UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO – MATEMATIĈKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

MASTER RAD

GAJENJE AZOTOFIKSIRAJUĆIH I FOSFOSOLUBILIZIRAJUĆIH BAKTERIJA U

KONTROLISANIM USLOVIMA FERMENTORA U CILJU BIOFERTILIZACIJE

ZEMLJIŠTA

Niš, 2016.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO – MATEMATIĈKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

MASTER RAD

GAJENJE AZOTOFIKSIRAJUĆIH I FOSFOSOLUBILIZIRAJUĆIH BAKTERIJA U

KONTROLISANIM USLOVIMA FERMENTORA U CILJU BIOFERTILIZACIJE

ZEMLJIŠTA

Kandidat: Mentor:

Dunja Ţ. Ilić Prof. Dr Tatjana Mihajilov-Krstev

Niš, 2016.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

MASTER THESIS

GROWING NITROGENFIXATION AND PHOSPHORSOLUBIZING BACTERIA UNDER

CONTROLLED CONDITIONS IN FERMENTOR WITH A GOAL TO FERTILISE THE SOIL

Candidate: Mentor:

Dunja Ţ. Ilić Prof. dr Tatjana Mihajilov-Krstev

Niš, 2016.

ZAHVALNICA

Zahvaljujem svima koji su pomogli u izradi ovog master rada. Najveću zahvalnost

dugujem svom mentoru, prof. dr Tatjani Mihajilov – Krstev, kao i Jovani Jović, na

nesebičnoj podršci i pomoći. Veliku zahvalnost dugujem i firmi ,,Fertico“, kao i vlasniku

Slavoljubu Vukičeviću, koji su mi omogućili sprovođenje celokupnog istraživačkog rada

i dobijanje određenih rezultata.

Posebno zahvaljujem svojoj porodici na razumevanju, podršci i strpljenju za vreme

studiranja, a najviše svojoj mami, kojoj i posvećujem ovaj master rad.

SAŽETAK

Zemljišni mikroorganizmi imaju znaĉajnu ulogu u ekosistemu. Njihova višestruka korist se

ogleda u fiksaciji, solubilizaciji, mobilizaciji i obnavljanju nutritijenata u zemljištu. Obogaćivanje

zemljišta korisnim mikroorganizmima je biofertilizacija tj. implementacija u zemljište u formi

mikrobioloških Ċubriva.

U ovom radu je opisan proces optimizacije medijuma kao i Fed-Batch procesa gajenja

azotofiksatorskih i fosfosolubilizirajućih bakterija, sa ciljem povećanja njihove biomase, proizvodnje

mikrobioloških Ċubriva i njihove implementacije u zemljište. Bakterijske kulture Bacillus subtilis,

Bacillus megatherium i Azotobacter vinelandii su korišćene za ispitivanje procesa fermentacije u strogo

kontrolisanim uslovima bioreaktora. Rezultati naših istraţivanja su pokazali da je odgovarajućom

optimizacijom podloge i kinetikom Fed-batch procesa moguće postići što veću biomasu korisnih

mikroorganizama u fermentoru.

Kljuĉne reĉi: azotofiksirajuće i fosfosolubizirajuće bakterije, mikrobiološka Ċubriva, biofertilizacija.

ABSTRACT

Soils play the crucial role in the ecosystem. Their multiple use is shown in fixation,

solubilization, mobilization and recover of nutritients in soil. Soil fertilization with useful

microorganisms is biofertilization so called implementation of soil in form of microbiological fertilizer.

This work shows the process of optimization of medium as well as fed batch growth

nitrogenfixation and phosphorsolubizing bacteria in order to improve biomass and production of

microbiological fertilizer and their implementation in soil. Bacterias culture Bacillus subtilis, Bacillus

megatherium and Azotobacter vinelandii are used for research of process of fermentation in strictly

controlled conditions of bioreactor. The final results of the search shows that appropriate optimization

of the soil and kinetics fed batch process is possible to gain bigger biomass of useful microorganisms in

fermentor.

Key words: nitrogenfixation and phosphorsolubizing bacteria, microbiological fertilizer,

biofertilization.

SADRŽAJ

1. UVOD ................................................................................................................................................................1

2. OPŠTI DEO .............................................................................................................................................................2

2.1. OSOBINE BAKTERIJA I NJIHOVA GRAĐA ........................................................................................................2

2.2. ZEMLJIŠTE I MIKROORGANIZMI U ZEMLJIŠTU ...............................................................................................7

2.3. ODNOSI MIKROORGANIZAMA U ZEMLJIŠTU ................................................................................................9

2.4. ELEMENTI POTREBNI ZA RAZVOJ BILJAKA ................................................................................................. 11

2.5. CIKLUS AZOTA ............................................................................................................................................. 13

2.6. CIKLUS SUMPORA ....................................................................................................................................... 18

2.7. CIKLUS FOSFORA ......................................................................................................................................... 19

2. 8. ĐUBRIVA .................................................................................................................................................... 20

2.8.1. MINERALNA ĐUBRIVA ......................................................................................................................... 20

2.8.2. ORGANSKA ĐUBRIVA ........................................................................................................................... 23

2.9. MIKROBIOLOŠKA ĐUBRIVA I BIOFERTILIZACIJA.......................................................................................... 25

3. CILJ RADA ........................................................................................................................................................... 34

4. MATERIJAL I METODE ........................................................................................................................................ 35

4.1. MATERIJAL .................................................................................................................................................. 35

4.2. METODE ...................................................................................................................................................... 36

4.2.1. PRIPREMA BAKTERIJSKIH KULTURA ..................................................................................................... 36

4.2.2. PRIPREMA STARTNE KULTURE (inokuluma) ....................................................................................... 37

4.2.3. KONTROLA STERILNOSTI I ODREĐIVANJE BROJNOSTI MIKROORGANIZAMA ..................................... 39

4.2.4. PRIPREMA FERMENTORA .................................................................................................................... 40

4.2.5. METODE BIOFERMENTACIJE ................................................................................................................ 40

5. REZULTATI I DISKUSIJA....................................................................................................................................... 42

Bacillus subtilis ................................................................................................................................................... 42

Bacillus megaterium .......................................................................................................................................... 43

Azotobacter vinelandii ....................................................................................................................................... 44

6. ZAKLJUČAK ........................................................................................................................................................ 45

7. LITERATURA ....................................................................................................................................................... 46

8. BIOGRAFIJA ........................................................................................................................................................ 49

1

1. UVOD

U poljoprivrednoj proizvodnji i uzgajanju biljnih kultura je neophodno zemljištu dodavati

odreĊene asimilate, jer se oni, ili u velikoj koliĉini nalaze u vazduhu (azot), ili su prisutni u

zemljištu u formi koja je nedostupna biljkama (fosfor, azot, kalijum, gvoţĊe i dr.). Zbog toga

se zemljištu dodaju veštaĉka sintetska Ċubriva. Rezultati velikog broja istraţivanja su pokazali

da sintetsko azotno Ċubrivo to jest, dodavanje kombinovanog azota u zemljište u formi koja je

laka za asimilovanje, kroz duţi vremenski period, dovodi do potsticanja razvoja

mikroorganizama (bakterija i plesni) koje se hrane organskom materijom. Sa smanjenjem

sadrţaja organske materije, zemljište podleţe kompaktizaciji, ĉime se ograniĉava rast korena

biljaka i smanjuje sposobnost zadrţavanja vode te zemljište postaje zavisnije od iritacije i

podloţnije eroziji. Sa promenama u fiziĉko – hemijskim karakteristikama zemljišta i sa

smanjenjem raspoloţivog kiseonika usporava se rastmikroflore zemljišta, menja se struktura

prirodnih mikrobiocenoza i sloţeni sistem biološke razmene asimilativa se narušava.

Antropogeno delovanje i navedene promene u zemljištu su prisutne i na obradivim

površinama u Srbiji. Osim toga, povećanje oticanja nitrata dovodi do zagaĊenja nadzemnih

voda, dok emisija azot-dioksida u atmosferu znaĉajno doprinosi efektu staklene bašte. I

najzad, proizvodnja veštaĉkih Ċubriva troši rezerve fosilnih goriva, zagaĊuje ţivotnu sredinu i

veoma mnogo košta.

Mikroorganizmi su, kao neizostavni ĉlanovi svih ţivotnih zajednica, kljuĉni za odrţavanje

biogeohemijskih ciklusa kruţenja materija na Zemlji, i kao najznaĉajnija komponenta

biološke faze zemljišta, vaţni indikator plodnosti i procesa degradacije u njemu. Pored

azotofiksatora koji vraćaju azot iz atmosfere u zemljište, mikroorganizmi mobilišu fosfor,

kalijum, gvoţĊe, sumpor i ĉine ih dostupnim biljkama. Budućnost poljoprivredne proizvodnje

je u primeni biofertilizacije (unošenje ţivih mikroorganizama u zemljište) to jest, u upotrebi

mikrobioloških Ċubriva.

U ovom radu je vršena optimizacija uslova za gajenje azotofiksirajućih bakterija u cilju

proizvodnje velike biomase tj. mikrobioloških Ċubriva.

2

2. OPŠTI DEO

2.1. OSOBINE BAKTERIJA I NJIHOV ZNAĈAJ I GRAĐA

Mikrobiologija je nauka koja se bavi prouĉavanjem mikroorganizama, odnosno

ispitivanjem ţivota veoma sitnih organizama. Naziv mikrobiologija potiĉe od grĉkih reĉi

micros-mali, bios-ţivot, logos-nauka. Mikrobiologija se bavi prouĉavanjem svih pojava i

zakonitosti vezanih za ţivot mikroorganizama, odnosno ona ukljuĉuje morfologiju,

fiziologiju, genetiku, ekologiju i sistematiku mikroba.

Mikroorganizmi su veoma stara grupa organizama, negde oko 4 milijardi godina i

imali su ulogu u formiranju ţivota na Zemlji, a i danas uĉestvuju u njegovom odrţavanju.

Sam naziv kaţe, to su veoma mali organizmi, koji se ne mogu golim okom videti, jer su

manji od 0,1 mm. Mikrobi predstavljaju veoma heterogenu grupu u svakom pogledu, oni

obuhvataju najsitnije organizme – viruse veliĉine 0, 01 mikrometara (virusi nemaju ćelijsku

graĊu), ali obuhvataju i organizme vidljive golim okom (neke alge i gljive). Kao što je već

reĉeno, mikroorganizmi su heterogena grupa koja obuhvata viruse, bakterije, alge, gljive,

lišajeve i protozoe, pa u zavisnosti od toga, mikrobiologija obuhvata sledeće discipline:

bakteriologiju, virusologiju, algologiju, mikologiju, lihenologiju i protozologiju. Oni imaju

razliĉit oblik, veliĉinu, graĊu i fiziologiju, ali se u njihovom prouĉavanju uglavnom koriste

iste metode, dok su im zajedniĉke karakteristike: mala veliĉina tela, brz metabolizam, brzo

razmnoţavanje, rasprostranjenost po celom svetu – kosmopoliti (Petrović et al., 2007).

Mikroorganizmi koji nemaju ćelijsku graĊu su virusi, dok su mikroorganizmi sa

prokariotskim tipom ćelija (nemaju organizovano jedro) bakterije i modrozelene alge, a sa

eukariotskim tipom ćelija (imaju organizovano jedro) su protozoe, gljive, lišajevi, alge.

Uloga mikroorganizama je veoma velika, neophodni su u mnogim procesima. Oni

imaju degradacionu ulogu, to jest, ulogu razlagaĉa, ĉime se omogućava kruţenje materije i

proticanje energije u prirodi. To uglavnom obavljaju bakterije i gljive. Mikroorganizmi su i

producenti primarne organske materije i proizvoĊaĉi kiseonika, a za to su zasluţne alge. Oni

su neizostavni deo ţivota ĉoveka. Njihov uticaj moţe biti i štetan i koristan.

Štetni mikroorganizmi su izazivaĉi mnogih bolesti, pa tako ostvaruju negativan uticaj

na ĉoveka. Mikrobi su neophodni u proizvodnji hrane i pića (proizvodnja jogurta, pravljenje

hleba, turšija). Koriste se u hemijskoj, farmaceutskoj industriji, rudarstvu, agronomiji, zaštiti

šivotne sredine, medicini, genetici, dobijanju energije i drugim oblastima, što prikazuje njihov

3

pozitivan efekat po ĉoveka. Na osnovu ovoga, vidimo da je mikrobiologija veoma bitna

nauĉna disciplina, koja se još uvek razvija i koja ima veliku primenu u svim segmentima

ţivota, dok se mikroorganizmi sve više i više primenjuju u razliĉitim granama. Mikrobiologija

je doprinela razvoju molekularne biologije, genetike, biohemije, biotehnologije (Petrović et

al., 2007).

Bakterije spadaju u prokariotske mikroorganizme. One su veoma malih dimenzija,pa

se posmatraju pomoću mikroskopa. Bakterije su najsitniji organizmi celularne graĊe. Postoje

razliĉiti oblici bakterijskih ćelija, ali se kao osnovni oblici izdvajaju: loptast, štapićast, izvijen

i konĉast oblik. Loptaste bakterije su koke, koje obuhvataju više tipova: monokoke,

diplokoke, tetrade, sarcine, u zavisnosti od naĉina razdvajanja nakon deobe. Štapićaste

bakterije su bacilli koji isto obuhvataju razliĉite tipove. Bakterije koje imaju izvijen oblikili

izgled zapete su vibrioni. Konĉast oblik imaju bakterije kod kojih je jedna dimenzija

izraţenija od ostalih i one mogu biti granate i negranate. Postoje i mnogidrugi izvedeni oblici

bakterija (Petrović et al., 2007).

Bakterije u svom sastavu imaju odreĊene morfološke i funkcionalne strukture (Slika

1.) koje obuhvataju:

- površinske ćelijske strukture i vanćelijske tvorevine (spoljašnji omotaĉi, ćelijski zid

i izraštaji na ćeliji);

- citoplazmu, citoplazmatske ćelijske strukture i ćelijske inkluzije (citoplazma,

citoplazmatska membrane i intracelularne membranske tvorevine, ribozomi,

nukleoid).

Spoljašnji omotaĉi bakterijskih ćelija su:

- Glikokaliks predstavlja omotaĉ koji naleţe na ćelijski zid. On je izgraĊen od homo

ili heteropolisaharida, a reĊe od glikoproteina i polipeptida.

- Kapsula predstavlja kompaktan omotaĉ bakterijske ćelije koji je izgraĊen od

polisaharida, ĉvrstine gela. Postoje razliĉite vrste polisaharida koje grade kapsulu.

Nemaju sve bakterijske ćelije kapsulu na svojoj površini. Bakterije koje imaju

kapsulu uglavnom imaju sjajnu i glatku površinu – S tip kolonija, dok one koje je

nemaju su hrapave i mat – R tip kolonija. Osnovna funkcija kapsule je zaštita

bakterijskih ćelija. Ona je osmotska barijera, spreĉava isušivanje ćelija i štiti ćeliju

od spoljnih uticaja.

- Sluzna sara predstavlja rigidni omotaĉ proteinsko-polisaharidno-lipidne graĊe

gvoţĊevitih i manganskih bakterija.

4

- S omotaĉi su planarne kristalne strukture na samoj površini ćelija, izgraĊene od

proteina ili glikoproteina. Kod arhea su jedini omotaĉi, ali se sreću i kod ostalih

bakterija.

Slika 1. GraĊa bakterijske ćelije

Ćelijski zid bakterija je sloţene graĊe i ĉine ga polisaharidi i peptidi, koji su povezani

kovalentnom vezom. Njegova osnovna jedinica graĊe je muropeptid koji je sastavljen iz N-

acetilglukozamina povezanog β (1-4) glikozidnom vezom sa N-acetilmuraminskom

kiselinom, vezanom za tetrapeptid. Ćelijski zid se razlikuje u graĊi kod Gram pozitivnih i

Gram negativnih bakterija. Razlika je po tipu veza u mureinu, hemijskom sastavu i strukturi.

Osnovna funkcija ćelijskog zida je da daje oblik ćeliji i štiti od spoljašnjih uticaja. On ne

predstavlja osmotsku barijeru, jer je porozan. Antibiotski agensi narušavaju strukturu

ćelijskog zida, jer ometaju njegovu sintezu (Petrović et al., 2007).

