII-helata (Cakmak et al.,
1987; Moog & Brüggemann, 1994) i nitrata (de Marco et al., 1995), pri čemu dolazi i do
depolarizacije membranskog potencijala (Moog & Brüggemann, 1994).
U epidermalnim ćelijama korena biljaka startegije I, nedostatak gvožđa indukuje
palzmamembranski vezani reduktazni sitem (“turbo”; Bienfait, 1985), kao glavnu komponentu
odgovora korena na nisku pristupačnost Fe u zemljištu (Bienfait, 1988, 1989; Bienfait & Lüttge,
Pregled literature
6
1988; Marschner & Römheld, 1994; Moog & Brüggemann, 1994). Ovaj indukovani redoks
sistem sposoban je da redukuje različita FeIII-helatna jedinjenja u apoplastu korena, što je
praćeno prenosom elektrona sa NADPH (Sijmons et al., 1984b; Lubberding et al., 1988) ili
verovatnije sa NADH (Buckhout et al., 1989; Brüggemann et al., 1990; Schmidt & Janiesch,
1991) iz citosola do ekstarcelularnih FeIII-helata kroz plazmamembranu.
Plazmamembranska ATP-aza uključena je u FeIII-helatnu redukciju korena biljaka
strategije I preko odavanja H+, čime se održava optimalna pH (oko 5.5) za redoks aktivnost na
strani plazmamembrane prema apoplastu i kontrola elektronskih šarži na celoj površini
plazmamembrane (Alcántara et al., 1991; Toulon et al., 1992; Moog & Brüggemann, 1994;
Rabotti & Zocchi, 1994). Zbog toga biljne vrste strategije I pokazuju simptome hloroze na
alkalnim (krečnim) zemljištima koja imaju visoku koncentraciju HCO3- i jak pH-puferni
kapacitet (Römheld, 1987; Toulon et al., 1992).
2.4 Transport Fe kod biljaka
Mehanizam radijalnog transporta Fe od rizodermalnih ćelija kroz korteks i dalje do
ksilemskih sudova još uvek nije dovoljno jasan (Zhang, 1995). Kod biljaka sa strategijom I,
FeIII-helati se redukuju u apoplastu korena, pre transporta u citoplazmu (Chaney et al., 1972;
Römheld & Marschner, 1983). Posle redukcije FeIII-helata na palzmamembrani rizodermalnih
ćelija, oslobođeni Fe2+ iz helata, sledeći gradijent membranskog potencijala, prolazi kroz jon-
specifične kanale ili putem prenosioca (posebni transportni protein; Kochian, 1991; Fox et al.,
1996) ulazi u simplast korena. Usvojeno FeII u citoplazmi vezuje se za endogeni FeII-helator,
jedinjenje nikotianamin (Stephan et al., 1990; Stephan & Scholz, 1993), koji je takođe i
prethodnik u biosintezi fitosiderofora kod biljaka strategije II (Shojima et al., 1990). Kompleks
FeII-nikotianamin dalje se trasportuje kroz simplast, što uključuje i transport od ćelije do ćelije
preko plazmodezmi (Scholz et al., 1988, 1992; Stephan & Scholz, 1993).
Pre ulaska u ksilem, FeII se u simplastu oksidiše do FeIII forme (Brown and Jolley, 1989),
kompleksira sa citratom i uglavnom se u obliku FeIII-citrata transportuje preko ksilema do
gornjih delova biljke (Tiffin, 1966a, 1966b, 1970, 1972; White et al., 1981; Chaney, 1989). Na
brzinu transporta gvožđa kroz ksilem posebno utiče intenzitet transpiracije (Branton & Jacobson,
1962; Schultz & Marschner, 1969).
Gvožđe pokazuje zadovoljavajuću pokretljivost u floemu (Hill, 1980; Stephan et al., 1994;
Zhang et al., 1995b). Tako je retranslokacija obeleženog Fe iz razvijenih (starijh) ka mladim
Pregled literature
7
listovima uočena kod različitih biljnih vrsta (Bukovac & Wittwer, 1957; Pandey & Kannan,
1979; Römheld, 1979; Zhang et al., 1995a, 1996). Zbog nedovoljne razvijenosti ksilema u
meristemu i slabijeg intenziteta transpiracije mladih listova Fe se do mladih listova uglavnom
transportuje kroz floem (Zhang et al., 1995a, 1995b). U floemskom soku dominiraju
FeIII-kompleksi (Mass et al., 1988; Mori et al., 1991) ili kompleks FeII sa nikotianaminom
(Stephan & Scholz, 1993; Schmidke & Stephan, 1995).
2.5 FeIII redukcija i usvajanje Fe simplastom lista
U ćelijama mezofila lista gvožđe ima važnu ulogu u razvoju hloroplasta i odvijanju
fotohemijskih i metaboličkih reakcija (Terry, 1980; Terry & Abadía, 1986). U ranijem periodu
smatralo se da fotohemijska redukcija FeIII-citrata do Fe2+ pod uticajem UV i plave svetlosti ima
ključnu ulogu u obezbeđivanju pristupačnog Fe u listu (Brown et al., 1979; Olsen & Brown,
1981; Bennett et al., 1982; Krizek et al., 1982; Jolley et al., 1987). Kako je u većini navedenih
radova proučavana samo in vitro redukcija FeIII kompleksa pod uticajem svetlosti različitih
talasnih dužina, ovakva tumačenja imaju pretežno spekulativni karakter. Jedino su Jolley et al.
(1987) u svome radu utvrdili da redukcija FeIII-citrata u intaktnim listovima pamuka zavisi od
svetlosti različite talasne dužine. Pored pretpostavke da gvožđe ulazi u ćelije lista kao Fe2+ posle
fotoredukcije FeIII-citrata (Brown et al., 1979), postojala je i pretpostavka da se FeIII-citrat
transportuje kroz plazmamembranu i redukuje u citoplazmi ćelija mezofila, pod uticajem
kratkotalasne svetlosti (Kolesch, 1985).
Međutim, danas je više prihvaćena pretpostavka da je za usvajanje Fe2+ iz apoplasta u
ćelije mezofila lista neophodna sekundarna enzimska FeIII redukcija (Böttger et al., 1991), ali su
eksperimentalne potvrde za ovakvu pretpostavku još uvek nedovoljne (Brüggemann et al., 1993).
Za razliku od korena, vrlo malo se zna o postojanju plazmamembranske redoks aktivnosti u
fotosintetskim ćelijama lista, o čemu je objavljeno samo nekoliko radova. Upotrebom
fericijanida, kao veštačkog akceptora elektrona visokog redoks potencijala (+360 mV),
postojanje plazmamembranskih redoks sistema i transport elektrona kroz plazmamembranu
fotosintetskih ćelija utvrđeno je u celim biljkama Lemna gibba (Lass et al., 1986), lisnim
segmentima ovsa (Dharmawardhane et al., 1987) i šećerne repe (Askerlund et al., 1989),
izolovanim ćelijama mezofila Asparagus sprengeri (Neufeld & Bown, 1987), protoplastima
stominih ćelija Commelina communis (Gautier et al., 1992), kao i u prečišćenim
plazmamembranskim vezikulama listova šećerne repe i spanaća (Askerlund et al., 1989;
Pregled literature
8
Askerlund et al., 1991). Međutim, kako je fericijanid jedinjenje koje pokazuje vrlo visok redoks
potencijal i proizvod reakcije, ni jedan od pomenutih radova nije dao potvrdu o usvajanju
oslobođenog Fe2+ (Brüggemann et al., 1993).
Prema istraživanjima Campbella i Redinbaugha (1984) fericijanid i FeIII-citrat u listu mogu
biti redukovani i od strane NADH-zavisne nitrat reduktaze, ali je FeIII redukcija prostorno
odvojena od redukcije nitrata. Kako se NO3- i FeIII-citrat, kao dva prirodna akceptora za
elektrone, redukuju na različitim mestima nitrat reduktaze, ne postoji kompeticija za mesto
redukcije, ali se ova dva supstrata takmiče za slobodne elektrone, pri čemu su NO3- efikasniji
(Redinbaugh & Campbell, 1983). Iako je utvrđeno postojanje NADH-zavisne nitrat reduktazne
aktivnosti na plazmamembrani (Lüthje et al., 1997), fiziološki značaj ove FeIII redukcije nije u
usvajanju Fe od strane simplasta, ali bi mogao da bude u remobilizaciji Fe iz fitoferitina kao
rezervnog jedinjenja gvožđa koje se nalazi u stromi hloroplasta (Seckbach, 1982). Međutim, nije
jasno kako bi taj mehanizam mogao da se odvija, kada se nitrat reduktaza nalazi u citoplazmi
(Terry & Abadía, 1986), pa bi verovatniji mehanizam redukcije FeIII iz fitoferitina bio preko
askorbatnih radikala (Bienfait & van der Mark, 1983). Prema Omholtu i Boyeru (1988) nitrat
reduktaza nije glavna komponenta FeIII reduktazane aktivnosti koja se odvija na mebranama, ali
može da bude uključena u in vivo redukciju i asimilaciju gvožđa.
FeIII-helatna redukcija na plazmamembrani proučavana je u protoplastima Acer
pseudoplantanus, dobijenim u kulturi (Macrì et al., 1992), mezofilu lista i izolovanim,
prečišćenim plazmamembranama Vigna unguiculata (Brüggemann et al., 1993) i u intaktnim
lisnim diskovima suncokreta (de la Guardia & Alcántara, 1996). Do sada su jedino Brüggemann
et al. (1993) eksperimentalno dokazali da je prethodna enzimska FeIII redukcija na
plazmamembrani ćelija mezofila neophodna za usvajanje Fe2+ iz apoplasta u ćelije mezofila
Vigna unguiculata, posle čega centralni joni (Fe2+) mogu biti usvojeni nezavisno od helatora
(citrata). Na usvajanje Fe simplastom lista mogao bi da utiče nivo endogenog nikotianamina,
verovatno preko mehanizma povratne sprege u regulaciji Fe-homeostaze u ćeliji i njenim
kompartmentima (Pich & Scholz, 1991).
Fotosintetski aktivna radijacija pokazala je snažno stimulativno dejstvo na FeIII redukcionu
aktivnost i usvajanje Fe u listu (Brüggemann et al., 1993; de la Guardia & Alcántara, 1996). Ovo
se dovodi u vezu sa povećanjem odnosa NAD(P)H:NAD(P)+ tokom fotosinteze, ali FeIII
redukcija može biti posredno potpomognuta i nastankom superoksid radikala ili jakom sevetlosti
(fotoredukcija) (Brüggemann et al., 1993). FeIII redukcija intaktnog mezofila i izolovanih
Pregled literature
9
plazmamembrana Vigna unguiculata ispoljila je Michaelis-Mentenovu kinetiku, a razlike su
ispoljene u većim Km utvrđenim u intaktnom tkivu (Brüggemann et al., 1993).
Ne postoji dovoljno eksperimentalnih dokaza o uticaju nedostatka Fe na povećanje ili
aktiviranje FeIII redukcije, kao što je to slučaj u korenu. Listovi suncokreta i Vigna unguiculata
nisu pokazali povećanje FeIII redukcione aktivnosti kada su bili izloženi nedostatku Fe
(Brüggemann et al., 1993; de la Guardia & Alcántara, 1996). Sa druge strane, u listovima, kao i u
korenu Fe deficitarnih biljaka Arabidopsis thaliana utvrđena je povećana akumulacija frohC
gena, za koje je vrlo verovatno da su, preko sinteze proteina klase FRE1, direktno uključeni u
FeIII redukciju pri usvajanju Fe iz zemljišta ili njegovoj retranslokaciji u biljci (Robinson et al.,
1997).
2.6 Fe-hloroza izazvana bikarbonatima
Povećana koncentracija bikarbonata u zemljišnom rastvoru smatra se glavnim faktorom
koji izaziva Fe-hlorozu kod većeg broja biljaka, koje rastu na krečnim zemljištima (Boxma,
1972; Mengel et al., 1984; Römheld & Marschner, 1986a; Bertoni et al., 1992; Mengel, 1994). U
zavisnosti od parcijalnog pritiska CO2 u tim zemljištima, koncentracija HCO3- u zemljišnom
rastvoru obično se kreće u intervalu 1-4 mM (Takkar et al., 1987), ali u rizosferi lako može da
poraste i preko 10 mM, posebno u zemljištima bogatim organskom materijom ili na plavljenim
zemljištima (McCray & Matocha, 1992). U hranljivim rastvorima HCO3- takođe mogu da
izazovu Fe-hlorozu, što se često koristi za testiranje otpornosti biljnih genotipova na Fe-hlorozu
(Coulombe et al., 1984; Romera et al., 1991, 1992; Chaney et al., 1992).
Fiziološka osnova Fe-hloroze kod biljaka gajenih pri povišenoj koncentraciji HCO3- nije
potpuno objašnjena (Loeppert & Hallmark, 1985; Mengel, 1994). Postoje različita objašnjenja
kako bikarbonati deluju na rastenje korena i metabolizam (Yang et al., 1994; Alhendawi et al.,
1997), na usvajanje i transport Fe (Forno et al., 1975; Fleming et al., 1984; Cinelli et al., 1995) ili
na fiziološku pristupačnost gvožđa u listu (Mengel, 1994). Potvrđeno je u mnogim
proučavanjima da HCO3- deluju kao jaki puferi na održavanje visoke pH u rizosferi i apoplastu
korena i tako inhibiraju mobilizaciju i usvajanje gvožđa od strane korena i njegovu translokaciju
do listova (Rutland & Bukovac, 1971; Römheld et al., 1982; Fleming et al., 1984; Römheld &
Marschner, 1986a). Bikarbonati u rizosferi mogu da izazovu povećanje pH apoplasta korena,
tako što HCO3- neutrališu H+ odate iz citosola preko plazmamembranske ATP-aze (Mengel &
Geurtzen, 1988; Kosegarten et al., 1998). Visok sadržaj bikarbonata, što je tipično za krečna
Pregled literature
10
zemljišta, mogao bi tako da dovede do povećanja pH apoplasta korena, ali i drugih delova biljke,
uključujući i apoplast lista (Mengel & Geurtzen, 1986).
2.7 Inaktivacija gvožđa u apoplastu lista
Biljka se u celini, osim stominih ćelija, može podeliti na tri glavna kompartmenta:
vakuolu, simplast i apoplast, koji su jedni od drugih odvojeni tonoplastom i plazmamembranom
(Dannel et al., 1995). Rastvor apoplasta biljnih ćelija smatra se kao sadržaj dva glavna prostora:
(a) Donnanovog slobodnog prostora, u kome je rastvor apoplasta pod uticajem elektrostatičkog
potencijala fiksirane negativne šarže karboksilnih grupa matriksa zida i (b) slobodnog prostora za
vodu, u kome je rastvor apoplasta izvan uticaja tih sila (Starrach i Mayer, 1989). Dugo vremena
apoplast viših biljaka smatrao se kao “mrtvi produkt ekskrecije živog simplasta” (vidi: Mühling
& Satetlmacher, 1995). U skorije vreme, apoplast sve više postaje atraktivan za različita
istraživanja, zbog toga što sadrži različite enzime (Li et al., 1989; Li & McClure, 1990; Pinedo et
al., 1993) i visoke koncentracije metabolita, kao što su različite forme askorbinske kiseline (Polle
et al., 1990; Luwe et al., 1993; Takahama, 1993) i šećera (Tetlow & Farrar, 1993); ima ulogu u
zaštiti od zagađivača vazduha kao što su SO2 (Pfanz & Oppmann, 1991), usvajanju i transportu
vode (Canny et al., 1988), usvajanju jona u ćeliju (Jeschke, 1976; Kaiser & Heber, 1983),
transportu i skaladištenju mineralnih hraniva (Starrach & Mayer, 1989; Wolf et al., 1990; Zhang
et al., 1991), u odbrambenim reakcijama protiv patogena (Roby et al., 1985; Pinedo et al., 1993);
uključen je u prenosu signala u koje spadaju biljni hormoni (Hartung et al., 1992).
Glavni razlog za još uvek slabo poznavanje procesa koji se odvijaju u apoplastu, svakako
je metodološke prirode, jer do sada primenjene metode imaju ograničeni pristup ovom prostoru
(Dannel et al., 1995; Mühling & Sattelmacher, 1995). U proučavanju in situ apoplasta korišćene
su mikroelektrode (Blatt, 1985; Starrach & Mayer, 1989) i jon-selektivne fluorescentne boje
(Hoffmann et al., 1992; Tetlow & Farrar, 1993; Mühling et al., 1995). Za izolovanje fluida
apoplasta najčešće se primenjuju dve metode, koje su razvijane proteklih godina: (a) izlaganje
listova povećanom pritisku, primenom modifikovane Scholanderove bombe (Jachetta et al.,
1986; Hartung et al., 1992) i (b) metode infiltracije i centrifugiranja (Terry & Bonner, 1980;
Rohringer et al., 1983; Pfanz & Oppmann, 1991; Aked & Hall, 1993; Pinedo et al., 1993; Dannel
et al., 1995; Mühling & Sattelmacher, 1995). Prva metoda omogućava dobijanje čistog rastvora
apoplasta, ali je njegova zapremina suviše mala za mnoge analize. Iako druga grupa metoda daje
Pregled literature
11
veće zapremine, moguće je da postupak infiltracije u različitim rastvorima ili destilovanoj vodi
dovede do promene pH i koncentracije jona u fluidu apoplasta (Dannel et al., 1995).
Uloga apoplasta korena u usvajanju, vezivanju i akumulaciji rezervnog Fe u korenu je
dobro poznata (Bienfait et al., 1985, Tipton & Thowsen, 1985; Longnecker & Welch, 1990;
Zhang et al., 1991). Takođe, postoji nekoliko publikacija o distribuciji Fe u apoplastu i simplastu
lista (Pich & Scholz, 1991; Becker et al., 1992; Zhang, 1995b; George, 1996). Međutim, vrlo
malo se zna o ulozi apoplasta lista u usvajanju Fe simplastom lista, posebno u vezi sa
pretpostavljenom Fe inaktivacijom u listu. Promene pH apoplasta lista mogu izazvati nekoliko
različitih faktora, kao što su: svetlost (Mühling et al., 1995), zagađivači vazduha (Pfanz &
Oppmann, 1991), mineralna ishrana (Hoffmann et al., 1992), suša (Hartung et al., 1988) ili
fitohormoni (Aloni et al., 1988).
Svako povećanje pH ksilemskog soka ili apoplasta lista moglo bi da pomogne disocijaciju
kompleksa FeIII-citrat i dovede do taloženja FeIII-fosfata ili hidroksida, ili do čvrstog vezivanja
FeIII u ćelijskom zidu (Bienfait & Scheffers, 1992). Stoga se, akumulacija gvožđa u apoplastu
lista često koristi kao objašnjenje za Fe-hlorozu na listovima biljaka koje su rasle u zemljištima
sa visokim sadržajem bikarbonata ili u hranljivim rastvorima sa nitratnom formom azota, što je
opisano kao inaktivacija gvožđa u listu (Mengel & Geurtzen, 1988; Mengel, 1994). Nitrati se,
kao glavni mineralni oblik azota u većini biljaka, translociraju kroz ksilem do listova (van
Beusichem et al., 1988) i usvajaju preko nitrat/proton-kotransporta i OH--antiporta (Thibaud &
Grignon, 1981; Ullrich, 1992) iz apoplasta u ćelije lista. Ovo znači da pri usvajanju
NO3- istovremeno ulaze protoni u citosol a odaju se OH- joni u apoplast, tako da se pH apoplasta
lista povećava. Uprkos dobrom pH-pufernom kapacitetu ćelijskog zida (Pfanz i Dietz, 1987),
povećanje pH apoplasta lista, mereno različitim tehnikama, zabeleženo je pri ishrani nitratnim
oblikom azota kod suncokreta (Hoffmann et al., 1992; Mengel et al., 1994; Dannel et al., 1995),
soje (Englisch, 1993; Kosegarten & Englisch, 1994) i kod kukuruza (Englisch, 1993). Nasuprot
tome, azotna forma (NH4+/NO3
-) nije uticala na promenu pH apoplasta lista kod Vicia faba
(Mühling & Sattelmacher, 1995).
Iako u vezi uticaja bikarbonata na povećanje pH apoplasta lista postoje mnoge spekulacije,
samo su Mengel et al. (1994) eksperimentalno pokazali da visoka koncentracija HCO3- (10 mM)
indukuje povećanje pH apoplasta lista suncokreta. Efekat nitrata na pojavu Fe-hloroze i
povećanje pH ksilemskog soka suncokreta, koji može da predstavlja i pH apoplasta, bio je
pojačan u kombinaciji sa bikarbonatima (Kosegarten et al., 1998). Sa druge strane, HCO3-
dodati preko korena mogu biti uključeni u sintezu organskih kiselina u korenu i tako fiksirani in
Pregled literature
12
situ preko PEP karboksilaze (EC 4.1.1.41) do malata (Cramer et al., 1993; Davies, 1986), i u tom
obliku se mogu dalje transportovani kroz ksilem do lista. Međutim, visoka snabdevenost korena
bikarbonatima uticala je na povećanje pH citoplazme lista, što je utvrđeno u različitim
eksperimentima kod suncokreta i vinove loze (Kolesch et al., 1984, 1987). U održavanju pH
ravnotežnog stanja ćelije (pH-stat mehanizam), svako povećanje pH citosola odražava se i na
spoljašnju pH (Felle, 1988), pa se može pretpostaviti da u tom slučaju bikarbonati mogu da
izazovu povećanje pH apoplasta u listu. U prilog tome govore rezultati da je ozelenjavanje
hlorotičnih listova posle različitih tratetmana bilo povezano sa smanjenjem pH u apoplastu lista
(Mengel & Geurtzen, 1988; Plänker, 1991).
Potvrda hipotezi o inaktivaciji Fe u listu može da bude to što se u izvesnim slučajevima u
hlorotičnim listovima može naći slična ili čak veća koncentracija Fe nego kod zelenih listova
(Mengel et al., 1984; Kosegarten & English, 1994; Nikolić, 1995; Kosegarten et al., 1998). Taj
fenomen nazvan je “paradoks hloroze” i on navodi na zaključak da Fe-hloroza može biti
izazvana inaktivacijom Fe u listu, posebno u apoplastu lista, npr. preko procesa alkalizacije
(Römheld, 1999). Koncentracija “aktivnog” gvožđa u listu, koje predstavlja frakciju Fe
ekstahovanu razblaženim kiselinama (Häussling et al., 1985) ili FeII helatorima (Abadía et al.,
1984), uvek pokazuje dobru korelaciju sa sadržajem hlorofila u listovima biljaka gajenih u
poljskim uslovima (Mengel & Bübl, 1983; Abadía et al., 1989; Nikolić, 1995). Međutim, priroda
“aktivnog” gvožđa, kao i njegova lokalizacija u listu još uvek nije poznta (Abadía, 1992).
Nasuprot tome, istraživanja Dockendorfa i Höfnera (1990) nisu potvrdila inaktivaciju Fe u
listovima pod uticajem HCO3- u hranljivom rastvoru, što ukazuje na primarno delovanje
bikarbonata na nivou korena.
Cilj rada
13
3 Cilj rada
Na osnovu proučene novije literature došli smo do zaključka da je mehanizam usvajanja
gvožđa iz apoplasta u simplast lista još uvek nedovoljno poznat i da postoji niz nerešenih pitanja,
posebno u vezi sa dilemom o mogućoj inkativaciji Fe u apoplastu lista. Stoga bi glavni cilj ovih
istarživanja bio je da se detaljnije prouči mogući mehanizam usvajanja Fe iz apoplasta u ćelije
mezofila lista viših biljaka, posebno pri različitoj obezbeđenosti biljaka Fe. Takođe, ova
istraživanja trebalo bi da ukažu na značaj prethodne FeIII redukcije na plazmamembrani ćelija
lista, kao preduslova za usvajanje Fe u citoplazmu ćelija mezofila. Važno pitanje koje se
postavlja u ovim istraživanjima je da li nedostatak Fe indukuje FeIII reduktazni sistem listu, kao
što je to slučaj u korenu. Od posebnog značaja je da se objasni uticaj visoke koncentracije
spoljašnjeg HCO3- (hranljivi rastvor) na pH apoplasta lista i njegove moguće uloge u
pretpostavljenoj inhibiciji FeIII redukcije na plazmamembrani ćelija lista i inaktivaciji Fe u
apoplastu lista, kao mogućem uzroku Fe-hloroze.
Ova istraživanja, takođe imaju za cilj da ukažu da li je mehanizam usvajanja gvožđa u listu
opšte važeći kod viših biljaka ili se razlikuje u zavisnosti od mehanizma mobilizacije i usvajanja
Fe od strane korena (strategije I i II; Marschner & Römheld, 1994). Za tu svrhu korišćene su
različite biljne vrste koje ispoljavaju i različit stepen otpornosti na Fe-hlorozu (Vicia faba L.,
Helinathus annuus L., Vitis ssp. i Zea mays L.), pa bi jedan od ciljeva bio utvrđivanje
interspecijskih i genotipskih razlika u pogledu mehanizma usvajnja Fe od strane simplasta lista.
Poseban značaj ovom radu daje i to što je, prema našim saznanjima, ovo jedina do sada
objavljena uporedna studija vezana za FeIII redukciju i usvajanje Fe u mezofilu lista. Pored
prvenstveno teoretskog značaja, ova doktorska disertacija ima i određeni praktični značaj u
regulisanju ishrane biljaka Fe i otklanjanju Fe-hloroze.
Materijal i metode
14
4 Materijal i metode
4.1 Biljni materijal
U različitim eksperimentima koji su imali za cilj proučavanje mehanizma usvajanja Fe od
strane simplasta lista, sa posebnim obzirom na inaktivaciju Fe kao mogućeg uzroka Fe-hloroze,
korišćene su sledeće biljne vrste: bob (Vicia faba L.), suncokret (Helianthus annuus L.), vinova
loza (Vitis ssp.) i kukuruz (Zea mays L.).
Bob (Vicia faba L. cv. Troy) odabran je kao model biljka u najvećem broju eksperimenata,
jer se sa njegovih listova lako uklanja donji (abaksijalni) epidermis i tako dobija intaktni mezofil.
U toku gajenja u hranljivom rastvoru bez Fe, bob je pokazivao početnu otpornost prema Fe-
hlorozi, zbog visoke koncentracije Fe u krupnim kotiledonima (Kosegarten et al., 1998; O.
Strasser, lično saopštenje). Ova biljka, takođe je veoma često korišćena u različitim ispitivanjima
apoplasta lista (Aloni et al., 1988; Mühling & Sattelmacher, 1995; Mühling et al., 1995).
Veći deo eksperimanata vezanih za usvajanje 59Fe simplastom lista obavljen je na
suncokretu (Helinathus annuus L. cv. Frankasol), kao biljnoj vrsti osetljivoj na Fe-hlorozu (V.
