MEDIJATORI PRIJENOSA ELEKTRONA

• redoks centar – nalazi se u dubini proteinskog lanca

• - nema električnog kontakta između redoks centra i površine elektrode

• - tanki proteinski lanac stvara kinetičku barijeru prijelazu elektrona (tuneliranju elektrona)

Marcusova- teorija o prijenosu elektrona

∆G°, λ − slobodna energija i energija reorganizacije elektronskog prijelaza (eV)

• do, d- Wan der Walaesov razmak između donorskog iakceptorskog centra elektrona (Á)

• ket- (electron-transfer rate constant) konstanta prijelaza elektrona (M-1s-1)

• β -konstanta razmaka propadanja (Á-1)• 0.4 < β < 1.3 Á-1

• koeficijent proporcionalnost = 1013

Marcusova teorija –prijelaz elektrona u biološkim sustavima

Konstanta prijelaza elektrona ovisi o :

– Standardnom redukcijskom potencijalu medijatora– pH vrijednosti– Ionskoj jakosti otopine– Utjecaju interferenata– Elektrostatskim interakcijama (međudjelovanje)

reaktanta, medijatora i enzima.

• Kod biosenzora se zahtjevaju visoke konstante prijelaza elektrona

• za elektronsko tuneliranje od 8-17Á , ket ≈ 1 do 10 4 M-1s-1

SVOJSTVA MEDIJATORA ELEKTRONA

• DOBRA TOPLJIVOST U VODENIM I NEVODENIM OTAPALIMA• REVERZIBILNO ELEKTROKEMIJSKO PONAŠANJE• KEMIJSKA STABILNOST OKSIDACIJSKOG I REDUKCIJSKOG OBLIKA

MEDIJATORA• NISKI REDUKCIJSKI REDOKS POTENCIJAL-SPREČAVANJE

OKSIDACIJE POTENCIJALNIH INTERFERENATA• KEMIJSKA INAKTIVNOST PREMA SUPSTRATU• AKTIVAN U ŠIROKOM pH PODRUČJU• NEOSJETLJIVOST NA PROMJENE IONSKE JAKOSTI OTOPINA• EFIKASNA I BRZA REAKCIJA S ENZIMSKIM REDOKS CENTROM • EFIKASNO PRIMANJE I PREDAJA ELEKTRONA NA ELEKTRODNOJ

POVRŠINI

REDOKS POTENCIJAL MEDIJATORA ELEKTRONA

• OKSIDACIJSKA BIOKATALIZA• E0

MEDIJATORA > E0ENZIMA

• REDUKCIJSKA BIOKATALIZA• E0

MEDIJATORA < E0ENZIMA

PRIMJENA MEDIJATORA ELEKTRONA U IZVEDBAMA BIOSENZORA

• Direktni kontakt površine elektrode i enzimskog redoks centra - biosenzori bez medijatora elektrona

• Elektronski prijenos elektrona ostvaren difuzijom medijatora

• Koimobilizacija enzima i medijatora u polimernom sloju i unutar anorganske matrice

• Električki kontatk enzima i medijatora unutar sol-gel matrice

• Električki kontatk enzima i medijatora unutar grafitne paste

Direktni kontakt površine elektrode i enzimskog redoks centra - biosenzori bez

medijatora elektrona• elektroredukcija O2 i H2O2

biokatalizirana lakazom i peroksidazom

Biokataliza s peroksidazom kao direktnim prijenosnikom elektrona

• ENZIM:• - peroksidaza• - citokrom c peroksidaza• - laktoperoksidaza• - kloroperoksidaza• Osnovno svojstvo:• 42% površine enzima leži na površini

elektrode, HEM je u kontaktu selektrodom

•MOLEKULARNI KISIK:•kisik služi kao elektron akceptor za oksidaciju supstrata•Radijus GO = 43 Á – nemoguć direktan kontakt s površinom elektrode•Upotreba biosenzori s enzimima:• glukoza oksidaza• laktat oksidaza• alkohol oksidaza• kolesterol oksidaza• ksantin oksidaza• katehol oksidaza

Reakcije s oksidazom i O2

• Mjeri se: -smanjenje koncentracije kisika u uzorku • redukcija ili oksidacija vodikovog peroksida

