MAGISTRSKO DELO Petra SEVER

Univerza v Mariboru

Fakulteta za naravoslovje in matematiko

Oddelek za biologijo

MAGISTRSKO DELO

Petra SEVER

Maribor, 2017

Univerza v Mariboru

Fakulteta za naravoslovje in matematiko

Oddelek za biologijo

Petra SEVER

Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic

duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela

trebušne slinavke miši

MAGISTRSKO DELO

Mentorica: izr. prof. dr. Saška Lipovšek

Somentor: doc. dr. Andraž Stožer

Maribor, 2017

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke miši. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2017. II

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA NARAVOSLOVJE IN MATEMATIKO

IZJAVA O AVTORSTVU

Podpisana Petra Sever, rojena 02. 07. 1990 v Mariboru, študentka Fakultete za naravoslovje

in matematiko Univerze v Mariboru, študijskega programa Biologija in ekologija z

naravovarstvom, izjavljam, da je magistrsko delo z naslovom Mikroskopske in

ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne

slinavke miši pri mentorici izr. prof. dr. Saški Lipovšek in somentorju doc. dr. Andražu

Stožerju avtorsko delo. V magistrskem delu so uporabljeni viri in literatura korektno

navedeni; teksti in druge oblike zapisov niso uporabljeni brez navedbe avtorjev.

Maribor, 14. 02. 2017 Petra Sever

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke miši. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2017. III

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in

gastričnega dela trebušne slinavke miši. Magistrsko delo, Univerza v Mariboru, Fakulteta

za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, 2017.

POVZETEK Diabetes, pankreatitis, rak na trebušni slinavki so samo nekatere od številnih bolezni, ki so

vzrok za raziskovanje trebušne slinavke. Modelni organizem teh raziskav je miš (Mus

musculus), ki veliko prispeva k znanju v humani medicini. Trebušna slinavka je druga največja

prebavna žleza v trebušni votlini. Je eksokrina žleza, ki izloča prebavne sokove in endokrina

žleza, ki regulira glukozno homeostazo. Zanimali sta nas struktura in ultrastruktura treh

različnih delov trebušne slinavke miši; duodenalnega, spleničnega in gastričnega režnja.

Trebušno slinavko miši smo odstranili iz trebušne votline in analizirali prej omenjene dele s

pomočjo svetlobne in transmisijske elektronske mikroskopije. Ugotovili smo, da so velikosti

Langerhansovih otočkov med različnimi strukturnimi deli trebušne slinavke miši med seboj

primerljivi. Do statistično pomembnih razlik pa je prišlo med velikostmi glukagonskih veziklov

in granul, inzulinskih veziklov in granul, velikosti somatostatinskih granul ter velikosti

zimogenih granul acinusa. Le med najdaljšim premerom somatostatinskih granul v

duodenalnem in spleničnem delu trebušne slinavke nismo zaznali statističnih razlik. Deleži

endokrinih in eksokrinih granul v različnih strukturnih delih trebušne slinavke so med seboj

primerljivi. Med samimi deli trebušne slinavke miši ni strukturnih razlik, so pa zaznavne

razlike v ultrastrukturi. Dobljene rezultate smo primerjali z že objavljenimi rezultati in

ugotovili, da so med seboj skladni.

Ključne besede: Langerhansovi otočki, endokrine celice, eksokrine celice, mišja trebušna

slinavka, struktura

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke miši. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2017. IV

Sever P: Microscopic and ultrastructural features of the cells from the duodenal, splenic,

and gastric lobe of the mouse pancreas. Master’s thesis, University of Maribor, Faculty of

Natural Sciences and Mathematics, Department of Biology, 2017.

ABSTRACT Diabetes, pancreatitis and pancreatic cancer are only some of the many diseases which

provide us with a reason to perform studies of the pancreas. The mouse (Mus musculus), as

a model organism for pancreas research, can be considered one of the more important

sources of knowledge for the field of Human Medicine. The pancreas is the second largest

digestive gland inside the abdomen. It functions both as an exocrine gland, excreting gastric

juices, and as an endocrine gland, regulating the homeostasis of glucose. This work focused

on the study of the structure and ultrastructure of the duodenal, splenic, and gastric lobes of

the mouse pancreas. After removing the pancreas from the abdomen of the mouse, we

analyzed its structural parts using light microscopy and transmission electron microscopy.

The results of this work indicate that the sizes of islets of Langerhans of different structural

parts of the mouse pancreas do not differ. Additionally, it was determined that statistically

significant differences between the sizes of glucagon vesicles and granules, insulin granules

and vesicles, somatostatin granules and acinar zymogen granules exist. No statistical

differences in the longest diameters of somatostatin granules between the duodenal and the

splenic lobes were observed. Additional analysis showed that the ratios of endocrine and

exocrine granules between different structural parts of the mouse pancreas do not differ.

Structural differences of the lobes of the mouse pancreas were not observed, though

differences in the ultrastructure were seen. No large differences were found when

comparing the results of this work with other results obtained from other published

literature.

