Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
MASTER RAD
Efekat etarskog ulja celera (Apium graveolens var. dulce
(Mill.) Pers) na rast vrste Bacillus cereus u komercijalnoj
pilećoj supi kao modelu hrane
Niš, 2014.
Kandidat:
Milena Milutinović
Mentor:
dr Zorica Stojanović-Radić
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
Effect of celery essential oil (Apium graveolens var. dulce
(Mill.) Pers) on the growth of Bacillus cereus in
commercial chicken soup as a food model
Master thesis
Niš, 2014.
Mentor:
PhD Zorica Stojanović-Radić
Candidate:
Milena Milutinović
Zahvalnica
Zahvaljujem se svom mentoru dr Zorici Stojanović-Radić na ukazanom
poverenju, korektnoj saradnji i stručnoj pomoći.
Najviše se zahvaljujem svojoj porodici koja mi je pružila nesebičnu
ljubav i podršku tokom studiranja.
Biografija
Ime i prezime: Milena Milutinović
Datum rođenja: 14. 2. 1990 god.
Mesto rođenja: Sokobanja
Osnovna škola: ''Mitropolit Mihajlo'' Sokobanja
Srednja škola: Poljoprivredna škola ''Šumatovac'' u Aleksincu
Smer- Veterinarski tehničar
Fakultet: Prirodno-matematički fakultet u Nišu
Smer: Biologija
Osnovne akademske studije upisane školske 2009/2010 god.
Master studije upisane školske 2012/2013 god.
Poslednji ispit položen: 30.09.2014. god.
Sažetak
Celer (Apium graveolens var. dulce (Mill.) Pers) je začinska biljka,
korišćena u skoro svim kuhinjama sveta. Sa druge strane, kao biljka sa
dokazanim antimikrobnim dejstvom, njena upotreba može biti i kratkoročna
konzervacija hrane u kojoj se nalazi kao začin. Do sada, efikasnost ove biljke, a
posebno njenog etarskog ulja u čistom stanju nije ispitana na modelu hrane,
koji je i jedini validan tip istraživanja vezanih za hranu.
Cilj master rada bio je da se istraži potencijal etarskog ulja celera u
prevenciji kvarenja supe uzrokovanog vrstom Bacillus cereus. Etarsko ulje je
izolovano iz svežeg biljnog materijala (koren) hidrodestilacijom u aparaturi po
Klevendžeru. Hemijski sastav dobijenog etarskog ulja je analiziran korišćenjem
gasne hromatografije-masene spektrometrije. Antimikrobna aktivnost etarskog
ulja ispitana je određivanjem minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) na
dva soja bakterije Bacillus cereus (izolat iz hrane i ATCC soj). U cilju
određivanja efikasnosti ulja celera u realnim uslovima, njegov efekat na rast
vrste Bacillus cereus je ispitan na komercijalnoj pilećoj supi kao modelu.
Ispitivanje je vršeno na različitim temperaturama i različitim periodima
inkubacije. Nakon ukupnog perioda inkubacije, utvrđeno je da inkubacija sa
etarskim uljem celera značajno redukuje broj ćelija vrste Bacillus cereus i da se
ovo etarsko ulje može koristiti kao efikasni konzervans ove vrste hrane.
Ključne reči: etarsko ulje, celer (Apium graveolens var. dulce (Mill.)
Pers), antimikrobna aktivnost, Bacillus cereus
Abstract
Celery (Apium graveolens var. dulce (Mill.) Pers) is a spice plant, used in
almost all cuisines of the world. On the other hand, as a plant with a proven
antimicrobial activity, its use can be a short-term conservation of food spiced
with this plant. Until now, the efficiency of this plant, especially its essential oil
in the pure state has not been tested on a food model, which is only valid type
of the food-related research.
The goal of this master thesis was to investigate the potential of the
essential oil of celery in preventing spoilage of soup caused by Bacillus cereus
species. The essential oil was isolated from fresh plant material (root) by
hydrodistillation in Clevenger apparatus. Chemical composition of the obtained
essential oil was analyzed using gas chromatography-mass spectrometry. The
antimicrobial activity of essential oil was tested by determining the minimum
inhibitory concentration (MIC) on the two strains of Bacillus cereus (isolates
from food and ATCC strain). In order to determine the efficiency of celery oil
in real terms, its effect on the growth of Bacillus cereus has been tested on a
commercial chicken soup as a model. The test was performed at different
temperatures and different periods of incubation. After a total incubation
period, it was found that incubation with essential oil of celery significantly
reduces the number of cells of Bacillus cereus and that this essential oil can be
used as an effective preservative for these types of food.
Keywords: essential oil, celery (Apium graveolens var. dulce (Mill.)
Pers), antimicrobial activity, Bacillus cereus
SADRŽAJ
1. Uvod……………………………………………………………………..….1
1.1. Etarska ulja biljaka kao značajni antimikrobni biljni sekundarni
metaboliti………………………………………………………….....….3
1.1.1. Opšti sastav etarskih ulja………………………….……………....3
1.1.2. Etarska ulja kao antimikrobni agensi…………………………..…5
1.1.3. Primena etarskih ulja………………………………………..…….8
1.2. Opšte karakteristike celera (Apium graveolens var. dulce (Mill.)
Pers)........................................................................................................10
1.2.1. Prinos i hemijski sastav celera………..………………………....12
1.2.2. Pregled istraživanja antimikrobnog efekta etarskog ulja celera
(Apium graveolens var. dulce)……………………..……………....13
1.3. Opšte karakteristike vrste Bacillus cereus…………………...…….…..19
1.3.1. Značaj vrste Bacillus cereus kao kontaminanta hrane……….….20
1.3.2. Toksini vrste Bacillus cereus……………………………..…..…22
1.4. Ciljevi istraživanja……………………………………………..…..….24
2. Materijal i metode…………………………………………………...…..…25
2.1. Rastvori, podloge i reagensi……………………………..……………25
2.2. Biljni materijal………………………………………………..……….27
2.3. Izolovanje etarskog ulja celera………………………………..…..…..27
2.4. Antimikrobna aktivnost vrste Apium graveolens var. dulce………….28
2.4.1. Kulture mikroorganizama……………………………..…..…….28
2.4.2. Mikrodiluciona metoda……………………………..………..….28
2.5. Model hrane………………………………………………………..….30
2.6. Statistička analiza dobijenih podataka……………………...………....32
3. Rezultati i diskusija……………………………………...……….......…….33
3.1. Prinos etarskog ulja………………………….………………………..33
3.2. Hemijski sastav etarskog ulja………………………………..………..34
3.3. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Apium
graveolens……………………………………………………………...38
3.4. Efekat etarskog ulja celera na rast vrste Bacillus cereus u modelu
hrane………..………………………………………………………….40
4. Zaključak……………………………………………………………....…..44
5. Literatura……………………………………………………………...…....46
1
1. UVOD
Još od davnina čovek je uvideo da su biljke veoma značajne i da se mogu
upotrebljavati u različite svrhe, pre svega za ishranu i lečenje. Produkti biljaka
koji se koriste radi poboljšanja ukusa i mirisa hrane i pića nazivaju se začini.
Oni se koriste hiljadama godina u pripremi hrane kao i u njenom očuvanju
(Govindarajan, 1985; Dillon & Board, 1994). Svaki začin karakteriše
jedinstveni ukus i aroma koji potiču od sekundarnih metabolita te začinske
biljke. Ovi metaboliti imaju ulogu zaštite biljke od insekata, gljiva, patogena i
biljojeda (Fraenkel, 1959; Walker, 1994). Biljke i začini su dobri antioksidanti i
predstavljaju prirodne konzervanse koji se sve češće koriste za produžavanje
veka trajanja hrane (Peter, 2001). Poznato je da određeni broj hemijskih aditiva
mogu imati negativni uticaj na ljudsko zdravlje, pa se javlja sve veći interes
naučne zajednice za istraživanja kojima će se pronaći prirodni, a samim tim i
neškodljivi aditivi za hranu. Među njima su u centru pažnje začinske biljke koje
se vekovima koriste u kuhinjama raznih naroda, što je primarni dokaz njihove
efikasnosti i neškodljivosti. Iz njih se istražuje veliki broj ekstrakata, ali
najznačajniji broj naučnih studija posvećen je etarskim uljima, koja su
dokazana kao veoma jaki antimikrobni agensi koji u isto vreme pokazuju visok
antioksidativni efekat.
Smeše mirišljavih lako isparljivih jedinjenja koja nastaju u sekretornim
delovima biljaka koji se mogu naći u cvetovima, stablu, listovima i drugim
delovima biljke nazivaju se etarskim uljima. Etarska ulja mogu biti izolovana iz
različitih delova biljke, pri čemu se njihov hemijski sastav, a samim tim i
bioaktivnost može značajno razlikovati u zavisnosti od dela biljke iz kojih su
dobijena. Do sada su vršena mnoga istraživanja na temu antimikrobne
2
aktivnosti začinskih biljaka, među kojima su najviše ispitivane aromatične
začinske biljke poput origana, majčine dušice, bosiljka, dok su neke začinske
biljke (ili njihovi pojedini delovi) koje nemaju veliki prinos, bile zapostavljene.
Među njima je i biljka celer Apium graveolens var. dulce (Mill.) Pers., koja se
koristi širom sveta kao začin, ali je relativno slabo ispitana u smislu potencijala
za konzervaciju hrane. Ispitivanja na temu ove biljke bavila su se hemijskim
sastavom i antimikrobnom aktivnošću njenih različitih ekstrakata, prevashodno
iz listova i semena, dok je koren, koji se intenzivno koristi kao začin, veoma
slabo istražen. Takođe, ne postoje podaci dobijeni naučnim metodama na temu
efikasnosti bilo kog ekstrakta ove biljke na modelu hrane, koji je jedini validni
i realan način istraživanja vezanih za hranu.
3
1.1 Etarska ulja biljaka kao značajni antimikrobni biljni sekundarni
metaboliti
Etarska ulja su složena, nestabilna, prirodna jedinjenja koja imaju jak
miris i predstavljaju sekundarne metabolite aromatičnih biljaka. Najčešće se
izdvajaju parom ili hidrodestilacijom. U prirodi, štite biljke od bakterija, virusa,
gljiva, insekata i biljojeda. Etarska ulja imaju ulogu u privlačenju nekih
insekata kako bi došlo do disperzije polena i semena, ali mogu biti repelenti za
neke druge insekte. Mogu biti sintetisani u svim biljnim organima a čuvaju se u
sekretornim ćelijama, kanalima, šupljinama, epidermalnim ćelijama ili
žlezdanim trihomama (Massoti et al., 2003; Angioni et al., 2006).
1.1.1. Opšti sastav etarskih ulja
Začini i etarska ulja izolovana iz kulinarskih biljaka sadrže širok spektar
aktivnih fitohemikalija. Etarska ulja mogu sadržati više od šezdeset
pojedinačnih komponenti. Glavna komponenta može činiti i do 85% etarskog
ulja dok ostale komponente mogu biti prisutne samo u tragovima (Bauer et al.,
2001; Senatore, 1996). Etarska ulja, najčešće, čine sledeće komponente:
alkoholi, aldehidi, kiseline, estri, ketoni, fenoli, laktoni i ugljovodonici
(Gessner, 1993). Sva ova jedinjenja mogu pripadati terpenima ili
fenilpropanima (Andrade et al., 2011; De Sousa, 2011, Griffin et al., 1999) ili
ugljovodoničnim i kiseoničnim jedinjenjima (Akhila, 2006; Halm, 2008;
Hunter, 2009; Margaris et al., 1982; Pourmourtazavi & Hajimirsadeghi, 2007;
Shibamoto, 2010).
4
Ugljovodonici su jednostavni molekuli koji sadrže samo atome vodonika
i ugljenika (Savage et al., 1996). Većina etarskih ulja spada u ugljovodonike.
Mogu biti zasićeni i nezasićeni ugljovodonici. Zasićeni ugljovodonici su
najjednostavniji i najmanji polarni organski produkti. Obično čine kutikularni
vosak biljaka na listovima ili voću (Hamilton, 1995; Eglinton & Hamilton,
1967). Mogu biti aciklični, aliciklični i aromatični ugljovodonici. Imaju razna
terapeutska dejstva.
Estri daju prijatan miris uljima i deluju kao spazmolitik i sedativ a imaju
i antifungalno i antiinflamatorno delovanje.
Oksidi ili ciklični estri daju jak miris etarskim uljima, podstiču
iskašljavanje i stimulišu nervni sistem.
Laktoni imaju veliku molekulsku težinu, a utiču na sniženje krvnog
pritiska, deluju kao sedativ i antipiretik. Mogu izazvati i alergiju čiji su
simptomi vidljivi na koži.
Alkoholi pored prijatnog mirisa imaju antimikrobno i antiseptičko
dejstvo a deluju i kao spazmolitik. Ovde spadaju linalol, mentol i drugi alkoholi
etarskih ulja.
Fenoli su potencijalno otrovne i najreaktivnije komponente etarskih ulja.
Pored antimikrobnih svojstava, stimulišu imuni i nervni sistem, smanjuju
holesterol u krvi a deluju i kao rubefacijent. Na sobnoj temperaturi su u obliku
kristala.