Bakterije se mogu kretati pasivno i aktivno. Pasivan naĉin kretanja bakterija je rezultat

fiziĉkih sila i pokretanja ĉestica teĉnosti, dok je aktivan naĉin kretanja bakterija rezultat

metaboliĉkih procesa u samoj ćeliji, pri ĉemu se bakterije kreću klizeći ili plivajući. Bakterije

se kreću plivajući pomoću flagela. Flagele su tanki i dugaĉki izraštaji koji se sastoje iz

bazalnog tela, kuke i filamenta (u ĉijem sastavu ulaze proteinske subjedinice flagelina). Za

pokretanje flagela je neophodno prisustvo Mot proteina, bitnog za stvaranje energije. Flagele

se pokreću rotacijom, u smeru suprotnom kazaljci na satu. Broj flagela kod bakterija je

razliĉit, mogu imati jednu flagelu i to su monotrihe bakterije ili više njih i to su politrihe

bakterije.Bakterije koje nemaju flagele su atrihe. Spirohete imaju specifiĉne strukture za

5

kretanje, odnosno aksijalni filament. Ukoliko su pokreti bakterija uslovljeni nekim nadrţajem,

onda se nazivaju taksije (hemotaksije, fototaksije).

Bakterije imaju još površinskih struktura, a to su fimbrije i pili. Fimbrije nemaju ulogu

u kretanju, već omogućavaju adheziju bakterija. One su tanje od flagela i u mnogo većem

broju (Petrović et al., 2007).

Pili su sliĉni fimbrijama, graĊeni od subjedinica pilina i uglavnom se javljaju jedan do

tri. Njihova uloga je u razmeni genetiĉkog materijala, u procesu konjugacije, pa se zato i zovu

sex pili.

Citoplazma bakterija se sastoji iz vode, 70 – 80 %, u kojoj su rastvoreni razliĉiti

organski molekuli, koji su gradivne materije ćelije (aminokiseline, peptidi, proteini, lipidi,

ugljeni-hidrati, vitamini, joni). Koliĉina vode odreĊena je fiziološkim procesima u ćeliji,

starenjem ćelija, kao i spoljnim uticajima. U citoplazmi bakterijskih ćelija se ne javljaju

organele karakteristiĉne ze eukariote. Prisutni su ribozomi, koji imaju ulogu u sintezi proteina.

Broj ribozoma zavisi od metaboliĉkih aktivnosti ćelija. Bakterije kao ekvivalent jedru imaju

nukleoid, koji predstavlja deo citoplazme sa DNK, ali bez jedrovog omotaĉa (Petrović et al.,

2007).

Intracelularne membranske tvorevine – mezozomi, u širem smislu su razliĉite

morfološke invaginacije citomembrane koje predstavljaju morfološki i funkcionalno

jedinstven sistem. Ove tvorevine su, zapravo, analozi eukariotskih organela, pa tako ovde

spadaju:

- analozi mitohondrija imaju ulogu u ćelijskoj respiraciji;

- mezozomi imaju ulogu u deobi Gram pozitinih bakterija;

- kruškaste tvorevine imaju ulogu u replikaciji DNK;

- analozi glatkog, hrapavog endoplazmatiĉnog retikuluma i druge strukture.

Citoplazmatske inkluzije se mogu javljati u ćelijama i biti organskog ili neorganskog

porekla. Uglavnom predstavljaju rezervne hranljive materije (primer, glikogen i skrob, koji su

polisaharidne inkluzije) (Petrović et al., 2007).

Neki bakterijski rodovi imaju sposobnost formiranja endospora. To su zaštitne,

latentne forme ili forme za konzervaciju i uglavnom ih formiraju Gram pozitivne bakterije

(Clostridiumi Bacillus). Enzimska i metaboliĉka aktivnost endospora svedena je na minimum

ili je potpuno odsutna pa ona predstavlja dormantni stadijum. Spore nastaju tokom

sporogeneze, odnosno sporulacije koja poĉinje kada dostupnost hranljivih materija kreće da

opada u stacionarnoj fazi rasta. Spora je u stanju mirovanja sve dok ne dospe u povoljne

uslove za ţivot, što moţe trajati i nekoliko stotina godina. Aktivacija spora kreće pod uticajem

6

nekih spoljašnjih faktora. Spore imaju zaštitnu ulogu, odnosno omogućavaju preţivljavanje

nepovoljnih perioda.

Bakterije stvaraju i dodatne formacije koje su oznaĉene kao ciste (karakteristiĉne za

rod Azotobacter). Ciste su otporne na isušivanje, mehaniĉke uticaje i UV zraĉenje, ali nisu

otporne na visoke temperature i nisu potpuno dormantne. Postoje i mikrospore ćija je

otpornost mnogo manja nego li kod endospora. Neke bakterije stvaraju i egzospore, dok su za

metanogene i fotosintetske bakterije karakteristiĉne dormantne egzospore. Aktinomicete i

Gram pozitivne filamentozne razgranate bakterije formiraju konidije, koje prvenstveno sluţe

za razmnoţavanje (Petrović et al., 2007).

Kao i svi drugi organizmi, bakterije rastu i razmnoţavaju se. Za rast bakterija

neophodna je hrana koja potiĉe iz spoljašnje sredine, pri ĉemu bakterije usvajaju hranljive

materije. Hrana je neophodna za sve ţivotne procese i predstavlja izvor energije, kao i

gradivne materije. Pod rastom prokariotskih ćelija podrazumeva se povećanje koliĉine svih

hemijskih komponenti koje ih grade. U mikrobiologiji se uglavnom prati rast populacije, koja

predstavlja skupinu ogromnog broja ćelija koje vode poreklo od jedne ćelije. Ukoliko su

populacije nastale u definisanim uslovima sredine, pod kontrolisanim laboratorijskim

uslovima, oznaĉavaju se kao kulture. Kulture su ĉiste ako sadrţe samo jednu vrstu organizma,

a mešovite ako sadrţe više vrsta organizama. Rast bakterija nije beskonaĉan, jer nakon

dostizanja odreĊenih veliĉina ćelija stupa u deobu. Rast je uvek praćen deobom ćelija što

dovodi do povećanja broja ćelija. Bakterije se razmnoţavaju prostom ćelijskom deobom, koja

je binarna, popreĉna i dovodi do obrazovanja dve identiĉne ćerke ćelije. Deoba poĉinje

udvajanjem genetiĉkog materijala. Nasledni materijal bakterija je jedan, dvostruki,

cirkulatorni DNK molekul, koji je smešten u nukleoidu (Petrović et al., 2007).

Razmena genetiĉkog materijala kod prokariota, a samim tim i bakterija vrši se:

- transformacijom, usvajanjem DNK fragmenata jedne bakterije od strane druge

bakterije, direktno iz spoljašnje sredine u koju ona dospeva nakon smrti i lize

bakterijske ćelije;

- konjugacijom, uspostavljanjem bliskog kontakta dve bakterije pomoću sex pila (F

pila);

- transdukcijom, prenošenje genetskog materijala sa jednje bakterije na drugu

pomoću bakteriofaga (virusi koji inficiraju bakterije) (Petrović etal., 2007).

Na osnovu metode diferencijalnog bojenja bakterija po Gramu, koje je dobilo naziv po

danskom nauĉniku Kristian Gramu, bakterije se dele na: Gram pozitivne i Gram negativne

bakterije i zbog toga, ovaj naĉin bojenja sluţi za identifikaciju bakterijskih grupa. Ovim

7

bojenjem Gram pozitivne bakterije se boje ljubiĉastom bojom, a Gram negativne bakterije se

boje crvenom bojom. Ove razlike su uslovljene fiziĉko – hemijskim osobinama bakterija, a i

hemijskim sastavom ćelijskih zidova. Gram negativne bakterije u svom ćelijskom zidu imaju

lipopolisaharid, dok Gram pozitivne bakterije imaju peptidoglukane, koje etanol ne rastvara

pa i nakon obezbojavanja ostaju ljubiĉaste. Lipopolisaharide etanol rastvara pa se u sledećem

bojenju boje crveno (Mihajilov – Krstev, 2008).

Mikroorganizmi su kosmopoliti, odnosno oni imaju širok spektar rasprostranjenja.

Naseljavaju celokupnu biogeosferu (pedosferu, hidrosferu, atmosferu i biosferu).

Mikroorganizmi imaju znaĉajnu ulogu u stvaranju, odrţavanju i funkcionisanju razliĉitih

ekosistema i rasprostranjeni su u svim ekološkim sistemima, pri ĉemu se njihova aktivnost

odvija stalnom interakcijom abiotiĉkih i biotiĉkih komponenti (Petrović et al., 2007).

2.2. ZEMLJIŠTE I MIKROORGANIZMI U ZEMLJIŠTU

Zemljište (pedosfera) je obavezna komponenta svake biogeocenoze i predstavlja tanak

površinski sloj zemljine kore. Zemljište nastaje procesom pedogeneze, usled dugotrajnog

delovanja klimatskih, bioloških i reljefnih faktora na matiĉnu stenu. Zemljište je polidisperzni

sistem i ĉine ga tri faze: ĉvrsta, teĉna i gasovita faza. Tip i kvalitet zemljišta odreĊuju mnogi

faktori kao što su njegove fiziĉke osobine (veliĉina ĉestica), organski ostatak (humus, nastaje

degradacijom ţivotinjskih i biljnih otpadaka), voda i gasovi. Zemljište predstavlja ţivotnu

sredinu mnogih biljaka, ţivotinja i mikroorganizama, a njegova ekološka uloga se razmatra u

vidu:

- biogeocenotiĉke funkcije zemljišta i

- globalne funkcije zemljišta (Đukić et al., 2000).

Globalnim funkcijama zemljišta pripadaju:

biohemijske transformacije površinskih slojeva litosfere;

hidrološke funkcije zemljišta;

uticaj zemljišta na gasni reţim i kruţenje vode u atmosferi;

uloga zemljišta kao faktora evolucije (Đukić et al., 2000).

Biogeocenotiĉke funkcije zemljišta su u neposrednoj vezi sa ţivotnom aktivnošću

zemljišnih mikroorganizama. Ovde spadaju:

- fiziĉke funkcije (stanište i sklonište, mehaniĉki oslonac, depo semena);

8

- fiziĉko – hemijske funkcije (izvor hranljivih elemenata; stimulator i

inhibitor biohemijskih procesa; depo vlage, hranljivih materija i energije;

sorpcija materija i mikroorganizama);

- informacione funkcije (signal za niz bioloških procesa; regulator brojnosti

istrukture biogeocenoza; pogonski mehanizam nekih sukcesija; odrţavanje

istorije razvoja biogeocenoze)

- opšteekološke funkcije (akumulacija i transformacija materije i energije;

sanitarna funkcija; puferni i zaštitini biogeocenotiĉki ekran; uslovi nastanka

i evolucije organizama) (Đukić et al., 2007).

Zemljište kao ţivotna sredina pruţa najpovoljnije uslove za ţivot skoro svih grupa

mikroorganizama. Mikrobi koji se nalaze u zemljištu svojom aktivnošću utiĉu na osnovne

karakteristike zemljišta, njegovu strukturu i plodnost. Zbog svega ovoga, mikroorganizmi koji

ţive u zemljištu se smatraju posebnom grupom i predstavljaju nerazdvojni ĉinilac zemljišta.

Tako zemljište predstavlja njihov rezervoar, pri ĉemu oni dospevaju i u druge ţivotne sredine.

Odnos mikroorganizama u zemljištu je uravnoteţan i karakteristiĉan za svaki tip zemljišta.

Ukoliko se zemljište tretira pesticidima, obraĊuje i koriste Ċubriva odnos mikroorganizama se

narušava.To se manifestvuje promenom brojnosti, sastava i aktivnosti mikroorganizama. Ove

karakteristike (brojnost i aktivnost mikroorganizama) karakterišu se kao plodnost zemljišta

(Đukić et al., 2007).

U zemljištu mikroorganizmi imaju odreĊeni raspored i on moţe da bude:

- horizontalni raspored mikroorganizama;

- vertikalni raspored mikroorganizama.

Horizontalni raspored mikroba u zemljištu podrazumeva njihovo prisustvo od polova

ka ekvatoru. On je uslovljen najviše klimatskim faktorima. Na osnovu ovog rasporeda,

utvrĊeno je da su juţnija zemljišta bogatija mikoorganizmima.

Vertikalni raspored zemljišta se definiše kao raspored mikroorganizama po dubini

zemljišta. Tu je izraţena odreĊena pravilnost koja govori o odreĊenim mikrobiološkim

profililma u zemljištu, odnosno o posebnom rasporedu mikroorganizama. Ovaj mikrobiološki

profil je karakteristiĉan za svaki tip zemljišta. Kada je organska materija zastupljenija na

površini zemljišta, onda se mikroorganizmi nalaze bliţe površini i tu je njihova brojnost veća

(Petrović et al., 2007).

Mikrobno naselje u zemljištu ima veoma vaţnu i veliku ulogu. Mikroorganizmi

uĉestvuju u nastanku i stvaranju zemljišta (pedogenezi), kao i u njegovoj daljoj evoluciji.

Svojom aktivnošću oni doprinose promenama u sredini, ali i prilagoĊavaju uslove svojim

9

potrebama. Istovremeno su sposobni da se adaptiraju promenjenim uslovima. Tako utiĉu,

pored stvaranja i na odrţavanje sadašnjeg zemljišta. Oni se u zemljištu nalaze u ogromnim

koliĉinama, ali njihov precizan broj nije utvrĊen.

Na brojnost mikroba u zemljištu utiĉu mnogi faktori, kako ekološki, tako i mnogi

drugi. Najveći uticaj imaju njegove fiziĉko – hemijske osobine, tip zemljišta, karakter

vegetacije, temperatura, dostupnost vode i hranljivih materija, pH vrednosti i biotiĉki faktori.

Najveća brojnost mikroorganizama je u zemljištu koje ima visok sadrţaj organskih materija,

odnosno humusa. Nastanak humusa je uslovljen i aktivnošću mikroorganizama, pri ĉemu se

od biljnih i ţivotinjskih ostataka, procesima fermentacije, amonifikacije i saponifikacije

dobijaju CO2, H2O, NH3, mineralne soli, druga organska jedinjenja i mikrobiološki protein.

Polimerizacijom i kondenzacijom dobija se organska materija koja se razlikuje od polaznih

jedinjenja, a sadrţi visok sadrţaj humusnih kiselina pa se zato zove humus, a sam proces je

humifikacija. Ove humusne kiseline se stvaraju od fenolnih azotnih jedinjenja (Đukić et al.,

2007).

U zemljištu su zastupljene razliĉite vrste mikroorganizama i one se oznaĉavaju kao

zemljišni mikroorganizmi. Najzastupljenije su bakterije, aktinomicete, gljive, alge i na kraju

protozoe. Aktinomicete su zastupljene u manjem broju od bakterija i njihova uloga je u

razgradnji kompleksnih organskih supstrata. Odlikuje ih produkcija antibiotika. Gljive koje se

nalaze na površini zemljišta imaju ulogu u razgradnji celuloze, pektina, lignina, povezivanju

ĉestica zemljišta. Zelene i silikatne alge imaju ulogu u formiranju zemljišta. Što se bakterija

tiĉe, javljaju se i autotrofni i hetrotrofni predstavnici, aerobne i anaerobne bakterije koje mogu

biti i mezofili, termofili. Njihova uloga je ogromna, svojom metaboliĉkom aktivnošću,

celulolitskom, proteolitskom ili uzimanjem šećera tokom azotofiksacije imaju vaţnu ulogu u

obogaćivanju zemljišta azotom (Đukić et al., 2007).

2.3. ODNOSI MIKROORGANIZAMA U ZEMLJIŠTU

Mikroorganizmi u zemljištu su meĊusobno povezanim razliĉitim odnosima,ali su

takoĊe, povezani i sa drugim stanovnicima zemljišta, algama, ţivotinjama, biljkama (njihovim

korenovim sistemom). Ovi odnosi su veoma sloţeni. Njihovu osnovu ĉine kruţenje materije i

proticanje energije pri ĉemu se u toku ţivotne aktivnosti mikrobne populacije razmenjuju

izmeĊu sebe i sa drugim predstavnicima, svojim proizvodima metabolizma, biološki aktivnim

supstancama. Odnosi izmeĊu mikroorganizama su neutralizam (bez efekata populacija jedne

na drugu), amensalizam (jedna populacija suzbija drugu, ali ne trpi negativno dejstvo),

parazitizam (jedna populacija nepovoljno deluje na drugu, ali zavisi od nje), komensalizam

10

(jedna populacija ima korist iz zajednice, a druga nema ni korist, ni štetu), protokooperacija

(obe populacije imaju korist, ali njihova veza nije obligatna) i mutualizam (obe populacije

imaju korist i ne mogu jedna bez druge) (Đukić et al., 2007).

Odnosi izmeĊu mikroorganizama se dele u dve grupe i to su antagonizam i simbioza.

Prilikom borbe za hranu, pogotovo ako ona nedostaje, dominiraju konkurencija i

amensalizam. To moţe dovesti i do eliminacije jedne populacije. PrilagoĊeniji mikrobi mogu

istisnuti one manje prilagoĊene. Jedan od naĉina borbe jeste produkcija antibiotika jedne

populacije, koji ima negativni uticaj na drugu populaciju. Tako, na primer, Streptomyces

olivocinereus, koji je producent heliomicina, suzbija u nesterilnom zemljištu populaciju

Arthrobacter crystallopoietes (Đukić et al., 2007).

