Hemotaksonomska karakterizacija podsekcija Pinus i...Hemijski sastav etarskog ulja četina 24 taksona sekcije Pinus, uključujući 17 taksona podsekcije Pinus i 7 taksona podsekcije

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Hemotaksonomska karakterizacija podsekcija Pinus i

Pinaster (Pinus, Pinaceae) na osnovu terpenskih markera

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Jelena Stevanović 152 Dr Zorica S. Mitić

Niš, 2016.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Chemotaxonomic characterisation of subsections Pinus

and Pinaster (Pinus, Pinaceae) based on terpene markers

MASTER THESIS

Candidate: Mentor:

Jelena Stevanović 152 Dr. Zorica S. Mitić

Niš, 2016.

BIOGRAFIJA KANDIDATA

Jelena Stevanović, roĎena je 16. decembra 1991. godine u Nišu. Završava osnovnu

školu ”Jovan Jovanović Zmaj” u Malči i Prehrambeno-hemijsku školu u Nišu. Prirodno-

matematički fakultet u Nišu upisuje 2011. godine na Departmanu za biologiju i ekologiju.

Osnovne akademske studije završava 2014. godine i iste godine upisuje Master akademske

studije, smer biologija, koje u predviĎenom roku završava.

ZAHVALNICA

Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru dr Zorici Mitić sa Departamana za

biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu na izboru teme, neizmernoj

saradnji, razumevanju, pomoći i usmeravanju tokom celokupne izrade ovog master rada.

Veliku zahvalnost dugujem i prof. dr Bojanu Zlatkoviću sa Departamana za biologiju

i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu kao i prof. dr Petru Marinu sa Katedre

za morfologiju i sistematiku biljaka, Biološkog fakulteta u Beogradu na dragocenoj pomoći u

sakupljanju biljnog materijala.

Posebnu zahvalnost dugijem prof. dr Gordani Stojanović, Snežani Jovanović i Ivani

Zrnzević sa Departmana za hemiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu, na pomoći u

realizaciji hemijskih analiza i interpretaciji dobijenih rezultata.

Najveću zahvalnost na bezgraničnoj podršci i pomoći bez koje ne bih završila studije

dugujem svojim roditeljima i sestrama Karolini i Mileni.

SAŽETAK

Hemijski sastav etarskog ulja četina 24 taksona sekcije Pinus, uključujući 17 taksona

podsekcije Pinus i 7 taksona podsekcije Pinaster, uporeĎen je u cilju utvrĎivanja

hemotaksonomskog značaja terpena na mezosistematskom (infrageneričnom nivou). Sastav

etarskog ulja P. nigra ssp. pallasiana sa područja Srbije, Makedonije i Grčke analiziran je u

ovom radu, a osnovni kriterijumi za izbor literaturnih podataka bili su način izolacije etarskog

ulja (hidrodestilacija) i vrsta organa (četine). Na ovaj način, u analizu je uključeno 57 uzoraka

etarskog ulja dobijenih metodom hidrodestilacije iz četina 24 taksona sect. Pinus. Prema

rezultatima analize varijanse (ANOVA) moţe se videti da 15, od ukupno 34 ispitivana

terpenska karaktera, poseduje visok nivo statističke značajnosti, što ukazuje na to da postoji

statistički značajna razlika izmeĎu ispitivanih podsekcija. Najveći nivo statističke značajnosti

(P<0.001) pokazuju γ-kadinen i kamfen, a zatim slede α-pinen, δ-kadinen, germakren D, α-

kadinol, gvajol i (E)-β-ocimen (P<0.01). Najmanji nivo statističke značajnosti (P<0.05)

poseduju feniletil-3-metil butanoat, mircen, biciklogermakren, γ-terpinen, kembren, α-

terpineol i bornil acetat. Klaster analiza (CA) ukazala je na izdvajanje 5 grupa taksona, pri

čemu prve 3 grupe čine predstavnici subsect. Pinaster (sa izuzetkom P. merkusii), a druge

dve članovi subsect. Pinus (sa izuzetkom P. canariensis). Ovakvi rezultati se u velikoj meri

poklapaju sa dosadašnjim morfološkim, biohemijskim i molekularnim istraţivanjima koji

jasno ukazuju na postojanje dve sestrinske klade u okviru sekcije Pinus uključujući "prave"

mediteranske borove sa jedne (subsect. Pinaster) i evroazijske borove sa druge strane

(subsect. Pinus). TakoĎe, rezultati ovog rada potvrĎuju značaj terpena kao

hemotaksonomskih markera na infrageneričnom nivou.

Ključne reči: subsect. Pinus, subsect. Pinaster, terpeni, hemotaksonomija

ABSTRACT

The chemical composition of needle essential oils of 24 taxa from the section Pinus,

including 17 and 7 taxa of subsections Pinus and Pinaster, respectively, were compared in

order to determine chemotaxonomic significance of terpenes on mesosystematic

(infrageneric) level. The composition of essential oils in P. nigra ssp. pallasiana from Serbia,

Macedonia and Greece was analyzed in this paper, while the basic criteria for selection of

literature data included the method of essential oil isolation (hydrodistillation) and the type of

conifer organs (needles). In this way, 57 samples of essential oil obtained by hydrodistillation

from needles of 24 taxa of sect. Pinus were analyzed. According to the results of analysis of

variance (ANOVA), out of 34 examined terpene characters 15 had a high level of statistical

significance, indicating statistically significant difference between the examined subsections.

The highest level of statistical significance was shown by γ-cadinene and camphene

(P<0.001), followed by α-pinene, δ-cadinene, germacrene D, α-cadinol, guaiol and (E)-β-

ocimene (P<0.01). The lowest levels of statistical significance (P<0.05) were recorded for

phenyl ethyl-3-methyl butanoate, myrcene, bicyclogermacrene, γ-terpinene, cembrene, α-

terpineol, and bornyl acetate. Cluster analysis (CA) has shown separation of five groups of

taxa, where first three groups included representatives of subsect. Pinaster (with the

exception of P. merkusii), and the other two members of subsect. Pinus (with the exception of

P. canariensis). These results are largely consistent with previous morphological,

biochemical and molecular studies that clearly indicated presence of two clades in the section

Pinus, including "proper" Mediterranean pines on one side (subsect. Pinaster) and Eurasian

pines on the other side (subsect. Pinus). In addition, the results of this study confirm the

significance of terpenes as chemotaxonomic markers on infrageneric level.

Keywords: subsect. Pinus, subsect. Pinaster, terpenes, chemotaxonomy

SADRŽAJ

1. UVOD ............................................................................................................................................. 1

1.1. Opšte karakteristike roda Pinus L. .......................................................................................... 1

1.2. Opšte karakteristike Pinus sect. Pinus .................................................................................... 2

1.3. Opšte karakteristike vrste Pinus nigra Arnold ........................................................................ 3

1.4. Opšte karakteristike etarskih ulja ............................................................................................ 6

1.4.1. Fizičke osobine etarskih ulja ........................................................................................... 8

1.4.2. Hemijski sastav etarskih ulja ........................................................................................... 9

1.4.3. Taksonomski značaj terpena ......................................................................................... 10

1.4.4. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja borova ..................................................... 12

2. CILJEVI RADA ............................................................................................................................ 13

3. MATERIJAL I METODE ............................................................................................................ 14

3.1. Biljni material ............................................................................................................................ 14

3.2. Izolovanje etarskog ulja ............................................................................................................. 14

3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja ..................................................................................... 16

3.4. Literaturni podaci ....................................................................................................................... 16

3.5. Statistička analiza ....................................................................................................................... 19

4. REZULTATI I DISKUSIJA ......................................................................................................... 21

4.1. Hemijski sastav etarskog ulja četina P. nigra ssp. pallasiana ................................................... 21

4.2. Hemijski sastav etarskog ulja četina podsekcije Pinus .............................................................. 28

4.3. Hemijski sastav etarskog ulja četina podsekcije Pinaster .......................................................... 31

4.4. Analiza varijanse (ANOVA) ...................................................................................................... 35

4.5. Klaster analiza (CA) .................................................................................................................. 38

5. ZAKLJUČCI ................................................................................................................................. 41

6. LITERATURA ............................................................................................................................. 43

Jelena Stevanović Master rad

1

1. UVOD

"Within the wealth of data available for Pinus, it is perhaps surprising that key

phylogenetic relationships remain unresolved" (Syring et al., 2005).

1.1. Opšte karakteristike roda Pinus L.

Rod Pinus, sa oko 110 opisanih vrsta, predstavlja najveći recentni rod četinara.

Prirodna distribucija roda ograničena je na severnu hemisferu, izuzev jedne populacije P.

merkusii koja se nalazi juţno od ekvatora na Sumatri (Mirov, 1967, prema Šarac, 2014).

Borovi su obilno zastupljeni u Severnoj i Centralnoj Americi, Evropi i Aziji, a nekoliko

taksona proteţe se i do severne Afrike. Javljaju se na raznovrsnim staništima, od nivoa mora

do 3700 m nadmorske visine, a vrlo često su i edifikatori različitih zajednica. Po pravilu,

borovi odsustvuju u toplim i vlaţnim regionima tropskog pojasa, gde su slabi kompetitori sa

ostalim taksonima (Mirov, 1967, prema Šarac, 2014). U okviru tropskog pojasa javljaju se

isključivo u planinskim ili semi-aridnim područjima.

Najšire prihvaćenu klasifikaciju roda predloţili su Little i Critchfield (1969), a u

kasnijim revizijama izmenjen je broj vrsta i modifikovana taksonomska organizacija na nivou

sekcija i podsekcija (Farjon i Styles, 1997; Price et al., 1998; Gernandt et al., 2003; 2005,

prema Šarac, 2014). Naime, rod Pinus se deli deli na dva podroda: Pinus (= Diploxylon ili

trvdi borovi) i Strobus (= Haploxylon ili meki borovi). Subgenus Pinus odlikuju dva sudovna

snopića u centru lista i trajni rukavac koji obavija četine u čuperku (osim kod vrsta P.

leiophylla i P. lumholtzii). Plodne ljuspe su deblje i rigidnije u poreĎenju sa plodnim

ljuspama Strobus. Ostale karakterisitke podroda, koje navodi Farjon (1984), su veoma

polimorfne ili imaju malu dijagnostičku vrednost: broj iglica u čuperku varira od 2-8, poloţaj

smolnih kanala polimorfan (unutrašnji, spoljašnji, medijalni ili septalni), krilce spojeno ili

sraslo sa semenom, zrele šišarke se otvaraju odmah ili nakon odreĎenog vremena, subgenus

je rasprostranjen širom severne hemisfere i na različitim tipovima staništa. Sa druge strane,

subgenus Strobus odlikuje jedan sudovni snopić u centru lista i rukavci četina koji brzo

opadaju (osim kod vrste P. nelsonii). Plodne ljuspe su tanje i fleksibilnije, broj iglica u


2

čuperku varira od 1-5 (retko 6), smolni kanali su medijalni ili spoljašnji, krilca semena veoma

polimorfna (odsutno, rudimentirano, spojeno ili sraslo), zrele šišarke se obično odmah

otvaraju. Strobus je, takoĎe, rasprostranjen širom severne hemisfere, na različitim tipovima

staništa, osim u subtropskim nizijama. Dalja podela na sekcije i podsekcije se razlikuje

izmeĎu pojedinih autora. PoreĎenjem morfologije, anatomije, citologije, sekundarnih

metabolita, proteina i DNK, Price et al. (1998) izdvajaju 111 vrsta u 2 podroda, 4 sekcije i 17

podsekcija, dok su Gernandt et al. (2005) na osnovu analize hloroplastne DNK (matK i rbcL)

smanjili broj podsekcija na 11 (tabela 1.1) (prema Šarac, 2014).

Tabela 1.1. Klasifikacija roda Pinus prema Gernandt et al. (2005).

Podrod Pinus (Diploxylon) Sekcija Pinus, Podsekcija Pinus: P. densata, densiflora, hwangshanensis, kesiya, luchuensis,

massoniana, merkusii, mugo*, nigra*, resinosa, sylvestris*, tabuliformis, taiwanensis, thunbergii,

tropicalis, uncinata, yunnanensis; Podsekcija Pinaster: P. brutia, canariensis, halepensis, heldreichii*,

pinaster, pinea, roxburghii.

Sekcija Trifoliae, Podsekcija Contortae: P. banksiana, clausa, contorta, virginiana;

Podsekcija Australes: P. attenuata, caribaea, cubensis, echinata, elliottii, glabra, greggii, herrerae,

jaliscana, lawsonii, leiophylla, lumholtzii, muricata, occidentalis, oocarpa, palustris, patula,

praetermissa, pringlei, pungens, radiata, rigida, serotina, taeda, tecunumanii, teocote; Podsekcija

Ponderosae: P. cooperi, coulteri, donnell-smithii, devoniana, douglasiana, durangensis, engelmannii,

hartwegii, jeffreyi, maximinoi, montezumae, nubicola, ponderosa, pseudostrobus, sabineana, torreyana,

washoensis.