Aldehidi su nestabilne komponente koje pružaju sladak i prijatan miris
eteričnim uljima. Deluju umirujuće na organizam, kao spazmolitik i antipiretik,
a imaju i antivirusno dejstvo.
5
Ketoni su stabilni molekuli koji nisu često zastupljenji u eteričnim
uljima. Deluju kao analgetik, sedativ i digestiv, a mogu biti i neurotoksični.
Ulja koja se nalaze u biljnim ćelijama mogu se osloboditi pomoću
toplote i pritiska iz različitih delova biljke. Ekstrakcija se može izvršiti na
različite načine a najčešće se koristi hidrodestilacija (Bowles, 2003; Margaris et
al., 1982; Surburg & Panten, 2006). Može se primeniti ekstrakcija
rastvaračima, vodena infuzija, hladno i toplo presovanje i druge metode (Da
Porto et al., 2009; Hunter, 2009; Lahlou, 2004; Martinez, 2008; Pourmortazavi
& Hajimirsadeghi, 2007; Surburg & Panten, 2006). Hemijski sastav ulja zavisi
od načina ekstrakcije. Ukoliko se primeni hidrodestilacija ili destilacija pomoću
pare izdvajaju se ulja bogata terpenskim ugljovodonicima (Donelian et al.,
2009; Eikani et al., 2007; Reverchon, 1997; Wenqiang et al., 2007). Miris i
hemijski sastav ulja može zavisiti i od geografskog položaja, klime i uslova u
kojima raste (tip zemljišta, nadmorska visina, dostupnost vode i drugi faktori),
vremena branja (Andrade et al., 2011; Deans et al., 1992; Margaris et al., 1982;
Pengelly, 2004; Sangwan et al., 2001) i genetskog sastava biljke.
1.1.2. Etarska ulja kao antimikrobni agensi
Još u XIX veku su otkrivene antimikrobne i antioksidativne osobine
začina i njihovih etarskih ulja (Anitescu et al., 1997). Sve više se obraća pažnja
na narodnu medicinu i tradicionalno korišćenje biljaka za otkrivanje širokog
spektra efikasnih jedinjenja (Ahmad at al., 1998; Aswal et al., 1996; Bauer at
el., 1966). Povećanje rezistencije bakterija na antibiotike predstavlja veliki
globalni problem, zbog čega zadnjih godina raste interesovanje za biološki
aktivna jedinjenja izolovanih iz biljaka a koja se koriste za eliminaciju
patogenih mikroorganizama (Hunter and Reeves, 2002).
6
Biljke poseduju širok spektar sekundarnih metabolita kao što su tanini,
terpenoidi, alkaloidi i flavonoidi koji su zaslužni za antimikrobnu aktivnost
(Cowan, 1999). Antibakterijska svojstva etarskih ulja zavise uglavnom od
fenolnih komponenti ulja (Cosentino et al, 1999), od kojih su najčešće
zastupljeni karvakrol, eugenol (2-metoksi-4-(2-propenil) fenol) i timol
(Cosentino et al., 1999; Dorman & Deans, 2000; Farag et al., 1989; Juliano et
al., 2000; Lambert et al., 2001; Thoroski et al., 1989). Nekada manje
zastupljene komponente etarskog ulja mogu uticati na antimikrobnu aktivnost,
što je posledica njihovog sinergističkog efekta sa ostalim komponentama
etarskog ulja. Sinergizam komponenti etarskog ulja je primećen kod žalfije
(Marino et al., 2001), nekih vrsta timusa (Lattaouni & Tantaoui-Elaraki; 1994,
Marino et al., 1999; Paster et al., 1995) i origana (Paster et al., 1995).
Zbog različitog sastava i količine komponenti etarskih ulja kao i
drugačijih načina njihovih delovanja, etarska ulja pokazuju različito
antimikrobno delovanje. Mogu izazvati trajno oštećenje ćelijske membrane
bakterije i njenu smrt usled promene u masnim kiselinama i fosfolipidima
membrane ćelije, translokacije njenih proteina, poremećaja elektronskog
transporta i oštećenja ćelijskog zida. Ovaj efekat rezultuje izlaskom ćelijskih
komponenti u vanćelijski prostor i nepovratnim oštećenjem ćelije. Etarska ulja
mogu izazvati i promene u sintezi DNK i RNK, koagulaciju ćelijskog sadržaja
ili mogu sprečiti produkciju toksina (Bakkali et al., 2008; Burt, 2004; Di
Pasqua et al., 2007; Hammer et al., 2008; Shan et al., 2007). Fenolna jedinjenja
etarskih ulja pre svega oštećuju citoplazmatičnu membranu ćelije, ali i ometaju
kretanje protona i elektrona, aktivni transport i dovode do koagulacije ćelijskog
sadržaja (Davidson, 1997; Sikkema et al., 1995). Većina Gram-negativnih
organizama je manje osetljiva na antibakterijske agense, a razlog je taj što
7
poseduju spoljašnju membranu (Ratledge & Wilkinson, 1988) i sprečavaju
prodor hidrofobnih jedinjenja zahvaljujući lipopolisaharidnom sastavu ove
membrane (Vaara, 1992). Varijacije u hemijskom sastavu između različitih
etarskih ulja mogu izazvati različit stepen osetljivosti Gram-negativnih i Gram-
pozitivnih bakterija (Burt, 2007).
Širom sveta su ispitivana antimikrobna svojstva biljaka, gde je najveći
potencijal utvrđen za biljke koje pripadaju familiji Lamiaceae zbog specifičnog
hemijskog sastava bogatog tepenima. Mellisa officinalis je pokazala najbolju
antimikrobnu aktivnost protiv svih testiranih bakterijskih sojeva, ali i etarska
ulja biljaka Salvia officinalis, Rosmarinus officinalis i Lavandula officinalis su
pokazala aktivnost protiv ispitivanih životinjskih bakterijskih patogena.
Istraživanja na ovu temu posebno su brojna za vrste Južne Afrike (Nascimento
et al., 2000). Neke biljke familije Zingiberaceae sadrže različite antimikrobne
agense (Hirasa & Takemasa, 1998; Guzman & Siemonsma, 1999; Oonmetta-
aree et al., 2006). Etarsko ulje kurkume inhibira rast bakterije Bacillus cereus
(Burt, 2004). Rezultati su pokazali da su Gram-pozitivne bakterije osetljivije na
etanolne ekstrakte određenih biljaka iz familije Zingiberaceae u odnosu na
Gram-negativne bakterije (Pattaratanawadee et al., 2006). Maurer-Grmes i
saradnici su dokazali antimikrobnu aktivnost 59 vrsta biljaka familija
Acanthaceae i Scrophulariaceae (Maurer-Grmes et al., 1996). Dokazano je i
antimikrobno dejstvo 22 endemske biljke koje rastu na određenom regionu
Turske (Buruk et al., 2006). Etarska ulja biljaka mogu se koristiti pojedinačno
ili u kombinaciji sa antibioticima i imati potencijalnu primenu za lečenje i
prevenciju bolesti izazvanih multirezistentnim patogenima (Niculae et al.,
2009). Vodeni, etanolni i etil acetatni ekstrakti izolovani iz 12 biljnih vrsta
familije Apiaceae su pokazali dobru antibakterijsku aktivnost protiv testiranih
8
mikroorganizama. Najveću aktivnost su pokazali ekstrakti biljke Torilis
anthriscus, posebno na bakterijsku vrstu Pseudomonas glycinea (Brković et al.,
2006).
Antibakterijska svojstva etarskih ulja i njihovih komponenti su
iskorišćena u različitim komercijalnim proizvodima u stomatologiji (Manabe et
al., 1987) kao antiseptici (Bauer & Garbe, 1985; Cox et al, 2000) i kao dodatak
ishrani krmača i prasadi (Ilsley et al., 2002; Van Welie, 1997). Iako začini
imaju inhibitorno i antimikrobno dejstvo, oni su često izvor velikog broja
mikroba. Jedan od dvadeset začina sadrži Aspergillus flavus a četiri od tih
začina su uticali na rast ove plesni i proizvodnju aflatoksina (Flanning & Hui,
1976). Začini mogu da sadrže više od 108 aerobnih bakterija po gramu
(Banswart, 1981).
1.1.3. Primena etarskih ulja
Etarska ulja se koriste u ishrani, etnomedicini i farmaciji. Bitnu ulogu
imaju i u proizvodnji parfema i kozmetičkih proizvoda kao i u prehrambenoj
industriji za proizvodnju slatkiša, alkoholnih i bezalkoholnih pića. Neka ulja se
koriste kao insekticidi, neka imaju primenu u veterini a druga se koriste u
industriji boja i lakova kao i u kožarskoj industriji. Sve veću ulogu imaju u
sprečavanju zaraznih bolesti. Ekstrakt biljke Solanum nigrescens i nistatin su
primenjivani kod žena kod kojih je potvđeno prisustvo C. albicans, gde je
ekstrakt ove biljke pokazao dobro dejstvo protiv ovog mikroorganizma (Giron
et al., 1988). Sirovi ektrakt kaktusa Opuntia streptacantha je bio efikasan u in
vitro uslovima na virus HIV-a (Ahmad et al., 1996). Dobru efikasnost su
pokazali i ekstrakti biljaka Salvia sclarea i Humulus lupulus protiv izazivača
tuberkuloze Mycobacterium tuberculosis (Pauli & Schilcher, 2003).
9
Hloroformni ekstrakt biljke Milletia thonningii primenjen lokalno na kožu
miševa sprečava infekciju uzrokovanu parazitom Schistosoma mansoni (Perrett
et al., 1995). Etarska ulja imaju sve veću primenu u inhibiciji rasta i smanjenju
broja mikroorganizama koji učestvuju u kvarenju hrane i izazivaju različite
bolesti.
10
1.2. Opšte karakteristike celera (Apium graveolens var. dulce (Mill.)
Pers)
Celer je biljka koja pripada familiji Apiaceae u našem narodu poznata je
kao familija štitonoša zbog karakterističnih tipova cvasti koje se nazivaju
štitovi. Štitonoše ili štitare mogu biti jednogodišnje, dvogodišnje i višegodišnje
zeljaste biljke koje poseduju sekretorne kanale u kojima se nalaze etarska ulja,
od kojih potiče njihov karakterističan miris i ukus. Imaju šuplje, rebrasto stablo
sa naizmeničnim listovima koji su najčešće višestruko perasto deljeni, sa
razvijenim lisnim rukavcem. Cvasti su predstavljene složenim štitovima, dok su
cvetovi sitni, aktinomorfni. Plod je šizokarpijum koji se posle sazrevanja cepa
na dve orašice. Građa ploda je bitna za sistematiku štitara. Štitare imaju skoro
kosmopolitsko rasprostranjenje, najviše zastupljene u predelima sa umerenom i
suptropskom klimom severne hemisfere.
Carstvo Plantae
Razdeo Magnoliophyta
Klasa Magnoliopsida
Red Apiales
Familija Apiaceae
Rod Apium
Vrsta Apium graveolens Slika 1. Apium graveolens var. dulce
11
Celer je dvogodišnja biljka sa mesnatim korenom u obliku repe. Ima
blago gorak ukus. Stabljika je rebrasta, uspravna i visoka od 30-100 cm. Listovi
su sjajni, tamnozelene boje. Donji listovi imaju drške i perasto su deljeni dok su
gornji listovi sedeći i trorežnjeviti. Štitasta cvast je izgrađena od puno cvetova,
gde su krunični listići sitni i beli. Plod je poluloptast sa uočljivim rebrima.
Cveta od juna do oktobra. Gajeni celer potiče od močvarnog celera koji raste
samoniklo u severnoj i srednjoj Evropi na vlažnom i slanom zemljištu. Zeleni
izdanak, koren i plod se koriste kao začin i povrće. Celer se kao začin na tržištu
pojavljuje u vidu osušenog lista, semena, ekstrakta a koriste se i sveži delovi
celera.
Osušeni i samleveni list celera ulazi u sastav koncentrovanih supa u
kesicama i služi kao začinski dodatak jelima. Koren celera zbog svojih
mirišljavih, sočnih i mesnatih osobina koristi se kao začin. Celerova so koristi
se kao začin za paradajz sok, jela od povrća i sos salate. Seme celera se koristi
kao dodatak ajvaru, jelima od mesa, salatama, hlebu i drugim namirnicama.
Celer se, kao začin, može koristiti za poboljšanje ukusa uz istovremeno
produženje roka trajanja prehrambenih proizvoda (Momin & Nair, 2000).
U etnomedicini i farmaciji celer je poznat kao afrodizijak, antihemintik,
antispazmolitik, karminativ, diuretik, laksativ, sedativ, stimulans i otrov.
Poznat je kao blag diuretik i urinarni antiseptik. Uljani ekstrakti celera koji se
dobijaju iz korena ili semena koriste se kao dodaci ishrani koji regulišu krvni
pritisak i pomažu kod bolesti zglobova.