Simbiotski odnosi se manifestvuju razliĉito i oni se razvijaju po tipu komensalizma.

Primećena je koegzistencija izmeĊu celuloznih mikroorganizama i slobodnih azotofiksatora, u

osnovi ĉega leţi protokooperacija (Cellvibrio, Corynobacterium + Clostridium; mikromicete

+ Clostridium; Cytophaga + Azotobacter) (Đukić et al., 2007).

Pored meĊusobnih odnosa mikroorganizama znaĉajni su i njihovi odnosi sa

zemljašnim ţivotinjama, koji mogu biti pozitivni i negativni. Mikrobi ţivotinjama mogu

sluţiti kao hrana, ali oni mogu da stvaraju odreĊene antibiotiĉke materije protiv odreĊenih

zemljišnih ţivotinja (protozoe).

Znaĉajni su i odnosi izmeĊu algi i mikroba, pri ĉemu su zasnovani na protokooperaciji

i obe populacije imaju korist. Alge se primenjuju u poljoprivredi u ulozi biostimulatora

mikroba i biljaka, a i u vidu organskog Ċubriva, što omogućava manju upotrebu veštaĉkih

Ċubriva. U samom zemljištu se aktiviraju mikrobiološki procesi, smanjuju se gubici

mineralizovanog azota, zemljište se obogaćuje mikroelementima i drugim materijama (Đukić

et al., 2007).

Odnosi izmeĊu mikroorganizama i biljaka isto mogu biti pozitivni i negativni.

Negativni odnosi se odnose na produkciju jedinjenja kojia imaju inhibitorno dejstvo na rast

biljaka, ali i jedinjenja koja izazivaju razliĉita oboljenja biljaka, koja mogu zahvatati

nadzemni deo ili korenov sistem. Postoji mnogo toksiĉnih oblika bakterija i nalaze se u svim

tipovima zemljišta. Poznati su Bacillus i Pseudomonas.

Pozitivni odnosi su oni koji ĉine osnovu pedogeneze i plodnosti zemljišta. Mikrobi

zajedno sa algama pripremaju mrtve supstrate za razvoj poĉetnih biljnih zajednica. Osnovni

destruktori biljnog otpada su mikroorganizmi i time doprinose kruţenju ugljenika i drugih

elemenata u prirodi. Bakterije i drugi oblici mikroorganizama doprinose ishrani biljaka. Oni

se razvijaju aktivno u zoni korenova i njihovoj blizini transformišu organska i mineralna

jedinjenja zemljišta, snabdevajući biljke potrebnim elementima ishrane. Mikrobi stvaraju i

11

biološki aktivne materije – vitamine, aminokiseline, biljne hormone (auksine i gibereline) koji

imaju ulogu u ţivotu biljke, disanju, fotosintezi, oploĊivanju, fosfornu i azotnu razmenu

(Đukić et al., 2007).

Biljke takoĊe utiĉu na razvoj mikroba u zemljištu stvarajući im povoljne uslove za

njihov opstanak. Tokom njihove vegetacije izdvajaju se mineralna i organska jedinjenja koja

predstavljaju hranu mikrobima. One regulišu pH zemljišta i nivo vlaţnosti što stvara povoljne

uslove za rast mikroba (Đukić et al., 2007).

2.4. ELEMENTI POTREBNI ZA RAZVOJ BILJAKA

Za rast i razvoj biljaka neophodni su mnogi elementi. Biljke primaju razliĉite

mineralne soli iz zemljišta na kome ţive. Elementi bez kojih biljke ne mogu da ţive

oznaĉavaju se kao esencijalni elementi i njih ĉini grupa od 17 elemenata. To su ugljenik,

kiseonik, vodonik, azot, sumpor, fosfor, kalijum, kalcijum, magnezijum, gvoţĊe, mangan,

cink, bakar, bor, hlor, molibden, nikl. Korisni elementi su elementi bez kojih biljka moţe da

opstane,ali ipak imaju pozitivni efekat ukoliko su prisutni (silicijum je koristan za mnoge

trave, jer daje ĉvrstinu ćelijskom zidu; aluminijum utiĉe na boju nekih cvetova, a samim tim i

na oprašivanje). Na osnovu potreba biljaka, elemente moţemo da podelimo na:

- makroelemente, biljci potrebni u velikim koliĉinama (N, P, K, Ca, Mg, S );

- mikroelemente, biljci potrebni u malim koliĉinama (B, Cl, Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Ni)

(Kastori., 1991).

Uloga ovih elemenata je višestruka i raznovrsna. Zbog toga su oni grupisani u

nekoliko grupa:

1. Elementi koji ulaze u sastav organskih molekula. Veliki broj elemenata uĉestvuje

u izgradnji najvaţnijih organskih jedinjenja. To su ugljenik, vodonik i kiseonik.

Ugljenik, vodonik i kiseonik biljke dobijaju iz vode i ugljen-dioksida. Pored ovih

elemenata, ovde spadaju i azot, fosfor, sumpor, magnezijum, bakar i cink.

2. Kofaktori u enzimskim reakcijama. U većini enzimskih reakcija neophodno je

uĉešće nekog mineralnog elemenata. Mnogi enzimi sadrţe jone metala (kalcijum

ulazi u sastav amilaze, cink u alkoholnoj dehidrogenazi).

3. Uĉesnici u transportu elektrona. Najrasprostranjeniji su prenosioci koji sadrţe jon

gvoţĊa, bakar i molibden.

4. Slobodni joni. Neki elementi se nalaze kao slobodni joni u citosolu i tako

odrţavaju osmotski potancijal ćelije. Takvu ulogu imaju kalijum i hlor, ali mogu

12

inatrijum i kalijum da doprinesu odrţavanju osmotskog potencijala (Kastori.,

1991).

Azot je element koji uĉestvuje u izgradnji proteina, nukleinskih kiselina, u formiranju

peptidnih veza. On obezbeĊuje porast i plodonošenje voćaka, pre svega, uslovljava rast i

razvoj svih organa. U sluĉaju njegovog nedostatka biljka usporava svoj rast, zbog smanjene

sinteze organskih jedinjenja. Lišće gubi zelenu boju, sitniji su listovi, cvetovi i plodovi.

Ukoliko se nalazi u većim koliĉinama isto nepovoljno utiĉe na biljku. Stabla i listovi su bujno

razvijeni, koren je manji, smanjeni su plodovi.

Sumpor ulazi u sastav aminokiselina, koenzima i vitamina. Nedostatak sumpora je

redak u prirodi, ali dovodi do istih simptoma kao i nedostatak azota. Biljke su male,

zakrţljalog rasta, listovi su mali, uski. Prevelika koliĉina sumpora za biljku je štetna.

Fosfor je sastavni deo ATPa, nukleotida, nukleinskih kiselina, fosfolipida,

fosforilizovanih šećera, koenzima NAD, NADP, FAD. Biljka jednu istu koliĉinu fosfora moţe

stalno da koristi i to je reutilizacija fosfata, tako što fosfat prelazi iz starijih delova biljke u

mlaĊe. U sluĉaju njegovog nedostatka ili povećane koncentracije, dolazi do promena na

biljkama, odnosno nekroze biljaka.

Kalijum je jedini elemenat koji se u biljci javlja iskljuĉivo u jonskom obliku. On se

nikada ne ugraĊuje u organska jedinjenja. Kalijuma ima najviše u meristemskim tkivima u

kojima se vrše aktivne ćelijske deobe. Kalijum uĉestvuje u uspostavljanju osmotskog

potencijala (Kastori., 1991).

Kalcijum inkrustrira ćelijske zidove, odrţava integritet membrane i spreĉava njena

oštećenja i pasivnu propustljivost. Neophodan je za dejstvo mnogih enzima.

Joni magnezijuma su aktivatori mnogih enzima i uĉestvuju u graĊi molekula hlorofila.

GvoţĊe ima ulogu u razliĉitim redoks sistemima, jer lako moţe da primi i otpusti

elektron.

Mangan kao dvovalentni je aktivator mnogih enzima u ciklusu TCA, sintezi masnih

kiselina i nukleinskih kiselina.

Bakar uĉestvuje u nekim redoks sistemima, jer njegov atom moţe da menja valencu.

Sastavni je deo citohrom oksidaze u mitohondrijama i plastocijanina u hloroplastima

(Kastori., 1991).

Cink je sastavni deo alkoholne dehidrogenaze i u njegovom nedostatku biljke su

malog rasta, sa kratkim internodijama.

Bor je esencijalan samo za više biljke i lokalizovan je u ćelijskom zidu gde utiĉe na

transport kroz membranu, naroĉito na transport šećera. Molibden je sastavni deo nitratne

reduktaze i u njegovom nedostatku biljke ne mogu da koriste nitrat. Kod mikroorganizama

13

koji fiksiraju azot, molibden je neophodan i kao sastavni deo enzima nitrogenaze (Kastori.,

1991).

Hlor je kofaktor u fotosintezi pri transportu elektrona od vode do fotosistema II.

Prateći je anjon pri transportu kalijuma i ima znaĉaja za odrţavanje turgora. U sluĉaju

nedostatka svih ovih elemenata ili ukoliko se oni nalaze u povećanim koncentracijama dolazi

do promena na biljkama, koje uglavnom utiĉu na rast i boju biljaka (Kastori., 1991).

Azot i sumpor ulaze u većinu organskih jedinjenja samo u redukovanom obliku i zato

njihovi oksidovani oblici, nitrat i sulfat moraju prethodno da se redukuju. Redukciju azota i

sumpora obavljaju samo biljke. Azot je najobilniji sastojak vazduha, ali biljke ne mogu da

koriste atmosferski azot za svoje potrebe. Tu sposobnost imaju samo izvesne bakterije i

aktinomicete. One redukciju obavljaju u biljci (biljka odmah ukljuĉuje amonijum u svoje

metaboliĉke procese) ili u zemljištu, pri ĉemu ga biljka apsorbuje iz zemljišta (Kastori.,

1991).

2.5. CIKLUS AZOTA

Azot se nalazi u vazduhu i ĉini 78% atmosferskog vazduha, u obliku neorganskih jona

NO3- i NH4

- ulazi u sastav zemljišta i kao sastojak mnogih organskih jedinjenja rasprostranjen

je u celom ţivom svetu. Ovi oblici azota se neprikidno transformišu jedan u drugi i sve te

promene su povezane u ciklus azota. Više biljke dobijaju azot iskljuĉivo iz zemljišta na kome

ţive. Zemljište se stalno obogaćuje azotnim jedinjenjima koja potiĉu od ţivih ili izumrlih

ţivotinja i biljaka. Skoro 90% azota u zemljištu se nalazi u obliku organskih azotnih

jedinjenja koje bakterije i gljivice razlaţu i obrazuju amonijak (Jemcev and Đukić., 2000).

Mikrobiološka fiksacija azota je veoma bitna, pošto drugi organizmi ne mogu da

fiskiraju elementarni azot iz atmosfere. On je kao takav nedostupan za njih i zbog toga je

veoma bitno postojanje azotofiksatora. Azotofiksatori imaju sposobnost da elementarni azot iz

vazduha ukljuĉuju u svoj azotni metabolizam. Taj proces katalizuje enzimski kompleks

nitrogenaza. Za aktivnost ovog kompleksa neophodna je odreĊena koliĉina energije, ATPa.

Elementarni azot se pomoću ovog enzima redukuje do amonijaka. Amonijak se dalje koristi

za sintezu aminokiselina. Azotofiksatori su uglavnom bakterije, modrozelene alge,

aktinomicete i neke gljive. Ovi organizminastanjuju sva zemljišta i sve vodene sredine

(Jemcev and Đukić., 2000).

Postoji više grupa azotofiksatora:

- Slobodni azotofiksatori, ţive u zemljištu ili rizosferi biljaka, ali nisu vezani za

biljke i ne izazivaju morfološke promene. Slobodni azotifiksatori iz bakterijskih

14

rodova su Azotobacter, Derxia, Azomonas i Clostridium, a tu se svrstavaju i

Cianobacteria.

- Asocijativni azotofiksatori, vezani su za biljke, ali ne izazivaju morfološke

promene. Oni predstavljaju prelaz izmeĊu simbiotske i slobodne azotofiksacije.

Predstavnici ove grupe azotofiksatora su Azospirillum, Pseudomonas, Enterobacter.

- Simbiotski azotofiksatori, vezani su za biljke i izazivaju promene na biljkama. Ţive

na korenu leguminoznih biljaka i tu formiraju nodule, odnosno kvrţice. Simbioza

izmeĊu njih i biljaka je genetski odreĊena i specifiĉna. U grupu slobodnih

azotofiksatora spadaju Rhizobium i Bradyrhizobium (Jemcev and Đukić., 2000).

Od ukupnog biološkog azota, 80% proizvedu slobodni azotofiksatori. Koliĉina takvog

azota po jedinici površine je znatno manja nego što mogu da proizvedu simbiotski

azotofiksatori, ali je ipak znaĉajna, jer ĉak i bez Ċubrenja usevi mogu da daju 30% prinosa u

odnosu na poĊubrenu varijantu.

Od asocijativnih azotofiksatora najvaţniji su: Azotobacter chroooccum, Azotobacter

vinelandii, Azospirillum lipoferum, Beijerinckia derxii, Klebsiella planticola, Bacillus

subtillis, Bacillus megaterium, Pseudomonas sp., Clostridium i dr. Ovo su heterotrofni

organizmi kojih ima svuda u zemljištu, ali je vaţna njihova odlika da imaju dobar

interakcijski odnos sa biljkama zato što najbolje uslove za ţivot imaju u njihovoj rizosferi, pri

ĉemu od biljke dobijaju energiju u vidu šećera koje biljka izluĉuje na aktivnom delu

korenovog sistema, a zauzvrat joj daju fiksirani azot u obliku vezane forme NH,

hidroksilamina, aminokiselina, peptida, hormona rasta, biofungicida itd.

Osim fiksacije atmosferskog azota, većina ovih mikroorganizama je sposobna za

izvlaĉenje fosfora, kalijuma ili nekog drugog elementa iz kristalne rešetke minerala u

zemljištu i da ga stave u vodeni rastvor pristupaĉan biljkama. U okviru jedne vrste bakterija

postoji mogućnost pojave sojeva, koji su posebno prilagoĊeni na jednu biljnu vrstu ili ĉak

sortu, tako da njihovim izdvajanjem i umnoţavanjem, zatim inokulacijom semena ili

predsetvenom inkorporacijom u zemljište, moţe da se postigne povećanje prinosa 10-20%

(Jemcev and Đukić, 2000).

Kod jednogodišnjih biljaka najbolji rezultati su postignuti inokulacijom semena, pri

ĉemu bakterije prate rast mladih korenĉića, a kod povrtarskih vrsta i voća bolje je namoĉiti

korenov sistem rasada i sadnica u teĉnu kulturu azotofiksatora. Istovremeno, treba smanjiti

unos azotnih Ċubriva za 30-40%.

Pošto su ovi mikroorganizmi jako osetljivi na direktnu svetlost, taĉnije, ultravioletni

zraci su smrtonosni za njih, podrazumeva se da se tretiranje biljnog materijala vrši u senci.

15

Ima mnogo gotovih preparata sa bakterijama azotofiksatorima koji se mogu kupiti, a

moguće je vrlo lako u domaćoj radinosti napraviti mikrobiološko Ċubrivo. Obiĉno se uzima

plodna baštenska zemlja u kojoj sigurno ima Azotobactera. Sitna i prosejana zemlja se meša

sa 2-5% nekog izvora ugljenih hidrata (brašno, melasa, šećer,...), uz to se dodaje voda da

smesa doĊe u stanje lepljive plastiĉne mase, koja se u tankom sloju 1-2,5 cm razmazuje u

posudama i ostavlja na toplom. Za 3-4 dana celu masu prekrije i proţme sluzava masa od

ćelija Azotobaktera, koja se potom rastvara u vodi za nanošenje na biljni material (Radić.,

2015).

Fiksacija azota je redukcioni proces u kome se gas azota iz vazduha prevodi u

amonijak. Sve biljke imaju potrebu za azotom u obliku amonijaka ili nitrata koji im je

potreban za sintezu aminokiselina. Od tih aminokiselina one izgraĊuju svoje proteine, a biljni

proteini predstavljaju jedini izvor proteina za ţivotinje. Zato je fiksacija azota vitalan ekološki

proces. Organizmi koji mogu da obavljaju ovu vrstu redukcionih reakcija su neke vrste

bakterija i cijanobakterija (modrozelene alge). Celokupan ţivot na planeti zasnovan je na

zavisnosti od ovih organizama. (Jemcev and Đukić., 2000).