Podrod Strobus (Haploxylon) Sekcija Parrya, Podsekcija Balfourianae: P. aristata, balfouriana, longaeva; Podsekcija

Cembroides: P. cembroides, culminicola, discolor, edulis, johannis, maximartinezii, monophylla,

pinceana, quadrifolia, remota, rzedowskii; Podsekcija Nelsoniae: P. nelsonii

Sekcija Quinquefoliae, Podsekcija Gerardianae: P. bungeana, gerardiana, squamata;

Podsekcija Krempfianae: P. krempfii; Podsekcija Strobus: P. albicaulis, armandii, ayacahuite,

bhutanica, cembra, chiapensis, dabeshanensis, dalatensis, fenzeliana, flexilis, koraiensis, lambertiana,

monticola, morrisonicola, parviflora, peuce*, pumila, sibirica, strobus, wallichiana, wangii.

*Autohtone vrste u flori Srbije (Jovanović, 1992).

1.2. Opšte karakteristike Pinus sect. Pinus

Sekciju Pinus odlikuje trajni rukavac, broj iglica u čuperku od dve do tri, obično

spoljašnji ili medijalni poloţaj smolnih kanala, ali ponekad i unutrašnji (P. merkusii) ili

septalni (P. tropicalis). Zrele šišarke se otvaraju nakon odreĎenog vremena (osim kod P.

pinea) i imaju debele plodne ljuspe sa dorzalnim poloţajem štita (umbo). Krilce je labavo

vezano za seme kod većine vrsta, osim kod P. canariensis i P. roxburghii gde je krilce čvrsto

vezano za seme. Sekcija je rasprostranjena širom Evroazije i Mediterana sa samo dve

američke vrste (P. resinosa iz istočne Severne Amerike i P. tropicalis sa zapadne Kube).


3

Na osnovu varijabilnosti hloroplastnih DNA sekvenci (matK i rbcL), Gernandt et al.

(2005) ukazali su na postojanje dve klade u okviru sect. Pinus (tabela 1.1):

subect. Pinus koja uključuje evroazijske borove i dve severnoameričke vrste

(P. resinosa i P. tropicalis).

subsect. Pinaster koja obuhvata "prave" mediteranske borove zajedno sa

himalajskom vrstom P. roxburghii.

Sa druge strane, analiza matriksa kvalitativnih morfoloških karaktera nije otkrila

nijedan diskriminišući karakter izmeĎu podsekcija Pinus i Pinaster (Gernandt et al., 2005).

1.3. Opšte karakteristike vrste Pinus nigra Arnold

Pinus nigra Arnold (crni ili austrijski bor) je visoko, srednje ili nisko drvo do 30, reĎe

40 (50) m, u zavisnosti od staništa, sa širokokupastom do amrelastom krošnjom (slike 1.1 i

1.2). Kora na odraslom stablu debela, tamnosiva; rano ispuca nepravilnim, kasnije dubokim

uzduţnim i poprečnim brazdama. Kora se u boji i debljini malo razlikuje u donjem i gornjem

delu (razlika od P. sylvestris). Mlade grančice gole, sjajne, pokrivene sitnim rombičastim

ljuspama. Pupoljci valjkasti pri vrhu, oštro zašiljeni, smolasti. Četine po dve, tamnozelene,

krupne, duge 8-18 cm, široke, 1.5-2.1 mm, pravo pruţene ili blago uvijene, traju obično 4-5

godina, pri bazi su obuhvaćene zajedničkim rukavcem. Smoni kanali u četinama medijalno

postavljeni; rukavac trajan, dug 10-12 mm, obavija po dve četine (Vidaković, 1982;

Jovanović, 1992).

Crni bor je jednodoma vrsta sa jednopolnim strobilusima. Muški i ţenski strobilusi se

pojavljuju od aprila do maja meseca. Muški strobilusi (mikrostrobilusi) podsećaju na rese,

zbijeni su pri osnovi mladih grančica, ţutozeleni, gotovo sedeći i koţasti. Ţenski strobilusi

(makro-, megastrobilusi) su 5-7.5 cm dugi, i 2-3.5 (4) cm široki, skoro sedeći, smešteni pri

vrhu mladih izdanaka. Razvijen ţenski strobilus (šišarka, conus) je izgraĎen od kompaktno

rasporeĎenih, odrvenelih plodnih ljuspi koje su, sa donje strane, crnosmeĎe, poprečno

ispucale, a na vrhu poseduju štitoliki izraštaj, apofizu. Zreli semeni zameci su izduţeno

jajasti, 4-6 mm dugi, sivi, sa izduţenim, krilastim, poluprozirnim dodatkom 3-4 puta duţim

od samog semenog zametka. Sazrevanje šišarke i semenih zametaka traje skoro dve sezone

nakon oploĎenja (Zlatković i Šarac, 2016).


4

Slika 1.1. P. nigra ssp. pallasiana: A) Olimp, Grčka (foto: Rajčević, 2015);

B) Stumica, Makedonija (foto: Zlatković, 2013)

A

B


5

Crni bor je jedan od najšire rasprostranjenih i najpolimorfnijih četinara Evrope.

Diskontinuirano je rasprostranjen oko severnog Mediterana, od istočne Španije i juţne

Francuske, preko Korzike i Kalabrije,

Austrije i Balkanskog poluostrva do Male

Azije i Krima. U Flori Evrope Gaussen et

al. (1993) razlikuju pet alopatričnih

podvrsta crnog bora (slika1.2): ssp. nigra

(od Austrije do centralne Italije i Grčke),

ssp. dalmatica (Vis.) Franco (priobalni

region i ostrva Dalmacije - Hrvatska), ssp.

pallasiana (Lamb.) Holmboe (Balkansko

poluostrvo, juţni Karpati i Krim), ssp.

salzmannii (Dun.) Franco (Ceven i Pirineji

- Francuska, centralna i istočna Španija), i

ssp. laricio (Poir.) Maire (Kalabrija i

Sicilija - Italija i Korzika - Francuska).

TakoĎe, afričke populacije P. nigra

opisane su kao posebna podvrsta: ssp.

mauretanica (Maire i Peyerimh) Heywood

(Greuter et al., 1984).

Palasov ili krimski crni bor (ssp.

pallasiana) (slike 1.1 i 1.2) se od tipične

podvrste odvaja, pre svega, duţim lisnim

rukavcima (18-26 mm) (Jovanović, 1992).

Ovogodišnje grančice su ţute do

svetlosmeĎe, sjajne. Ljuspe na grančicama

svetloţute, po duţini jednake rukavcima

četina ili duţe. Ljuspe su tri puta duţe od

svoje širine, sa paralelnim ivicama; na

leĎima imaju usko, istaknuto rebro i

zašiljen, povijen vrh. Četine prave do malo

savijene, krute, duge 8-12 (-18) cm i 1.6-Slika 1.2. P. nigra ssp. pallasiana na planini Crnook

(Jarešnik), jugoistočna Srbija (foto: Zlatković, 2013)


6

2.1 mm široke, tamnozelene. Hipodermalne ćelije sa 2-5 slojeva. Smonih kanala u parenhimu

obično manje od 11. Šišarice tamnosmeĎe i sjajne, duge 5-10 cm, 2-4 cm široke sa tupim

rebrom na zrakasto naboranim apofizama gornjih i srednjih ljuspi; grbice crvenkaste do sive.

Na teritoriji Srbije krimski crni bor zabeleţen je jedino u jugoistočnoj Srbiji

(Rajevski, 1950) na planini Crnook (Jarešnik) u okolini Bosilegrada, na nadmorskoj visini

oko 1300 m, na kristalastim škriljcima (slika 1.2). Takson je zakonom zaštićen kao prirodna

retkost na području Srbije (Sl. gl. R. Srbije br. 66/91, 83/92), dok je stanište na Crnooku

proglašeno za strogi rezervat prirode.

1.4. Opšte karakteristike etarskih ulja

Etarska ulja su mirisne smese isparljivih, lipofilnih sastojaka (sekundarnih biljnih

metabolita), koje se sintetišu i lokalizuju u specijalnim sekretornim strukturama biljaka i

mogu predestilovati vodenom parom (Petrović et al., 2009).

Etarska ulja su uglavnom lako pokretljive, mirisne tečnosti; pojedina su na sobnoj

temperaturi viskozna ili čvrste konzistencije. Glavni sastojci etarskih ulja su monoterpeni,

seskviterpeni i u manjoj meri derivati fenilpropana. To su različiti ugljovodonici (zasićeni ili

nezasićeni), alkoholi, fenoli, estri, aldehidi, ketoni, epoksidi ili karboksilne kiseline. Etarska

ulja su smese oko 20-200 sastojaka. Ovi sastojci su, na osnovu koncentracije u etarskom ulju,

podeljeni na: glavne (20-95%), sporedne (1-20%) i zastupljene u tragovima (ispod 1%).

Etarska ulja najčešće sadrţe svega nekoliko glavnih komponenti (npr. karvakrol (30%) i

timol (27%) u etarskom ulju Origanum compactum, a mentol (59%) i menton (19%) u ulju

Mentha x piperita), a nekada je to samo jedan sastojak (npr. 1,8-cineol (50%) u etarskom ulju

Cinnamomum camphora ili linalol (68%) u ulju Coriandrum sativum).

Etarska ulja su uglavnom produkti kopnenih biljaka (Embryophyta). Ove biljke su

rasporeĎene u preko pedeset familija, a najpoznatije su aromatične biljke familija Pinaceae,

Cupressaceae, Lauraceae, Zingiberaceae, Myrtaceae, Rutaceae, Lamiaceae, Apiaceae i

Asteraceae. Etarska ulja se mogu naći u svim delovima biljke (korenu, rizomu, stablu, kori,

semenu, listovima, cvetovima i plodovima), ravnomerno rasporeĎena u svim biljnim

organima ili samo u odreĎenom biljnom organu - najčešće i u najvećem procentu su

zastupljena u listu i cvetu. Interesantno je da etarska ulja lokalizovana u različitim delovima

iste biljke, mogu biti sličnog sastava, ali mogu se i značajno razlikovati (etarsko ulje zelenog


7

i zrelog ploda, listova i korena peršuna razlikuju se po dominantnim sastojcima) (Kovačević,

2004). Prinosi etarskih ulja se obično kreću izmeĎu 0.2 i 2.0%, mada postoje znatna

odstupanja. U zavisnosti od sadrţaja etarskog ulja koji moţe da varira (prinos izuzetno

cenjenog ruţinog ulja često ne prelazi 0.03%, dok prinos nekih drugih ulja moţe dostizati i

do 20%, npr. etarsko ulje karanfilića) biljke su podeljene u red bogatih ili siromašnih uljem

(Gašić, 1985).

Etarska ulja se najčešće nalaze u slobodnom stanju i to egzogeno: u ţlezdama,

ţlezdanim ljuspama i ţlezdanim dlakama, i endogeno: u sekretornim ćelijama,

intercelularnim šizogenim šupljinama i intercelularnim šizogenim i lizogenim rezervoarima.

Postoje izuzeci kada su ulja vezana u obliku heterozida (seme crne slačice, seme gorkog

badema). U vezanom obliku ulja su bez mirisa, a pod uticajem specifičnih enzima i u

prisustvu vode, nastaju isparljivi mirisni sastojci (aglikoni).

Biosinteza etarskih ulja se odvija u sekretornim ćelijama sa gustom citoplazmom i

većim brojem plastida, mitohondrija i diktiozoma (Simić, 2000). U posebnim delovima

biljaka dolazi do akumulacije ulja, najčešće u neposrednoj blizini ili na samim mestima gde i

nastaju. Postoji više vrsta sekretornih struktura, u zavisnosti od samih biljaka, i to:

1. ulje se sakuplja na mestu nastanka u ćeliji - modifikovane parenhimske ćelije

(idioblasti). Ovo je slučaj kod biljaka familija Lauraceae, Piperaceae, Zingiberaceae, Araceae

itd.;

2. meĎućelijski sekretorni prostori - okrugle šupljine ili cilindrični kanalići koji se

prema postanku dele na šizogene (Myrtaceae), lizigene (u plodovima Citrus voća) i

šizolizigene (kod Rutaceae); kod predstavnika familije Pinaceae unutar mezofila listova često

se nalaze smolni kanali šizogenog porekla, okruţeni parenhimskim ţlezdanim ćelijama koje

produkuju smolu i etarska ulja (slika 1.3.)

3. ţlezde i ţlezdane dlake (peltatne i kapitatne dlake) koje se nalaze na površini

zeljastih delova biljaka (Asteraceae i Lamiaceae).


8

Biološka funkcija etarskih ulja povezana je sa atraktantnim delovanjem na insekte,

čime je obezbeĎeno je prenošenje polena i oprašivanje biljaka. Sa druge strane, veoma je

značajna i uloga etarskih ulja u zaštiti biljaka od napada insekata i ţivotinja, herbivora.

TakoĎe, gotovo sva ulja više ili manje intenzivno sprečavaju razvoj mikroorganizama, i tako

suzbijaju širenje infekcija na biljkama u kojima nastaju. Interesantni su i podaci o specifičnim

efektima ulja jedne biljke, koje prelazi u podlogu i inhibira klijanje semena drugih biljaka

(alelopatija). Neka etarska ulja sprečavaju klijanje sopstvenih semena i obezbuĎuju ţivotni

prostor svake individue. Stara je teorija, koja samo delimično moţe biti prihvaćena, da biljke

sintezom i odavanjem ovih isparljivih produkata stvaraju specifičnu mikroklimu, koja ih štiti

od prekomerne transpiracije u različitim nepovoljnim uslovima (Kovačević, 2004).

