UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

MASTER RAD

Tehnološka karakterizacija bakterija mlečne kiseline izolovanih

iz peglane kobasice

Mentor: Kandidat:

Prof. dr Nataša Joković Jelena Vujić, 231

Niš, 2018.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

MASTER RAD

Tehnološka karakterizacija bakterija mlečne kiseline

izolovanih iz peglane kobasice

Mentor: Kandidat:

Prof. dr Nataša Joković Jelena Vujić, 231

Niš, 2018.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Technological characterization of lactic acid bacteria

isolated from “peglana” sausage

Master thesis

Mentor: Candidate:

PhD Nataša Joković Jelena Vujić, 231

Niš, 2018.

Zahvalnica

Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Nataši Joković na velikoj profesionalnosti,

angažovanosti i pomoći oko izrade master rada.

Posebno se zahvaljujem asistentu Stanković Nikoli koji mi je pomogao da uspešno i na vreme

obavim laboratorijski deo ovog rada.

Biografija

Jelena Vujić je rođena 11. maja 1994. godine u Nišu. Osnovnu školu “Đura Jakšić” u Jelašnici

završava 2009. god. sa odličnim uspehom. Nakon toga upisuje srednju Ugostiteljsko-turističku

školu u Nišu, smer Turistički tehničar, koju završava 2013. sa odličnim uspehom. Iste godine

upisuje Osnovne akademske studije na Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-

matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu i završava 2016. godine sa prosečnom ocenom 8,79.

Master akademske studije, smer Biologija upisuje iste godine i završava 2018. sa prosečnom

ocenom 9.44.

Sažetak

Bakterije mlečne kiseline (BMK) su Gram-pozitivne bakterije koje žive na obogaćenim

podlogama. Koriste se kao starter kulture pri porizvodnji fermentisanih proizvoda, među kojima

su kobasice. U ovom radu rađena je tehnološka karakterizacija bakterija mlečne kiseline izolovanih

iz peglane kobasice. Korišćeni su izolati identifikovani kao Lactobacillus sakei (31 soj),

Lactobacillus curvatus (5 sojeva), Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (1 soj),

Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (4 soja), Weissella viridescens (10 soja),

Carnobacterium maltaromaticum (2 soja), Carnobacterium divergens (1 soj), kao i

Staphylococcus hominis (1 soj), Staphylococcus capitis (1 soj) i Staphylococcus sp. (2 soja) koji

ne pripadaju grupi BMK. Ispitan je rast izolata na: niskim temperaturama, podlogama sa različitim

koncentracijama NaCl, začina i aw vrednostima. Rađeno je ispitivanje produkcije određenih

enzima (lipaze, proteinaze, nitrat reduktaze, ureaze, citrate liaze), sinteze egzopolisaharida i

antimikrobnih supstanci. Utvrđeno je da BMK rastu na niskim temperaturama, na podlogama sa

različitim koncentracijama NaCl i začina i na podlogama sa visokim aw vrednostima. Neki izolati

BMK produkuju citrat liaze, sintetišu egzopolisaharide i antimikrobne supstance. Rezultati su

pokazali da BMK mogu da se koriste kao starter kulture pri proizvodnji kobasica, ali uz dodatak

drugih bakterija koje imaju sve one osobine koje su značajne za dobijanje kvalitetnog proizvoda.

Ključne reči: peglana kobasica, bakterije mlečne kiseline, tehnološke karakteristike

Abstract

Lactic acid bacteria (LAB) are Gram-positive bacteria that live in enriched supstrate. They are

used as starter cultures in production of fermented products, among which are sausages. In this

paper, the technological caracterization of lactic acid bacteria isolated from “peglana” sausage was

done. The isolates were identified as Lactobacillus sakei (31 strains), Lactobacillus curvatus (5

strains), Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (1 strain), Leuconostoc mesenteroides ssp.

dextranicum (4 strains), Weissella viridescens (10 strains), Carnobacterium maltaromaticum (2

strains), Carnobacterium divergens (1 strain), as well as Staphylococcus hominis (1 strain),

Staphylococcus capitis (1 strain) and Staphylococcus sp. (2 strains) which don’t belong to the LAB

group. The isolates growth was tested on: low temperature, substrates with different concentration

of NaCl, spices and aw value. Testing of various enzymes production was also performed (lipase,

proteinase, nitrate reductase, urease, citrate lyase), as well as synthesis of egzopolysaccharides and

antimicrobial substances. It was established that LAB growth in low temperature, on substrates

with different concentration of NaCl and spices and on substrates with high aw value. Some LAB

isolates produced citrate lyase, synthesized egzopolysaccharides and antimicrobial substances.

Results showed that characterized LAB isolated could be used as starter cultures in sausages

production, but with the addition of other bacteria that have all the features that are significant for

getting quality product.

Key words: “peglana” sausage, lactic acid bacteria, technological characteristics

Sadržaj

1. UVOD -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1

1.1. Bakterije mlečne kiseline ------------------------------------------------------------------------------- 1

1.2. Bakterije mlečne kiseline u kobasicama -------------------------------------------------------------- 4

1.3. Tehnološka svojstva bakterija mlečne kiseline značajna za starter kulture u kobasicama ---- 5

1.3.1. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija ------------------------------------------------------ 5

1.3.2. Enzimska aktivnost bakterija mlečne kiseline -------------------------------------------------- 6

1.3.3. Katabolizam citrata --------------------------------------------------------------------------------- 8

1.3.4. Sinteza egzopolisaharida --------------------------------------------------------------------------- 9

1.3.5. Sinteza antimikrobnih supstanci ------------------------------------------------------------------ 9

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ------------------------------------------------------------------------------ 11

3. MATERIJAL I METODE ------------------------------------------------------------------------------- 12

3.1. Bakterijski sojevi ---------------------------------------------------------------------------------------- 12

3.2. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija ---------------------------------------------------------- 12

3.3. Sinteza enzima ------------------------------------------------------------------------------------------- 13

3.4. Razgradnja citrata --------------------------------------------------------------------------------------- 15

3.5. Sinteza egzopolisaharida ------------------------------------------------------------------------------- 15

3.6. Sinteza antimikrobnih supstanci ---------------------------------------------------------------------- 15

3.7. Kriva rasta ------------------------------------------------------------------------------------------------ 16

4. REZULTATI I DISKUSIJA ----------------------------------------------------------------------------- 16

4.1. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija ---------------------------------------------------------- 17

4.2. Sinteza enzima ------------------------------------------------------------------------------------------- 23

4.3. Razgradnja citrata --------------------------------------------------------------------------------------- 27

4.4. Sinteza egzopolisaharida ------------------------------------------------------------------------------- 28

4.5. Antimikrobna aktivnost -------------------------------------------------------------------------------- 28

4.6. Kriva rasta ------------------------------------------------------------------------------------------------ 31

5. ZAKLJUČAK --------------------------------------------------------------------------------------------- 33

LITERATURA ----------------------------------------------------------------------------------------------- 35

1

1.UVOD

1.1. Bakterije mlečne kiseline

Bakterije mlečne kiseline (BMK) spadaju u jednu od najstarijih grupa organizama na

Zemlji. Smatra se da su nastale pre 2,75 milijardi godina o čemu nam svedoče fosilni ostaci

pronađeni u sedimentima. Ovde spadaju Gram-pozitivne koke i bacili, koje imaju mali broj guanin-

citozin parova u genomu. Ne produkuju enzim katalazu, pa zbog toga ne mogu da razgrađuju

vodonik peroksid. Ne poseduju citohrome tako da spadaju u grupu mikroaerofilnih ili anaerobnih

mikroorganizama. Istraživanje je pokazalo da ukoliko se u supstrat stavi hem, bakterije počinju da

sntetišu katalaze i citohrome (Hutkins, 2006). Ne produkuju spore.

BMK se gaje na podlogama koje su bogate šećerima, vitaminima, amino kiselinama,

purinima i pirimidinima. Kao glavni izvor energije iz podloge koriste glukozu. Katabolizmom

glukoze nastaje piruvat, koji ulazi u proces mlečne fermentacije zbog nedostatka citohroma i

elektronskog transportnog lanca. Sinteza mlečne kiseline je osnovna karakteristika ovih bakterija.

BMK se dele na homofermentativne i heterofermentativne bakterije. Kod

homofermentativnih bakterija krajnji produkti fermentacije glukoze su 2 mola ATP i 2 mola

mlečne kiseline (laktat). Krajnji produkti heterofementativnih bakterija su 1 mol ATP, 1 mol

laktata, 1 mol etanola i 1 mol CO2. Mlečna kiselina može da ima dva optički aktivna oblika, D(+)

i D(-). Prisustvo D(-) oblika u fermentisanim proizvodima nije poželjno jer humane ćelije ne mogu

da ga metabolišu, što može da izazove acidozu.

BMK nemaju štetan efekat na ljudsko zdravlje osim nekih pripadnika roda Streptococcus

koje izazivaju bolesti poput upale pluća, miokarditisa, meningitisa itd. Veliki broj vrsta pripada

normalnoj flori usne duplje, gastrointestinalnog trakta i vagine kod sisara. Mogu da se nađu u

mleku i mlečnim proizvodima, mesu i piću.

Poslednjih godina BMK imaju veliku primenu u industriji fermentisane hrane. FDA (Food

and Drug Administration) je ovim mikroorganizmima dodelio GRAS (Generaly Recognized As

2

Safe) status, što omogućava njihovu bezbednu upotrebu u industriji hrane. Produkti nastali tokom

rasta BMK i fermentacije u hrani utiču na teksturu i ukus hrane.

Produkcija mlečne kiseline snižava pH vrednost supstrata pri čemu se inhibira rast drugih

mikroorganizama. BMK se dodaju kao starter kulture pri proizvodnji jogurta, kefira, kiselog

mleka, pavlake, sireva i drugih proizvoda.

Red Lactobacialles poseduje nekoliko rodova koji pripadaju grupi bakterija mlečne

kiseline. Najznačajniji rodovi BMK čiji su predstavnici značajni u mikrobiologiji hrane su:

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Oenococcus, Enterococcus,

Streptococcus i Weissella.

Rod Lactobacillus

Laktobacili predstavljaju jednu vrlo heterogenu grupu bakterija. Mogu da budu različitog

oblika, od kratkih do veoma dugih štapića povezanih u lance. Takođe mogu da imaju i kokoidni

oblik (kokobacili). Nalaze se u usnoj duplji, gastrointestinalnom i urogenitalnom traktu sisara.

Mogu izazvati kvarenje mlečnih i mesnih proizvoda, piva, vina i voća. Dele se na:

1. obligatno homofermentativne koji katabolišu samo heksoze. Lactobacillus delbrueckii

subsp. bulgaricus dodaje se kao starter kultura pri proizvodnji jogurta, a Lactobacillus helveticus za

proizvodnju sireva. Lactobacillus acidophilus je izolovan iz gastrointestinalnog trakta ljudi a koristi

se kao probiotska bakterija za proizvodnju mlečnih napitaka i probiotskih preparata;

2. fakultativno heterofermentativne koji fermentišu heksoze i pentoze, a iz glukonata

produkuju gas. Ovde spadaju Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei, Lactobacillus

rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus i Lactobacillus sakei. Lb. paracasei, Lb.

casei i Lb. rhamnosus dodaju se kao starter kulture pri proizvodnji sireva. Lb. plantarum se dodaje

kao starter kultura pri proizvodnji kobasica i kiselog kupusa. Lb. curvatus i Lb. sakei se dodaju kao

starter kultura pri proizvodnji proizvoda od mesa;

3. obligatno heterofermentativne koji fermentišu heksoze do laktata, sirćetne kiseline, CO2 i

etanola. Lactobacillus sanfranciscensis se koristi za proizvodnju kiselog testa, Lactobacillus kefiri i

Lactobacillus kefiranofaciens za proizvodnju kefira dok je Lactobacillus reuteri probiotska bakterija

izolovana iz gastrointestinalnog trakta čoveka.