Römheld, lično saopštenje). Kukuruz (Zea mays L. cv. Alice), kao genotip otporan na Fe-hlorozu
(von Wirén et al., 1995), korišćen je za poručavanje FeIII redukcije u listu.
Uticaj bikarbonanata u hranljivom rastvoru na moguću inaktivaciju Fe u listu, proučavan je
na loznoj podlozi SO4 (Vitis berlandieri × Vitis riparia), za koju su ranija ispitivanja pokazala da
je otporna na Fe-hlorozu (Kolesch, 1985; Bavaresco et al., 1991).
Ispitivanje usvajanja 59Fe preko korena i njegove translokacije do listova u intaktnim
biljkama, obavljena su na loznim podlogama različite otpornosti prema Fe-hlorozi, osetljivoj
Vitis riparia (Brancadoro et al., 1995) i otpornoj 41B (Vitis vinifera cv. Chasselas × Vitis
berlandieri) (Pouget & Ottenwalter, 1975).
4.2 Sastav hranljivog rastvora i uslovi gajenja biljaka
U svim eksperimentima biljke su gajene u hidroponima. Osnovni hranljivi rastvor sadržao
je (M): 0.7 × 10-3 K2SO4; 0.1 × 10-3 KCl; 2 × 10-3 Ca(NO3)2; 0.5 × 10-3 MgSO4; 0.1 × 10-3
KH2PO4; 1 × 10-5 H3BO3; 0.5 × 10-6 MnSO4; 0.5 × 10-6 ZnSO4; 0.2 × 10-6 CuSO4; 1 × 10-8
(NH4)6Mo7O24. Hranljivi rastvori u kojima je gajena Vicia faba sadržali su dodatno i 3 × 10-6 M
Materijal i metode
15
CoCl2 (Mühling et al., 1995). Hranljivi rastvori menjani su svaka 3-4 dana, uz neprekidno
uduvavanje vazduha.
Biljke su gajene u komori sa kontrolisanim uslovima sa fotoperiodom od 16/8 h
(svetlost/mrak), temperaturom 24/22oC, relativnom vlažnosti vazduha 65-75% i intenzitetom
svetlosti oko 240 µmol fotona m-2 s-1.
4.3 Gajenje biljaka
4.3.1 Bob
Seme boba (Vicia faba L. cv. Troy) preko noći je držano u zasićenom rastvoru CaSO4, uz
stalno produvavanje vazduha, a zatim je nakijavano na filter papiru navlaženom zasićenim
rastvorom CaSO4. Posle 5 dana klijanci su preneti u plastične sudove zapremine 3 l (10
biljaka/sudu) i gajeni naredna 4 dana u 1/2 razblaženom kompletnom hranljivog rastvoru. Posle
toga, biljke su dalje gajene 3-4 nedelje u različitim uslovima ishrane Fe: 1 × 10-4 M FeEDDHA, za
+Fe biljke; 2 × 10-7 M FeEDDHA, za -Fe biljke; 1 × 10-6 M FeEDDHA, uz dodatak 10 mM
NaHCO3.
4.3.2 Kukuruz Seme kukuruza (Zea mays cv. Alice) naklijavano je na fliter papiru navlaženom zasićenim
rastvorom CaSO4 u toku 5 dana, posle čega su malde biljke prenete u plastične sudove zapremine 3 l
(10 biljaka/sudu) i gajene naredna 4 dana u 1/2 razblaženog kompletnog hranljivog rastvora. Posle
toga biljke su dalje gajene 14 dana u hranljivim rastvorima sa različitom ishranom Fe: 1 × 10-4 M
(+Fe); 1 × 10-6 M (-Fe).
4.3.3 Suncokret Seme suncokreta (Helianthus annuus L. cv. Frankasol) nakijavano je u kvarcnom pesku
navlaženom zasićenim rastvorom CaSO4. Posle 7 dana mlade biljke su prenete u plastične sudove
zapremine 3 l (10 biljaka/sudu) i gajene 4 dana u 1/2 razblaženom kompletnom hranljivom rastvoru,
a zatim su biljke dalje gajene 14 dana u hranljivim rastvorima sa različitom ishranom Fe: 1 × 10-4 M
FeEDDHA (+Fe); 2 × 10-7 M FeEDDHA (-Fe).
Materijal i metode
16
4.3.4 Podloge vinove loze Reznice loznih podloga (Vitis ssp.) ožiljavane su tokom 4 nedelje u vlažnom kvarcnom
pesku u staklari. Ožiljene reznice pažljivo su izvađene iz kvarcnog peska, koren je ispran
tekućom vodom, a zatim ispiran u zasićenom rastvoru CaSO4 tokom 12 časova, uz neprekidnu
aeraciju. Tako pripremljene biljke prenete su u plastične sudove od 3 l (4 biljke/sudu) i dalje
gajene u hranljivim rastvorima pri različitim tretmanima.
Lozna podloga SO4 gajena je naredih 21 dana pri različitim koncentracijama Fe (0, 10 i
100 µM FeEDDHA) i HCO3- (0, 5, 10 i 20 mM NaHCO3).
Lozne podloge V. riparia i 41B gajene su 18 dana u hranljivim rastvorima različitio
snabdevenim Fe: 1 × 10-4 M FeEDDHA (+Fe) i 2 × 10-7 M FeEDDHA (-Fe).
4.4 Ispitivanja ksilema i apoplasta lista
4.4.1 Sakupljanje fluida apoplasta lista
Sakupljanje fluida apoplasta iz intaktnih listova boba obavljeno je metodom centrifugiranja
prema Dannelu et al. (1995). Listovi (oko 10 g SvT) su odvojeni od biljke i njihove peteljke su
odsečene skalpelom neposredno uz lisnu laminu, a zatim su listovi orijentisani sa odsečenim
delom peteljke prema dole, omotani oko plastičnog valjka, obavijeni i pričvršćeni plastičnom
folijom oko ose i postavljeni u Ependorf špric od 50 ml. Svi postupci obavljani su na
termperaturi 4oC. Da bi se metoda modifikovala i prilagodila za listove boba, centrifugalna sila je
povećavana za 500 × g, od 1000 do 4000 × g, a tako dobijene frakcije posebno su sakupljne i
proverene na eventualnu citoplazmatičnu kontaminaciju. Za kasnije analize korišćena je frakcija
dobijena centrifugiranjem na 3000 × g, posle odbacivanja prethodne frakcije dobijene na 1500 ×
g. Vreme centrifugiranja u svim frakcijama iznosilo je 15 minuta, na temperaturi 4oC.
Kod listova vinove loze za sakupljanje fluida apoplasta lista, korišćena je metoda
infiltracije i centrifugiranja (H. Rogalla, lično saopštenje). U toku infiltracije listova pod
vakuumom u izotoničnom rastvoru, ovaj rastvor ulazio je u apoplast lista i ispirao rastvorljive
komponente, čime je dobijen isprani intercelularni fluid (IWF-intracellular washing fluid).
Listovi su odvojeni od biljke i skalpelom su isečeni duž glavnog nerva, tako da su dobijene dve
polovine lisne lamine. Delovi listova oprani su u ledeno hladnoj dejonizovanoj vodi, a zatim su
30 minuta infiltrirani u eksikatoru u 0.28 M izotoničnom rastvoru sorbitola (Hauseted &
Schjoerring, 1995), na 4oC, pod vakuumom (-35 kPa). Po završenoj infiltraciji pritisak u
eksikatoru je lagano povećavan, čime je omogućen potpun ulazak infiltracionog rastvora u
Materijal i metode
17
apoplast lista. Listovi su potom pažljivo osušeni upijajućom hartijom i orijentisani tako da je
presek listova postavljan na gore, a zatim su postavljeni u Ependorf špric od 50 ml, kako je to
već opisano. Centrifugiranje je obavljeno na 2000 × g u toku 15 minuta na 4oC.
Da bi se špric sa listovima fiksirao tokom centrifugiranja korišćen je posebno napravljen
PVC pribor za centrifugu po Dannelu et al. (1995). U dobijenim uzorcima odmah je meren pH ili
su uzorci trenutno zamrzavani u tečnom azotu i do analiza čuvani na -20oC.
4.4.2 Markeri citoplazmatične kontaminacije fluida apoplasta
Za ispitivanje eventualne citoplazmatične kontaminacije fluida apoplasta lista, kao markeri su
poslužili su aktivnost malat dehidrogenaze (MDH; EC 1.1.1.37) i koncentracija K+ jona koji su
uproređivani sa lisnim homogenatom.
Homogenat listova dobijan je tako što su sveži listovi odmah zamrznuti u tečnom azotu, a
zatim homogenizovani na 4oC u rastvoru pufera, koji je sadržao: 50 mM Tris (pH 7.5), 0.5 mM
EDTA, 2 mM DTT, 1 mM CaCl2, 1% BSA i 1% PVP. Posle 10 minuta centrifugiranja na 10 000 ×
g (4oC), supernatant je sakupljen i odmah analiziran.
Aktivnost MDH određena je spektrofotometrijski na 340 nm, preko reakcije enzimske
redukcije oksal-acetata kao supstrata uz korišćenje NADH kao donora elektrona. Reakcioni
medijum sadržao je u krajnjoj koncentraciji: 50 mM Tris (pH 9.5), 0.1 mM NADH i 0.4 mM
oksal-acetata, uz dodatak 25 µl supernatanta homogenata lista ili 50 µl fluida apoplasta, do ukupne
zapremine reakcionog medijuma od 1 ml.
Koncentracija K+ jona u fluidu apoplasta i supernatantu homogenata lista određena je
atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom (Unicam 939), tako što su uzorci prethodno
razblaženi dejonizovanom vodom (1:1000), uz dodatak La/Cs pufera (1:4).
4.4.3 Sakupljanje eksudata ksilema Biljke boba su presečene 2 cm iznad korena, dok je kod vinove loze presek napravljen na
zelenim lastarima 2 cm iznad drvenog dela reznice. Na presecima su postavljeni komadići
plastičnog creva dužine 3 cm i fiksirani parafilmom. Eksudat ksilema sakupljan je Pasterovom
pipetom tokom 2 časa, a posle odbacivanja eksudata dobijenog tokom prvih nekoliko minuta.
Sakupljeni eksudat je duboko zamrznut i čuvan na -20oC do kasnijih analiza.
4.4.4 Merenja pH u ksilemu i apoplastu lista
U uzorcima fluida apoplasta lista i eksudata ksilema pH-vrednost je merena mikroelektrodom
(Mettler Toledo Inlab 432, Electrolyte 9811), odmah po njihovom sakupljanju.
Materijal i metode
18
4.4.5 Određivanje organskih kiselina Uzorci fluida apoplasta i eksudata ksilema, koji su prethodno bili zamrznuti na -20oC,
razblaženi su dejonizovanom vodom (fluid apoplasta 1:30; eksudat ksilema 1:10) i u njima su
određene organske kiseline metodom HPLC (GROM, Herrenberg, Germany). Organske kiseline su
razdvojene i upoređivane sa poznatim standardima, korišćenjem kolone RP-18 (GS ODS 120 3CP 3
µm veličine čestica) 250 × 4 mm I.D. i zaštitne kolone (GS ODS 5 µm veličine čestica) 10 × 4 mm
I.D. Eluacija je obavljena sa sa 18 mM KH2PO4 (pH 2.2 podešen sa H3PO4), brzina proticanja
iznosila je 0.5 ml/min, zapremina injektiranja 20 µl, temperatura je podešena na 25oC, a UV-
detekcija na 215 nm.
4.4.6 Određivanje ukupnih fenola Određivanje ukupnih fenola obavljeno je modifikovanom metodom Swaina i Hillisa (1959).
U kivetu za spektrofotometar od 3 ml dodato je 100 µl uzorka (fluid apoplasta ili eksudat ksilema)
ili standarda (kafeinska kiselina), 1000 µl bidestilovane vode uz dodatak 150 µl Folin-Cicolteau
reagensa i sadržaj je odmah promešan. Rastvor je inkubiran u toku 3 minuta, a zatim je dodato 300
µl zasićenog rastvora Na2CO3 i posle inkubacije od 1 časa merena je apsorbanca na 725 nm na
spektrofotometru (Hitachi U 3000). Ukupni fenoli izraženi su kao ekvivalenti kafeinske kiseline.
4.4.7 Određivanje Fe u fluidu apoplasta i eksudatu ksilema Gvožđe je određeno bez prethodne pripreme uzoraka, posle razblaživanja dejonizovanom
vodom (1:1), metodom atomske apsorpcione spektrofotometje uz korišćenje posebnog dodatka za
mikro injektiranje uzorka (25 µl).
4.5 Ispitivanje mehanizma FeIII redukcije u listu
4.5.1 Priprema lisnih segmenata Sa listova boba, pomoću pincete sa tankim vrhom, uklonjen je epidermis sa naličja lista, kako
bi se dobio neoštećeni mezofil. U eksperimentima sa suncokretom, vinovom lozom i kukuruzom
korišćeni su intaktni listovi bez prethodnog uklanjanja epidermisa.
Pomoću borera dijametra 4 mm sa listova isečni su diskovi između glavnih nerava (bob,
suncokret ili vinova loza), a sa listova kukuruza skalpelom su isečne trake 2 × 10 mm, duž
centralnog nerva. Uzorci koji su sadržali 20-40 lisnih diskova (oko 60-100 mg SvT) ili 20 lisnih
isečaka (oko 100 g SvT), posle merenja sveže mase, ispirani su dva puta po 10 minuta u 2 ml
Materijal i metode
19
pufernog rastvora za ispiranje, koji je sadržao: 5 mM MES (pH 6.0), 0.5 mM CaSO4 i 250 mM
sorbitola.
4.5.2 Merenje FeIII redukcije
Posle preinkubacije u rastvoru za ispiranje, isti je zamenjen sa 2 ml inkubacionog rastvora
koji je sadržao: 10 mM MES/KOH (pH 6.0), 0.5 mM CaSO4, 250 mM sorbitola, 20-100 µM FeIII-
citrata ili 100 µM FeIIIEDTA i 300 µM BPDS (bob i suncokret) ili 300 µM Ferrozine (vinova loza i
kukuruz). Da bi se istisnuo vazduh iz apoplasta lista i tako pospešilo ulaženje reakcionog rastvora
u apoplast, vršena je prethodna vakuum infiltracija uzoraka 5 minuta u eksikatoru (-32 kPa).
Lisni diskovi vinove loze pre vakuum infiltracije, dodatno su inkubirani tokom 5 minuta u
rastvoru pufera uz dodatak Triton X-100 (0.05%), kao bi se smanjio površinski napon između
lista i inkubacionog rastvora zbog debele kutikule i gustih dlačica na listu vinove loze. Lisni
diskovi su potom inkubirani 60 minuta u mraku, uz stalno mešanje rastvora (125 rpm) na sobnoj
temperaturi.
FeIII redukcioni kapacitet određen je spektrofotometrijski kao kompleks ružičaste boje
FeII(BPDS)3, merenjem apsorbance na 535 nm ili kao kompleks ljubičaste boje FeII(Ferrozine)2,
merenjem apsorbance na 562 nm. Koncentracija FeII izračunata je korišćenjem milimolarnog
ekstincionog koeficijenta 22.14 mM-1 cm-1 za BPDS (Chaney et al., 1972) ili 25.20 mM-1 cm-1 za
Ferrozine (Chaney, 1989). Kao blank korišćen je inkubacioni rastvor bez lisnog materijala.
4.6 Ispitivanje usvajanja 59Fe simplastom lista
4.6.1 Merenje usvajanja 59Fe od strane lisnih diskova
Obeleženi 59Fe-helati pripremani su 24 časa pre eksperimenta, mešanjem 59Fe-obeleženog
FeCl3 sa EDDHA u odnosu 1:1.1, ili sa limunskom kiselinom u različitim odnosima u zavisnosti od
eksperimenata (1:1.1, 1:100 i 1:1000). Posle dodavanja 10 mM MES, pH rastvora podešen je na 6.0
sa NaOH. Stabilizacija helata obavljena je tokom noći neprekidnim mešanjem na magnetnoj
mešalici, uz dodatak malih komada filter papira kako bi apsorbovali koloide i precipitate gvožđa.
Posle toga, obeleženi rastvor helata je filtriran kroz membranu sa porama 0.1 µm, uz pomoć
vakuuma.
Merenje usvajanja 59Fe simplastom lisnih diskova obavljeno je u staklenim scintilacionim
posudicama sa 40 lisnih diskova. Lisni diskovi prethodno su pripremljeni na isti način kao i za
merenje FeIII redukcije, kao što je to već opisano. Posle vakuum infiltracije u neaktivnom
preinkubacionom rasrtvoru u toku 5 minuta, preinkubacioni rastvor zamenjen je sa 2 ml
Materijal i metode
20
radioaktivnog inkubacionog rastvora, osnovnog sastava: 10 mM MES, 0.5 mM CaSO4, 250 mM
sorbitola. U eksperimentu sa lisnim diskovima boba korišćeni su obeleženi helati 100 µM 59FeEDDHA i 100 µM 59FeIII-citrat (oba specifične aktivnosti 74 GBq mol-1), a u eksperimentu sa
suncokretom 20 µM 59FeIII-citrat (specifične aktivnosti 185 GBq mol-1). Lisni diskovi su inkubirani
60 minuta u obeleženim rastvorima u mraku, uz stalno mešanje (125 rpm) na na sobnoj temperaturi.
Posle inkubacije uklonjen je radioaktivni rastvor i lisni diskovi su kratko vreme ispirani u istoj
zapremini neaktivnog rastvora, a zatim finalno ispirani u 5 min u 5 ml 5 mM MES (pH 6.0) i 0.5
mM CaSO4. Nerastvorljiva radioaktivna feri-jedinjenja iz apoplasta lista uklonjena su
modifikovanom metodom po Bienfaitu et al. (1985), inkubiranjem lisnih diskova u 5 ml 12 .5 mM
Na-ditionita i 1.5 mM 2’,2’-bipiridila 5 minuta, uz neprekidno uduvavanje N2. Po uklanjanju
ekstracelularnog 59Fe, lisni diskovi su finalno isprani u 5 ml 0.5 mM CaSO4 (1 min). Posle 12
časova sušenja na 65oC, merenja suve težine i spaljivanja 8 časova na 550oC, pepeo je rastvoren u 1
ml 1% HCl. Uzorcima je dodato po 1 ml tečnog scintilacionog koktela (Quicksafe A, Zinsser
analytic) i 59Fe radioaktivnost određena je na tečnom scintilacionom spektrometru (Packard 3380
AAA-544).
4.6.2 Merenje usvajanja 59Fe od strane intaktnih listova Za usvajanje 59Fe simplastom intaktnih listova korišćeni su listovi suncokreta čije su peteljke
odsečene ispod vode, kako bi se sprečio ulazak vazduha u ksilem. Peteljka lista je potom pažljivo
uronjena u Ependorf kivetu sa 1.5 ml radioaktvnog rastvora, koji je sadržao 10 mM MES (pH 6.0) i
20 µM FeIII-citrata (1:100), specifične radioaktivnosti 493 GBq mol-1. Da bi se regulisala
transpiracija i tako obezbedilo kontinuirano kretanje radioaktivnog rastvora kroz ksilem do
apoplasta lista, listovi su prekriveni malim vrećicama od providne plastične folije. Inkubacija listova
obavljena je u komori sa kontrolisanim uslovima (temperatura 24oC; relativna vlažnost vazduha
oko 70%; intenzitet svetlosti oko 240 µmol m-2 s-1) u toku 2 časa.
Posle inkubacije u radioaktivnom rastvoru, sa lisnog tkiva između nerava napravljeni su
diskovi ( d=4 mm), a zatim su pažjivo isprani 5 minuta u 5 ml rastvora pufera, koji je sadržao: 5
mM MES (pH 6.0) i 0.5 mM CaSO4. Radioaktivno 59Fe iz apoplasta uklonjeno je modifikovanom
metodom po Bienfaitu et al. (1985), kako je to već ranije opisano. Posle završnog ispiranja u 5 ml
0.5 mM CaSO4 (1 min), lisni diskovi su sušeni 12 časova na 65oC i mereni. Biljni materijal je
zatim spaljivan 8 časova na 550oC, pepeo je rastvoren u 1% HCl i 59Fe radioaktivnoist određena je
tečnom scintilacionom metodom.
Materijal i metode
21
4.7 Usvajanje i translokacija 59Fe od korena do lista
4.7.1 Primena 59FeEDDHA Neposredno pre radioaktivnog eksperimenta, biljke su iz hranljivih rastvora prenete u čaše od
250 ml (jedna biljka po čaši) sa hranljivim rastvorom bez mikroelementa. Posle 2 časa
preinkubacije, biljke su prenete u nove čaše sa 240 ml obeleženog hranljivog rastvora bez
mikroelementa sa 1 × 10-5 M 59FeEDDHA, uz stalno uduvavanje vazduha. Specifična
radioaktivnost obeleženih rastvora iznosila je 5.1 GBq mol-1, za rastvor puferovan sa 10 mM MES
(pH 6.0) i 25.6 GBq mol-1, za rastvor puferovan sa 10 mM NaHCO3 (pH 8.0). Ove razlike uzete su
u obzir pri kasnijim izračunavanjima usvajenog i translociranog 59Fe. Eksperimet je izveden u klima
komori, pri intenzitetu svetlosti od oko 240 µmol m-2 s-1, temperaturi od 24oC i relativnoj vlažnosti
vazduha od oko 75%.
4.7.2 Određivanje sadržaja 59Fe u korenu i lisovima Posle usvajanja 59Fe u toku 12 časova, biljke su pojedinačno prenete iz 59Fe obeleženog
rastvora u čaše sa 250 ml rastvora 0.5 mM CaSO4 i 5 mM MES (pH 5.5), koji je neprekidno aerisan.
Posle 10 minuta ispiranja korena, ekstracelularno 59Fe iz korena uklonjeno je metodom po Bienfaitu
et al. (1985), inkubiranjem korena 7 minuta u 250 ml rastvora, koji je sadržao: 10 mM MES (pH
5.5), 1.5 mM 2’,2’-bipiridila i 12.5 mM natrijum ditionita, , uz neprekidno uduvavanje N2. Posle
toga biljke su podeljene na koren i listove, biljni materijal je sušen 12 časova na 65oC, izmerena
suva težina, a zatim je suvo spaljen na 550oC tokom 8 časova. Pepeo je zatim rastvoren u 10 ml 1%
HCl i 59Fe radioaktivnost određena je na tečnom scintilacionom brojaču. Izračunavanje
usvojenog i translociranog 59Fe obavljeno je prema Römheldu (1979).
4.8 Analiza Fe u listu
4.8.1 Određivanje Fe u simplastu i apoplastu lista Za određivanje Fe apoplasta lista korišćena je metoda po Beckeru et al. (1992). Sa listova su
isečeni diskovi (d=7 mm), kratko vreme isprani u 0.5 mM CaCl2 i preneti u inkubacioni rastvor, koji
je sdržao 10 mM Na2EDTA, 0.5 mM CaCl2 (pH 5.5). Posle dve kratke vakuum infiltracije (-75 kPa)
od po 1 minut, lisni diskovi su inkubirani naredna 2 časa, uz stalno mešanje (125 rpm). Prema
Beckeru et al. (1992), u toku dvo časovne inkubacije ne dolazi do mobilizacije Fe simplasta. Posle
toga, inkubacioni rastvor prenet je u kivetu i centrifugiran 10 minuta na 2500 × g. U alikvotu od 2
ml inkubacionog rastvora određeno je ekstacelularno Fe kao kompleks FeII(BPDS)3, dodavanjem 60
Materijal i metode
22
µl 0.4 mM BPDS, posle prethodne redukcije sa 15 µl 5 mM Na-ditionitom. Absorbanca
FeII(BPDS)3 kompleksa merena je na 535 nm, a za izračunavanje je korišćen milimolarni
koeficijenat ekstincije 22.14 mM-1 cm-1.
Fe simplasta je određeno po uklanjanju Fe iz apoplata lista. Lisni diskovi su isprani nekoliko
puta dejonizovanom vodom, sušeni 12 časova na 65oC, izmereni i potom spaljivani 8 časova na
550oC. Pepeo je rastvoren u 1:30 (v/v) HCl i Fe je određeno atomskom apsorpcionom
spektrofotometrijom.
4.8.2 Određivanje ukupnog i “aktivnog” Fe u listu
Za analizu ukupnog Fe, intaktni listovi su oprani u dejonizovanoj vodi, sušeni 12 časova na
65oC, posle čega je izmerena suva masa. Bijlni materijal je dalje suvo spaljen na 550oC za 8 časova,
pepeo je razoren sa 1:3 (v/v) HNO3 i suvi ostatak je rastvoren u 1:30 (v/v) HCl, posle čega je Fe
određeno atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom.
“Aktivno” gvožđe u listu određeno je metodom po Häusslingu et al. (1985), uz manje
modifikacije. Listovi su zamrznuti u tečnom azotu, a zatim su usitnjeni. Uzorci su ekstahovani
16 časova u 0.5 M HCl (0.5 g u 10 ml) mešanjem na 175 rpm i posle filtriranja (plava traka 5893),
Fe je određeno atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom.
4.9 Određivanje hlorofila
Sadržaj hlorofila određen je spektrofotometrijski na 603, 647 i 664 nm, posle inkubacije 10
lisnih diskova (d=4 mm) u 3 ml DMF 24 časa na 4oC u mraku (Moran & Porath, 1980). Za
izračunavanje sadržaja hlorofila korišćene su formule po Moranu (1982). Takođe je za ocenu
stepena Fe-hloroze često korišćen hlorofilmetar SPAD-502 (Minolta Camera Co., Ltd., Japan),
kao nedestruktivna metoda za merenje sadržaja hlorofila u listu.
4.10 Statistička obrada podataka
Za statističku analizu podataka korišćen je programski paket SPSS, Inc. Razlike između
srednjih vrednosti tretmana utvrđene su analizom varijanse (ANOVA), a ocena statističke
značajnosti testirana je t-testom. Odstupanja od srednjih vrednosti prikazana su u tabelama i
graficima kao standardna devijacija (± SD).
Rezultati
23
5 Rezultati
5.1 Uloga apoplasta u usvajaju Fe simplastom lista
5.1.1 Citoplazmatična kontaminacija fluida apoplasta lista boba Da bi se utvrdio uticaj centrifugiranja na citoplazmatičnu kontaminaciju fluida apoplasta
lista boba (dobijen centrifugalnom tehnikom), centrifugalna sila je povećavana postepeno, uz
pojedinačno sakupljanje frakcija. Karakteristike tako dobijenih parametara prikazane su na slici
1. Najveća zapremina fluida apoplasta lista dobijena je pri centrifugalnoj sili između 2500 i 3000
× g i ona je iznosila 22-27 µl g-1 SvT. Sa daljim povećanjem centrifugalne sile smanjivala se i
zapremina izdvojenih frakcija fluida apoplasta.