1.4.1. Fizičke osobine etarskih ulja

Etarska ulja su uglavnom bezbojne, ţute ili ţutozelene tečnosti; pojedina su specifično

obojena (npr. etarsko ulje cimeta i karanfilića smeĎecrveno). Droge sa proazulenima daju

destilacijom vodenom parom plavo ili zeleno obojena etarska ulja (npr. plava etarska ulja

daju Matricariae flos, Absinthii herba i Millefolii herba). Proazuleni su neisparljivi, bezbojni,

gorki seskviterpenski laktoni. Tokom destilacije vodenom parom prelaze u obojene isparljive

azulene. Miris etarskih ulja potiče od sastojaka sa kiseoničnim funkcionalnim grupama. On je

intenzivan čak i kada su ovi sastojci zastupljeni u niskom procentu (etarsko ulje limuna). U

koncentrovanom obliku etarska ulja uglavnom imaju oštar, nadraţujući ukus, koji pali.

Slika 1.3. Poprečni presek kroz list (četinu) P. nigra

smolni kanali


9

Razblaţivanjem ukus uglavnom postaje prijatan. Izuzeci su npr. etarsko ulje anisa i morača

koja su slatkog ukusa (Petrović et al., 2009).

Etarska ulja su lipofilna, rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima, etanolu,

mastima i masnim uljima. Generalno, etarska ulja se ne rastvaraju u vodi. U stvari, samo mali

broj sastojaka ulja je rastvorljiv; ovakvi proizvodi nazivaju se aromatične vode.

Kao tečnosti, etarska ulja su definisana nekim fizičkim konstantama. Relativna

gustina ulja moţe biti manja ili veća od 1; ipak neuporedivo je mani broj etarskih ulja čija je

relativna gustina veća od 1. Kao parametar kvaliteta, značajne su vrednosti indeksa refrakcije

i ugla skretanja ravni polarizovane svetlosti. Kao specifična karakteristika definisana je i

rastvorljivost etarskog ulja u etanolu odreĎenog razblaţenja.

Specifičnost ove grupe biljnih proizvoda je da nemaju tačno definisanu temperaturu

ključanja. Pošto su to smeše različitih jedinjenja, svako od njih isparava na svojoj temperaturi

ključanja. Tako, etarska ulja frakciono k - C (Kovačević,

2004).

1.4.2. Hemijski sastav etarskih ulja

Etarska ulja su sloţene mešavine dve različite klase jedinjenja: terpena i

fenilpropanskih derivata. U okviru terpenske frakcije, zastupljeni su isparljivi mono- i

seskviterpeni.

Monoterpeni se javljaju u obliku acikličnih (linearnih), mono- i bicikličnih, alifatičnih

i aromatičnih struktura. Na osnovu uvedenih funkcionalnih grupa, sastojci ulja mogu biti

uljovodonici, alkoholi, aldehidi, ketoni, kiseline, estri, fenoli, etri, oksidi, peroksidi, epoksidi.

U okviru frakcije seskviterpena, formirane su još raznovrsnije strukture osnovnog

skeleta; zbog duţine lanaca C atoma veća je mogućnost različitih ciklizacija. I ova grupa

terpena javlja se u obliku ugljovodonika, oksida, alkohola, ketona i estara.

U etarskim uljima su aromatični, fenilpropanski sastojci (C6-C3) zastupljeni u manjim

količinama. Postoje i izuzeci, kada glavninu ulja čine upravo ovakva jedinjenja. Najčešće su

to aril- ili propenilfenoli (eugenol, anetol) i aldehidi (cimetni aldehid). Ovakva jedinjenja su

uglavnom prisutna u etarskom ulju biljaka iz familija Apiaceae i Myrtaceae. Kao sastojci

etarskih ulja sreću se i C6-C1 jedinjenja, kao što je vanilin i derivati antranilne kiseline.


10

Tokom destilacije, iz biljne sirovine mogu predestilisati i različita alifatična jedinjenja

manje molekulske mase (zasićeni i nezasićeni ugljovodonici, alkoholi, aldehidi, estri, laktoni)

koji se rastvaraju u etarskom ulju i postaju njegov sastavni deo. TakoĎe, kod nekih droga koje

su izloţene fermentaciji ili torefakciji, na primer, male količine prisutnog etarskog ulja

postaju obogaćene sumpornim i azotnim jedinjenjima koja nastaju tokom tih specifičnih

procesa; time se formira specifična aroma ovakvih droga (seme kafe, kakaovca) (Kovačević,

2004).

1.4.3. Taksonomski značaj terpena

Upotreba terpena u sistematici biljaka ima veoma dugu tradiciju, a zasniva se na

činjenici da je sastav terpena pod genetičkom kontrolom i u velikoj meri nezavisan od uticaja

faktora spoljašnje sredine (Incerti et al., 2013). Kod mnogih vrsta sastav terpena je povezan

sa poreklom biljnog materijala, tako da terpeni mogu biti korišćeni kao markeri u istraţivanju

genetičkog variranja na geografskom ili ekološkom nivou (Nikolić et al., 2007; 2008; 2009)

kao i u verifikaciji materijala nepoznatog porekla (Cenard et al., 1997). Hanover (1992) je

istakao da su terpeni odlični markeri za istraţivanje biodiverziteta, geografske varijabilnosti,

evolucije i sistematike, naročito kod četinara. Do danas je objavljen veliki broj radova o

terpenima kod četinara i ostalih vaskularnih biljaka, a meĎu njima ima najviše onih koji se

bave proučavanjem sastava terpena i njihovim geografskim varijabilitetom. TakoĎe, dosta je

uraĎeno u oblasti taksonomije, biosinteze terpena i ispitivanja uticaja terpena na otpornost

biljaka prema bolestima, štetočinama i spoljašnjim faktorima (Šarac, 2014).

I pored neosporne činjenice da su sastav i produkcija terpena pod genetičkom

kontrolom, kod terpena (kao i kod drugih sekundarnih metabolita biljaka) uočava se odreĎena

varijabilnost, kao posledica uticaja različitih ekoloških faktora (temperatura, vlaţnost i

aeracija zemljišta, mineralne soli u podlozi, nadmorska visina, duţina izloţenosti svetlu,

kvalitet svetlosti, vlaţnost vazduha i vazdušna strujanja). Zbog toga je pre analize

taksonomskog značaja neophodno istraţiti intra- i interpopulacionu varijabilnost terpena

odreĎenog taksona. TakoĎe, pravilno uzorkovanje i doslednost u postupcima branja,

skladištenja i izolacije etarskih ulja su preduslovi validne interpretacije dobijenih rezultata.

Niži nivoi klasifikacije. Iako je hemotaksonomski značaj terpena kod četinara

potvrĎen na nivou rodova (Picea i Pinus, Nikloić et al., 2011) i sekcija (Juniperus i Sabina,


11

Adams, 1991; Tsuga i Hesperopeuce, Lagalante i Montgomery, 2003), u najvećem broju

radova terpeni su uspešno korišćeni (prema Šarac, 2014):

1. kao hemotaksonomski markeri na nivou vrsta:

• Pinus halepensis, P. brutia, P. nigra, P. pinea i P. canariensis (Roussis et al.,

1995),

• Pinus attenuata, P. heldreichii, P. peuce, P. pinaster i P. radiata, (Petrakis et al.,

2001),

• P. pinea, P. halepensis, P. pinaster i P. nigra (Macchioni et al., 2003), itd.

2. u identifikaciji infraspecijskih taksona i proceni geografske varijabilnosti vrsta iz

rodova:

• Pinus (P. nigra, Arbez et al., 1974; Kubeczka i Schultze, 1987; Gerber et al.,

1995; Bojović, 1995; Chalchat i Gorunovic, 1995a; 1995b; Vidrich et al., 1996; Rafii et al.,

1996; Rezzi et al., 2001; Bojovic et al., 2005; Sezik et al., 2010; P. sylvestris, Manninen et

al., 2002; Naydenov et al., 2002; 2005b; Semiz et al., 2007; P. heldreichii, Nikolić et al.,

2007; P. peuce, Nikolić et al., 2008; P. contorta var. latifolia, Pauly i von Rudloff, 1971; P.

pinea, De Simón et al., 2001; P. pinaster, Arrabal et al., 2005; itd.),

• Picea (P. glauca, von Rudloff, 1972; P. abies, Persson et al., 1996; P. omorica,

Nikolić et al., 2009; itd.),

• Abies (A. lasiocarpa, Zavarin et al., 1970; A. alba, Zeneli et al., 2001; A.

nephrolepsis, Li et al., 2005; itd.),

• Pseudotsuga (P. taxifolia var. menziesii i var. glauca, von Rudloff, 1973)

• Thuja (T. plicata, von Rudloff et al., 1988),

• Juniperus (J. squamata var. fargesii, Adams et al., 1996; J. communis, Mastelić

et al., 2000; J oxycedrus, Medini et al., 2010; J. deltoides, Rajčević et al., 2013; itd.)

2. u proučavanju i detekciji hibrida: Picea glauca x P. engelmannii (Schaefer i

Hanover, 1986), Pinus brutia x P. halepensis (Gallis i Panetsos, 1977), Pinus nigra x P.

sylvestris i P. densiflora x P. thunbergiana (Idţojtić et al., 2005) itd.

3. u proučavanju prelaznih oblika: izmeĎu Pinus discolor i P. johannis (Zavarin i

Snajberk, 1986), Pinus discolor i P. cembroides (Bailey et al., 1982).

Viši nivoi klasifikacije. Obimni literaturni podaci ukazuju da je korišćenje terpena u

sistematici biljaka, pre svega korisno na niţim nivoima klasifikacije (najviše do nivoa roda).


12

Njihov značaj na suprageneričnim nivoima se smanjuje povećavanjem taksonomnskog nivoa,

što je očekivano s obzirom na njihovu funkciju u biljci, njihovu biosintezu i na strukturne

karakteristike (Marin, 2003).

Jedan od interesantnih primera značaja terpena na višim nivoima klasifikacije se

odnosi na familiju Lamiaceae. Naime, po nekim starijim klasifikacijama, Lamiaceae se dele

na dve podfamilije: Lamioideae i Nepetoideae. Nepetoideae su, generalno, bogate etarskim

uljima, za razliku od Lamioideae. Sa druge strane, kod Lamioideae se javljaju iridoidni

glukozidi koji su, po pravilu, odsutni kod predstavnika Nepetoideae. Postoji još nekoliko

hemijskih parametara koji diferenciraju ove dve velike grupe unutar familje Lamiaceae.

1.4.4. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja borova

Prema Dervendzi (1992), etarsko ulje borova (Pini aetheroleum) najviše se koristi u

narodnoj medicini za lečenje respiratornih infekcija praćenih kašljem, bronhitisom,

bronhijalnom astom, efizemom, traheitisom, sinuzitisom, laringitisom, faringitisom i

influencom. Pored toga, etarska ulja borova široko se koriste kao aditivi u prehrambenoj i

industriji alkoholnih pića. U mnogim proizvodima namenjenim za čišćenje, ulja borova

poznata su kao osveţavajuća i dezinfekciona sredstva. TakoĎe, ova ulja intenzivno se koriste

u farmaceutskoj, kozmetičkoj i parfimerijskoj industriji.

Na osnovu pregleda literaturnih podataka, moţemo reći da etarsko ulje borova čitav

niz bioloških aktivnosti:

• antibakterijsku i antifungalnu (Toroglu, 2007; Kolayli et al., 2009; Politeo et

al., 2011; Karapandzova et al., 2011; Šarac et al., 2014);

• akaricidnu (Macchioni et al., 2002);

• larvicidnu i repelentnu aktivnost protiv Aedes albopictus (Koutsaviti et al.,

2015);

• antiagregantnu (antitrombocitnu) (Tognolini et al., 2006).

• antioksidativnu (Ustun et al., 2012);

• herbicidnu aktivnost protiv Phalaris canariensis, Trifolium campestre i

Sinapis arvesis (Amri et al., 2014).


13

2. CILJEVI RADA

Osnovni naučni ciljevi ovog istraţivanja mogu se predstaviti u nekoliko teza:

1. Upoznavanje varijabilnosti sastava i sadrţaja etarskog ulja četina u prirodnim

populacijama P. nigra ssp. pallasiana sa područja Srbije, Makedonije i Grčke.

2. PoreĎenje hemijskog sastava etarskog ulja četina dve sestrinske podsekcije (Pinus

i Pinaster) u cilju utvrĎivanja hemotaksonomskog značaja terpena na

mezosistematskom (infrageneričnom) nivou.

3. Definisanje potencijalnih hemotipova istraţivanih podsekcija.

4. PoreĎenje dobijenih rezultata sa morfološkim, biohemijskim i molekularnim

karakterima koji su do sada korišćeni u taksonomiji i sistematici sect. Pinus.


14

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Biljni material

Odabirom populacija P. nigra ssp. pallasiana, sprovedenim tokom 2013. i 2015.

godine, obuhvaćene su 4 populacije sa teritorije centralnog i juţnog Balkana: 1. Jarešnik

(Dukat, Srbija), 2. Mreţičko-Roţden (Koţuf, Makedonija), 3. Tri Vodi (Strumica,

Makedonija), 4. Kalamaras (Olimp, Grčka). Geografski poloţaj populacija je odreĎen uz

pomoć GPS ureĎaja (GPS Garmin eTrex Vista® C). Orografske karakteristike staništa pre

svega nadmorska visina i ekspozicija su preuzeti iz SRTM (Shuttle Radar Topography

Mission) (Reuter et al., 2007) digitalnog elevacionog modela rezolucije 90 x 90 m (Farr et al.,

2007) pomoću softvera ArcGIS 10 (ESRI, 2011) (tabela 3.1). Herbarski primerci deponovani

su u Herbarijumu Departama za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u

Nišu (HMN).