Rod Lactococcus

Laktokoke su okrugle nepokretne bakterije u okviru kojih postoji pet vrsta: Lactococcus

garvieae, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis i Lactococcus

3

lactis sa tri podvrste Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis i Lc. lactis subsp. hordniae. Lc.

plantarum se nalazi na površini biljaka. Lc. garvieae izaziva mastitis kod krava. Meso lososa sadrži

vrstu Lc. piscium. Na površini kože i u sirovom mleku domaćih životinja nalazi se vrsta Lc.

raffinolactis. U mlečnim proizvodima su najčešće prisutne Lc. lactis subsp. lactis i Lc. lactis subsp.

cremoris. Podvrsta Lc. lactis subsp. lactis ima varijetet Lc. lactis subsp. lactis biovarijetet diacetylactis

koja ima sposobnost da metaboliše citrat i da proizvodi aromatična jedinjenja (acetaldehid, acetoin,

2-3 butandiol i diacetil). Sposobnost da metaboliše citrat je kodirana genima na plazmidima, pa je to

veoma varijabilna osobina. Spadaju u grupu mezofilnih homofermentativnih bakterija koje sintetišu

L(+) laktat.

Osnovna uloga laktokoka je snižavanje pH vrednosti supstrata, proteoliza i sinteza jedinjenja

koja utiču na organoleptička svojstva hrane.

Rod Leuconostoc

U okviru ovog roda postoji veoma značajna vrsta Leuconostoc mesenteroides sa nekoliko

podvrsta: mesenteroides, dextranicum i cremoris. Mogu da se nađu na površini svežih biljaka, a

učestvuju u fermentaciji kobasica, žitarica, povrća i mlečnih proizvoda. Kokoidnog su oblika.

Pripadaju mezofilnim heterofermentativnim bakterijama, koje produkuju CO2, etanol i D(-) laktat.

Izoluju se iz sireva i kefira, a sintezom acetaldehida, etanola, diacetila i egzopolisaharida poboljšavaju

organoleptička svojstva hrane.

Rod Pediococcus

Vrste u okviru ovog roda su okruglog oblika i nakon ćelijske deobe formiraju tetrade.

Pediococcus acidilactici i Pediococcus pentosaceus se koriste kao starter kulture pri proizvodnji

kobasica i fermentisanog povrća. Mezofilne su i homofermentativne bakterije koje produkuju L(+)

oblik mlečne kiseline. Šećer laktozu slabo katabolišu. Podnose nisku pH vrednost sredine i

halotolerantne su, što znaci da podnose visoku koncentraciju soli u podlozi.

Rod Enterococcus

Enterokoke su specifične po tome što imaju okrugle i malo izdužene ćelije, udružene u parove

ili lance. Termofilne su i heterofermentativne bakterije koje produkuju L(+) oblik mlečne kiseline.

Mogu da se nađu u vodi, zemljištu, na površini biljaka, u hrani i mogu da preživljavaju različite uslove

sredine. U gastrointestinalnom traktu čoveka, kao pripadnici normalne flore javljaju se vrste

Enetrococcus faecalis i Enterococcus faecium. Ove dve vrste kao i vrsta E. durans izolovane su iz

mlečnih proizvoda, kao posledica loših higijenskih uslova proizvodnje. Podstiču zrenje sireva kao što

4

su čedar sir, mocarela, feta, zahvaljujući svojoj proteolitičkoj aktivnosti i sintezi različitih jedinjenja

koja daju aromu proizvodu. Usled pada imuniteta mogu da izazovu različite bolesti, pa se nazivaju

opurtunističkim patogenima. U svom genomu poseduju gene za rezistenciju na antibiotike.

Rod Weissella

Pripadnici roda Weissella su mezofilne heterofermentativne bakterije koje produkuju D(-)

mlečnu kiselinu katabolizmom ugljenih hidrata. Po svojoj morfologiji spadaju u veoma kratke i

napravilne štapiće ili kokoidne bakterije. Njihovo prirodno stanište je biljni materijal ali su izolovani

iz mleka, mlečnih proizvoda i kobasica. Najznačajniji su u fermentaciji kiselog povrća.

1.2. Bakterije mlečne kiseline u kobasicama

Svaki deo sveta je prepoznatljiv po tradicionalnoj proizvodnji fermentisanih kobasica. U

različitim fazama zrenja kobasica, sastav mikrobnih populacija se menja. Tokom svake faze se

izoluju mikroorganizmi i vrši se njihova identifikacija do nivoa vrste i soja zahvaljujući

savremenim molekularnim metodama. BMK su najdominantnije vrste bakterija u ovim

proizvodima. Pored BMK, nalaze se i druge vrste bakterija, kao što su enterokoke, mikrokoke,

zatim kvasci i plesni. Svaka grupa mikroorganizama obavlja određenu funkciju, što se odražava

na kvalitet i organoleptička svojstva proizvoda.

BMK produkuju bakteriocine i mlečnu kiselinu inhibirajući rast patogenih

mikroorganizama. Na taj način proizvod ostaje stabilan i dugotrajan. Enterokoke se dodaju zbog

svoje lipolitičke aktivnosti, proteolitičke aktivnosti, redukcije nitrata i stabilizacije boje proizvoda.

Tradicionalna proizvodnja kobasica ne zahteva dodavanje starter kultura, što se odražava na ukus

i kvalitet proizvoda. U prehrambenoj industriji se prilikom proizvodnje kobasica dodaju starter

kulture koje vrše proces fermentacije pod kontrolisanim uslovima. Smatra se da su kobasice

dobijene na tradicionalan način boljeg kvaliteta od onih koje se proizvode u industriji. Veoma

često se dodaje starter kultura čiji sastav mikroorganizma nije prilagođen uslovima koji vladaju u

mesu. Slaba aktivnost ili nedostatak aktivnosti tih mikroorganizama se direktno odražava na ukus

i kvalitet proizvoda. Zato se u novije vreme vrši selekcija autohtonih starter kultura koje potiču iz

tradicionalnih mesnih proizvoda i koje će se lakše prilagoditi uslovima koji vladaju u mesu.

5

1.3. Tehnološka svojstva bakterija mlečne kiseline značajna za starter kulture

u kobasicama

U tehnološke karakteristike bakterija koje su značajne za proizvodnju kobasica svrstavaju se

sve one osobine starter kultura koje su pogodne za dobijanje kvalitetnog proizvoda. Neke od tih

osobina su određene genetičkim metaboličkim potencijalom vrste bakterija, kao što su produkcija

određenih enzima (lipaze, proteinaze, citrat liaze, ureaze, nitratne reduktaze i dr.), sinteza

anitmikrobnih jedinjenja i egzopolisaharida. Određene osobine zavise od spoljašnjih uslova sredine u

kojoj se nalaze bakterije pri fermentaciji kobasica poput temperature mesa (nadeva), aktivnosti vode,

količine NaCl kao i pH vrednosti koja se menja tokom zrenja kobasica, zbog sineteze mlečne kiseline

u procesu fementacije.

1.3.1. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija

U odnosu na temperaturni opseg sve mikroorganizme možemo da podelimo na: psihrofilne

(6-10oC), mezofilne (20-40oC) i termofilne (45-65oC). Bakterije mlečne kiseline su najčešće

mezofilne i termofilne. Optimalna temperatura na kojoj rastu bakterije mlečne kiseline je 30oC. BMK

imaju duže generacijsko vreme u odnosu na patogene bakterije. Neke vrste mogu da rastu na 4oC u

frižideru, pa se na taj način ponašaju kao psihrofili. U zavisnosti od načina sušenja kobasica, različite

vrste će preživljavati rezličite temperature. Lb. curvatus i Lb. sakei se koriste kao starter kulture za

proizvodnju sirovih fermentisanih kobasica i drugih proizvoda od mesa. Takvi proizvodi se pakuju

u vakuum ambalaži i čuvaju na temperaturi ispod 5oC. Vrste u okviru roda Pediococcus vrše

fermentaciju na visokim temperaturama i dodaju se kao stareter kulture pri proizvodnji kobasica.Vrste

u okviru roda Leuconostoc se takođe mogu koristiti kao starter kulture pri proizvodnji kobasica, a

fermentaciju vrše na niskoj temperaturi (Kegalj et al., 2012).

Povećana količina vode, odnosno vlage u kobasicama omogućava patogenima brži razvoj pri

fermentaciji kobasica. Dodavanjem NaCl smanjuje se količina vode u kobasici i sprečava se razvoj

svih mikroorganizama koji bi izazvali njeno kvarenje. Često se kao zamena za NaCl dodaje nitritna

so koja daje mesu crvenu boju.

Tehnološka funkcija NaCl je da iz komadića mesa ekstrahuje proteine koji povezuju

komadiće mesa sa komadićima masnog tkiva, što doprinosi razvoju čvrste teksture tokom sušenja i

zrenja kobasica (Lilić et al., 2013). Uobičajena količina NaCl koja se dodaje nadevu za proizvodnju

kobasica je 26-30 g/kg nadeva. Različita koncentracija soli deluje inhibitorno na različite vrste

6

patogena. Vrstu Clostridium botulinum tip E inhibira 5% soli, vrstu Clostridium botulinum tip B 10%,

vrstu Staphylococcus aureus 18% a vrstu Halobacterium halobium inhibira 26% soli u nadevu.

Povišena koncentracija NaCl u mesu smanjuje aktivnost BMK, ali čini proizvod

kompaktijim i čvršćim. Da bi se podstakla aktivnost BMK i da bi proizvod bio kompaktniji dodaju

se manja koncentracija NaCl i određene koncentracije hloridnih soli kalijuma, kalcijuma i

magnezijuma.

Voda predstavlja važan faktor za opstanak svih mikroorganizama. U različitim sredinama

voda je zastupljena u različitim količinama. Neke vrste mikroorganizama mogu da opstanu u jako

sušnim uslovima sredine. Za mikroorganizme nije bitna količina vode u okruženju, već njena

dostupnost. Voda može biti slobodna i vezana. Slobodna voda je ona koju koriste mikroorganizmi.

Ukoliko su za vodu vezani šećeri, soli ili neka druga jedinjenja za takvu vodu kažemo da je vezana i

mikroorganizmi ne mogu da je koriste. Količina slobodne vode u određenoj sredini se označava kao

aktivnost vode (aw). To je ona količina vode koja je neophodna za odvijanje brojnih reakcija.