Kontaminacija fluida apoplasta simplastom praćena je pomoću aktivnosti MDH i
koncentracije K+ u poređenju sa lisnim homogenatom. MDH aktivnost u sakupljenim frakcijama
fluida apoplasta izražena je u relativnim vrednostima u odnosu na MDH aktivnost homogenata
lista, i takođe je zavisila od brzine centrifugiranja. Najveće vrednosti MDH aktivnost pokazala
je pri 1500-2000 × g, a zatim je naglo opadala sa porastom brzine 2500-3000 × g. U frakciji
dobijenoj centrifugiranjem na 3500 × g zapaža se nagli porast MDH aktivnosti, kao posledica
oštećenja ćelija lista što je i vizuelno uočeno. Vrednost relativne MDH aktivnosti u fluidu
apoplasta dobijenom centrifugiranjem na 3000 × g iznosila je ispod 1%, što ukazuje na vrlo
malo oštećenje ćelija. Koncetracija kalijuma (K+) u fluidu apoplasta paralelno je pratila trend
aktivnosti enzima markera. Na osnovu dobijenih rezultata primenom oba markera (MDH i K+) za
kasnije analize odabrana je frakcija dobijena centrifugiranjem na 3000 × g, posle prethodnog
odbacivanja frakcije dobijene na 1500 × g. Sa druge strane, manja MDH aktivnost i manja
koncentracija K+ u frakciji dobijenoj na 3000 × g, koja je imala maksimalnu zapreminu, moglo
bi da bude vezano i za efekat razblaženja.
Rezultati
24
Zapr
emin
a (µ
l g-1
SvT
)
0
10
20
30
40
50
Kon
cent
raci
ja K
+ (mM
)
0
10
20
30
40
50
Centrifugalna sila (x g)
1500 2000 2500 3000 3500 4000
Rel
ativ
na M
DH
akt
ivno
st (%
)
0
1
2
3
4
5
6
pH a
popl
asta
0
1
2
3
4
5
6
Slika 1. Uticaj brzine centrifugiranja na zapreminu, pH, koncentraciju K+ i MDH aktivnost fluida apoplasta iz intaktnih listova boba. (¨) K+; (n) zapremina; (¡) MDH; (l) pH. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
5.1.2 Uticaj ishrane Fe na pH i koncentraciju K+ u apoplastu lista boba
Uticaj različite ishrane gvožđem na pH i koncentraciju K+ u fluidu apoplasta lista
prikazane su u tabeli 1. Gajenje biljaka boba u hranljivim rastvorima različito obezbeđenim Fe
uticalo je na jasnu pojavu simptoma Fe-hloroze, gde se količina hlorofila smanjila od 5.52 mg g-1
Rezultati
25
SvT na 1.78 mg g-1 SvT, ali to nije značajno uticalo na promenu pH fluida apoplasta lista (P >
0.05). Međutim, nedostatak Fe uticao je na neznatno smanjenje pH apoplasta za oko 0.1 pH
jedinica. U fluidu apoplasta lista biljaka boba koje su bile obezbeđene Fe utvrđena je nešto veća
koncentracija K+ u odnosu na Fe deficitarne biljke, ali ni u ovom slučaju nisu utvrđene statistički
značajne razlike (P > 0.05).
Povećanje koncentracije K+ u apoplastu lista od 15.56 mM (+Fe biljke) do 17.50 mM (-Fe
biljke) praćeno je smanjenjem pH od 5.47 do 5.35, što jasno ukazuje da je K+ influks povezan sa
H+ efluksom.
Tabela 1. Uticaj ishrane Fe na koncentraciju hlorofila u listu, pH i koncentraciju K+ u fluidu apoplasta lista boba. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Tretman Hlorofil Fluid apoplasta lista
(mg g-1 ST) pH K+ (mM)
+Fe 5.52 ± 0.53 5.47 ± 0.07 15.56 ± 2.21
-Fe 1.78 ± 0.20 5.35 ± 0.01 17.50 ± 5.30
5.1.3 Uticaj ishrane Fe na sadržaj organskih kiselina i redukujućih supstanci u fluidu apoplasta lista boba
Sadržaj organskih kiselina u fluidu apoplasta lista boba pri različitoj ishrani Fe prikazan je
u tabeli 2. Za razliku od veoma malog smanjenja pH, koncentracija citrata u apoplastu lista se
vrlo značajno povećala pri Fe nedostatku (P < 0.001), za oko 5 puta u odnosu na Fe snabdevene
biljke. Povećanje koncentracije malata u fluidu apoplasta lista kod -Fe biljaka bilo je manje
izraženo u poređenju sa citratima. Drastično povećanje koncentracije citrata i smanjenje
koncentracije akonitata, koji može da se javi u obliku dva hemijska izomera (cis- i trans-), može
da ukaže na snajenje nivoa enzima akonitaze koji sadrži Fe, u uslovima njegovog nedostatka.
Sadržaj ukupnih fenola, kao glavnih redukujućih supstanci u fluidu apoplasta lista nije se
razlikovao između biljaka različito snabdevenih gvožđem (tabela 3).
Rezultati
26
Tabela 2. Uticaj ishrane Fe na koncentraciju organskih kiselina u fluidu apoplasta lista boba. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD; n.d. - nije detektovano.
Tretman Koncentracija (mM)
Malat Citrat Fumarat cis-Akonitat trans-Akonitat
+Fe 2.69 ± 0.90 3.45 ± 1.44 n.d. 0.06 ± 0.01 0.23 ± 0.05
-Fe 3.89 ± 0.37 17.96 ± 6.48 n.d. 0.07 ± 0.02 0.06 ± 0.03
Tabela 3. Uticaj ishrane Fe na sadržaj redukujućih supstanci (ukupnih fenola) u fluidu apoplasta lista boba. Ukupni fenoli izraženi su kao kafeinska kiselina. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Tretman Ukupni fenoli (mM)
+Fe 13.64 ± 7.82
-Fe 13.11 ± 7.12
5.1.4 Uticaj ishrane Fe na koncentraciju Fe u fluidu apoplasta lista boba Uticaj ishrane Fe na koncentraciju Fe u fluidu apoplasta lista boba prikazan je u tabeli 4.
Koncentracija gvožđa u fluidu apoplasta lista Fe deficitarnih biljaka smanjila se preko 2.5 puta u
odnosu na Fe snabdevene biljke. Smanjenje koncentracije Fe i povećanje koncentracije citrata
(tabela 2) u fluidu apoplasta lista pri nedostatku gvožđa, uticalo je i na značajno povećanje
odnosa Fe/citrat.
Tabela 4. Uticaj ishrane Fe na koncentraciju Fe i odnos Fe/citrat u fluidu apoplasta lista boba. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Tretman Koncentracija Fe Odnos
nmol g-1 SvT µM Fe/citrat
+Fe 1.26 ± 0.33 31.69 ± 4.41 1:100
-Fe 0.47 ± 0.20 12.38 ± 3.54 1:1500
Rezultati
27
5.1.5 Uticaj ishrane Fe i forme FeIII-helata u apoplastu lista na FeIII redukciju i usvajanje Fe simplastom lista boba
U prvom eksperimentu izvršeno je poređenje efekta sintetičkog FeIII-helata i prirodnih
FeIII-helata (prisutnih u ksilemskom soku) na FeIII redukciju od strane lisnih diskova boba.
Prirodni Fe-helati (FeIII-citrat i FeIII-malat) kao izvor Fe u apoplstu lista za FeIII redukciju,
pokazali su nekoliko puta veći redukcioni kapacitet u odnosu na sintetički Fe-helat kao što je
FeIII EDTA (slika 2, 3).
Red
ukci
oni k
apac
itet (µ
mol
Fe2+
g-1S
vT h
-1)
0
1
2
3
FeIII malatFeIII citratFeIIIEDTA
+ Fe- Fe
Pretretman
Pretretman+Fe- Fe
!
Slika 2. Uticaj različitih izvora FeIII-helata na FeIII redukciju u lisnim diskovima boba. Posle vakuum infiltracije u preinkubacionom medijumu, lisni diskovi su inkubirani u standardnom inkubacionom medijumu sa 100 µM Fe u obliku FeIIIEDTA (Fluka), FeIII-citrata (1:1.1) ili FeIII-malata (1:1.1). Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
U skladu sa prethodnom FeIII-helatnom redukcijom na plazmamembrani ćelija lista,
usvajnje 59Fe od strane citoplazme takođe je zavisilo od forme FeIII-helata. Na slici 3 jasno se
može uočiti da biljke prvenstveno usvajaju FeIII-citrat kao prirodni oblik helatnog gvožđa, koji je
dominantan u ksilemskom soku i fluidu apoplasta lista boba (tabela 2). Prirodni oblik helatnog
Fe (FeIII-citrat) pokazao je oko 10 puta veću FeIII redukciju i usvajanje 59Fe u simplastu lista
boba, u odnosu na sintetičke helate (FeIIIEDTA i FeIIIEDDHA). Izračunate Michaelis-Mentenove
konstante FeIII-helatne redukcije veoma su se razlikovale od primenjene Fe-helatne forme. Tako
je redukciju FeIII-citrata u apoplastu lista boba karakterisala Km = 58 µM, dok je redukcija
FeIIIEDTA pokazala mnogo veću vrednost Km = 165 µM. Ishrana Fe nije pokazala značajan
uticaj na FeIII redukciju i usvajanje 59Fe od strane simplasta lista boba (slika 2, 3).
Rezultati
28
5.2 FeIII redukcija u listu
5.2.1 Hemijska i enzimska FeIII redukcija u listu Da bi se utvrdila priroda redukcije FeIII-helata u listu paralelno je merena ukupna redukcija
u lisnim diskovima i hemijska redukcija od strane redukujućih supstanci koje su iz citoplazme
ćelija lista otpuštene u apoplast. Iz te razlike dobijena je enzimska redukcija FeIII-helata, koja
predstavlja aktivnost FeIII reduktaze vezane za plazmamembranu ćelija mezofila lista.
Slika 3. Uticaj FeIII-helatne forme na FeIII redukciju i usvajanje 59Fe u lisnim diskovima boba. (A) Eksperiment je izveden reakcionom medijumu koji je sadržao: 10 mM MES/KOH (pH 6.0), 0.5 mM CaSO4, 250 mM sorbitola, 300 µM BPDS i 100 µM FeIIIEDTA (Fluka) ili 100 µM FeIII-citrata (1:1.1), ponaosob. Prikazane su srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD. (B) Eksperiment je izveden u radioaktivnom rastvoru (specifična aktivnost 74 GBq mol-1 ), koji je sadržao: 10 mM MES/KOH (pH 6.0), 0.5 mM CaSO4, 250 mM sorbitola, 300 µM BPDS i 100 µM 59FeIIIEDDHA ili 100 µM FeIII-citrata (1:1.1). Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
FeIII citrat
Red
ukci
ja (µ
mol
Fe2+
g-1
SvT
h-1
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5+ Fe - Fe
FeIIIEDTA
A
Usv
ajan
je (µ
mol
59Fe
g-1
SvT
h-1
)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
59FeIIIEDDHA
B(X 10)
Pretretman
59FeIII citrat
Rezultati
29
U tabeli 5 sumirani su rezultati ovih eksperimenata. Hemijska redukcija FeIIIEDTA
iznosila je oko 10% od ukupne redukcije, dok su redukujuće supstance apoplasta lista imale
nešto veći redukcioni kapacitet prema FeIII-citratu, tako da je na ovaj način redukovano oko 20%
od ukupno redukovanog FeIII-citrata. Međutim, najveći značaj u redukciji FeIII-helata pokazala je
enzimska redukcija (reduktaza), čiji se udeo u ukupnoj redukciji kretao od 80% (FeIII-citrat) do
90% (FeIIIEDTA). Za razliku od korena, gde nedostatak Fe izaziva pojačanu ekskreciju
redukujućih supstanci (uglavnom fenola) u apoplast i povećanu hemijsku redukciju (Marschner
& Römheld, 1994), u apoplastu lista nije došlo do povećanog odavanja fenola (tabela 4), a tako
ni do povećane hemijske redukcije (tabela 5). Sa druge strane, nedostatak Fe nije indukovao
povećanje aktivnosti FeIII reduktaze, a što je takođe slučaj sa korenom biljaka strategije I.
Tabela 5. Hemijska (redukujuće supstance u apoplastu lista) i enzimska (plazmamembranski vezana reduktaza) FeIII-helatna redukcija u listu boba. Hemijska redukcija određena je inkubacijom lisnih diskova 1 h u standardnom inkubacionom medijumu bez Fe. Posle uklanjanja lisnih diskova iz medijuma, dodato je u krajnjoj koncentraciji 300 µM BPDS i 100 µM FeIIIEDTA ili 100 µM FeIII-citrata (1:1.1), a posle 30 minutne inkubacije izmerena je apsorbanca na 535 nm. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Pretretman Ukupna redukcija Hemijska redukcija Reduktaza
(nmol g-1 svT h-1) (nmol g-1 svT h-1) (%) (nmol g-1 svT h-1) (%)
FeIIIEDTA
+Fe 301 ± 22 28 ± 7 9 273 ± 27 91
-Fe 293 ± 20 31 ± 15 10 262 ± 8 90
FeIII-citrat
+Fe 2437 ± 100 528 ± 89 22 1909 ± 100 78
-Fe 2354 ± 400 470 ± 100 20 1884 ± 300 80
5.2.2 Vremenski tok FeIII redukcije u listu Rezultati prikazani na slici 4 jasno pokazuju da redukcija FeIIIEDTA i FeIII-citrata u lisnim
diskovima skoro linearno raste u toku 120 minuta. Apsorbance na 535 nm u inkubacionom
medijumu sa dodatiih 100 µM FeIII-citrata pokazale su oko 10 puta veće apsolutne vrednosti u
odnosu na inkubacioni medijum sa 100 µM FeIIIEDTA u svim intervalima merenja, što takođe
ukazuje na veću efikasnost u redukciji prirodnih Fe-helata (FeIII-citrat) u apoplastu lista.
Rezultati
30
2D Graph 6
Vreme (h)
0 20 40 60 80 100 1200
1
2
3
Aps
orba
nca
na 5
35 n
m
0.0
0.1
0.2
0.3
FeIIIcitrat
FeIIIEDTA
Slika 4. Vremenski tok FeIII-helatne redukcije u listu boba. Posle vakuum infiltracije u preinkubacionom rastvoru bez FeIII-helata, lisni diskovi su inkubirani u 10 ml standardnog inkubacionog medijuma (100 µM FeIIIEDTA ili 100 µM FeIII-citrata), 2 h u mraku U određenim vermenskim intervalima uziman je 1 ml rastvora za merenje apsorbance na 535 nm i posle merenja vraćan u inkubacioni rastvor. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
5.2.3 Michaelis-Mentenova kinetika FeIII redukcije u listu Kinetička analiza FeIII redukcije pokazala je Michaelis-Mentenovu saturacionu kinetiku za
FeIII-helate (slika 5, 6). Kinetički parametri za redukciju FeIIIEDTA i FeIII-citrata dati su u tabeli
6. Km i Vmax nisu se značajno razlikovali između Fe snabdevenih i Fe deficitarnih biljaka, kod oba
supstrata Fe. Prirodni helati (FeIII-citrat) korišćeni kao supstrat za FeIII redukciju u listu boba
pokazali su oko 3 puta manju Km u odnosu na sintetičke helate (FeIIIEDTA). Za razliku od
Rezultati
31
relativno visoke Km za FeIIIEDTA, FeIII-citrat je redukovan sa visokom specifičnošću.
Maksimalna brzina saglasno tome bila je oko 10 puta veća u odnosu na FeIIIEDTA.
Slika 5. Uticaj koncentracije supstrata (FeIIIEDTA i FeIII-citrata) na FeIII redukciju u lisnim diskovima boba Prikazane su srednje vrednosti iz reprezentativnog eksperimenta (+Fe tretman) od 4 ponavljanja ± SD.
µM
0 100 200 300 400 500
µm
ol F
e2+ g
-1 Sv
T h-1
0
1
2
3
FeIIIEDTA
0.0
0.1
0.2
0.3
FeIII citrat
Rezultati
32
(x e-3)
0 1 2
v (µ
mol
g-1
h-1
)
0
1
2
3
4 FeIIIEDTA
v s-1 (l g-1SvT h-1)
0 20 40 60
FeIIIcitrat(x 10)
Slika 6. Hofsteeova grafička transformacija supstratne zavisnosti FeIII-helatne redukcije sa linijom linearne regresije koja je korišćena u izračunavanju Km i Vmax. (l) +Fe; (¡) -Fe. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja.
Tabela 6. Parametri Michaelis-Mentenove kinetike in vivo FeIII redukcije lisnih diskova boba. Km je data u µM, a Vmax u µmol g-1 SvT h-1. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja.
Supstrat
Parametar FeIIIEDTA FeIII-citrat
+Fe biljke -Fe biljke +Fe biljke -Fe biljke
Km 168 183 53 60
Vmax 0.41 0.34 3.23 3.10
5.2.4 Uticaj pH inkubacionog medijuma
Kako je pH apoplasta lista posebno značajan za odvijanje FeIII redukcije, posebno u
objašnjenju hipoteze o inaktivaciji gvožđa u listu (vidi: Mengel, 1994), u različitim
eksperimentima detaljno je proučena pH zavisnost redukcije FeIII-helata kod različitih biljaka.
Rezultati
33
nmol
Fe2+
g-1
SvT
h-1
0
50
100
150
200
pH
0.0 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
µm
ol F
e2+ g
-1 S
vT h
-1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
+ Fe- Fe
Pretretman
FeIIIEDTA
FeIIIcitrat
Slika 7. pH zavisnost redukcije FeIII-helata lisnim diskovima boba. Posle vakuum infiltracije u preinkubacionom medijumu (bez FeIII-helata), lisni diskovi su inkubirani 1 h u mraku u standardnom reakcionom rastvoru (100 µM FeIIIEDTA ili 100 µM FeIII-citrata). Inkubacion medijum puferovan je sa 10 mM MES (pH 5.5-6.5) ili sa 10 mM HEPES (pH 7.0-7.5). FeIII-citrat pripremljen je mešanjem FeCl3 i limunske kiseline u odnosu 1:1.1. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Rezultati
34
pH
0.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
Red
ucio
ni k
apac
itet (µ
mol
Fe2+
g-1
ST
h-1)
0.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
+ Fe- Fe
Pretretman
Slika 8. pH zavisnost redukcije FeIII-citrata u lisnim diskovima suncokreta. Posle vakuum infiltracije u preinkubacionom medijumu (bez FeIII-citrata), lisni diskovi su inkubirani 1 h u mraku, u standardnom reakcionom rastvoru (20 µM FeIII-citrat), puferovanom sa 10 mM Na-acettnog pufera (pH 5.0), 10 mM MES (pH 5.5-6.5) ili 10 mM HEPES (pH 7.0). FeIII-citrat pripremljen je u odnosu Fe/citrat 1:1.1 Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Razlike u FeIII redukcionom kapacitetu lisnih diskova suncokreta bile su još manje
izražene pri fiziološkoj pH u intervalu 5.0-6.5 (slika 8). Povećanje pH preko 7.0 takođe je
izazvalo opadanje FeIII redukcije. Ishrana Fe ni u ovom slučaju nije pokazala uticaj na redukciju
FeIII-helata.
Na slici 9 prikazana je pH zavisnost FeIII redukcije listova kukuruza. I u ovom slučaju nisu
jasno ispoljene razlike u okviru fiziološke pH 5.5-6.5, dok je sa daljim povećanjem pH prema 7.0
FeIII redukcioni kapacitet naglo opadao. Slično bobu i suncokretu i FeIII redukcija u listovima
kukuruza nije zavisila od prethodne ishrane Fe.
Rezultati
35
Slika 9. pH zavisnost FeIII-citratne redukcije u lisnim segmentima kukuruza. Posle vakuum infiltracije u preinkubacionom medijumu (bez FeIII-helata), lisni segmenti su inkubirani 1 h u mraku, u standardnom inkubacionom rastvoru (100 µM FeIII-citrat), puferovanom sa 10 mM MES (pH 5.5-6.5) ili sa 10 mM HEPES (pH 7.0). FeIII-citrat pripremljen je u odnosu Fe/citrat 1:1.1. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
5.2.5 Uticaj svetlosti i DCMU Da bi se utvrdilo kako svetlost utiče na enzimsku redukciju FeIII-helata, izvedeni su
eksperimeni na svetlosti i u mraku. Takođe, da bi se utvdilo u kojoj su meri redukcioni
ekvivalenti (NADPH/NADH) rezultat fotosinteze izvedeni su i eksperimenti sa prethodnim
dugotrajnim izlaganjem intaktnih biljaka jakoj svetlosti.
U prethodnim eksperimentima, merenjem fotoredukcije FeIII-helata u inkubacionom
medijumu bez listova (blank), dobijene su veće vrednosti u odnosu na inkubacioni medijum,
posebno kod FeIII-citrata. Do ovog efekta je došlo jer su lisni diskovi prekrivali inkubacioni
medijum i na taj način apsorbovali jedan deo svetlosti, što je u kasnijem eksperimentu otklonjeno
dodavajnjem diskova napravljenih od zelene plastične trake.
pH
0.0 5.5 6.0 6.5 7.0
Red
ukci
oni k
apac
itet (
nmol
Fe2+
g-1
SvT
h-1
)
0
50
100
150
200
250
300
+ Fe- Fe
Pretretman
Rezultati
36
!
Red
ukci
oni k
apac
itet (
µm
ol F
e2+ g-1
SvT
h-1
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
+ DCMU
Mrak Svetlo Sika 10. Uticaj svetlosti i DCMU na FeIII EDTA redukciju lisnih diskova boba. Lisni diskovi izloženi su svetlosti intenziteta oko 250 µmol m-2 s-1 (Sylvania VHO Cool White). Blank rastvor sadržao je isti broj diskova (d=4 mm) napravljenih od zelene plastične trake. U kontroli (mrak) reakcione posudice su obavijene Al-folijom. DCMU je dodat u finalnoj koncentraciji 50 µM. Diskovi listova inkubirani su 1 h u standardnom inkubacionom medijumu sa 100 µM FeIIIEDTA. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Rezultati prikazani na slici 10 pokazuju da je redukcioni kapacitet lisnih diskova boba oko
4 puta veći na svetlosti nego u marku. Dodavanjem 50 µM DCMU (inhibitor FS II) u
inkubacioni medijum smanjen je FeIII redukcioni kapacitet na svetlosti sa 1.5 nmol g-1 h-1 na 0.5
nmol g-1 h-1, a što je odgovaralo i kapacitetu FeIII redukcije u mraku. Merenjem apsorbance na
535 nm inkubaciog rastvora bez listova, preračunata je vrednost fotoredukcije FeIIIEDTA u
inkubacionom rastvoru, koja se kretala na nivou oko 20% od ukupne redukcije.
Na slici 11 prikazani su rezultati merenja FeIII redukcionog kapaciteta lisnih diskova lozne
podloge SO4, koji su dobijeni sa biljaka dugotrajno izloženih svetlosti. Slično rezultatima iz
prethodnog eksperimenta, redukcioni kapacitet ovih diskova bio je oko 4 puta veći nego kod
biljaka koje su držane u mraku (slika 11). Međutim, prethodna ishrana biljaka Fe nije pokazala
efekat na FeIII redukciju u listovima lozne podloge SO4, nezavisno tretmana svetlo/mrak.
Rezultati
37
Slika 11. Uticaj svetlosti na FeIII redukciju u listu podloge vinove loze SO4. Biljke su izložene svetlosti (500 µmol m-2 s-1) 8 h ili su isto vreme držane u mraku pri istim uslovima (24oC, RVV 70%). Priprema i preinkubacija lisnih diskova obavljeni su pod istim svetlosnim uslovima (svetlo/mrak), a zatim su lisni diskovi kratko vreme infiltrirani pod vakuumom i inkubirani 15 minuta u mraku, u standradnom inkubacionom medijumu (100 µM FeIIIEDTA). Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
5.2.6 Uticaj NADH i metaboličkih inhibitora Egzogeno dodati 0.1 mM NADH u inkubacionom medijumu uticao je na povećanje FeIII
redukcije u lisnim diskovima boba (slika 12). U prisustvu NADH, FeIII redukcija povećala se
oko 2.5 puta u odnosu na standardne uslove (P < 0.01).
Dodavanje vanadata kao inhibitora plazmamembranske H+-ATP-aze u inkubacionom
medijumu dovelo je do veoma izraženog smanjenja FeIII redukcije lisnih diskova boba (slika 13).
Inhibicija FeIII redukcije u prisustvu vanadata iznosila je 94% u odnosu na kontrolu.
Red
ukci
oni k
apac
itet (
nmol
Fe2+
g-1
SvT
h-1
)
0
20
40
60
80
100
120
+Fe- Fe
Svetlo Mrak
Pretretman
Rezultati
38
- NADH
Red
ukci
oni k
apac
itet (µ
mol
g-1
SvT
h-1
)
0.0
0.5
1.0
1.5
+ NADH
Slika 12. Uticaj egzogeno dodatog NADH na FeIII EDTA redukciju lisnih diskova boba. Inkubacija lisnih diskova obavljena je u standardnom inkubacionom medijumu sa 100 µM FeIIIEDTA u mraku. NADH (Merck) dodat je u finalnoj koncentraciji 0.1 mM. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Slika 13. Uticaj vanadata (Na3VO4) na FeIIIEDTA redukciju lisnih diskova boba. Inkubacija lisnih diskova obavljena je u standardnom inkubacionom medijumu sa 100 µM FeIIIEDTA u mraku. Vanadat (Sigma Chemical, Co) dodat je u finalnoj koncentraciji 0.5 mM. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Kontrola
Red
ukci
oni k
apac
itet (
nmol
Fe2+
g-1 S
vT h
-1)
0
100
200
300
400
500
Vanadat
Rezultati
39
5.2.7 Uticaj kiseonika Nivo kiseonika u inkubacionom medijumu pokazao je vrlo jak uticaj na FeIII redukciju u
lisnim diskovima boba (slika 14). Različite koncentracije kiseonika u inkubacionom medijumu
(0 i 20%) nisu pokazale značajne razlike u FeIII redukcionom kapacitetu (P > 0.05), dok je
povećanje koncentracije kiseonika na 100%, dovelo je do značajnog smanjenja FeIII redukcije (P
< 0.01).
O2 (%)
Red
ukci
oni k
apac
itet (
nmol
Fe2+
g-1
SvT
h-1
)
0
50
100
150
200
250
300
0 10020
Slika 14. Uticaj različitih koncentracija kiseonika u inkubacionom medijumu na FeIIIEDTA redukciju lisnih diskova boba. Tri različite koncentracije kiseonika dobijena su uduvavanjem N2 (0%), vazduha (20%) ili O2 (100%) direktno u inkubacioni medijum, posle infiltracije lisnih diskova pod vakuumom. Inkubacija lisnih diskova obavljena je u standardnom inkubacionom medijumu sa 100 µM FeIIIEDTA. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
5.2.8 Uticaj nedostatka Fe U tabeli 7 sumirani su rezultati dobijeni iz nekoliko nezavisnih eksperimenta ispitivanja
uticaja ishrane gvožđem na FeIII redukciju u listovima različitih biljnih vrsta. Ovi rezultati
pokazali su da nedostatak Fe nije uticao na povećanje FeIII redukcije u listu ni kod jedne biljne
vrste.