Azot koji se fiksira u obliku amonijaka ili amonijuma je osnovni materijal za

hemoautotrofne nitrifikacione bakterije.

Fiksacija azota je sloţen proces koji predstavlja seriju redukcionih reakcija. Atomi

azota su meĊusobno povezani trostrukom kovalentnom vezom unutar molekula. Zato je azot

stabilan molekul. Ovu vezu mogu da redukuju samo azotofiksirajuće bakterije i

cijanobakterije koje poseduju heterociste.

Heterociste predstavljaju nefotosintetiĉke ćelije u kojima se vrši fiksacija azota. One

koriste fotosistem i pri tome obezbeĊuju energiju koja je potrebna za fiksaciju azota. Time

gube deo procesa svetle faze fotosinteze gde dolazi do oslobaĊanja O2 (Jemcev and Đukić.,

2000.).

Na osnovu analize azotofiksatorskih fotosintetiĉkih cijanobakterija moţemo da

zakljuĉimo da su to organizmi koji su sami sebi dovoljni. Potrebni su im samo ugljen-dioksid

i neke organske materije, a sve ostalo mogu sami sebi da obezbede. Zato su ovi oblici

pionirske zajednice, jer uspevaju da kolonizuju nova staništa.

Za proces fiksacije azota neophodni su ATP i enzim nitrogenaza. Trostruka

kovalentna veza koja se javlja u atomu azota je veoma stabilna i potrebna je velika koliĉina

energije kako bi se ona raskinula. Nitrogeneza je neophodna za ovaj proces, ali se ona brzo

inaktiviše prisustvom molekularnog kiseonika i ne moţe da funkcioniše u ćeliji gde dolazi do

proizvodnje kiseonika u toku fotosinteze. Zbog toga se fiksacija azota kod cijanobakterija vrši

u heterocistama.

16

Dosta su prouĉavane bakterije koje vrše fiksaciju azota, pogotovo zbog njihovog

znaĉaja u poljoprivredi. Biljke mahunarke (pasulj, grašak, detelina) su znaĉajne kulture u

rotiranju useva, jer poboljšavaju plodnost zemljišta. To je zbog toga, jer na ĉvorićima korena

ovih biljaka ţive bakterije koje koriste šećere. Te šećere biljke proizvode u procesu

fotosinteze, a one ih zauzvrat snabdevaju amonijakom. Ovoj grupi bakterija pripada rod

Rhizobium (Ahemad et al., 2014).

Sve više i više se ovaj fenomen koristi kako bi se smanjila upotreba azotnih Ċubriva, a

poboljšao kvalitet proteina ovih kultura. Ova oblast istraţivanja ukljuĉuje selekciju,

mikrobiologiju i genetiĉki inţenjering. U daljem radu biće opisani rodovi odreĊenih vrsta

bakterija i neke od metoda koje omogućavaju fiksaciju azota, sa ciljem smanjenja upotrebe

veštaĉkih Ċubriva.

Ciklus kruţenja azota (Slika 2.) poĉinje kada azotofiksatori apsorbuju atmosferski azot

i vezuju ga u svom telu u nekim organskim jedinjenjima azota (aminokiselinama). Bakterije iz

roda Rhizobium isto vrše fiksaciju azota, u simbiozi sa korenom leguminoznih biljaka. Kada

doĊe do truljenja tela ovih azotofiksatora, njihove aminokiseline se pretvaraju u amonijak,

koji se pod uticajem drugih vrsta bakterija – nitrifikacionih bakterija, pretvara u nitrate, koji

su dostupni biljkama (Jemcev and Đukić., 2000).

Amonifikatori su mikroorganizmi koji mogu razliĉitim putevima dezaminacije

polipeptida i aminokiselina da oslobaĊaju amonijak. To je mikrobiološki proces koji dovodi

do oslobaĊanja azota iz organskih materija u formi amonijaka i oznaĉava se kao

amonifikacija. Amonifikaciju vrše razliĉiti mikroorganizmi koji mogu biti aerobi, anaerobi,

fakultativni anaerobi, sporogeni, asporogeni. U zemljištu, u kome vladaju neutralni i slabo

alkalni uslovi, glavni razlagaĉi proteina su bakterije iz roda Bacillus. To su sporogene vrste i

tu spadaju Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Od asporogenih vrsta to su

Pseudomonas fluorescenes, Escherihia coli (Mihajilov – Krstev., 2008).

Ukoliko su zemljišta kisela, razlaganje proteina vrše gljive iz rodova Aspergillus,

Penicillium, Mucor, Rhizopus.

Nitrifikacija je sloţen proces, koji obuhvata dva sukcesivna procesa: nitritaciju i

nitrataciju. Bakterije koje vrše oksidaciju amonijaĉnih soli do nitrita i nitrata se oznaĉavaju

kao nitrifikatori. Nitritacija je proces oksidacije NH3+ do NO2

-i to obavljaju nitritacione

bakterije. Nitratacija je proces oksidacije NO2- do NO3

-i u tom procesu uĉestvuju nitratacione

bakterije. Procesi nitritacije i nitratacije su meĊusobno povezani. Odvijaju se istovremeno i u

zemljištu. Nitrifikatori predstavljaju obligatne aerobne mikroorganizme i pripadaju grupi

hemoautotrofa. Oksidaciju amonijaka do nitrita vrše Nitrosomonas europea,

Nitrosococusmobilis, Nitrosospira briensis i to je proces nitritacije. Proces nitratacije,

17

odnosno oksidaciju nitrita do nitrata vrši Nitrobacter winogradsky, Nitrospira gracilis

(Mihajilov – Krstev., 2008).

Heterotrofni mikroorganizmi koji u anaerobnim uslovima redukuju soli azotne kiseline

do gasovitih proizvoda (N2, N2O) su denitrifikatori. Do redukcije nitrata dolazi, jer su u

anaerobnim uslovima, akceptori soli azotne kiseline - nitrati, dok je u aerobnim uslovima,

akceptor vodonika i elektrona kiseonik. Redukcija nitrata se odvija u dva stupnja, nitrat se

redukuje u nitrit, a nitrit se zatim redukuje u amonijumov jon. Za ove procese najbitniji su

enzimi nitratna i nitritna reduktaza. Redukcija nitrata se moţe odvijati u korenu, gde se

izgraĊuju aminokiseline i amidi. Oni se dalje transportuju putem ksilema. Nitratni jon se moţe

transportovati u listove, gde se vrši sinteza i redukcija organskih jedinjenja. Tada se

aminokiseline floemom vraćaju u koren. Redukciju nitrata u nitrit vrši enzim nitratna

reduktaza u citosolu ćelija korena i lista. Redukciju nitrita u amonijum vrši enzim nitritna

reduktaza, koja je u plastidima.

Slika 2. Ciklus azota

Azot se ugraĊuje u organska jedinjenja samo u vidu amonijumovih jona. Biljka prima

amonijumov jon iz spoljašnje sredine ili on nastaje redukcijom nitrata u korenu ili listu.

Amonijum ulazi u sastav aminokiselina, a zatim i u druga jedinjenja. Biosinteza

aminokiselina je zavisna od fotosinteze koja obezbeĊuje sve ove uslove. U korenu, u

njegovim ćelijama, obavljaju se procesi sinteze aminokiselina i amida. Deo produkata se

koristi u samom korenu, a ostatak se prenosi u nadzemni deo biljke, putem ksilema (Mihajilov

– Krstev., 2008).

18

2.6. CIKLUS SUMPORA

Sumpor ima veoma veliki biološki znaĉaj. On predstavlja strukturnu komponentu u

izgradnji nekih aminokiselina (cistein, metionin), belanĉevina, kao i enzima. Sumpor se nalazi

u zemljištu u obliku mineralnih soli i organskih jedinjenja. Ulazak sumpora u ţive sisteme je

u vidu sulfata i sulfida, koje biljke apsorbuju iz zemljišta. Nakon toga, oni podleţu redukciji i

ugraĊuju se u aminokiseline, proteine (Jemcev and Đukić., 2000).

Sumpor se u atmosferi nalazi u vidu SO2, SO3 i H2S, koji nastaju sagorevanjem

fosilnih goriva. Pri sagorevanju fosilnih goriva oslobaĊaju se najveće koliĉine sumpora, u

obliku SO2. Danas je to jedan od najvećih zagaĊivaĉa vazduha. Ovi gasovi sa kišom padaju na

zemlju u vidu sulfita. Deo SO2 se transformiše do sumporne kiseline i javlja u obliku kiselih

kiša. U ciklus kruţenja (Slika 3.) sumpora ukljuĉene su i neke autotrofne, sumporne

bakterije, kao što je rod Begiatoa. Sumpor iz zemljišta se prevodi u sulfate, a zatim sintezom

proteina se pretvara u organski vezan sumpor. Najĉešći oblik sumpora koji biljke koriste je

sulfatni jon. Biološka redukcija sulfata je analogna redukciji nitrata i samo su biljke sposobne

da je obavljaju. Ipak, glavni izvor sumpornih jedinjenja u zemljištu su organske materije, koje

su poreklom od tela uginulih biljaka i ţivotinja. Usled aktivnosti razliĉitih mikoorganizama,

sumporna jedinjenja se cikliĉno oksiduju i redukuju. U kruţenju sumpora moţe doći i do

digresija putem njegove sedimentacije u obliku nerastvorljivih soli fero-sulfata (FeS), feri-

sulfata (Fe2S3) i kalcijum-sulfata (CaSO4). Tako dolazi do blokiranja gvoţĊa i ostalih

nutritivnih sastojaka koji su znaĉajni za biološke sisteme (bakar, cink,). Ukoliko doĊe do

odstupanja od normalnih koliĉina odreĊenog elementa, to se manifestvuje poremećajima u

kruţenju materije (Jemcev and Đukić., 2000).

Slika 3. Ciklus sumpora

19

2.7. CIKLUS FOSFORA

Fosfor je znaĉajan elemenat i javlja se u zemljištu u razliĉitim organskim i

neorganskim oblicima. Na osnovu dostupnosti ţivom svetu, najvaţniji oblik fosfora je

ortofosfat, koji nastaje oksidacijom u procesima mineralizacije organskih materija koje sadrţe

fosfor. Fosfor je takoĊe strukturna komponenta ţivih sistema. Uĉestvuje u graĊi ćelijskih

jedinjenja, nukleinskih kiselina, fosfolipida, jedinjenja bogata energijom (ATP, ADP, AMP).

Biljke apsorbuju fosfor u obliku ortofosfata i zatim se prenosi do konzumenata i razlagaĉa u

obliku organskog fosfora. Nakon mineralizacije, opet dolazi do biljaka (Slika 4.) (Jemcev and

Đukić., 2000).

Fosfor se u zemljištu nalazi u obliku fosfata, koji potiĉu od razliĉitih organskih

jedinjenja. Biljke najbolje primaju jednovalentni fosfat i to je pristupaĉni fosfat. Fosfat se

ugraĊuje u organska jedinjenja bez prethodne redukcije. Prvi stupanj usvajanja fosfata u

biljnim ćelijama je njegovo vezivanje ze šećer inozit pri ĉemu nastaje fitinska kiselina. Pravi

ulazak fosfora u organska jedinjenja koja imaju metaboliĉku funkciju je sinteza ATP, koja se

odvija u hloroplastima, mitohondrijama, u glikolizi. Sa ATPa se fosfat prenosi na mnoga

druga jedinjenja. Sve veze koje gradi ATP oslobaĊaju visoku energiju pri hidrolizi i one su

najvaţniji naĉin transformacije iprenosa energije u ţivoj ćeliji (Jemcev and Đukić., 2000).

Slika 4. Ciklus fosfora

20

2. 8. ĐUBRIVA

Na osnovu svega navedenog, znamo da su svi do sada opisani elementi neophodni

biljkama, a samim tim su neophodni i za nastavak ţivota, jer bi bez njih to bilo nemoguće.

Kako bi se poboljšao kvalitet zemljišta i biljkama povećala dostupnost svih hranljivih

materija, u poljoprivredi se koriste azotna Ċubriva. Azotna Ċubriva predstavljaju hranu za

biljke, odnosno ona pojaĉavaju mobilizaciju hranljivih materija u zemljištu i povećavaju

energiju ţivotnih procesa u njemu, a samim tim i menjaju svojstva zemljišta (Đukić et al.,

2007). Postoje dve osnovne grupe Ċubriva, na osnovu njihovog hemijskog sastava i to su:

- Organska Ċubriva (stajnjak, gnojivo, kokošiji izmet, treset, siderati, slama, smeće,

pleva, talog otpadnih voda, kao i bakterijska Ċubriva) i

- Mineralna Ċubriva, mogu biti jednostavna (azotna, fosforna, sumporna, kalijumova,

magnezijumova..) i kompleksna ( sloţena – Nitrofos; sloţeno-mešovita; mešovite

smese – NPK, NK).

Postoje industrijska i mesna Ċubriva, u zavisnosti od porekla i mesta njihovog

dobijanja (Đukić et al., 2007).

2.8.1. MINERALNA ĐUBRIVA

Mineralna Ċubriva koja se proizvode industrijski su zastupljena u veoma velikom

broju. Njihova široka primena u poljoprivredi uslovljena je slabom zastupljenošću zemljišta

elementima ishrane. To se posebno odnosi na zastupljenost azota. Od azotnih Ċubriva

najĉešće se koriste amonijaĉno – nitratna (amonijaĉna i kreĉno-amonijaĉna šalitra),

amonijaĉna (amonijum – sulfat, amonijum hlorid, amonijum – sulfat), nitratna (natrijumova i

kalcijumova šalitra), amidna (karbamid, urea – formaldehid). U pokušaju je dobijanje azotnih

mineralnih Ċubriva koje sporo odaju azot biljkama, odnosno Ċubriva sa povećanom

otpornošću. To su jedinjenja koja se slabo rastvaraju u vodi ili su pokrivena materijama, koje

oteţavaju brzo rastvaranje jedinjenja azota. Koliĉina dostupnog azota biljkama, u zemljištu,

je ograniĉena i odreĊena uslovima zemljišta. Njegove zalihe uglavnom ne prelaze 4%

ukupnog azota. Kako bi postale pristupaĉne biljkama, azotne materije prolaze sloţene

biohemijske transformacije, da bi se dobili amonijaĉni i nitratni azot, kojima se biljke hrane.

Azotna mineralna Ċubriva utiĉu na poboljšavanje strukture zemljišta, doprinose smanjenju

vode i slabljenju erozije. Koriste se u odreĊenim dozama, mada postoji veliki broj ĉinjenica

koje ukazuju na negativni uticaj mineralnih Ċubriva, koja se primenjuju u visokim dozama i

duţem vremenskom periodu. Kada je zemljište bogato humusom, mineralna Ċubriva

21

ubrzavaju proces mineralizacije organske materije, pa to moţe dovesti i do gubitka humusa.

Unošenjem mineralnog Ċubriva povećava se sadrţaj azota po ĉitavom zemljišnom profilu.

MeĊutim, povećanjem sadrţaja nitrata u zemlji, dolazi do zagaĊenja podezemnih voda, što

utiće na njihov ţivi svet. Mineralna Ċubriva dovode i do smanjenja pH vrednosti, pri ĉemu

slabi puferna sposobnost zemljišta. To dovodi do gubitka nekih elemenata (kalcijuma,

kalijuma, magnezijuma), aktivacije i mobilizacije gvoţĊa, mangana, vezivanja fosfora i

povećanje toksiĉnog dejstva teških metala. Nekada se smatralo da se korišćenjem mineralnih

Ċubriva povećava brojnost i biomasa zemljišnih mikroorganizama, ali danas je dokazano

suprotno. Korišćenje mineralnih azotnih Ċubriva ima negativni uticaj na zemljišne mikrobe,

gde se, pri njihovoj duţoj upotrebi smanjuje njihova brojnost i biomasa. Do toga dolazi zbog

promena aktivne reakcije zemljišnog rastvora i povećanja sadrţaja mobilnog aluminijuma.

Primena ovih Ċubriva dovodi i do poremećaja u biogeohemijskim ciklusima hranljivih

materija. Dolazi do poremećaja prirodne ravnoteţe zemljišnih mikroorganizama koji su

odgovorni za procese azotofiksacije, nitrifikacije, humifikacije. Veoma bitna pojava, koja se

javlja usled dugotrajnog unošenja azotnih mineralnih Ċubriva, jeste stvaranje ekstra – azota.