Optimalna količina vode u svežem mesu je veća od 0,97, a optimalna aw za većinu bakterija je od 0,93

do 0,99. Ukoliko je aw u mesu manje od 0,90 onda se tu razvijaju gljivice (Kegalj et al., 2012).

pH vrednost predstavlja količinu slobodnih vodonikovih protona (H+ ) u rastvoru, odnosno

supstratu. Poznato je da se pH vrednost fermentisanih proizvoda menja zbog aktivnosti BMK. BMK

vrše fermentaciju i u tom slučaju se oslobađaju kiseline koje menjaju pH vrednost proizvoda. Ove

kiseline mogu da inhibiraju rast patogenih ali i nepatogenih mikroorganizama. Sirćetna kiselina ima

jači efekat na kvasce i plesni nego mlečna kiselina. Mlečna kiselina koju sintetišu bakterije može da

deluje inhibitorno na njih, ukoliko se njena količina poveća, tj. ukoliko je pH vrednost niža u odnosu

na onu koje bakterije tolerišu.

Optimalna pH vrednost za većinu bakterija je 6,5-7,0. Neke vrste mikroorganizama mogu da

rastu u širokom rasponu pH vrednosti 4,0-9,5. Acidofilne bakterije mogu da prežive kada je pH manja

od 4,0 (Kegalj et al., 2012).

1.3.2. Enzimska aktivnost bakterija mlečne kiseline

Lipolitička aktivnost

Lipaze su enzimi koji vrše hidrolizu, odnosno razgradnju lipida na masne kiseline i glicerol,

a daljom razgradnjom ovih jedinjenja nastaju aldehidi, ketoni i estri. Ova karbonilna jedinjenja daju

ukus kobasicama. Lipaze su senzitivne kada je pH vrednost niska, a najaktivnije su kada je sredina

7

neutralna ili alkalna. Aktivnost lipaza zavisi i od temperature. Najmanja aktivnost je na temperaturi

od od 1oC, a najveća je na 40oC (Kenneally et al., 2013).

Da bi se ispitala lipolitička aktivnost bakterija u kobasicama, vrsta Staphylococcus xylosus je

korišćena kao model jer ulazi u sastav starter kultura pri proizvodnji fermentisanih mesnih proizvoda

koji sazrevaju na temperaturi od 10-30oC. Ispitano je koji spoljašnji faktor najviše utiče na aktivnost

lipaza. Rezultati su pokazali da visoke koncentracije soli u nadevu i niska pH vrednost inhibiraju

lipaze, dok promena temperature ne utiče negativno na aktivnost lipaza (Kenneally et al., 2013).

BMK ne produkuju lipaze. Zbog toga se prilikom proizvodnje fermentisanih kobasica dodaju

neke vrste bakterija koje imaju tu sposobnost. Takve vrste pripadaju rodu Micrococcus.

Proteolitička aktivnost

Proteinaze su enzimi koji razlažu proteine na oligopeptide, dok peptidaze razlažu peptide na

amino kiseline. Oslobođene amino kiseline se koriste za kataboličke ili anaboličke procese.

Dekarboksilacijom amino kiselina nastaju biogeni amini koji su toksični za čoveka i izazivaju

kvarenje hrane. Usled delovanja intracelularnih enzima od amino kiselina nastaju alkoholi, aldehidi,

kiseline i sumporna jedinjenja koja utiču na organoleptička svojstva hrane, ali i NH3 i H2S koji

dovode do kvarenja hrane. BMK su specifične po tome što imaju sposobnost degradacije proteina

što se odražava na organoleptička svojstva fermentisane hrane. Proteolitički sistem BMK čine

ekstracelularne proteinaze (prtP, prtB, prtH i prtR), specifičan transportni sistem za di, tri i

oligopeptide, intracelularne peptidaze i enzimi koji katabolišu aminokiseline do jedinjenja koja su

značajna za formiranje ukusa i mirisa krajnjeg proizvoda. Sve proteinaze koje produkuju BMK

pripadaju grupi subtilizinskih serinskih proteinaza koje u aktivnom centru sadrže katalitičku trijadu

Asp, His i Ser.

Sinteza nitrat reduktaza

U anaerobnom disanju vrši se oksidacija organskih jedinjenja, pri čemu se redukuje koenzim

NAD+, koji se oksiduje na respiratornom lancu. Zbog nedostatka kiseonika akceptor elektrona je

vezani kiseonik organskih jedinjenja. To su najčešće soli azotne, sumporne ili ugljene kiseline.

Nitrati su krajnji akceptori elektrona u takozvanom nitratnom disanju. Vodonik se odvaja od

supstrata procesom dehidrogenacije i prenosi na respiratorni lanac gde se krajnji akceptor elektrona

oksidiše enzimom nitratnom reduktazom. Ovaj enzim se sintetiše u anaerobnim uslovima i u prisustvu

nitrata i vrši redukciju nitrata do nitrita.

NO3 + 2e- + H+ NO2 + H2O

8

Redukcija nitrata se vrši sve dok se ne dobiju neredukujući oblici azot - N2 i amonijak - NH3.

Nitritna so se dodaje prilikom proizvodnje kobasica jer daje crvenu boju kobasicama, a sa

druge strane inhibira nepoželjne mikroorganizme. Ako se proizvode kobasice koje imaju dug period

zrenja onda se dodaju nitrati koji se redukuju do nitrita zahvaljujući bakterijama koje produkuju

nitratne reduktaze (Staphylococcus i Micrococcus) (Lilić et al., 2013). BMK su poznate po tome što

ne vrše redukciju nitrata, pa se iz tog razloga dodaju one bakterije koje imaju takvu sposobnost.

Sinteza ureaza

Ureaze su enzimi koji vrše hidrolizu uree na amonijak i ugljen dioksid. Hidroliza predstavlja

neku vrstu fermentacije urina. Ove enzime produkuju različite vrste bakterija. Među tim bakterijama

mogu da se nađu uzorčnici infekcija urinarnog trakta. Ureaze se koriste za dobijanje fermentisanih i

alkoholnih napitaka, kao što su crveno i belo vino, kinesko vino, sake itd. U tom slučaju koriste se

ureaze izolovane iz bakterija koje pripadaju rodovima Lactobacillus (Lb. fermentum, Lb. reuteri, Lb.

animalis, Lb. salivarius, Lb. ruminis, Lb. delbrueckii), Streptococcus (Streptococcus mitior, S.

salivarius, S. thermophylus), Weissella (Weissella cibaria, W. confusa, W. wiridescens),

Enterococcus (Enterococcus faecalis, E. faecium, E. pseudoavium) i Enterobacter, kao i vrstama

Arthrobacter mobilis i Providencia rettgeri (Phang et al., 2018).

1.3.3. Katabolizam citrata

Važan izvor energije za bakterije mlečne kiseline, pored ugljenih hidrata jeste citrat. Citrat se

nalazi u mleku, voću, povrću i u živim ćelijama. Bakterije ga katabolišu istovremeno sa ugljenim

hidratima, pri čemu nastaju C4 jedinjenja ili aromatogena jedinjenja, koja daju aromu fermentisanoj

hrani. U C4 jedinjenja spadaju acetaldehid, acetoin, 2-3 butandiol i diacetil. Količina ovih jedinjenja

je veća kada se istovremeno sa citratom kataboliše glukoza ili laktoza, a na kraju prve faze

katabolizma nastaje piruvat. Višak piruvata se oksidativnom dekarboksilacijom pretvara u diacetil.

Neke BMK, naročito one iz roda Lactococcus, Leuconostoc i Lactobacillus, mogu da razlažu citrat

do CO2, acetata, diacetila, acetoina i nekada 2,3 butandiola.

Za ćelijsku membranu je vezan enzim citrat permeaza zahvaljujući kome citrat ulazi u ćeliju,

a za unutrašnju stranu enzima vezuje se mlečna kiselina koja se razmenjuje za anjonski oblik citrata.

Citrat ulazi u ćelije samo kada se vrši katabolizam ugljenih hidrata.

Zahvaljujući citrat liazi, citrat se kataboliše do acetata i oksalacetata. Oksalacetat se razgrađuje

do piruvata i CO2, a od piruvata nastaju C4 jedinjenja.

9

1.3.4. Sinteza egzopolisaharida

Polisaharidi su ugljeni hidrati građeni od velikog broja monosaharidnih jedinica. Dele se na

intracelularne (unutar ćelije), strukturne (izgrađuju ćelijsku membranu) i ekstracelularne ili

egzopolisaharide (izlučuju se van ćelije). Egzopolisaharidi (EPS) se izlučuju u vidu kapsule i imaju

veliku molekulsku masu. Sprečavaju gubitak svih materija koje su neophodne bakterijama. Takođe

omogućavaju formiranje biofilma (Ivanković, 2016).

Bakterije iz rodova Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc i Lactococcus mogu da

produkuju EPS koji su različiti po svom hemijskom sastavu, strukturi i veličini. Na osnovu

strukture, mehanizma biosinteze i potrebnih prekursora, EPS se dele na homopolisaharide i

heteropolisaharide. Homopolisaharidi su polimeri koji se sastoje od jedne vrste monosaharida.

Tako dekstran koji produkuju Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides i Ln. mesenteroides ssp.

dextranicum kao i neki laktobacili i veisele sastoji se od monomera glukoze. Heteropolisaharide

proizvodi veliki broj laktokoka, laktobacila i streptokoka. Oni se sastoje od ponavljajućih

oligomernih jedinica monosaharida koji često sadrže kombinaciju D-glukoze, D-galaktoze i D-

ramnoze, a u nekim slučajevima N-acetilglukozoamin, N-acetilgalaktozoamin ili glukuronsku

kiselinu.

1.3.5. Sinteza antimikrobnih supstanci

Razgradnjom ugljenih hidrata, BMK produkuju jedinjenja koja imaju antimikrobnu aktivnost.

Tu spadaju primarni i sekundarni metaboliti.

Organske kiseline imaju antimikrobnu aktivnost. BMK produkuju mlečnu, sirćetnu i

limunsku kiselinu. Ugljen dioksid (CO2) nastaje usled metabolizma heterofementativnih BMK.

Stvara anaerobne uslove što ne pogoduje mnogim bakterijama. Narušava potencijal ćelijske

membrane. Vodonik peroksid (H2O2) svoju antimikrobnu aktivnost ispoljava na taj način što se

vezuje za membranu ćelijskih organela i vrši njenu destrukciju. Diacetil daje aromu fermentisanim

proizvodima i ima antimikrobnu aktivnost. Etanol nastaje kao krajnji produkt katabolizma ugljenih

hidrata. Vrši denaturaciju ćelijskih membrana.

Bakteriocini su molekuli proteinske prirode koji imaju inhibitorni efekat na Gram pozitivne

bakterije iz rodova Listeria, Staphylococcus, Clostridium i Bacillus. Sintetišu se u stacionarnoj

fazi rasta kao sekundarni metaboliti.

Bakteriocini su podeljeni u nekoliko grupa. Prvu grupu čine lantibiotici, stabilni peptidi

koji se sastoje od neuobičajenih amino kiselina lantionina, β-metillantionina, dehidroalanina i

10

dehidrobutirina. Najpoznatiji lantibiotik je nizin koga sintetišu laktokoke. Narušava membranski

potencijal i sprečava reparaciju ćelijskog zida.

Drugu grupu čine termostabilni peptidi bez modifikovanih amino kiselina ili mogu da budu

izgrađeni od jednog ili dva polipeptidna lanca. Ovde spada pediocin koga sintetišu pediokoke. U

hrani se često razvija vrsta Lysteria monocytogenes koju inhibira pediocin.

Treću grupu čine bakteriolizini. Oni vrše hidrolizu ćelijskog zida, što dovodi do lize ćelije.

Najpoznatiji je helveticin koga sintetiše Lb. helveticus.