Rezultati
40
Tabela 7. Uticaj ishrane Fe na FeIII redukcioni kapacitet u listu različitih biljaka. Intaktni isečci listova lisni diskovi boba, suncokreta, vinove loze (Strategija I) kukuruza (Strategija II) inkubirani su u standardnom inkubacionom medijumu sa 100 µM FeIII-citratom. Kao helatni reagensi za FeII korišćeni su BPDS (bob i suncokret) ili Ferrozine (vinova loza i kukuruz), oba u koncentraciji 300 µM. Srednje vrednosti iz nekoliko nezavisnih eksperimenata.
Pretretman Koncentracija hlorofila
(SPAD)
Redukcioni kapacitet
(nmol g-1 SvTh-1)
Bob (Vicia faba)
+Fe 37.5 2305.62
-Fe 18.8 2174.85
Suncokret (Helianthus annuus)
+Fe 38.1 174.61
-Fe 9.8 167.66
Vinova loza (Vitis ssp.)
+Fe 28.4 129.60
-Fe 10.2 126.35
Kukuruz (Zea mays)
+Fe 41.2 211.82
-Fe 10.8 184.94
5.3 Usvajanje Fe simplastom lista
5.3.1 Uloga FeIII redukcije u usvajnju 59Fe simplastom lista
Da bi se proverilo da li je FeIII redukcija neophodna u procesu usvajanja Fe u ćelije lista,
korišćen je BPDS kao jak reagens za Fe2+, koji je dodat direkno u 59Fe-obeleženi medijum za
usvajanje. Rezultati na slici 15 vrlo jasno pokazuju jaku inhibiciju usvajanja Fe u prisustvu
BPDS (oko 67% inhibicije), a što ukazuje da je u procesu usvajanja 59Fe od strane ćelija
mezofila lista uključena prethodna FeIII redukcija.
Rezultati
41
Slika 15. Uticaj BPDS kao FeII-helatnog reagensa na usvajanje 59Fe iz FeIII-citrata (1:1.1) od strane simplasta lisnih diskova suncokreta. Posle vakuum infiltracije u neaktivnom rastvoru, lisni diskovi su inkubirani 1 h u maraku, u radioaktivnom rastvoru (185 GBq mol-1 ) ± BPDS (300 µM). Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
5.3.2 Uticaj odnosa Fe/citrat
S obzirom da je molarni odnos Fe/citrat veoma varijabilan u ksilemskom soku i fluidu
apoplasta lista (tabela 5; vidi: Tiffin, 1966b; White et al., 1980), usvajanje 59Fe mereno je u
inkubacionom rastvoru sa obeleženim 59FeIII-citratom u različitim odnosima. Kao što je
prikazano na slici 16, pri odnosima Fe/citrat 1:1.1 i 1:100 nisu ispoljene značajne razlike u
usvajanju Fe, dok je pri odnosu 1:1000 usvajanje Fe znatno smanjeno.
5.3.3 Uticaj pH Slično FeIII redukciji, uticaj pH apoplasta na usvajanje 59Fe bio je takođe mali u okviru
fizioloških vrednosti pH apoplasta 5.5-6.0 (slika 17). Pri pH većim od 6.0 ustanovljeno je
značajno smanjenje usvajanja Fe od strane simplasta lisnih diskova suncokreta.
Usv
ajan
je (n
mol
59Fe
g-1
ST
h-1)
0
100
200
300
400
500
+ BPDS- BPDS
+ Fe - FePretretman
Rezultati
42
FeIII/citrat
Usv
ajan
je (n
mol
59Fe
g-1
ST
h-1)
0
100
200
300
400
500
+ Fe- Fe
1:1.1 1:100 1:1000
Pretretman
Slika 16. Uticaj različitih odnosa Fe/citrat na usvajanje 59Fe od strane simplasta lista suncokreta. U svim tretmanima obeleženo 59Fe dodato je u koncentraciji 20 µM, sa različitim odnosom citrata u višku. U inkubacionom rastvoru, pH-vrednost podešena je na 6.0 sa KOH i radioaktivni rastvor je puferovan sa 10 mM MES. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
5.3.4 Uticaj nedostatka Fe Uticaj prethodne ishrane Fe na usvajanje 59Fe od strane simplasta lisnih diskova boba i
suncokreta prikazan je u tabeli 8. Nedostatak Fe nije uticao na povećanje ovog procesa u listu,
kao što je to slučaj sa korenom.
Rezultati
43
pH
0.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
Usv
ajan
je (n
mol
59Fe
g-1
ST
h-1)
0
100
150
200
250
300
350
400
+ Fe- Fe
Pretretman
Slika 17. pH zavisnost usvajanja 59Fe iz FeIII-citrata u lisnim diskovima suncokreta. Posle vakuum infiltracije u neaktivnom rastvoru, lisni diskovi su su inkubirani 1 h u mraku, u 59Fe-obeleženom rastvoru (20 µM), puferovanom sa 10 mM Na-acettnog pufera (pH 5.0), 10 mM MES (pH 5.5-6.5) ili 10 mM HEPES (pH 7.0). FeIII-citrat pripremljen je u odnosu Fe/citrat 1:100 Prikazane su srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Tabela 8. Uticaj ishrane Fe na usvajanje 59Fe od strane simplasta lisnih diskova boba i suncokreta. Posle vakuum infiltracije u neaktivnom rastvoru, intaktni lisni diskovi su inkubirani 1 h u maraku, u radioaktivnom rastvoru sa 100 µM 59FeIII-citrata (74 GBq mol-1 ) za bob ili 20 µM 59FeIII-citrat (185 GBq mol-1 ) za suncokret. U oba slučaja odnos Fe/citrat bio je 1:1.1. Srednje vrednosti iz nekoliko nezavisnih eksperimenata.
Pretretman Koncentracija hlorofila
(SPAD)
Usvojeno 59Fe
(µmol g-1 ST h-1)
Bob (Vicia faba)
+Fe 37.5 1.21
-Fe 18.8 1.30
Suncokret (Helianthus annuus)
+Fe 38.1 0.41
-Fe 9.8 0.40
Rezultati
44
5.3.5 Usvajanje 59Fe lisnim diskovima i intaktnim listovima Ovaj eksperiment izveden je da bi se odredilo da li se usvajanje Fe u intaktnim listovima
razlikuje u principu od usvajanja u lisnim diskovima, gde su ćelije lista delimično oštećene
prilikom sečenja.
Tabela 9. Distribucija obeleženog 59Fe simplastu i apoplastu intaktnih listova i lisnih diskova suncokreta. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Ekstracelularno 59Fe Usvojeno59Fe Odnos
Pretretman Tretman (apoplast)
(nmol g-1 ST h-1)
(simplast)
(nmol g-1 ST h-1)
usvojeno/
ekstracelularno Fe
+Fe Intaktni list 2.40 ± 0.55 35.20 ± 9.92 14.7
Lisni diskovi 30.50 ± 8.07 320.33 ± 25.97 10.5
-Fe Intaktni list 2.62 ± 0.73 36.12 ± 14.12 13.8
Lisni diskovi 30.36 ± 6.85 367.50 ± 25.98 12.1
Rezultati pokazuju da je usvajanje 59Fe od strane intaktnih listova bilo oko 10 puta niže od
lisnih diskova (tabela 9). Ovo se može pripisati ograničenom kontaktu ćelija intaktnih listova sa
obeleženim rastvorom, koji se transportovao kroz ksilem peteljke i lisnih nerava do apoplasta
lista, u poređenju sa lisnim diskovima koji su posle vakuum infiltracije bili u direktnom kontaktu
sa obeleženim rastvorom. U pogledu odnosa usvojenog (simplast) i ekstracelularnog (apoplast) 59Fe nisu postojale značajne razlike između intaktnih listova i lisnih diskova. Prethodna ishrana
Fe nije ispoljila uticaj na usvajanje i distribuciju 59Fe u apoplastu i simplastu lista suncokreta.
5.4 Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na moguću inaktivaciju Fe u listu
5.4.1 Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na pojavu Fe-hloroze kod boba
5.4.1.1 Sadržaj hlorofila
Dinamika razvoja Fe-hloroze kod biljaka boba gajenih u hranljivim rastvorima različto
snabdevenim Fe i bikarbonatima prikazana je na slici 18.
5.4.1.2 Sadržaj ukupnog Fe
U tabeli 10 prikazan je sadržaj ukupnog Fe u zavisnosti od bikarbonata i ishrane Fe. Kod
hlorotičnih listova koncentracija ukupnog Fe značajno se smanjila u odnosu na zelene listove.
Rezultati
45
Između biljaka gajenih u hranljivom rastvoru deficitarnom gvožđem i biljaka gajenih sa niskim
sadržajem Fe i bikarbonatima nisu ustanovljene značajne razlike u sadržaju Fe u listu (P > 0.05).
Slika 18. Uticaj bikarbonata i ishrane Fe i na dinamiku razvoja Fe-hloroze
Tabela 10. Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na koncentraciju Fe u listovima boba. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Tretman
Hlorofil (SPAD)
Koncentracija Fe
(µg g-1 ST)
100 µM Fe (zelen) 37.52 ± 3.53 277.65 ± 27.58
0.2 µM Fe (hlorotičan) 18.78 ± 2.20 103.44 ± 10.46
1 µM Fe + 10 mM HCO3- (hlorotičan) 17.62 ± 1.27 112.66 ± 5.20
5.4.1.3 Sadržaj Fe u simplastu i apoplastu lista
Distribucija Fe u apoplastu i simplastu lista boba u zavisnosti od ishrane Fe i visoke
koncentracije HCO3- (10 mM) prikazana je u tabeli 11. U hlorotičnim listovima koncentracija Fe
se smanjila u oba kompartmenta, apoplastu i simplastu. Koncentracija Fe apoplasta u hlorotičnim
listovima, smanjila se za oko 2 puta u odnosu na zelene listove, dok se istovremeno
koncentracija Fe simplasta smanjila za oko 3 puta. Odnos Fesimp/Feapop smanjio se u hlorotičnim
listovima u odnosu na zelene, posebno u tretmanu sa bikarbonatima.
!
Dani
7 14 21 28
Kon
cent
raci
ja h
loro
fila
(SP
AD
)
0
10
20
30
40
50
100 µM Fe0.2 µM Fe
1 µM Fe + 10 mM HCO3-
!
Rezultati
46
Tabela 11. Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na distribuciju Fe u apoplastu i simplastu listova boba. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Tretman Koncentracija Fe (µg g-1 ST) Odnos
Apoplast Simplast Fesimp/Feapop
100 µM Fe (zelen) 42.64 ± 3.98 235.00 ± 55.60 5.5
0.2 µM Fe (hlorotičan) 21.29 ± 2.60 82.14 ± 7.91 3.9
1 µM Fe + 10 mM HCO3- (hlorotičan) 25.11 ± 2.87 87.55 ± 4.96 3.5
5.4.1.4 pH eksudata ksilema i fluida apoplasta lista
Gajenje boba u hranljivim rastvorima različito snabdevenim Fe i HCO3- nije pokazalo
značajan uticaj na pH ksilemskog soka i fluida apoplasta lista (tabela 12).
Tabela 12. Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na pH u eksudatu ksilema i fluidu apoplasta lista boba. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Tretman Hlorofil pH
(mg g-1 ST) Eksudat ksilema Fluid apoplasta lista
100 µM Fe (zelen) 5.52 ± 0.53 5.36 ± 0.03 5.47 ± 0.07
0.2 µM Fe (hlorotičan) 1.78 ± 0.20 5.31 ± 0.03 5.35 ± 0.01
1 µM Fe + 10 mM HCO3- (hlorotičan) 1.62 ± 0.27 5.32 ± 0.06 5.33 ± 0.02
Bikarbonati (10 mM) nisu izazvali pretpostavljeno povećanje pH ksilemskog soka i fluida
apoplasta lista. U fluidu apopalsta lista kod Fe deficitarnih biljaka, došlo je do smanjenja pH za
0.12-0.14 pH jedinica što je posledica povećanja koncentracije citrata u apoplastu (tabela 13), ali
to povećanje nije bilo statistički značajno (P > 0.05).
5.4.1.5 Koncentracija Fe i organskih kiselina u eksudatu ksilema i fluidu apoplasta lista
Koncentracija Fe u eksudatu ksilema i fluidu apoplasta lista Fe deficitarnih biljaka boba
smanjila se oko 2.5-3 puta u odnosu na biljke optimalno snabdevene gvožđem (tabela 13).
Između tretmana izloženih nedostaku Fe (0.2 µM Fe; 1 µM Fe + 10 mM HCO3-) nisu postojale
značajne razlike. Koncentracija organskih kiselina u ksilemskom soku i fluidu apoplsta lista
prikazana je u tabeli 14.
Rezultati
47
Tabela 13. Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na koncentraciju Fe u eksudatu ksilema i fluidu apoplasta lista boba. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Eksudat ksilema Fluid apoplasta lista
Tretman Koncentracija Fe
(µM)
Odnos
Fe/citrat
Koncentracija Fe
(µM)
Odnos
Fe/citrat
100 µM Fe (zelen) 12.12 ± 2.28 1:10 31.69 ± 4.41 1:109
0.2 µM Fe (hlorotičan) 4.20 ± 1.46 1:626 12.38 ± 3.54 1:1451
1 µM Fe + 10 mM HCO3- (hlorotičan) 5.51 ± 1.65 1:423 11.12 ± 2.88 1:832
Tabela 14. Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na koncentraciju organskih kiselina u eksudatu ksilema i fluidu apoplasta lista boba. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Tretman Eksudat ksilema Fluid apoplasta lista
Malat (mM) Citrat (mM) Malat (mM) Citrat (mM)
100 µM Fe (zelen) 0.34 ± 0.14 0.12 ± 0.03 2.69 ± 0.90 3.45 ± 1.44
0.2 µM Fe (hlorotičan) 0.28 ± 0.10 2.63 ± 1.73 3.89 ± 0.37 17.96 ± 6.48
1 µM Fe + 10 mM HCO3- (hlorotičan) 0.71 ± 0.31 2.33 ± 1.03 3.88 ± 1.78 9.25 ± 2.95
5.4.2 Uticaj bikarbonata na FeIII redukciju i usvajanje 59Fe u listu boba U finalnom eksperimentu ispitivan je uticaj visoke koncentracije HCO3
- (10 mM) na
redukciju i usvajanje Fe u lisnim diskovima boba. Kao što je prikazano u tabeli 15, nije bilo
značajnog uticaja snabdevenosti hranljivog rastvora bikarbonatima na FeIII redukciju u apoplastu
i usvajanje 59Fe od strane simplasta.
Tabela 15. Uticaj pretretmana sa bikarbonatima na FeIII-citratni redukcioni kapacitet i usvajanje 59Fe u lisnim diskovima boba. Biljke su gajene u kompletnom hranljivom rastvoru sa 1 × 10-4 M FeEDDHA (kontrola) i hranljivom rastvoru sa 1 × 10-6 M FeEDDHA uz dodatak 10 mM NaHCO3 (+HCO3
--tretman). U eksperimentima FeIII redukcije i usvajanja 59Fe lisni diskovi su inkubirani u standardnim reakcionim rastvorima (neaktivnim i radioaktivnim) sa 100 µM FeIII-citrata (1:1.1). Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Preretman Sadržaj hlorofila
(mg g-1 ST)
Redukcioni kapacitet
(µmol Fe2+g-1 ST h-1)
Usvajanje
(µmol 59Fe g-1 ST h-1)
Kontrola (zelen) 5.52 ± 0.53 24.32 ± 1.72 1.52 ± 0.14
+HCO3- (hlorotičan) 2.62 ± 0.27 19.15 ± 3.15 1.51 ± 0.08
Rezultati
48
5.4.3 Uticaj bikarbonata i ishrane Fe na pojavu Fe-hloroze kod lozne podloge SO4
5.4.3.1 pH eksudata ksilema i fluida apoplasta lista
Fluid apoplasta lista kod lozne podloge SO4 dobijen je infiltraciono-centrifugalnom
tehnikom. Parametri koji karakterišu frakciju ispranog intracelularnog fluida (IWF) dobijenu
centrifugiranjem prethodno vakuum-infiltriranih listova na 2000 × g, prikazani su u tabeli 16.
Prethodna istraživanja pokazala su da centrifugalna sila u intervalu 500-5000 × g nije uticala na
MDH aktivnost u ekstraktu apoplasta lista vinove loze (cv. 3309 i SO4) koja se uvek kretala
ispod 1% od lisnog homogenata, što ukazuje na vrlo malo oštećenje ćelija lista tokom
ekstrakcije. Tabela 16. Karakteristike fluida apoplasta lista (IWF) lozne podloge SO4, dobijenog centrifugiranjem na 2000 × g. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
Parametri IWF
Zapremina (µl g-1 SvT) 16.72 ± 5.44
pH 5.32 ± 0.03
K+ (mM) 10.42 ± 0.49
Relativna MDH (%) 0.6 ± 0.1
Simptomi Fe-hloroze povećavali su se sa smanjenjem koncentracije Fe i povećanjem
koncentracije bikarbonata u hranljivom rastvoru (tabela 17). Različita koncentracija bikarbonata
u hranljivom rastvoru nije pokazala značajan uticaj na pH ksilemskog soka i fluida apoplasta
lista, koji je takođe bio nezavistan i od obezbeđenosti biljaka gvožđem (tabela 17).
Rezultati
49
Tabela 17. Uticaj različitih koncentracija Fe i bikarbonata u hranljivom rastvoru na razvoj Fe-hloroze i pH eksudata ksilema i fluida apoplasta listova podloge vinove loze SO4. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
HCO3- Sadržaj hlorofila pH
(mM) (SPAD) Eksudat ksilema Fluid apoplasta lista
Bez Fe
0 10.17 ± 2.90 5.71± 0.06 5.44 ± 0.06
5 10.57 ± 3.49 5.68 ± 0.04 5.44 ± 0.08
10 11.10 ± 0.86 5.66 ± 0.02 5.42 ± 0.03
20 9.85 ± 1.01 5.80 ± 0.07 5.43 ± 0.08
10 µM Fe
0 18.70 ± 0.50 5.58 ± 0.06 5.44 ± 0.04
5 11.35 ± 0.44 5.59 ± 0.04 5.48 ± 0.11
10 9.60 ± 1.20 5.58 ± 0.03 5.42 ± 0.04
20 9.95 ± 1.68 5.65 ± 0.01 5.41 ± 0.02
100 µM Fe
0 28.45 ± 1.25 5.75 ± 0.01 5.42 ± 0.02
5 20.30 ± 1.45 5.78 ± 0.05 5.39 ± 0.02
10 12.55 ± 1.12 5.75 ± 0.04 5.38 ± 0.02
20 9.30 ± 2.11 5.75 ± 0.03 5.40 ± 0.01
5.4.3.2 Koncentracija Fe u eksudatu ksilema
Različita snabdevenost hranljivih rastvora gvožđem odrazila se i na koncentraciju Fe u
ksilemskom soku. Tako je povećanje koncentracije Fe u hranljivom rastvoru od 0 do 100 µM
sledilo i povećanje koncentracije Fe u ksilemu od 0.44 do 8.16 µM (tabela 18). Pri koncentraciji
Fe u hranljivom rastvoru 10 i 100 µM, bikarbonati (10 mM) su izazvali značajno smanjenje
koncentracije Fe u eksudatu ksilema.
Rezultati
50
Tabela 18. Uticaj ishrane gvožđem i bikarbonatima na koncentraciju Fe u eksudatu ksilema podloge vinove loze SO4. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
HCO3- Koncentracija Fe
(mM) (µM)
Bez Fe
0 0.44 ± 0.16
10 0.32 ± 0.13
10 µM Fe
0 3.15 ± 0.33
10 1.23 ± 0.16
100 µM Fe
0 8.16 ± 0.33
10 6.06 ± 0.90
5.4.3.3 Sadržaj ukupnog i “aktivnog” Fe
Koncentracija ukupnog i gvožđa ekstrahovanog u HCl (“aktivno” Fe) prikazane su u tabeli
19. Povećanje snabdevenosti biljaka gvožđem uticalo je i na povećanje ukupnog i HCl-
ektrahovanog Fe. Pri manjim koncentracijama Fe u hranljivom rastvoru (10 µM), primena
visokih koncentracija HCO3- (10 ili 20 mM) uticala je na značajno smanjenje sadržaja ukupnog
Fe u listu (P < 0.01), dok je pri većoj koncentraciji Fe (100 µM) do značajnog smanjenja
koncentracije Fe u listu došlo samo uslučaju 20 mM HCO3-. Kod biljaka gajenih bez Fe i pri
nižim koncentracijama Fe (10 µM), različite koncentracije HCO3- u hranljivom rastvoru nisu
uticale na značajne razlike u koncentraciji “aktivnog” Fe u listu. Međutim, značajne razlike
ispoljene su pri visokoj koncentraciji Fe u hranljivom rastvoru (100 µM).
Rezultati
51
Tabela 19. Uticaj različitih koncentracija gvožđa i bikarbonata u hranljivom rastvoru na koncentraciju ukupnog i HCl-ekstahovanog (“aktivnog”) Fe u listu podloge vinove loze SO4. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
HCO3- Ukupno Fe HCl-ekstrahovano Fe
(mM) µg g-1 ST µg g-1 ST % od ukupnog Fe
Bez Fe
0 26 ± 2 15 ± 2 58
5 31 ± 5 16 ± 2 52
10 31 ± 6 16 ± 1 52
20 26 ± 6 14 ± 2 53
10 µM Fe
0 47 ± 2 20 ± 5 64
5 43 ± 5 17 ± 3 39
10 32 ± 1 18 ± 3 56
20 25 ± 2 15 ± 2 60
100 µM Fe
0 95 ± 4 59 ± 4 62
5 106 ± 3 40 ± 1 40
10 84 ± 4 36 ± 8 43
20 57 ± 13 28 ± 6 49
5.4.3.4 FeIII redukcija u listu
Snabdevenost biljaka gvožđem, kao ni različite koncentracije bikarbonata u hranljivom
rastvoru nisu ispoljile značajan uticaj na FeIII redukciju u lisnim diskovima lozne podloge SO4
(tabela 20).
Rezultati
52
Tabela 20. Uticaj različitih koncentracija gvožđa i bikarbonata u hranljivom rastvoru na FeIII redukcioni kapacitet lisnih diskova podloge vinove loze SO4. Srednje vrednosti od 4 ponavljanja ± SD.
HCO3- Redukcioni kapacitet
(mM) (nmol Fe2+ g-1 SvT h-1)
Bez Fe
0 61.1 ± 6.0
10 58.2 ± 8.6
10 µM Fe
0 67.0 ± 12.6
10 62.2 ± 10.8
100 µM Fe
0 67.4 ± 15.0
10 62.8 ± 10.2
5.4.3.5 Uticaj bikarbonata na usvajanje 59Fe korenom i translokaciju 59Fe do listova
Da bi se proučio uticaj bikarbonata u obeleženom hranljivom rastvoru na usvajanje i
translokaciju gvožđa do listova, korišćene su dve lozne podloge različite otpornosti prema
Fe-hlorozi.
U toku prethodnog gajenja u hranljivim rastvorima različito snabdevenih Fe, koncentracija
hlorofila kod biljaka obezbeđenih Fe (+Fe) nije se značajno razlikovala između dve podloge (V.
riparia i 41 B). Međutim, pri nedostatku Fe (-Fe) V. riparia, kao lozna podloga osetljiva na Fe-
hlorozu pokazala je značajno manji sadržaj hlorofila u poređenju sa otpornom podlogom 41 B
(tabela 21). Posle 12 časova usvajanja, količina usvojenog 59Fe povećala se kod -Fe biljaka kod
obe lozne podloge u odnosu na kontrolu (+Fe biljke), ali je to povećanje bilo značajno veće kod
otporne lozne podloge (351%) u odnosu na osetljivu (163%). Apsolutne vrednosti usvojenog 59Fe kao biljaka snabdevenih Fe bile su značajno veće kod genotipa osetljivog na Fe-hlorozu u
poređenju sa otpornim.
Rezultati
53
Tabela 21. Sadržaj hlorofila u listovima i količina usvojenog 59Fe 12 h posle primene 1 × 10-5 M 59FeEDDHA kod Fe obezbeđenih (1 × 10-4 M FeEDDHA) i Fe deficitarnih (2 × 10-7 M FeEDDHA) loznih podloga, različite otpornosti prema Fe-hlorozi. Srednje vrednosti od 3 ponavljanja ± SD.
Tretman Sadržaj hlorofila
(SPAD)
Količina 59Fe
(nmol 59Fe biljka-1) Povećanje u %
Vitis riparia (osetljiva)
+Fe 27.73 ± 0.74 6.95 ± 2.37 100
-Fe 12.25 ± 0.45 11.32 ± 3.25 163
41 B (otporna)
+Fe 27.58 ± 1.34 4.03 ± 1.83 100
-Fe 16.17 ± 2.46 14.13 ± 6.03 351
Tabela 22. Uticaj bikarbonata na distribucija 59Fe između listova i korena Fe obezbeđenih (1 × 10-4 M FeEDDHA) i Fe deficitarnih (2 × 10-7 M FeEDDHA) loznih podloga 12 h posle primene 1 × 10-5 M 59FeEDDHA. Srednje vrednosti od 3 ponavljanja ± SD.
Pretretman
Tretman
Količina
(nmol 59Fe organ-1)
Koncentracija
(nmol 59Fe g-1 ST)
Koren List Koren List
Vitis riparia (osetljiva)
+Fe Kontrola 6.67 ± 1.95 0.28 ± 0.03 7.35 ± 2.39 0.13 ± 0.04
+HCO3- 5.76 ± 3.92 0.08 ± 0.03 6.54 ± 1.73 0.07 ± 0.02
-Fe Kontrola 10.2 ± 8 2. 1.03 ± 0.06 8.54 ± 1.20 0.36 ± 0.14
+HCO3- 5.12 ± 2.49 0.13 ± 0.04 6.18 ± 2.24 0.08 ± 0.01
41 B (otporna)
+Fe Kontrola 4.75 ± 1.00 0.12 ± 0.06 14.06 ± 3.28 0.28 ± 0.17
+HCO3- 2.06 ± 0.5 0.09 ± 0.03 8.17 ± 2.54 0.06 ± 0.03
-Fe Kontrola 12.18 ± 2.58 1.96 ± 0.48 22.47 ± 2.38 0.72 ± 0.13
+HCO3- 6.64 ± 2.82 0.63 ± 0.31 14.63 ± 3.08 0.45 ± 0.20
Prethodno gajenje biljaka u hranljivom rastvoru bez Fe uticalo je na značajno povećanje
količine i koncentracije 59Fe u korenu i listu oba genotipa (tabela 22).