Njegova koliĉina raste još većim dodavanjem azotnog Ċubriva. Stvaranje ovog ekstra – azota

praćeno je gubitkom organskog ugljenika, pa se zato zemljištu dodaje i organik, gde se na

odreĊenu koliĉinu azotnog Ċubriva, zemljištu dodaje i odreĊena koliĉina organskog ugljenika

(5kg organskog ugljenika na 1kg unešenog azota). Primenom mineralnih Ċubriva menja se i

struktura zemljišnih organizama, dolazi do smanjenja brojnosti bakterija, ali raste broj bacila

u toj cenozi, pogotovu Bacillus mesentericus, kao posledica osiromašivanja zemljišta

organskim jedinjenjima. Specifiĉno je to da se brojnost Bacillus mycoides takoĊe smanjuje.

Primećeno je da se pod uticajem NPK povećava sadrţaj gljiva u cenozi, zbog promene pH

zemljišta. Korišćenjem velikih doza mineralnih Ċubriva smanjuje se koliĉina cijanobakterija,

pa se azotofiksatorske vrste zamenjuju drugim vrstama. Smatra se da mineralna Ċubriva

povećavaju periodiĉnu toksiĉnost zemljišta, verovatno nakupljanjem odreĊenih bakterija

(Đukić et al., 2007).

Na osnovu analize mineralnih azotnih Ċubriva (nitratnih, amonijaĉnih i amidnih)

utvrĊeno je njihovo negativno dejstvo. Oni smanjuju proces disanja u zemljištu,

azotofiksirajuću aktivnost i antibiotiĉki potencijal zemljišta, pri ĉemu stimulišu razvoj

patogena. Smatra se da su nitratna Ċubriva najmanje štetna, odnosno da su posle amidnih i

amonijaĉnih, jer najmanje utiĉu na procese azotofiksacije i denitrifikacije. MeĊutim, nitratna

Ċubriva takoĊe smanjuju brojnost odreĊenih mikoorganizama u zemljištu, što je i dokazano

odreĊenim metodama (Đukić et al., 2007).

22

Azot se u mnogim poljoprivrednim oblastima nalazi u veoma malim koliĉinama, pa

zbog toga azotna Ċubriva imaju vaţnu ulogu, jer povećavaju prinos poljoprivrednih kultura.

Neophodan uslov za njihovu primenu je kombinovanje sa fosfornim, kalijumovim i

mikroĊubrivima, kako bi se ona efikasno iskoristila. Od unete doze azotnih Ċubriva odreĊenu

koliĉinu iskorišćavaju zemljišni mikroorganizmi, dok jedan deo ĉine nepovratni gasoviti

gubici. Ti gubici su osnovni uzrok smanjenja iskorišćavanja azota od strane biljaka, što samim

tim, smanjuje i njegovu efikasnost. Nakon unošenja mineralnih Ċubriva poĉinje njihova

fiziĉka, hemijska i mikrobiološka transformacija. Gasoviti gubici azota povezani su sa

aktivnošću denitrifikacionih bakterija koje vrše redukciju nitratnog azota. Ovi gasoviti

proizvodi denitrifikacije, pored toga što smanjuju efikasnost azotnih Ċubriva, oni su i

ekološka opasnost, jer uĉestvuju u razgradnji ozonskog omotaĉa stratosfere, zbog oksdidacije

N2O i NO. Kako bi se zaštitila okolna ţivotna sredina i povećala efikasnost azotnih Ċubriva,

prouĉavani su mnogi naĉini smanjenja gubitka azota u gasovitom sadrţaju i smanjenje

sadrţaja oksida azota. Jedan od naĉina je primenom preparata, koji ograniĉavaju

razmnoţavanje denitrifikacionih bakterija, ali oni još uvek nisu razraĊeni. Zbog toga se

koriste preparati koji ograniĉavaju aktivnost nitrifikacionih bakterija. Jedan odtakvih

preparata je N-serve koji se koristi za smanjenje gubitka amonijaĉnih i amidnih oblika azotnih

Ċubriva i njegovo dejstvo se ispoljava i inhibiciji razvoja Nitrosomonas, koji je izazivaĉ prve

faze nitrifikacije. Bitna osobina ovog inhibitora je to što je male toksiĉnosti, brzo se razlaţe u

zemljištu. Dokazano je da se korišćenjem ovog inhibitora povećao rast mnogih kultura

(pšenice, kukuruza) (Đukić et al., 2007). Mnogi inhibitori koji se danas koriste utiĉu na

smanjenje razmnoţavanja nitrifikacionih bakterija, ali i denitrifikacionih bakterija. Na dejstvo

inhibitora nitrifikacije manje su osetljive amonifikacione bakterije. Njihovo razmnoţavanje je

smanjeno samo prvih 10 – 20 dana nakon unošenja preparata. Inhibicija razmnoţavanja

nitrifikacionih bakterija omogućava ĉuvanje amonijaĉnog oblika azota iz Ċubriva, pri ĉemu se

gasoviti oblici azota smanjuju. Nakon privremenog zaustavljanja razmnoţavanja zemljišnih

mikroorganizama, dolazi do fiksiranja azota Ċubriva u zemljištu, a i do jaĉanja procesa

mobilizacije azota zemljišta. Tako, pri unošenju inhibitora dolazi do povećanog usvajanja

azota od strane biljaka. Kod kultura jeĉma, ovi inhibitori nemaju uticaj na njihov prinos. Na

osnovu toga, utvrĊeno je da unošenje inhibitora ne mora dovesti do povećanja prinosa, ali ima

pozitivno dejstvo na bilans azota iz Ċubriva, na njegovo fiksiranje u zemljištu, smanjenje

gasovitih gubitaka i na mobilizaciju zemljišnog azota (Đukić et al., 2007).

Veoma je vaţno da se azotna Ċubriva unose u odreĊeno vreme, odnosno u periodu

kada biljke mogu da iskorišćavaju hranljive elemente. To povećava njihovu efikasnost

korišćenja i smanjuje gubitke. Uglavnom se azotna Ċubriva unose na jesen ili proleće.

23

Ukoliko se unose na jesen dolazi do znaĉajnih gasovitih gubitaka azota, jer su u tom periodu

usporeni mikrobiološki procesi, kao i proces denitrifikacije azota unesenih Ċubriva (Đukić et

al., 2007).

2.8.2. ORGANSKA ĐUBRIVA

U grupu organskih Ċubriva spadaju stajnjak, gnojivo, treset, izmet, komunalni otpad,

komposti i mnogi drugi. Oni predstavljaju izvore energije i mineralnih elemenata, a njihova

uloga je i u intenziviranju mikrobioloških procesa.

Stajnjak ĉini 20 – 25 % organske materije (azot, fosfor, kalijum) i ostatak predstavlja

voda. Industrijskim stoĉarenjem dobija se stajnjak koji sadrţi oko 90% vode. Postoje ĉetiri

naĉina ĉuvanja stajnjaka i to je: štalsko ĉuvanje (pod stokom), ĉuvanje na Ċubrištu, priprema

hladnog stajnjaka (ubrzanim sabijanjem) i priprema toplog stajnjaka (povremenim

rastresanjem i sabijanjem). Đubrivo viskog kvaliteta dobija se ĉuvanjem stajnjaka pod

stokom, odnosno štalskim ĉuvanjem, ali zbog antisanitarnih uslova se najmanje koristi. U

sveţem stajnjaku nalazi se veliki broj mikoorganizama, ĉiji je razvoj specifiĉan u zavisnosti

od njegovog ĉuvanja. U sazrevanju hladnog stajnjaka najveću ulogu imaju asporogene

bakterije. U sveţem stajnjaku najzastupljenije su koke predstavljene amonifikatorima koje

zapoĉinju proces truljenja. Bakterije iz roda Pseudomonas su dosta zastupljene u stajnjaku, ali

se nalaze i truleţne sporogene bakterije Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus

mycoides. Mnoge amonifikacione bakterije iz stajnjaka mogu da dovedu do razlaganja uree. U

njemu se nalaze i vrste koje razlaţu celulozu, zatim nitrifikatori, koji oksidišu amonijak i

razlaţu purinske baze iz stajnjaka. U nastanku stajnjaka menja se zastupljenost materija, oko

40% azota stajnjaka nalazi se u vidu hipurne i mokraćne kiseline, ali je najveći deo u vidu

uree koju hidrolizuju urobakterije i saprofitne bakterije i time se stvara amonijum – karbonat,

koji zatim disocira na amonijum i ugljendioksid (Đukić et al., 2007).

Slama se koristi kao organsko Ċubrivo i njenim unošenjem zemljište se obogaćuje

humusom, ali ona sadrţi i elemente potrebne biljkama, azot i druge. Razlaganjem slame

oslobaĊa se ugljendioksid, što povoljno utiĉe na useve. U slami je odnos ugljenika i azota

veliki, odnosno 100 : 1, pa njenim dodavanjem biljke pate od nedostatka azota, izuzetak su

leguminoze. Nedostatak azota bi se prevazišao dodavanjem azotnih Ċubriva. Smatra se da

slama sadrţi i neke toksiĉne materije za biljke, ali adekvatnom primenom i obradom zemljišta

to bi se prevazilazilo (Đukić et al., 2007).

Treset se takoĊe moţe primenjivati kao organsko Ċubrivo. On sadrţi veliku koliĉinu

vode, organskih materija, od kojih su najzastupljenija humusne supstance i supstance sliĉne

24

ligninu. Uglavnom se primenjuje nizijski treset, ali i on sadrţi malu koliĉinu azota, koji se i

sporo mineralizuje (Đukić et al., 2007).

Kompost, kako bi se dobila organska Ċubriva i time smanjilo korišćenje mineralnih

Ċubriva i hemijskih sredstava za zaštitu biljaka, primenjuje se metod kompostiranja razliĉitih

organskih otpada. Taj otpad moţe biti gradsko smeće, koje predstavlja smešu organskih i

neorganskih materija, biljni otpad (mulj). U kompostiranju se organski supstrat podvrgava

aerobnoj biodegradaciji sa mikrobima u uslovima povećane temperature i vlaţnosti. Ovim

procesom, organska komponenta trpi fiziĉke i hemijske transformacije, pri ĉemu se na kraju

stvara stabilni humikovani proizvod - kompost, koji ima veliku koliĉinu organskih jedinjenja,

biomasu uginulih mikroorganzama, odreĊenu koliĉinu ţivih organizama. Kompostiranje

predstavlja dinamiĉan mikrobiološki proces u kome uĉestvuju mikrobi (bakterije, gljive, alge,

virusi), mikrofauna (praţivotinje, protozoe), makrofauna (stonoge, krpelji, crvi) (Đukić et al.,

2007).

Ostvarivanje maksimalne produktivnosti i profita u poljoprivredi podrazumeva

intenzivnu obradu zemljišta, navodnjavanje, adekvatnu primenu Ċubriva, hemijsku kontrolu

štetoĉina, korova i bolesti, kao i maksimalnog iskorišćavanja genetskog potencijala gajenih

biljaka. Sve to dovodi do mnogih negativnih posledicana agroekosistem i kvalitet ţivota

sredine. Brz razvoj biotehnologije, zasnovan na ekološkim principima, utiĉe da tradicionalni

sistemi zemljoradnje doţive brojne promene.

Rezultati mnogih nauĉnih istraţivanja pokazali su da Ċubriva hemijskog porekla zbog

sadrţaja toksiĉnih materija, mogu da se dovedu u vezu sa neţeljenim efektima koje

ispoljavaju na zdravlje ljudi, reprodukciju, probleme sa krvlju i jetrom kao i na pojavu

hiperaktivnosti dece. Nikako se ne moţe dozvoliti da se zanemari negativan uticaj koji

prekomerna upotreba ovih Ċubriva ima na ţivotnu sredinu (Đukić et al., 2007). Razvoj

poljoprivrede je zasnovan na promenama u tehnologiji gajenja useva i oplemenjivanju

biljaka. Biljka je ţivo biće koje ţivi u dve sredine, atmosferi i pedosferi. Zemljište sluţi

biljkama za uzimanje vode, hranljivih materija i energije, koji se nalaze u njemu. Ako je

zemljište nestrukturno, bez dovoljno vode i hranljivih materija onda je broj korisnih mikroba i

zreo humus u zemljištu, osnov za planiranje dobrog i kvalitetnog prinosa. To doprinosi boljem

uspostavljanju ekološke ravnoteţe i stabilnosti prirodnih resursa. Zbog toga se uvodi novi

pojam, a samim tim i nova metoda – biofertilizacija (Singh., 2012).

25

2.9. MIKROBIOLOŠKA ĐUBRIVA I BIOFERTILIZACIJA

Biofertilizacija predstavlja unošenje ţivih mikroorganizama u zemljište sa ciljem

poboljšanja snabdevanja biljaka neophodnim nutritijentima. Tako se moţe poboljšati

snabdevanje biljaka azotom, fosforom, kalijumom, gvoţĊem, sumporom, ali i stimulisati rast

korena. Unošenjem ovih bakterija u rizosferu biljaka ubrzavaju se procesi transformacije

organske materije i biljka se snabdeva potrebnim nutritijentima (Singh., 2012).

Mikrobiološka Ċubriva predstavljaju ĉiste kulture aktivnih mikroorganizama koje se

gaje na hranljivoj podlozi. Nazivaju se i bakterijska Ċubriva. Njihova upotreba je

najzastupljenija u voćarstvu. Mikrobiološka Ċubriva svoj uticaj na biljke ispoljavaju kroz:

- ubrzanje procesa pretvaranja organske materije u forme koje su pogodne za

ishranu voćaka;

- poboljšanje snabdevanja voćaka azotom;

- oslobaĊanje elemenata iz teško pristupaĉnih formi, u forme koje voćke mogu lako

koristiti;

- smanjenje koncetracije CO2 u zemljištu;

- umanjenje mogućnosti asfikacije korena.

Mikrobiološka Ċubriva mogu se koristiti u razliĉitim oblicima: vlaţna, teĉna,

zamrznuta (granulirana) i suva (u prahu). U praksi se bakterijska Ċubriva primenjuju na

sledeće naĉine:

- potapanjem korena sadnice u suspenziji odreĊenog Ċubriva,

- zalivanjem voćaka rastvorom smeše ţivinskog i bakterocidnog Ċubriva.

Najĉešće se koriste sledeća mikrobiološka Ċubriva:

- Azotofiksatori, povećavaju koliĉinu azota u zemljištu. Đubriva mogu biti sa

slobodnim i simbiotskim azotofiksatorima, pa na osnovu toga imaju razliĉite

komercijalne nazive: Azotobakterin, Rizotrofin, Nitrogin, Azotofiksin i dr.

- Fosfobakterin-ova Ċubriva sadrţe bakterije koje mineralizuju organska jedinjenja

sa fosforom i pretvaraju ih u oblike lako dostupne korenovom sistemu biljaka.

- Mikorizin, sadrţi mikorizne gljive koje se mogu inokulirati na koren mladih

sadnica, neposredno pred sadnju. Mikorizin se sastoji od gljiva sposobnih da

26

potpomaţu ishranu voćaka (apsorpciju vode i hranljivih elemenata). Koristi se u

formi vlaţnog Ċubriva.

- Humivorin, unosi se u zemljište sa stajnjakom ili kompostom. Sastoji se od raznih

bakterija sposobnih da humus pretvaraju u mineralne materije pogodne za ishranu

biljaka.

- Silikobakterin, doprinosi oslobaĊanju kalijuma iz alumo silikata. Sojevi ovih

mikroorganizama proizvode veće kolićine ugljene kiseline i na taj naĉin rastvaraju

alumo silikate i druge minerale kalijuma.

Komponente mikroloških Ċubriva su uglavnom Azotobacter, Azospirillum, Bacillus,

Pseudomonas i druge. Pošto je azot veoma znaĉajan u ishrani biljaka, posebno mesto se

pridaje bakterijama koje snabdevaju biljke azotom. To su bakterije iz grupe azotofiksatora

koje elementarni, atmosferski azot prevode u oblike pristupaĉne biljkama. Ove bakterije se

nalaze u neposrednoj blizini korena i azot predaju neposredno biljkama.

Za rast biljaka neophodan je i fosfor, koji je prisutan u zemljištu u formama koje su

nepristupaĉne biljkama. Bakterije iz roda Bacillus i Azotobacter mogu da sintetišu organske

kiseline i fosfataze koje će nepristupaĉan fosfor prevesti u biljkama pristupaĉnu formu

(Gowathy et al., 2008).

Kalijum je u zemljištu u obliku alumosilikata. Zahvaljujući aktivnosti bakterija iz roda

Bacillus, postaje pristupaĉan biljkama. Neke bakterije zahvaljujući prisustvu siderofora

doprinose snabdevanje biljaka gvoţĊem. TakoĊe je poznato da bakterije iz roda Pseudomonas

mogu transformisati organske forme sumpora u neorganski i na taj naĉin ga uĉiniti

pristupaĉnim za biljke (Đukić et al., 2007).