Često se kao aditivi prehrambenim proizvodima dodaju bakteriocini. Jedan od njih je već

pomenuti nizin. U farmaceutskoj industriji mogu se koristiti kao zamena za antibiotik, ali se po svojim

karakteristikama dosta razlikuju od antibiotika. Zato bi trebalo da se koriste istovremeno, jer imaju

sinergistički efekat.

11

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

Bakterije mlečne kiseline svojim rastom i metabolizmom usmeravaju proces zrenja

fermentisanih kobasica. Koriste se i kao starter kulture za proizvodnju kobasica standardnog

kvaliteta. Izbor sojeva BMK izolovanih iz autohtonih proizvoda za starter kulture u proizvodnji

kobasica zavisi od tehnoloških svojstava izolata. Zato su ciljevi istraživanja bili sledeći:

1. ispitivanje uticaja temperature, različitih koncentracija NaCl, začina i aktivnosti vode

na rast BMK izolovanih iz peglanih kobasica,

2. ispitivnje produkcije određenih enzima (proteinaze, lipaze, ureaze, nitratne reduktaze,

citrate liaze),

3. ispitivanje produkcije egzopolisaharida i antimikrobnih supstanci.

12

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Bakterijski sojevi

Bakterijski sojevi korišćeni u ovom radu su izolovani iz mesa od kojeg su pravljene peglane

kobasice (oznaka M), kao iz dva uzorka peglanih kobasica (PK i PF). Identifikovani su na Institut

za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo (IMGGI) u Beogradu do nivoa vrste. Izolovane

su sledeće vrste: Lactobacillus sakei (31 soj), Lactobacillus curvatus (5 sojeva), Leuconostoc

mesenteroides ssp. mesenteroides (1 soj), Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (4 soja),

Weissella viridescens (10 soja), Carnobacterium maltaromaticum (2 soja), Carnobacterium

divergens (1 soj), Staphylococcus hominis (1 soj), Staphylococcus capitis (1 soj) i Staphylococcus

sp. (2 soja). Čuvani su u stokovima na temperaturi od -20oC. Za aktivaciju kultura, sojevi su vađeni

iz stoka, zasejavani na MRS agar i inkubirani na 30oC. Radna kultura dobijena je nakon inokulacije

MRS bujona (Torlak, Srbija) određenim aktiviranim sojem i inkubacije zasejanih podloga na 30oC.

3.2. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija

Da bi se ispitao uticaj niskih temperatura na rast sojeva bakterija mlečne kiseline, MRS

bujoni su inokulisani prekonoćnim kulturama i čuvani u frižideru na +4oC. Rast je praćen na

osnovu zamućenja narednih deset dana. Za određene sojeve je merena pH vrednost bujona i

optička gustina na OD640 nm, posle 6, 24, 48,72 i 96 h.

Da bi se ispitao uticaj NaCl na rast sojeva BMK, zasejavan je MRS agar sa različitom

koncentracijom NaCl od 4%, 8% i 10%. MRS agar je inkubiran na 30oC, a rast se pratio na osnovu

formiranja kolonija. Uticaj koncentracije NaCl na rast sojeva ispitivan je i u tečnim podlogama.

MRS bujon (4%, 6% i 8% NaCl) je inokulisan određenim sojevima i inkubiran na 30oC. Za

određena sojeve je merena pH vrednost bujona i optička gustina na OD640 nm, posle 6, 24 i 48h.

Kako bi se ispitao uticaj začina na rast sojeva, pravljen je MRS agar sa začinom. MRS agar

je sa 2% NaCl prokuvan i sterilisan. Nakon toga je dodato 1,5% aleve paprike i 1% belog luka.

Takva podloga je opet prokuvana do ključanja i razlivena u Petrijeve šolje. Eksperiment je

ponovljen, s tim što je u MRS agar dodata duplo veća koncentracija NaCl, aleve paprika i belog

luka. Rast je praćen na osnovu formiranja kolonija. Za praćenje rasta sojeva u tečnoj podlozi, MRS

13

bujonu je dodato 4% NaCl, 3% aleve i 2% belog luka. Bujon je inokulisan određenim sojevima i

inkubiran na 30oC. Merena je pH vrednost bujona i optička gustina na OD640 nm, posle 6, 24 i 48h.

Da bi se odredila minimalna aw vrednost koja omogućava rast bakterijskim sojevima,

korišćen je Mlečni agar sa različitom koncentracijom saharoze, odnosno kuhinjskog šećera. Mlečni

agar sadrži 1 g obranog mleka u prahu, 5 g peptona, 3 g ekstrakta kvasca, 15 g Agar-agar, 1 l

destilovana voda, 5 g natrijum citrat, saharoza i glicerol. U tabeli 1 su date koncentracije saharoze

i glicerola za različite aw vrednosti.

Tabela 1. Različite koncentracije saharoze i glicerola za različite aw vrednosti

aw0.99 aw0.95 aw0.91

saharoza 18.3 g/100 ml 18.3 g/100 ml 87.7 g/100 ml

glicerol 2.0 g/100 ml 21.5 g/100ml 40.5 g/100 ml

Podloga je zagrejana na 50oC, a zatim sterilisana na 100oC, bez pritiska 10 minuta. Za sve

tri vrednosti aw je korišćena saharoza u prvom ponavljanju, a u drugom je korišćen kuhinjski šećer

za aw 0,99.

3.3. Sinteza enzima

Lipolitička aktivnost

Tributirin agar (TBA) i Spirit Blue Agar (SBA) su korišćeni za određivanje produkcije

lipaza, enzima koji razgrađuju lipide.

TBA je pravljen dodavanjem 2% Tributyrin Agar Base w/o Triibutyrin (Himedia, India) u

1 l destilovane vode.

SBA je pravljen dodavanjem 2% Agar-agar, 1% tripton i 0,5% ekstrakta kvasca u 1 l

destilovane vode. Lipoidalna emulzija je pravljena mešanjem 0,2% TWEEN-80 i 20% svinjske

masti. U SBA je prvi put dodato 3%, a drugi put 1% lipoidalne emulzije.

TBA i SBA su sterilisane u autoklavu na 121oC pod pritiskom. Praćen je rast kolonija i

pojava svetlih zona (halo) oko kolonija.

Proteolitička aktivnost

Za određivanje proteolitičke aktivnosti pravljena je podloga u koju su dodati

sarkoplazmatski proteini. Podloga se sastoji od 0,5% triptona, 0,25% ekstrakta kvasca, 0,1%

glukoze i 1,5% Agar-agar. Sarkoplazmatski proteini su izolovani tako što je izblendirano 10 g

14

mesa u 100 ml NaH2PO4 pufera, čija je pH vrednost 7,4. Po 1 ml je sipano u epndorfice i

centrifugirano na 8000 g na 4oC 15 minuta. Nakon centrifugiranja dobijeni supernatant je sterilisan

filtracijom (prečnik pora je 0,45 μm) i ubačen u podlogu. Za dobijanje miofibrilarnih proteina

prethodno dobijeni pelet je prebačen u 100 ml pufera KJ, čija je pH vrednost 7,4 i centrifugiran na

8000 g na 4oC 15 minuta. Dobijeni pelet je izmeren i u odnosu na tu količinu dodato je 10x više

KJ pufera. Prebačen je po 1 ml u ependorfice i centrifugiran na 10 000 g na 4oC 20 minuta. U

dobijeni natant je sipano 10x više pufera KJ. Dobijeni miofibrilarni proteini su profiltrirani i

prebačeni u podlogu.

Proteolitička aktivnost se utvrđuje na osnovu pojave svetle zone oko bunarčića u koji su

zasejani sojevi čija se proteolitička aktivnost ispituje.

Sinteza nitrat reduktaze

Kako bi se odredila redukcija nitrata, pravljen je YT agar čiji su sastojci sledeći: 1 l

destilovna voda, 1% tripton, 0,5% ekstrakt kvasca, 1,5% Agar-agar i 0,1% KNO3. Bakterijski

sojevi su zasejani na dati agar. Praćen je rast kao i redukcija nitrata. Pozitivan rezultat redukcije je

promena boje podloge. Rađeno je i spektrofotometrijsko ispitivnje redukcije nitrata u nitrite tako

što je 100 μl prekonoćnih kultura ispitivanih sojeva inokulisano u 10 ml YT bujona kome je dodato

250 ppm KNO3 i inkubirano na 20 i 30oC 24 h i na 15 oC 72 h. Deo kulture je korišćen za

određivanje suve mase, dok je 100 μl dodato u 250 μl Griess I (0,5 g sulfanilne kiseline u 150 ml

5 N sirćetne kiseline), 250 μl Griess II (0,5 g naftilamina u 50 ml destilovane vode i 100 ml 5 N

sirćetne kiseline) i 2 ml destilovane vode. Sve ovo je vorteksirano 1 minut i inkubirano na sobnoj

temperaturi 15 minuta. Masa je merena analitičkom vagom, tako što je nastavkom za automatsku

pipetu vađeno 1 ml YT bujona i stavljeno u čašu. Suva masa je dobijena tako što je od mase bujona

sa izolatima oduzeta masa kontrole. Masa kontrole je merena za sve tri temperature. Suva masa je

izražena kao mg/ml bujona. Produkcija nitrita iz nitrata je određena merenjem optičke gustine na

OD540 nm.

Ureazna aktivnost

Za određivanje ureazne aktivnosti korišćen je Urea Agar Base (Filter sterilizable) (w/o

Agar) (Himedia, India). Podloga je sterilisana filtracijom i stavljena je u inkubator na 37oC. Agar-

agar je prokuvan sa destilovanom vodom i sjedinjen sa Urea agarom. Dobijena podloga je

razlivena u Petrijeve šolje i zasejana. Praćeno je da li bakterije rastu na ovoj podlozi i da li razlažu

ureu, što se vidi na osnovu promene boje podloge.

15

3.4. Razgradnja citrata

Da bi se utvrdilo da li sojevi razlažu citrate, pravljena je podloga Mlečni citratni agar. Za

ovu podlogu je potrebno 10 g obranog mleka u prahu, hidrolizat kazeinat 2,5 g, glukoza 5 g, Agar-

agar 18 g, destilovana voda 1 l. Dobijena podloga je sterilisana u autoklavu na 100oC bez pritiska

10 minuta. Napravljeni rastvori A (10% K-fericijanid) i B (0,025% feri citrate i 0,025% natrijum

citrate), sterilisani su odvojeno i dodati u zapremini od 1 ml u sterilnu podlogu. Podloga je

razlivena u Petri šolje i nakon toga je vršeno zasejavanje. Sposobnost razlaganja citrata se vidi na

osnovu promene boje kolonija na podlozi u plavo.

3.5. Sinteza egzopolisaharida

Za ispitivanje sinteze egzopolisaharida pravljen je rekonstruisani MRS agar koji sadrži

sledeće sastojke: 10 g/l pepton, 5 g/l ekstrakt kvasca, 10 g/l mesni ekstrakt, 20 g/l saharoza, 2 g/l

K2HPO4, 5 g/l natrijum acetat, 0.2 g/l MgSO4, 0.05 g/l MnSO4 x H2O, 1.08 g/l TWEEN-80, 2 g/l

amonijum citrat, 15 g/l Agar-agar i 1 l destilovana voda.

Podloga je sterilisana i razlivena u Petrijeve šolje i na njoj su zasejane bakterije. Praćena

je pojava egzopolisaharida u vidu sluzave mase preko površine kolonija.