Prisustvo bikarbonata u 59Fe-obeleženom hranljivom rastvoru uticalo je na smanjenje
količine i koncentracije 59Fe u korenu i listu kod oba genotipa, nezavisno od prethodne ishrane
Rezultati
54
gvožđem. Međutim, količina i koncentracija usvojenog 59Fe u korenu i listu bile su značajno
veće kod otpornog genotipa (41 B) u poređenju sa osetljivim genotipom (V. riparia), kada su ovi
genotipovi prethodno gajeni u hranljivom rastvoru bez Fe.
Kao što je prikazano na slici 19, kod oseljive lozne podloge nisu postojale značajne razlike
u usvojenom 59Fe kod +Fe i -Fe biljaka, dok je kod otpornog genotipa utvrđeno značajno
povećanje usvojenog Fe kod -Fe biljaka. Bikarbonati u obeleženom rastvoru pokazali su manji
uticaj na inhibiciju usvajanja Fe kod otpornog genotipa (oko 65%) u odnosu na osetljiv (oko
80%). Prethodno gajenje biljaka u rastvoru bez Fe uticalo je na značajno povećanje
nmol
59Fe
g-1
ST
kore
na 1
2 h-1
0
10
20
30
nmol
59Fe
g-1
ST
kore
na 1
2 h-1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Kontrola +HCO3- Kontrola +HCO3
-
Usvojeno Fe
Translocirano Fe
A B
A B
Slika 19. Usvajanje 59Fe korenom i translokacija 59Fe do listova u zavisnosti od prethodne ishrane gvožđem i prisustva bikarbonata u radioaktivnom inkubacionom rastvoru (1 × 10-5 M 59FeEDDHA kod loznih podloga različite otpornosti prema Fe-hlorozi. (A) Vitis riparia (osetljiva); (B) 41 B (otporna). (n) +Fe (1 × 10-4 M FeEDDHA); (�) -Fe (2 × 10-7 M FeEDDHA). Tretmani: Kontrola (10 mM MES, pH 6.0); +HCO3
- (10 mM HCO3, pH 8.0). Srednje vrednosti od 3 ponavljanja ± SD.
Rezultati
55
translociranog 59Fe od korena do listova kod oba genotipa, ali su apsolutno veće vrednosti
utvrđene kod otpornog genotipa. Bikarbonati u radioaktivnom rastvoru, uticali su na značajno
smanjenje translokacije 59Fe, i to na 33% od kontrole kod otpornog, odnosno na 17% od kontrole
kod osetljivog genotipa. Međutim, inhibicija usvajanja i translociranja 59Fe bila je mnogo manje
izražena kod otpornog genotipa.
Diskusija
56
6 Diskusija
6.1 FeIII redukcija u apoplastu i usvajanje Fe simplastom lista
Ekstrakt homogenizovanog lisnog materijala pokazuje jaku FeIII redukcionu aktivnost, što
je pripisano askorbinskoj kiselini i fenolima kao redukujućim supstancama (Mehrotra & Gupta,
1990). U našim ispitivanjima nije vršena ekstrakcija, već su intaktni lisni diskovi posle ispiranja
inkubirani u pufernom medijumu. Tokom duge inkubacije ili upotrebom nekih hemikalija, može
da dođe do izlaženja redukujućih agenasa iz ćelija (de la Guardia & Alcántara, 1996). Sa druge
strane, u fluidu apoplasta lista boba utvrđena je i relativno visoka koncentracija ukupnih fenola
(tabela 3), što ukazuje da se in vivo u apoplastu lista FeIII-helati mogu i hemijski redukovati.
HPLC identifikacija fenolnih jedinjenja u eksudatu korena i biljnim tkivima, pokazala je da se
uglavnom radi o kafeinskoj kiselini (Römheld & Marschner, 1983; G. Neumann, lično
saopštenje). Hemijska redukcija u listu boba iznosila je oko 10% od ukupne FeIII redukcije, kada
je kao supstrat korišćen FeEDTA, što je u saglasnosti sa rezultatima koje su za suncokret dobili
de la Guardia & Alcántara (1996) dobili za suncokret. Međutim, ovi autori navode da se u mraku
taj procenat može povećati, što u našim eksperimentima nije potvrđeno. Kada je kao supstrat
korišćen FeIII-citrat dobijen je duplo veći procenat hemijske redukcije u ukupnoj redukciji (oko
20%). Ipak, ovi rezultati ukazuju da reduktanti otpušteni iz simplasta u apoplast lista imaju mali
zanačaj za redukciju FeIII-helata, slično kao i kod korena (Barrett-Lennard et al., 1983; Römheld
& Marschner, 1983).
Svetlost, osim što učestvuje u svetloj fazi fotosinteze, takođe stimuliše i zakišeljavanje
apoplasta ćelija mezofila (van Volkenburgh & Cleland, 1980) preko odavanja protona, što je
praćeno hiperpolarizacijom membranskog potencijala (Felle & Bertl, 1986). Svetlost je ispolljila
stimulativno delovanje na fericijanidnu redukciju u listu ili ćelijama mezofila (Dharmawardhane
et al., 1987; Neufeld & Bown, 1987), dok je dodata DCMU inhibirala ovaj efekat
(Dharmawardhane et al., 1987). Prema Dharmawardhaneu et al. (1987) fotosinteza posredno
vodi povećanju brzine elektronskog transporta koji se već dešava u mraku. Ovi autori smatraju
da na plazmamembrani ćelija mezofila ovsa postoje dva redoks sistema i da svetlost stimuliše
samo jedan od njih. De la Guardia & Alcántara (1996) takođe pretpostavljaju da na
plazmamembrani ćelija lista postoje dva različita redoks sistema ili dva stanja jednog istog
sistema za redukciju FeIII-helata, koji rade na svetlosti ili u mraku. Slično fericijanidnoj redukciji,
fotosintetski aktivna svetlost uticala je na povećanje FeIII-helatne redukcije na plazmamembrani
Diskusija
57
ćelija lista (slika 12; vidi: Brüggemann et al., 1993; de la Guardia i Alcántara, 1996) i usvajanja
Fe u ćelije mezofila lista Vigna unguiculata (Brüggemann et al., 1993). Inhibitor fotosistema II,
DCMU smanjio je FeIII redukciju na svetlosti, blizu vrednosti dobijenih u mraku (slika 10; vidi:
de la Guardia & Alcántara, 1996; Brüggemann et al., 1993). Međutim, smanjenje fotosintetske
gustine fluksa sa 200 na 25 µmol m-2 s-1 u oblasti crvene svetlosti, pokazalo je vrlo mali uticaj na
smanjenje redukcije (Brüggemann et al., 1993).
U in vivo uslovima plava svetlost, takođe, učestvuje u fotoredukciji FeIII-citrata u apoplastu
lista (Alluntt & Bonner, 1987; Jolley et al., 1987; Bienfait & Scheffers, 1992). Naši eksperimenti
pokazali su da pri jakoj svetlosti oko 20% od ukupne redukcije FeIIIEDTA čini fotoredukcija u
apoplastu. Verovatno da bi se taj udeo povećao za FeIII-citrat, koji se na jakoj beloj svetlosti
(200-500 µmol m-2 s-1) mnogo jače redukovao od FeIIIEDTA, ali upravo zbog toga, in vivo
merenja fotoredukcije FeIII-citrata u lisnim diskovima nisu bila moguća. Prema Bennettu et al.
(1982) fotoredukcija FeIII-citrata, pod utivajem plave i UV-svetlosti, bila je značajno veća u
poređenju sa FeIII-malatom, a posebno FeCl3.
Jedno od pitanja koje se postavlja je kako proces fotosinteze, koji je ograničen na
hloroplaste, stimuliše redoks procese na plazmamembrani. Prema Dharmawardhaneu et al.
(1987) za efekat svetlosti na fericijanidnu redukciju u mezofilu lista odgovorni su relativno
stabilni hemijski produkti fotosinteze, prvenstveno triozo fosfati, pre nego nestabilni
fotohemijski intermedijeri. Triozo fosfati sintetisani u hloroplastima mogu da se translocirjua u
citosol (Heldt et al., 1991) i preko reverzibilne glikolize, metaboliziraju do glukoze-6-fosfata,
koji bi dalje bio uključen u generisanje NADPH posredstvom glukozo-6-fosfat dehidrogenazne
(EC 1.1.1.49) aktivnosti ili NADH u procesu glikolize. Mogućnost da hloroplasti direktno
obezbeđuju NADPH, kao redukujući ekvivalenat za trans-plazmamembransku redoks aktivnost
ne postoji, zbog nepropustljivosti unutrašnje membrane plastida za taj nukleotid (Heber, 1974).
Takođe, nije verovatno da bi ATP koji je nastao u procesu fotosintetske fosforilacije mogao da
napusti hloroplast, zbog vrlo slabe aktivnosti ATP-translokatora na unutrašnjoj membrani
hloroplasta (Heber, 1974). Na osnovu svega ovoga, može se objasniti i uticaj dugotrajnog
izlaganja biljaka i lisnih diskova jakoj svetlosti (500 µmol m-2 s-1) na povećanje FeIII
redukcionog kapaciteta u toku kratke inkubacije u mraku (slika 11). Stoga bi se moglo
pretpostaviti da je generisanje citosolnog redukujućeg ekvivalenta NAD(P)H inhibirano u
hlorotičnim listovima, što potvrđuju i rezultati de la Guardie i Alcántare (1996). Time bi moglo
da se objasni zbog čega nisu postojale razlike u FeIII redukciji između zelenih i hlorotičnih
listovima u našim merenjima koja su izvođena u mraku.
Diskusija
58
Kada je u reakcioni medijum egzogeno dodat NADH kao donor elektrona, redukcija
fericijanida bila je stimulisama i svetlost je tada imala mali uticaj na trans-plazmamembransku
redukciju ćelija mezofila ovsa (Dharmawadhane et al., 1987). Egzogeno dodati NADH, takođe je
povećao fericijanidnu redukciju izolovanih protoplasta šećerne trske (Thom & Maretzki, 1985),
kao i FeIII-helatnu redukciju izolovanih ćelija i protoplasta Acer pseudoplantanus (Macrì et al.,
1992). Macrì et al. (1992) ovaj efekat objašnjavaju time što dodati NADH može da poveća
NADH-zavisnu peroksidaznu aktivnost na plazmamembrani ili ćelijskom zidu i tako smanji
nastanak H2O2, koji bi mogao da dovede do reoksidacije FeII do FeIII u toku nastanka hidroksil
radikala (Fentonova reakcija). Sličan efekat egzogeno dodati NADH pokazao je na FeIIIEDTA
redukciju u ćelijama mezofila lista boba u našim eksperimentima (slika 12). Međutim, zbog toga
što je oksidacija supstrata katalizovana na mestima sa jedne strane membrane, eksperimente sa
intaktnim listovima ili sa izolovanim ćelijama i protoplastima u kojima je NADH primenjen
spolja, neophodno je razmatrati sa rezervom (Bienfait & Lüttge, 1988).
Prema modelu koji su predložili Marrè et al. (1988), fericijanidna redukcija na
plazmamembrani ćelija lista povezana je sa fluksom H+ kroz membranu i depolarizacijom trans-
plazmamembranskog potencijala, gde važnu pokretačku ulogu ima H+-ATP-azna pumpa. U
fotosintetskim ćelijama mezofila, transport elektrona kroz plazmamembranu u redoks sistemu
spregnut je sa otpuštanjem H+ preko ATP-azne pumpe u odnosu e-/H+ (Neufeled & Bown, 1987),
za razliku od korena gde je taj odnos 2e-/H+ (Sijmons et al., 1984a; Zocchi & Cocucci, 1990).
Lokalizacija acidifikacije i redukcije u biljnim tkivima mogla bi da bude makroskopski dokaz
postojanja ove sprege (Römheld et al., 1984). Međutim, prema Toulonu et al. (1992) promena
pH apoplasta usled aktivnosti H+-ATP-azne pumpe nije jedini mehanizam koji je uključen u
kuplovanje Fe III redukcije i H+ transporta. Uticaj vanadata kao inhibitora H+-ATP-aze, na
smanjenje in vivo FeIII-helatne redukcije, dokazan je od strane mnogih autora (vidi: Moog &
Brüggemann, 1994), što je potvrđeno i u slučaju FeEDTA redukcije u mezofilu lista boba (slika
13). Svi eksperimenti u kojima se pominje povećanje FeIII redukcije primenom stimulatora H+-
ATP-aze (fuzikokcin) ili njeno smanjenje primenom inhibitora (vanadat, CCCP, DCCD),
uključujući i naše, izvedeni su u mraku jer svetlost preko promene membranskog potencijala
može da menja i aktivnost protonske ATP-azne pumpe (Elzenga et al., 1995). Mišljenja o ulozi
protonske ATP-azne pumpe u depolarizaciji membranskog potencijala ćelija mezofila su
podeljena, ali je mnogo verovatnije da svetlost ima daleko veći značaj u ovim procesima.
Jaka inhibicija FeIII redukcije od strane kiseonika (100% O2) (slika 14; vidi: de la Guardia
& Alcántara, 1996) mogla bi da se objasni kompeticijom za elektrone u redoks sitemu između
Diskusija
59
FeIII i O2 (Böttger & Lüthen, 1986; Cakmak et al., 1987; Macrì et al., 1992) ili čak kompeticijom
za NAD(P)H između plazmamembranski vezanog redoks sistema i mitohondrija pri disanju u
mraku (Mauriño et al., 1986; de la Guardia & Alcántara, 1996). Međutim, superoksid radikali
(O2•-) koji nastaju kao produkti NAD(P)H-zavisne redukcije O2 na plazmamembrani, mogu biti
uključeni u elektronski transfer do FeIII-helata u apopalstu i da tako učestvuju u FeIII redukciji
(slika 20; vidi: Cakmak et al., 1987). Ovim bi se mogao objasniti izostanak inhibicije FeIII
redukcije kada je koncentracija O2 u medijumu iznosila 20% (slika 14). Takođe bi jedno od
objašnjenja inhibitornog delovanja O2 na FeIII redukciju, moglo da bude i oksidacija
funkcionalnih -SH grupa plazmamembranskog redoks sistema molekulskim kiseonikom
(Bienfait & Lüttge, 1988, Luster & Buckhout, 1989). Međutim, ne treba isključiti ni mogućnost
da je moglo da dođe i do reoksidacije FeII molekulskim kiseonikom (Cakmak et al., 1987) ili
H2O2 preko Fentonove reakcije, pre njegovog kompleksiranja sa BPDS. Kao potvrda ove
pretpostavke može da posluži to što je u prisustvu BPDS u medijumu, egzogeno dodata
superoksid dismutaza (SOD; EC 1.15.1.1) smanjila FeIII-helatnu redukciju izolovanih protoplasta
ili intaktnih lisnih diskova na svetlosti (Macrì et al., 1992; de la Guardia & Alcántara, 1996).
Nasuprot ovoj pretpostavci, pokazano je da u prisustvu BPDS u inkubacionom medijumu dolazi
do trenutnog helatiranja FeII, čime se sprečava Fentonova reakcija (Macrì et al., 1992).
Mehanizam usvajanja Fe u ćelije lista, uključujući i prethodnu trans-plazmamembransku
redukciju FeIII-helata u apoplastu lista, pokazuje različite karakteristike u poređenju sa korenom
(Brüggemann et al., 1993). U intaknom mezofilu lista, prirodni oblici FeIII healta u ksilemu i
apoplastu lista (tabela 2, 4; vidi: Tiffin, 1972) pokazali su mnogo veću FeIII redukciju i usvajanje
Fe od sintetičkih helata (FeEDTA, FeEDDHA), što je potvrđeno i 3-4 puta nižim Km za FeIII-
citrat od FeEDTA (slika 2, 3; vidi: Brüggemann et al., 1993). Sasvim različit slučaj je u ćelijama
korena, gde se FeEDTA ili slični kompleksi efikasnije redukuju u poređenju sa Fe citratom
(Römheld & Marschner, 1983). Očigledno je da se FeIII redukcioni kapacitet ćelija mezofila
povećavao sa porastom redoks potencijala (Eoʹ) (FeEDTA: +130 mV, Fe citrat: +200 mV; Price,
1968), a smanjivao sa porastom konstante stabilnosti (Ks) (Fe citrat: 1011.4, FeEDTA: 1024.2;
Römheld & Marschner, 1983). Takođe, za razliku od korena, FeIII redukcija i usvajanje Fe u listu
bili su najefikasniji kada su kao izvor Fe korišćeni slobodni Fe3+ joni (Eoʹ = +770 mV; Mahler &
Cordes, 1967) iz rastvora FeCl3 (Brüggemann et al., 1993). Ovo ukazuje da na FeIII redukciju pre
utiče redoks potencijal, nego stabilnost FeIII kompleksa i pristupačnost Fe3+ jona, te bi stoga, in
vivo usvajanje Fe u ćelijama lista moglo da bude u funkciji redoks potencijala FeIII jedinjenja u
apoplastu i redoks stanja citoplazme (slika 20; vidi: Brüggemann et al., 1993).
Diskusija
60
]elije mezofila lista pokazale su visoku specifičnost za redukciju FeIII-citrata (Km = 53-60
µM) u poređenju sa FeIIIEDTA (Km = 168-183 µM), a što je saglasnosti sa kinetikom in vivo
FeIII-helatne redukcije u mezofilu lista Vigna unguiculata kao što pokazali Brüggemann et al.
(1993). Vrednosti Km (FeIII-citrat) izolovanih plazmammembrana lista bile su preko dva puta niže
od vrednosti dobijenih u in vivo uslovima redukcije (Brüggemann et al., 1993). Ukoliko su O2 i
FeIII na strani plazmamembrane prema apoplastu, u kompeticiji za elektrone sa intracelularnog
donora NAD(P)H, u in vivo uslovima, intermedijerna pojava superoksid radikala može da poveća
FeIII redukciju (Cakmak et al., 1987), čime bi se mogle objasniti manje vrednosti Km in vivo u
porećenju sa in vitro uslovima koje su dobili Brüggemann et al. (1993).
Stimulacija FeIII reduktaze preko promene (sniženja) pH apoplasta usled otpuštanja H+,
mogla bi da bude rezultat promene elektrostatičkih interakcija između helata i fiksiranih šarži na
ćelijskom zidu i plazmamembrani (Toulon et al., 1992). Prema Moog i Brüggemannu (1994) i
drugim autorima, FeIII-helatna reduktazna aktivnost je pH zavisna i FeIIIEDTA redukcija
intaktnih korena ima jasan pH optimum oko 5.5 (pH apoplasta korena). Sa druge strane, postoji
vrlo malo informacija o pH zavisnosti FeIII-helatne redukcije intaktnih ćelija lista. Prikazani
rezultati (slika 7, 8, 9) nisu pokazali jaku pH zavisnost u okviru fiziološke pH apoplasta od 5.0
do 6.5 kod različitih biljnih vrsta (Vicia faba, Helianthus annuus, Zea mays), dok je poveaćanje
pH preko 6.5 uvek uticalo na opadanje FeIII redukcije. Kod svih biljaka, pH optimum kretao se
oko 6.0, nezavisno od ishrane Fe. Ove vrednosti, daleko su niže od pH optimuma FeIII redukcije
u intaktnom mezofilu Valeriana locusta na 7.6 kod Fe snabdevenih biljaka ili na 6.8 kod Fe
deficitarnih (P. Moog, lično saopštenje). Brüggemann et al. (1993) navode da je FeIII-citratna
redukcija izolovanih plazmamembrana Vigna unguiculata pokazala jasan pH optimum na 6.5-
6.8, mada ove vrednosti ne bi mogle da predstavljaju realnu situaciju u in vivo mezofilu, jer pri
izolovanju plazmamembranskih vezikula može da dođe do izvesnih poremećaja membrane
(Mengel, 1994). S obzirom da in vivo FeIII redukcija u mezofilu lista mnogih biljaka ne pokazuje
jaku pH zavisnost i nije indukovana nedostatkom Fe, može se pretpostaviti da se radi o već
postojećem osnovnom (standardnom) redoks sistemu, koji se razlikuje od Fe nedostatkom
indukovane (“turbo”) reduktaze na plazmamembrani ćelija korena (Brüggemann et al., 1994).
Redukcioni kapacitet lisnih segmenata različitih biljaka (suncokret, bob, vinova loza,
kukuruza) adekvatno snabdevenih Fe, imao je uvek slične ili nešto veće vrednosti od Fe
deficitarnih biljaka. Međutim, Brüggemann et al. (1993) su u svojim proučavanjima kinetike in
vivo FeIII-citratne redukcije u intaktnom mezofilu lista Vigna unguiculata dobili skoro tri puta
veće vrednosti Vmax za -Fe biljke u poređenju sa +Fe biljkama, dok se pri tome Km nisu
Diskusija
61
razlikovale, što jasno ukazuje da je Fe nedostatak indukovao FeIII-citratnu redukciju. Uprkos
tome, u kasnijoj dikusiji svojih rezultata, ovi autori iznose pretpostavku da nedostatak Fe ipak
nije pokazao stimulativni efekat na FeIII-helatnu redukcionu aktivnost. Međutim, potrebno je
napomenuti da su njihova preračunavanja FeIII redukcione aktivnosti bazirana na sadržaju
hlorofila, a ne na svežoj ili suvoj težini lista. De la Guardia i Alcántara (1996) navode da je u
hlorotičnim listovima (-Fe) suncokreta FeIIIEDTA redukcija u lisnim diskovima bila oko 2 puta
niža nego u zelenim listovima (+Fe), pri izvođenju eksperimenta na svetlosti (200 µmol m-2 s-1).
Ovo se razlikuje od naših rezultata, gde pri dugotrajnoj ekspoziciji biljaka na jakoj svetlosti
(500 µmol m-2 s-1), iako je utvrđen njen pozitivan efekat na FeIII redukciju, nije postojala razlika
između +Fe i -Fe biljaka lozne podloge SO4 (slika 11). Međutim, kada je određivanje FeIII
redukcije obavljeno u mraku, nisu postojale značajne razlike između +Fe i -Fe biljaka (de la
Guardia & Alcántara, 1996), a što je u saglasnosti sa našim nalazima. Ovi autori daju objašnjenje
da su FeIII-helatni plazmamembranski redoks sistemi u sličnoj količini prisutni u listovima -Fe i
+Fe biljaka, ali da je tada FeIII redukcija u zavisnosti od nivoa citosolnog NAD(P)H. Kod listova
kivija (Actinidia deliciosa), Fe nedostatak nije indukovao nikakvo povećanje FeIII-helatne
redukcije preračunate na svežu težinu, dok je kod listova Valerianella locusta pri Fe nedostatku
došlo do slabijeg povećanja FeIII redukcije, ali samo kada je kao osnova za preračunavnje služio
sadržaj hlorofila (P. Moog, lično saopštenje). Indukcija FeIII redukcione aktivnosti na nivou
listova primećena je kod Arabidopsis thaliana kada su biljke gajene na Murashige-Skoog
medijumu bez Fe, ali je taj efekat izostao kada su biljke gajene na Gambors medijumu bez Fe (C.
Procter, lično saopštenje). Očigledno je da, prema našim i saznanjima drugih autora, FeIII-helatna
redukcija u ćelijama lista nije indukovana nedostatkom Fe, kao što je to slučaj u korenu biljaka
strategije I.
U ovom radu pokazano je da dodavanje BPDS kao helatnog reagensa za Fe2+ u obeleženi
medijum jako inhibira usvajanje 59Fe u simplast lista (slika 15), što je u saglasnosti sa rezultatima
Brüggemana et al. (1993). U toku plazmamembranske redukcije FeIII-helata nastali Fe2+ se
snažno vezuju sa BPDS u kompleks FeII(BPDS)3, koji ostaje na strani plazmamembrane prema
apoplastu, zbog njene nepropustljivosti za ovaj kompleks (Chaney et al., 1972). Eksperimenti sa
obeleženim [14C]Fe citratom u mezofilu lista (Brüggemann et al., 1993), kao i dvostruko
obeleženim 59Fe[14C]EDDHA u korenu (Marschner & Römheld, 1983) pokazali su da se helat iz
kompleksa Fe-helat usvaja mnogo manje nego Fe, što ukazuje da usvajanju Fe predhodi
disocijacija kompleksa. Rezultati naših eksperimenata sa lisnim diskovima i intaktnim listovima
pokazali su da se većina radioakativnog 59Fe posle 1 časa inkubacije nalazilo u simpalstu (tabela
Diskusija
62
9), što je u saglasnosti sa rezultatima koje su dobili Brüggemann et al. (1993), s tim da je u
našem eksperimentu odnos simplast/appoplast 59Fe bio nešto veći. Na osnovu dobijenog sličnog
odnosa usvojenog i ekstarcelularnog 59Fe u lisnim diskovima i intaktnim listovima, naša metoda
za merenje FeIII redukcije može se smatrati reprezenatativnom i za intaktne listove, u kojima,
osim metodom fluorescencije (Mengel et al., 1994), nije moguće direktno meriti in vivo FeIII
redukciju. Ovi rezultati jasno ukazuju da je FeIII redukcija na plazmamembrani neophodan i
važan korak u usvajanju Fe iz apoplasta u simplast mezofila lista (slika 20), kao što je to slučaj u
korenu dikotiledonih biljaka (Chaney et al., 1972).
Poznato je da FeIII-citrat predstavlja glavnu formu Fe u fluidu ksilema kod biljaka (Tiffin,
1972). Odnos citrat/Fe u eksudatu ksilema zavisi od ishrane Fe i kod suncokreta se kretao od 74
pri niskoj do 0.4 pri visokoj obezbeđenosti Fe (Tiffin, 1966b). U našim eksperimentima sa
bobom, nedostatak Fe uticao je na značajno povećanje koncentracije citrata i povećanje odnosa
citrat/Fe u ksilemskom soku i fluidu apoplasta lista. Nasuprot tome, de Vos et al. (1986) nisu
utvrdili značajne razlike u koncentarciji citrata u lisnom tkivu Fe deficitarnih i kontrolnih biljaka
pasulja. Usvajanje 59Fe iz apoplasta u simplast lista suncokreta nije se razlikovalo pri odnosu
Fe/citrat 1:1.1 ili 1:100 pri konstantnoj koncentraciji Fe (20 µM) u inkubacionom medijumu
(slika 16), što je u granicama prirodnog odnosa Fe/citrat u eksudatu ksilema (tabela 13; vidi:
Tiffin, 1966a, 1966b, 1970; Brown & Jolley, 1986;). Redukcija FeIII-citrata i Michaelis-
Mentenova kinetika redukcije u intaktnom mezofilu Vigna unguiculata bili su nezavisni od viška
citrata od 4 do 100 puta, u okviru koncentracije Fe 20-500 µM (Brüggemann et al., 1993), a što
je u saglasnosti sa našim rezultatima. U in vitro eksperimentu, pri niskom odnosu Fe/citrat (1:5),
Fe se snažno redukovalo tokom nekoliko minuta na svetlosti i koncentracija Fe2+ u rastvoru nije
se menjala u toku 2 časa, dok u inkubacionom rastvoru sa velikim viškom citrata (Fe/citrat
1:1000) Fe2+ joni nisu detektovani (Bienfait & Scheffers, 1992). Prema Bienfaitu i Scheffersu
(1992), akumulacija citrata može da izazove brzu reoksidaciju Fe2+ i taloženje ili čvrsto
vezivanje FeIII u ćelijskom zidu, posebno kada dođe do fotodestrukcije citrata. Prema tome, do
brze reoksidacije Fe2+ pri visokoj koncentraciji citrata, moglo bi da dođe pre helatiranja Fe2+ sa
BPDS ili njegovog transporta kroz plazmamembranu, čime bi se moglo objasniti zbog čega je
usvajanje 59Fe bilo oko četiri puta manje pri velikom višku citrata (slika 16).