U svakoj od odabranih populacija crnog bora izvršeno je sakupljanje grančica sa

dvogodišnjim četinama sa većeg broja odraslih stabala. U ručnom friţideru ili u specijalnim

kesama sa ledom uzorci su sa mesta sakupljanja prenošeni do zamrzivača (- 20°C) na

skladištenje do momenta upotrebe.

3.2. Izolovanje etarskog ulja

Hidrodestilacija. Iz 100 g sveţih i iseckanih četina P. nigra ssp. pallasiana

(uklonjenih sa grančica 20 različitih individua iz svake ispitivane populacije) destilovano je

etarsko ulje u aparatu tipa Clavenger u toku 2.5 h. Ulje je ekstrahovano etrom, a etarski

ekstrakt sušen anhidrovanim Mg2SO4 (European Pharmacopoeia, 1983). Posle odvajanja

sredstva za sušenje filtracijom, etar je uklonjen destilacijom na rotacionom-vakuum

uparivaču bez zagrevanja, a etarsko ulje čuvano u zatvorenim hromatografskim vijalama na

4°C do analize. Prinos etarskog ulja je izraţen preko zapreminskih procenata (%) tj. v/w,

obračunato u odnosu na 100 g biljnog materijala. 40 µL svakog ulja razblaţeno je etrom do

1mL za dalje hromatografske analize.


15

Tabela 3.1. Geografski poloţaj i stanišne karakteristike odabranih populacija P. nigra ssp. pallasiana.

Takson P. nigra ssp. pallasiana

Lokalitet Srbija: Dukat, Jarešnik Makedonija: Koţuf, Mreţičko-Roţden Makedonija: Strumica, Tri Vodi Grčka: Olimp, Kalamaras

Geografska širina (N) 42°24'7.25'' 41°11'58.72'' 41°24'36.00'' 40°01'40.50''

Geografska duţina (E) 22°23'25.12'' 21°58'31.17'' 22°37'38.00'' 22°41'61.30''

Nadmorska visina (m) 1440 577 320 1536

Ekspozicija SW NW SE SW

Geološka podloga silikat krečnjak silikat krečnjak

Datum sakupljanja 22.07.2013. 05.05.2013. 04.05.2013. 02.10.2015.

Vaučer broj 7027 HMN 7033 HMN 7028 HMN 11960 HMN


16

3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja

Svaki uzorak etarskog ulja rastvoren u etru je sniman u triplikatu na 7890/7000B

gasnom hromatografu (Agilent Technologies, USA) sa Combi PAL auto-semplerom i HP-5

MS kolonom (5% fenil metil siloksan, 30 m x 0.25 mm i.d. i 0.25 µm debljina filma)

kuplovan sa plamenim jonizacionim detektorom 7890A (FID) i masenim detektorom 5977A

(MS). Temperaturni program: izotermalno prvih 2.25 minuta 50 °C, zatim linearni porast

temperature (gradijent 4 °C/min) od 50 do 290 °C. Temperatura injektora 250 °C, interfejsa

300 °C; protok nosećeg gasa – helijuma 1.0 mL/min. Injektovana zapremina ulja 1µL, split

40:1; injektovana zapremina HS isparljivih 500 μL, split 10:1. Bekfleš 1.89 min, na 280 °C,

sa helijumom pod pritiskom od 50 psi. MS uslovi (EI): jonizacija -70 eV, opseg masa 35 –

435 amu (3 skena u sekundi), vreme skenova 0.2 sekunde. GC-FID analiza je izvedena pod

istim eksperimentalnim uslovima kao što je već navedeno za GC-MS analizu. Procentni

sastav je preračunat na osnovu površine GC-FID pikova sa hromatograma snimljenih pod

istim uslovima kao GC-MS, bez korekcionih faktora.

Identifikacija komponenti. Komponente etarskih ulja identifikovane su pomoću

AMDIS softvera (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver.

2.1, DTRA/NIST, 2011), na osnovu lineranih retencionih indeksa (RI), koji su odreĎeni na

osnovu retencionih vremena standardne serije n-alkana (C8-C40), snimljene na istom aparatu i

pod istim uslovima kao i uzorak ulja. RI su uporeĎivani sa literaturnim vrednostima (Adams,

2007 i NIST Chemistry WebBook).

3.4. Literaturni podaci

Hemijski sastav etarskog ulja četina 24 taksona sect. Pinus, uključujući 17 taksona

subsect. Pinus i 7 taksona subsect. Pinaster, uporeĎeno je u cilju utvrĎivanja

hemotaksonomskog značaja terpena na mezosistematskom (infrageneričnom nivou). Sastav

etarskog ulja P. nigra ssp. pallasiana sa područja Srbije, Makedonije i Grčke analiziran je u

ovom radu, a osnovni kriterijumi za izbor literaturnih podataka bili su način izolacije etarskog

ulja (hidrodestilacija) i vrsta organa (četine). Na ovaj način u analizu je uključeno 57 uzoraka

etarskog ulja, dobijenih medotom hidrodestilacije iz četina 24 taksona sect. Pinus (tabela

3.2).


17

Tabela 3.2. Pregled istraţivanih taksona subsect. Pinus i subsect. Pinaster.

R. br.

uzorka

Takson1) Referenca

Podsekcija Pinus

1 P. densiflora Ioannou et al. (2014)

2 P. massoniana Ioannou et al. (2014)

3 P. merkusii Kurose et al. (2007)

4 P. mugo Ioannou et al. (2014)

5 P. mugo var. prostrata Ioannou et al. (2014)

6 P. mugo var. pumilio Ioannou et al. (2014)

7 P. nigra ssp. nigra_1 Krstić (2016)





12 P. nigra ssp. nigra_6 Ioannou et al. (2014)

13 P. nigra ssp. pallasiana_1 ova studija




17 P. nigra ssp. caramanica Ioannou et al. (2014)

18 P. nigra ssp. dalmatica Politeo et al. (2011)

19 P. nigra ssp. laricio_1 Rezzi et al. (2001)

20 P. nigra ssp. laricio_2 Rezzi et al. (2001)

21 P. nigra ssp. laricio_3 Ioannou et al. (2014)

22 P. nigra ssp. laricio_4 Amri et al. (2014)

23 P. nigra ssp. salzmannii Ioannou et al. (2014)

24 P. nigra_1 Koutsaviti et al. (2015)

25 P. nigra_2 Koutsaviti et al. (2015)

26 P. nigra_3 Macchioni et al. (2003)

27 P. nigra_4 Ustun et al. (2012)

28 P. sylvestris_1 Ustun et al. (2012)

29 P. sylvestris_2 Ioannou et al. (2014)

30 P. sylvestris ssp. scotica Ioannou et al. (2014)

31 P. tabuliformis Ioannou et al. (2014)


18

32 P. taiwanensis Ioannou et al. (2014)

33 P. thunbergii Ioannou et al. (2014)

Podsekcija Pinaster

34 P. brutia_1 Koutsaviti et al. (2015)

35 P. brutia_2 Ustun et al. (2012)

36 P. brutia_3 Ioannou et al. (2014)

37 P. brutia_4 Lahlou (2003)

38 P. canariensis_1 Koutsaviti et al. (2015)

39 P. canariensis_2 Ioannou et al. (2014)

40 P. halepensis_1 Koutsaviti et al. (2015)

41 P. halepensis_2 Macchioni et al. (2003)

42 P. halepensis_3 Fekih et al. (2014)

43 P. halepensis_4 Ustun et al. (2012)

44 P. halepensis_5 Ioannou et al. (2014)

45 P. halepensis_6 Lahlou (2003)

46 P. halepensis_7 Dob et al. (2005)

47 P. heldreichii_1 Petrakis et al. (2001)

48 P. heldreichii_2 Ioannou et al. (2014)

49 P. pinaster_1 Koutsaviti et al. (2015)

50 P. pinaster_2 Macchioni et al. (2003)

51 P. pinaster_3 Ioannou et al. (2014)

52 P. pinaster_4 Lahlou (2003)

53 P. pinea_1 Macchioni et al. (2003)

54 P. pinea_2 Ustun et al. (2012)

55 P. pinea_3 Ioannou et al. (2014)

56 P. roxburghii_1 Ioannou et al. (2014)

57 P. roxburghii_2 Satyal et al. (2013)

1) Lista istraţivanih taksona prema klasifikaciji roda Pinus od strane

Gernandt et al. (2005). Taksoni za koje postoji veći broj literaturnih

podataka o terpenskom sastavu četina su numerisani.


19

3.5. Statistička analiza

Deskriptivna statistika. Za komponente koje su detektovane u koncentraciji većoj od

0.5% u etarskom ulju istraţivanih populacija P. nigra ssp. pallasiana, kao i za komponente

pristune u koncentraciji većoj od 2% u minimalno jednom od 57 analiziranih uzoraka sect.

Pinus, uraĎena je osnovna deskriptivna statistika (srednja vrednost, maksimum, minimum,

standardna devijacija i koeficijent varijacije) na osnovu koje je uraĎena analiza varijabilnosti

pojedinačnih hemijskih karaktera. Ovi rezultati su grafički prikazani uz pomoć whisker box

plotova gde je za svaki karakter prikazana njegova hemijska varijabilnost na nivou ispitivane

podvrste, podsekcija i sekcije. Koeficijent varijacije (CV%) je korišćen za opisivanje

hemijske varijabilnosti karaktera i u odnosu na njegove vrednosti karakteri su okarakterisani

kao nisko varijabilni (CV% < 10), umereno varijabilni (10 < CV% < 50), visoko varijabilni

hemijski karakteri (50 < CV% < 100), oni karakteri kod kojih je CV% >100 su okarakterisani

kao jako visoko varijabilni.

Jednofaktorska analiza varijanse (ANOVA) je uraĎena da bi se utvrdilo da li

postoji statistički značajna razlika u prosečnim vrednostima hemijskih karaktera izmeĎu

analiziranih podsekcija (subsect. Pinus i subsect. Pinaster). Osnovni postupak na kome se

zasniva ova tehnika jeste izvoĎenje dve različite ocene varijanse podsekcija iz podataka, za

koje se zatim računa količnik. Jedna od ovih ocena (varijansa izmeĎu grupa) predstavlja meru

efekata nezavisne promenljive udruţene sa varijansom greške. Druga ocena (varijansa unutar

grupa) je mera samo varijanse greške. Količnik varijansi izmeĎu i unutar grupa označava se

kao F-vrednost ili F-količnik. Statistički značajnan F-količnik ukazuje da su prosečne

vrednosti posmatranog karaktera za date podsekcije veoma različite. Za ovu analizu

izdvojene su 34 komponente etarskog ulja koje su detektovane u koncentraciji većoj od 2% u

minimalno jednom od istraţivanih uzoraka.

Klaster analiza. Klaster analiza omogućava grupisanje analiziranih varijabli u grupe

ili klastere tako se da slični uzorci nalaze u istoj klasi (klasteru). U ovoj analizi je korišćen

algomerativni hijerarhijski metod (UPGMA) koji kao krajnji rezultata produkuje fenogram

koji u suštini, moţe da se shvati kao grafički prikaz sličnosti uporeĎivanih grupa. Kako bi se

izračunala distanca analiziranih jedinica posmatranja, korišćena je Euklidova distanca. Ova

analiza je korišćena da bi se utvrdila sličnost izmeĎu prvobitno neklasifikovanih objekata tj.

taksona subsect. Pinus i subsect. Pinaster u ovom slučaju.


20

Statistička obrada podataka je raĎena u statističkom programu Statistica, version 5.1

(StatSoft Inc., 1996, Tulsa, OK, USA).


21

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Hemijski sastav etarskog ulja četina P. nigra ssp. pallasiana

Biljni materijal P. nigra ssp. pallasiana prikupljen je sa četiri lokaliteta na području

Srbije, Makedonije i Grčke tokom 2013. i 2015. godine (tabela 3.1). Iz sveţih četina,

postupkom hidrodestilacije u aparatu po Clevenger-u izolovana su etarska ulja čiji se prinos

nalazi u opsegu 0.16 - 0.29 (v/w) (tabela 4.1). Kombinacijom GC i GC/MS analize u

etarskom ulju istraţivanih populacija detektovano je 114 jedinjenja, od kojih je 96

identifikovano. Kvlatitativni i kvantitativni sastav ulja je dat u tabeli 4.1, pri čemu su

prikazana samo jedinjanja prisutna u koncentraciji većoj od 0.5%, minimalno u jednoj od

ispitivanih populacija. Rezultati deskriptivne statistike za izabrane hemijske karaktere na

nivou podvrste predstavljeni su u tabeli 4.2 i na slici 4.2. Dobijeni hromatogrami za sve

ispitivane populacije su prikazani na slici 4.1.

U etarskom ulju četina ispitivanih populacija P. nigra ssp. pallasiana utvrĎeno je

prisustvo 16 komponenti u koncentraciji većoj od 0.5%: 8 monoterpenskih ugljovodonika, 1

oksidovani monoterpen, 6 seskviterpenskih ugljovodonika i 1 oksidovani diterpen. Prosečno

ove komponete čine 90.7% etarskog ulja, pri čemu su seskviterpeni nešto više zastupljeni

(48.6%) u odnosu na monoterpenske komponente (41.8%) (tabela 4.2).