12
1.2.1. Prinos i hemijski sastav celera
Celer je bogat folnom kiselinom, ß-karotenom, vitaminom C,
magnezijumom, kalijumom, natrijumom, silicijum dioksidom, hlorofilom i
vlaknima. Sadrži i veliki procenat vode. Etarsko ulje celera sadrži delta
limonen i različite seskviterpene (Chopra & De, 1929). Celer takođe sadrži
fenole, furokumarine, isparljiva ulja, seskviterpenske alkohole i masne kiseline
(Garg et al., 1980; Sipailiene et al., 2003). U furokumarine celera spadaju
celerin, bergapten, apiumosid, apigravrin, ostenol, isopimpinelin,
isoimperatorin, celereozid i 5 i 8-hidroksi metoksipsoralen. Fenoli uključuju A
i B graveobiozid, apin, apigenin, isokvercitrin, tanine i fitatnu kiselinu
(Baananou et al., 2013; Sipailiene et al., 2003). Karakteristična aroma celera
potiče uglavnom od dve vrste laktona: 3-n-butilftalid i sedanolid (Chopra &
De, 1929). Ftalidi su zaslužni za tipičan miris celera iako su zastupljeni u
manjoj količini (Gijbels et al., 1985).
Prinos ekstrakata varira od 0.52-1.59% za seme celera i 0.56-1.26% za
lišće celera. Limonen je glavni sastojak etarskog ulja korena i listova celera, ali
je više zastupljen u listovima ove biljke. Alifatični terpen mircen je
karakterističan za etarsko ulje listova celera dok se u etarskom ulju korena
celera nalazi u količini manjoj od 0.2%. Skoro jednak sadržaj 3-n-butilftalida se
nalazi u oba ekstrakta. Značajne količine sedanenolida i sedanolida su
primećene u etarskom ulju korena celera dok ih etarsko ulje listova celera ne
sadrži. Sadržaj seskviterpena u ekstraktu listova je veoma visok, kao i sadržaj
α-humulena i β-kariofilena koji je viši u odnosu na ekstrakt korena celera
(Sipailiene et al., 2005). Listovi celera sadrže proteine (6.3%), masti (0.6%),
minerale (2.1%) i ugljene hidrate (1.6%) (procenti izraženi na 100 g biljnog
13
materijala). Od minerala i vitamina listovi sadrže kalcijum, fosfor, gvožđe,
riboflavin, karotin i vitamin C (Blish et al., 1972).
Hemijskom analizom metanolnog ekstrakta semena celera utvrđeno je
prisustvo ugljenih hidrata, flavonoida, alkaloida, steroida, glikozida, i širokog
spektra mikroelemenata (Srinivasa et al., 2012; Shad et al., 2011). Parnom
destilacijom je izolovano etarsko ulje iz semena celera i utvrđeno je da je
glavna komponenta limonen (80%). Pored limonena, izolovano ulje sadržalo je
i kariofilen, α-selinen, N-butil ftalid, sedanenolid, sabinen, linalul, cis-
dihidrokarvon, trans-dihidrokarvon, alfa-terpineol, karvon, perialdehid i timol.
Seme celera je bogato vitaminom B (Orient, 1996; Anonimous, 1990; Yan et
al., 1998; Ghosh et al., 1929). Do sada su istraživanja korena celera bila veoma
oskudna i postoji samo jedan rad na temu sastava njegovog etarskog ulja
(izolovanog iz svežeg korena), gde je utvrđeno prisustvo (Z)-3-
butilideneftalida, 3-butil-4,5-dihidroftalida, 3-n-butilftalida i α-tujena kao
glavnih komponenti.
1.2.2. Pregled istraživanja antimikrobnog efekta etarskog ulja celera
(Apium graveolens var. dulce)
Antimikrobna svojstva začina i aromatičnog bilja su testirana u brojnim
studijama, uključujući i njihovu ulogu u prirodnom očuvanju hrane (Bedin et
al., 1999). Etarsko ulje celera inhibira različite patogene i saprofitne
mikroorganizme (Elgayyar et al., 2001). Utvrđeno je da furanokumarini koji se
nalaze u ovom ulju inhibiraju bakterije Listeria monocytogenes, Escherichia
coli O157:H7 i Micrococcus luteus (Ulate-Rodrigues et al., 1997). U nekim
slučajevima je ispitivano etarsko ulje celera bilo neaktivno ili je imalo malu
aktivnost (Kivanc & Akgul, 1986). Celer ima snažno antimikrobno dejstvo na
14
Bacillus subtilis, Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiae (Krishna
and Banerjee, 1999). U ulju celera su identifikovana razna biološki aktivna
jedinjenja kao što su sedanolidi i dva senkiunolida koji su aktivni protiv
nematoda, larvi komaraca i gljiva (Momin & Nair, 2001).
Rezultati dosadašnjih istraživanja antimikrobne aktivnosti celera
prikazani su u Tabeli 1. U eksperimentu koji su sproveli Sipailiene et al.
(2005), korišćen je osušen koren i listovi celera, čija je ekstrakcija vršena
tečnim CO2. Antimikrobna svojstva su procenjena disk difuzionom metodom
na agru. Za testiranje njihove antimikrobne aktivnosti korišćeno je deset vrsta
bakterija nepoželjnih u prehrambenim proizvodima (patogena hrane):
Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Citrobacter freundii, Hafnia alvei,
Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Enterococcus feacalis, Enterobacter
aerogenes, Staphylococcus aureus i Proteus vulgaris. Etanolni ekstrakti listova
i korena celera u većini slučajeva delovali su inhibitorno na bakterijski rast u
test kulturama. Bacillus cereus je bio najosetljiviji, čija je inhibicija primećena
na svim primenjenim koncentracijama svih ekstrakata korišćenih u
eksperimentu. Više koncentracije ekstrakta su pokazale veći negativni efekat na
bakterije. Utvrđeno je da su ekstrakti lista celera pokazali bolju aktivnost u
odnosu na ekstrakte korena celera (Sipailiene et al., 2005).
Parnom destilacijom su izolovana ulja iz nekoliko biljaka i testirana na
nekoliko različitih vrsta mikroorganizma i kvasaca. Ulje celera je pokazalo
veoma jaku aktivnost na Yersinia enterocolitica, Geotrichum candidum i
Rhodotorula sp., umerenu aktivnost protiv Listeria monocytogenes i
Staphylococcus aureus a veoma slabu protiv Escherichia coli O157:H7,
Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa i Aspergillus niger
(Elgayyar et al., 2001).
14
Tabela 1. Dosadašnja istraživanja antimikrobne aktivnosti etarskog ulja celera
Etarsko ulje celera
Vrste mikroorganizama
Metoda
određivanja
antimikrobne
aktivnosti
Reference
Poreklo Vrsta
ekstrakta
Seme
etanol Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa Agar difuziona
metoda Mahdi, 2011;
Sipailiene et
al., 2005;
Shad et al.,
2011.
metanol
Candida albicans, C. parapsilopsis, Staphylococcus
aureus, S. albus, Shigella dysenteriae, S. flexneri,
Salmonella typhi, Streptococcus faecalis,
S.pyogenis, Pseudomonas solanacearum, P.
aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus subtilis,
Trychophyton lingifuss, Microsporum canis
Disk difuziona
metoda, agar
difuziona
heksan Trychophyton lingifuss, Microsporum canis Agar difuziona
metoda
Koren etanol
Escherichia coli, Listeria monocytogenes,
Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Salmonella
typhimurium, Bacillus cereus, Enterococcus
feacalis, Enterobacter aerogenes, Staphylococcus
aureus, Proteus vulgaris
Disk difuziona
metoda
Sipailiene et
al., 2005
List
etanol
Escherichia coli, Listeria monocytogenes,
Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Salmonella
typhimurium, Bacillus cereus, Enterococcus
feacalis, Enterobacter aerogenes, Staphylococcus
aureus,S. mutans, Proteus vulgaris,
Disk difuziona
metoda, agar
difuziona metoda
Sipailiene et
al., 2005;
Malik et al.,
2011;
Aboud et al.,
2014;
Majidah et al.,
2014
voda Staphylococcus aureus
15
Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Listeria
ivanovii, Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Pseudomonas fluorescens,
Modifikovana
mikrodiluciona
metoda,
mikrodiluciona
metoda
Witkowska et
al., 2013;
Mišić et al.,
2008.
U ispitivanju koje je proučavalo ekstrakte 30 biljaka, od svake biljke
napravljena su tri ekstrakta korišćenjem vode, 96% etanola ili heksana kao
rastvarača. Bakterije koje su korišćene u eksperimentu bile su Listeria innocua,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus i Pseudomonas fluorescens. Rezultati
su pokazali da izbor rastvarača za izdvajanje ekstrakata bilja i začina ima
značajan uticaj na antibakterijsku aktivnost (Witkowska et al., 2013).
Modifikovanom mikrodilucionom metodom određena je vrednost MIC
(minimalna inhibitorna koncentracija) za ekstrakte koji su pokazali
antimikrobnu aktivnost (Sokmen et al., 2004). Vodeni ekstrakt celera je
pokazao slab inhibitorni efekat dok su etanolni i heksanski ekstrakt celera
pokazali jaku antimikrobnu aktivnost na ispitivane bakterije. Ekstrakt celera je
pokazao baktericidno dejstvo na Listeria innocua i Staphylococcus aureus a
bakteriostatsko dejstvo na Escherichia coli i Pseudomonas fluorescens
(Witkowska et al., 2013).
U studiji koju je radio Mahdi (2011) je ispitivana inhibitorna aktivnost
etanolnog ekstrakta semena celera i još dve biljke na Staphylococcus aureus,
Salmonella spp., Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa pri
temperaturama od 37 °C i 25 °C. Rezultati su pokazali da su alkoholni ekstrakti
ispitivanih biljaka, među kojima je i celer, inhibirali rast bakterije
Staphylococcus aureus. Alkoholni ekstrakt celera na 25 °C u koncentraciji 100
mg/ml je pokazao značajnu antimikrobnu aktivnost na bakteriju
16
Staphylococcus aureus dok je alkoholni ekstrakt na 25 °C i 37 °C pokazao
antimikrobnu aktivnost na bakteriju Pseudomonas aeruginosa u
koncentracijama od 100 i 200 mg/ml. Utvđeno je da je celer imao bolje
antimikrobno delovanje protiv ispitivanih bakterija u odnosu na testirani
antibiotik (gentamicin). Celer je pokazao umerenu antimikrobnu aktivnost na
Salmonella spp. i Escherichia coli (Mahdi, 2011).
Metanolni ekstrakt semena celera je pokazao dobar efekat u borbi protiv
komaraca, nematoda i gljiva, takođe inhibirajući rast Candida albicans i
Candida parapsilopsis ( Evans et al., 1989). Celer je ispoljio izuzetnu aktivnost
protiv mnogih bakterija uključujući Staphylococcus aureus, Staphylococcus
albus, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi, Streptococcus faecalis,
Streptococcus pyogenes i Pseudomonas solanacearum (Sipailiene et al., 2005).
Antimikrobna aktivnost može biti posledica prisustva slobodnih hidroksilnih
grupa ili komponenti poput limonena, β-selinena i drugih jedinjenja koji mogu
interagovati sa ugljenim hidratima i proteinima u bakterijskom ćelijskom zidu
(Harborne & Baxter, 1995).
Shad et al. (2011) su ispitivali nutritivni i farmakološki potencijal
semena celera koji potiču sa različitih mesta u Pakistanu. Rezultati su pokazali
da su heksanski, metanolni, hloroformni i vodeni ekstrakti semena celera
ispoljili različite stepene antibakterijske aktivnosti na neke bakterije
(Escherichia coli, Bacillus subtillis, Shigella flexneri, Staphyllococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa i Salmonella typhi). Pored antibakterijskog, dokazan
je i dobar antifungalni potencijal na Trichophyton longifuss, Candida albicans,
Aspergillus flavus, Microsporum canis, Fusarium solani i Candida glabrata.
Metanolni ekstrakt semena celera je pokazao antibakterijsku aktivnost u odnosu
na sve ispitivane sojeve. Metanolni i heksanski ekstrakt imaju jaku inhibitornu
17
aktivnost na Trichophyton longifuss i Microsporum canis. Heksanski,
metanolni, hloroformni i vodeni ekstrakti celera nisu pokazali insekticidnu
aktivnost (Shad et al., 2011).
U istraživanju sprovedenom od strane Mišića i saradnika (2008)
ispitivana je antimikrobna aktivnost etarskog ulja semena celera na bakterijske
sojeve Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes i Listeria ivanovii.
Etarsko ulje je dobijeno metodom superkritične tečne ekstrakcije sa CO2 i
hidrodestilacijom. Rezultati pokazuju da etarsko ulje semena celera, izolovano
superkritičnom tečnom ekstrakcijom, efikasnije gotovo protiv svih ispitivanih
sojeva i pokazalo je jak antimikrobni efekat u odnosu na ono etarsko ulje
izolovano metodom hidrodestilacije (Mišić et al., 2008).
Malik et al. (2011) su istraživali antibakterijski potencijal etanolnih
ekstrakata listova 12 vrsta biljka poreklom iz Iraka na bakteriju Salmonella
typhimurium. Skoro svi ekstrakti listova ovih biljaka su ispoljili jaku
antibakterijsku aktivnost. Celer je u svim ispitivanim koncentracijama pokazao
dobru aktivnost protiv bakterije Salmonella typhimurium (Malik et al., 2011).