Ovo ukazuje da se primenom mikrobioloških Ċubriva koja u sebi sadrţe mešane

populacije mikroorganizama moţe poboljšati snabdevanje biljaka neophodnim nutritijentima

uz istovremeno oĉuvanje ţivotne sredine i proizvodnju zdravstveno bezbedne hrane. Pored

toga ove bakterije imaju sposobnost sinteze biljnih hormona tipa giberalina, auksina, ĉime se

dodatno stimuliše biljni rast i utiĉe na otpornost biljaka. Unošenjem mikrobioloških Ċubriva u

zemljište utiĉe se na tok i usmeravanje mikrobioloških procesa u zemljištu što će uticati na

rast, razviće biljaka ali i na zemljište. Neki od mikroorganizama koji su uneti u zemljište

odlikuju se mogućnošću sinteze sluzavih materija koje igraju znaĉajnu ulogu u slepljivanju

mikroagregata što doprinosi formiranju fine strukture zemljišta. Nakon izumiranja

mikroorganizama unetih u zemljište povećava se ukupna biomasa, a efekti će se odraziti u

sledećoj vegetaciji. Povećanjem organske biomase dovešće do povećanja plodnosti zemljišta i

stvaranje biljkama neophodnih mineralnih nutritijenata. Pri tome ne dolazi do zagaĊivanja

27

zemljišta, voda i atmosfere. Azotobacter chroococum prisutan je u rizosferi mnogih biljaka, a

kod nekih biljnih vrsta pribliţava se asocijativnim azotofiksatorima. U tim uslovima

Azotobacter prevodi elementarni azot iz atmosfere u oblik koji je pristupaĉan biljkama.

Bacillus megaterium var. phosphaticus uĉestvuje u procesu amonifikacije. Fosfor na taj naĉin

dolazi u neorganski oblik, pristupaĉan za biljku. U zemljištu je prisutna silikatna bakterija

Bacillus circulans koja razlaţe alumosilikate iz kojih se oslobaĊa kalijum. Sve ovo upućuje da

primena mikrobioloških Ċubriva ima svoje mesto u savremenoj konvencionalnoj, ali i

organskoj poljoprivrednoj proizvodnji (Đukić et al., 2007).

Osnovu biofertilizatora ĉine bakterije koje direktnim ili indirektnim delovanjem

pozitivno utiĉu na rast biljke i porast useva, a vrlo se jednostavno nanose na površinu biljke,

semena ili zemlje. Reĉ je o bakterijskim vrstama koje pozitivno deluju na rast biljaka kroz

sposobnost:

- fiksacije atmosferskog azota;

- pretvaranje jedinjenja fosfora u oblike lako pristupaĉne za biljku;

- razlaţu organsku materiju;

- izluĉuju supstance antibiotskog i fungistatiĉkog delovanja i

- poseduju sposobnost produkcije hormona i drugih supstanci koji su neophodne za

rast i razviće biljaka (tzv. PGP Plant Growth Promoting bakterije). Hormoni koje

produkuju bakterije (auksini, citokinini, giberelini) su potpuno prirodni analozi

biljnim hormonima (Singh., 2012).

FOSFAT SOLUBILIZIRAJUĆI MIKROORGANIZMI (PSM)

Mikroorganizmi koji imaju sposobnost da konvertuju nedostupne u dostupne forme

jedinjenja koje korenov sistem biljaka moţe da usvoji, su solubilizatori. Fosfosolubilizatori

(PSM – Phosphorus Solubizing Microorganisms) su grupa bakterija i gljiva koje konvertuju

neorganski oblik fosfora u organski. Ovaj mehanizam se odvija zahvaljujući sekreciji

organskih kiselina (glukonska, mleĉna, limunska, oksalna, fumarna), u spoljašnju okolinu

mikroorganizama, što je rezultat razgradnje šećea. Sniţenje pH sredine dovodi do toga da

anjonska forma – kiselina, vezuje katjon neorganskog oblika fosfata i tako konvertuje

nedostupna fosfatna jedinjenja u rastvorljive forme, dostupne korenovom sistemu. Proces

zavisi od vrste mikroorganizama i kiseline koju stvara. Najefikasniji put je ekstracelularna

oksidaza glukoze, posredstvom enzima glukozna dehidrogenaza, gde se stvara glukonska

kiselina. Alifatiĉna kiselina (glukonska kiselina, 2-ketoglukonska kiselina) se pokazala

najefikasnijom (Richardson andSimpson., 2011).

28

Ovde spadaju vrste iz roda: Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Penicillium,

Fusarium i dr.

FOSFAT MOBILIZIRAJUĆI ORGANIZMI (PMB)

U ovu grupu spadaju mikroorganizmi sa sposobnošću mobilizacije nedostupnih formi

jedinjenja fosfora, cinka i sumpora, ĉineći ih dostupnim za biljke. Posebno se izdvajaju

mikorizalne gljive – fosofomobilišuće gljive koje stupaju u mutualistiĉki odnos sa biljkama.

Hife povećavaju apsorpcionu površinu korena što je od velikog znaĉaja ukoliko je neki od

nutritijenata u manjku. Mikorizalne gljive se dele na:

- ektomikorize,

- endomikorize (AM – arbuskularne mikorize); Glomus, Gigaspora, Sclerocystis...

- ektendomikorize (Richardson andSimpson., 2011)

Bakterija Frateuria aurentia je poznata po sposobnosti mobilizacije kalijuma.

BILJNI HORMONI (FITOHORMONI)

Fitohormoni su organske supstance male molekulske mase, koje ne spadaju u hranljive

materije, a koje (u malim koliĉinama) stimulišu, inhibiraju ili na neki drugi naĉin modifikuju

rast i razvoj biljaka. To su prirodne supstance koje se izgraĊuju u biljnom organizmu koje

utiĉu na rastenje i razviće biljaka. Svi hormone deluju tokom celog razvića biljke na procese u

razliĉitim ćelijama i organima. Efekat jednog hormona na iste ćelije moţe biti razliĉit u

zavisnosti od stadijuma razvića ćelija. Fitohormoni obuhvataju nekoliko klasa jedinjenja,

meĊu kojima su auksini, giberelini, citokini i drugi (Kastori., 1991).

Auksini su prva grupa biljnih hormona koji su otkriveni na osnovu toga što stimulišu

rastenje biljaka. Po hemijskoj strukturi slavna grupa auksina su indolna jedinjenja, a centralno

mesto pripada indolil-3-sirćetnoj kiselini (IAA). Glavne funkcije auksina su:

- stimulativni efekat auksina na izduţivanje ćelija stabla i koleoptila (fototropska i

geotropska reakcija);

- u deobi ćelija;

- inhibicija mirujućih pupoljaka (Ortiz – Castro., 2009).

29

Giberelini su otkriveni u Japanu kao produkt gljive Ascomycetes. Biljke izgraĊuju

gibereline u tkivima koja aktivno rastu, kao što su apikalni delovi stabla, mladi listovi, koreni,

nezrela semena i plodovi. Fiziološki efekti giberelina su:

- rastenje ćelija u vegetativnim tkivima;

- izduţivanje stabla;

- razvoj listova i izduţivanje lisnih drški;

- diferencijacija floemskih elemenata;

- izduţivanje polenovih cevi;

- klijanje semena (Kastori., 1991).

Citokini su grupa biljnih hormona ĉija je osnovna funkcija da stimulišu ćelijske deobe,

ali su za to neophodni i auksini. Citokina ima najviše u vrhu korena, koji je dominantno mesto

njihove sinteze, odakle se transportuju ksilemom u ostale organe (stablo i listove). Glavne

funkcije citokina su:

- stimulacija ćelijskih deoba u prisustvu auksina;

- indukcija novih pupoljaka i stimulacija mirujućih pupoljaka;

- ukidanje apikalne dominacije;

- fascijacija i debljanje stabla;

- rastenje listova;

- diferencijacija hloroplasta;

- stimulacija cvetanja i regulacija pola cvetova;

- usmeravanje transporta i akumulacija asimilata i metabolita u organima bogatim

citokinima (Ortiz – Castro., 2011).

ANTIBIOTICI

Antibiotici su metaboliti jednih mikroorganizama, koji deluju inhibitorno ili ĉak

latentno na druge mikroorganizme. Antibiotike je prvi uoĉio Aleksandar Fleming 1929.

godine kada je primetio da gljiva Pencilium naotatum stvara zonu u kojoj ne dolazi do razvića

bakterija – zona inhibicije. Antibiotici se najĉešće dobijaju mikrobiološkim putem procesom

fermentacije, kao i polusintetskim i sintetskim putem (Kastori., 1991).

Biofertilizatori su organskog porekla i unapreĊuju primarnu poljoprivrednu

proizvodnju popravljajanjem fiziĉkih svojstava zemljišta na kome se koriste, njegovu

plodnost i produktivnost. Ĉinjenica da se njihovom upotrebom smanjuje koliĉina hemikalija

u poljoprivrednoj proizvodnji ĉini biofertilizaciju eko frendli procesom. Uticaj biofertlizatora

30

zavisi od soja bakterija, ali i od koncentracije bakterijskih ćelija u inokulatu biljne vrste,

primenjenih mera i osobina zemljišta (Singh., 2012).

Biofertilizatori kojima se pospešuje proces azotofiksacije su uglavnom bakterije iz

rodova Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Allorhizobium,

Azorhizobium. Ovi mikroorganizmi uĉestvuju u simbiotskoj azotofiksaciji, prodiru u koren ili

stablo leguminoznih biljaka i formiraju kvrţice (nodule). Rodovi koji uĉestvuju u

asocijativnoj azotofiksaciji uglavnom ne formiraju kvrţice i koriste se pre setve na seme ili se

unose tokom vegetacije. U ovu grupu spadaju Acetobacter, Bacillus, Azrospirillum,

Pseudomonas. Sve ove vrste fiksiraju azot iz atmosfere i proizvode materije koje utiĉu na rast

biljaka (Singh., 2012).

Pored obezbeĊivanja azota, slobodni azotofiksatori produkuju i mnoga biološki

aktivna jedinjenja, organske kiseline koje razlaţu fosfate, aerišu zemljište, a i sintetišu mnoga

organska jedinjenja. Kod proizvodnje neleguminoznih biljaka i ostalih povrtarskih biljaka

uglavnom se koristi Azotobacter sp, a u proizvodnji pirinĉa se koriste razliĉite vrste

cijanobakterija (Singh., 2012).

2.9.1. ROD AZOTOBACTER

Rod Azotobacter pripada grupi Gram negativnih aerobnih/mikroaerofilnih štapića i

koka. To je heterogena grupa bakterija. Kod ovih bakterija zastupljen je respiratorni tip

metabolizma. Bakterije su pleomorfne i imaju razliĉit oblik. Mogu biti štapići ili koke.

Javljaju se pojedinaĉno, u parovima ili u nepravilnim grupama. Azotobakter su uglavnom

pokretne bakterije, kreću se peritrihama, mada su primećeni i neki nepokretni oblici. Ove

bakterije rastu mikroaerofilno i neki sojevi proizvode pigment. Za Azotobakter je

karakteristiĉna sposobnost azotofiksacije. Ove bakterije su zastupljene u zemljištu i vodi a

karakteriše ih i sposobnost formiranja asocijacija sa višim biljkama. Tipiĉan predstavnik ovog

roda je Azotobakter chroococum. Azotobacter pored sposobnosti azotofiksacije ima

sposobnost i proizvodnje hormona rasta (citokini, giberelini), vitamina (produkuje B

vitamine). On konvertuje azot u amonijak koji uzimaju biljke. Ova bakterija moţe da

proizvede i antifugalna jedinjenja, koja se koriste u zaštiti biljaka. Proizvodnja Ċubriva sa

Azotobacter vrši se na odreĊenim ĉvrstim ili teĉnim podlogama, u zavisnosti od biljne vrste

(Petrović et al., 2007).

31

Azotobacter vinelandii

Azotobacter vinelandii je rod slobodnoţivećih diazotrofnih bakterija koje fazu

odmaranja provode u vidu ciste. Nalazi se u alkalnom zemljištu, akvatiĉnoj sredini i na nekim

biljkama. To je Gram-negativna bakterija. Poseduje nekoliko metaboliĉkih mogućnosti,

ukljuĉujući i fiksaciju atmosferskog azota i njegovu konverziju do amonijaka. Njihov

jedinstveni sistem posebnih enzima nitrogenaza, omogućava ovim bakterijama korišćenje u

nauci, kako bi se bolje razumeo proces azotofiksacije i njeno korišćenje u poljoprivredi.

Azotobacter sp. ima najveću metaboliĉku stopu od drugih organizama. One su zbog

jedinstvenog naĉina metabolizma za aerobnu fiksaciju azota, privukle dosta interesovanja

nauĉnika. Ćelije sa visokom stopom respiracije omogućavaju normalnu osetljivost

nitrogenaza kada se izloţe kiseoniku. Azotobacter se moţe koristiti za produkciju proteina

koji štite nitrogenaze od iznenadnog stresa izazvanim kiseonikom. Ove bakterije sintetišu tri

nitrogenaze.

Diazotrofni organizmi, kao što je i Azotobacter, imaju kljuĉnu ulogu u svakom

ekosistemu, jer omogućavaju dostupnost azota svim organizmima. Oni procesom

azotofiksacije pretvaraju azot u amonijak, nakon ĉega se amonijak redukuje do proteina, koji

se ugraĊuju u biljke. Azotofiksacija se koristi u poljoprivredi, gde se biofertilizacijom

povećava plodnost zemljišta. Azotobacter vinelandii pored fiksacije azota, uĉestvuje u

proizvodnji nekih biljnih hormona (auksina i giberilina), ali je bitan i u dobijanju nekih

vitamina.

2.9.2. ROD BACILLUS

Rod Bacillus pripada grupi Gram pozitivnih štapića i koka koje formiraju endospore.

To su krupne, sporogene bakterije koje su aerobi ili fakultativni anaerobi. Mnoge vrste imaju

sposobnost sinteze nekih antibiotika (gramicidin, bacitracin) i nekih ekstracelularnih enzima.

Bacillus anthracis je vrsta koja je najznaĉajnija za medicinu, koja je patogena za ljude i

ţivotinje, jer izaziva antraks (crni prišt). U poslednje vreme, veoma vaţnu ulogu zauzima i

Bacillus thurigiensis, jer u toku sporulacije formira kristalni protein, odnosno parasporalno

telo. To je veoma aktivan biološki insekticid. Ovaj kristalni protein se rastvara u crevima

larvi, prelazi u krv i dovodi do smrti larve. Kako bi se zaštitila ţivotna sredina, ovaj pesticid je

veoma znaĉajan, jer se hemijski pesticidi teško uklanjaju iz zemljišta. Kao biološki agens koji

utiĉe na suzbijanje brojnosti fitopatogena, najveći znaĉaj ima Bacillus subtilis, mada se

zadnjih godina skreće paţnja i na korišćenje Bacillus mycoides i Bacillus cereus. Bakterije

32

ovog roda sintetišu veliki broj jedinjenja kojima utiĉu na svoju okolinu, povećavajući tako

pristupaĉnost potrebnih elemenata biljkama (Petrović et al., 2007).

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis je Gram-pozitivna bakterija, koja je pokretna, štapićastog oblika.

Prvenstveno je prisutna u zemljištu, ali i u vodi, vazduhu, na biljnom materijalu. U poĉetku se

je ova bakterija zvala ,,Vibrio subtilis″, ali joj je naziv promenjen 1872. godine. Tokom

nutritivnog stresa stvara endospore koje joj omogućavaju preţivljavanje nepovoljnih uslova

(visoke temperature, zraĉenja, otrovne supstance). U preţivljavanju glavnu ulogu imajuα i β

proteini koji zasićuju molekul DNA i pri tome je štite. Ovi proteini prisutni su samo u

endospori i nema ih u vegetativnim ćelijama. Spore Bacillus subtilis su rasprostranjene svuda

u prirodi. Bacillus subtilis je mezofilna vrsta i moţe da raste na temperaturama od 200C do

2500C, dok njene spore mogu da preţive i 1000

0C 30 minuta. Tokom svoje aktivnosti stvara

veliki broj enzima (Petrović et al., 2007).