3.6. Sinteza antimikrobnih supstanci

Za antimikrobnu aktivnost je napravljen MRS agar i razliven u Petrijeve šolje. Plastični

sterilni prstenčići su naređani preko MRS agara. Pripremljene su dve vrste bujona, Sabouraud

Dextrose (Himedia, India) sa prekonoćnom kulturom kvasca Candida albicans i Mueller Hinton

bujon (Himedia, India) sa prekonoćnim kulturama bakterija Escherichia coli, Staphylococcus

aureus, Lysteria monocytogenes, Bacillus cereus i Sallmonela enteritidis. Takođe su pripremljene

epruvete sa dve vrste top agara, Sabouraud Dextrose i Mueller Hinton, tako što je bujonima dodato

0,7% Agar-agar. Epruvete sa top agarima su zasejane sa 80 μl prekonoćne kulture indikator soja i

sipane u Petrijeve šolje sa MRS agarom i sterilnim prstenčićima. Nakon nekoliko minuta prstenčići

su izvađeni, tako da su na taj način dobijeni bunarčići. U bunarčiće je sipano po 50 μl prekonoćne

kulture različitih sojeva bakterija mlečne kiseline. Pripremljene ploče su inkubirane na 30oC i

praćena je pojava zona inhibicije oko bunarčića.

16

Kada su korišćeni indikator sojevi Lysteria monocytogenes, Bacillus cereus, Sallmonella

enteritidis i Yersinia enterocolitica korišćene su tečna i čvrsta podloga Brain Heart Infusion Agar

sledećeg sastava: ekstrakt mesa 13 g, pepton 10 g, glukoza 2 g, NaCl 5 g, disodijum fosfat 2,5 g,

destilovana voda 1 l.

3.7. Kriva rasta

Za određivanje krive rasta pimenjena je tehnika razblaživanja i merena je optička gustina

spektrofotometrom OD600 nm u toku 24 h. Kriva rasta je određena za sojeve u okviru vrste Lc.

mesenteroides ssp. dextranicum (PK15), Lb. curvatus (PK4) i Lb. sakei (PF18).

U tri erlenmajera je napravljeno po 50 ml MRS bujona. Napravljen je i 0,9% fiziološki

rastvor NaCl. Na MRS agaru su zasejane prekonoćne kulture datih sojeva i inkubirane na 30oC.

Sutradan su napravljene suspenzije, tako što su prekonoćne kulture ubačene u fiziološki rastvor, a

na densitometru je podešeno 0,5 McF. U MRS bujon je prebačeno 500 μl suspenzije sa određenim

sojem tako da je dobijeno razblaženje 10-1. U mikrotitar ploču je sipano po 90 μl fiziološkog

rastvora u 6 bunarčića. Iz MRS bujona je u prvi bunarčić sipano 10 μl, iz prvog u drugi takođe 10

μl i tako sve do poslednjeg bunarčića, u kome je razblaženje bilo 10 -7. Razblaženja su pravljena

na svaka tri sata i po 10 μl svakog razblaženja je prenšeno na MRS agar. Praćen je rast kolonija i

određen je broj ćelija. Na svaka tri sata je merena optička gustina spektrofotometrom OD600 nm.

4. REZULTATI I DISKUSIJA

17

4.1. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija

Nakon što su MRS bujoni inokulisani prekonoćnim kulturama bakterijskih sojeva, čuvani

su u frižideru na +4oC. Svakodnevno je praćen rast, odnosno zamućenje bujona. Nakon deset dana

je utvrđeno koji izolati rastu na datoj temperaturi (Tabela 2). Izolati koji nisu rasli na datoj

temperaturi su: Lb. sakei M11, M14, M16, Lb. sakei PK17 i W. viridescens M4 (Tabela 2).

Tabela 2. Uticaj različitih spoljašnjih faktora na rast bakterija mlečne kiseline

Rast

na

Izolati 4⁰C 4%

NaCl

8%

NaCl

10%

NaCl Zacin

Zacin

(2X)

Aw

0.91

Aw

0.95

Aw

0.99

s.

Aw

0.99

š.

Lb. sakei

M16 0 0 0 0 + + 0 0 + +

M19 + + 0 0 + + 0 0 + +

M11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

M12 + 0 0 0 + + 0 0 + +

M15 + 0 0 0 + 0 0 0 + +

M14 0 0 0 0 + 0 0 0 + +

M13 + + 0 0 + + 0 0 + 0

PK1 + + 0 0 + + 0 0 + +

PK7 + + 0 0 + + 0 0 0 +

PK6 + 0 0 0 0 0 0 0 0 +

PK17 0 + 0 0 + + 0 0 0 +

PK18 + + 0 0 + + 0 0 + +

PK19 + + 0 0 + + 0 0 + +

PF1 + + 0 0 + + 0 0 + +

PF2 + + 0 0 + + 0 0 + +

PF3 + 0 0 0 + + 0 0 + +

PF6 + 0 0 0 + + 0 0 0 +

PF8 + + 0 0 + + 0 0 0 0

PF11 + + 0 0 + + 0 0 0 +

PF12 + + 0 0 + + 0 0 + 0

PF13 + + 0 0 + + 0 0 + +

PF4 + + 0 0 + + 0 0 + +

PF9 + + 0 0 + + 0 0 0 +

PF14 + + 0 0 + + 0 0 + +

PF15 + 0 0 0 + + 0 0 + +

PF18 + + 0 0 + + 0 0 + +

PF19 + + 0 0 + + 0 0 + +

PF20 + 0 0 0 + + 0 0 + +

Lb. curvatus

PK5 + + 0 0 + 0 0 0 0 +

PK14 + + 0 0 + + 0 0 0 +

PK20 + + 0 0 + + 0 0 0 +

18

PK4 + 0 0 0 + + 0 0 0 0

PF17 + 0 0 0 + + 0 0 + +

Ln. meseneroides

ssp. mesenteroides

PK21 + + 0 0 + + 0 0 0 +

Ln. meseneroides

ssp. dextranicum

PK6A + + 0 0 + 0 0 0 0 0

PK15 + 0 0 0 + + 0 0 0 +

PK16 + + 0 0 + + 0 0 0 0

PK16A + + 0 0 + + 0 0 0 +

W. viridescens

M10 + + 0 0 + + 0 0 0 +

M18 + + 0 0 + + 0 0 + +

M20 + 0 0 0 + + 0 0 + +

M1 + + 0 0 + + 0 0 + +

M7 + + 0 0 + + 0 0 + 0

M8 + 0 0 0 + + 0 0 0 +

M9 + + 0 0 + + 0 0 + +

M4 0 + 0 0 + + 0 0 + +

M1 + + 0 0 + + 0 0 + +

M8 + 0 0 0 + + 0 0 + +

C. maltaromaticum

M2 + + 0 0 + 0 0 0 + +

M3 + 0 0 0 + + 0 0 0 +

C. divergens

PK3 + 0 0 0 + 0 0 0 + +

St. hominis

M17 + 0 0 0 + 0 0 0 + +

St. capitis

PK8 + + 0 0 + 0 0 0 0 0

Staphylococcus

sp.

PK11 + + + + + + 0 0 + +

PK12 + + + + + + 0 0 + +

+ postoji rast; 0 nema rasta

Da bi se ispitao broj ćelija u bujonu i količina sintetisane mlečne kiseline, za određene

sojeve koji su rasli na 4oC, vršeno je merenje optičke gustine bakterijskih ćelija spektrofotometrom

(OD640 nm) i merena je pH vrednost bujona u kome je gajen određeni izolat. U tabeli 3 prikazani

su dobijeni rezultati. U većini slučajeva apsorbanca je imala veće vrednosti nakon nego nakon 24

h, dok je nakon 48 h bila opet veća nego nakon 24 h. pH vrednost se takođe nije značajno menjala.

Uglavnom su najniže vrednosti zabeležene nakon 96 h.

Tabela 3. Merenje optičke gustine i pH vrednosti MRS bujona koji je čuvan u frižideru na 4oC

19

OD640

pH

Izolati 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h 72 h 96 h

kontrola 0.565 0.503 0.503

Lb. sakei

M14 0.484 0.448 0.448 6.59 6.63 6.67 6.66 5.42

PK17 0.385 0.470 0.470 6.56 6.54 6.72 6.58 5.40

PF18 0.590 0.583 0.583 6.55 6.39 6.58 6.45 6.17

PF19 0.531 0.491 0.491 6.64 6.39 6.60 6.31 5.57

Lb. curvatus

PK4 0.506 0.492 0.492 6.56 6.52 6.61 6.31 5.37

PK5 0.525 0.496 0.496 6.54 6.48 6.33 6.57 6.57

PF17 0.492 0.393 0.393 6.56 6.63 6.64 6.41 5.71

Ln.

mesenteroides

ssp.

dextranicum

PK15 0.558 0.477 0.477 6.57 6.60 6.38 6.27 5.57

W. viridescens

M18 0.512 0.520 0.520 6.55 6.49 6.63 6.54 6.53

C.

maltaromaticum

M2 0.503 0.434 0.434 6.52 6.52 6.60 6.71 6.46

Kako bi se ispitao uticaj povećane koncentracije NaCl na rast bakterijskih sojeva, svaki od

izolovanih sojeva je zasejan na MRS agaru sa 4%, 8% i 10% NaCl. Na MRS agaru sa 4% NaCl

zabeležen je rast kod skoro polovine ispitivanih sojeva (Tabela 2). Rast izolata je zabeležen kod

vrsta Lb.sakei (19), Lb. curvatus (3), Ln. mesenteroides ssp. dextranicum (3), Ln. mesenteroides

ssp. mesenteroides (1), W. viridescen (7), C. maltaromaticum (1), St. capitis (1), Staphylococcus

sp. (2). Na MRS agaru sa 8 i 10% NaCl rasli su samo izolati Staphylococcus sp PK11. i PK12. To

su stafilokoke koje imaju sposobnost da rastu na slanim agarima. Zato su pokazale i najefikasniji

rast (Tabela 2).

Prema ispitivanjima Kurćubić et al. (2011), sadržaj NaCl u kobasicama je 3,45 g/100 g

nadeva. Ova količina NaCl je nešto manja u odnosu na koncentraciju koja je stavljena u podlogu

(4%). Prilikom ispitivnja viršli sa novosadskog tržišta dokazano je da se NaCl dodaje u mnogo

manjoj koncentraciji koja se kreće od 1,2 do 2,55% (Prica et al., 2013) nego što je to slučaj sa

fermentisanim kobasicama. Svi oni izolati koji su porasli na podlozi sa 4% NaCl mogu da se

koriste kao starter kulture prilikom proizvodnje kobasica u kojima se dodaje 4% soli.

20

Određeni izolati su gajeni u bujonima sa 4%, 6% i 8% NaCl. Merena je optička gustina

(OD640 nm) (Tabela 4) i pH vrednost posle 6 h, 24 h i 48 h (Tabela 5).

U bujonima sa 4% NaCl apsorbanca je bila manja nakon svakog merenja, dok se pH

vrednost takođe znatno smanjila nakon 24 h. U bujonima sa 6% NaCl apsorbanca je varirala dok

se pH nije drastično promenila osim za izolat Lb. sakei PF19. Takođe je apsorbanca varirala u

bujonima sa 8% NaCl. pH vrednost se nije znatno promenila nakon 48 h.