• direktni kontakt redoks centra enzima i površine elektrode može se ostvariti vodljivim nanočesticama-najnovije izvedbe biosenzora

BIENZIMSKI SUSTAV PEROKSIDAZA-OKSIDAZA

• -direktni kontakt HRP s elektrodom• Poznati biosenzori:• peroksidaza +• glukoza oksidaza• alkohol oksidaza• amino kiselina oksidaza • kolin oksidaza

ELEKTROKEMIJSKI INAKTIVNI SPOJEVI MALE MOLEKULARNE MASE

•• Promotori: vezivanje redoks centra enzima (citokrom c)

i površine elektrode• - vežu se na površinu elektrode• - tiolima• - disulfidnim skupinama• - amino kiselinama• - imidazolima• - jodidom• - tiofenom

ELEKTRONSKI TRANSFER OSTVAREN DUFUZIJOM MEDIJATORA

• Medijator difundira od redoks centra do elektrode• medijator je otopljen unutar enzimskog sloja• imobiliziran u monosloju ili multi sloju na

elektrodi• uklopljen u poroznoj matrici• Funkcionalnost biosenzora: - postiže se odabirom

hidrofobih/hidrofilnih svojstava medijatora ienzima

•

Difuzijski medijatori elektrona u biosenzorima

• Feroceni• Organske boje• Heksacianoferati• Ru-kompleksi• Ostali

FEROCEN

• Diciklopentadienilželjezo• Kordinacijski broj 2 (10 veza)

Fe

E nzym e M ediator M ediator redox poten tia l / m V

(vs. SC E )

G lucose oxidase E C 1.1 .3 .4 . from A spergillu s n iger

1 ,4-benzoquinone

1 ,1-dim ethylferrocene

ferrocene carboxylic acid

phenazine m ethosu lphate

tetrath iofu lvalene

tetracyanoquinodim ethane

39

100

275

-161

300

127

X anthine oxidase E C 1 .1 .3 .22. from b u tterm ilk

[Fe(C N )6]4– 180

C holesterol oxidase E C 1 .1 .3 .6 . from P seu dom on as sp .

ferrocene carboxylic acid 275

H ydrogen hydrogenase E C 1.12.1 .2

d im ethylvio logen –681

P eroxidase E C 1 .11.1 .7 . from h orserad ish

[Fe(C N )6]4– 180

L actate dehydrogenase

(cyt.b 2) E C 1.1 .2 .3 . from yeast

[Fe(C N )6]4– 180

G lucose dehydrogenase E C 1 .1 .99 .17. from A . C alcoaceticu s

1,1’-d im ethylferrocene

phenazine ethosulfate

100

-172

N A D H dehydrogenase E C 1 .6 .99 .3 from B acillu s

stearoth erm oph ilu s

ferrocenylm ethanol

ferrocenecarboxylic acid

185

Feroceni - difuzijski medijatori elektrona

Enzimi imobilizirani u anorganskim i polimernim matricama

• Vodljivi polimeri (polipirol)-direktan kontakt redoks centra i elektrode-slabo osjetljivi senzori

• Dodatak difuzijskog medijatora- pospješuje elektronsku komunikaciju

• Sol-gel imobilizacije• Efikasnost difuzijskog medijatora limitirana ispiranjem

iz imobiliziranog sloja- polimerna poroznnost• Najčešći medijatori: benzokinon, hidrokinonsulfonat,

feroceni, heksacianoferati

Koimobilizacija enzima i medijatora u polimernom sloju i unutar anorganske

matrice

• Električka veza: ostvaruje sekoimobilizacijom enzima i medijatora

• najčešće: ionskoizmjenjivačko svojstvo polipirola i fercenova karboksilata

Električki kontatk enzima i medijatora unutarsol-gel matrice

Električki kontakt enzima i medijatora unutar grafitne paste

• najčešči medijatori:• -feroceni• -benzokinon• -tetratiofulven• -kobalt ftalocianin• -metilensko zeleno• - bakrov heksacianoferat

ELEKTRIČKI KONTAKT MEDIJATOROM FUNKCIONALIZIRANE ELEKTRODE

ELEKTRIČKI KONTAKT MEDIJATOROM MODIFICIRANOG ENZIMA