Bacillus subtilis nije patogena za ĉoveka, ali postoje podaci o infekcijama ovom

bakterijom kod osoba sa oslabljenim imunitetom. Uglavnom su to oportunistiĉke

infekcije. Bacillus subtilis je jedna od najĉešće korišćenih bakterija za produkciju enzima i

drugih produkata koji imaju široku primenu u industriji. Ova vrsta izaziva koagulaciju mleka

usled proteolitiĉke aktivnosti (slatko zgrušavanje). Bacillus subtilis razgraĊuje kompleksne

ugljenohidrate i proizvodi amilazu. Smatra se idealnim probiotikom, zbog svoje sposobnosti

preţivljavanja na niskim pH u gastrointestinalnom traktu. Stvaranjem endospora moţe se

odrţati veoma dugo. Bacillus subtilis stimuliše imuni sistem, tako da se dobije širok spektar

antitela. Koristi se za produkciju velikog broja antibiotika. Pored enzima, ova bakterija

produkuje i toksin subtilizin, koji je izazivaĉ mnogih alergijskih reakcija. Bacillus subtilis je

uzet i kao zemljišni inokulant i koristi se za dobijanje mikrobioloških Ċubriva. Ova vrsta

produkuje neke fungicidne komponente, pa se koristi i za zaštitu biljaka. Zbog lake genetiĉke

manipulacije koristi se i kao model u laboratorijama. Koriste se i za prouĉavanje kolonija

bakterija, jer dobro rastu na agru, u svim uslovima (Jemcev and Đukić, 2000).

Bacillus megaterium

Bacilllus megaterium je štapićasta, Gram-pozitivna bakterija, prisutna na razliĉitim

staništima. Ĉesto se moţe javljati u parovima ili lancima. Bacillus megaterium raste na

temperaturama od 30C pa do 45

0C, ali je optimalna temperature za njen rast 30

0C. Uglavnom

raste na biljkama i koristi se kao biokontrolni agens za zaštitu biljaka. Pre otkrića Bacillus

33

subtilis, ova bakterija je korišćena za prouĉavanje biohemijskih procesa, sporulacije i drugo.

Najveću prednost dobija razvojem biotehnologije, gde se koristi u mnoge svrhe. Veoma je

vaţan industrijski organizam. Produkuje razne penicillin amidaze koje se koriste za sintetiĉko

dobijanje penicilina, amilaze koje se koriste u pekarskoj industriji i glukozo-dehidrogenaze

koje se koriste za testove glukoze u krvi. Jedna od glavnih osobenosti Bacillus megateriuma

je sposobnost fiksacije azota, a uĉestvuje i u transformaciji fosfora, nastanku hormona rasta

biljaka i vitamina B12, kao i lekova sa fungicidnim i antiviralnim karakteristikama (Petrović

et al., 2007).

34

3. CILJ RADA

Rezultati mnogobrojnih istraţivanja su pokazali da odreĊene vrste zemljišnih

mikroorganizama imaju veliki znaĉaj u stimulaciji rasta biljaka, što se manifestuje kroz

njihovu sposobnost solubilizacije, mobilizacije i sinteze biološki aktivnih materija koje

povoljno deluju na biljni metabolizam.

Shodno tome, ciljevi ovog rada su definisani u sledećem:

1. Optimizacija medijuma za gajenje odabranih sojeva korisnih zemljišnih bakterija

sa sposobnošću sinteze aktivnih supstanci, solubilizacije fosfata i azotofiksacije, u

kontrolisanim uslovima fermentatora, radi dobijanja najveće biomase;

2. Modifikacija sastava medijuma, sa ciljem da se postigne jednostavnija i jeftinija

proizvodnja mikrobiološkog Ċubriva, dostupnog za široku, komercijalnu upotrebu.

35

4. MATERIJAL I METODE

4.1. MATERIJAL

4.1.1. BAKTERIJSKE KULTURE

U radu su korišćene bakterijske kulture Bacillus subtilis (sintetiše aktivne supstance),

Bacillus megaterium (solubilizacija fosfata) i Azotobacter vinelandii (azotofiksacija).

Navedeni mikroorganizmi su nepatogeni izolati iz zemljišta. Štok kulture bakterijskih sojeva

su ĉuvane u krioviala masa 15% glicerolom i odgovarajućom hranljivom podlogomna – 850

C.

4.1.2. HRANLJIVE PODLOGE

Podloge korišćene za zasejavanje mikroorganizama izvaĊenih iz štoka su:

- HA, hranljivi agar koji je gotova podloga (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium)

- Pikovskaya′s agar, koristi se za fosfobakterije (Bacillus megaterium)

- Jenson′s agar, predstavlja bezazotnu podlogu za azotofiksatore (Azotobacter

vinelandii).

Tabela 1. Sastav podloga

g/l

Podloge

PSB,

Pikovskaya agar

N-fiksirajući

Јensenagar

Dekstroza 10

Glukoza 20

ekstrakt.kvasca 0.5

K2HPO4 1

MgSO4 0.1 0.5

KCl 0.2

NaCl 0.5

(NH4)2SO4 0.5

Na2MoO4 0.001

FeSO4 Tr 0.01

Ca3(PO4)2 5

CaCO3 2

Agar 15 15

36

4.2. METODE

4.2.1. PRIPREMA BAKTERIJSKIH KULTURA

Bacillus subtilis i Bacillus megaterium su presejani na petri ploĉe sa hranljivim

agarom, a Azotobacter vinelandii na (Jenson agar) bezazotnoj podlozi. Ovako presejane

kulture su inkubiranena 300

C, 3 dana Bacillus i 5 dana Azotobacter vinelandii, nakon ĉega su

se jasno uoĉavale kolonije.

Priprema bakterijske suspenzije

,,Revitalizovani″ mikroorganizmi su korišćeni za pravljenje suspenzija u 0,9 %

rastvoru NaCl (fiziološki rastvor). Turbiditet suspenzija je uz upotrebu densitometra podešen

na 0,5 McF, što odgovara 108

CFU/ml (colony formit unit).

Solubilizacija fosfata

Dokazivanje solubilizacije fosfata, od strane odabranih bakterijskih sojeva, je vršeno

kvalitativnom metodom ĉvrstog agara na Pikovskaya podlozi (SIGMA-ALDRICH), ĉiji je

sastav dat u tabeli 1. Pomenuta podloga je odmerena, sterilisana i razlivena u petri ploĉe, a

nakon hlaĊenja su na njoj ezom zasejani pomenuti sojevi. Usled prisustva nerastvornog

kalcijumfosfata, boja podloge je mleĉnobela. Solubilizacija fosfata se manifestuje tokom

inkubacije 5-7 dana na 300

C, kada se oko formiranih kolonija uoĉavaju providne zone.

Efikasnost solubilizacije se moţe odrediti na osnovu dijametra kolonije i dijametra

obezbojene zone (Karpagam and Nagalakshmi., 2014). Ovom metodom je potvrĊena

sposobnost solubilizacije od strane Bacillus megaterium.

Azotofiksacija

Sposobnost azotofiksacije soja Azotobacter vinelandii je potvrĊena zasejavanjem soja

na bezazotnoj podlozi – Jensen agar (HIMEDIA), ĉiji je sastav dat u tabeli 1. Azot je

neophodan element za rast mikroorganizama, tako da se ova podloga koristi za izolaciju i

identifikaciju mikroorganizama koji imaju sposobnost vezivanja atmosferskog azota.

37

4.2.2. PRIPREMA STARTNE KULTURE (inokuluma)

Startne kulture su pripremljene u erlenmajere i odgovarajućim sterilisanim teĉnim

podlogama za izabrane sojeve (Tabela 2.,Tabela 3. i Tabela 4.). U sterilnim uslovima

laminara (ESCO, USA) (Slika 5.) su inokulisane podloge sa po 1,5 ml odgovarajuće

bakterijske suspenzije. Ovako zasejane kulture su stavljene na rotacioni mešaĉ (200 rpm) gde

je svakog dana kontrolisana sterilnost i brojnost mikroorganizama. Mikroorganizmi su gajeni

na 300C 48h Bacillus i 72h Azotobacter vinelandii. Startne kulture su korišćene za inokulaciju

teĉnog fermentora.

Slika 5. Priprema inokuluma na rotacionom mešaĉu

Tabela 2. Sastav podloga g/l za inokulum i fermentor za Bacillus subtilis.

Bacillus subtilis Teĉna podloga

GFM modifikovana. F1 F2

Glukoza 20 10 3

Pepton 5 5

Ekstrakt kvasca 1 1 1

Mesni ekstrakt 3 3

NH4NO3 0.5 0.3

KH2PO4 5 5

MgSO4 0.5 0.5

NaCl 0.5 0.5

(NH4)2MoO4 u tragovima

Ca3(NO3)2, 1M (ml) 1 1.45

MgSO4x7H2O 0.5

(NH4)2SO4 1

PVP-40 20 20

FeCl3 0.03M (ml) 8.4 2 2

CaO 1.12

EDTA 2

Rastvor soli (ml) 10 10

NH4HPO4 2 3

38

Tabela 3. Sastav podloge g/l za inokulum i fermentor za Bacillus megaterium.

Bacillus megaterium Podloga

Glukoza 10

Ekstrakt kvasca 1

NH4NO3 0.5

KH2PO4 5

MgSO4 0.5

NaCl 0.5

Ca3(NO3)2, 1М (ml) 1

(NH4)2SO4 1

PVP-40 20

FeCl3 0.03M (ml) 2

Rastvor soli (ml) 10

NH4HPO4 5

Glicerol (ml) 15

Tabela 4. Sastav podloga g/l za inokulum i fermentor za Azotobacter vinelandii.

Azotobacter vinelandii teĉna podloga

Jenson - modif. LPM

Šećer 20 10

K2HPO4 1 0.583

MgSO4 0.5 0.098

NaCl 0.5 0.058

Na2MoO4 0.005 0.002

FeSO4 0.1 0.005

glicerol (ml) 10

CH3CO2NH4 1.2 1.2

PVP-40 20

CaSO4x2H2O

0.1

KH2PO4

0.224

39

4.2.3. KONTROLA STERILNOSTI I ODREĐIVANJE BROJNOSTI

MIKROORGANIZAMA

Svakog dana inkubacije, iz erlenmajera i fermentora (Slika 6.) je uziman uzorak kako

bi se ispitala brojnost mikroorganizama (metoda posrednog odreĊivanja brojnosti) i potvrdilo

odsustvo kontaminacije. U ove svrhe je korišćena metoda kapi ili “drop plate method”

(Somasegaran P and Hoben JH., 1994). Serija razblaţenja uzorka je pripremljena

prebacivanjem 1 ml uzorka u 9 ml sterilnog fiziološkog rastvora u pripremljenim sterilnim

epruvetama. A zatim je iz svakog razblaţenja, od 10-1

do 10-10

, uzimano po 20 mikrolitara i u

vidu kapi izruĉeno u petri ploĉe sa hranljivim agarom, koje su prethodno podeljene u

kvadrante. Svaki kvadrant je obeleţen i predstavlja odgovarajuće razblaţenje. Zasejani

mikroorganizmi su inkubirani 24h-48h, na 30ᵒ C, a brojanje je vršeno u tri ponavljanja.

Slika 6. Fermentor

Ukupan broj ćelija u 1 ml poĉetnog uzorka je raĉunat po sledećoj formuli:

N= n x 50 x10x

N –ukupan broj ćelija u 1 ml uzorka

50 – koeficijent ispravke do 1ml

10x - razblaţenje

40

4.2.4. PRIPREMA FERMENTORA

Fermentor (Slika 6.) zapremine 15L (Naprto Scientific, India) je napunjen

odgovarajućom podlogom i sterilisan na 1200 C, 20 minuta, pod pritiskom od 1,2 bara. Posle

hlaĊenja medijuma, na bioreaktoru je podešen i aktiviran sistem sledećih parametara: pH,

temperature i vazduha.

1. pH: 6,5 – 6,7 za Bacillus;

7 – 7,2 za Azotobacter vinelandii.

Regilisanje pH medijuma je postignuto uz pomoć peristaltiĉkih pumpi kojima je

kontrolisano dodavanje kiseline (1M HCL) i baze (1M NaOH).

2. Temperatura je odrţavana na 300C uz pomoć vodenog sistema (Water Chilleri).

3. Rastvoreni kiseonik je odrţavan na 30%, a ravnomerno mešanje je postignuto

magnetnim mešaĉem na 200 – 300 rpm.

4.2.5. METODE BIOFERMENTACIJE

Bacillus subtilis

Metoda 1: Startna kultura je pripremljena na već opisan naĉin u GFM modifikovanoj

podlozi (tabela 2.), a zatim je njome inokulisan fermentor u kome je takoĊe pripremljena

GFM modifikovana podloga. Proces fermentacije je praćen 72h uz stalno uzimanje uzoraka,

radi provere sterilnosti i praćenja broja ćelija (CFU/ml).

Metoda 2: Pripremljenim inokulumom je inokulisan fermentor sa podlogom f1 i f2

ĉija je receptura data u tabeli 2. Metoda fermentacije je bila po principu Fed-Batch

fermentacije -,,hranjenja″ bakterija posle 12h inkubacije, što je automatski podešeno putem

peristaltiĉkih pumpi.

Šema hranjenja:

Vreme

inkubacije

Ca(NO3)2+glukoza (NH4)2SO4+

(NH4)2HPO4

Podloga

12 – 13h

13 – 14h

14 – 15h

15 – 16h

30 ml

30 ml

60 ml

80 ml

20 ml

20 ml

20 ml

20 ml

f1

12 – 13h

13 – 14h

14 – 15h

15 – 16h

60 ml

80 ml

100 ml

120 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

f2

41

U periodu od 12 – 16h fermentacije, peristaltiĉkom pumpom je ukupno dodato:

- za prvu podlogu f1, 200 ml rastvora glukoze + Ca(NO3)2 koncentracije 400g/l

(glukoza) , 10 g/l Ca i 80 ml (NH4)2SO4 (120 g/l) + (NH4)2HPO4 (120 g/l);

- za drugu podlogu f2, 360 ml rastvora glukoze + Ca(NO3)2 i 120 ml (NH4)2SO4 (120

g/l) + (NH4)2HPO4 (120 g/l).

Bacillus megatherium

Metode fermentacije su sliĉne opisanim metodama kod gajenja Bacillus subtilis.

Receptura ispitivane teĉne podloge u fermentoru je data u tabeli 3.

Metodom 1 je praćeno uvećanje biomase bez dodavanja hranljivih materija, dok je

metoda 2 uvećanja biomase po principu Fed-Batch fermentacije tj. hranjenja. Dodavanje

nutritijenata je vršeno posle 24h fermentacionog procesa i to: 200 ml glukoza + Ca(NO3)2 i

50 ml (NH4)2SO4 + (NH4)2HPO4 (koncentracije rastvora su identiĉne kao za metodu 2

gajenja B.subtilis).

Azotobacter vinelandii

Za azotofiksirajuću bakteriju, praćena je fementacija u dve podloge ĉiji sastav je

naveden u tabeli 4:

- Jenson′s medium (bezazotna podloga) i

- Podloga za veliku proizvodnju (LPM).

Bioreaktor (fermentor) je inokulisan startnom kulturom i svi parametri su strogo

kontrolisani u narednih 72h. U periodima posle 24, 48 i 72h fermentacije, uziman je uzorak i

vršeno zasejavanje radi odreĊivanja brojnosti mikroorganizama, metodom razreĊenja.

42

5. REZULTATII DISKUSIJA

Rezultati dobijeni ispitivanjem optimizacije medijuma za gajenje odabranih sojeva

korisnih zemljišnih bakterija u kontrolisanim uslovima fermentatora,radi dobijanja najveće

biomase, tj. jednostavnije i jeftinije proizvodnje mikrobiološkog Ċubriva, su obraĊeni i

prikazani pojedinaĉno za svaki soj.

Bacillus subtilisa

Dobijeni rezultati su pokazali da je maksimalni broj ćelija u GFM podlozi 5x108

cfu/ml posle 72h fermentacije. Sa ciljem optimizacije medijuma i dobijanja veće biomase,

metodom 2 je modifikovana podloga, a zatim je uveden reţim “hranjenja”. U tom sluĉaju je

primećen veći rast brojnosti ćelija, što se moţe videti u tabeli 5. Metodom 2, gde smo

ispitivali porast B. subtilis u podlozi f1 i f2, dobili smo sliĉne rezultate, uprkos modifikaciji

podloga i drugaĉijem reţimu ishrane. MeĊutim, u oba sluĉaja, postignut je bolji rezultat i

dobijena veća biomasa ćelija u odnosu na prvu metodu posle 72h procesa fermentacije:

2.5x109 u podlozi f1 i 2x10

9 u podlozi f2 (cfu/ml).