Key words: islets of Langerhans, endocrine cells, exocrine cells, mouse pancreas, structure

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke miši. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2017. V

KAZALO VSEBINE 1 Uvod .................................................................................................................................... 1

1.1 Histologija in anatomija trebušne slinavke ................................................................. 1

1.2 Ultrastruktura glavnih tipov endokrinih celic trebušne slinavke miši ......................... 4

1.3 Biogeneza in dinamika inzulinskih sekretornih granul endokrinega dela trebušne

slinavke ................................................................................................................................... 7

1.3.1 Primerjava eksocitoze celic beta z eksocitozo celic alfa in delta ....................... 12

1.3.2 Vpliv grelina in pankreatičnega polipeptida (PP) na okoliške celice .................. 12

1.4 Eksocitoza acinarnih celic eksokrinega dela trebušne slinavke ................................ 13

1.5 Eksokrino izločanje celic izvodil trebušne slinavke.................................................... 13

1.6 Primerjalna endokrinologija po sistemu vretenčarjev (Vertebrates) ........................ 14

1.6.1 Endokrini del trebušne slinavke pri pticah (Aves) .............................................. 14

1.6.2 Endokrini del trebušne slinavke pri plazilcih (Reptilia) ...................................... 14

1.6.3 Endokrini del trebušne slinavke pri ribah (prave kostnice, Teleostei) ............... 16

1.6.4 Endokrini del trebušne slinavke pri dvoživkah (Amphibians) ............................ 16

1.6.5 Endokrini del trebušne slinavke pri glodavcih (podgana, Rattus sp. in miš, Mus

sp.) ...…............. ................................................................................................................. 17

2 Namen in cilji magistrskega dela ...................................................................................... 18

3 Material in metode ........................................................................................................... 19

3.1 Žrtvovanje živali ......................................................................................................... 19

3.2 Priprava histoloških preparatov ................................................................................ 19

3.3 Rezanje in barvanje tkiva za svetlobno mikroskopijo ............................................... 20

3.4 Rezanje in barvanje tkiva za transmisijsko elektronsko mikroskopijo ...................... 21

3.5 Analiza fotografij ........................................................................................................ 21

3.6 Statistična obdelava podatkov .................................................................................. 22

4 Rezultati ............................................................................................................................ 24

4.1 Strukturne značilnosti trebušne slinavke .................................................................. 24

4.1.1 Velikost Langerhansovih otočkov ....................................................................... 24

4.2 Granule v endokrinih in eksokrinih celicah duodenalnega, spleničnega in gastričnega

dela trebušne slinavke miši .................................................................................................. 26

4.2.1 Glukagonske granule .......................................................................................... 29

4.2.2 Inzulinske granule ............................................................................................... 31

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke miši. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2017. VI

4.2.3 Somatostatinske granule .................................................................................... 33

4.3 Granule eksokrinega dela trebušne slinavke ............................................................. 35

4.4 Površine granul endokrinih in eksokrinih celic .......................................................... 37

5 Razprava ............................................................................................................................ 38

5.1 Strukturne značilnosti trebušne slinavke .................................................................. 38

5.2 Granule v endokrnih in eksokrinih celicah duodenalnega, spleničnega in gastričnega

dela trebušne slinavke miši .................................................................................................. 38

5.3 Površine granul endokrinih in eksokrinih celic .......................................................... 41

6 Zaključki ............................................................................................................................. 43

7 Zahvale .............................................................................................................................. 45

8 Literatura ........................................................................................................................... 46

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke miši. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2017. VII

KAZALO SLIK Slika 1: Makroskopska anatomija človeške (A) in mišje (B) trebušne slinavke. Povzeto po

Dolenšek et al. (2015). ............................................................................................................... 1

Slika 2: Langerhansov otoček (LO) obdan z eksokrinim tkivom (ET) spleničnega dela trebušne

slinavke miši. (Foto: Sever, 2016) ............................................................................................... 3

Slika 3: Langerhansov otoček (LO) obdan z eksokrinim tkivom (ET) spleničnega dela trebušne

slinavke miši. (Foto: Sever, 2016) ............................................................................................... 3

Slika 4: Ultratanka rezina endokrinega tkiva s celicami alfa trebušne slinavke miši. (Vir:

Lipovšek et al., 2013). ................................................................................................................. 5

Slika 5: Ultratanka rezina endokrinega tkiva s celicami beta trebušne slinavke miši. (Vir:

Lipovšek et al., 2013). ................................................................................................................. 6

Slika 6: Ultra tanka rezina endokrinega tkiva s celicami beta (BC) in celicami delta (DC)

trebušne slinavke miši. (Vir: Lipovšek et al., 2013). ................................................................... 7

Slika 7: Glukozno inducirana biosinteza inzulinskih sekretornih granul v celicah beta trebušne

slinavke miši. Prirejeno po Borgonovo et al. (2006) .................................................................. 9

Slika 8: Povezava glukoze in inzulina v celicah beta trebušne slinavke miši. Prirejeno po

Rupnik (2009) ........................................................................................................................... 10

Slika 9: Pripenjanje sekrecijske granule na membrano in eksocitoza. Prirejeno po Rorsman in

Renström (2003) ....................................................................................................................... 11

Slika 10: Skica položaja trebušne slinavke (črno) pri različnih predstavnikih plazilcev : želvi (a),

krokodilu (b), kuščarju (c) in kači (d). Prirejeno po Yadav (2008) ............................................ 15

Slika 11: Merjenje premera Langerhansovega otočka v programu pyCellCouneter ............... 21

Slika 12: Merjenje ploščin granul v programu pyCellAnalyser ................................................. 22

Slika 13: Langerhansovi otočki (LO) v duodenalnem (a,b), spleničnem (c, d) in gastričnem (e,

f) delu trebušne slinavke miši. ................................................................................................. 25

Slika 14: Velikosti Langerhansovih otočkov v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu

trebušne slinavke miši .............................................................................................................. 26

Slika 15: Ultratanka tkivna rezina duodenalnega dela trebušne slinavke miši ........................ 27

Slika 16: Ultratanka tkivna rezina celice alfa (a), celice beta (b) in celice delta (c)

duodenalnega dela trebušne slinavke miši .............................................................................. 27

Slika 17: Ultratanka tkivna rezina spleničnega dela trebušne slinavke miši. ........................... 28