Dve dominantne komponente u etarskom ulju P. nigra ssp. pallasiana čine zajedno

57.7% ulja: seskviterpenski ugljovodonik, germakren D (13)1 (prosečna zastupljenost 31.6%)

i monoterpenski ugljovodonik, α-pinen (2) (prosečna zastupljenost 26.0%). Za preostale

prikazane komponente moţemo reći da imaju srednje visok sadrţaj (0.5 – 10.0%, prema von

Rudloff, 1975; Lieutier et al., 1991), osim α-tujena i manoil oksida čiji je prosečni sadrţaj

manji od 0.5% na nivou podvrste.

1 Italic brojevi se odnose na redne brojeve u tabeli 4.1.


22

Tabela 4.1. Hemijski sastav etarskog ulja četina u ispitivanim populacijama P. nigra ssp.

pallasiana (prikazana su samo jedinjanja detektovana u koncentraciji većoj od 0.5%; dve

dominantne komponente su boldirane).

Klasa terpena R. br. Komponente Sadrţaj (%)

Dukat Koţuf Strumica Olimp

Monote

pre

nsk

i u

glj

ov

od

onic

i

1 α-tujen 0.67 0.09 0.32 0.60

2 α-pinen 26.28 24.57 29.49 23.75

3 kamfen 0.91 0.67 0.71 0.67

4 β-pinen 10.86 8.76 7.26 4.69

5 mircen 0.99 0.77 0.79 0.83

6 limonen 2.34 1.61 1.86 2.01

7 (E)-β-ocimen 1.01 0.51 0.32 1.63

8 terpinolen 1.66 0.33 0.71 1.56

Oksidovani monoterpen 9 α-terpinil acetat 0.99 5.45 1.09 0.30

Ses

kvit

epre

nsk

i uglj

ovodonic

i 10 β-kariofilen 8.96 13.23 10.80 10.92

11 α-humulen 1.66 2.47 1.76 1.98

12 γ-murolen 0.71 1.56 1.80 0.00

13 germakren D 32.76 25.38 31.93 36.46

14 γ-kadinen 0.46 1.07 0.99 0.67

15 δ-kadinen 1.26 2.69 2.95 1.72

Oksidovani diterpen 16 manoil oksid 0.42 0.27 0.06 0.80

Ukupno 91.94 89.43 92.84 88.59

Monoterpeni 45.71 42.76 42.55 36.04

Seskviterpeni 45.81 46.40 50.23 51.75

Prinos ulja % (v/w) 0.16 0.29 0.28 0.28


23

Slika 4.1. TIC hromatogrami etarskog ulja četina P. nigra ssp. pallasiana A) populacija Dukat i B) populacijaKoţuf

A

B

β-pinen

α-pinen

β-kariofilen germakren D

H2C

H3C CH3

CH3


24

Slika 4.1. TIC hromatogrami etarskog ulja četina P. nigra ssp. pallasiana C) populacija Strumica i D) populacijaOlimp

C

D


25

Tabela 4.2. Rezultati deskriptivne statistike za 16 komponenti etarskog ulja P. nigra ssp.

pallasiana (dve dominantne komponente su boldirane; Avg - srednja vrednost, Min -

minimalna vrednost, Max maksimalna vrednost, St.Dev - standardna devijacija, CV –

koeficijent varijacije).

R. br. Karakter Avg Min Max St.Dev. CV%

1 α-tujen 0.42 0.09 0.67 0.27 63.56

2 α-pinen 26.02 23.75 29.49 2.54 9.76

3 kamfen 0.74 0.67 0.91 0.11 15.53

4 β-pinen 7.89 4.69 10.86 2.60 32.89

5 mircen 0.85 0.77 0.99 0.10 11.81

6 limonen 1.96 1.61 2.34 0.31 15.61

7 (E)-β-ocimen 0.87 0.32 1.63 0.59 67.52

8 terpinolen 1.07 0.33 1.66 0.65 60.98

9 α-terpinil acetat 1.96 0.30 5.45 2.35 120.29

10 β-kariofilen 10.98 8.96 13.23 1.75 15.93

11 α-humulen 1.97 1.66 2.47 0.36 18.33

12 γ-murolen 1.02 0.00 1.80 0.82 80.97

13 germakren D 31.63 25.38 36.46 4.61 14.57

14 γ-kadinen 0.80 0.46 1.07 0.28 35.57

15 δ-kadinen 2.16 1.26 2.95 0.80 37.01

16 manoil oksid 0.39 0.06 0.80 0.31 80.55

monotepreni 41.77 36.04 45.71 4.08 9.77

seskviterpeni 48.55 45.81 51.75 2.90 5.97


26

Prosečan hemijski profil glavnih terpenskih komponenti (preko 5%) u etarskom ulju

P. nigra ssp. pallasiana moţemo predstaviti na sledeći način:

Germakren D >> α-Pinen >> ß-Kariofilen > ß-Pinen

(> označava razliku 1.1-5.0%, >> razliku 5.1-15.0%, prema Petrakis et al., 2001).

Ako uporedimo redosled dominantnih terpena izmeĎu ispitivanih populacija, moţemo

primetiti da je u svim populacijama germakren D prva, a α-pinen druga dominantna

komponenta, dok je redosled treće i četvrte komponente promenjiv. Naime, jedino je u

populaciji sa područja Srbije (Dukat) ß-pinen treća, a ß-kariofilen četvrta dominantna

komponenta, dok je u svim ostalim populacijama situacija obrnuta (slika 4.3).

Slika 4.2. Whisker plot za 16 komponenti etarskog ulja P. nigra ssp. pallasiana


27

Koeficijent varijacije (CV%). Vrednosti koeficijenta varijacije kod ispitivanih

komponenti etarskog ulja P. nigra ssp. pallasiana variraju u opsegu od 9.8% do 120.3%

(tabela 4.2). Jako visok koeficijent varijacije CV%>100 pokazuje samo α-terpinil acetat, dok

γ-murolen, manoil oksid, (E)-ß-ocimen, α-tujen i terpinolen pokazuju visok nivo ovog

koeficijenta (50<CV%<100). Svi ostali hemijski karakteri pokazuju umeren nivo koeficijenta

varijacije (10<CV%<50), sa izuzetkom druge dominantne komponente α-pinena koji se moţe

okarakterisati kao nisko varijabilan karakter u ispitivanim populacijama (CV% <10).

Germakren D varira u opsegu od 25.4% do 36.5%. Najniţe vrednosti ovog karaktera

zabeleţene su u populaciji Koţuf, a najviše u populaciji Olimp. Germakren D spada u

karaktere sa umerenom varijabilnošću (CV% = 14.6) (tabele 4.1 i 4.2).

α-Pinen varira u opsegu od 23.8% do 29.5% i spada u nisko varijabilne karaktere

(CV% = 9.8). Najniţe vrednosti ovog karaktera zabeleţene su u populaciji Olimp, a najviše u

populaciji Strumica.

Slika 4.3. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) etarskog ulja četina u istraţivanim populacijama

P. nigra ssp. pallasiana


28

ß-Kariofilen varira u opsegu od 9.0% do 13.2%. Najniţe vrednosti ovog karaktera su

zabeleţene su u populaciji Dukat, a najviše u populaciji Koţuf. Kao i germakren D, spada u

karaktere sa umerenom varijabilnošću (CV% = 15.9).

ß-Pinen varira u opsegu od 4.7% do 10.9% i takoĎe spada u karaktere sa umerenom

varijabilnošću (CV% = 32.9). Najniţe vrednosti ovog karaktera zabeleţene su u populaciji

Olimp, a najviše u populaciji Dukat.

4.2. Hemijski sastav etarskog ulja četina podsekcije Pinus

Za komponente etarskog ulja koje su detektovane u koncentraciji većoj od 2% u

minimalno jednom od 33 ispitivana uzorka subsect. Pinus (tabela 3.2), uraĎena je osnovna

deskriptivna statistika (srednja vrednost, maksimum, minimum, standardna devijacija i

koeficijent varijacije) na osnovu koje je uraĎena analiza varijabilnosti pojedinačnih hemijskih

karaktera (tabela 4.2). Ovi rezultati su grafički prikazani uz pomoć whisker box plota gde je

za svaki karakter prikazana njegova hemijska varijabilnost na nivou ispitivane podsekcije

(slika 4.4).

U etarskom ulju subsect. Pinus utvrĎeno je prisustvo 33 komponente detektovane u

koncentraciji većoj od 2% u minimalno jednom od ispitivanih uzoraka. Prosečno ove

komponete čine 86.6% etarskog ulja, pri čemu su monotepreni nešto više zastupljeni (45.4%)

u odnosu na seskviterpenske komponente (38.8%). Diterpeni su, kao što je i očekivano,

najslabije zastupljena klasa terpenoidnih jedinjenja u analiziranim etarskim uljima (2.5%)

(tabela 4.3).

Dve dominantne komponente u etarskom ulju subsect. Pinus čine zajedno 41.01%

ulja: monoterpenski ugljovodonik, α-pinen (1)2 (prosečna zastupljenost 21.8%) i

seskviterpenski ugljovodonik, germakren D (22) (prosečna zastupljenost 19.2%). Srednje

visok sadrţaj (0.5 – 10.0%, prema von Rudloff, 1975; Lieutier et al., 1991) ima 20

komponenti, dok je preostalih 11 prikazanih jedinjenja zastupljeno u koncentraciji ispod

0.5% na nivou podsekcije (tabela 4.3).



29

Tabela 4.3. Rezultati deskriptivne statistike za 33 komponente etarskog ulja subsect. Pinus

(dve dominantne komponente su boldirane; Avg - srednja vrednost, Min - minimalna

vrednost, Max maksimalna vrednost, St.Dev - standardna devijacija, CV – koeficijent

varijacije).

R. br. Karakter Avg Min Max St.Dev CV%

1 α-pinen 21.84 2.10 44.20 10.21 46.74

2 kamfen 1.38 0.00 6.50 1.42 103.43

3 sabinen 0.33 0.00 4.80 0.86 258.05

4 β-pinen 7.88 0.40 21.30 5.89 74.81

5 mircen 2.24 0.00 7.70 2.05 91.42

6 δ-3-karen 1.77 0.00 16.10 4.17 235.68

7 limonen 2.62 0.00 12.50 2.71 103.29

8 β-felandren 1.66 0.00 15.60 3.75 226.27

9 (E)-β-ocimen 0.99 0.00 3.00 0.80 80.33

10 γ-terpinen 0.11 0.00 0.80 0.18 157.12

11 terpinolen 1.19 0.00 5.60 1.22 103.21

12 terpinen-4-ol 0.05 0.00 0.60 0.12 218.11

13 α-terpineol 0.42 0.00 2.30 0.61 145.69

14 timol metil etar 0.19 0.00 2.50 0.54 284.83

15 linalil acetat 0.21 0.00 2.00 0.44 206.20

16 bornil acetat 1.61 0.00 14.10 2.84 176.83


18 β-kariofilen 10.95 2.60 43.10 7.11 64.95

19 β-kopaen 0.24 0.00 3.90 0.67 276.03

20 α-humulen 1.97 0.00 9.00 1.58 80.35

21 γ-murolen 0.51 0.00 2.58 0.75 147.07

22 germakren D 19.17 0.00 38.21 11.35 59.20

23 feniletil-2-metil

butanoat 0.14 0.00 2.60 0.46 331.89

24 biciklogermakren 0.86 0.00 6.00 1.79 209.21


butanoat 0.22 0.00 2.30 0.57 262.66

26 δ-amorfen 0.21 0.00 2.50 0.44 213.85

27 γ-kadinen 0.81 0.00 3.80 0.78 95.75

28 δ-kadinen 2.40 0.00 9.00 1.87 77.85

29 kariofilen oksid 0.61 0.00 11.90 2.06 337.70


30

30 α-kadinol 1.01 0.00 4.30 1.32 130.30

31 kembren 0.08 0.00 1.20 0.27 353.93

32 manoil oksid 2.38 0.00 38.00 7.57 318.60

33 abietadien 0.02 0.00 0.22 0.06 284.51

monoterpeni 45.38 11.60 74.50 13.51 29.77

seskviterpeni 38.75 14.40 70.80 13.70 35.35

diterpeni 2.47 0.00 38.00 7.55 305.55

Prosečan hemijski profil glavnih terpenskih komponenti (preko 5%; slika 4.6) u

etarskom ulju subsect. Pinus moţemo predstaviti na sledeći način:

α-Pinen > Germakren D >> ß-Kariofilen > ß-Pinen


Slika 4.4. Whisker plot za 33 komponente etarskog ulja subsect. Pinus


31


komponenti etarskog ulja subsect. Pinus variraju u opsegu od 46.7% do 353.9% (tabela 4.3).

Jako visok koeficijent varijacije (CV%>300) pokazuju 4 komponente: kembren, kariofilen

oksid, feniletil-2-metil butanoat i manoil oksid, dok visok nivo koeficijenta varijacije

(200<CV%<300) ispoljava čak 11 komponenti etarskog ulja. U kategorijama umereno

(100<CV%<200) i nisko (10<CV%<100) varijabilnih karaktera nalazi se po 9 komponenti

etarskog ulja.

Prva dominantna komponenta u etarskom ulju subsect. Pinus, α-pinen, spada u

kategoriju nisko varijabilnih karaktera, sa najniţom vrednosti koeficijenta varijacije u odnosu

na sve ostale komponente (CV% = 46.7). Preostale tri dominantne komponente (germakren

D, β-kariofilen i β-pinen), takoĎe, spadaju u nisko varijabilne karaketere (10<CV%<100).