Tabela 5. Standardizacija rasta Bacillus subtilis

Vreme

inkubacije u

fermentoru

GFM (cfu/ml) f1 (cfu/ml) f2 (cfu/ml)

24h 1.5x10^8 9.2x10^8 9.5x10^8

48h 5x10^8 1.5x10^9 3x10^9

72h 5x10^8 2.5x10^9 2x10^9

Na osnovu datih receptura podloga (Tabela 2.), moţe se uoĉiti znaĉajna razlika u

koliĉini glukoze koja ulazi u njihov sastav. Rezultati ukazuju na neophodnost šećera kao

glavnog izvora energije, ali i da njegova koliĉina u startu nije presudna za dobijanje što veće

biomase, već da je to u korelaciji sa fazom rasta pri kultivisanju u teĉnoj podlozi. Zapravo,

hranjenjem mikroorganizama i odrţavanjem konstantnim uslove sredine u fermentoru, moţe

se produţiti eksponencijalna faza rasta, kako bi prirast biomase bio što veći (Jemcev and

Đukić., 2000). Fed-batch fermentacijom i optimizacijom procesa hranjenja bakterija,

postignut je bolji rast biomasa B.subtilis K-C3, kao i veća produkcija enzima natokinaze u

43

bioreaktoru (Pornkamol et al., 2012). Dodavanjem polimera PVP-a (polivinilpirolidon) i

glicerola u odredjenoj koncentraciji, postiţe se duţe preţivljavanje ćelija u medijumu, što je

takoĊe uticalo na bolje dobijene rezultate u podlogama gde su prisutni. Ova jedinjenja su

osmoprotektanti koji ĉuvaju ćeliju od isušivanja i imaju sposobnost vezivanja toksina, koji se

stalno oslobaĊaju kao produkti metabolizma (Sridhar et al., 2004).

Bacillus megaterium

B. megaterium je pokazao bolji rast pri metodi 2 gajenja u bioreaktoru. Posle 72 h

fermentacionog procesa, dobijeno je 7x109

cfu/ml, što predstavlja bolji rezultat u odnosu na

metodu 1. Rezultati su predstavljeni u tabeli 6.

Tabela 6. Standardizacija rasta Bacillus megaterium

Vreme

inkubacije u

fermentoru

Metoda 1 Metoda 2

24h 1.6x10^9 1.8x10^9

48h 1.45x10^9 6x10^9

72h 1.55x10^9 7x10^9

Pošto je u prethodno opisanoj metodi 2, korišćen princip hranjenja posle 24h

fermentcionog procesa, naglo povećanje biomase je postignuto posle 48h, gde je dobijeno

6x109

cfu/ml. Metodom 1, nakon istog vremenskog intervala je dobijeno 1.45x109

cfu/ml, što

se nije znaĉajno promenilo do kraja samog procesa. Ovakav rezultat se moţe objasniti

obogaćivanjem podloge (tj. hranjenjem bakterija) u metodi 2 izvorom ugljenika i azota kroz

dodavanje smeše glukoze i amonijaĉnih jedinjenja.

Kako je već opisano (JemcevandĐukić., 2000), u eksponencijalnoj fazi se ćelije

najbrţe dele, iscrpljujući hranljive materije u teĉnoj podlozi u kojoj rastu. MeĊutim, produkti

metabolizma menjaju sredinu u fermentoru, iako su pojedini parametri strogo kontrolisani

(pH, kiseonik, temperatura, mešanje). To ima za posledicu nagomilavanja toksiĉnih produkata

koji usporavaju ritam razmnoţavanja, a ubrzo i odumiranja ćelija. Zato je vrlo bitno, prekinuti

proces fermentacije baš u ovoj fazi, stacionarnoj, gde je broj ţivih ćelija neko vreme skoro

nepromenljiv. Na osnovu dobijenih rezultata u metodi 1, moţemo videti da je ova faza u

fermentoru postignuta već posle 24h za B.megaterium i 48h za B.subtilis. Zato je hranjenjem

44

bakterija posle 12h (B.subtilis) i 24h (B.megaterium) u metodi 2, eksponencijalno

razmnoţavanje produţeno, pa je shodno tome, posle 48h fermentacionog procesa i dobijen

veći broj ćelija.

Azotobacter vinelandii

Azotobacter vinelandii je pokazao brţi rast posle 24h fermentacije u bioreaktoru u

Jensons modif. podlozi, u odnosu na podlogu za veliku proizvodnju. Posle 24h postignuto je

uvećanje broja ćelija na 9.6x108

cfu/ml u prvoj podlozi, dok je u drugoj bilo znatno manje

1.8x107

cfu/ml. Ovakav rezultat se moţe objasniti većom koliĉinom šećera u prvoj podlozi,

koji predstavlja glavni izvor energije i ugljenika. Rezultati su predstavljeni u tabeli 7.

Tabela 7. Standardizacija rasta Azotobacter vinelandii

Vreme

inkubacije u

fermentoru

Teĉna podloga

Jens.modif LPM

24h 9.6x10^8 1.8x10^7

48h 4.5x10^9 1x10^9

72h 5.5x10^9 3.8x10^9

Kako je vreme kultivacije odmicalo, moţe se uoĉiti da je najveći broj ćelija u dvema

ispitivanim podlogama bio 109

cfu/ml. Iako je naglo uvećanje brojnosti ćelija uoĉeno u prvoj

podlozi posle 24h, već nakon 48h, primećuje se i u drugoj podlozi. Zapravo, posle 72h

fermentacionog procesa, moţe se videti da nema velike razlike u brojnosti kada su u pitanju

ove dve podloge: 5.5x109

i 3.8x109

cfu/ml. Moţda bi ovakav rezultat mogli da objasnimo

periodom prilagoĊavanja bakterija na uslove sredine, koji je duţi u drugoj podlozi, a samim

tim je i eksponencijalna faza odloţena. Svakako, radi se o podlozi sa manje zastupljenim

neophodnim hranljivim materijama i solima (tabela 4), što moţe uzrokovati ovakav efekat.

Samim tim, se moţe uvrstiti za komercijalnu proizvodnju siromašnija podloga, kako bi

proces i proizvod bili jeftiniji i dostupniji za komercijalnu upotrebu.

45

6. ZAKLJUĈAK

Zemljišni mikroorganizmi imaju znaĉajnu ulogu u ekosistemu. Njihova višestruka

korist se ogleda u fiksaciji, solubilizaciji, mobilizaciji i obnavljanju nutritijenata u zemljištu.

Na ovaj naĉin, korisni mikroorganizmi ĉine esencijalne mineralne elemente dostupnim

korenovom sistemu.

Alternativna tehnologija, kojom bi se izbegli svi negativni efekti hemijskog Ċubriva,

ogleda se u povećanju brojnosti korisnih mikroorganizama u zemljištu. Izolacijom ovih

sojeva, njihovom identifikacijom, umnoţavanjem kroz proces fermentacije i vraćanjem u

zemljište – BIOFERTILIZACIJA, teţi se prirodnom rešavanju problema nedostatka ili

nedostupnosti nutritijenata. Mikrobiološka Ċubriva su ekološka i isplativija, a u zavisnosti od

osobina mikroorganizama, višestruko korisna: utiĉu na rast i razvoj biljaka obavljanjem

metaboliĉkih funkcija, povećavaju biološku produktivnost zemljišta, redukuju patogene

mikroorganizme (produkcija aktivnih metabolita).

Rezultati naših istraţivanja su pokazali da je odgovarajućom optimizacijom podloge i

kinetikom Fed-batch procesa moguće postići što veću biomasu korisnih mikroorganizama u

fermentoru. Samim tim, dodavanjem najefikasnijih osmoprotektanata bi se produţio ţivotni

vek ćelija u teĉnoj formi proizvoda. U budućnosti bi trebalo pratiti variranje brojnosti ćelija u

datim formulacijama, radi taĉnog odreĊivanja efikasnosti proizvoda, gde brojnost ćelija na

osnovu deklarisanih parametara, ne bi trebalo da bude manji od 108 cfu/ml. TakoĊe,

efikasnost ispitivanih bakterija bi trebalo ispitati na biljnim kulturama, kako bi se potvrdila

mogućnost korišćenja proizvoda kao mikrobiološko Ċubrivo.

46

7. LITERATURA

1. Ahemad, M., Kibert, M. 2014: Mechanisms and applications of plant growth promoting

Rhizobacteria: Current perspective. – Journal of King Saud University – Science. 26: 1 –

20.

2. Alikhani, H. A., Saleh – Rastin, N., Antoun, H. 2006: Phosphate solubilization activity

of rhizobia native to Iranian soils. – Plant and Soil. 287: 35 – 41.

3. Chandra, K. 2005: Liquid biofertilizers – Regional centre of organic farming, India.

4. Đukić, D., Jemcev, V. 2004: Opšta i industrijska mikrobiologija, Novi Sad.

5. Đukić, D., Jemcev, V., Kuzmanova, J. 2007: Biotehnologija zemljišta. – Budućnost,

Novi Sad.

6. Glick, B. 2012: Plant Growth – Promoting Bacteria: Mechanisms and Applications. –

Scientifica. 2012, 15 pages.

7. Gomathy, M., Thangaraju, M., Gunasekaran, S., Gopal, N. O., Gopal, H. 2008: Method

and Quantity of Liquid Formulation of Phosphobacteria Required for Seed Inoculation.

– Pakistan Journal of Biological Sciences. 11(1): 86 – 91.

8. Jemcev, V., Đukić D. 2000: Mikrobiologija. – Vojnoizdavaĉki zavod, Beograd.

9. Khan, A., Jilani, G., Akhtar, S. M., Naqvi, S. M. S., Rasheed, M. 2009: Phosphorus

Solubilizing Bacteria: Occurrence, Mechanisms and their Role in Crop Production. –

Journal of Agricultural and Biological Science. 1: 48 – 58.

10. Kumaresan, G., Reetha, D. 2011: Survival of Azospirillum brasilense in liquid

formulation amended with different chemical additives. – Journal of Phytology. 3:48 -

51.

11. Leo Daniel, 2013: Effect of Polymeric Additives, Adjuvants, Surfactants on Survival,

Stability and Plant Growth Promoting Ability of Liquid Bioinoculants. – Journal of

PlantPhysiology & Pathology. 1:2.

12. Ma, X., Wang, X., Cheng, J., Nie, X., Yu, X., Zhac, Y., Wang, W. 2015:

Microencapsulation of Bacillus suptilis B99 – 2 and its biocontrol efficiency against

Rhizoctonia solani in tomato. – Biological control. 90: 34 – 41.

47

13. Mauricio, A.2013: Scale – up from shake flasks to pilot-scale production of the plant

growth – promoting bacterium Azospirillum brasilense for preparing a liquid inoculants

formulation. – Applied Microbiology and Biotechnology. 97:9665 – 9674.

14. Mihajilov – Krstev, T. 2008: Radna sveska iz mikrobiologije. – Niš: Prirodno –

matematiĉki fakultet, Odsek za biologiju sa ekologijom, Niš.

15. Monteiro, S. M. S., Clemente, J. J., Carrondo, M. J. T., Cunha, A. E. 2014: Enhanced

Spore Production of Bacillus subtilis Grown in a Chemically Defined Medium. –

Advances inMicrobiology. 4: 444 – 454.

16. Omer, A. M., 2010: Bioformulations of Bacillus Spores for using as Biofertilizer. – Life

ScienceJournal.7: 124 – 131.

17. Ortiz – Castro, R., Contreras – Cornejo, H.A., Macias – Rodriguez, L., Lopez – Bucio,

H. 2009: The role of microbial signals in plant growth and development. – Plant

Signaling and Behavior. 4: 701 – 712.

18. Petrović, O., Kneţević, P., Simeunović, J. 2007: Mikrobiologija. – Skripta za studentre,

Novi Sad.

19. Rahman, A., Sitepu, I., Tang, S.-Y., Hashidoko, Y. 2010: Salkowski′s Reagent Test as a

Primary Screening Index for Functionalities of Rhizobacteria Isolated from Wild

Dipterocarp Saplings Growing Naturally on Medium. – Strongly Acidic Tropical Peat

Soil. – Bioscience Biotechnology andBiochemistry. 74: 2202 – 2208.

20. Richardson, A., Simpson, R. 2011: Soil Microorganisms Mediating Phosphorus

Availability. – Plant physiology. 156: 989 – 996.

21. Seshadri, S., Muthukumarasamy, R., Lakshminarasimhan, C., Ignacimuthu, S. 2000:

Solubilization of inorganic phosphates by Azospirillum halopraeferans. – Current

science. 79.

22. Singh, T., Purohit, S.S. 2012: Biofertilizer Technology. – Agrobios, India.

23. Sivakumar, P. K, Parthasarthi, R., Lakshmipriya, V. P. 2014: Encapsulation of plant

growth promoting inoculant in bacterial alginate beads enriched with humic acid. –

International Journalof Current Microbiology and Applied Sciences. 3: 415 – 422.

24. Sridhar, V., Brahmaprakash, G.P., Hegde, S.V. 2004: Development of a Liquid Using

Osmoprotectants for Phosphate Solubilizing Bacterium (Bacillus megaterium). –

Kamataka. Journal of Agricultural Science. 17: 251 – 257.

25. Unrean, P., Nguyen, N., Visessanguan, W., Kitsuban, P. 2012: Improvement of

nattokinase production by Bacillus subtilis using an optimal feed strategy in fed – batch

fermentation. – Researchjournal.17: 769 – 777.

48

26. Velineni, S., Brahmaprakash, G. P. 2011: Survival and Phosphate Solubilizing Ability

of Bacillus megatherium in Liquid Inoculants under High Temperature and Desiccation

Stress. – Jornal ofAgriculture Science and Technology. 13: 795 – 802.

27. Young, C. C., Rekha, P. D., Lai, W. A., Arun, A. B. 2006: Encapsulation of Plant

Growth – Promoting Bacteria in Alginate Beads Enriched With Humic Acid. –

Biotechnology andBioengineering.95.

49

8. BIOGRAFIJA

Dunja Ilić roĊena je 26. oktobra 1990. godine u Beogradu. Osnovnu školu ,,Desanka

Maksimović”, završava 2005. godine u Grdelici i iste upisuje srednju medicinsku školu ,,Dr.

Milenko Hadzić “, u Nišu, gde završava smer medicinska sestra - vaspitaĉ. Osnovne

akademske studije na Prirodno – matematiĉkom fakultetu Univerziteta u Nišu, Departman za

biologiju i ekologiju, upisuje 2009. godine. Studije završava 2013. godine i tada upisuje

Master akademske studije, smer Biologija.

Прилог5/1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: Текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Дуња Илић

Ментор, МН: Татјана Михајилов – Крстев

Наслов рада, НР: Гајење азотофиксирајућих и фосфосолубилизирајућих

бактерија у контролисаним условима ферментора у циљу

биофертилизације земљишта

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2016

Издавач, ИЗ: Ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Микробиологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Азотофиксирајуће и фосфосолубилизирајуће бактерије, микробиолошка ђубрива, биофертилизација.

УДК 631.461.7 : 631.484 631.461.5 : 631.484

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Земљишни микроорганизми имају значајну улогу у екосистему. Њихова вишеструка корист се огледа у фиксацији, солубилизацији, мобилизацији, обнавлјанју нутритијената у земљишту. Обогаћиванје земљишта корисним микроорганизмима је биофертилизација, то јест имплементација у земљиште у форми микробиолошких ђубрива. У овом раду је описан процес оптимизације медијума као и Fed – Batch процеса гајења азотофиксирајућих и фосфосолубилизирајућих бактерија, са циљем повећања њихове биомасе, производње микробиолошких ђубрива и њихове имплементације у земљиште. БактеријеBacillus suptilis, Bacillus megateriumи Azotobacter vinelandiiсу коришћене за испитивање процеса ферментације у строго контролисаним условима биореактора. Резултати наших истраживања су попоказали да је одговарајућом оптималном подлогом и кинетиком Fed – Batch процеса могуће постићи што већу биомасу корисних микроорганизама у ферментору.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

Члан, ментор:

ОбразацQ4.09.13- Издање

1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: Master’s thesis

Author, AU: Dunja Ilić

Mentor, MN: Tatjana Mihajilov - Krstev

Title, TI: GROWING NITROGENFIXATION AND PHOSPHORSOLUBIZING BACTERIA UNDER

CONTROLLED CONDITIONS IN FERMENTOR WITH A GOAL TO FERTILISE THE SOIL

Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2016

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Microbiology

Subject/Key words, S/KW: Nitrogenfixation and phosphosolubizing bacteria, microbiological fertilizer,

biofertilization

UC 631.461.7 : 631.484 631.461.5 : 631.484

Holding data, HD: Library

Note, N: Abstract, AB: Soils play the crucial role in the ecosystem.Their multiple use is shown in fixation,solubilization,

mobilization and recover of nutritients in soil. Soil fertilization with useful microorganisms is

biofertilization so called implementation of soil in form of microbiological fertilizer. This work

shows the process of optimization of medium as well as fed batch growth nitrogenfixation and

phosphorsolubizing bacteria in order to improve biomass and production of microbiological

fertilizer and their implementation in soil. Bacterias culture Bacillus subtilis, Bacillus

megatherium and Azotobacter vinelandii are used for research of process of fermentation in

strictly controlled conditions of bioreactor. The final results of the search shows that appropriate

optimization of the soil and kinetics fed batch process is possible to gain bigger biomass of useful

microorganisms in fermentor.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

2