U studiji Aboud et al. (2014), ispitivan je efekat vodenog i etanolnog
ekstrakta listova celera in vitro na bakteriju Staphylococcus aureus i efekat
vodenog ekstrakta listova celera na ovu bakteriju u urinarnom sistemu zečeva
in vivo. Rezultati pokazuju da sirovi ekstrakti listova celera imaju
antibakterijsku aktivnost u in vivo i in vitro uslovima na bakteriju S. aureus.
Vodeni i alkoholni ekstrakt celera su takođe pokazali antibakterijsku aktivnost
na istu bakteriju. Utvrđeno je da se urinarna infekcija kod zečeva, izazvana
ovom bakterijom, može ublažiti vodenim ekstraktom listova celera (Aboud et
al., 2014).
18
U studiji Majidah et al. (2014) ispitivana je antibakterijska aktivnost
etanolnog ekstrakta listova celera na bakteriju Streptococcus mutans. Dokazano
je da ekstrakt listova celera ima antibakterijsku aktivnost na ispitivanu
bakteriju, sa minimalnom inhibitornom koncentracijom od 12.5%.
Benbelaid et al. (2013) su istraživali efekat sušenja na prinos i
antibakterijsku aktivnost devet aromatičnih biljaka i biljaka korišćenih u
medicini. Efekat sušenja na antibakterijsku aktivnost ispitivanih biljaka je
procenjen disk difuzionom metodom na agru. Primećeno je smanjenje prinosa
kao i smanjenje antimikrobne aktivnosti nakon sušenja biljnog materijala.
Etarska ulja izolovana iz stabljike i listova celera su pokazala značajno
smanjenje prinosa nakon sušenja. Ustanovljeno je da celer pokazuje
antimikrobnu aktivnost na mikroorganizme kao što su Candida albicans,
Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus, koja se drastično smanjuje nakon
sušenja biljnog materijala. Celer pokazuje antibakterijsku aktivnost na bakteriju
Pseudomonas aeruginosa samo ako se koristi kao svež ekstrakt (Benbelaid et
al., 2013).
19
1.3. Opšte karakteristike vrste Bacillus cereus
Rod Bacillus obuhvata Gram-pozitivne mikroorganizme koji formiraju
spore. To su aerobni ili fakultativno anaerobni mikroorganizmi. Optimalna
temperatura rasta je od 25-37 °C, mada mogu biti i psihrofilni i termofilni i
rasti na temperaturama od 3°C odnosno 75 °C. Deli se u tri grupe na osnovu
morfoloških i fizioloških osobina. Bacillus cereus pripada grupi u koju spadaju
i vrste B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. anthracis i B.
weihenstephanensis. Bakterije ove grupe imaju veoma sličnu DNK strukturu
(Daffonchio et al., 1998; Helgason et al., 2000).
Bacillus cereus je sporogeni Gram-pozitivni štapić, koji su Frankland i
Frankland 1887. godine izolovali iz vazduha u štali. Rastu na temperaturi od 7-
49 °C. Na osnovu izolata iz hrane i ljudi, sojevi ovog patogena se mogu
podeliti na mezofilne i psihrotrofne. Mezofilni sojevi rastu na 37°C, ali ne i
ispod 10°C. Psihrotrofni sojevi rastu na nižim temperaturama dok slabo rastu
na temperaturama preko 37°C (Wijnands et al., 2006). Bacillus cereus dostiže
optimalan rast u prisustvu kiseonika, ali se pojavljuje i u anaerobnim uslovima
gde pokazuje bolju otpornost na visoku temperaturu i kiseline u odnosu na
sojeve koji rastu aerobno (Mols et al., 2009). Najčešće poseduju peritrihalne
flagele za kretanje, ali pronađeni su i nepokretni oblici. Dobro raste na
hranljivom agru. Pokazuje potrebu za nekim amino kiselinama, ali ne i za
vitaminima. Može sintetisati različite ekstracelularne enzime, toksine i
antibiotike.
Spore su otporne na visoke temperature a klijaju pri temperaturi od 8-30
°C i pri pH vrednosti od 4.9-9.3. Otpornije su na zračenje u donosu na
20
vegetativne ćelije. Endospore su ovalne, ponekad okrugle ili cilindrične. Na
sporulaciju ne utiče izlaganje aerobnim uslovima. Mogu imati različite dodatke
koji im omogućavaju pridržavanje za različite tipove površina, kao što je
oprema za preradu hrane i epitelne ćelije tankog creva. Kasnije mogu klijati i
proizvoditi enterotoksine.
Veruje se da je primarno stanište ovog mikroorganizma zemljište. Može
se naći i u hrani, lekovitom bilju i začinima. Ova bakterija se može naći i u
ranama posle operacije i može izazvati oportunističke infekcije kao što su
sepsa, meningitis i pneumonija. Bacillus cereus može izazvati lokalizovane
infekcije oka kod ljudi (Schoeni & Wong, 2005).
1.3.1. Značaj vrste Bacillus cereus kao kontaminanta hrane
Bakterijska kontaminacija hrane izaziva sve veću zabrinutost jer se
zarazne bolesti mogu lako širiti preko kontaminiranih namirnica i pića.
Namirnice koje se koriste za ishranu odojčadi predstavljaju bogat izvor
hranljivih materija i javlja se potencijalni rizik od pojave patogena u njima
(Kim et al., 2011). Bacillus cereus je izolovan iz pirinča, začina, mesa, jaja i
mlečnih proizvoda (Johnson, 1984). Endospore su veoma otporne, mogu
preživeti različita stresna stanja tokom proizvodnje hrane, odnosno sušenja i
termičke obrade (Nakamura; 1998). Spore mogu dugo da se zadrže na čeliku u
fabrikama za proizvodnju hrane i na taj način mogu kontaminirati proizvedenu
hranu (Tauveron et al., 2006). Kao bakterijske forme za preživljavanje
nepovoljnih uslova, spore mogu opstati duži vremenski period nakon
pasterizacije i skladištenja u uslovima sa malo vlage. Stopa preživljavanja
21
vegetativnih ćelija zavisi od soja, faze vegetativnog rasta ćelije i pH želuca
(Wijnands et al., 2009).
Bacillus cereus je važan izazivač bolesti ljudi uzrokovane pokvarenom
hranom. Može biti prisutna u velikom broju različitih namirnica. Ova bakterija
je izazivač dva tipa bolesti: sindrom dijareje i emetički sindrom. Nakon
unošenja kontaminirane hrane, u digestivnom traktu, ćelije Bacillus cereus i
njeni toksini su izloženi niskoj pH i delovanju pepsina. Ukoliko je hrana pre
upotrebe bila na odgovarajući način obrađena, samo će spore biti prisutne u
hrani i stići će do tankog creva. U suprotnom, biće prisutne i vegetativne ćelije
i toksini. Emetički toksin se u tankom crevu vezuje za odgovarajući receptor i
dolazi do emetičke intoksikacije (Clavel et al., 2004). Dijareični toksini biće
uništeni zbog enzimske aktivnosti. Epidemiološki podaci pokazuju da do
pojave simptoma uzrokovanih hranom kontaminiranom vrstom Bacillus cereus
dolazi ako je koncentracija veća od 105 CFU/g kontaminirane hrane (Kramer &
Gilbert, 1989; Becker et al., 1994). Antimikrobna sredstva koja inhibiraju rast
vrste B. cereus su benzoati, sorbati i etilendiamintetrasirćetna kiselina (Jenson
& Moir, 2003).
22
1.3.2. Toksini vrste Bacillus cereus
Bacillus cereus proizvodi nekrotizujuće enterotoksine, emetične
enterotoksine, fosfolipaze, proteaze i hemolizine (Turnbull, 1981; Turnbull,
1986).
Emetični sindrom izaziva cereulid, koji je ciklična polipeptidna struktura
izgrađena od četiri aminokiseline koje se ponavljaju 3 puta u njegovoj strukturi
(Agata et al., 1994). Pokazuje otpornost na visoke temperature, pH i proteolizu
(Kramer & Gilbert; 1989). Cereulid može opstati i u termički obrađenim
namirnicama i nakon smrti B. cereus ćelija. Da bi se cereulid detektovao u
hrani, potrebno je od 105 do 10
8 vitalnih ćelija po gramu hrane (Agata et al.,
2002). Ovaj sindrom je najčešće povezan sa namirnicama bogatim skrobom
biljnog porekla (pirinač, testenine, krompir, peciva) (Janson & Moir, 2003).
Manifestuje se akutnim napadom mučnine i povraćanja nakon 30 minuta do 5 h
od uzimanja kontaminirane hrane (Kramer & Gilbert, 1989). Ova vrsta trovanja
slična je po simptomima trovanju uzrokovanom stafilokokama, ali je smrtni
ishod redak (Malher et al., 1997).
Tri enterotoksina sindroma dijareje su hemolizin BL, nehemolitički
enterotoksin i citotoksin K. Dijareični sindrom izaziva enterotoksin u tankom
crevu. Da bi ovaj sindrom nastao, potrebano je uneti veliki broj ćelija i/ili spora
kontaminiranom hranom (Schneider et al., 2004). Ovaj sindrom se najčešće
povezuje sa namirnicama kao što su mesni proizvodi, supe, povrće, mleko i
mlečni proizvodi. Hrana koja sadrži više od 104 ćelija ili spora/g može
predstavljati rizik (Granum & Lund, 1997). Do pojave simptoma dolazi nakon
6 do 24 h od konzumiranja pokvarene hrane. Simptomi trovanja dijareja tipa su
bol u stomaku, umerena mučnina praćena prolivom, i ne retko groznica, ali su
simptomi prolazni i blagi. Četiri vrste enterotoksina mogu izazvati dijareični
23
sindrom: enterotoksin-T, citotoksin-K, hemolizin BL i nehemolitični
enterotoksin (Wijnands et al., 2002).
Hemolizin BL se sastoji iz 3 subjedinice proteinske prirode. Pokazuje
dermonekrotičnu aktivnost i utiče na vaskularnu propustljivost. Nehemolitični
enterotoksin se takođe sastoji iz tri subjedinice i za njegovu maksimalnu
aktivnost su potrebne sve tri komponente (Granum & Lund, 1997).
Enterotoksin-T se sastoji iz jedne proteinske jedinice i ne izaziva bolesti
prouzrokovane hranom (Agata et al., 1995). Citotoksin-K je enterotoksin
izgrađen od jedne proteinske komponente i pokazuje nekrotičnu i hemolitičku
aktivnost a veoma je toksičan za epitelne ćelije ljudi (Hardy et al., 2001).
24
1.4. Ciljevi istraživanja
Izolovanje etarskog ulja iz korena celera metodom hidrodestilacije
Hemijska analiza etarskog ulja iz različitih delova korena celera i
poređenje njihovog hemijskog sastava sa prethodnim rezultatima
Utvrđivanje antimikrobne aktivnosti etarskih ulja izolovanih iz različitih
delova korena celera na vrstu Bacillus cereus u in vitro uslovima
Utvrđivanje uticaja etarskog ulja u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji
na rast i razmnožavanje ćelija bakterije Bacillus cereus u modelu hrane
Ispitivanje uticaja temperature inkubacije i vremena inkubacije na
efikasnost etarskog ulja celera u modelu hrane
Procena potencijala etarskog ulja celera kao dodatka hrani za prevenciju
kvarenja supe
25
2. MATERIJAL I METODE
2.1. Rastvori, podloge i reagensi
Trifenil-tetrazolijum-hlorid (TTC) je pravljen rastvaranjem 0.5 g
supstance u 100 ml destilovane vode.
Fiziološki rastvor je 0.9% (m/V) rastvor NaCl u destilovanoj sterilisanoj
vodi. Dobija se rastvaranjem 0.9 g NaCl u 100 ml destilovane vode.
Miler Hinton bujon (Müeller Hinton Broth, HiMedia, M391) je
podloga za određivanje minimalnih inhibitornih koncentracija (MIK)
antimikrobnih agenasa metodom dilucije u bujonu. Sastav ove podloge na 1000
ml je sledeći: mesni ekstrakt 30.00 g, kazein hidrolizat 17.50 g, štirak 1.50 g
(konačna pH vrednost 7.4±0.2 na 25 °C). Priprema ove podloge vršena je
suspendovanjem 21 g suve podloge u 1000 ml destilovane vode. Nakon
stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou radi potpunog
rastvaranja, vršena je sterilizacija podloge autoklaviranjem u trajanju od 20
minuta na 121 °C.
Hranljivi agar (Torlak) je podloga čija je namena kultivisanje širokog
sprektra mikroorganizama. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: pepton
15.00 g, mesni ekstrakt 3.00 g, natrijum hlorid (NaCl) 5.00 g, kalijum fosfat
0.30 g, agar-agar 18.00 g (konačna pH vrednost 7.3 na 25 °C). Priprema ove
podloge je vršena suspendovanjem 38.00 g suve podloge u 1000 ml destilovane
vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou do
potpunog rastvaranja, vršeno je razlivanje podloge i autoklaviranje u trajanju
od 20 minuta na 121 °C.