Slika 18: Ultratanka tkivna rezina celice alfa (a), celice beta (b) in celice delta (c) spleničnega

dela trebušne slinavke miši. ..................................................................................................... 28

Slika 19: Ultratanka tkivna rezina gastričnega dela trebušne slinavke miši ............................ 29

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke miši. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2017. VIII

Slika 20: Ultratanka tkivna rezina celice alfa (a), celice beta (b) in celice delta (c) gastričnega

dela trebušne slinavke miši ...................................................................................................... 29

Slika 21: Premeri glukagonskih granul v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu

trebušne slinavke miši. ............................................................................................................. 30

Slika 22: Premeri glukagonskih veziklov v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu

trebušne slinavke miši. ............................................................................................................. 31

Slika 23: Premer inzulinskih granul v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne

slinavke miši ............................................................................................................................. 32

Slika 24: Premeri inzulinskih veziklov v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu

trebušne slinavke miši .............................................................................................................. 33

Slika 25: Dolžina najdaljšega dela somatostatinske granule v duodenalnem, spleničnem in

gastričnem delu trebušne slinavke miši. .................................................................................. 34

Slika 26: Dolžina najkrajšega dela somatostatinske granule v duodenalnem, spleničnem in

gastričnem delu trebušne slinavke miši. .................................................................................. 35

Slika 27: Ultratanka rezina eksokrinega dela trebušne slinavke miši. ..................................... 36

Slika 28: Premer granul acinusa v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne

slinavke miši. ............................................................................................................................ 37

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke miši. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2017. IX

KAZALO TABEL Tabela 1: Povzetek razlik med mišjo in človeško trebušno slinavko (Vir: Stožer, 2013;

Dolenšek et al., 2015) ................................................................................................................. 4

Tabela 2: Način priprave tkiva za histološki pregled po Glauertu (1987) ................................ 20

Tabela 3: Mediana, interkvartilni razmik (IQR), minimum in maksimum velikosti (v μm)

Langerhansovih otočkov. ......................................................................................................... 25

Tabela 4: Analiza variance velikosti Langerhansovih otočkov duodenalnega, spleničnega in

gastričnega dela trebušne slinavke .......................................................................................... 26

Tabela 5: Povprečje, standardna deviacija, minimum in maksimum premerov (v nm)

glukagonskih granul in veziklov. ............................................................................................... 30

Tabela 6: Analiza variance glukagonskih granul duodenalnega, spleničnega in gastričnega

dela trebušne slinavke.............................................................................................................. 30

Tabela 7: Analiza variance glukagonskih vezikolov duodenalnega, spleničnega in gastričnega


Tabela 8: Povprečje, standardna deviacija, minimum, maksimum premera inzulinskih granul

in inzulinskih veziklov v treh delih trebušne slinavke miši. ...................................................... 32

Tabela 9: Analiza variance inzulinskih granul duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela

trebušne slinavke ..................................................................................................................... 32

Tabela 10: Analiza variance inzulinskih veziklov duodenalnega, spleničnega in gastričnega


Tabela 11: Povprečje, standardna deviacija, minimum, maksimum premera inzulinskih granul

in inzulinskih veziklov v treh delih trebušne slinavke miši. ...................................................... 33

Tabela 12: Analiza variance najdaljšega dela somatostatinskih granul duodenalnega,

spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke .................................................................. 34

Tabela 13: Analiza variance najkrajšega dela somatostatinskih granul duodenalnega,

spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke .................................................................. 34

Tabela 14: Povprečje, standardna deviacija, minimum, maksimum zimogenih granul v treh

delih trebušne slinavke miši. .................................................................................................... 36

Tabela 15: Analiza variance zimogenih granul duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela

trebušne slinavke ..................................................................................................................... 36

Tabela 16: Deleži endokrinih in eksokrinih granul na 10 µm2 tkiva......................................... 37

Tabela 17: Pregled rezultatov velikosti Langerhansovih otočkov drugih raziskovalcev .......... 38

Tabela 18: Pregled rezultatov velikosti endokrinih in eksokrinih granul naše raziskave in

drugih raziskovalcev ................................................................................................................. 39

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke miši. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2017. X

KRAJŠAVE Ac-CoA acetil koencim A

ATP adenin trifosfat

Ca+ kanali kalcijevi kanali

ER endoplazemski retikulum

FADH2 reducirana oblika flavin adenin dinukleotida

GA Golgijev aparat

GIP glukozno odvisni inzulinotropni peptid

GLP-1 glukagonu podobni peptid 1

glut1,glut2 in glut3 glukozni prenašalni protein

GTP gvanozin trifosfat

ICA 512/IA-2 intrinzični membranski protein sekretornih granul

K+- kanali kalijevi kanali

kDa kiloDalton

kanal KATP od ATP odvisni K+ kanali

mRNA informacijska ribonukleinska kislina

Na+/K+ ATPaza natrij/kalijeva adenin trifosfataza

Na+/HCO3- kotransport natrij/bikarbonatni kotransport

NADH reducirana oblika nikotinamid adenin dinukleotida

PP pankreatični polipeptid

PTB polipirimidinski traktpovezujoči protein

PTP tirozin fosfatna domena

RNA ribonukleinska kislina

SNAP-25 na sinaptosom vezan protein teže 25 kDa

SNARE receptor topnega NSF vezavnega faktorja

RER zrnati endoplazemski retikulum

RRP hitro dostopna zaloga inzulinskih veziklov

SRP počasi dostopna zaloga inzulinskih veziklov

STAT, STAT3 in STAT 5 citoplazemski proteini, ki jih kot transkripcijske faktorje fosforilira in s tem aktivira Janusova kinaza

TGN trans Golgijevo mrežje

UTR neprevedena genska regija

VAMP na vezikel vezan membranski protein

VDCC kalcijevi napetostno odvisni kanali

Sever P: Mikroskopske in ultrastrukturne značilnosti celic duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke miši. Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2017. 1

1 Uvod Trebušna slinavka miši je pogosto predmet raziskav, predvsem zaradi kliničnih obolenj, kot

so diabetes, pankreatitis, tumorji v endokrinem delu trebušne slinavke in rak trebušne

slinavke. Ker je miš (Mus musculus) modelni organizem za študij trebušne slinavke, so

raziskave na trebušnih slinavkah miši izredno pomembne v humani medicini (Dolenšek et al.,

2015).