Tabela 4. Merenje optičke gustine (OD640 nm) u bujonu sa različitim koncentracijama NaCl

OD640

4%

NaCl

6%

NaCl

8%

NaCl

Izolati 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h

kontrola 0.209 0.185 0.201 0.192 0.191 0.193 0.197 0.187 0.190

Lb. sakei

PK17 0.204 0.204 0.178 0.188 0.210 0.177 0.179 0.152 0.174

PF18 0.177 0.239 0.184 0.161 0.197 0.182 0.187 0.182 0.178

PF19 0.197 0.361 0.101 0.182 0.185 0.101 0.111 0.180 0.177

Lb. curvatus

PK4 0.170 0.408 0.167 0.190 0.202 0.167 0.166 0.171 0.172

PK5 0.206 0.187 0.144 0.169 0.193 0.144 0.145 0.180 0.173

PF17 0.193 0.186 0.175 0.189 0.170 0.175 0.175 0.156 0.159

Ln.

mesenteroides

ssp.

dextranicum

PK15 0.156 0.441 0.171 0.199 0.199 0.171 0.172 0.177 0.179

W.viridescens

M18 0.171 0.231 0.198 0.191 0.199 0.198 0.197 0.193 0.189

C.

maltaromaticum

M2 0.188 0.205 0.190 0.191 0.192 0.190 0.190 0.180 0.186

U tabeli 5 je prikazana promena pH vrednosti bujona sa 4%, 6% i 8% NaCl. U bujonima

sa 4% i 6% NaCl pH vrednost je tokom vremena opadala, pri čemu je nešto veći pad u bujonima

21

sa 4% NaCl. Nakon 24 h, u bujonima sa 8% NaCl, pH vrednost se polako povećava ili je ostaje

ista kao i prilikom merenja nakon 24 h.

Tabela 5. Merenje pH vrednosti bujona sa različitom koncentracijom NaCl

pH 4% pH 6% pH 8%

Izolati 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h

Lb. sakei

M14 6.74 6.66 4.13 6.53 6.53 6.46 6.53 6.46 6.51

PK17 6.77 6.09 3.75 6.62 6.55 5.45 6.62 6.31 6.48

PF18 6.68 5.06 3.83 6.64 6.56 5.89 6.52 6.60 6.52

PF19 6.69 4.62 3.76 6.61 6.65 3.99 6.51 6.45 6.42

Lb. curvatus

PK4 6.73 5.05 3.91 6.65 6.48 6.31 6.56 6.29 6.41

PK5 6.58 6.72 4.31 6.40 6.67 6.46 6.54 6.04 5.66

PF17 6.70 6.73 6.00 6.66 6.73 6.46 6.56 6.47 6.53

Ln.

mesenteroides

ssp.

dextranicum

PK15 6.63 4.77 3.96 6.54 6.51 6.34 6.63 6.25 6.25

W.viridescens

M18 6.68 6.28 3.94 6.69 6.54 6.17 6.59 6.42 6.42

C.

maltaromaticum

M2 6.66 6.53 4.25 6.56 6.56 6.51 6.60 6.45 6.45

MRS agar sa začinom imitira uslove koji vladaju u kobasici. Od začina je korišćen NaCl,

aleva paprika i beli luk. Eksperiment je ponovljen dva puta, pri čemu je prvi put stavljeno u

podlogu 2% NaCl, 1,5% aleve paprike i 1% belog luka. U tom slučaju je većina izolata formirala

kolonije (Tabela 2). Izolati koji nisu rasli su: Lb. sakei M11 i PK6. Drugi put je stavljena duplo

veća koncentracija začina. U tom slučaju, pored ova dva izolata Lb. sakei M11 i PK6, kolonije

nisu formirali ni Lb. sakei M11, M14, M15 i PK6, Lb. curvatus PK5, Ln. mesenteroides ssp.

dextranicum PK6A, C. maltaromaticum M2, C. divergens PK3, S. capitis PK8 i St. hominis M17.

Stafilokoke PK11 i PK12 su pokazale izvanredan rast.

Od začina, za pravljenje kobasica, se najčešće koristi aleva paprika, čiji je plod prethodno

osušen i smleven. Ona utiče na boju i ukus kobasica (Petrović, 2012), pa tako različita jedinjenja

iz začina deluju inhibitorno na bakterije u kobasici. Beli luk se dodaje zbog svog antimikrobnog i

antioksidativnog dejstva.

22

Bakterijski sojevi određenih vrsta su gajeni u MRS bujonu sa začinom. Kao i u prethodnim

slučajevima, apsorbanca je uglavnom bila veća nakon 6 h nego nakon 24 h, pa se onda opet

povećavala nakon 48 h. pH vrednost se takođe smanjivala tokom vremena (Tabela 6).

Tabela 6. Merenje optičke gustine i pH vrednosti MRS bujona sa začinom

OD640

pH

Izolati 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h

kontrola 1.241 1.172 1.216

Lb. sakei

M14 1.174 1.108 1.145 6.10 5.45 3.96

PK17 1.126 0.894 1.107 6.14 4.20 3.84

PF18 1.155 0.854 1.032 6.07 4.17 3.77

PF19 1.132 0.873 1.037 6.06 4.01 3.77

Lb. curvatus

PK4 1.118 0.874 1.099 6.14 4.34 4.04

PK5 1.073 1.206 1.228 6.19 5.99 3.99

PF17 1.169 1.039 1.128 6.03 5.69 3.96

Ln. mesenteroides

ssp. dextranicum

PK15 1.156 0.880 1.103 6.14 4.42 4.01

W. viridescens

M18 1.131 0.878 1.090 5.98 4.26 4.15

C. maltaromaticum

M2 1.067 1.000 1.134 6.13 4.95 3.87

Da bi se odredila minimalna količina vode u podlozi koja bi omogućila rast izolatima,

korišćena je podloga Mlečni agar sa različitim aw vrednostima: 0,91; 0,95 i 0,99. Na podlogama

sa aw 0,91 i 0,95 ni jedan izolat nije formirao kolonije (Tabela 2). Na podlozi gde je aw 0,99

određeni izolati su formirali kolonije.

Drugi put je eksperiment ponovljen tako što je u podlogu stavljen običan kuhinjski šećer

ali samo za aw 0,99. Na ovoj podlozi su izolati rasli u mnogo većem broju nego kada je za istu aw

vrednost korišćena saharoza.

Ako aw iznosi manje od 0,95, u tom slučaju patogene vrste ne mogu da rastu. Ukoliko se

aw spusti na vrednosti ispod 0,90, prestaje rast svih bakterija (Vuković et al., 2012). Ovim

istraživanjem je to na neki način potvrđeno. Velika količina šećera u podlozi vezuje vodu pa na taj

način voda postaje nedostupna mikroorganizmima.

23

4.2. Sinteza enzima

Tributyrin Agar je korišćen da bi se ispitala lipolitička aktivnost datih sojeva. Ni jedan soj

nije pokazao sposobnost vršenja lipolize, već samo sposobnost rasta na datoj podlozi. Jedini soj

koji nije porastao na ovoj podlozi je Lb. sakei M11 (Tabela 7).

Tabela 7. Sposobnost sinteze lipaza, proteinaza, nitrat reduktaza, ureaza, citrata i egzopolisaharida

Izolati TBA SBA 1%

emulzija

SBA 3%

emulzija

Miof.

proteini

Sarkopl.

proteini Nitrati

Urea

Mlecni

citratni

agar

EPS

Lb. sakei

M16 + + + + + + 0 0 +

M19 + + + + + + + + +

M11 0 0 0 0 0 0 0 + 0

M12 + + + + + + + 0 +

M15 + 0 + + + + + + +

M14 + + + + + + + + +

M13 + + + 0 0 + 0 + ++

PK1 + + + + + + + 0 +

PK7 + + + + + + + + +

PK6 + 0 0 + + 0 0 + +

PK17 + + + + + + + + +

PK18 + + + 0 + + + + +

PK19 + + + + + + + + +

PF1 + 0 + + + + 0 + +

PF2 + + + + + + 0 + +

PF3 + + +

+ + +

+ + plave

kolonije +

PF6 + + + + + + + 0 +

PF8 + + + 0 0 + + + +

PF11 + 0 + 0 0 + 0 + +

PF12 + 0 + 0 0 + 0 + +

PF13 + + + 0 0 + + 0 +

PF4 + + + + + + + + +

PF9 + + + 0 + + + + +

PF14 + + + + + + 0 + +

PF15 + + + + + + 0 0 +

PF18 + + + + + + + + +

PF19 + + + + + + + + ++

PF20 + + + 0 + + + 0 +

Lb. curvatus

PK5 + 0 0 + + + + + +

PK14 + + + + + + 0 + ++

PK20 + + + + + + 0 + ++

PK4 + + + + + + + 0 ++

24

PF17 + + + + + + + 0 +

Ln.

meseneroides

ssp.

mesenteroides

PK21 + + + + + + + + +

Ln.

meseneroides

ssp.

dextranicum

PK6A + 0 0 + + + 0 0 +

PK15 + + + + + + + 0 ++

PK16 + + + + + + 0 + ++

PK16A + + + + + + 0 + ++

W. viridescens

M10 + + + + + + + + ++

M18 + + + + + + + + +

M20 + + + + + + + 0 +

M1 + + + + + + + + +

M7 + + + 0 0 + 0 + +

M8 + + + + + + + 0 ++

M9 + + + + + + 0 + +

M4 + + + + + 0 + 0 +

M1 + + + + + + + + +

M8 + 0 + + + 0 0 + +

C.

maltaromaticu

m

M2 + + + + + + + + +

M3 + + + + + + + 0 +

C. divergens

PK3 + + + 0 0 + + + +

St. hominis

M17 + + + + + + 0 + 0

St. capitis

PK8 + 0 0 + + + 0 + +

Staphylococcu

s sp.

PK11 + halo halo + + + + 0 +

PK12 + halo halo 0 0 + + + +

+ postoji rast; 0 nema rasta; ++ rast i sinteza EPS

Spirit Blue Agar je takođe korišćen u iste svrhe. Pošto je ovde korišćena različita

koncentracija emulzije (1% i 3%) dobijeni su različiti rezultati rasta (Tabela 7). Na podlogama

kojima je dodato 1% ili 3% emulzije nisu rasle sledeće vrste: Lb. sakei M11 i PK6, Lb. curvatus

PK5, Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides PK6A i St. capitis PK8. Na agaru sa 1% emulzije nisu

25

rasli sojevi: Lb. sakei M15, PF1, PF8 i PF11 i W. viridescens M8. Ti isti sojevi su rasli na agaru sa

3% emulzije. Ostali sojevi su rasli na agaru i sa jednom i sa drugom koncentracijom emulzije.

Stafilokoke PK11 i PK12 su rasle prilikom dodatka jedne i druge koncentracije emulzije, a takođe

su pokazale da imaju lipolitičku aktivnost, jer su se oko kolonija stvarale svetle zone (halo). To je

znak da poseduju lipaze, enzime koji vrše hidrolizu lipida. Lipoliza utiče na organoleptička

svojstva kobasica. Hugas i Monfort (1997) su dokazali da stafilokoke imaju najveću sposobnost

razlaganja lipida. Takođe su Kenneally et al. (1997) dokazali da laktobacili nemaju sposobnost

razgradnje lipida.