26
Komercijalna pileća supa (K plus, Yumis, Niš) sledećeg sadržaja:
kuhinjska so, mononatrijum glutaminat, dekstroza, biljna i životinjska mast,
mešavina sušenog povrća (šargarepa, crni luk, paškanat), dehidrirano pileće
meso, začini, arome, limunska kiselina i riboflavin.
27
2.2. Biljni materijal
Svež celer (Apium graveolens var. dulce) je kupljen na lokalnoj pijaci u
Nišu i korišćen kao materijal za izolaciju etarskog ulja. Nakon odstranjivanja
nadzemnog dela, koren celera je opran vodom i spoljašnji deo korena je isečen
na sitne delove a kasnije i unutrašnji deo.
2.3. Izolovanje etarskog ulja celera
Sitno iseckan spoljašnji deo korena celera (750 g) je stavljen u balon za
hidrodestilaciju, dodata je određena količina vode (~ 1l) i vršena je
hidrodestilacija u trajanju od 3 sata u aparaturi po Clevengeru (Clevenger,
1928). Nakon ovog procesa, ulje je
ekstrahovano dodavanjem etra a zatim
je upareno na rotacionom vakuum
uparivaču.
Zbog male količine dobijenog
etarskog ulja, postupak
hidrodestilacije je ponovljen sa istim
materijalom, ali je on pre procesa
stavljen u blender kako bi se materijal
dodatno usitnio u cilju dobijanja što
veće količine etarskog ulja. Da bi se
identifikovala eventualna razlika u
sastavu i aktivnosti etarskog ulja
različitih delova korena celera, rađene Slika 2. Aparatura za hidrodestilaciju ulja
28
su još dve hidrodestilacije sa iseckanim spoljašnjim delom korena (1 kg) i
jedna hidrodestilacija sa unutrašnjim delom korena celera (1 kg). Izvršena je
hemijska analiza jednog dela dobijenih ulja a ostatak je odložen u kivetu na
čuvanje na 4 °C do dalje upotrebe.
2.4. Antimikrobna aktivnost vrste Apium graveolens var. dulce
2.4.1. Kulture mikroorganizama
Za testiranje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja celera korišćeni su
sojevi Bacillus cereus (izolat iz hrane dobijen iz Higijenskog zavoda u Nišu) i
Bacillus cereus (ATCC 27853) koje su održavani na hranljivom agru u
Mikrobiološkoj laboratoriji Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu.
2.4.2. Mikrodiluciona metoda
Diluciona metoda je metoda za određivanje antimikrobne aktivnosti neke
supstance i tačne koncentracije aktivnosti te supstance. Mikrodilucionom
metodom se određuje minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) koja
predstavlja najnižu testiranu koncentraciju etarskog ulja na kojoj nema
vidljivog rasta. Mikrotitar (mikrodilucione) ploče sadrže 96 bunarčića koji su
raspoređeni u 12 kolona, obeleženih brojevima od 1 do 12, i 8 redova,
obeleženih velikim latiničnim slovima od A do H (Singh, 2006).
Od prekonoćnih kultura ispitivanih sojeva mikroorganizama koji su
uzgajani na hranljivom agru, napravljene su suspenzije bakterija u sterilnom
fiziološkom rastvoru. Nakon podešavanja turbiditeta suspenzije tako da
29
odgovaraju turbiditetu 0.5 McFarland-a, koja odgovara koncentraciji bakterija
1-5 x 108
CFU/ml (Colony Forming Unit- jedinica za formiranje kolonija) na
McFarland densitometru (DEN-1, Biosan), suspenzije podešenog turbiditeta su
korišćene za inokulaciju Miler Hinton bujona u kome je test mikrodilucije
rađen.
Mikrodilucioni test je izvođen u mikrotitar pločama sa 96 bunarčića.
Nakon pravljenja suspenzije, mikrotitarske ploče su punjene sa po 100 μl Miler
Hinton bujona, koji je zasejan odgovarajućim volumenom suspenzije
turbiditeta McFarland u cilju dobijanja finalne koncentracije ćelija od ~ 106
CFU/ml. Početni rastvor svih dobijenih etarskih ulja celera, čija je inicijalna
koncentracija bila 35 mg/ml je rastvoren u Tween 80 (0.05% v/v) i zatim
stavljen u ultrazvučno kupatilo do potpunog rastvaranja. U ploči je vršena
serijska dilucija višekanalnom automatskom pipetom i pravljena su dupla
razređenja početnog rastvora ulja, čije su koncentracije bile u opsegu od 25-
0.04 mg/ml. Ovako pripremljena mikrotitar ploča je inkubirana 24 h na 30 °C.
Nakon perioda inkubiranja vršeno je očitavanje rezultata. Višekanalnom
automatskom pipetom je u mikrotitarsku ploču ubačeno po 20 μl TTC (trifenil-
tetrazolijum hlorid) reagensa. Mikrotitar ploče su stavljene 1h u inkubator,
nakon čega su čitani rezultati, pri čemu se pozitivnom reakcijom smatrala
pojava crvene boje u bunarčiću.
30
2.5. Model hrane
Za određivanje efekta etarskog ulja celera u minimalnoj inhibitornoj
koncentraciji na rast i razmnožavanje vrste Bacillus cereus kao model hrane je
korišćena komercijalna pileća supa (K plus, Yumis, Niš) kupljena u prodavnici.
Nakon pripremanja kockice supe po uputstvu sa kutije, supa je stavljena u
menzuru i dodata je voda da bi se podesila zapremina na 500 ml. Sadržaj
menzure je profiltriran pomoću filter papira a potreban deo sadržaja je podeljen
u dva staklena suda i prenet u autoklav na sterilizaciju u trajanju od 15 minuta
na 121 °C. pH vrednost supe je merena pre (pH 6.79) i posle autoklaviranja
(pH 6.69) i ustanovljeno je da nije značajno promenjena i da ta promena pH
vrednosti ne bi mogla uticati na rast ispitivanog soja bakterije.
Eksperimentalni dizajn uključivao je dva parametra čiji je efekat na
efikasnost delovanja etarskog ulja celera ispitivan i to su temperatura
inkubacije i dužina inkubacije. Ispitivanje je vršeno na sledećim temperaturama
inkubacije: 4 °C u frižideru, 18 °C na sobnoj temperaturi i 30 °C u inkubatoru i
u periodima inkubacije od 0 minuta, 30 minuta, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48
h i 72 h. Pošto je utvrđeno da nema značajne razlike u sastavu i aktivnosti
između etarskih ulja dobijenih iz različitih delova korena celera, radi dobijanja
dovoljne količine za ovaj eksperiment, korišćeno je ulje dobijeno mešanjem
svih ispitivanih ulja. Posle autoklaviranja, u prvi sud sa supom je dodato
etarsko ulje celera rastvoreno u 1 ml Tween 80 u koncentraciji kojom je
postignuta finalna koncentracija od 0.39 mg/ml, dok je u drugi sud sa supom
dodat samo 1 ml Tween 80. Rastvor etarskog ulja celera u supi je prenet u
ultrazvučno kupatilo 20 minuta kako bi rastvor bio homogen. Iz prve posude je
uzeto po 10 ml i ubačeno u sedam sterilisanih erlenmajera koji su prethodno
31
obeleženi brojevima od 1 do 7, nakon čega su prva šest erlenmajera zasejana
suspenzijom bakterija B. cereus (~105 CFU) dok je sedmi erlenmajer ostao
nezasejan i predstavljao je kontrolu sterilnosti supe (negativna kontrola).
Iz drugog suda, u koji je dodat samo Tween 80, po 10 ml je preneto u tri
čista erlenmajera obeleženih brojevima od 8 do 10 i oni su zasejani
suspenzijom bakterija Bacillus cereus (izolat iz hrane) kako bi se postigla
finalna koncentracija od ~105 CFU. Svi erlenmajeri su inkubirani u periodu od
72 h na odgovarajućim temperaturama prikazanim u Tabeli 2.
Tabela 2. Prikaz sadržaja erlenmajera i temperature inkubacije
Oznaka
erlenmajera
Sadržaj erlenmajera
Zasejavanje Temperatura MIC
etarsko ulje Supa Tween 80
1 + + + +, 105 18°C
2 + + + +, 105 18°C
3 + + + +, 105 4°C
4 + + + +, 105 4°C
5 + + + +, 105 30°C
6 + + + +, 105 18°C
7 + + + -, 0 18°C
8 - + + +, 105 18°C
9 - + + +, 105 4°C
10 - + + +, 105 30°C
32
U vremenu inkubacije od 0 minuta (odmah nakon zasejavanja), svaki
erlenmajer je stavljen nekoliko sekundi na vorteks, uziman je uzorak (500 μl) u
adekvatno obeležene, sterilne i suve epruvete prethodno napunjenih sa po 4.5
ml sterilnog fiziološkog rastvora. Nakon toga, pravljena je serija razblaženja
(10 x) od svakog uzorka. Iz svakog razblaženja (uključujući i nerazblaženi
uzorak) je uzeto po 25 μl (u triplikatu) i preneto ‘drop count’ metodom
(metodom kapi) na Petrijeve posude sa hranljivim agrom. Petrijeve posude su
stavljene u inkubator i inkubirane 24 h. Nakon perioda inkubacije, vršeno je
brojanje kolonija i preračunavanje broja ćelija po ml. Isti postupak je ponovljen
i za ostale periode inkubacije (30 minuta, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h i 72
h).
2.6. Statistička analiza dobijenih podataka
Dobijeni rezultati su obrađeni analizom varijanse (ANOVA) i tom
prilikom je rađeno poređenje srednjih vrednosti i računanje standardnih
devijacija.
33
3. REZULTATI I DISKUSIJA
3.1. Prinos etarskog ulja
U ovom eksperimentu je iz svežeg biljnog materijala korena celera
(Apium graveolens var. dulce) procesom hidrodestilacije izolovano etarsko ulje
a prinosi su prikazani u Tabeli 3.
Tabela 3. Prikaz težine ulja i prinosa nakon hidrodestilacije
Vrsta biljnog materijala Težina biljnog materijala
u balonu za destilaciju
Težina ulja dobijenog
nakon destilacije Prinos
Iseckani spoljašnji deo
korena celera 1750 g 98 mg 0.016%
Blendiran spoljašnji deo
korena celera,
ponovljena destilacija
1750 g 90 mg 0.005%
Iseckani unutrašnji deo
korena celera 1kg 16 mg 0.002%
Iz Tabele 2 može se videti da je prinos etarskog ulja u svežem korenu
celera ekstremno nizak (0.016% tokom prve destilacije i 0.005% nakon
ponovljene destilacije istog biljnog materijala za spoljašnji deo korena celera).
Unutrašnji deo korena celera je nakon destilacije imao prinos od svega 0.002%,
što je bio razlog za odluku da se destilacija ne ponavlja sa blendiranim
34
materijalom zbog male verovatnoće za bilo kakav prinos. Ovim istraživanjem
je takođe utvrđena činjenica da se veći deo etarskog ulja nalazi smešten u
spoljašnjem delu (kori) korena celera.
Sipailiene i saradnici su izolovali ekstrakte iz korena i lišća celera
pomoću tečnog CO2 i zaključili da prinosi ekstrakta korena celera variraju od
0.52-1.59% i da je prinos nizak. Na prinos je uticao kvalitet biljnog materijala,
finoća čestica i postupak ekstrakcije (Sipailiene et al., 2005). U literaturi je do
sada navedena samo jedna hidrodestilacija korena celera, pri kojoj je iz svežeg
materijala celog korena dobijen prinos od 0.1% (Sellami et al., 2012). Ovo je
značajno različito u odnosu na naš prinos, koji iznosi 0.023% (ukupni materijal
korena koji je destilovan). Razlog za ovu razliku u prinosu (u trenutnom
istraživanju dobijenje skoro 10 x manji prinos) može biti drugačija klima u
kojoj je celer kultivisan, jer je pomenuto istraživanje ispitivalo celer uzgajan na
području Tunisa, koja ima drastično različitu klimu u odnosu na klimu Srbije.
3.2. Hemijski sastav etarskog ulja
Hemijski sastav etarskog ulja celera je prikazan u Tabeli 4. Iz izolovanog
etarskog ulja celera ukupno je identifikovano 40 komponenti (95.9% ukupnog
sadržaja ulja). Dobijeni rezultati pokazuju da su glavni sastojci testiranog
etarskog ulja korena celera neoknidalid (23.1%), 3-butil tetrahidroftalid izomer
(16%), limonen (15%) i 5-pentilcikloheksa-1,3-dien (11.1%). Utvrđeno je da ne
postoji razlika u hemijskom sastavu etarskih ulja dobijenih iz različitih delova
korena celera.