Slika 1: Makroskopska anatomija človeške (A) in mišje (B) trebušne slinavke. (A) Človeška trebušna slinavka je razdeljena na glavo, telo in rep. (B) Mišja trebušna slinavka je sestavljena iz treh režnjev: dvanajstnikovega, vraničnega in želodčnega reženja. Homologni deli trebušne slinavke so barvno usklajeni. Povzeto po Dolenšek et al. (2015).

1.1 Histologija in anatomija trebušne slinavke

Trebušna slinavka je druga največja prebavna žleza pri človeku (Cvetko, 2016); je sivkasto

roza barve, pri odraslem človeku meri v dolžino 12 – 15 cm, v širino 3 - 5 cm, v debelino 1 - 2

cm in tehta približno 40 - 120 g (Atherton in Atherton, 2007, Stožer, 2013). Leži v epigastrični

regiji trebušne votline (Schuenke in Schulte, 2006), posteriorno ob glavni krivini želodca, ob

jetrih in žolčniku (Tortora in Nielson, 2009). Trebušna slinavka je podaljšan, sekundarni


retroperitonealni organ lociran pred prvim in drugim ledvenim vretencem hrbtenice in se

razteza vse do vranice (Schuenke in Schulte, 2006). Njeno sprednjo površino pokriva

parietalni peritonej (stenski list potrebušnice), pred katerim je želodec. Z zadnjo steno se

dotika aorte, spodnje votle vene, leve ledvice in leve nadledvične žleze (Cvetko, 2016).

V splošnem jo delimo na del levo od superiorne mezenterične arterije, ki se obravnava kot

meja med glavo trebušne slinavke in med srednjim delom, ki se obravnava kot telo trebušne

slinavke. Glava je oblikovana v obliki črke C in je poravnana z zgornjim delom dvanajstnika.

Ploščato ozko telo trebušne slinavke leži za želodcem, kjer se skoraj horizontalno razteza v

medialni ravnini. Koničast konec trebušne slinavke pa obravnavamo kot rep (Dolenšek et al.,

2015).

Mišjo trebušno slinavko v splošnem delimo na dvanajstnikov (duodenalni), vranični

(splenični) in želodčni (gastrični) reženj. Vranični reženj je največji del in zavzema več kot

polovico vsega volumna trebušne slinavke. Vranični reženj je homologen telesu in repu

trebušne slinavke človeka. Dvanajstnikov reženj se nahaja v mezenteriju dvanajstnika in je

homologen glavi trebušne slinavke človeka. Želodčni reženj je najmanjši in se ga včasih

obravnava kot del vraničnega režnja, ki se razvije med ontogenezo. Želodčni reženj je

homologen piramidnemu procesu, ta del človeške trebušne slinavke imenujemo uho ali

uhelj. (Dolenšek, 2015).

Okrog trebušne slinavke je tanka vezivna ovojnica, iz katere prehajajo pregrade iz vezivnega

tkiva in so podaljšane v žlezo, tako da površina izgleda režnjato (Cvetko, 2016). Mezenhim

predstavlja 15 – 25 % volumna trebušne slinavke in je sestavljen iz številnih maščobnih celic.

Eksokrini del trebušne slinavke predstavlja 96 – 99 % parenhima. Vsak reženj vsebuje več

manjših režnjev - režnjičev. Razmejitve med režnjiči ni mogoče natančno določiti, zato je

parenhim trebušne slinavke videti kot celota. Žlezni reženj je sestavljen iz struktur,

imenovanih acinusi. Acinus je skupek piramidnih acinarnih celic, ki tvorijo kupolasto

strukturo. Iz apikalnih polov acinarnih celic prevaja interkalarni vod izloček v lumen.

Interkalarni vod prevaja izloček do intralobularnega voda (leži med režnjiči), nato prevaja v

večji interlobularni vod (leži med režnji). Nazadnje se izloček zlije v glavni pankreatični vod ali

Wirsungov vod, ki se razteza po celotni dolžini trebušne slinavke. Vsebina glavnega

pankreatičnega voda se izloča v dvanajstnik v bližini žolčevoda. Miši imajo precej drugačno

anatomijo pankreatičnih vodov kot človek. Velik notranji vod prevaja izloček iz vseh treh

režnjev. Vranični in želodčni reženj združita svoja voda v enega, tik pred glavnim vodom, ki

vstopa v steno dvanajstnika. Žolčni vodi se individualno pritrjajo na glavni vod ali pa se

direktno izlivajo v dvanajstnik (Dolenšek et al., 2015).