Pod proteolizom se podrazumeva razgradnja proteina na polipeptide. U ovom slučaju je

ispitana proteoliza miofibrilarnih i sarkoplazmatskih proteina. Pravljena je podloga kojoj su dodati

miofibrilarni proteini i dokazano je da na njoj uglavnom rastu izolati, ali da ne vrše proteolizu. Ni

jedan izolat nije formirao svetlu zonu oko kolonije (Tabela 7). Isti rezultat je zabeležen i kod

sarkoplazmatskih proteina.

Prilikom vršenja proteolize dolazi do promene pH vrednosti mesa (Aymerich et al., 2003).

Ta pH raste do te mere da dostiže onu vrednost koju meso ima odmah nakon klanja životinje.

Za dokazivanje nitratnih reduktaza pravljen je YT agar. Na ovom agaru ni jedan izolat nije

pokazao sposobnost redukcije nitrata u nitrite, odnosno nije doslo do promene boje podloge. Izolati

kod kojih nije uočen rast su: Lb. sakei M11 i PK6 i W. viridescens M8 (Tabela 7).

Takođe je pravljen i YT bujon sa KNO3 koji je inokulisan izolatima: Lb. sakei M14, PK17,

PF18 i PF19, Lb. curvatus PK4, PK5, PF17, Ln. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, W.

viridescens M18, C. maltaromaticum M2. Inkubacija na 15oC je trajala 72 h, dok je na 20oC i 30

oC trajala 24 h. Deo bujona je korišćen za merenje optičke gustine OD540, a deo za merenje suve

mase. Prilikom mernja optičke gustine kod nekih izolata je apsorbanca za sve tri temperature imala

približnu vrednost, dok su se u nekim slučajevima vrednosti znatno razlikovale (Tabela 8).

U svakom bujonu sa određenim izolatom stavljeno je po 0,5 ml rastvora alfa-naftilamina i

1 ml rastvora sulfanilne kiseline da bi se utvrdila redukcija nitrata. Međutim, ni jedan izolat nije

pokazao sposobnost redukcije nitrata do nitrita, odnosno nije doslo do pormene boje iz žućkaste u

crvenkastu.

Da bi se uporedio rast bakterija na različitim temperaturama u YT bujonu, pre merenja

suve mase, merena je masa kontrole. Za 15oC je 995,0 mg, za 20oC i 30 oC je 1002,0 mg. Kontrole

26

su takođe inkubirane na datim temperaturama U tabeli 8 je prikazana masa bujona sa određenim

izolatima, dok je u tabeli 9 prikazana suva masa.

Tabela 8. Merenje optičke gustine (OD540 nm) i mase (mg) YT bujona sa izolatima

Inkubacija na 15oC 72 h Inkubacija na 20oC 24 h Inkubacija na 30oC 24 h

Izolati OD540 nm mg OD540 nm mg OD540 nm mg

Lb. sakei

M14 0,058 1019.4 0.064 1011.4 0.047 981.1

PK17 0.062 1027.4 0.074 1001.8 0.135 982.7

PF18 0.066 1007.4 0.072 995.5 0.070 987.4

PF19 0.076 1015.1 0.071 1001.8 0.102 988.8

Lb. curvatus

PK4 0.061 1032.6 0.063 989.7 0.037 984.5

PK5 0.053 1004.0 0.056 995.3 0.058 1011.1

PF17 0.088 1005.2 0.056 994.3 0.045 982.9

Ln.

mesenteroides

ssp.

dextranicum

PK15 0.142 1002.3 0.057 1014.4 0.034 1003.9

W. viridescens

M18 0.065 1029.2 0.136 1007.1 0.056 1009.9

C.

maltaromaticum

M2 0,060 1011.3 0.068 1029.3 0.083 988.1

U nekim slučajevima je suva masa imala negativnu vrednost. Takve vrednosti se javljaju

kod onih YT bujona koji su inkubirani na 20oC i 30 oC. Pretpostavlja se da je doslo do isparenja

bujona prilikom merenja.

Tabela 9. Merenje optičke gustine (OD540 nm) i suve mase (mg/ml)

Inkubacija na 15oC 72 h Inkubacija na 20oC 24 h Inkubacija na 30oC 24 h

Izolati OD540 nm mg/ml OD540 nm mg/ml OD540 nm mg/ml

Lb. sakei

M14 0,058 24.4 0.064 9.4 0.047 -20.9

27

PK17 0.062 32.4 0.074 -0.2 0.135 -19.3

PF18 0.066 12.4 0.072 -6.5 0.070 -14.6

PF19 0.076 20.1 0.071 -0.2 0.102 -13.2

Lb. curvatus

PK4 0.061 37.6 0.063 -12.3 0.037 -17.5

PK5 0.053 9 0.056 -6.7 0.058 9.1

PF17 0.088 10.2 0.056 -7.7 0.045 -19.1

Ln

mesenteroides

ssp.

dextranicum

PK15 0.142 7.3 0.057 12.4 0.034 1.9

W. viridescens

M18 0.065 34.2 0.136 5.1 0.056 7.9

C.

maltaromaticum

M2 0,060 16.3 0.068 27.3 0.083 -13.9

Urea agar je korišćen da bi se ispitalo da li bakterije razlažu ureu. Ukoliko bakterije

poseduju ureaze, razlaganjem uree dolazi do promene boje podloge iz žućkaste u ružičastu. U

ovom slučaju ni jedan izolat nije razlagao ureu, odnosno podloga nije promenila boju. Mnogi

izolati nisu formirali kolonije na ovoj podlozi (Tabela 7).

Poznato je da bakterije iz familije Enterobacteriaceae, gde spadaju stafilokoke, ne razlažu

ureu. BMK ne poseduju ureaze pa zbog toga ne mogu da razlažu ureu.

4.3. Razgradnja citrata

Mlečni citratni agar je korišćen da bi se ispitao rast BMK i produkcija citrat liaze, enzima

koji razgrađuje citrat. Na ovoj podlozi nisu rasli određeni izolati . Izuzetan rast kao i sposobnost

da razlaže citrat pokazao je soj Lb. sakei PF3, što se vidi na osnovu plave boje (Tabela 7). To je

dokaz da ovaj soj poseduje citrat liazu.

Prema istraživanju koje sprovodi Kršev (1976), dokazano je da samo neki sojevi u okviru

vrste Streptococcus lactis razlažu citrate. Uloga citrata u podlozi je povećanje pH vrednosti, što

ubrzava proces fermentacije (Mazić, Božanić, 2008). U istraživanju Mazić i Božanić (2008)

korišćene su vrste Lc. lactis ssp. lactis, Lc. lactis ssp. cremoris, Lc. lactis ssp. lactis biovar.

28

diacetylactis i Ln. mesenteroides ssp. cremoris. Ovim istraživanjem je dokazano da samo jedan

izolat razlaže citrat, a to je Lb. sakei PF3.

4.4. Sinteza egzopolisaharida

Egzopolisaharidi se javljaju u vidu providne kapsule iznad formiranih kolonija. BMK ih

sintetišu kada se u MRS podlogu stavi saharoza umesto glukoze. Svi izolati osim Lb. sakei M11 i

S. hominis M17 su rasli na ovoj podlozi, a samo su neki sintetisali egzopolisaharide (Tabela 7). To

su izolati: Lb. sakei M13 i PF19, Lb. curvatus PK4, PK14, PK20, Ln. mesenteroides ssp.

dextranicum PK15, PK16, PK16A, W. viridescens M8 i M10. To su sojevi u okviru rodova

Lactobacillus i Leuconostoc za koje se zna da produkuju egzopolisaharide, koji utiču povoljno na

organoleptička svojstva fermentisanog proizvoda (Samardžija et al., 2001).

4.5. Antimikrobna aktivnost

Kod izolata je ispitano da li produkuju neku od antimikrobnih supstanci koje deluju

inhibitorno na patogene vrste mikroorganizama. U eksperimentu, gde su na Mueller Hinton agaru

i Sabouraud Dextrose agaru gajene patogene vrste, neki od izolata su pokazali antimikrobnu

aktivnost, a to se videlo na osnovu svetle zone oko bunarčića. Antimikrobne supstance nisu

delovale na vrstu Cn. albicans jer je pokazala izuzetan rast na datoj podlozi. Ostale vrste (E. coli,

S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus i S. enteritidis) su normalno rasle na određenoj polozi a

izolati su inhibirali njihov rast zahvaljujući antimikrobnim supstancama. Oko bunarčića u kojima

su bili izolati stvarale su se zone inhibicije. Što je veća zona inhibicije jači je efekat antimikrobne

supstance. U tabeli 10 su prikazane zone inhibicije izražene u milimetrima. Prazna polja u tabeli

pokazuju da određeni izolat nije delovao inhibitorno na određenu patogenu vrstu.

Tabela 10. Antimikrobna aktivnost izolata iz peglane kobasice (zona inhibicije izražena u mm)

Izolat E.coli

St. aureus

L.

monocytogenes

B. cereus

S. enteritidis

Lb. sakei

M16 17 17 17 15 15

PK6 13 16 17 18 18

29

Prema istraživanju Vesković-Moračanin et al. (2010), dokazano je da Lb. sakei produkuje

bakteriocine i inhibira vrste L. monocitogenes i St. aureus. Vrsta Ln. mesenteroides ssp.

mesenteroides produkuje posebnu vrstu bakteriocina koji se naziva Mesenterocin 52. Ovaj

bakteriocin deluje inhibitorno na vrste iz rodova Lysteria i Staphylococcus, a na laktobacile i

leukonostoke ne deluje inhibirorno (Mathieu et al., 1993). Tabela pokazuje da je sposobnost

inhibicije rasta korišćenih indikator sojeva različita. Ukoliko je prečnik zone inhibicije veći od 15

mm, bakterija ima veliku antimikrobnu aktivnost.

Na slikama su prikazane zone inhibicije čiji je prečnik prikazan u tabeli 10.

Slika 1. Antimikrobna aktivnost sojeva na vrste E. coli i B. cereus

PF1 16 16 14 12 17

PF2 16 19 17 14 16

PF3 19 18 17 18

PF6 15 20 20 16

PF14 15 17 20 17 16

PF15 18 20 20 16

PF18 13 18 17 16 16

PF19 15 16 18 17 17

PF20 17 17 12 15

Lb. curvatus

PK4 14 19 18

PK20 17 18 18 18 20

Ln. mesenteroides

ssp. mesenteroides

PK21 15 12 20 13 16

Ln. mesenteroides

ssp. dextranicum

PK15 9 15 14 8

PK16 15 15 14 15

PK16A 17 16 18 13 17

30

Slika 2. Antimikrobna aktivnost sojeva na vrste St. aureus i S. enteritidis

Slika 3. Antimikrobna aktivnost sojeva na vrstu L. monocytogenes

Antimikrobna aktivnost izolata iz peglane kobasice je takođe ispitana tako što su patogene

vrste gajene na improvizovanom Brain Heart Infusion agaru. Od patogenih vrsta su korišćene L.

monocytogenes, S. enteritidis, B. cereus i Yersinia enterocolitica. U ovom slučaju su zone

inhibicije bile mnogo veće u odnosu na one iz prethodnog eksperimenta. Tabela 12 prikazuje

prečnik zone inhibicije izražene u milimetrima (mm). Zone inhibicije nisu postojale kod vrste Y.

enterocolitis i B. cereus. Sojevi vrste Lb. sakei PF3 i PF6 imali su najveći inhibitorni efekat na

vrstu L. monocytogenes. Prečnik zona inhibicije je 23 mm. Soj Lb. sakei M19 takođe ima jak

inhibitorni efekat na vrstu S. enteritidis (zona inhibicije 23 mm).