35
Tabela 4. Hemijski sastav etarskog ulja iz korena celera (Apium graveolens var. dulce)
Retenciono
vreme Jedinjenje Procenat
1. 3.38 Nonan 0.4
2. 3.91 α-Pinen 0.1
3. 4.51 Sabinen tr
4. 4.56 β-Pinen 1.9
5. 4.72 Mircen 1.6
6. 5.01 Oktanal 0.3
7. 5.28 α-Terpinen 0.1
8. 5.40 p-Cimen 0.2
9. 5.47 Limonen 15.0
10. 5.56 (Z)-β-Ocimen 2.7
11. 6.04 γ-Terpinen 1.7
12. 6.89 Undekan 0.1
13. 7.35 Nonanal tr
14. 7.56 trans-p-Menta-2,8-
dien-1-ol 0.1
15. 7.96 cis-p-Menta-2,8-
dien-1-ol tr
16. 8.25 5-Pentilcikloheksa-
1,3-dien 11.1
17. 9.38 α-Terpineol tr
18. 11.80 Tridekan tr
19. 14.07 1-Tetradeken tr
20. 14.75 (E)-Cariofilen 0.4
21. 15.12 trans-α-Bergamoten 0.1
36
22. 15.60 α-Humulen tr
23. 15.71 (E)-β-Farnesen tr
24. 15.96 (E)-9-epi-Cariofilen tr
25. 16.39 β-Selinen 0.6
26. 16.63 α-Selinen 0.1
27. 16.89 Kuparen tr
28. 17.37 Kesan tr
29. 18.66 Kariofilen oksid 0.1
30. 19.17 Rosifoliol 0.2
31. 19.76 β-Eudesmol 0.1
32. 19.86 3-Butil
heksahidroftalid 4.4
33. 20.08
3-Butil
heksahidroftalid
izomer 1
0.2
34. 20.29 3-Butil ftalid 1.1
35. 20.40
3-Butil
heksahidroftalid
izomer 2
4.9
36. 20.72 3-Butil ftalid
izomer 0.1
37. 21.91 Neoknidalid (sin.
sedanolid) 23.1
38. 22.12 (Z)-Ligustilid 8.6
39. 22.30
3-Butil
tetrahidroftalid
izomer
16.0
40. 27.89 (Z)-Falkarinol 0.5
Ukupno identifikovanih jedinjenja 95.9
37
Postoji samo jedan rad koji je prikazao rezultate hemijskog sastava
etarskog ulja korena celera dobijenog hidrodestilacijom, gde je utvrđeno da su
glavne komponente ovog ulja (Z)-3-butilindeftalid (30.5%), 3-n-butilftalid
(14.8%), 3-butil-4,5-dihodroftalid (12.3%) i α-tujen (12.4%), dok glavne
komponente detektovane u našem ulju nisu ni izolovane (sedanolid, 3-butil
tetrahidroftalid i 5-pentilcikloheksa-1,3-dien) ili su prisutne u jako maloj
koncentraciji (limonen 0.9%). Drastična razlika u hemijskom sastavu koja se
uočava se može objasniti različitim ekološkim činiocima koji su uticali na rast
biljke i produkciju etarskog ulja, obzirom na podatak da je biljka ispitivana u
pomenutom radu sakupljana u Tunisu (Sellami et al., 2012). Glavna
komponenta ovde ispitivanog ulja sedanolid (neoknidalid) se nalazi u biljkama
iz familije štitonoša a najzastupljeniji je u etarskom ulju semena celera. Ostali
ftalidi identifikovani u ispitivanom ulju su i ranije utvrđivani u hemijskom
sastavu etarskih ulja iz semena i lišća celera, i njima se pripisuje karakterističan
miris i ukus celera (MacLeod et al.,1988; Woods et al., 2001; Sipaliene et al.,
2005). Dva enantiomera limonena su najrasprostranjeniji monociklični
monoterpeni u prirodi. L-limonen je uglavnom prisutan u različitom drveću i
biljkama, kao što je Mentha spp, a D-limonen je glavni sastojak kore
pomorandže, limuna i etarskog ulja kima. Utvrđeno je da sprečava
dehidrataciju i inhibira rast gljiva i bakterija pri koncentracijama od 62.5 i 125
µg/mL (Wise & Croteau, 1999, Dai et al., 2013), kao i da poseduje
antioksidativni potencijal (Dai et al., 2013). Za limonen je utvrđeno da je
prisutan u ekstraktima lista i korena celera izolovanog tečnim CO2 kao glavna
komponenta, pri čemu je njegov procenat bio veći u lišću celera (Sipaliene et
al., 2005). U istraživanju sprovedenom na etarskom ulju semena celera sa ovog
područja (Mišić et al., 2008), utvrđeno je da je limonen glavna komponenta
koja zauzima čak 81.63% sastava ovog ulja.
38
3.3. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Apium graveolens
Pri ispitivanju MIK etarskog ulja celera, ispitana su oba etarska ulja i
utvrđeno je da imaju iste minimalne inhibitorne koncentracije. Ovo je bio
očekivan rezultat pošto je prethodno utvrđeno da nema razlike u njihovom
hemijskom sastavu. Rezultati antimikrobnog testiranja prikazani su u Tabeli 5,
gde se može videti da su etarska ulja celera pokazala slabiju aktivnost u
poređenju sa referentnim antibiotikom hloramfenikolom.
Dosadašnja istraživanja rađena na etarskom ulju celera pokazuju da
postoji antimikrobna aktivnost ovog etarskog ulja (Tabela 1). Dokazano je da
etarsko ulje ove biljke ima inhibitorni uticaj na različite bakterije (Bacillus
cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium i mnoge druge), neke gljive
(Candida albians, Candida parapsilopsis, Aspergillus flavus i druge vrste),
nematode i larve komaraca. Istraživanja su pokazala da ekstrakti korena celera
imaju nešto manju antimikrobnu aktivnost u odnosu na ekstrakte listova celera.
U eksperimentu koji su radili Sipailiene i saradnici, najveću osetljivost na
različite koncentracije ekstrakta korena celera je pokazala bakterija B. cereus u
odnosu na ostale testirane mikroorganizme (Sipailiene et al., 2005).
Rezultati koji su dobijeni našim eksperimentom ukazuju na to da je
etarsko ulje biljne vrste A. graveolens imalo inhibitornog uticaja na ispitivane
sojeve bakterije B. cereus. Utvrđene minimalne inhibitorne koncentracije
etarskog ulja celera iznose 0.39 i 0.78 mg/ml protiv izolata i ATCC soja, što
ukazuje na jaku antimikrobnu aktivnost izolovanog ulja.
39
Tabela 5. Minimalne inhibitorne koncentracije etarskih ulja izolovanih iz korena celera
Ranija istraživanja na ovu temu ne postoje za etarsko ulje korena celera, a
postojeća, koja su ispitivala etarska ulja semena i lišća nisu ispitivana metodom
mikrodilucije, pa je poređenje rezultata jako otežano jer nema konkretnih podataka
datih za minimalnu inhibitornu koncentraciju. Sipaliene et al. (2005) su utvrdili da
ekstrakt korena (ekstrahovanog ugljen dioksidom) pri koncentracijama od 1%, 5%
i 10% daje zone inhibicije u rasponu od 12.5 – 25.0 mm. Konkretna vrednost
minimalne inhibitorne koncentracije data je u radu Witkowska et al. (2013) za
heksanski i etanolni ekstrakt celera, pri čemu nije naveden deo biljke iz koga su
izolovani ovi ekstrakti. Utvrđeno je da pri koncentracijama od 10-40 mg/mL ovi
ekstrakti pokazuju antimikrobnu aktivnost, gde je jači potencijal pokazao etanolni
ekstrakt. Etarsko ulje semena celera sa ovog područja (Mišić et al., 2008) sa
limonenom, sedalinolidom i sedanolidom kao dominantnim komponentama
ispoljilo je antimikrobnu aktivnost pri koncentracijama od 0.64 i 1.28 mg/mL, što
je manja aktivnost od ovde utvrđene. Pri tome je efikasnost ispitivana na različite
patogene hrane (16 soja), ali ne i na Bacillus cereus.
soj
Bacillus cereus
Etarsko ulje
antibiotik
(µg/mL)
spoljašnji deo
korena
unutrašnji deo
korena hloramfenikol
izolat iz hrane 0.39 0.39 0.19
ATCC 11778 0.78 0.78 0.19
40
3.4. Efekat etarskog ulja celera na rast vrste Bacillus cereus u modelu hrane
Kako bi se ispitao potencijal etarskog ulja korena celera kao konzervansa,
testiran je njegov efekat na vrstu B. cereus na modelu hrane, kao i uticaj
temperature i perioda pri kome ovo ulje deluje. Na Grafiku 1 prikazan je efekat
etarskog ulja celera u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji na rast B. cereus u
komercijalnoj supi kao modelu hrane.
Utvrđeno je da pri temperaturi od 4 °C u prva dva sata nema značajne
promene brojnosti ćelija (104), da bi nakon ovog perioda njihov broj drastično
počeo da opada. Posle 12 h od početka inkubacije, došlo je do mikrobicidnog
efekta i nakon ovog perioda nije bilo živih ćelija u testiranim uzorcima. Kod
ispitivanih uzoraka inkubiranih na sobnoj temperaturi (18 °C), broj ćelija je ostao
sličan početnoj brojnosti inokuluma u prvih 6 h inkubacije, sa blagim povećanjem
Grafik 1. Efekat etarskog ulja celera (Apium graveolens) u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji
na rast bakterije Bacillus cereus u komercijalnoj pilećoj supi na različitim temperaturama (4 °C,
18 °C i 30 °C)
41
nakon 30 minuta, a do smanjenja broja ćelija je došlo nakon 12 h od početka
inkubiranja. Posle 24 h, nije bilo preživelih ćelija nakon presejavanja.
Upoređujući ove rezultate u odnosu na kontrolnu krivu (Grafik 2), gde se
javlja stalan rast ćelija (109), uočava se značajna inhibicija rasta zbog prisustva
etarskog ulja kojeg nije bilo u kontroli.U onim uzorcima koji su inkubirani na
temperaturi od 30 °C (optimalna temperatura), uočeno je postepeno smanjenje
broja ćelija već nakon 30 minuta (103). Do kraja 24 h perioda inkubacije, broj
ćelija se postepeno smanjivao, da bi nakon 48 h došlo do mikrobicidnog efekta bez
preživelih ćelija u supi.
Na Grafikonu 2 prikazan je rast bakterije Bacillus cereus na različitim
temperaturama inkubacije u kontrolama rasta, koje nisu sadržale etarsko ulje
celera, već samo rastvarač Tween 80.
Grafik 2. Rast bakterije Bacillus cereus na različitim temperaturama inkubacije (4°C, 18°C i
30°C) u komercijalnoj pilećoj supi bez dodatog etarskog ulja korena celera (kontrola rasta)
42
U kontroli rasta inkubiranoj na 4 °C može se uočiti postepen rast ćelija, gde
nakon 4 h dolazi do smanjenja broja ćelija, a nakon 12 h ponovni rast broja
bakterijskih ćelija, koji je rezultovao ukupnim brojem ćelija od ~106 nakon 72 h
(njihov broj uvećan je 10 x). Rezultati kontrole rasta inkubirane na sobnoj
temperaturi pokazuju rast bakterijskih ćelija gde između 2 h i 4 h dolazi do
stagnacije rasta. Nakon 4 h javlja se postepeni rast, a najveći broj bakterijskih
ćelija je zabeležen nakon 72 h (2 x 108). Kontrola rasta nakon inkubacije na 30 °C
pokazuje postepeni rast broja bakterijskih ćelija i posle 72 h taj broj dostiže
najveću vrednost (~ 109).
Na Grafiku 3. je prikazan uporedni pregled rasta kontrole i kulture sa
etarskim uljem korena celera.
Na osnovu zasejanih uzoraka iz erlenmajera u kojima nije dodato etarsko
ulje celera može se uočiti konstantan rast bakterijskih ćelija. Konačna smrt
bakterijskih ćelija dolazi posle 12 h na temperaturi od 4 °C, zatim nakon 24 h na 18
Grafik 3. Uporedni pregled rasta kontrole i kulture kojoj je dodato etarsko ulje korena celera u
MIK koncentraciji
43
°C i posle 48 h na 30 °C na osnovu uzoraka zasejanih iz erlenmajera koji sadrže i
MIK etarsko ulje celera.
Nakon dodavanja etarskog ulja celera primećena je niža stopa rasta
bakterijskih ćelija u odnosu na kontrole. Temperatura inkubacije značajno utiče na
efikasnost etarskog ulja - dve niže temperature povećavaju efikasnost etarskog ulja
korena celera. Sa druge strane, inkubacija bakterija na optimalnoj temperature u
prisustvu etarskog ulja prolongira njegov mikrobicidni efekat.
Rodrigues-Lozano i saradnici (2010) su ispitivali otpornost spora nekoliko
vrsta roda Bacillus spp. na visoke temperature (93-107 °C) i pH vrednosti 3.6-6.4 u
tri različite vrste supa (konzervirana krem supa od paradajza, krem supa od
krompira i praziluka i pileća krem supa). Otpornost spora na toplotu je ispitivana
staklenom kapilarnom tehnikom. Do smanjenja otpornosti spora na toplotu dolazi
prilikom povećanja temperature i smanjenja pH vrednosti na 3.6. Potvrđena je
otpornost tri od četiri testirane vrste ovog roda na toplotu što se pokazalo više od
predviđenog. Ovo može biti rezultat viskoznosti supe koja tako omogućava neku
vrstu zaštite testiranim organizmima tokom tretmana toplotom (Rodrigues-Lazano
et al., 2010). Eskandani (2010) je ispitivao efekat različitih koncentracija etarskog
ulja biljne vrste Zataria multiflora i temperature na rast bakterije Bacillus cereus u
komercijalnoj pilećoj supi u određenom vremenskom periodu (21 dan). Ustanovio
je da etarsko ulje ove biljke značajno utiče na rast ćelija Bacillus cereus i da je rast
značajno inhibiran na temperaturi od 25 °C, a da se na 8 °C rast uopšte ne odvija u
supi (Eskandani, 2010). Istraživanja vezana za antimikrobnu aktivnost etarskog
ulja korena celera u supi kao modelu hrane nisu rađena i samim tim je poređenje
rezultata nemoguće. Etarsko ulje celera je u ovom eksperimentu pokazalo
mikrobicidni efekat, koji je bio različit i uslovljen periodom kultivacije u
kombinaciji sa temperaturom inkubacije.