4.3. Hemijski sastav etarskog ulja četina podsekcije Pinaster

U etarskom ulju subsect. Pinaster utvrĎeno je prisustvo 33 komponente, detektovane

u koncentraciji većoj od 2% u minimalno jednom od ispitivanih uzoraka (tabela 4.4 i slika

4.5). Prosečno ove komponete čine 79.8% etarskog ulja, pri čemu monotepreni dominiraju

(50.05%) u odnosu na seskviterpenske komponente (28.19%). Diterpeni su, kao što je i

očekivano, najslabije zastupljena klasa terpenoidnih jedinjenja u analiziranim etarskim uljima

(1.5%).

Iako je isti broj komponenti detektovan i u Pinus uljima (tabel 4.3), ineteresanto je

napomenuti da je biciklogermakren komponenta koja odlikuje isključivo Pinus, a gvajol

Pinaster ulja. Odnos mono- i seskviterpena je sličan u obe istraţivane podsekcije, iako je

monoterpenska frakcija nešto jače zastupljena u Pinaster, a seskviterpenska u Pinus uljima

(monoterpeni/seskviterpeni = 45.4%/38.8%, tabela 4.3).

Dve dominantne komponente u etarskom ulju subsect. Pinaster čine zajedno 27.3%

ulja: seskviterpenski ugljovodonik, β-kariofilen (18)3 (prosečna zastupljenost 13.9%) i

monoterpenski ugljovodonik, α-pinen (1) (prosečna zastupljenost 13.4%). Srednje visok

sadrţaj (0.5 – 10.0%, prema von Rudloff, 1975; Lieutier et al., 1991) ima 17 komponenti, dok



32

je preostalih 14 prikazanih jedinjenja zastupljeno u koncentraciji ispod 0.5% na nivou

podsekcije (tabela 4.3).

Tabela 4.4. Rezultati deskriptivne statistike za 33 komponente etarskog ulja subsect. Pinaster

(dve dominantne komponente su boldirane; Avg – srednja vrednost, Min – minimalna

vrednost, Max maksimalna vrednost, St.Dev – standardna devijacija, CV – koeficijent

varijacije).

R. br. Karakter Avg Min Max St.Dev CV%

1 α-pinen 13.40 0.40 28.90 7.25 54.09

2 kamfen 0.34 0.00 1.50 0.38 112.17

3 sabinen 1.21 0.00 9.40 2.37 194.85

4 β-pinen 12.00 0.00 47.50 16.77 139.76

5 mircen 5.59 0.20 27.90 7.84 140.32

6 δ-3-karen 2.25 0.00 18.60 4.76 211.22

7 limonen 7.53 0.00 58.90 14.69 195.11

8 β-felandren 0.70 0.00 6.70 1.39 197.33

9 (E)-β-ocimen 0.44 0.00 1.70 0.55 123.30

10 γ-terpinen 0.41 0.00 2.80 0.75 182.97

11 terpinolen 2.23 0.00 10.50 3.50 156.55

12 terpinen-4-ol 1.82 0.00 30.10 6.16 338.20

13 α-terpineol 1.07 0.00 6.30 1.70 158.72

14 timol metil etar 0.05 0.00 1.20 0.24 489.90

15 linalil acetat 0.08 0.00 1.20 0.27 358.74

16 bornil acetat 0.36 0.00 5.30 1.06 293.28


18 β-kariofilen 13.86 0.00 40.31 9.86 71.16

19 β-kopaen 0.04 0.00 0.40 0.09 246.33

20 α-humulen 2.80 0.50 7.92 2.18 77.85

21 γ-murolen 0.44 0.00 6.80 1.38 311.71

22 germakren D 8.60 0.00 55.80 13.99 162.56


butanoat

0.11 0.00 1.00 0.25 225.96


butanoat 1.15 0.00 7.70 2.13 184.98

25 δ-amorfen 0.06 0.00 0.60 0.15 244.31

26 γ-kadinen 0.18 0.00 1.50 0.41 228.64


33

27 δ-kadinen 1.01 0.00 4.20 1.25 123.47

28 kariofilen oksid 0.37 0.00 1.20 0.38 101.36

29 gvajol 0.67 0.00 4.00 1.24 184.65

30 α-kadinol 0.15 0.00 1.30 0.29 192.62

31 kembren 0.80 0.00 6.50 1.89 237.19

32 manoil oksid 0.03 0.00 0.30 0.09 275.05

33 abietadien 0.69 0.00 14.80 3.02 439.25

monoterpeni 50.05 6.32 81.30 24.80 49.55

seskviterpeni 28.19 10.80 68.20 15.42 54.71

diterpeni 1.52 0.00 14.80 3.41 224.62

Prosečni hemijski profil glavnih terpenskih komponenti (preko 5%; slika 4.6) u

etarskom ulju subsect. Pinaster moţemo predstaviti na sledeći način:

β-Kariofilen ~ α-Pinen > ß-Pinen > Germakren D

(> označava razliku 1.1-5.0%, prema Petrakis et al., 2001).

Slika 4.5. Whisker plot za 33 komponente etarskog ulja subsect. Pinaster


34

Ako uporedimo dominantne terpene izmeĎu ispitivanih podsekcija (Pinus i Pinaster),

moţemo primetiti da obe podsekcije odlikuje dominacija 4 iste komponente, ali u drugačijem

redosledu (slika 4.6): dok su dok su u Pinus uljima α-pinen i germakren D dve

najzastupljenije komponete, u Pinaster uljima β-kariofilen i α-pinen imaju najveći sadrţaj.

TakoĎe, ineteresanto je da u Pinus uljima prve dve dominantne komponete čine zajedno čak

40% ulja, dok u Pinaster uljima prve tri komponete zajedno imaju toliki sadrţaj.


komponenti etarskog ulja subsect. Pinaster variraju u opsegu od 54.1% do 489.9% (tabela

4.4). Jako visok koeficijent varijacije (CV%>300) pokazuje 5 komponenti (timol metil etar,

abietadien, linalil acetat, terpinen-4-ol i γ-murolen), dok 9 komponenti ispoljava visok nivo

koeficijenta varijacije (200<CV%<300). U kategoriji umereno varijabilnih karaktera

(100<CV%<200) nalazi se najveći broj (16), a u kategoriji nisko varijabilnih (10<CV%<100)

najmanji broj (3) komponenti etarskog ulja.

Prve dve dominantne komponente u etarskom ulju subsect. Pinaster, β-kariofilen i α-

pinen, spadaju u kategoriju nisko varijabilnih karaktera, sa najniţim vrednostima koeficijenta

varijacije u odnosu na sve ostale komponente (CV% = 71.2 i 54.1, respektivno). Treća i

Slika 4.6 Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) u etarskom ulja četina

subsect. Pinus i subsect. Pinaster


35

četvrta dominantna komponenta (β-pinen i germakren D) spadaju u umereno varijabilne

karaktere (10<CV%<100), kao i najveći broj komponeti Pinaster ulja.

4.4. Analiza varijanse (ANOVA)

U cilju utvrĎivanja da li postoji statistički značajna razlika u prosečnim vrednostima

hemijskih karaktera (terpena) izmeĎu analiziranih podsekcija (subsect. Pinus i subsect.

Pinaster) uraĎena je analiza varijnse (ANOVA). ANOVA ili disperziona analiza, predstavlja

analitički model za testiranje značajnosti razlika izmeĎu srednjih vrednosti ispitivanih grupa,

koji omogućava izdvajanje karaktera koji su statistički značajni za izdvajanje i diferencijaciju

ispitivanih grupa (Petz, 1985; Bojović i Mitrović, 2010).

Za ANOVA izdvojene su 34 komponente etarskog ulja koje su detektovane u

koncentraciji većoj od 2% u minimalno jednom od istraţivanih uzoraka (tabela 4.5). Prema

rezultatima ANOVA analize moţe se videti 15, od ukupno 34 ispitivana karaktera, poseduje

visok nivo statističke značajnosti, što ukazuje na to da postoji statistički značajna razlika

izmeĎu ispitivanih podsekcija. Najveći nivo statističke značajnosti (P<0.001) pokazuju γ-

kadinen i kamfen, a zatim slede α-pinen, δ-kadinen, germakren D, α-kadinol, gvajol i (E)-β-

ocimen (P<0.01). Najmanji nivo statističke značajnosti (P<0.05) poseduju feniletil-3-metil

butanoat, mircen, biciklogermakren, γ-terpinen, kembren, α-terpineol i bornil acetat.

Tabela 4.5. Koeficijenti dobijeni ANOVA analizom (karakteri koji poseduju statističku

značajnost su boldirani; nivoi statističke značajnosti: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001).

R. br. Karakter F P

1 α-pinen 11.99 **

2 kamfen 12.11 ***

3 sabinen 3.91

4 β-pinen 1.71

5 mircen 5.54 *

6 δ-3-karen 0.17

7 limonen 3.54

8 β-felandren 1.40

9 (E)-β-ocimen 8.52 **

10 γ-terpinen 4.80 *


36

11 terpinolen 2.55

12 terpinen-4-ol 2.74

13 α-terpineol 4.19 *

14 timol metil etar 1.38

15 linalil acetat 1.87

16 bornil acetat 4.16 *

17 α-terpinil acetat 1.04

18 β-kariofilen 1.68

19 β-kopaen 2.21

20 α-humulen 2.78

21 γ-murolen 0.05

22 germakren D 9.90 **

23 feniletil-2-metil butanoat 0.06

24 biciklogermakren 5.46 *

25 feniletil-3-metil butanoat 5.79 *

26 δ-amorfen 2.35

27 γ-kadinen 13.19 ***

28 δ-kadinen 9.95 **

29 kariofilen oksid 0.32

30 gvajol 9.75 **

31 α-kadinol 9.87 **

32 kembren 4.70 *

33 manoil oksid 2.29

34 abietadien 1.62

Ukoliko izdvojimo prvih osam komponenti etarskog ulja, koje pokazuju najveće

nivoe statističke značajnost (P<0.001 i P<0.01), hemotipovi istraţivanih podsekcija se mogu

predstaviti na sledeći način:

1. Hemotip subsect. Pinus – etarska ulja sadrţe veći procenat γ-kadinena (0.8%),

kamfena (1.4%), α-pinena (21.8%), δ-kadinena (2.4%), germakrena D (19.2%), α-

kadinola (1.0%) i (E)-β-ocimena (1.0%), dok guaiol nije detektovan.

2. Hemtip subsect. Pinaster – etarska ulja sadrţe manji procenat γ-kadinena (0.2%),



37

kadinola (0.2%) i (E)-β-ocimena (0.4%), dok je guaiol detektovan u prosečnoj

koncentraciji od 0.7%.

Lista istraţivanih taksona subsect. Pinus i subsect. Pinaster prikazana je u poglavlju

3.4. "Literaturni podaci", a prati klasifikaciju roda Pinus od strane Gernandt et al. (2005).

Naime, Gernandt et al. (2005) su na osnovu varijabilnosti hloroplastnih DNA sekvenci (matK

i rbcL) ukazali na postojanje dve grupe vrsta u okviru sect. Pinus (tabela 1.1). S obzirom da

je ova dihotomija takoĎe potvrĎena i od strane Wang et al. (1999), na osnovu analize 4

hloroplastne DNA sekvence, moţemo zaključiti da molekularni markeri jasno ukazuju na

postojanje dve sestrinske klade u okviru sect. Pinus uključujući "prave" mediteranske borove

sa jedne (subsect. Pinaster) i evroazijske borove sa druge strane (subsect. Pinus).

MeĎutim, Gernandt et al. (2005) navode da analiza matriksa kvalitativnih morfoloških

karaktera nije otkrila nijedan diskriminišući karakter izmeĎu navedenih podsekcija, s obzirom

da vrste obe podsekcije odlikuje trajni rukavac, broj iglica u čuperku od dve do tri, spoljašnji

ili medijalni poloţaj smolnih kanala, zrele šišarke se otvaraju nakon odreĎenog vremena,

debele plodne ljuspe sa dorzalnim poloţajem štita (umbo) i krilce koje je labavo vezano za

seme.

Kaundun i Leberton (2010) su po prvi put uspešno okarakterisali podsekcije Pinus i

Pinaster na osnovu morfometrije četina i količine metilisanog flavonola izoramnetina.

Podsekciju Pinus odlikuju relativno kraće četine (88 mm vs. 126 mmm), manja količina

metilisanog flavonola izoramnetina (IRh: 17% vs. 28%) kao i manji sadrţaj ukupnih

metilisanih flavonola - izoramnetina, laricitrina i siringetina zajedno (MeO indeks: 17 vs. 36).

S obzirom da izoramnetin nastaje od kvercetina nepovratnom reakcijom O-metil-transferaze,

taksoni koji nemaju sposobnost sinteze ovog metilisanog flavonola mogu se smatrati

ancestralnim (primitivnijim) i obrnuto. Na ovaj način, subsect. Pinus se moţe smatrati

primitivnijom u odnosu na subsect. Pinaster, meĎutim umesto zaključivanja o direktnoj vezi,

autori smatraju da je prikladnije predloţiti postojanje dve odvojene grupe na različitim

nivoima evolucije.