Relativno majhen del parenhima trebušne slinavke (1 – 4 %) je zapolnjen z endokrinimi

mikroorgani, imenovanimi Langerhansovi otočki (v nadaljevanju otočki). Otočki so okrogle do

ovalne oblike, lahko tudi nepravilnih oblik. V otočkih je vsaj pet tipov endokrinih celic, ki

izločajo polipeptidne hormone. Najbolj številčne endokrine celice pri človeku so celice beta,

ki izločajo inzulin in predstavljajo 50 – 70 % celic v Langerhansovem otočku. Celice alfa

predstavljajo 20 – 40 % celotnega števila celic in izločajo glukagon. Celice delta in celice PP

sproščajo somatostatin in pankreatični polipeptid. Ta dva tipa celic sta maloštevilčna in


prestavljata 10 % vseh celic. Hormon grelin sproščajo celice epsilon, ki predstavljajo manj kot

1 % vseh celic (Dolenšek et al., 2015). Velikosti Langerhansovih otočkov so pri miših podobne

velikosti otočkov pri človeku. Najpogostejše so celice beta (60 - 80 % vseh celic), celice alfa

predstavljajo okrog 10 – 20 % vseh endokrinih celic. Miši imajo v povprečju večji delež celic

alfa in beta kot ljudje (Cabrera et al., 2006; Dolenšek et al., 2015). Celice delta in celice PP so

manj pogoste in predstavljajo manj kot 5 % vseh celic v otočkih pri miših (Dolenšek et al.,

2015).

Slika 2: Langerhansov otoček (LO) obdan z eksokrinim tkivom (ET) spleničnega dela trebušne slinavke miši. Poltanka tkivna rezina barvana s touilidinskim modrilom; KŽ - krvna žila. (Foto: Sever, 2016)

Slika 3: Langerhansov otoček (LO) obdan z eksokrinim tkivom (ET) spleničnega dela trebušne slinavke miši. Poltanka tkivna rezina barvana s touilidinskim modrilom; AC – acinus, D – izločalni vod, KŽ - krvna žila. (Foto: Sever, 2016)


Tabela 1: Povzetek razlik med mišjo in človeško trebušno slinavko (Vir: Stožer, 2013; Dolenšek et al., 2015)

obseg lastnosti MIŠ ČLOVEK

ORGAN

anatomski tip difuzni/dendrični, režnjični, mehak tudi mezenteričen

osamljen, kompakten, trden

izločalni vodi glavni vod se proksimalno združi z žolčnim vodom pri vhodu v dvanajstnik. Več dodatnih vodov.

glavni vod se združi z žolčnim vodom na točki, kjer vstopata v dvanajstnik. En dodaten vod.

TKIVO

premer režnjičev 0,5 – 1,5 mm 1 – 10 mm

premer endokrinih celic v otočku

posamezna celica 500 – 700 µm

posamezna celica 500 – 700 µm

premer otočkov 120 ± 80 µm 100 - 150 µm

število otočkov 1 000 – 5 000 1 000 000 – 15 000 000

lokacija otočkov naključno, interlobularno enakomerno, intralobularno

CELICE

% celic alfa in beta celice alfa: 10 - 20 % celice beta: 60 – 80 %

celice alfa: 20 – 40 % celice beta: 50 – 70 %

mikroarhitektura otočkov

prevladuje vzorec plašča prevladuje trilaminarni vzorec

1.2 Ultrastruktura glavnih tipov endokrinih celic trebušne slinavke miši

Celice alfa imajo elektronsko redkejšo citoplazmo, ki vsebuje veliko mitohondrijev in dobro

razvit zrnati endoplazemski retikulum (v nadaljevanju zrnati ER). Granule celic alfa so okrogle

oblike in so elektronsko goste. Okrog granul je ozek kolobar svetline (halo), nad njo pa je

membrana (slika 4). Premer veziklov celic alfa je 236 nm ± 30 nm, premer granul pa meri 185

nm ± 32 nm. Ob plazmalemi je na izbrani razdalji 3 µm v povprečju sedem glukagonskih

granul (Lipovšek et al., 2013).


Slika 4: Ultratanka rezina endokrinega tkiva s celicami alfa trebušne slinavke miši. RER – zrnati endoplazemski retikulum (ER), G – glukagonske granule, N – jedro celice alfa. Merilo: 500 nm (Vir: Lipovšek et al., 2013).

Celice beta imajo v citoplazmi prav tako dobro razvit zrnati ER in Golgijev aparat (GA), veliko

mitohondrijev in velike inzulinske granule. Citoplazma nekaterih celic beta je gosto

napolnjena z inzulinskimi granulami, zato je zrnati ER manjši in GA je manj viden, medtem,

ko so druge celice beta manj napolnjene z inzulinskimi granulami, organeli so vidni na večji

površini, kot v celicah, kjer prevladujejo inzulinske granule. Inzulinske granule so okrogle

oblike in imajo elektronsko gosto jedro in ohlapno membrano s prostornim halojem (slika 5).

Premer granul je 235 nm ± 43 nm z jedrom premera 141 nm ± 37 nm. Ob plazmalemi v

dolžini 3 µm je v povprečju sedem inzulinskih granul (Lipovšek et al., 2013).


Slika 5: Ultratanka rezina endokrinega tkiva s celicami beta trebušne slinavke miši. N – jedro celice beta, M – mitohondrij, I – inzulinska granula. Merilo: 500 nm (Vir: Lipovšek et al., 2013).

V citoplazmi celic delta je dobro razvit zrnati ER, prisotnih je veliko mitohondrijev in veliko

število somatostatinskih granul. Granule so heterogene in variirajo v obliki. Večina granul je

ovalnih oblik, številne so nepravilnih oblik (slika 6). Granule so elektronsko redkejše in

svetlejše od glukagonskih in inzulinskih granul. Vsebina granul je homogena in zavzema

celoten vezikel, svetline je manj kot pri glukagonskih in inzulinskih granulah (slika 6).

Najkrajši premeri granul merijo 174 nm ± 29 nm, najdaljši premeri granul pa merijo 212 nm ±

31 nm. V povprečju je osem somatostatinskih granul ob plazmalemi izbrane dolžine 3 µm.