44
4. ZAKLJUČAK
Na osnovu rezultata prezentovanih u ovom radu zaključuje se:
1. Etarsko ulje korena peršuna dobijeno hidrodestilacijom imalo je blago
žućkastu boju, karakteristični miris celera i prinos od 0.023% (v/w). U
spoljašnjem delu korena celera se nalazi veći procenat etarskog ulja.
2. Ovo etarsko ulje sadrži neoknidalid (23.1%), 3-butil tetrahidroftalid izomer
(16%), limonen (15%) i 5-pentilcikloheksa-1,3-dien (11.1%) kao glavne
komponente.
3. Mikrodilucionom metodom je ispitivana antimikrobna aktivnost etarskog
ulja korena celera i utvrđena je jaka antimikrobna aktivnost na vrstu Bacillus
cereus, pri koncentracijama od 0.39 i 0.78 mg/ml protiv izolata i ATCC soja.
4. Prilikom upotrebe komercijalne pileće supe kao modela hrane zapaženo je
da niže temperature inkubacije dovode do povećanja aktivnosti etarskog ulja
korena biljke Apium graveolens, a javlja se i efekat perioda inkubacije.
Najveći inhibitorni uticaj je zabeležen nakon 4 h inkubiranja gde se nakon
ovog vremenskog perioda manje ili više javlja inhibirani rast u zavisnosti od
temperature inkubacije. Najmanje inhibiran rast se javlja na optimalnoj
temperature, dok se najveća inhibicija rasta javlja na najnižoj temperaturi
inkubiranja.
5. Ukoliko hrana ili model hrane sadrži više od 103 CFU/ml Bacillus cereus
ćelija onda hrana nije bezbedna za korišćenje, a rezultati dobijeni ovim
istraživanjem ukazuju na visok potencijal etarskog ulja celera u ovom
pogledu. Etarsko ulje ove biljke je ispoljilo aktivnost pri vrlo visokim
koncentracijama ćelija u početnoj koncentraciji, što je ekvivalent veoma
kontaminirane hrane na kojoj je makroskopski vidljivo da nije za korišćenje.
45
6. Celer (Apium graveolens) odnosno njegovo etarsko ulje se može koristiti
kao dodatak različitim prehrambenim proizvodima i tako, ne samo poboljšati
ukus jelu, već i sprečiti kvarenje hrane i različite poremećaje nastale
trovanjem hranom.
46
5. LITERATURA
Aboud, N., Hussein, N., Al-Musawi, H., 2014: Studing the terapeutic effect of
watery & alcoholic extracts extract of Apium graveolens leaves on urinary
tract infections caused by Staphylococcus aureus in rabbits.- Journal of
Babylon University, Pure and Applied Sciences 2.
Agata, N., Mori, M., Ohta, M., Suwan, S., Ohtani, I., Isobe, M., 1994: A novel
dodecadepsipeptide, cerulide, isolated from Bacillus cereus causes vacuole
formation in Hep-2 cells.- Federation of European Microbiological Societies
Microbiology Letters 121: 31-34.
Agata, N., Ohta, M., Mori, M., Isobe, M., 1995b: A novel dodecadepsipeptide,
cerulide, is an emetic toxin of Bacillus cereus.- Federation of European
Microbiological Societies Microbiology Letters 129: 17-20.
Agata, N., Ohta, M., Yokoyama, K., 2002: Production of Bacillus cereus emetic
toxin (cereulidae) in various foods.- International Journal of Food
Microbiology 73: 23-27.
Ahmad, A., Davies, J., Randall, J., Skinner, G., 1996: Antiviral properties of
extract of Opuntia streptacantha.- Antiviral Research 30: 75:80.
Ahmad, I., Mehmood, Z., Mehmood, I., 1998: Evaluation of antipyretic and
analgesic activity of Emblica officinalis Gaertn..- Journal of
Ethanopharmacology 62: 183-193.
Akhila, A., 2006: Essential oil-bearing grasses, the genus Cymbopogon; Medicinal
and Aromatic Plants- Industrial Profiles.- CRC Press.
Andrade, E., Alves, C., Guimaraes, E., Carreira, L., Maia, J., 2011: Variability in
essential oil composition of Piper dilatatum L.C. Rich..- Biochemical
Systematics and Ecology 39: 669-675.
47
Angioni, A., Barra, A., Coroneo, V., Dessi, S., Cabras, P., 2006: Chemical
composition, seasonal variability, and antifungal activity of Lavandula
stoechas L. ssp. stoechas essential oils from stem/leaves and flowers.-
Journal of Agricultural and Food Chemistry 54: 4364-4370.
Anitescu, G., Doneanu, C., Radulescu, V., 1997: Isolation of Coriander oil:
Comparison between steam distillation and supercritical CO2 extraction.-
Flavour and Fragrance Journal 12: 173.
Aswal, B., Goel, A., Patnaik, G., 1996: Screening of novel 1,5-benzothiazepines.-
Indian Journal of Experimental Biology 34: 444-467.
Baananou, S., Bouftira, I., Mahmoud, A., Boukef, K., Marongiu, B., Boughattas,
N., 2013: Antiulcerogenic and antibacterial activities of Apium graveolens
essential oil and extract.- Natural product research 27: 1075-1083.
Banswart, G., 1981: Basic food microbiology.- The AVI publishing company, Inc.,
West Port, Connecticut.
Bauer, A., Kirby, M., Sherris, J., Turk, M., 1966: Antimicrobial activity of some
ethnomedicinal plants used by Paliyar tribe from Tamil Nadu, India.-
American Journal of Clinical Pathology 45: 493-496.
Becker, H., Schaller, G., Von Wiese, W., Terplan, G., 1994: Bacillus cereus in
instant foods and dried milk product.- International Journal of Food
Microbiology 23: 1-15.
Bedin, C., Gutkoski, S., Wiest, J., 1999: Antimicrobial activity of spices.- Higiene
Alimentar 13: 26-29.
Benbelaid, F., Abdoune, M., Khadir, A., Bendahou, M., 2013: Drying effect on
yield and antimicrobial activity of essential oils.- International Journal of
Medicinal and Aromatic Plants 3: 93-101.
Bowles, E., 2003: The chemistry of aromatherapeutic oils; 3rd
Edition.- Griffin
Press.
48
Brković, D., Čomić, Lj., Solujić-Sukolak, S., 2006: Antibacterial activity of some
plants from family Apiaceae in relation to selected phytopathogenic
bacteria.- Kragujevac Journal of Science 28: 65-72.
Burt, S., 2004: Essential oils: their antibacterial properties and potential application
in foods- a review.- International Journal of Food Microbiology 94: 223-
253.
Buruk, K., Sokman, A., Aydin, F., Erturk, M., 2006: Antimicrobial activity of
some endemic plants growing in the Eastern Black Sea Region, Turkey.-
Fitoterapia 77: 388-391.
Cosentino, S., Tuberoso, C., Pisano, B., Satta, M., Mascia, V., Arzedi, E., Palmas,
F., 1999: In-vitro antimicrobial activity and chemical composition of
Sardinian Thymus essential oils.- Letters in Applied Microbiology 29: 130-
135.
Cowan, M., 1999: Plant products an antimicrobial agents.- Clinical Microbiology
Review 12: 564-582.
Chopra, R., De, P., 1929.- Indian Journal of Medical Research 17: 351.
Da Porto, C., Decorti, D., Kikic, I., 2009: Falvour compounds of Lavandula
angustifolia L. to use in food manufacturing: Comparison of three different
extraction methods.- Food Chemistry 112: 1072-1078.
Dai, J., Zhu, L., Yang, L., Qui, J., 2013: Chemical composition, antioxidant and
antimicrobial activities of essential oil from Wedelia prostrata.-
Experimental and Clinical Sciences International Journal 12: 479-490.
Deans, S., Svoboda, K., Gundidza, M., Brechany, E., 1992: Essential oil profiles of
several temperate and tropical aromatic plants: their antimicrobial and
antioxidant activities.- Acta Horticulturae 306: 229-232.
De Sousa, D., 2011: Analgesic-like activity of essential oils constituents.-
Molecules 16: 2233-2252.
49
Di Pasqua, R., Betts, G., Hoskins, N., Edwards, M., Ercolini, D., Mauriello, G.,
2007: Membrane toxicity of antimicrobial compounds from essential oils.-
Journal of Agricultural and Food Chemistry 55: 4863-4870.
Donelian, A., Carlson, L., Lopes, T., Machado, R., 2009: Comparison of extraction
of patchouli (Pogostemon cablin) essential oil with supercritical CO2 and by
steam distillation.- The Journal of Supercritical Fluids 48: 15-20.
Dorman, H., Deans, S., 2000: Antimicrobial agents from plants: antibacterial
activity of plant volatile oils.- Journal of Applied Microbiology 88: 308-316.
Eikani, M., Golmohhamad, F., Rowshanzamir, S., 2007: Subcritical water
extraction of essential oils from coriander seeds (Coriandrum sativum L.).-
Journal of Food Engineering 80: 735-740.
Elgayyar, M., Draughon, F., Golden, D., Mount, J., 2001: Antimicrobial activity of
essential oils from plants against selected pathogenic and saprophytic
microorganisms.- Journal of Food Research 64: 1019-1024.
Evans, W., Evans, D., Trease, G., 1989: Trease and Evans` Pharmacognosy, 13th
edition.- WB Saunders.
Farag, R., Daw, Z., Abo-Raya, S., 1989: Influence of some spice essential oils on
Aspergillus parasiticus growth and production of aflatoxins in a synthetic
medium.- Journal of Food Science 54: 74.
Garg, S., Gupta, S., Sharma, N., 1980: Glucosides of Apium graveolens.- Planta
Medica 38: 363-365.
Gijbels, M., Fischer, F, Scheffer, J., Baerheim Svendson, ., 1985: Phthalides in
roots of Apium graveolens, A. graveolens var. rapaceum, Bifora testiculata
and Petroselinum crispum var. tuberosum.- Fitoterapia 56: 17-23.
Giron, L., Aguilar, G, Caceres, A., Arroyo, G., 1988: Anticandidal activity of
plants use for the treatment of vaginitis in Guatemala and clinical trial of a
50
Solanum nigrescens preparation.- Journal of Ethnopharmacology 22: 307-
313.
Gosh, S., Chatterjee, N., Dutta, A., 1929.- Journals of the Indian Chemical Society
6: 517.
Granum, P., Lund, T., 1997: Bacillus cereus and its food poisoning toxins.-
Federation of European Microbiological Societies Microbiology Letters
157: 223-8.
Griffin, S., Wyllie, S., Markham, J., Leach, D., 1999: The role of structure and
molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial
activity.- Flavour and Fragrance Journal 14: 322-332.
Guzman, C., Siemonsma, J., 1999: Plant resources of South-East Asia No. 13
Spices.- Prosea Borog Indonesia 1999, Indonesia.
Halm, M., 2008: Essential oils for management of symptoms in critically ill
patients.- American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 17:
160-163.
Hammer, K., Carson, C., Dunstan, J., Hale, J., Lehmann, H., Robinson, C.,
Prescott, S., Riley, T., 2008: Antimicrobial and anti-infamatory activity of
five Taxandria fragrans oils in vitro.- Microbiology and immunology 52:
522-530.
Harborne, S., Baxter, A., 1995: Phytochemical dictionary. A handbook of bioactive
compounds from plants.- Taylor & Francis.
Hirasa, K., Takemasa, M., 1998: Spice Science and technology.- Marcel Dekker,
Inc., New York.
Hunter, P., Reeves, D., 2002: The current status of surveillance of resistance to
antimicrobial agents: report on a meeting.- Journal of Antimicrobial and
Chemotherapy 49: 17-23.
51
Hunter, M., 2009: Essential oils: Agriculture, science, industry and
entrepreneurship.- Nova Science Publishers, Inc., New York.
Jenson. I., Moir, C., 2003: Bacillus cereus and other Bacillus species. Ch 14 In.
Hocking AD (ed) Foodborne microorganisms of public health significance.
6th
ed.- Australian Institute of Food Science and Technology (NSW Branch),
Sidney, 445-478.
Johnson, K., Nelson, C., Busta, F., 1984: Influence of heating and cooling rates on
B. cereus spore survival and growth in broth medium and in rice.- Journal of
Food Science 49: 34-39.