38

4.5. Klaster analiza (CA)

Klaster analiza na osnovu 57 uzoraka etarskog ulja (dobijenih metodom

hidrodestilacije) iz četina 24 taksona sect. Pinus ukazala je na izdvajanje 5 grupa, pri čemu

prve 3 grupe čine predstavnici podsekcije Pinaster (sa izuzetkom P. merkusii), a druge dve

članovi podsekcije Pinus (sa izuzetkom P. canariensis). Ovakvi rezultati se u velikoj meri

poklapaju sa dosadašnjim morfološkim, biohemijskim i molekularnim istraţivanjima koji

takoĎe jasno ukazuju na postojanje dve sestrinske klade u okviru sect. Pinus uključujući

"prave" mediteranske borove sa jedne (subsect. Pinaster) i evroazijske borove sa druge strane

(subsect. Pinus) (Wang et al., 1999; Gernandt et al., 2005; Kaundun i Leberton, 2010).

Na prikazanom dendogramu (slika 4.7) moţemo uočiti da prve tri grupe taksona čine

isključivo predstavnici podsekcije Pinaster sa izuzetkom vrste P. merkusii. Pinus merkusii je

azijska vrsta čija je prirodna distribucija ograničena na Vijetnam, KamboĎţu, Filipine,

Maleziju i Indoneziju, pri čemu se jedna populacija nalazi juţno od ekvatora na Sumatri. Na

ovaj način, P. merkusii predstavlja jedinu vrstu bora koja se prirodno javlja na juţnoj

Zemljinoj polulopti. Iako je ova vrsta na osnovu varijabilnosti dve cpDNK sekvence (matK i

rbcL) svrstana u subsect. Pinus (Gernandt et al., 2005) sa ostalim azijskim Diploxylon

borovima, nekoliko dosadašnjih morfoloških i fitohemijskih studija je već ukazalo na

distinktan poloţaj P. merkusii (Cooling, 1968; Weissmann i Lange, 1987; Szmidt et al.,

1996). Pored toga, udaljenost od ostalih azijskih predstavika subect. Pinus na molekularnom

nivou objavili su Wang i Szmidt (1993) na osnovu cpDNA restrikcionih mesta, Liston et al.

(1999) na osnovu jedarnog ITS regiona i Wang et al. (1999) na osnovu 4 cpDNA sekvence.

Pretpostavljeno je da je distinktan karakter P. merkusii rezultat rane separacije i duge

izolacije ove vrste u odnosu na ostale azijske predstavnike. Prema Mirov (1967), tokom

perioda Jure i Krede tropski borovi su bili prisutni u jugoisočnoj Aziji. Moguće je da je vrsta

P. merkusii nastavila svoj nezavistan razvoj u ovom regionu još od tog perioda, dok su ostale

azijske vrste migrirale u severoistočnu Aziju početkom Tercijara (Mirov, 1967). Uzimajući u

obzir sve ove činjenice kao i rezultate ovog rada, vrsta P. merkusii bi mogla biti isključena iz

subsect. Pinus. Sličan predlog dao je i Frankis (1993), koji je na osnovu sličnosti šišarki P.

merkusii i P. brutia, azijsku vrstu P. merkusii svrstao u subsect. Pinaster zajedno sa ostalim

mediteranskim borovima. Ipak, uzimajući u obzir nekonzistentnost karaktera dostupnih

morfoloških i molekularnih dokaza, dodatne studije su neophodne za svrstavanje ove vrste u

jednu ili drugu podsekciju.


39

Slika 4.7. Dendogram na onovu "Ward's method (Euclidean distances)" 34 terpenske komponente etarskog ulja iz četina

17 taksona subsect. Pinus i 7 taksona subsect. Pinaster

Pin

as

ter

Pin

as

ter

Pin

as

ter

Pin

us

Pin

us


40

Četvrtu grupu taksona čine predstavnici subsect. Pinus i po jedan uzorak P. pinaster i

P. heldreichii, dok se ostali uzorci ovih vrsta nalaze u okviru prve tri Pinaster grupe. Pinus

heldreichii (munika) je tercijarni relikt i subendemit Balkanskog poluostrva, sa malim

dopunskim arealom u juţnoj Italiji (Mirov, 1967). Taksonomski poloţaj munike je dugo

vremena bio nejasan i kontraverzan: Shaw (1914) je opisuje kao varijetet P. nigra; Mirov

(1967) je prvi ukazao na mogućnost da se radi o posebnoj vrsti s obzirom na potpuno

drugačiji terpenski sastav četina u odnosu na P. nigra; Klaus (1989) je zatim tretira kao

nezavisnu vrstu čiji su najbliţi srodnici P. nigra, P. sylvestris i azijski Diploxylon borovi

(subsect. Pinus); Schirone et al. (1991), na osnovu analize proteina semena, ukazuju na

intermedijarni poloţaj P. heldreichii izmeĎu mediteranskih (subsect. Pinaster) i evropskih

Diploxylon borova ("serija" sylvestres u okviru subsect. Pinus). MeĎutim, najnovija

molekularna istraţivanja jasno potvrĎuju distinktan taksonomski status ove retke i ugroţene

vrste kao i činjenicu da se njeni najbliţi srodnici ipak nalaze u okviru grupe "pravih"

mediteranskih borova (subsect. Pinaster) (Wang et al., 1999; Gernandt et al., 2005). S

obzirom da su ovom radu analizirana samo dva uzorka etaskog ulja P. heldreichii, pri čemu

se jedan nalazi u okviru Pinaster, a drugi u okviru Pinus grupe, za donošenje definitinvog

zaključka o poloţaju ovog kontraverznog taksona na osnovu terpenskih markera, trebalo bi

povećati broj ispitivanih uzoraka. Za sada moţemo reći da naši rezultati najpribliţniji gledištu

Schirone et al. (1991).

Petu grupu, kao i prethodnu čine predstavnici subsect. Pinus zajedno sa P.

canariensis, vrstom koja je endemična za Kanarska ostrva u Atlanskom okeanu. Iako su sve

dosadašnje studije nedvosmilsno svrstale ovu vrstu u subsect. Pinaster, izolovanost ostvrskih

populacija P. canariensis u odnosu na ostale mediteranske borove mogla se odraziti i na

drugačiji sastav etarskih ulja, po čemu je ona očigledno bliţa subsect. Pinus.


41

5. ZAKLJUČCI

1. U etarskom ulju četina iz četiri autohtone populacije P. nigra ssp. pallasiana sa područja

Srbije, Makedonije i Grčke detektovano je 114 jedinjenja, od kojih je 96 indentifikovano.

Od toga je samo 16 jedinjenja zastupljeno u koncentraciji većoj od 0.5%, pri čemu ove

komponente, u proseku, čine oko 90.7% ulja. Seskviterpenske komponente su nešto više

zastupljene (48.6%) u odnosu na monoterpene (41.8%), dok oksidovani diterpen (manoil

oksid) učestvuje sa svega 0.4%. Prosečan hemijski profil glavnih terpenskih kompinenti

(preko 5%) se moţe predstaviti na sledeći način:

Germakren D >> α-Pinen >> ß-Kariofilen > ß-Pinen


2. U etarskom ulju subsect. Pinus utvrĎeno je prisustvo 33 komponente detektovane u

koncentraciji većoj od 2% u minimalno jednom od 33 ispitivana uzoraka. Prosečno ove

komponete čine 86.6% etarskog ulja, pri čemu su monotepreni nešto više zastupljeni

(45.4%) u odnosu na seskviterpenske komponente (38.8%). Diterpeni su, kao što je i

očekivano, najslabije zastupljena klasa terpenoidnih jedinjenja u analiziranim etarskim

uljima (2.5%). Prosečan hemijski profil glavnih terpenskih komponenti (preko 5%) u

etarskom ulju subsect. Pinus moţemo predstaviti na sledeći način:

α-Pinen > Germakren D >> ß-Kariofilen > ß-Pinen

3. U etarskom ulju subsect. Pinaster utvrĎeno je prisustvo 33 komponente, detektovane u

koncentraciji većoj od 2% u minimalno jednom od 24 ispitivana uzorka. Prosečno ove

komponete čine 79.8% etarskog ulja, pri čemu monotepreni dominiraju (50.05%) u

odnosu na seskviterpenske komponente (28.19%). Diterpeni su, kao što je i očekivano,

najslabije zastupljena klasa terpenoidnih jedinjenja u analiziranim etarskim uljima

(1.5%). Iako je isti broj komponenti detektovan i u uljima subsect. Pinus, ineteresanto je

napomenuti da je biciklogermakren komponenta koja odlikuje isključivo Pinus, a guaiol

Pinaster ulja. Odnos mono- i seskviterpena je sličan u obe istraţivane podsekcije, iako je

monoterpenska frakcija nešto jače zastupljena u u Pinaster, a seskviterpenska u Pinus


42

uljima. Prosečni hemijski profil glavnih terpenskih komponenti (preko 5%) u etarskom

ulju subsect. Pinaster moţemo predstaviti na sledeći način:

β-Kariofilen ~ α-Pinen > ß-Pinen > Germakren D

4. Prema rezultatima ANOVA moţe se videti 15, od ukupno 34 ispitivana karaktera,

poseduje visok nivo statističke značajnosti, što ukazuje na to da postoji statistički

značajna razlika izmeĎu ispitivanih podsekcija. Najveći nivo statističke značajnosti

(P<0.001) pokazuju γ-kadinen i kamfen, a zatim slede α-pinen, δ-kadinen, germakren D,

α-kadinol, guaiol i (E)-β-ocimen (P<0.01). Najmanji nivo statističke značajnosti (P<0.05)

poseduju feniletil-3-metil butanoat, mircen, biciklogermakren, γ-terpinen, kembren, α-

terpineol i bornil acetat. Na ovaj način, hemotipovi istraţivanih podsekcija se mogu

predstaviti na sledeći način:

Hemotip subsect. Pinus – etarska ulja sadrţe veći procenat γ-kadinena (0.8%), kamfena

(1.4%), α-pinena (21.8%), δ-kadinena (2.4%), germakrena D (19.2%), α-kadinola

(1.0%) i (E)-β-ocimena (1.0%), dok guaiol nije detektovan.

Hemtip subsect. Pinaster – etarska ulja sadrţe manji procenat γ-kadinena (0.2%),


kadinola (0.2%) i (E)-β-ocimena (0.4%), dok je guaiol detektovan u prosečnoj

koncentraciji od 0.7%.

5. Klaster analiza (CA) na osnovu 57 uzoraka etarskog ulja (dobijenih metodom

hidrodestilacije) iz četina 24 taksona sect. Pinus ukazala je na izdvajanje 5 grupa, pri

čemu prve 3 grupe čine predstavnici podsekcije Pinaster (sa izuzetkom P. merkusii), a

druge dve članovi podsekcije Pinus (sa izuzetkom P. canariensis). Ovakvi rezultati se u

velikoj meri poklapaju sa dosadašnjim morfološkim, biohemijskim i molekularnim

istraţivanjima koji jasno ukazuju na postojanje dve klade u okviru sekcije Pinus

uključujući "prave" mediteranske borove sa jedne (subsect. Pinaster) i evroazijske borove

sa druge strane (subsect. Pinus). TakoĎe, rezultati ovog rada potvrĎuju značaj terpena kao

hemotaksonomskih markera na infrageneričnom nivou.


43

6. LITERATURA

Adams R. P. 1991. Analysis of juniper and other forest tree oils. In: Linskins H. F., Jackson J.

F., editors. Modern methods of plant analysis. Springler, Berlin, pp. 131-157.

Adams R. P. 2007. Identification of Essential Oil Component by Gas

Chromatography/Quadrupole Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation,

Carol Stream, IL.

Amri I., Hanana M., Jamoussi B., Hamrouni L. 2014. Essential oils of Pinus nigra J.F.

Arnold subsp. laricio Maire: Chemical composition and study of their herbicidal

potential. Arabian J. Chem. doi:10.1016/j.arabjc.2014.05.026.

Cooling E. N. G. 1968. Pinus merkusii. Commonwealth Forestry In- stitute, Department of

Forestry, Oxford University, Oxford.

Dervendzi V. 1992. Sovremeno lekuvanje so lekoviti bilki, Tabernakul, Skopje.

Dob T., Berramdane T., Chelgoum C. 2005. Chemical composition of essential oil of Pinus

halepensis Miller growing in Algeria. C. R. Chim. 8, 1939-1945.

European Pharmacopoeia. 1997: Biological tests. 3th ed. Paris: Council of Europe, 123–7.

Farr T. G., Rosen P. A., Caro E., Crippen R., Duren R., Hensley S., Kobrick M., Paller M.,

Rodriguez E., Roth L., Seal D., Shaffer S., Shimada J., Umland J., Werner M.,Oskin

M., Burbank D., Alsdorf D. 2007. The shuttle radar topography mission. Rev.

Geophys. 45, RG2004. 10.1029/2005RG000183.

Fekih N., Allali H., Merghache S., Chaib F., Merghache D., Dib M. A., Djabou N., Muselli

A., Tabti B., Costa J. 2014. Chemical composition and antibacterial activity of Pinus

halepensis Miller growing in West Northern of Algeria. Asian Pac. J. Trop. Dis. 4,

97-103.

Frankis M. P. 1993. Morphology and affinities of Pintis brutia. In International Symposium

on Pinus brutia Ten., 11-18. Ministry of Forestry, Ankara.

Gašić M. J. 1985. Etarska ulja. IHTM, Beograd.


44

Gaussen H., Heywood V. H., Charter A. O. 1993. Pinus L.. In: Tutin T. G., Heywood V. H.,

Burges N. A., Valentine D. H., Walters S. M., Webb B. A., editors. Flora Europea.