Slika 6: Ultra tanka rezina endokrinega tkiva s celicami beta (BC) in celicami delta (DC) trebušne slinavke miši. S – somatostatinska granula, I – inzulinska granula. Merilo: 500 nm (Vir: Lipovšek et al., 2013).

1.3 Biogeneza in dinamika inzulinskih sekretornih granul endokrinega

dela trebušne slinavke

Večji del celic endokrinega dela trebušne slinavke predstavljajo celice beta. To so celice, ki

izločajo inzulin, ki je najpomembnejši anabolni hormon in omogoča privzem glukoze v tarčna

tkiva (Rorsman in Renström, 2003). Sekretorne granule inzulina so znotrajcelične strukture,

obdane z membrano in velike nekaj sto nanometrov. Nezrele granule izhajajo iz trans

Golgijevega mrežja (TGN). S postopno obdelavo in pakiranjem peptidnega tovora se vsebina

granul kondenzira in tako granule dozorijo v zrele sekretorne granule. Zrela sekretorna

granula je tipično manjša od nezrele, in po izoblikovanju ohranja svojo identiteto skozi

celoten ekso-endocitotski cikel (Borgonovo et al., 2006).

Volgemut je v svojem magistrskem delu (2015) celice beta opisal kot celice z zelo dobro

razvitim endomembranskim sistemom (obilen zrnat endoplazemski retikulum, Golgijev

aparat in številne sekrecijske granule inzulina).

Sinteza inzulina poteka na zrnatem ER, po sintezi je inzulin aktiven in shranjen v granule, v

katerih čaka na sprostitev. Ena celica beta lahko vsebuje do 10.000 inzulinskih sekretornih

granul (Rorsman in Renström, 2003).


Borgonovo et al. so leta 2006 opisali dva modela biosinteze inzulinskih sekretornih granul, ki

razlagata, kako molekule potujejo v sekretorne granule in kako se ločijo od drugih

sekretornih proteinov. Trenutno velja model prikazan na sliki 6.

Z vnosom glukoze se izboljša stabilnost in translacija proinzulina v mRNA na 5' in 3'-

neprevedenih genskih regijah (angl. untraslated region, UTR), torej glukoza stimulira

novačenje proinzulinske mRNA v endoplazemski retikulum (Borgonovo et al., 2006). Glukoza

vdre v celice skozi transporterje glut2 (Rorsman in Renström, 2003). Stimulacija z glukozo

sproži nukleocitoplazmatsko translacijo polipirimidinskega traktpovezujočega proteina (PTB),

RNA povezujoč protein vsebuje pre-mRNA spajanje, stabilnost mRNA in lokalizacijo ter cap-

samostojno translacijo. Citosolna PTB veže degenerativni motiv bogat s pirimidini na 3'-UTR

ali 5'-UTR mRNA za proinzulin. Tako okrepi signale za stabilnost in translacijo. Če tarčno

odstranimo receptor za inzulin v celicah beta se inzulinska mRNA ne reducira. Alternativni

retrogradni signalni mehanizem vključuje intrinzični membranski protein sekretornih granul

(ICA 512/IA–2), katere citoplazmatski rep vsebuje katalitičen inaktiven protein tirozin

fosfatazno domeno (PTP).

Na eksocitozo sekretornih granul vpliva ICA 512, ki je predhodno vstavljena na plazmalemo

(slika 7). Rezultat ICA 512 citosolnega fragmenta je ciljno usmerjen v jedro, kjer se veže

tirozin fosfatiran STAT 5 in STAT 3, da tako prepreči inaktivacijo transkripcijskih faktorjev.

Tako, preko STAT proteinov ICA 512 regulira transkripcijo svojih genov, kot tudi genov za

inzulin in drugih komponent sekretornih granul (Borgonovo et al., 2006).


Slika 7: Glukozno inducirana biosinteza inzulinskih sekretornih granul v celicah beta trebušne slinavke miši. Glukoza stimulira eksocitozo sekretornih granul (1), medtem spodbudi posttranskripcijsko regulacijo biosinteze (2) z indukcijo nukleocitoplazmatske translokacije PTB, ki poveča stabilnost (2a) in translacijo (2b) mRNA proteinov sekretornih granul. Eksocitoza sekretornih granul je povezana s calpain-1 posredovano cepitvijo ICA 512 in translokacijo, kot rezultat ICA 512 citosolnega fragmenta v jedru, kjer so pospeševalci transkripcije genov sekretornih granul (3). Celice biosintezo prilagajajo glede na odziv na stimulacijo in glede na izčrpanost sekretornih granul. Prirejeno po Borgonovo et al. (2006)

Povišanje ekstracelularne glukoze pomeni vdor glukoze v celice preko že prej omenjenega

glukoznega prenašalca proteina glut1, glut2 in glut3, ki je od inzulina neodvisen prenašalec

glukoze. Pri človeku prevladujeta glut1 in glut3, pri miših pa glut2 (Stožer, 2013). Po vstopu

glukoze v citosol se glukoza fosforilira do glukoza-6-fosfata. Pri reakciji sodeluje glukokinaza

(heksokinaza IV) z nizko afiniteto na glukozo in je ključni encim v procesu glikolize v celicah

beta. Glukoza se presnovi do dveh molekul piruvata, dveh molekul NADH in dveh molekul

ATP (skupaj sedem molekul ATP). Molekule piruvata vstopijo v mitohondrij in poteče

aerobna razgradnja. Začne se z dekarboksilacijo do acetilkoencima A (Ac-CoA) v Krebsov

cikel. Tako iz dveh molekul piruvata nastane skupno osem molekul NADH, dve molekuli

FADH2 in dve molekuli GTP, kar ustreza 25 molekulam ATP. Glikoliza v kombinaciji s

Krebsovim ciklom da skupno 32 molekul ATP na molekulo glukoze (Skelin, 2011; Stožer,

2013).