Kim, S., Oh, S., Lee, Y., Imm, J., Hwang, I., Kang., D., Rhee, M., 2011: Microbial
contamination of food products consumed by infants and babies in Korea.-
Letters in applies microbiology 53: 532-538.
Kivanc, M., Akgul, A., 1986: Antibacterial activities of essential oils from Turkish
spices and citrus.- Flavour and Fragrance Journal 1: 175-179.
Kramer, J., Gilbert, R., 1989: Bacillus cereus and other Bacillus species. In: Doyle,
M. P. (ed) Foodborne bacterial pathogens.- Marcel Dekker Inc., New York,
pp 21-70.
Krishna, A., Banerjee, A., 1999: Antimicrobial screening of some Indian spices.-
Phytotherapy Research 13: 616-618.
Lahlou, M., 2004: Methods to study the phytochemistry and bioactivity of essential
oils.- Phytotherapy Research 18: 435-448.
Lambert, R., Skandamis, P., Coote, P., Nychas, G., 2001: A study of the minimum
inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol
and carvacrol.- Journal of Applied Microbiology 91: 453-462.
MacLeod, A., MacLeod, G., Subramanian, G., 1988: Volatile aroma costituents of
celery.- Phytochemistry 27: 373-375.
52
Mahdi, O., 2011: Evaluation of inhibitory activity of extracts of Apium graveolens,
Coriandrum sativum and Cuminum cyminum against number of pathogenic
bacteria.- Kufa Journal for Veterinary Medical Sciences 2: 37-50.
Malik, S., Mohhamed, H., Misak, J., 2011: Screening of antibacterial properties for
some Iraqui plants against Salmonella typhimurium.- The Iraqui Journal of
Veterinary Medicine 35: 28-35.
Margaris, N., Koedam, A., Vokou, D., 1982: Aromatic plants: basic and applied
aspects.- The Hague, London, Boston, Martinus, Nijhoff Publishers.
Martinez, J., 2008: Supercritical fluid extraction of nutraceuticals and bioactive
compounds.- CRC Press, NW.
Masotti, V., Juteau, F., Bessiere, J., Viano, J., 2003: Seasonal and phonological
variations of the essential oil from the narrow endemic species Artemisia
mollinieri and its biological activities.- Journal of Agricultural and Food
Chemistry 51: 7115-7121.
Meurer-Grmes, B., Mcbeth, D., Hllihan, B., Delph, S., 1996: Antimicrobial
activity of ethnobotanically important plants of Acanthaceae and
Scrophulariaceae.- Pharmaceutical Biology 34: 243-248.
Mišić, D., Zizovic, I., Stamenić, M., Ašanin, R., Ristić, M., Petrović, S., Skala, D.,
2008: Antimicrobial activity of celery fruit isolates and SFE process
modeling.- Biochemical Engineering Journal 42: 148-152.
Mols, M., Pier, I., Zwietering, M., Abee, T., 2009: The impact of oxygen
availability on stress survival and radical formation of Bacillus cereus.-
International Journal of Food Microbiology 135: 303-311.
Momin, R., Nair, M., 2001: Mosquitocidal, nematicidal, and antifungal compounds
from Apium graveolens L. seeds..- Journal of Agricultural and Food
Chemistry 49: 142-145.
53
Nakamura, L., 1998: Bacillus pseudomycoides sp..- International Journal of
Bacteriology 48: 1031-1035.
Nascimento, G., Locatelli, J., Freistas, P., Silva, G., 2000: Antibacterial activity of
plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria.- Brazilian
Journal of Microbiology 31: 247-256.
Oonmetta-aree, J., Suzuki, T., Gasaluck, P., Eumkeb, G., 2006: Antimicrobial
properties and action of galangal (Alpinia galanga Linn.) on Staphylococcus
aureus.- LWT 39: 1214-1220.
Orient, L., 1996: Indial Medicinal Plants: A compendium of 500 species.- Orient
Logman Private Ltd. 5: 80.
Paster, N., Menasherov, M., Ravid, U., Juven, B., 1995: Inhibitory effect of
oregano and thyme essential oils on molds and food borne bacteria.- Food
Protect 58: 81.
Pattaratanawadee, E., Rachtanapun, C., Wanchaitanawong, P., Mahakarnchanakul,
W., 2006: Antimicrobial activity of spice extracts against pathogenic and
spoilage microorganisms.- Kasetsart Journal (Natural Science) 40: 159-165.
Pengelly, A., 2004: The constituents of medicinal plants.- Allen & Ullwin.
Perrett, S., Whitfield, P., Sanderson, L, Bartlett, A., 1995: The plant molluscidae
Millettia thonningii (Leguminosae) as a tropical antischistomal agent.-
Journal of Ethnopharmacology 47: 49-54.
Pourmortazavi, S., Hajimirsadeghi, S., 2007: Supercritical fluid extraction in plant
essential and volatile oil analysis.- Journal of Chromatography 1136: 2-24.
Reverchon, E., 1997: Supercritical fluid extraction and fractionation of essential
oils and related products.- The Journal of Supercritical Fluids 10: 1-37.
Sangwan, N., Farooqi, A., Shabih, F., Sangwan, R., 2001: Regulation of essential
oil production in plants.- Plant Growth Regulation 34: 3-21.
54
Schneider, K., Parish, M., Goodrich, Cookingham, T., 2004: Preventing Foodborne
illness: Bacillus cereus and Bacillus anthracis.
Schoeni, J., Wong, A., 2005: Bacillus cereus food poisoning and its toxins.-
Journal of Food Protection 68: 636-648.
Shad, A., Shah, H., Bakht, J., Choudhary, M., Ullah, J., 2011: Nutraceutical
potential and bioassay of Apium graveolens L. grown in Khyber
Pakhtunkhwa-Pakistan.- Journal of Medicinal Plants Research 5: 5160-
5166.
Shan, B., Cai, Y., Brooks, J., Corke, H., 2007: The in vitro antibacterial activity of
dietary spice and medicinal herb extracts.- International Journal of Food
Microbiology 117: 112-119.
Sikkema, J., Debont., J., Poolman, B., 1995: Mechanisms of membrane toxicity of
hydrocarbons.- Microbiological Reviews 59: 201-222.\
Sipailiene, A., Venskutonis, P., Sarkinas, A., Cypiene, V., 2003: Composition and
antimicrobial activity of celery ( Apium graveolens) leaf and root extracts
obtained with liquid carbon dioxide.- In III WOCMAP Congress on
Medicinal and Aromatic Plants- Volume 3.- Perspectives in Natural Product
Chemistry 677: 71-77.
Sipailiene, A., Venskutonis, P., Sarkinas, A., Cypiene, V., 2005: Composition and
antimicrobial activity of celery ( Apium graveolens) leaf and root extracts
obtained with liquid carbon dioxide.- Perspectives in Natural Product
Chemistry 3: 71-73.
Surburg, H., Panten, J., 2006: Common fragrance and flavor materials. Preparation
properties and uses. 5th
Edition.- WILEY-VCH, Weinheim.
Tauveron, G., Slomianny, C., Henry, C., Faille, C., 2006: Variability among
Bacillus cereus strains in spore surface properties and influence on their
55
ability to contaminate food surface equipment.- International Journal of
Food Microbiology 110: 256:262.
Turnbull, P., 1981: Bacillus cereus toxins.- Pharmacology and Therapeutics 13:
453-505.
Turnbull, P., 1986: Bacillus cereus toxins. In F. Dorner and J. Drews (ed.),
Pharmacology of bacterial protein toxins.- Pergamon Press, New York, p.
397-448.
Ulate-Rodrigues, J., Schafer, H., Zottola, E., Davidson, P., 1997: Inhibition of
Listeria monocytogenes, Escherichia coli 0157:H7, and Micrococcus luteus
by linear furanocoumarins in culture media.- Journal of Food Protection 60:
1046-1049.
Wenquiang, G., Shufen, L., Ruixiang, Y., Shaokun, T., Can, Q., 2007: Comparison
of essential oils of clove buds extracted with supercritical carbon dioxide
and other three traditional extraction methods chemistry of essential oils.-
Food Chemistry 101: 1558-1564.
Wijnands, L., Dufrenne, J., Zwietering, M., van Leusden, F., 2006a: Spores from
mesophilic Bacillus cereus strains germinate better and grow faster in
simulated gastrointestinal conditions than spores from psychrotrophic
strains.- International Journal of Food Microbiology 112: 120-128.
Wijnands, L., Pielaat, A., Dufrenne, J., Zwietering, M., van Leusden, F., 2009:
Modelling the number of viable cells of Bacillus cereus passing through the
stomach.- Journal of Applied Microbiology 106: 258-267.
Wise, M., Croteau, R., 1999: Monoterpene biosynthesis. In: Cane (ed).-
Comprehensive natural product chemistry: isoprenoids, Elsevier, Oxford, pp
9715.
56
Witkowska, A., Hickey, D., Alonso-Gomez, M., Wilkinson, M., 2013: Evaluation
of antimicrobial activities of commercial herb and spice extracts against
selected food-borne bacteria.- Journal of Food Research 4: 37-54.
Woods, J., Jeweel, C., O’Brien, N., 2001: Sedanolide, a natural phtalide from
celery seed oil: effect on hydrogen peroxide and tert-butyl hydroperoxide-
induced toxicity in HepG2 and CaCO-2 human cell lines.- In Vitro &
Molecular Toxicology: A Journal of Basic and Applied Research 14: 233-
240.
Yan, X., Hou, J., Xie, G., 1998: Traditional Chinese medicines molecular structure,
natural sources and application.- Ashgate Publishing Ltd.: 124-148.
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: Monografska
Тип записа, ТЗ: tekstualni/grafički
Врста рада, ВР: Master rad
Аутор, АУ: Milena Milutinović
Ментор, МН: Zorica Stojanović-Radić
Наслов рада, НР: Efekat etarskog ulja celera (Apium graveolens var. dulce (Mill.) Pers) na rast
vrste Bacillus cereus u komercijalnoj pilećoj supi kao modelu hrane
Језик публикације, ЈП: Srpski
Језик извода, ЈИ: Engleski
Земља публиковања, ЗП: R. Srbija
Уже географско подручје, УГП: R. Srbija
Година, ГО: 2014.
Издавач, ИЗ: autorski reprint
Место и адреса, МА: Niš, Višegradska 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
56 strana, 5 tabela, 2 slike,3 grafika
Научна област, НО: Biologija
Научна дисциплина, НД: Mikrobiologija
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Etarsko ulje, celer (Apium graveolens var. dulce (Mill.) Pers), antimikrobna
aktivnost, Bacillus cereus
УДК 547.913:635.128+561.23:641
Чува се, ЧУ: Biblioteka
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: U ovom radu је izvršena hidrodestilacija etarskog ulja korena celera (Apium
graveolens) u cilju ispitivanja hemijskog sastava i testiranja njegove
antimikrobne aktivnosti pomoću mikrodilucione metode na vrstu Bacillus
cereus. Dalje analize u ovom radu vršene su u cilju ispitivanja dejstva istog
etarskog ulja u ovoj koncentraciji na modelu hrane. Ovo testiranje vršeno je
praćenjem broja bakterija u toku vremena koje su tretirane minimalnom
inhibitornom koncentracijom etarskog ulja na različitim temperaturama i
periodima inkubacije, kako bi se ispitao i njihov uticaj na efikasnost ulja i
predložila eventualna primena ovog ulja.
Датум прихватања теме, ДП: 08.10.2014.
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник: dr Nataša Joković
Члан: dr Slaviša Stamenković
Члан, ментор: dr Zorica Stojanović-Radić
Образац Q4.09.13 - Издање
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO:
Identification number, INO:
Document type, DT: Monograph
Type of record, TR: Textual/graphic
Contents code, CC: Master thesis
Author, AU: Milena Milutinović
Mentor, MN: Zorica Stojanović Radić
Title, TI: The effect of the essential oil of celery (Apium graveolens var. dulce (Mill.)
Pers) on the growth of Bacillus cereus in commercial chicken soup as a
model food
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: Engish
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2014.
Publisher, PB: Autor’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
56 pages, 5 tables, 2 pictures, 3 graph
Scientific field, SF: Biology
Scientific discipline, SD: Microbiology
Subject/Key words, S/KW: essential oil,celery (Apium graveolens var. dulce (Mill.) Pers), antimicrobial activity,
Bacillus cereus
UC 547.913:635.128+561.23:641
Holding data, HD: Library
Note, N:
Abstract, AB: In this thesis, the essential oil of celery root (Apium graveolens var. dulce
(Mill.) Pers) was isolated by hydrodistillation in order to investigate its
chemical composition and antimicrobial activity against Bacillus cereus by
microdilution method. Further analysеs in this paper were carried out to
investigate the effects of the same essential oil in MIC concentration on real
food model. This testing was performed by monitoring the number of bacteria
in the course of time, treated with the minimal inhibitory concentration of the
essential oils, at various temperatures to determine their effect to essential oil
efficacy and to propose possible applications of this oil.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: 08.10.2014.
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President: PhD Nataša Joković
Member: PhD Slaviša Stamenković
Member, Mentor: PhD Zorica Stojanović-Radić
Образац Q4.09.13 – Издање 1