31

Tabela 11. Antimikrobna aktivnost izolata iz peglane kobasice na L. monocytogenes i

S. enteritidis (zona inhibicije izražena u mm)

Izolati S. enteritidis Izolati L. monocytogenes

Lb. sakei Lb. sakei

M19 23 PF2 22

PK19 17 PF3 23

PF2 17 PF6 23

PF14 18 PF14 17

Lb. curvatus PF15 23

PK20 15 PF18 18

PK4 17 PF19 21

Ln. mesenteroides ssp.

dextranicum

PF20 22

PK15 15

PK16A 14

W. viridescens

M4 15

M18 17

M20 17

C. maltaromaticum

M3 14

4.6. Kriva rasta

Različite vrste mirkoorganizama imaju različito generacijsko vreme, tj. vreme koje je

potrebno da se broj ćelija u populaciji udvostruči. Da bi se utvrdilo generacijsko vreme izolata Lb.

sakei PF18, Lb. curvatus PK4 i Ln. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, izolati su zasejavani u

MRS bujon i inkubirani na 30o C pri čemu je optička gustina merena na svaka 3 h. Napravljena je

kriva rasta za sva tri izolata koja ima lag, log, stacionarnu i fazu odumiranja.

32

Od 9 pa do 21 h je log faza u kojoj se znatno povećao broj ćelija, pa je zbog toga apsorbanca

bila veća. Od 21 h je stacionarna faza u kojoj se broj ćelija nije znatno povećao, kao što je to bio

slučaj u prethodnoj fazi.

Tabela 12. Praćenje rasta sojeva merenjem optičke gustine (OD600 nm)

Vreme

Izolati 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 15 h 18 h 21 h 24 h 27 h

Lb. sakei PF18 0.021 0.016 0.012 0.027 0.540 0.093 0.410 1.587 1.940 2.128

Lb. curvatus

PK4 0.006 0.006 0.014 0.056 0.660 0.662 1.490 1.989 2.107 2.142

Ln.

mesenteroides

ssp. dextranicum

PK 15

0.007 0.006 0.021 0.035 0.428 0.046 0.572 1.427 1.585 1.673

Prilikom prvog merenja (0 h) najveću apsorbancu je imao bujon zasejan sojem Lb. sakei

PF18 (Tabela 12). Posle 9 h najveća apsorbanca je zabeležena u bujonu sa sojem Lb. curvatus

PK4. Do kraja praćenog perioda ovaj soj je pokazao najveći rast. Velika promena apsorbance kod

sva tri soja je zabeležena u periodu između 9 i 12 h. U periodu od 21 pa do 27 h apsorbanca se nije

začajno povećavala jer su izolati ušli u stacionarnu fazu.

Slika 4. Kriva rasta za izolate Lb. sakei PF18, Lb. curvatus PK4 i Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides

PK15

0

1

2

3

4

5

6

7

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27

Ap

sorb

anca

(O

D600

nm

)

Vreme (h)

PF18

PK4

PK15

33

Pored optičke gustine, za svaki izolat je određen i broj ćelija u bujonima u period inkubacije

od 24 h (Tabela 13). Početni broj ćelija bio je najveći u bujonu sa izolatom Ln. mesenteroides ssp.

mesenteroides PK15 (2,4 x103), dok je na kraju praćenog perioda inkubacije, najveći broj ćelija

(1,8 x 105) detektovan za izolat Lb. sakei PF18. Izolat Lb. curvatus PK4 je najsporije rastao u MRS

bujonu.

Tabela 13. Praćenje rasta sojeva određivanjem broja ćelija (CFU/ml)

Izolati 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 15 h 18 h 21 h 24 h

Lb. sakei

PF18

1x102 2.4x103 1.4x104 1.4x105 1.5x105 1.6x105 2.0x105 2.2x105 1.7x105

Lb. curvatus

PK4

0 8x102 1.7x104 1.2x105 1.2x105 9.2x104 1.1x104 3.2x105 6.7x103

Ln.

mesenteroides

ssp.

mesenteroides

PK15

2.4x103 9.5x102 1.7x104 1.2x105 7.5x106 7.7x105 1.3x105 6.5x105 1.2x105

5. ZAKLJUČAK

Na osnovu ovog istraživanja utvrđeno je da:

• izolati iz peglane kobasice mogu da rastu na temperaturi od +4oC,

• snižavaju pH podloge, zbog produkcije laktata,

• velika koncentracija NaCl deluje inhibitorno na izolate,

• skoro svi izolati rastu na podlogama sa začinom,

• ne mogu da rastu na podlozi čija je aw manja od 0,95,

• ispitivani izolati ne produkuju lipaze, osim stafilokoka,

• izolati ne produkuju proteinaze,

• ni jedan soj ne produkuju nitratne reduktaze,

• ne produkuju ureaze, ali mogu da rastu na agaru sa ureom,

34

• sojevi u okviru vrste Leuconostoc razlažu citrat,

• sojevi u okviru vrste Leuconostoc produkuju egzopolisaharide,

• određeni izolati produkuju antimirkobne supstance kojima inhibiraju patogene.

35

LITERATURA

Aymerich, T. et al., 2003. Microbial quality and direct PCR identifi cation of lactic acid bacteria

and nonpathogenic Staphylococci from artisanal low-acid sausages. Applied Environmental

Microbiology, 69: 4583–4594.

Breidt, F. et al., 2013. Fermented vegetables. In M. P. Doyle & R. L. Buchanan, eds. Food

Microbiology. American Society of Microbiology, 841–855.

Vesković-Moračanin S. et al., 2010. Antimicrobial properties of indigenous Lactobacillus sakei

strain. Acta Veterinaria, 1(60): 59-66.

Vuković, I. et al., 2012. Ispitivanje važnih promena u toku zrenja tradicionalne fermentisane

kobasice lemeški kulen. Tehnologija mesa, 53(2): 140-147.

Ivanković L., 2016. Mikrobni egzopolisaharidi. Zavrsni rad, 1-6.

Kegalj, A. et al., 2012. Raznolikost mikroflore u mesu i mesnim proizvodima. Znanstveno-stručni

skup „Hrana kao temelj zdravlja i dugovječnosti“, 3(12): 239-246.

Kenneally, P. et al., 1997. Evaluation of the lipolytic activity of starter cultures for meat

fermentation purposes. Jorunal of Applied Microbiology, 84: 839-846.

Kurćubić, V. et al., 2011. Sadržaj natrijum-hlorida i natrijuma u proizvodima od mesa različitih

grupa. Tehnologija mesa, 52(2): 225-233.

Lilić, S. et al., 2013. Uticaj smanjenog sadržaja natrijum-hlorida na process fermentacije I kvalitet

suvih fermentisanih kobasica. Tehnologija mesa, 54(2): 150-159.

Mathieu, F. et al., 1993. Mesenterocin 52, a bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides

ssp. mesenteroides FR52. Applied Microbiology, 4(74): 372-379.

Petrović, Lj., Tasić, T. (2012). Organska i tradicionalna proizvodnja i prerada mesa. Organska

prerada, Urednici Carić, M., Babović, J. (st. 91-114). Fakultet za ekonomiju i inženjerski

menadžment, Novi Sad, Srbija.

Prica, N. et al., 2013. Sadržaj natrijumhlorida u proizvodima od mesa. Arhiv veterinarske

medicine, 1(6): 71-79.

Phang, I. R. K. et al., 2018. Isolation and characterization of urease producing bacteria from

tropical peat. Biocatalysis and Agricultural Biotehnology, 13: 168-175.

Samardžija, D. et al., 2001. Karakteristika i uloga mezofilne culture bakterija mlečne kiseline.

Agriculturae Conspectus Scientificus, 2(66): 113-120.

36

Hugas M. and Monfort J., 1997. Bacterial starter cultures for meat fermentation. Food Chem., 59:

547–554.

Hutkins R. W., 2006. Microbiology and technology of fermented foods, Blackwell Publishing,

First edition, IFT Press.

file:///C:/Users/Admin/Downloads/djurdjevic_ivana_ptfos_2014_zavrs_sveuc.pdf

https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:641212

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Јелена Вујић

Ментор, МН: Наташа Јоковић

Наслов рада, НР: Технолошка карактеризација бактеријa млечне киселине изолованих из пеглане кобасице

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2018.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

36 стр. ; 4 слике, 13 табела

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: Микробиологија хране

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: пеглана кобасица, бактерије млечне киселине, технолошке карактеристике УДК 673.05 + 547.472.3 ] : 637.524

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Бактерије млечне киселине (БМК) су Грам – позитивне бактерије

које живе на обогаћеним подлогама. Користе се као стартер културе

при производњи ферментисаних производа, међу којима су

кобасице. У овом раду рађена је технолошка карактеризација

бактерија млечне киселине изолованих из пеглане кобасице.

Коришћени су изолати идентификовани као Lactobacillus sakei (31

сој), Lactobacillus curvatus (5 сојева), Leuconosstoc mesenteroides ssp.

Mesenteroides (1 сој), Leuconostoc mesenteroides ssp. Dextranicum (4

соја), Weisella viridescens (10 соја), Carnobacterium maltaromaticum

(2 соја), Carnobacterium divergens (1 сој), Staphzlococcus hominis (1

сој), Staphylococcus capitis (1 сој), I Staphylococcus sp. (2 соја) који не

припадају групи БМК. Испитан је раст изолата на: ниским

температурама, подлогама са различитим концентрацијама NaCl,

зачина и аw вредностима. Датум прихватања теме, ДП: 05.09.2018.

Датум одбране, ДО: 01.10.2018.

Чланови

комисије,

КО:

Председник: дp Татјана Михаjилов-Крстев

Члан: дp Зорица Стојановић-Радић

Члан, ментор: дp Наташа Јоковић

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: university degree thesis

Author, AU: Jelena Vujić

Mentor, MN: Nataša Joković

Title, TI: Technological characterization of lactic acid bacteria isolated from “peglana” sausage

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2018

Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

36 p. ; 4 pictures, 13 tables

Scientific field, SF: biology Scientific discipline, SD: food microbiology

Subject/Key words, S/KW: “peglana” sausage, lactic acid bacteria, technological characteristics

UC 673.05 + 547.472.3 ] : 637.524

Holding data, HD: library Note, N:

Abstract, AB: Lactic acid bacteria (LAB) are Gram-positive bacteria that live in enriched supstrate. They are used as starter cultures in production of fermented products, among which are sausages. In this paper, the technological caracterization of lactic acid bacteria isolated from “peglana” sausage was done. The isolates were identified as Lactobacillus sakei (31 strains), Lactobacillus curvatus (5 strains), Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (1 strain), Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (4 strains), Weissella viridescens (10 strains), Carnobacterium maltaromaticum (2 strains), Carnobacterium divergens (1 strain), as well as Staphylococcus hominis (1 strain), Staphylococcus capitis (1 strain) and Staphylococcus sp. (2 strains) which don’t belong to the LAB group. The isolates growth was tested on: low temperature, substrates with different concentration of NaCl, spices and aw value.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 05.09.2018.

Defended on, DE: 01.10.2018.

Defended Board, DB: President: PhD Tatjana Mihaliov-Krstev

Member: PhD Zorica Stojanović-Radić

Member, Mentor: PhD Nataša Joković