Celice beta trebušne slinavke miši vsebujejo deset do dvajset različnih proteinskih ionskih

kanalov, dva tipa sta najpomembnejša za iniciacijo sekrecije inzulina: ATP regulirani K+ kanali

(kanal KATP) in napetostno odvisni Ca+ kanal. Obstajajo trije ali štirje različni Ca+ kanali –

najpomembnejši za eksocitozo je L tip Ca+ kanala (Rorsman in Renström, 2003).


Depolarizacija plazmaleme je povezana s povišano citosolno aktivnostjo Ca+, od katere pa je

odvisna sprostitev inzulina v ekstracelularni prostor (Rupnik, 2009). Povišana koncentracija

ATP zmanjša možnost odprtja KATP kanalov. Celična membrana se depolarizira, aktivirajo se

kalcijevi napetostno odvisni kanali (angl. Voltage - dependent calcium channels; VDCC), kar

privede do zvišanja citosolne koncentracije kalcija. Nato se s pomočjo od kalcija odvisnega

sekretornega aparata sproži eksocitoza veziklov inzulina (Rupnik, 2009; Skelin, 2011) – slika

8.

Slika 8: Povezava glukoze in inzulina v celicah beta trebušne slinavke miši. Prirejeno po Rupnik (2009)

Centralni aspekt dinamike inzulinskih sekretornih granul je model regulirane eksocitoze

(Rorsman in Renström, 2003). Eksocitoza je proces, ki poteka v več stopnjah. Glavni cilj tega

procesa je sproščanje vsebine vezikla v ekstracelularni prostor. Poteče lahko popolna fuzija

veziklov, kjer se membrana sekretornih veziklov zlije s plazemsko membrano ali pa pride do

druge oblike imenovane »kiss and run« eksocitoza, pri kateri se membrana veziklov samo

delno zlije s plazmalemo (Skelin, 2011).

Trenutno je sprejet model, ki ga razlaga Skelin v svoji doktorski disertaciji (2011), da najprej

pride do nabora veziklov iz zaloge v citosolu v neposredno bližino plazmaleme. Vezikli, ki so

označeni z membranskima proteinoma sinaptotagminom in sinaptobrevinom (na vezikel

vezan membranski protein imenovan tudi VAMP; angl.: vesicle - associated membrane

proteine) ter s proteinom Rab3, se s pomočjo proteina sinapsina naberejo v neposredni

bližini plazmaleme. Po približanju vezikla se med njim in plazmalemo tvori stik (sidranje

vezikla). Usidrani vezikli gredo nato še skozi različne od ATP in kalcija odvisne stopnje zorenja

(Rorsman in Renström, 2003; Skelin, 2011).


Ko usidrani vezikli dozorijo, pride do stopnje proženja zlivanja in zlitja veziklov s plazmalemo,

kjer sodelujejo receptorji topnega NSF vezavnega faktorja (SNARE proteini; angl.: Soluble

NSF Attachment Protein Receptors). Primarna funkcija proteinov SNARE je sodelovanje pri

procesu zlivanja veziklov s celično membrano, kjer pride do formacije kompleksa SNARE.

Ločimo dve skupini proteinov SNARE, prva so proteini v-SNARE, ki so vezani na membrano

vezikla. Med njimi je tudi že omenjen sinaptobrevin. Druga skupina pa so proteini t-SNARE

in so del plazmaleme, sem spadata sintaksin in SNAP-25. Za regulirano eksocitozo je

prisotnost sintaksina nujna. Kompleks SNARE, ki ga sestavljajo sinaptobrevin na veziklu,

sintaksin in SNAP-25 na plazmalemi, drži obe membrani tesno skupaj (Skelin, 2011) – slika 9A

in 9B.

Slika 9: Pripenjanje sekrecijske granule na membrano in eksocitoza. Prirejeno po Rorsman in Renström (2003)

Kot že omenjeno, povišana koncentracija kalcija v celicah beta aktivira eksocitotski aparat in

sproži eksocitozo veziklov, ki vsebujejo inzulin. Sekrecija inzulinskih veziklov, ko

koncentracijo glukoze hitro zvišamo in vivo in jo tako ohranjamo na stalni vrednosti, bo

potekala v dveh fazah. Prehodni prvi fazi z veliko amplitudo hitrosti izločanja sledi izločanje

inzulina z manjšo hitrostjo, kot med vrhom prve faze in vivo, a tako, da hitrost izločanja med

drugo fazo in vivo postopno narašča. V razmerah in vitro se druga faza pri miši in človeku

razlikuje od razmer in vivo tako, da je hitrost izločanja inzulina v razmerah in vitro v drugi fazi

stalna (Henquin et al, 2006; Skelin, 2011; Stožer, 2013). Za pojasnitev dvofazičnosti odziva pa

obstajata dva teoretična modela. Prvi temelji na dveh različnih populacijah veziklov inzulina,

tako da naj bi se v prvi fazi vezikli izločali v omejenem številu, vnaprej pripravljeni na

eksocitozo. Po drugem modelu pa naj bi dvofazičnost sekrecije bila posledica dvofazičnosti

signalov, ki uravnavajo sekrecijo (Skelin, 2011; Stožer, 2013).