Usvajanje Fe simplastom lista pokazalo je sličnu tendenciju u pogledu pH medijuma, kao i
FeIII redukcija. I u ovom slučaju, pH optimum je bio u širim granicama u okviru fiziološke pH u
apoplastu (5.0-6.5), a samo je pH veća od 6.5 dovela do bitnog smanjenja usvojenog 59Fe u
simplastu lista (slika 17). Pri pH 3-5 kompleks FeIII-citrat ima jednu negativnu šaržu usled
Diskusija
63
apsorpcije hidroksilnog jona (Warner & Weber, 1953), ali iznad pH 5 nastaje negativniji polimer
hidroksil (Moog & Brüggemann, 1994). Veliki polimer FeIII hidroksil/citrat u rastvoru je
obavijen dicitratnim omotačem (Spiro et al., 1967), i prema titracionoj krivoj ne taloži se do pH
9 (Toulon et al., 1992). Polimer nije dugo pristupačan za redukciju i usvajanje na
plazmamembrani ćelija mezofila, usled njegove vrlo spore difuzije kroz ćelijski zid, gde može da
dođe i do taloženja Fe, posle cepanja dicitratnog omotača pod uticajem plave svetlosti ili posle
enzimske redukcije (Moog & Brüggemann, 1994). Pri visokim pH (preko 7.0), FeIII dicitratni
kompleks nije dugo stabilan i Fe3+ joni postaju izloženi dejstvu hidroksilnih i fosfatnih jona u
ćelijskom zidu (Beinfait & Scheffers, 1992), što može da dovede do čvrstog vezivanja i taloženja
FeIII u apoplastu.
!
Ksilem
1!!e-
3
2
!H+
Fe2+
Simplast
Plazmamembrana
!!!!!! H+
Apoplast
NAD(P)H
O2•!"
O 2
FeIII citrat
citrat
FeII kompleks
ATP
ADP
!!H+
pH ~ 5.5 pH 7.0-7.5-120 mV
NAD(P)+ + H+
FeIII citrat!
Slika 20. Model FeIII redukcije i usvajanja Fe od strane simplasta lista. (1) plazmamembranski vezana reduktaza; (2) sistem za transport Fe2+ kroz plazmamembranu (specifični transportni protein ili katjonski kanal); (3) H+-ATP- azna pumpa.
U većem broju eksperimenata, gde je u lisnim diskovima paralelno merena FeIII redukcija i
usvajanje 59Fe od strane ćelija lista, influks Fe2+ kroz plazmamembranu bio je uvek preko 10
Diskusija
64
puta manji od njene redukcione aktivnosti (slika 3; tabela 15). Ovi nalazi mogli bi da ukažu da se
FeII pre transpotuje kroz plazmamembranu preko prenosioca (specifičnog transportnog proteina),
nego kroz jonske kanale za dvovalentne katjone. Međutim, veći redukcioni kapacitat od influksa
Fe2+ mogao bi da se objasni i reoksidacijom Fe2+ molekulskim kiseonikom ili mogućim
taloženjem u ćelijskom zidu (Grusak et al., 1990), što može da učini jedan deo FeII
nepristupačnim za membranski transport. Prema Pearsonu i Grusaku (neobjavljeni rezultati),
elektrofiziološka proučavanja na lisnim diskovima graška pokazala su da postoje dve
komponente transporta. Pri većim koncentracijama Fe u apoplastu (>100 µM) influks Fe2+ odvija
se preko komponente niskog afiniteta (“low-affinity”) koju inhibira prisustvo Zn2+, što asocira na
jonske kanale, dok se pri nižim koncentracijama (<100 µM), Fe2+ transportuje kroz
plazmamembranu preko specifičnog prenosioca visokog afiniteta (“high-affinity”). Iako je u
izvesnim slučajevima uočeno povećano usvajanje 59Fe od strane simplasta hlorotičnih listova
(slika 3), generalno uzevši, nedostatak gvožđa nije uticao na povećano usvajanje 59Fe u ćelije
mezofila (tabela 8, 9; slika 16). Stoga, pitanje da li nadostatak Fe indukuje transport FeII preko
specifičnog prenosioca na plazmamembrani ćelija mezofila ili možda povećava njegovu
aktivnost ostaje još uvek otvoreno.
Velike razlike u FeIII redukcionom kapacitetu i usvajanju 59Fe u mezofilu lista koje su
ispoljene između različitih biljnih vrsta (tabela 7, 8) mogle bi da se objasne razlikama u uslovima
merenja tokom različitih nezavisnih eksperimenata (npr. FeII-reagens, koncentracija Fe). BPDS
može da bude mnogo efikasniji kao zamka za Fe2+ u poređenju sa Ferrozine (Chaney, 1989),
tako da su razlike u apsorbancama obojenih FeII-kompleksa utoliko uočljivije, ukoliko je vreme
inkubacije kraće (W. Hördt, lično saopštenje). Takođe, FeIII redukcija i usvajanje 59Fe u lisnim
diskovima pokazali su jaku zavisnost od koncentracije supstrata prema Michaelis-Mentenovoj
kinetici (slika 5; tabela 6; vidi: Brüggemann et al., 1993), tako da bi i razlike u koncentraciji Fe
(20-100 µM) mogle da uslove ispoljene interspecijske razlike. Međutim, među različitim vrstama
nisu postojale razlike u samom mehanizmu FeIII redukcije i usvajanja Fe (npr. iste pH
karakteristike; slika 7, 8, 9), što ukazuje da različiti mehanizmi mobilizacije i usvajanja Fe od
strane korena (strategije I i II; Marschner & Römheld, 1994), kao i stepen otpornosti biljaka na
Fe-hlorozu nemaju značajnu ulogu u usvajanju Fe iz apoplasta u ćelije mezofila lista.
Diskusija
65
6.2 Inaktivacija Fe u apoplastu lista kao mogući uzrok Fe-hloroze
Metodološki problemi pri dobijanju nekontaminiranog fluida apoplasta lista predstavljaju
znatno ograničenje u proučavanjima ovog biljnog kompartmenta (Mühling & Sattelmacher,
1995). U novije vreme, metoda infiltracije i centrifugiranja često je korišćena u različitim
varijantama: (a) tehnika centrifugiranja bez infiltracije (Meinzer & Moore, 1988; Dannel et al.,
1995), (b) tehnika infiltracije bez centrifugiranja (Li & McClure, 1990) ili (c) kombinacija obe
tehnike, tzv. infiltraciono-centrifugalna tehnika (Pfanz & Oppmann, 1991; Takahama & Oniki,
1992; Husted & Schjoerring, 1995; Mühling & Sattelmacher, 1995). Glavni nedostatak svih ovih
tehnika je moguća kontaminacija rastvorima iz citoplazme ili ksilema (Mühling i Sattelmacher,
1995), ali i u mogućim promenama u koncentraciji jona (H. Rogella, lično saopštenje). Do
povrede ćelija najčešće dolazi pri sečenju peteljke (Dannel et al., 1995) i lisnih nerava (Husted &
Schjoerring, 1995). Drugi razlog za moguću kontaminaciju iz citoplazme je oštećenje ćelijskog
zida i membrana pri centrifugiranju na velikim centrifugalnim silama (Dannel et al., 1995). Za
proveravanje moguće kontaminacije fluida apoplasta lista simplastom, kao marker enzim za
citosol, korišćena je MDH (Dannel et al., 1995; Husted & Schjoerring, 1995). Međutim, u
listovima ječma i ovsa pronađena je rastvorljiva MDH u apoplastu, što bi moglo da dovede u
pitanje njeno korišćenje kao citosolnog enzimskog markera (Li et al., 1989). Stoga se, ukoliko je
MDH aktivnost u fluidu apoplasta lista visoka koriste drugi enzimski markeri, najčešće
heksozofosfat izomeraza (EC 5.3.1.9) za citosol i NADP-zavisna gliceraldehid-3-fosfat
dehidrogenaza (EC 1.2.1.13) za stromu hloroplasta (F. Dannel i H. Pfeffer, lično saopštenje).
Prema Dannelu et al. (1995), relativna MDH aktivnost ispod 1.6% u fluidu apoplasta lista
suncokreta dobijenog tehnikom centrifugiranja predstavlja njegov sastav u intaktnim listovima.
Ove vrednosti nešto su veće od vrednosti realtivne MDH dobijenih u našem reprezentativnom
eksperimentu sa listovima boba (slika 1). Kod fluida apoplasta dobijenog infiltracijom i
centrifugiranjem (IWF) relativna MDH aktivnost pokazivala je vrednosti ispod 1% i nije zavisila
od centrifugalne sile od 1000 do 12000 × g (Husted & Schjoerring, 1995), a što je u saglasnosti
sa našim rezultatima kod listova vinove loze (tabela 16). Mnogi autori, koristeći različite
eksperimentalne tehnike utvrdili su da se koncentracija K+ u fluidu apoplasta lista kreće u širim
granicama 5-50 mM (Blatt, 1985; Long & Widders, 1990; Speer & Kaiser, 1991). Razlog za
ovako velika variranja mogao bi da bude metodološki, ali i u razlikama u biljnom materijalu i
starosti listova (Mühling & Sattelmacher, 1995). Koncentracija K+ u fluidu apoplasta lista,
Diskusija
66
utvrđena u našim eksperimentima (slika 1; tabela 1), u saglasnosti je sa vrednostima koje su
dobili Pennewiß et al. (1997) u fluidu apoplasta lista boba. Nasuprot ovim rezultatima, Mühling
& Sattelmacher (1995) su kod iste biljne vrste dobili mnogo manje vrednosti koncentracije K+
(1.3-4.5 mM), a samo kada su korišćene materije koje menjaju propustljivost membrana (CDTA,
Na-acetat) koncentarcija K+ u fluidu apoplasta lista porasla je do 48.3 mM.
Prikazani rezultati jasno pokazuju da pH fluida apoplasta lista boba i vinove loze nije zavio
od ishrane gvožđem ili visoke koncentracije bikarbonata u hranljivom rastvoru (tabela 12, 17). U
većine biljnih vrsta pH apoplasta se kreće između 5.0 i 6.5 (Grignon & Sentenac, 1991), tako da
je pH fluida apoplasta lista boba u našim eksperimentima (5.3-5.5) u granicama izmerenim
fluorescentnom bojom (FITC-dextran) u intaktim listovima (Mühling et al., 1995) ili
mikroelektrodom postavljenoj u kapi nepuferovanog izotoničnog rastvora na površini lisnih
diskova bez epidermisa (Aloni et al., 1988). Međutim, Mühling i Sattelmacher (1995) su kod
Vicia faba, infiltraciono-centraifugalnom tehnikom, dobili mnogo veće vrednosti pH fluida
apoplasta lista (oko 6.1). Ove razlike u koncentraciji K+ i H+ pre bi mogle da ukažu na
razblaženje koncentracije ovih jona infiltriranjem u rastvoru BaCl2 ili destilovanoj vodi u
Mühlingovom eksperimentu, nego na njihovo koncentrovanje u toku centrifugiranja u našim
uzorcima.
Obezbeđenost hranljivog rastvora NO3- može da indukuje manje povećanje pH u apoplastu
lista, što je i utvrđeno kod suncokreta, merenjima pH u intaktnim listovima pomoću
fluorescentnih boja (Mengel et al., 1994; Hofmann & Kosegarten, 1995) ili u fluidu apoplasta
lista dobijenom centrifugiranjem (Dannel et al., 1995). Kao posledica gajenja biljaka u
hranljivim rastvorima sa visokom koncentracijom NO3- (5-10 mM) utvrđene su vrlo visoke
negativne korelacije između koncentracije hlorofila i pH apoplasta lista kod suncokreta (Mengel
et al., 1994), soje (Englisch, 1993; Koesegarten & Englisch, 1995) i kukuruza (Englisch, 1993).
Visoka koncentracija NO3- u hranljivim rastvorima, takođe je uticala i na povećanje pH
ksilemskog soka kod suncokreta (Dannel et al., 1995; Kosegarten et al., 1998). Pretpostavlja se
da je povećanje pH u apoplastu prouzrokovano H+/NO3- kotransportom kroz plazmamembranu
ćelija lista i otpuštanjem OH-, nastalih pri redukciji nitrata u simplastu lista (Ullrich, 1992).
Međutim, NO3- N-forma nije uticala na pH ksilemskog soka (Kosegarten et al., 1998) i fluida
apoplasta lista (Mühling i Sattelmacher, 1995) kod boba. Prema Kosegartenu et al. (1998)
alkalna ishrana (NO3-; NO3
- + HCO3-) nije uticala na pH ksilemskog soka kod boba, dok je kod
suncokreta, pri istim uslovima ishrane, došlo do značajnog povećanja, za oko 0.4 pH jedinice.
Naši rezultati (tabela 7, 8), kao i rezultati drugih autora (Kosegarten et al., 1998; O. Strasser i Y.
Diskusija
67
Feng, lično saopštenje) ukazuju da su simptomi Fe-hloroze kod boba manje izraženi i da se
javljaju mnogo kasnije u poređenju sa drugim biljnim vrstama, gajenim pod istim uslovima.
Kosegarten et al. (1998) razlike u stepenu Fe-hloroze i sadržaja Fe u listu između boba i
suncokreta gajenih u hranljivim rastvorima (15-25 dana) objašnjavaju značajnim razlikama u
rezervi Fe u kotiledonima između ovih biljnih vrsta (bob, 16-37 µg; suncokret, 4 µg).
Mengel et al. (1994) su pronašli da obezbeđenost hranljivog rastvora bikarbonatima
značajno smanjuje koncentraciju hlorofila u listu suncokrata, što je u saglasnosti sa našim
rezultatima (slika 18; tabela 10, 12, 17). Međutim, nasuprot našim rezultatima (tabela 12, 17), pH
apoplasta lista suncokreta merena metodom fluorescencije smanjila se za oko 0.8 pH (Mengel et
al., 1994). Ove razlike mogle bi se lako objasniti činjenicom da su u Mengelovom eksperimentu
peteljke odvojenih listova tokom 12 časova bile direktno uronjene u rastvor koji je sadržao
fluorescentnu boju (5-karboksifluorescin) i 10 mM KNO3. Očigledno da tako dobijeni rezultati
sa izolovanim listovima ne odgovaraju intaktnim biljkama, kada se bikarbonati usvojeni preko
korena ukjučuju u njegov metabolizam. Nasuprot našim rezultatima, kod vinove loze gajene u
hranljivim rastvorima sa 3 mM HCO3-, pH eksudata ksilema povećao se za oko 0.2 jedinice
(Saglio, 1969). Tagliavini et al. (1995) su u poljskim uslovima kod kivija utvrdili negativnu
korelaciju između sadržaja hlorofila i pH u listu, što se razlikuje od podataka dobijenih za pH
apoplasta lista vinove loze, gajene u poljskim uslovima na krečnom zemljištu (M. Nikolić,
neobjavljeni rezultati). Međutim, tehnikom istiskivanja soka iz lista pod pritiskom, koju su
koristili Tagliavini et al. (1995), moglo je da dođe do vrlo jake kontaminacije iz citoplazme usled
povrede ćelija, pa se ovi rezultati ne mogu prihvatiti kao dovoljno reprezentativni za intaktne
listove. Kosegarten et al. (1998) utvrdili su da je primena NO3- + HCO3
- uticala na smanjenje pH
u ksilemskom soku boba za oko 0.05 pH jedinica u poređenju sa NH4NO3 ishranom, što je u
saglasnosti sa našim rezultatima (tabela 12). Međutim, prema istim autorima NO3- + HCO3
-
pokazali su kumulativni efekat na povećanje pH ksilemskog soka kod suncokreta za 0.1,
odnosno 0.46 pH jedinica, u poređenju sa NH4NO3 i NO3- ishranom. Ove razlike autori su
pokušali da objasne efikasnijom acidifikacijom ksilema i većom redukcijom NO3- u korenu boba
u poređenju sa suncokretom. Bouche-Pillona et al. (1994) su u ksilemskim sudovima boba
pronašli veći broj H+-ATP-aznih mesta, koja bi mogala da budu odgovorna za efikasniju
acidifikaciju ksilema. Tako visoka aktivnost protonske pumpe u tkivima lista Vicia vezana je za
H+-spregnuto usvajanje neutralnih amino kiselina kroz plazmamembranu (Petzold & Dahse,
1988).
Diskusija
68
Mengel (1994) pretpostavlja da je glavni razlog zbog koga dolazi do povećanja pH u
ksilemu i apoplastu lista to, što dospeli HCO3- iz korena mogu da neutrališu protone, koje
plazmamembranska ATP-aza otpušta u ksilem ili apoplast lista. Međutim, bikarbonati primenjeni
preko korena u koncentraciji preko 20 mM, u toku 14 dana nisu pokazali uticaj na pH ksilema
stabla i fluida apoplasta lista kod različitih biljnih vrsta (Biino et al. 1997), a što je u saglasnosti
sa našim rezultatima (tabela 12, 17). Transport HCO3- u ćelije korena može se odvijati aktivanim
transportom ili kotransportom sa ekvivalentnim H+ (Lucas & Berry, 1985). Iskorišćavanje
rastvorenih bikarbonata u in situ fiksaciji organskog ugljenika od strane korena, povezano je sa
sintezom organskih kiselina preko PEP karboksilaze (Wallace & Abou-Zamzam, 1986;
Anderson et al., 1987). Alhendawi et al. (1997) navode da je povećanje koncentracije HCO3- u
hranljivom medijumu uticalo na inhibiciju rastenja korena, ali ne i na značajno povećanje pH
ksilemskog soka. Međutim, samo u slučaju kada je kukuruz gajen pri koncentraciji bikarbonata
od 20 mM u toku dužeg perioda, pronađena su vizuelna oštećenja korena, što je praćeno i
povećanjem pH ksilemskog soka za oko 0.5 jedinica. Kod korena biljaka koje su dugo vremena
bile izložene visokoj koncentraciji HCO3- u hranljivom rastvoru, došlo je do povećanja neto
efluksa K+ i NO3-, što ukazuje da je primarni uzrok inhibicije rastenja korena nepovoljan efekat
bikarbonata na celovitost plazmamembrane korena (Alhendawi et al., 1997). Takođe, do
inhibicije rastenja korena pirinča nije došlo kada su u hranljivi rastvor, umesto NaHCO3, dodate
Na-soli ili HEPES u istoj koncentraciji (Yang et al., 1994). Kod paradajza gajenog na medijumu
bogatom HCO3-, značajno se povećao nivo organskih kiselina (uglavnom malata) u ksilemskom
soku, što je imalo za posledicu smanjenje pH-vrednosti za oko 0.5 jedinica (Bialczyk &
Lechowski, 1995). Povećana sinteza malata uglavnom je posledica povećanja PEP karboksilazne
aktivnosti, do koje je došlo usled povećanja koncentracije bikarbonata (Gout et al., 1992) ili
povećanja pH u citoplazmi (Kolesch et al., 1984, 1987), a što potom aktivira mehanizam
održanja pH ćelije (pH-stat mehanizam) (Smith & Raven, 1979) i odgovarajuće povećanje
sinteze organskih kiselina (de Vos et al., 1986; Alhendawi et al., 1997). Nastali malati, mogu se
dalje uključiti u sintezu amino kiselina kao supstrat za transaminaciju, direktno u TCA ciklus ili
preko glukoneogeneznog puta u sintezu ugljenih hidrata (Lance & Rustin, 1984; Bialczyk &
Lechowski, 1992). Kako se većina apsorbovanog HCO3- u ćelijama korena metabolizira do
organskih jednijenja (npr. malata), nije verovatno da bi slobodni HCO3- u ksilemu ili apoplastu
lista bili sposobni da značajnije promene njihovu pH-vrednost. Sa druge strane, naši nalazi da
kod biljaka izloženih Fe-stresu pH apopalsta lista nije sledila drastično povćanje koncentracje
organskih kiselina u ksilemu ili apoplastu lista (tabela 12, 14), moglo bi da ukaže i na vrlo dobar
Diskusija
69
puferni kapacitet apoplasta lista kao što su takođe utvrdili Pfanz i Dietz (1987). Naši rezultati
jasno su pokazali da visoka koncentracija bikarbonata (10 mM) u hranljivom rastvoru nije
inhibirala FeIII redukciju i usvajanje 59Fe u lisnim diskovima i intaktnim listovima boba, jer nije
izazvala povećanje pH u ksilemu i apoplastu lista (tabela 12, 15).
Veći broj autora utvrdio je da visoka koncentracija bikarbonata u hranljivom rastvoru
inhibira usvajanje 59Fe u korenu i njegovu translokaciju do lista. Tako su bikarbonati u
obeleženom hranljivom rastvoru inhibirali usvajanje i translokaciju 59Fe kod boranije (Gross &
Romeny, 1959), pomorandže (Wallihan, 1961), soje (Fleming et al., 1984), hrizanteme (Rutland
& Bukovac, 1971) i suncokreta (Venkat Raju & Marschner, 1981; Römheld et al., 1982). Prema
Römheldu et al. (1982) u eksperimentu sa suncokretom, posle 10 časova inkubacije biljaka u
20 µM 59FeEDDHA, bikarbonati (10 mM) su uticali na smanjenje translokacije 59Fe za 80% kod
-Fe biljaka, dok je mnogo manji efekat ispoljen kod +Fe biljaka, a što je u saglasnosti sa našim
rezultatima (slika 19). Ovi rezultati ukazuju na uticaj bikarbonata na inhibiciju FeIII redukcije u
korenu (Romera et al., 1992), posle čega se FeIII taloži u obliku FeIII-hidroksida i fosfata ili se
čvrsto vezuje za fosfatne grupe u apoplastu korena (Bienfait et al., 1985). To je i razlog zbog
čega svi pomenuti autori navode vrlo visoku koncentraciju 59Fe u korenu, u odnosu na
traslocirano 59Fe do izdanaka, što se razlikuje od našeg eksperimenta sa podlogama vinove loze,
gde je rezidualno 59Fe iz apoplasta korena uklonjeno metodom po Bienfaitu et al. (1985). Prema
Flemingu et al. (1984) 10 mM HCO3- smanjili su translokaciju 59Fe do izdanaka 31% od kontrole
za otporan, a 17% za neotporn genotip soje, a što je u saglasnosti sa našim rezultatima (slika 19).
Visoka koncentracija HCO3- (28 mM) u hranljivom rastvoru nije pokazala značajan uticaj na
transport obeleženog 55Fe na veća rastojanja, ali je uticala na njegovu translokaciju iz
vaskularnih tkiva u ćelije oko lisnih nerava (Mengel & Bübl, 1983). Međutim, u ovim
eksperimentima 55Fe nije primenjeno preko korena, već je tankom iglom ubrizgano u peteljke
listova na različitim položajima, što ne daje jasnu sliku o njegovom usvajanju i transportu od
korena do lista.
U našim eksperimentima sa bikarbonatima nije uočena pojava povećane koncentracije Fe u
hlorotičnim listovima (“paradoks hloroze”), koja se obično javlja u poljskim uslovima (V.
Römheld, lično saopštenje). Sa druge strane, iako koncentracija Fe može da se povećava u
hlorotičnim listovima, količina Fe po listu je uvek niža od zelenih listova (Häussling et al., 1985;
Dockendorf & Höfner; 1990; V. Römheld, lično saopštenje). Postoje rezultati koji ukazuju da
“paradoks hloroze” u poljskim uslovima nije uzrok inaktivacije Fe, već je pre posledica
smanjenog razblaženja Fe u mladim, hlorotičnim listovima (Römheld, 1999). Visoka
Diskusija
70
koncentracija HCO3- u hranljivom rastvoru ili rizosferi može da utiče indirektno na sadržaj i
iskorišćavanje gvožđa u listu, tako što inhibira rastenje i disanje korena, korenov pritisak i sadržaj
citokinina u nadzemnom delu (Marschner, 1995). Citokinini su neophodni za sintezu proteina i
razvoj hloroplasta (Parthier, 1979), tako da visok sadržaj Fe u hlorotičnim listovima može da bude
posledica manjeg porasta listova, slabije razvijenosti hloroplasta i smanjene sinteze hlorofila
(Marschner, 1995). U našem eksperimentu sa loznom podlogom SO4, bikarbonati su pred
smanjenja koncentracije “aktivnog” Fe uticali i na smanjenje koncentracije ukupnog Fe u listu
(tabela 19), što bi moglo da ukaže da bikarbonati nisu ispoljili efekat i na fiziološku
pristupačnost gvožđa. Međutim, visoka koncentracija HCl-ekstrahovanog Fe nije dokaz
adekvatne ishrane biljaka gvožđem, zbog toga što stanje vezivanja i kompartmentacija HCl-
ekstarhovanog Fe u ćeliji nije poznato (George, 1996). Takođe, i kod određivanja “aktivnog” Fe
ekstarkcijom sa FeII-helatirajućim reagensima, može da se pojave visoke vrednosti u odnosu na
ukupno Fe (George, 1996). Razlog tome mogao bi da bude u sposobnosti FeII-helatora da
ekstrahuju i deo FeIII iz feritina (Abadía, 1992). Takođe, Abadía et al. (1984) utvrdili su da je
FeIII dodato u ekstrakt lista kompletno redukovano u prisustvu FeII-helatora. Primenom
Mössbauerove spektroskopije nije bilo moguće jasno detektovati FeII u listu različitih biljaka
(Goodman & DeKock, 1982; Huang et al., 1986; Ambe, 1989), što baca sumnju na definisanje
“aktivnog” Fe kao FeII forme.