Vol. 1, 2nd edn. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 40-44.

Gernandt D. S., Geada López G., Ortiz García S., Liston A. 2005. Phylogeny and

classification of Pinus. Taxon 54, 29-42.

Hanover J. W. 1992. Applications of terpene analysis in forest genetics. New Forest. 6, 159-

178.

Ioannou E., Koutsaviti A., Tzakou O., Roussis V. 2014. The genus Pinus: a comparative

study on the needle essential oil composition of 46 pine species. Phytochem. Rev.

DOI 10.1007/s11101-014-9338-4.

Jovanović B. 1992. P. nigra Arn. In: Sarić M, editor. Flora Srbije 1. Srpska akademija nauka

i umetnosti, Beograd, pp. 200-202.

Karapandzova M., Stefkova G., Cvetkovikj I., Trajkovska-Dokik E., Kaftandzieva A.,

Kulevanova S. 2014. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential

oils of Pinus peuce (Pinaceae) growing wild in R. Macedonia. Nat. Prod. Commun. 9,

1623-1628.

Kaundun S. S., Lebreton Ph. 2010. Taxonomy and systematic of the genus Pinus based on

morphological, biogeographical and biochemical characters. Plant Syst. Evol. 284, 1-

15.

Klaus W. 1989. Mediterranean pines and their history. Plant Syst. Evol. 162, 133-163.

Kolayli S., Ocak M., Aliyazicioglu R., Karaoglu S. 2009. Chemical analysis and biological

activities of essential oils from trunk-barks of 8 trees. Asian J. Chem. 21, 2684-2694.

Koutsaviti K., Giatropoulos A., Pitarokili D., Papachristos D., Michaelakis A., Tzakou O.

2015. Greek Pinus essential oils: larvicidal activity and repellency against Aedes

albopictus (Diptera: Culicidae). Parasitol. Res. 114, 583-592.

Kovačević N. 2004. Osnovi farmakognozije. Treće izdanje. Srpaska školska knjiga, Beograd.

Krstić N. 2016. Vrijabilnost terpena u prirodnim populacijama Pinus nigra Arnold: uticaj

ekoloških parametara i načina izolacije. Master rad. Prirodno-matematički fakultet,

Univerzitet u Nišu.


45

Kurose K., Okamura D., Yatagai M. 2007. Composition of the essential oils from the leaves

of nine Pinus species and the cones of three of Pinus species. Flavour Frag. J. 22, 10-

20.

Lagalante A. F., Montgomery M. E. 2003. Analysis of terpenoids from Hemlock (Tsuga)

species by solid-phase microextraction/gas chromatography/ion-trap mass

spectrometry. J. Agric. Food Chem. 51, 2115-2120.

Lahlou M. 2003. Composition and molluscicidal properties of essential oils of five Moroccan

Pinaceae. Pharm. Biol. 41, 207-210.

Liston A., Robinson W. A., Pinero D., Alvarez-Buylla E. R. 1999. Phylogenetics of Pinus

(Pinaceae) based on nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer region

sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 11, 95-109.

Little E. L., Critchfield W. B. 1969. Subdivisions of the genus Pinus (Pines). USDA

Miscellaneous Publication 1144, Washington, DC.

Macchioni F., Cioni P. L., Flamini G., Morelli I., Maccioni S., Ansaldi M. 2003. Chemical

composition of essential oils from needles, branches and cones of Pinus pinea, P.

halepensis, P. pinaster and P. nigra from central Italy. Flavour Fragr. J. 18, 139-143.

Macchioni F., Cioni P. L., Flamini G., Morelli I., Perrucci S., Franceschi A., Macchioni G.,

Ceccarini L. 2002. Acaricidal activity of pine essential oils and their main

components against Tyrophagus putrescentiae, a stored food mite. J. Agric. Food

Chem. 50, 4586-4588.

Marin P. D. 2003. Biohemijska i molekularna sistematika biljaka. NNK international,

Beograd.

Mirov N. T. 1967. The genus Pinus. Ronald Press Company, New York, NY.

Nikolić B., Ristić M., Bojović S., Marin P. D. 2007. Variability of the needle essential oils of

Pinus heldreichii from different populations in Montenegro and Serbia. Chem.

Biodiversity 4, 905-916.

Nikolić B., Ristić M., Bojović S., Marin P. D. 2008. Variability of the needle essential oils of

Pinus peuce from different populations in Montenegro and Serbia. Chem.

Biodiversity 5, 1377-1388.


46

Nikolić B., Ristić M., Tešević V., Marin P. D., Bojović S. 2011. Terpene chemodiversity of

relict conifers Picea omorika, Pinus heldreichii, and Pinus peuce, endemic to Balkan.

Chem. Biodiversity 8, 2247-2260.

Nikolić B., Tešević V., ĐorĎević I., Marin P. D., Bojović S. 2009. Essential oil variability in

natural populations of Picea omorika, a rare European conifer. Chem. Biodiversity 6,

193-203.

Petrakis P. V., Tsitsimpikou C., Tzakou O., Couladis M., Vagias C., Roussis V. 2001. Needle

volatiles from five Pinus species growing in Greece. Flavour Fragr. J. 16, 249-252.

Petrović S., Maksimović Z., Kundaković T. 2009. Analiza sastojaka biljnih droga. Priručnik

za teorijsku i praktičnu nastavu iz predmeta Farmakognozija. Farmaceutski fakultet,

Beograd.

Politeo O., Skocibusic M., Maravic A., Ruscic M., Milos M. 2011. Chemical composition

and antimicrobial activity of the essential oil of endemic Dalmatian black pine (Pinus

nigra ssp. dalmatica). Chem. Biodiversity 8, 540-547.

Rajevski L. 1950: Nalazište Pinus nigra Arn. var. pallasiana (Lamb.) u okolini Bosilegrada.

Zbornik radova Instituta za ekologiju i biogeografiju, Srpska Akademija Nauka i

Umetnosti, Beograd.

Reuter H. I., Nelson A., Jarvis, A. 2007. An evaluation of void filling interpolation methods

for SRTM data. Int. J. Geogr. Inf. Sci. 21, 983-1008.

Rezzi S., Bighelli A., Mouillot D., Casanova J. 2001. Composition and chemical variability

of the needle essential oil of Pinus nigra subsp. laricio from Corsica. Flavour Fragr. J.

16, 379-383.

Satyal P., Paudel P., Raut J., Deo A., Dosoky N. S., Setzer W. N. 2013. Volatile constituents

of Pinus roxburghii from Nepal. Pharmacognosy Res. 5, 43-48.

Schirone B., Piovesan G., Bellarosa R., Pelosi C. 1991. A taxonomic analysis of seed proteins

in Pinus spp. (Pinaceae). Plant Syst. Evol. 178, 43-53.

Shaw G. R. 1914. The genus Pinus. Publication of Arnold Arboretum Number 5. Riverside

Press, Cambridge, MA.

Simić N. 2000. Hemijsko i mikrobiološko ispitivanje domaćih vrsta roda Achillea L..

Doktorska disertacija. Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Nišu.


47

Syring J., Willyard A., Cronn R., Liston A. 2005. Evolutionary relationships among Pinus

(Pinaceae) subsections inferred from multiple low-copy nuclear loci. Am. J. Bot. 92,

2086-2100.

Szmidt A. E., Wang X.-R., Changtragoon S. 1996. Contrasting patterns of genetic diversity in

two tropical pines: Pinus kesiya (Royle ex Gordon) and P. merkusii (Jungh et De

Vriese). Theor. Appl. Genet. 92, 436-441.

Šarac Z. 2014. UtvrĎivanje varijabilnosti i diferencijacije prirodnih populacija Pinus nigra

Arnold u Srbiji korišćenjem fitohemijskih i molekularnih markera. Doktorska

disertacija. Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu.

Šarac Z., Matejić J. S., Stojanović-Radić Z. Z., Veselinović J. B., Dţamić A. M., Bojović S.,

Marin P. D. 2014. Biological activity of Pinus nigra terpenes – evaluation of FtsZ

inhibition by selected compounds as contribution to their antimicrobial activity.

Comput. Biol. Med. 54, 72-78.

Tognolini M., Barocelli E., Ballabeni V., Bruni R., Bianchi A., Chiavarini M., Impicciatore

M. 2006. Comparative screening of plant essential oils: phenylpropanoid moiety as

basic core for antiplatelet activity. Life Sci. 78, 1419-1432.

Toroglu S. 2007. In vitro antimicrobial activity and antagonistic effect of essential oils from

plant species. J. Environ. Biol. 28, 551-559.

Ustun O., Senol F. S., Kurkcuoglu M., Erdogan Orhan I., Kartal M., Baser K. H. C. 2012.

Investigation on chemical composition, anticholinesterase and antioxidant activities of

extracts and essential oils of Turkish Pinus species and pycnogenol. Ind. Crops. Prod.

38, 115-123.

Vidaković M. 1982. Četinjače. Morfologija i varijabilnost. JAZU i Sveučilišna naklada Liber,

Zagreb.

Wang X. R., Tsumura Y., Yoshimaru H., Nagasaka K., Szmidt A. E. 1999. Phylogenetic

relationships of Eurasian pines (Pinus, Pinaceae) based on chloroplast rbcL, matK,

rpl20-rps18 spacer, and trnV intron sequences. Am. J. Bot. 86, 1742-1753.

Wang X.-R., Szmidt A. E. 1993. Chloroplast DNA-based phylogeny of Asian Pinus species

(Pinaceae). Plant Syst. Evol. 188, 197-211.


48

Weissmann V. G., Lange W. 1987. Zusammensetzung der Neutralteile des

Balsamkolophoniums von Pinus massoniana Lamb., Pinus merkusii Jungh. und Pinus

luchuensis Mayr. Holzforschung 41, 147-154.

Zlatković B., Šarac Z. 2016. Praktikum iz sistematike biljaka. Prirodno-matematički fakultet,

Univerzitet u Nišu.

Прилог5/1

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Јелена Стевановић

Ментор, МН: Зорица С. Митић

Наслов рада, НР: Хемотаксономска карактеризација подсекција Pinus и Pinaster

(Pinus, Pinaceae) на основу терпенских маркера Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2016.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

48 страна; 9 слика; 8 табела

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Ботаника

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: subsect. Pinus, subsect. Pinaster, терпени, хемотаксономија УДК 582.475 : 581.573

Чува се, ЧУ: Библиотека Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Хемијски састав етарског уља четина 24 таксона sect.

Pinus, укључујући 17 таксона subsect. Pinus и 7 таксона subsect.

Pinaster, упоређен је у циљу утврђивања хемотаксономског

значаја терпена на мезосистематском (инфрагенеричном

нивоу). Састав етарског уља P. nigra ssp. pallasiana са подручја

Србије, Македоније и Грчке анализиран је у овом раду, а

основни критеријуми за избор литературних података били су

начин изолације етарског уља (хидродестилација) и врста

органа (четине). На основу анализе варијансе (ANOVA) може се

видети да 15, од укупно 34 испитивана терпенска карактера,

поседује висок ниво статистичке значајности, што указује на то

да постоји статистички значајна разлика између испитиваних

подсекција. Кластер анализа (CA) указала је на издвајање 5

група таксона, при чему прве 3 групе чине представници

subsect. Pinaster (са изузетком P. merkusii), а друге две чланови

subsect. Pinus (са изузетком P. canariensis). Датум прихватања теме, ДП: 31.08.2016.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије,

КО:

Председник: Др Гордана Стојановић

Члан: Др Бојан Златковић

Члан, ментор: Др Зорица Митић

Образац Q4.09.13- Издање 1

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Jelena Stevanović

Mentor, MN: Zorica S. Mitić

Title, TI: Chemotaxonomic characterisation of subsections Pinus and Pinaster (Pinus,

Pinaceae) based on terpene markers

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2016

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/a

ppendixes)

48 p.; 9 pictures; 8 tables

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Botany

Subject/Key words, S/KW: subsect. Pinus, subsect. Pinaster, terpenes, chemotaxonomy

UC 582.475 : 581.573

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: The chemical composition of needle essential oils of 24 taxa from the section

Pinus, including 17 and 7 taxa of subsections Pinus and Pinaster, respectively,

were compared in order to determine chemotaxonomic significance of terpenes

on mesosystematic (infrageneric) level. The composition of essential oils in P.

nigra ssp. pallasiana from Serbia, Macedonia and Greece was analyzed in this

paper, while the basic criteria for selection of literature data included the

method of essential oil isolation (hydrodistillation) and the type of conifer organs

(needles). According to the results of analysis of variance (ANOVA), out of 34

examined terpene characters 15 had a high level of statistical significance,

indicating statistically significant difference between the examined subsections.

Cluster analysis (CA) has shown separation of five groups of taxa, where first

three groups included representatives of subsect. Pinaster (with the exception

of P. merkusii), and the other two members of subsect. Pinus (with the

exception of P. canariensis).

Accepted by the Scientific Board

on, ASB:

31.08.2016.

Defended on, DE:

Defended

Board,

DB:

President: Dr. Gordana Stojanović

Member: Dr. Bojan Zlatković

Member, Mentor: Dr. Zorica Mitić

ОбразацQ4.09.13- Издање 1

Documents

Hemotaksonomska karakterizacija podsekcija Pinus i...Hemijski sastav etarskog ulja četina 24 taksona sekcije Pinus, uključujući 17 taksona podsekcije Pinus i 7 taksona podsekcije