Sadržaj Fe u apoplastu listova određen je posle inkubacije lisnih diskova u rastvoru
Na2EDTA metodom po Beckeru et al. (1992). Koncentracija Fe u apopplastu i simplastu lista
značajno se smanjila kod biljaka izloženih Fe-stresu, tako da HCO3- u hranljivom rastvoru (10
mM) nisu uticali na očekivano značajno povećanje odnosa Fe u simplastu i apoplastu lista (tabela
11). Sadržaj Fe u apoplastu lista, uglavnom je mnogo manji od sadržaja u simplastu (tabela 11;
vidi: Becker et al., 1992; George, 1996). Međutim, Pich i Sculz (1991) su dobili jednake ili nešto
veće koncentracije Fe u apoplastu u poređenju sa simplastom, kada su Fe u apoplastu lista
preračunali kao razliku između ukupne koncentracije Fe u intaknim listovima i koncentacije Fe u
izolovanim protoplastima. Metoda po Beckeru et al. (1992) mogla bi da smanji realnu
koncentraciju gvožđa u apoplastu na račun simplasta, jer je moguće da gvožđe koje je istaloženo
u obliku FeIII-hidroksida i fosfata ili čvrsto vezano u ćelijskom zidu (Bienfait & Scheffers, 1992)
nije u mogućnosti da se kompleksira sa EDTA tokom infiltracije i ekstrakcije. Osim toga, iako je
kompleks FeEDTA mnogo stabilniji od CaEDTA na pH 5.5 (Norvell, 1991), ipak postoji
mogućnost kompeticije između kalcijuma vezanog u ćelijskom zidu i FeIII za EDTA, s obzirom
da se veći deo ukupog Ca u biljnim tkivima nalazi vezan u izmenljivoj formi u apoplastu
Diskusija
71
(Marschner, 1995; George, 1996). Međutim, i pored toga što bi odnos između Fe u apoplastu i
simplastu mogao da bude različit od naših rezultata, ni u ovom slučaju nije sporno da bikarbonati
nisu mogli da značajno utiču na inaktivaciju Fe u apoplastu. Mogućnost da se Fe veže u
apoplastu lista mogla bi da postoji zbog relativno visokog odnosa citrat/Fe u ksilemu i apoplastu
lista kod Fe deficitarnih biljaka (tabela 13; vidi: Bienfait & Scheffers, 1992), pre nego zbog
disocijacije FeIII-citrata i inhibicije FeIII redukcije, pri povećanom pH ksilemskog soka i
apoplasta lista od strane bikarbonata.
Zaključak
72
7 Zaključak
Na osnovu rezultata iz različitih eksperimenata koji su imali za cilj ispitivanje mehanizma
usvajanja Fe iz apoplasta u ćelije mezofila lista viših biljaka mogu se izvesti sledeći glavni
zaključci:
• Plazmamembranska redukcija FeIII-helata (citrata) predstavlja preduslov za usvajanje Fe iz
apoplasta lista u ćelije mezofila. U pogledu odvijanja FeIII redukcionih procesa u listu nisu
postojale razlike između proučavanih biljnih vrsta (Vicia faba, Helianthus annuus, Vitis ssp.,
Zea mays), što bi moglo da ukaže da je ovaj proces opšte važeći kod većine viših biljaka.
• Svetlost je pokazala jak stimulativan uticaj na FeIII redukciju, verovatno posredno preko
fotosinteze i generisanja NAD(P)H kao citosolnih donora elektrona, neophodnih za trans-
plazmamembransku redukciju FeIII-helata u apoplastu. U in vivo FeIII redukcionim procesima
na plazmamembrani ćelija mezofila, uključeni su molekulski kiseonik i plazmamembranska
H+-ATP-aza, ali njihovo delovanje nije dovoljno jasno.
• Ćelije mezofila lista pokazale su visoku specifičnost za FeIII redukciju i usvajanje gvožđa iz
FeIII-citrata i FeIII-malata, kao prirodnih helatnih formi gvožđa u ksilemu, u poređenju sa
veštačkim helatima (FeIIIEDTA, FeIIIEDDHA). Na usvajanje 59Fe simplastom lista uticao je
odnos FeIII/citrat u apoplastu. Nije utvrđena jasna pH zavisnost FeIII redukcije i usvajanja Fe
u mezofilu u okviru fiziološke pH apoplasta lista (5.0-6.5).
• Nedostatak Fe nije uticao na povećanje FeIII-helatne redukcije u listu, što pre ukazuje na
bazičnu (“standard”) transmembransku reduktazu, nego na indukovanu (“turbo”) reduktazu,
kao što je to slučaj u korenu dikotiledonih biljaka.
• U ksilemskom soku i fluidu apoplasta lista nedostatak Fe uticao je na povećanje
koncentracije citrata i smanjenje koncentracije Fe, pri čemu se povećao i odnos Fe/citrat.
• U hlorotičnim listovima smanjila se koncentracija ukupnog, “aktivnog” (HCl-ekstrahovano
Fe), kao i gvožđa simplasta i apoplasta. Odnos Fesimp/Feapop smanjio se pri nedostatku Fe.
• Bikarbonati u hranljivom rastvoru nisu uticali na povećanje pH ksilema i apoplasta lista, kao
ni na inhibiciju FeIII redukcije u apoplastu i usvajanja Fe od strane simplasta lista. Takođe,
bikarbonati nisu uticali na povećanje koncentracije Fe u apoplastu lista. Međutim,
bikarbonati su inhibirali usvajanje Fe u korenu i njegovu translokaciju do lista, i to više kod
genotipa osetljivog na Fe-hlorozu.
Zaključak
73
• Prikazani rezultati nisu potvrdili hipotezu da je visoka koncentracija bikarbonata u
zemljišnom rastvoru odgovorna za povećanje pH apoplasta lista i inaktivaciju Fe u listu.
Očigledno je, da inaktivacija Fe u apoplastu lista nije primarni uzrok Fe-hloroze, već pre
njena posledica. Ovi rezultati istovremeno ukazuju da usvajanje Fe iz apoplasta lista u ćelije
mezofila u prvom redu zavisi od snabdevenosti biljaka gvožđem.
• Ova istraživanja, iako u prvom planu imaju fundamentalni karakter, mogu da doprinesu i
praktičnim rešenjima ishrane biljaka gvožđem i otklanjanju Fe-hloroze, posebno pri
folijarnoj primeni Fe-helata.
Literatura
74
8 Literatura Abadía, A., Sanz, M., de las Rivas, J., Abadía, J. 1989. Photosynthetic pigments and mineral composition of iron
deficient pear leaves. J. Plant Nutr. 12: 827-838. Abadía, J. 1992. Leaf responses to Fe deficiency: A review. J. Plant Nutr. 15: 1699-1713. Abadía, J., Monge, E., Montañés, L., Hears, L. 1984. Extaction of iron from plant leaves by Fe(II) chelators. J. Plant
Nutr. 7: 777-784. Aked, J., Hall, J.L. 1993. Effect of powdery mildew infection on concentrations of apoplastic sugars in pea leaves.
New Phytol. 123: 283-288. Alcántara, E., de la Guardia, M.D., Romera, F.J. 1991. Plasmalemma redox activity and H+ extrusion in roots of Fe-
deficient cucumber plants. Plant Physiol. 96: 1034-1037. Alhendawi, R. A, Römheld, V, Kirkby, E. A., Marschner, H. 1997. Influence of increasing bicarbonate
concentrations on plant growth, organic acid accumulation in roots and iron uptake by barley, sorghum, and maize. J. Plant Nutr. 20: 1731-1753.
Alluntt, F.C.T. and Bonner, W.D.Jr. 1987. Evaluation of reductive release as a mechanism for iron uptake from ferioxamine B by Chlorella vulgaris. Plant Physiol. 85: 751-768.
Aloni, B., Daie, J., Wyse, R. E. 1988. Regulation of apoplastic pH in source leaves of Vicia faba by gibberellic acid. Plant Physiol. 88: 367-369.
Ambe, S. 1989. Mössbauer study of iron in the tomato plant. Appl. Radiat. Isot. 40: 671-675. Anderson, M.P., Heichel, G.H., Vance, C.P. 1987. Nonphotosynthetic CO2 fixation by alfalfa (Medicago sativa L.)
roots and nodules. Plant Physiol. 85: 283-289. Asard, H., Horemans, N., Caubergs, R.J. 1995. Involvement of ascorbic acid and b-type cytohrome in plant plasma
membrane redox reaction. Protoplasma 184: 36-41. Askerlund, P., Larsson, C., Widell, S. 1989. Cytohromes of plant plasma membranes. Characterization by
absorbance difference spectrophotometry and redox titration. Physiol. Plant. 76: 123-134. Askerlund, P., Laurent, P., Nakagawa, H., Kader, J-C. 1991. NADH-ferricyanide reductase of leaf plasma membranes.
Partial purification and imunological relation to potato tuber microsomal NADH-ferricyanide reductase and spinach leaf NADH-nitrate reductase. Plant Physiol. 95: 6-13.
Barrett-Lennard, E.G., Marschner, H., Römheld, V. 1983. Mechanism of short term FeIII reduction by roots. Evidence against the role of secreted reductans. Plant Physiol. 73: 893-898.
Bavaresco, L., Fregoni, M., Fraschini, P. 1991. Investigations on iron uptake and reduction by excised roots of different grapevine rootstocks and V. vinifera cultivar. Plant Soil 130: 109-113.
Becker, R., Grün, M., Scholz, G. 1992. Nicotianamine and the distribution of iron into the apoplasm and sympalsm of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). I. Determination of the apoplasmic and symplasmic iron pools in roots and leaves of the cultivar Bonner Beste and its nicotianamine-less mutant chloronerva. Planta 187: 48-52.
Bennett, J.H., Lee, E.H., Krizek, D.T., Olsen, R.A., Brown, J.C. 1982. Photochemical reduction of iron. II. Plant related factors. J. Plant Nutr. 5: 335-344.
Bertoni, G.M., Pissaloux, A., Morard, P., Sayag, D.R. 1992. Bicarbonate-pH relationship with iron chlorosis in white lupine. J. Plant Nutr. 15: 1509-1518.
Bialczyk, J., Lechowski, Z. 1992. Absorption of HCO3- by roots and its effect on carbon metabolism of tomato. J.
Plant Nutr. 15: 293-312. Bialczyk, J., Lechowski, Z. 1995. Chemical composition of xylem sap of tomato grown on bicarbonate containing
medium. J. Plant Nutr. 18: 2005-2021. Bienfait, F., Lüttge, U. 1988. On the function of two systems that can transfer electron across the plasma membrane.
Plant Physiol. Biochem. 26: 665-671. Bienfait, F.H., Bino, van der Bleik, A.M., Duivenvoorden, J.F., Fontaine, J.M. 1983. Characterization of ferric
reduction activity in roots of Fe-deficient Phaseolus vulgaris. Plant Physiol. 59: 196-202. Bienfait, H.F. 1985. Regulated redox processes at the plasmalemma of plant root cells and their function in iron uptake.
J. Bioenerg. Biomembr. 17: 73-83. Bienfait, H.F. 1988. Mechanisms in Fe-efficiency reactions of higher plants. J. Plant Nutr. 11: 605-629. Bienfait, H.F. 1989. Prevention of stress in iron metabolism of plants. Acta Bot. Neerl. 38: 105-129. Bienfait, H.F., Scheffers, M.R. 1992. Some properties of ferric citrate relevant to the iron nutrition of plants. Plant Soil
143: 141-144. Bienfait, H.F., van den Briel, W. and Mesland-Mul, N.T.T. 1985. Free space iron pools in roots. Generation and
mobilization. Plant Physiol. 78: 596-600.
Literatura
75
Bienfait, H.F., van der Mark, F. 1983. Phytoferritin and its role in iron metabolism. In: Metals and Micronutrients: Uptake and Utilization by Plants (D.A. Robb and W.S. Pierpoint), pp 310-315. Academic Press, London.
Biino U., Zocchi G., Römheld V. 1997. Effect of bicarbonate in root media on pH of xylem and leaf apoplasmic fluid and on iron nutrition of various plant species. IX International Symposium on Iron Nutrition and Interactions in Plants, Abstract 18, S2–7.
Blatt, M.R. 1985. Extracellular potassium activity in attached leaves and its relation to stomatal function. J. Exp. Bot. 36: 240-251.
Böttger M., Crane, F.L., Barr, R. 1991. Physiological aspects of transplasma membrane electron transport in roots and cultured carrot tissue. In: Oxidoreduction at the Plasma Membrane: Relation to growth and Transport. Vol. II (F.L. Crane, D.J. Morre, and H.E. Löw, eds.), pp 207-236. CRC Press Inc., Boca Raton.
Böttger, M., Lüthen, H. 1986. Possible linkage between NADH-oxidation and proton secretion in Zea mays L. roots. J. Exp. Bot. 37: 666-675.
Bouche-Pillon, S., Fleurat-Lessard, P., Formont, J.-C., Serrano, R., Bonnemain, J.L. 1994. Immunolocalization of the plasma membrane H+-ATPase in minor veins of Vicia faba in relation to phloem loading. Plant Physiol. 105: 691-697.
Boxma, R. 1972. Bicarbonate as the most important soil factor in lime-induced chlorosis in the Netherlands. Plant Soil 37: 233-243.
Brancadoro, L., Rabotti, G., Zocchi, G. 1995. Mechanisms of Fe-efficiency of Vitis ssp. in response to iron deficiency stress. Plant Soil 171: 229-234.
Branton, D., Jacobson, L. 1962. Iron transport in pea plants. Plant Physiol. 37: 539-545. Brown, J.C., Foy, C.D., Bennett, J.H., Christiansen, M.N. 1979. Two light sources differentially affected ferric iron
reduction and growth of cotton. Plant Physiol. 63: 692-695. Brown, J.C., Jolley, V.D. 1986. An evaluation of concepts related to iron deficiency chlorosis. J. Plant Nutr. 9: 175-182. Brown, J.C., Jolley, V.D. 1988. Strategy I and Strategy II mechanisms affecting iron availability to plants may be
established too narrow or limited. J. Plant Nutr. 11: 1077-1097. Brown, J.C., Jolley, V.D. 1989. Plant metabolic responses to iron deficiency stress. Biol. Sci. 39: 546-551. Brüggemann, W., Maas-Kantel, K., Moog, P.R. 1993. Iron uptake by leaf mesophyll cells: The role of the plasma
membrane-bound ferric-chelate reductase. Planta 190: 151-155. Brüggemann, W., Moog, P.R., Nakagawa, H., Janiesch, P., Kuiper, P.J.C. 1990. Plasma membrane-bound Fe3+-EDTA
reductase and iron deficiency in tomato Lycopersicon esculentum. Is there a Turbo reductase? Physiol. Plant. 79: 339-346.
Buckhout, T.J., Bell, P.F., Luster, D.G., Cahney, R.L. 1989. Iron-stress induced redox activity in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) is localized on the plasma membrane. Plant Physiol. 90: 151-156.
Bukovac, M.J., Wittwer, S.H. 1957. Absorption and mobility of foliar applied nutrients. Plant Physiol. 32: 428-435. Cakmak, I., van de Wetering, D.A.M., Marschner, H., Bienfait, H.F. 1987. Involvement of superoxide radical in
extracellular ferric reduction by iron-deficient bean roots. Plant Physiol. 85: 310-314. Campbell, W.H., Redinbaugh, M.G. 1984. Ferric-citrate reductase activity of nitrate reductase and it’s role in iron
assimilation by plants. J. Plant Nutr. 7: 799-806. Canny, M.J. 1988. Water pathways in wheat leaves. IV. The interpretation of images of fluorescent apoplastic tracer.
Aust. J. Plant Physiol. 15: 541-555. Chaney, R.L. 1989. Kinetics of ferric chelate reduction by roots of iron deficient peanut (Arachis hypogea). Acta
Bot. Neerl. 32: 155-163. Chaney, R.L., Bell, P.F. 1987. Complexity of iron nutrition: Lessons for plant-soil interaction research. J. Plant
Nutr. 10: 963-994. Chaney, R.L., Brown, L.C., Tiffin, J.C. 1972. Obligatory reduction of ferric chelates in iron uptake by soybeans.
Plant Physiol. 50: 208-213. Chaney, R.L., Chen, Y, Green, C.E., Holden, M.J., Bell, P.F., Luster, D.G., Angle, J.S. 1992. Root hairs on chlorotic
tomatoes are an effect of chlorosis rather than part of the adaptive Fe-stress response. J. Plant Nutr. 15: 1857-1875.
Chaney, R.L., Coulombe, B.A., Bell, P.F., Angle, J.S. 1992. Detailed method to screen dicot cultivars for resistance to Fe-chlorosis using FeDTPA and bicarbonate in nutrient solutions. J. Plant Nutr. 15: 2063-2083.
Chereskin, B.M., Castelfranco, P.A. 1982. Effects of iron and oxigen on chlorophyll biosynthesis. II. Observations on the biosynthetic pathway in isolated etio-chloroplasts. Plant Physiol. 68: 12-116.
Cinelli, F., Viti, R., Byrne, D.H., Reed, D.W. 1995. Physiological characterization of two pech seedlings rootstocks in bicarbonate nutrient solution. I. Root iron reduction and iron uptake. In: Iron Nutrition in Soils and Plants (J. Abadía, ed.), pp 323-328. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
Cohen, C.K., Norvell, W.A., Kochian, L.V. 1997. Induction of the root cell plasma membrane ferric reductase. An exclusive role for Fe and Cu. Palnt Physiol. 114: 1061-1069.
Literatura
76
Coulombe, B.A., Chaney, R.L., Wiebold, W.J. 1984. Use of bicarbonate in screening soybeans for resistance to iron chlorosis. J. Plant Nutr. 7: 411-425.
Cramer, M.D., Lewis, O.A.M., Lips, S.H. 1993. Inorganic carbon fixation and metabolism in maize roots as affected by nitrate and ammonium nutrition. Physiol. Plant. 89: 632-639.
Crane, F.L., Sun, I.L., Clark, M.G., Grebing, C., Löw, H. 1985. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim. Biophys. Acta 811: 233-264.
Dannel, F., Pfeffer, H., Marschner, H. 1995. Isolation of apoplasmic fluid from sunflower leaves and its use for studies on influence of nitrogen supply on apoplasmic pH. J. Plant Physiol. 146: 273-278.
Davies, D.D. 1986. The fine control of cytosolic pH. Physiol. Plant. 67: 702-776. de la Guardia, M.D., Alcántara, E. 1996. Ferric chelate reduction by sunflower (Helianthus annuus L.) leaves: influence
of light, oxygen, iron-deficiency and leaf age. J. Exp. Bot. 47: 669-675. de Marco, A., Pinton, R., Fischer-Schliebs E., Varanini, Z. 1995. Possible interaction between peroxidase nad
NAD(P)H-dependent nitrate reductase activities of plasma membranes of corn roots. J. Exp. Bot. 46: 1677-1683. de Vos, C.R., Lubberding, H.J., Bienfait H.F. 1986. Rhizosphere acidification as a response to iron deficiency in bean
plants. Plant Physiol. 81: 842-846. Dharmawardhane, S., Stern, A.I., Rubinstein, B. 1987. Light-stimulated transplasmalemma electron transport in oat
mesophyll cells. Plant Science 51: 193-201. Dockendorf, H., Höfner, W. 1990. Einfluß von Bicarbonat auf die subzelluläre Verteilung von blatt- und
wurzelappliziertem Eisen bei Sonnenblumen (Helianthus annuus L.). Z. Pflanzenernähr. Bodenk. 153: 313-317. Elzenga, J.T.M., Hidde, P.B.A., van Volkenburgh, E. 1995. Light induced membrane potential changes of epidermal
and mesophyll cells in growing leaves of Pisum sativum. Planta 197: 127-134. Englisch, G. 1993. Der Einfluß unterschiedlicher Stickstoff-Ernährungsformen auf den pH-Wert im Apoplasten von
Blattmesophyllzellen sowie auf die Ausbildung einer Eisen-mangelshlorose bei Glycine max L. und Zea mays L. M. Sc. thesis. Justus-Liebig-Universität, Gießen, Germany.
Felle, H. 1988. Short-term pH regulation in plants. Minireview. Physiol Plant. 74: 583-591. Felle, H., Bertl, A. 1986. Light-induced cytoplasmic changes and their interrelation to the activity of the electrogenic
proton pump in Riccia fluitans. Biochim. Biophys. Acta 848: 176-182. Forno, D.A., Yoshida, S., Asher, C.J. 1975. Zinc deficiency in rice. II. Studies on two varieties differing in
susceptibility to zinc deficiency. Plant Soil 42: 551-563. Fox, T.C., Shaff, J.E., Grusak, M.A., Norvell, W.A., Chen Y., Chaney, R.L., Kochian, L.V. 1996. Direct
masurement of 59Fe-labeled Fe2+ influx in roots of pea using a chelator bufer system to control free Fe2+ in solution. Plant Physiol. 111: 93-100.
Gautier, H. Vavasseur, A., Lasceve, G., Bourdet, A.M. 1992. Redox procceses in the blue light response of guard cell protoplasts of Commelina communis L. Plant Physiol. 98: 34-38.
George, A. 1996. Regulation of realease of phytosiderophores in barley (Hordeum vulgare L.) and wheat (Triticum aestivum L.) under iron and zinc deficiency. Ph. D. thesis. Universität Hohenheim, Stuttgart, Germany.
Goodman, B.A., DeKock, P.C. 1982. Mössabuer studies of plant materials. I. Duckweed, stocks, soybean and pea. J. Plant Nutr. 5: 345-353.
Gout, , E., Bligny, R., Pascal, N., Douce, R. 1992. Regulation of intracellular pH values in higher plant cells: Carbon-13 and phosphorus-31 nuclear magnetic resonance studies. J. Biol. Chem. 267: 13903-13909.
Grignon, C., Sentenac, H. 1991. pH and ionic conditions in the apoplast. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 103-128.
Gross, J.A., Romney, E.M. 1959. Effects of bicarbonate and some other anions on the shoot content of 32P, 45Ca, 86Rb, 90Sr, 116Ru, 137Cs, 144Ce in bean and barley plants. Plant Soil 10: 233-241.
Grusak, M.A., Welch, R.M., Kochian, L.V. 1990. Does iron deficiency in Pisum sativum enhance the activity of the root plasmalemma iron transport protein? Plant Physiol. 94: 1353-1357.
Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C. 1986. Iron and free radical reactions: two aspects of antioxidant protection. Trends Biochem. Sci. 11: 372-357.
Hartung, W., Radin, J.W., Hendrix, D.L. 1988. Abscisic acid movement into the apoplastic solution water-stressed cotton leaves. Role of apoplastic pH. Plant Physiol. 86: 908-913.
Hartung, W., Weiler, E.W., Radin, J.W. 1992. Auxin and cytokinins in the apoplastic solution of dehydrated cotton leaves. J. Plant Physiol. 140: 324-327.
Häussling, M., Römheld, V., Marschner, H. 1985. Beziehungen zwischen Chlorosegrad, Eisengehalten und Blattwachstum von Weinreben auf verschiedenen Standorten. Vitis 24: 158-168.
Heber, U. 1974. Metabolite exchange between chloroplast and cytoplasm. Annu. Rev. Plant Physiol. 25: 393-421. Heldt, H.W., Flügge, U-I., Borchert, S. 1991. Diversity of specificity and function of phosphate translocators in
vrious plastids. Plant Physiol. 95: 341-343. Hill, J. 1980. The remobilization of nutriens from leaves. J. Plant Nutr. 2: 407-444.
Literatura
77
Hoffmann, B., Kosegarten, H. 1995. FITC-dextran for measuring apoplast pH and apoplastic pH gradients between various cell types in sunflower leaves. Physiol. Plant. 95: 327-335.
Hoffmann, B., Plänker, R., Mengel, K. 1992. Measurements of pH in the apoplast of sunflower leaves by means of fluorescence. Physiol. Plant. 84: 146-153.
Holden, M.J., Luster, D.G., Chaney, R.L., Buckhout, T.J., Robinson, C.J. (1991): Fe3+ chelate reductase activity of plasma membranes isolated from tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) roots. Comparison of enzymes from Fe-deficient and Fe-sufficient roots. Plant Physiol. 97: 537-544.
Hsu, W., Miller, G.W. 1969. Coproporphyrinogenase in tobaco (Nicotiana tabacum L.) Biochem. J. 117: 215-220. Huang, Z.W., Ambe, S., Ambe, F., Nozaki, T. 1986. Multitracer and Mössbauer studies on uptake and distribution of
59Fe, 65Zn, 57Co, and 57Fe in different growth stages of the soybean plant. Appl. Radiat. Isot. 37: 947-953. Husted, S., Schjoerring, J.K. 1995. Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brasica napus L. Plant
Physiol. 109: 1453-1460. Jachetta, J.J., Appleby, A.P., Boersma, L. 1986. Use of the pressure vessel to measure concentrations of solutes in
apoplastic and membrane-filtered symplastic sap in sunflower leaves. Plant Physiol. 82: 995-999. Jeschke, W.D. 1976. Ionic relation of leaf cells. In: Encyclopedia of Plant Physiology, Vol. 2B: Transport in Plants II (U.
Lüttge and M.G. Pitman, eds.), pp 160-164. Springr Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.. Jolley, V.D., Brown, J.C. 1987. Soybean response to iron-deficiency stress as related to iron supply in the growth
medium. J. Plant Nutr. 10: 637-651. Jolley, V.D., Brown, J.C., Pushnik, J.C., Miller, G.W. 1987. Influence of ultra-violet (UV)-blue light radiation on the
growth of coton. I. Effect on iron nutrition and iron stress response. J. Plant Nutr. 10: 333-351. Kaiser, G., Heber, U. 1983. Photosynthesis of leaf cell protoplasts and permeability of the plasmalemma to some
solutes. Planta 157: 462-470. Kochian, L.V. 1991. Mechanisms of micronutrient uptake and translocation in plants. In: Micronutrients in
Agriculture (J.J. Mortvedt, F.R. Cox, L.M. Shuman and R.M. Welch, eds.), pp 229-296. Soil. Sci. Soc. Amer., Inc., Madison, Wisconsin.
Kolesch, H. 1985. Die Eisenmangelchlorose der Weinrebe (Vitis vinifera L.) Einfluß von Bikarbonat und Phosphat unter Berücksichtigung der genetisch fixierten Chloroseanfälligkeit zweier Unterlagen. Ph.D. thesis. Justus-Liebig-Universität, Gießen, Germany.
Kolesch, H., H.M., Oktray, M., Höfner, W. 1984. Effect of iron chlorosis-inducing factors on the pH of the cytoplasm of sunflower (Helianthus annuus) Plant Soil 82: 215-221.
Kolesch, H., Höfner, W., Schaller, K. 1987. Effect of bicarbonate and phosphate on iron-chlorosis of grape-vines with special regard to the susceptibility of the rootstocks. II: Pot experiments. J. Plant Nutr. 10: 231-240.
Kosegarten, H., Englisch, G. 1994. Effect of various nitrogen forms on the pH in leaf apoplast and on iron chlorosis of Glycine max L. Z. Pflanzenernähr. Bodenk. 157: 401-405.
Kosegarten, H., Schwed, U., Wilson, G., Mengel K. 1998. Comparative investigation on the susceptibiluty of faba bean (Vicia faba L.) and sunflower (Helianthus annuus L.) to iron chlorosis. J. Plant Nutr. 21: 1511-1528.
Krizek, D.T., Bennett, J.H., Brown, J.C., Zaharieva, T., Norris, K.H. 1982. Photochemical reduction of iron. I. Light reactions. J. Plant Nutr. 5: 323-333.
Lance, P., Rustin, P. 1984. The central role of malate in plant metabolism. Physiol. Vég. 22: 625-641. Landsberg, E.C. 1981. Organic acid synthesis and release of hydrogen ions in response to Fe deficiency stress of mono-
and dicotyledonous plant species. J. Plant Nutr. 3: 579-591. Landsberg, E.C. 1994. Transfer cell formation in sugar beet roots induced by latent Fe deficiency. Plant Soil 165:
197-205. Lass, B., Thiel, G., Ullrich-Eberius, C.I. 1986. Electron transport across the plasmalemma of Lemna gibba Gl.
Planta 169: 251-259. Li, Z.-C., McClure, J.W. 1990. Soluble and bound apoplastic proteins and isozymes of peroxidase, esterase and
malate dehydrogenase in oat primary leaves. J. Plant Physiol. 136: 398-403. Li, Z.-C., McClure, J.W., Hagerman, A.E. 1989. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, β-d-
glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plant Physiol. 90: 185-190.
Lindsay, W.L., Schwab, A.P. 1982. The chemistry of iron in soils and its availability to plants. J. Plant Nutr. 5: 821-840.
Loeppert, R.H., Hallmark, C.T. 1985. Indigenous soil properties influencing the availability of iron in calcareous soils. Soil Sci. Am. J. 49: 597-603.
Long, J.M., Widders, I.E. 1990. Quantification of apoplastic potassium content by elution analysis of leaf lamina tissue from pea (Pisum sativum L. cv Argenteum). Plant Physiol. 94: 1040-1047.
Longnecker, N., Welch, R.M. Accumulation of apoplstic iron in plants roots. A factor in the resistance of soybeans to iron-deficiency inducted chlorosis? Plant Physiol. 92: 17-22.
Literatura
78
Lubberding, H.J., de Graff, F.H.J.M., Bienfait, H.F. 1988. Ferric reducing activity in roots of Fe deficient Phaseolus vulgaris: Source of reducing equivalents. Biochem. Physiol. Pflan. 183: 271-276
Lucas, W.J., Berry, J.A 1985. Inorganic carbon transport in aquatic photosynthetic organisms. Physiol. Plant. 65: 538-543.
Luster, D.G., Buckhout, T.J. 1989. Purification and identification of a plasma membrane associated electron transport protein from maize (Zea mays L.) roots. Plant Physiol. 91: 1014-1019.
Lüthje, S., Döring, O., Heuer, S., Lüthen, H., Böttger, M. 1997. Oxidoreductases in plant plasma membranes. Biochim. Biophys. Acta 1331: 81-102.
Luwe, M.W.F., Takahama, U., Heber, U. 1993. Role of ascorbate in detoxifyng ozone in the apoplast of spinach (Spinacea oleracea L.) leaves. Plant Physiol. 101: 969-976.
Ma, J.F., Kusano, G., Kimura, S., Nomoto, K. 1993. Specific recognition of mugineic acid-ferric complex by barley roots. Phytochem. 34: 599-603.
Maas, F.M. van de Wetering, D.A.M. van Beusichem, M.L., Bienfait, H.F. 1988. Characterization of phloem iron and its possible role in the regulation of Fe-efficiency reactions. Plant Physiol. 87: 167-171.
Macrì, F., Braidot, E., Petrussa, E., Zancani, M., Vianello, A. 1992. Ferric ion and oxygen reduction at the surface of protoplasts and cells of Acer pseudoplatanus. Bot. Acta 105: 97-103.
Mahler, H.R., Cordes, E.H. 1967. Biological Chemistry. Harper and Row, New York. Marrè, M.T., Moroni, A., Albergoni, F.G., Marrè, E. 1988. Plasmalemma redox activity and H+ extrusion.
Activation of the H+-pump by ferricyanide-induced potential depolarization and cytoplasm acidification. Plant Physiol. 87: 25-29.
Marschner, H. 1995. Mineral Nutrition of Higher Plants. Academic Press, London. Marschner, H., Römheld, V. 1994. Strategies of plants for acquisition of iron. Plant Soil 165: 261-274. Marschner, H., Römheld, V., Kissel, M. 1986. Different strategies in higher plants in mobilization and uptake of
iron. J. Plant Nutr. 9: 659-713. Mauriño, S.G., Echevarria, C., Mejias, J.A., Vargas, M.A., Maldonado, J.M. 1986. Properties of the in vivo nitrate
reductase assay in maize, soybean and spinach leaves. J. Plant Physiol. 124: 123-130. McCray, J.M., Matocha, J.E. 1992. Effects of soil water levels on solution bicarbonate, chlorosis and growth of
sorghum. J. Plant Nutr. 15: 1877-1890. Mehrotra, S.C., Gupta, P. 1990. Reduction of iron by leaf extracts and its significance for the assay of Fe(II) iron in
plants. Plant Physiol. 93: 1017-1020. Meinzer, F.C., Moore, P.H. 1988. Effect of apoplastic solutes on water potential in elongating sugarcane leaves.
Plant Physiol 86: 873-879. Mengel, K. 1994. Iron availability in plant tissues - iron chlorosis on calcareous soils. Plant Soil 165: 275-283. Mengel, K., Breininger, M.T., Bübl, W. 1984. Bicarbonate, the most important factor inducing iron chlorosis in vine
grapes on calcareous soils. Plant Soil 81: 333-344. Mengel, K., Bübl, W. 1983. Verteilung von Eisen in Blättern von Weinreben mit HCO3
- induzierter Fe-Chlorose. Z. Pflanzenernähr. Bodenk. 146: 560-571.
Mengel, K., Geurtzen, G. 1986. Iron chlorosis on calcareous soils. Alkaline nutritional condition as the cause for the chlorosis. J. Plant Nutr. 9: 161-173.
Mengel, K., Geurtzen, G. 1988. Relationship between iron chlorosis and alkalinity in Zea mays. Physiol. Plant. 72: 460-465.
Mengel, K., Plänker, R., Hoffmann, B. 1994. Relationship between leaf apoplast pH and iron chlorosis of sunflower (Helianthus annuus L.). J. Plant Nutr. 17, 1053-1065.
Miller, G.W., Denny, A., Pushnik, J., Yu, M.H. 1982. The transformation of delta-aminolevulinate a precursor for chlorophyll, in barley and the role of iron. J. Plant Nutr. 5: 289-300.
Moog, P.R., Brüggemann, W. 1994. Iron reductase systems on the plant plasma membrane - A reiew. Plant Soil 165: 241-260.
Moran, R. 1982. Formulae for determination of chlorophyllous pigments extracted with N,N-dimethylformamide. Plant Physiol. 69: 1376-1381.
Moran, R., Porath, D. 1980. Chlorophyll determination in intact tissues using N,N-dimethiylformamide. Plant Physiol. 65: 478-479.
Mori, S., Nishizawa, N., Hayashi, H., Chino, M. Yoshimura, E., Ishihara, J. 1991. Why are young rice plants highly susceptible to iron deficiency? Plant Soil 130: 143-156.
Mühling, K.H., Plieth, C., Hansen, U-P., Sattelmacher, B. 1995. Apoplastic pH of intact leaves of Vicia faba as influenced by light. J. Exp. Bot. 46: 377-382.
Mühling, K.H., Sattelmacher, B. 1995. Apoplastic ion concentration of intact leaves of field bean (Vicia faba) as influenced by ammonium and nitrate nutrition. J. Plant Physiol. 147: 81-86.
Murad, E., Fischer, W.R. 1988. The geochemical cycle of iron. In: Iron in Soils and Clay Minerals (J.W. Stucki, B.A. Goodman and U. Schwertman, eds.), pp 1-18. Reidel, Dordrecht.
Literatura
79
Neufeld, E., Bown, A.W. 1987. A plasmamembrane redox system and proton transport in isolated mesophyll cells. Plant Physiol. 83: 895-899.
Nikolić, M. 1995. Proučavanje Fe-hloroze i načina njenog suzbijanja na vinovoj lozi (Vitis vinifera L.). M.Sc. thesis. Faculty of Agriculture, University of Belgrade, Yugoslavia.
Norvell, W.A. 1991. Reactions of metal chelates in soils and nutrient solution. In: Micronutriens in Agriculture (J.J. Mortvedt, F.R. Cox, L.M. Shuman and R.M. Welch, eds.), pp 279-324. Soil. Sci. Soc. Amer., Inc., Madison, Wisconsin.
Olsen, R.A., Bennett, J.H., Blume, D., Brown, J.C. 1981. Chemical aspects of the Fe-stress response mechanism in tomatoes. J. Plant Nutr. 3: 905-921.
Olsen, R.A., Brown, J.C. 1981. Light-induced reduction of Fe3+ as related to cause of chlorosis in cotton. J. Plant Nutr. 3: 776-787.
Omholt, T.E., Boyer, G.L. 1988. Reduction of iron in squash callus cultures. J. Plant Nutr. 11: 1227-1235. Pandey, D.P., Kannan, S. 1979. Modification of retranslocation patterns of Fe++ and Rb+ in bean plants during new
growth. Z. Pflanzenphysiol. 93: 365-369. Parthier, B. 1979. The role of phytohormones (cytokinin) in chloroplast development. Biochem. Physiol. Pflanz. 144:
173-214. Pennewiß, K., Mühling, K.H., Sattelmacher, B. 1997. Leaching from the leaf surface and its significance for
apoplastic ion balance. In: Plant Nutrition for Sustainable Food Production and Envaironment (T. Ando, K. Fujita, T. Mae, H. Matsumoto, S. Mori nad J. Sekiya, eds.), pp 87-88. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
Petzold, U., Dahse, I. 1988. Proton extrusion by leaf discs of Vicia faba L.: Light- and ion-stimulated H+ release. Biologia Plantarum 30: 124-130.
Pfanz, H., Dietz, K.J. 1987. A fluorescence method for the determination of apoplastic proton concentration in intact leaf tissues. J. Plant Physiol. 129: 41-48.
Pfanz, H., Oppmann, B. 1991. The possible role of apoplastic peroxidases in detoxifying the air pollutant sulphur dioxide. In: Biochemical, Molecular and Physiological Aspects of Plant Peroxidases (J. Laborzewski, H. Greppin, C. Penel and T. Gaspar, eds.), pp 400-417. University of Geneva.
Pich, A., Scholz, G. 1991. Nicotinamine and the distribution of iron into apoplast and symplast of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) II. Uptake of iron by protoplasts from the variety bonner beste and its nicotianamine-less mutant chloronerva and the compratment of iron in leaves. J. Exp. Bot. 42: 1517-1523.
Pindeo, M.L., Segarra, C., Conde, R.D. 1993. Occurrence of two endoproteinases in wheat leaf intercellular washing fluid. Physiol. Plant. 88: 287-293.
Plänker, R. 1991. Die Bedeutung des Apoplasten pH-Wertes für die Eisenchlorose. Untersuchungen an Helianthus annuus. Ph.D. thesis. Justus-Liebig-Universität, Geißen, Germany.
Polle, A., Chakrabarti, K., Schürmann, W., Rennenberg, H. 1990. Composition and properties of hydrogen peroxide decomposing systeems in extracellular and total extracts from needels of Norway spruce (Picea abies L. Karst.). Palnt Physiol. 94: 312-319.
Pouget, R., Ottenwaelter. 1975. Les problèmes posés par la sélection de porte-greffes résistants à la chlorose calcaire. Vitis 13: 292-296.
Powell, P.E., Staniszlo, P.J., Cline, G.R., Reid, C.P.P. 1982. Hydroxamate siderophores in the iron nutrition of plants. J. Plant Nutr. 5: 653-673.
Price, C.A. 1968. Iron compounds and plant nutrition. Ann. Rev. Plant Physiol. 19: 239-248. Pushnik, J.C., Miller, G.W. 1989. Iron regulation of chloroplast photosynthesis function: mediation of PS I
development. J. Plant Nutr. 12: 407-421. Rabotti, G., Zocchi, G. 1994. Plasma membrane-bound H+-ATPase and reductase activities in Fe-deficient
cucumber roots. Physiol. Plant. 90: 779-785. Redinbaugh, M.G., Campbell, W.H. 1983. Purification of squash NADH:nitrate reductase by zinc chelate affinity
chromatography. Plant Physiol. 71: 205-207. Robinson, N.J., Groon, S., Groom Q.J. 1997. The forth gene family from Arabidopsis thaliana: Putative iron-chelate
reductase. In: Plant Nutrition for Sustainable Food Production and Envaironment (T. Ando, K. Fujita, T. Mae, H. Matsumoto, S. Mori nad J. Sekiya, eds.), pp 191-194. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
Roby, D., Toppan, A., Esquerre-Tugaye, M.T. 1985. Cell surfaces in plant-microorganism interaction. V. Elicitors of fungal and of plant origin trigger the synthesis of ethylene and cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein in plants. Plant Physiol. 77: 700-704.
Rohringer, R., Ebrahim-Nesbat, F., Wolf, G. 1983. Proteins in intercellular washing fluids from leaves of barley (Hordeum vulgare L.). J. Exp. Bot. 34: 1589-1605.
Romera, F.J. Alcántara, E., de la Guardia, M.D. 1991. Characterization of the tolerance to iron chlorosis in different peach rootstocks grown in nutrient solution. I. Effect of bicarbonate and phosphate. Plant Soil 130: 115-119.
Romera, F.J., Alcántara, E., de la Guardia, M.D. 1992. Effect of bicarbonate, phosphate and high pH on the reducing capacity of the Fe-deficient sunflower and cucumber plants. J. Plant Nutr. 15: 1519-1530.
Literatura
80
Römheld, V. 1991. The role of phytosiderophores in aquisition of iron and other micronutrients in graminaceous species: An ecological apporoach. Plant Soil: 130: 159-166.
Römheld, V. 1979. Mechanismus der Aufnahme und Verlagerung Eisenchelaten bei höheren Pflanzen. Ph.D. thesis. Technische Universität Berlin, Germany.
Römheld, V. 1987. Different strategies for iron acquisition in higher plants. Physiol. Plant. 70: 231-234. Römheld, V., Kramer, D. 1983. Relationship between proton efflux and rhizodermal transfer cells induced by iron
deficiency. Z. Pflanzenphysiol. 113: 73-83. Römheld, V., Marschner, H. 1981. Iron deficiency stress inducted morphological and physiological changes in root tips
of sunflower. Physiol. Plant. 53: 354-360. Römheld, V., Marschner, H. 1983. Mechanism of iron uptake by peanut plants. I. FeIII reduction, chelate splitting and
release of phenolics. Plant Physiol. 71: 949-954. Römheld, V., Marschner, H. 1986a. Mobilization of iron in the rizosphere of different plant species. In: Advances in
Plant Nutrition. Vol. 2. (B. Tinker and A. Läuchli, eds.), pp 155-192. Praeger Publishers, New York. Römheld, V., Marschner, H. 1986b. Evidence for specific uptake system for iron phytosiderophores in roots of
grasses. Plant Physiol. 80: 175-180. Römheld, V., Marschner, H. 1990. Genotypical differences among graminaceous species in release of
phytosiderophores and uptake of iron phytosiderophores. Plant Soil 123: 147-153. Römheld, V., Marschner, H. 1991. Function of micronutrients in plants. In: Micronutrients in Agriculture (J.J.
Mortvedt, F.R. Cox, L.M. Shuman and R.M. Welch, eds.), pp 279-324. Soil. Sci. Soc. Amer., Inc., Madison, Wisconsin.
Römheld, V., Marschner, H., Kramer, D. 1982. Response to Fe deficiency in roots of “Fe-efficient” plant species. J. Plant Nutr. 5: 489-498.
Römheld, V., Müller, C., Marschner, H. 1984. Localization and capacity of proton pumps of roots of intact sunflower plants. Plant Physiol. 76: 603-606.
Rutland, R.B., Bukovac, M.J. 1971. The effect of calcium bicarbonate on iron absporption and distribution by Chrysanthemum morfolium Ram. Plant Soil 35: 225-236.
Saglio, P. 1969. Nutrition en fer de la vigne. I Essai d’induction d’une chlorose ferrique par l’action combinée du bicarbonate et de l’orthophosphate sur deux variétés: L’une sensible et l’autre resistante. Ann. Physiol Vég. 11: 27-35.
Schmidke, I., Stephan, U.W. 1995. Transport of metal micronutrients in the phloem of castor bean (Ricinus communis) seedlings. Physiol Plant. 95: 147-153.
Schmidt, W., Janiesch, P. 1991. Specificity of the electron donor for transmembrane redox systems in bean (Phaseolus vulgaris L.) roots. J. Plant Physiol. 138: 450-453.
Schmidt, W., Janiesch, P., Brüggemann, W. 1990. FeEDTA reduction in roots of Plantago lanceolata by a NADH-dependent plasma mebrane-bound redox system. J. Palnt Physiol. 136: 51-55.
Scholz, G., Becker, R., Pich, A., Stephan, U.W. 1992. Nicotianamine - a common constituent of strategies I and II of iron acquisition by plants. A review. J. Plant Nutr. 15: 1647-1665.
Scholz, G., Becker, R., Stephan, U.W., Rudolph, A., Pich, A. 1988. The regulation of iron uptake and possible functions of nicotianamine in higher plants. Biochem. Physiol. Pflanzen 183: 257-269.
Schultz, R., Marschner, H. 1969. Aufnahme auf Verlagerung von Eisen bei Bohnenpflanzen in Abhängigkeit von Transpiration und Stoffwechselaktivität. Z. Pflanzenernähr. Bodenk. 124: 1-12.
Seckbach, J.J. 1982. Ferreting out the secret of plant ferritin - A review. J. Plant Nutr. 5: 369-394. Shojima, S., Nishizawa, N., Fushiya, S., Nozoe, S., Irifune, T., Mori, S. 1990. Biosynthesis of phytosiderphores. In vitro
biosynthesis of 2’-deoxymugineic acid from L-methionine and nicotianamine. Plant Physiol. 93: 1497-1503. Sijmons, P.C., Lanfermeijer, F.C., De Boer, A.H., Prins, H.B., Bienfait, H.F. 1984a. Depolarization of cell
membrane potential during trans-plasma membrane electron transfer to extracellular electron acceptors in iron-deficient roots of Phaseolus vulgaris L. Plant Physiol. 76: 943-946.
Sijmons, P.C., van den Briel, W., Bienfait, H.F. 1984b. Cytosolic NADPH is the electron donor for extracellular FeIII reduction in iron-deficient bean roots. Plant Physiol. 75: 219-221.
Smith, F.A., Raven, J.A. 1979. Intracellular pH and its regulation. Annu. Rev. Plant Physiol. 30: 289-311. Speer, M., Kaiser, W.M. 1991. Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacea oleracea L. and
Pisum sativum L. under salinity. Plant Physiol. 97: 990-997. Spiller, S.C., Castelfranco, A.M., Castelfranco, P.A. 1982. Effects of iron and oxygen on chlorphyll biosynthesis. I.
In vivo observations on iron and oxygen- deficient plants. Plant Physiol. 69: 107-111. Spiro, T.G., Pape, L., Saltman, P. 1967. The hydrolytic polymerization of ferric citrate. I. The chemistry of the
polymer. J. Am. Chem. Soc. 89: 5555-5559. Starrach, N., Mayer, W.-E. 1989. Changes of the apoplastic pH and K+ concentration in the Phaseolus pulvinus in
situ in relation to rhythmic leaf movements. J. Exp. Bot. 40: 865-873.
Literatura
81
Stephan, U.W., Schmidke, I., Pich, A. 1994. Phloem translocation of Fe, Cu, Mn and Zn in Ricinus seedlings in relation to the concentrations of nicotianamine, an endogenous chelator of divalent metal ions, in different seedlings parts. Plant Soil 165: 181-188.
Stephan, U.W., Scholz, G. 1993. Nicotianamine: mediator of transport of iron and heavy metals in the phloem? Physiol. Plant. 88: 522-529.
Stephan, U.W., Scholz, G., Rudolph, A. 1990. Distribution of nicotianamine, a presumed symplast iron transporter, in different organs of sunflower and of a tomato wild type and its mutant chloronerva. Biochem. Physiol. Pflanzen 1986: 81-88.
Swain T., Hillis W.E. 1959. The phenolic constituents of Prunus domestica. I. The quantitative analysis of phenolic constituents. J. Sci. Food Agric. 10: 63-68
Tagliavini, M., Scudellari, Marangoni, B., Toselli, M. 1995. Acid-spray regreening of kiwifruit leaves affected by lime-induced iron chlorosis. In: Iron Nutrition in Soils and Plants (J. Abadía, ed.), pp 191-195. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
Takagi, S., Nomoto, K., Takemoto, T. 1984. Physiological aspect of mugineic acid, a possible phytosiderophore of graminaceous plants. J. Plant Nutr. 7: 469-477.
Takahama, U. 1993. Regulation of peroxidase-dependent oxidation of phenolics by ascorbic acid: Different effect of ascorbic acid in the oxidation of coniferyl alcohol by the apoplast soluble and cell wall-bound peroxidases from epicotyls of Vigna angularis. Plant Cell Physiol. 34: 809-817.
Takahama, U., Oniki, T. 1992. Regulation of peroxidase-dependent oxidation of phenolics in the apoplast of spinach leaves by ascorbate. Plant Cell Physiol. 33: 379-387.
Takkar, P.N., Ulrich, B., Meiwes, K.J. 1987. Method for estimation of CO2 (ag) plus H2CO3, HCO3- and pH in soil
solution collected under field conditions. Z. Pflanzenernähr. Bodenk. 150: 319-326. Terry, M.E., Bonner, B.A. 1980. An examination of centrifugation as a method of extracting an extracellular solution
from peas and its use for the study of indolacetic acid-induced growth. Plant Physiol. 66: 321-325. Terry, N. 1980. Limiting factors in photosynthesis. I. Use of iron stress to control photochemical capacity in vivo. Plant
Physiol. 65: 114-120. Terry, N., Abadía, J. 1986. Function of iron in chloroplasts. J. Plant Nutr. 9: 609-646. Tetlow, I.J., Farrar, J.F. 1993. Apoplstic sugar concentration and pH in barley leaves infected with brown rust. J. Exp.
Bot. 44: 929-936. Thibaud, J.B., Grignon, C. 1981. Mechanism of nitrate uptake in corn roots. Palnt Sci. Lett. 22: 279-289. Thom, M., Maretzki, A. 1985. Evidence for a plasmalemma redox system in sugarcane. Plant Physiol. 77: 873-876. Tiffin, L.O. 1966a. Iron translocation I. Plant culture, exudate sampling, iron-citrate analysis. Plant Physiol. 41: 510-514. Tiffin, L.O. 1966b. Iron translocation II. Citrate/iron ratios in plant stem exudates. Plant Physiol. 41: 515-518. Tiffin, L.O. 1970. Translocation of iron citrate and phosphorus in xylem exudate of soybean. Plant Physiol. 45, 280-283. Tiffin, L.O. 1972. Translocation of micronutrients in plants. In: Micronutrients in Agriculture (J.J. Mortvedt, P.M.
Giordano and W.L. Lindsay, eds.), pp 199-229. Soil. Sci. Soc. Amer., Inc., Madison, Wisconsin. Tipton, C.L., Thowsen, J. 1985. FeIII reduction in cell walls of soybean roots. Plant Physiol. 79: 432-435. Toulon, V., Sentenac, H., Thibaud, J.B., Davidian, J.C., Moulineau, C. and Grignon, C. 1992. Role of apoplast
acidification by H+ pump. Planta 186, 212-218. Ullrich, W.R. 1992. Transport of nitrate and ammonium through plant membranes. In: Nitrogen Metabolism in
Plants (K. Mengel and D.J. Pilbeam, eds.), pp 121-137. Oxford University Press, Oxford, UK. Uren, N.C. 1984. Forms, reactions and availability of iron in soils. J. Plant Nutr. 7: 165-176. van Beusichem, M.L., Kirkby, E.A., Bass, R. 1988. Influence of nitrate and ammonium nutrition on the uptake,
assimilation, and distribution of nutrients in Ricinus communis. Plant Physiol. 86: 914-921. van Volkenburgh, E., Cleland, R.E. 1980. Proton excretion and cell expansion in bean leaves. Planta 148: 273-278. Venkat Raju, K., Marschner, H. 1972. Regulation of iron uptake from relatively insoluble iron compounds by sunflower
plants. Z. Pflanzenernähr. Bodenk. 133: 227-241. von Wirén, N., Marschner, H., Römheld, V. 1995. Uptake kinetics of iron-phytosiderophores in two maize
genotypes differing in iron efficiency. Physiol. Plant. 93: 611-616. Wallace, A., Abou-Zamzam, A.M. 1986. Uptake of labeled 14C bicarbonate by some monocot and dicot plants from
nutrient solution. J. Plant Nutr. 9: 887-892. Wallihan, E.F. 1961. Effect of sodium bicarbonate on iron absorption by orange seedlings. Plant Physiol. 36: 52-53. Warner, R.C., Weber, I. 1953. The cupric and ferric citrate complexes. J. Am. Chem. Soc. 75: 5086-5094. Welkie, G.W., Miller, G.W. 1993. Plant iron uptake physiology by nonsiderophore systems. In: Iron Chelation in
Plants and Soil Microorganisms (L.L. Barton and B.C. Hemming, eds.), pp 345-366. Academic Press, London. White, M.C., Baker, F.D., Chaney, R. L., Decker, M.A. 1981. Metal complexation in xylem fluid II. Theoretical
equilibrium model and computational computer program. Plant Physiol. 67: 301-310. Wolf, O. Munns, R., Tonnet, M.L., Jeschke, W.D. 1990. Concentrations and transport of solutes in xylem and
phloem along the leaf axis of NaCl-treated Hordeum vulgare. J. Exp. Bot. 41: 1133-1141.
Literatura
82
Yang, X., Römheld, V., Marschner, H. 1994. Effect of bicarbonate on root growth and accumulation of organic acids in Zn-inefficient and Zn-efficient rice cultivars Oryza sativa L. Plant Soil 164: 1-7.
Zhang, C. 1995. Uptake, transport and remobilization of iron in bean (Phaseolus vulgaris L.) plants. Ph. D. thesis. Universität Hohenheim, Stuttgart, Germany.
Zhang, C., Römheld, V., Marschner, H. 1995a. Distribution pattern of root-supplied 59iron in iron-sufficient and iron-deficient bean plants. J. Plant Nutr. 18: 2049-2058.
Zhang, C., Römheld, V., Marschner, H. 1995b. Retranslocation of iron from primary leaves of bean plants under iron deficiency. J. Plant Physiol. 146: 268-272.
Zhang, C., Römheld, V., Marschner, H. 1996. Effect of primary leaves on 59Fe uptake by roots and 59Fe distribution in the shoot of iron sufficient and iron deficient bean (Phaseolus vulgaris L.) plants. Plant Soil 182: 75-81.
Zhang, F., Römheld, V., Marschner, H. 1991. Role of the root apoplasm for iron acquisition by wheat plants. Plant Physiol. 97: 1302-1305.
Zocchi, G., Cocucci, S. 1990. Fe uptake mechanism in Fe-efficient cucumber roots. Plant Physiol. 92: 908-911.