Leta 2003 sta Rorsman in Renström ugotovila, da se sekretorni vezikli celic beta nahajajo v

različnih zalogah. Večina veziklov inzulina (95 - 99 %) spada v zalogo, ki se sprošča počasi

(angl. slowly releasable pool; SRP), to pomeni, da morajo ti vezikli opraviti še serijo reakcij

odvisnih od ATP, Ca+, časa in temperature, za pridobitev kompetence sproščanja inzulinskega

tovora. Drugi del zaloge je hitro dostopna zaloga (angl. ready releasable pool, RRP), ki hrani 1


– 5 % sekrecijskih veziklov, ki so sposobni takojšnje sprostitve in eksocitoze brez modifikacij

po stimulaciji. Velikost RRP je ocenjena na 40 granul, ki lahko takoj eksocitirajo v pri fazi

sekrecije inzulina (Rorsman in Renström, 2003; Skelin, 2011).

1.3.1 Primerjava eksocitoze celic beta z eksocitozo celic alfa in delta

Celice alfa imajo močno električno aktivnost, ki jo znanstveniki pripisujejo aktivnosti KATP

kanalov, katera spodbuja depolarizacijo. Že sama električna aktivnost celic alfa je zadostna za

sprožitev glukagonske sekrecije (Barg et al., 2000). Do eksocitoze pride, ko je v okolju

koncentracija ekstracelularne glukoze nizka (pod 3 mM). Visoka koncentracija

ekstracelularne glukoze inhibira sproščanje glukagona. Postopno zviševanje koncentracije

ekstracelularne glukoze (do 20 mM) inhibira signalizacijo kalcijevih ionov tako, da zapira

čedalje več kanalov KATP, in s tem inaktivira kalcijeve kanale (Gylfe, 2016). Ugotovili so tudi,

da v primerjavi z inzulinsko sekrecijo glukagonska poteče hitreje (Barg et al., 2000). Za

stimulacijo eksocitoze celic alfa skrbijo hormoni inkretini, sem spadata glukagonu podobni

peptid 1 (GLP-1) in glukozno odvisni inzulinotropni peptid (GIP) (Ma et al., 2005). Celice alfa

in beta so kolocirane, tako je v otočku olajšana koordinacija sproščanja inzulina in glukagona

iz otočkov (DiGruccio et al., 2016). Ugotovili so tudi, da v primerjavi z inzulinsko sekrecijo,

glukagonska poteče hitreje (Barg et al., 2000). Povišana koncentracija glukagona spodbuja

sproščanje inzulina iz celic beta (Kawai, 1995). Povišana koncentracija inzulina pa zavre

sproščanje glukagona iz celic alfa (Müller, 1971).

Somatostatin nima direktnega učinka na glukozni metabolizem, vendar je učinkovit parakrini

inhibitor inzulinske in glukagonske sekrecije (Braun et al., 2009; DiGruccio et al., 2016). Pri

odraslih ljudeh je somatostatinska sekrecija stimulirana z glukozo in tolbutamidom. Pri

glodavcih so leta 2009, Braun et al. ugotovili, da je v mišjem Langerhansovem otočku zaradi

periferne lokacije celic delta otežena parakrina regulacija inzulina in glukagona, kar je pri

človeških Langerhansovih otočkih lažje, saj so celice delta razpršene po celotnem otočku

(Braun et al., 2009). Sekrecijo somatostatina aktivira povišana koncentracija kalcija v celici,

tako kot pri celicah alfa in beta. Leta 2016 so DiGruccio et al. po transkriptomski analizi

ugotovili, da imajo celice delta in celice beta podobno mehansko kontrolo glukozno odvisne

eksocitoze. Kot že omenjeno višje koncentracije somatostatina zavirajo sekrecijo glukagona

in inzulina (DiGruccio et al., 2016).

1.3.2 Vpliv grelina in pankreatičnega polipeptida (PP) na okoliške celice

Grelin, ki ga izločajo celice epsilon, močno povečajo glukozno stimulacijo somatostatinske

sekrecije v mišjih otočkih. Grelin direktno inducira celice delta in stimulira kalcijev odziv v

njih. Prav tako grelin deluje na celice beta. Spodbuja proliferacijo celic in preprečuje njihovo

apoptozo (DiGruccio et al., 2016).

Pankreatični polipeptid (PP) izločajo celice PP. PP je vključen v regulacijo sekrecije celic

eksokrinega dela trebušne slinavke (Boel et al., 1984). Sekrecijo PP spodbudi že sam vnos

hrane v prebavni trakt, predvsem vnos maščob. Sekrecija PP ni odvisna od povišane

koncentracije glukoze, tako kot pri ostalih endokrinih celicah. Sekrecijo PP pri človeku

regulirata parasimpatični živčni sistem in pentagastrin (Lonovics et al., 1981). Pentagastrin je


sintetiziran hormon, ki opravlja funkcijo naravnega hormona gastrina, ko ta v telesu ni

prisoten v zadostni koncentraciji. Funkcija gastrina je stimulacija želodca, da izloča kislino, ki

pomaga pri prebavi (WiseGEEK, 2017).

1.4 Eksocitoza acinarnih celic eksokrinega dela trebušne slinavke

Tudi eksokrine celice trebušne slinavke sproščajo vsebino svojih veziklov s procesom

regulirane eksocitoze, kar pomeni tarčno zlivanje membrane sekretornega vezikla s

plazmalemo in naknadno sprostitev vsebine vezikla (Pickett in Edwardson, 2006; Skelin,

2011).

Acinarne celice shranjujejo do 1 µm velike sekretorne vezikle (zimogene granule) ob apikalni

membrani, kjer je domena za sproščanje sekretorne vsebine. Pickett in Edwardson sta leta

2006 navedla, da se eksocitoza zimogenih granul kaže kot večkrat zaporedno spenjanje

granul. Najprej se na plazmalemo pripne ena zimogena granula, ki je tarča za ostale granule,

ki se zaporedno ena za drugo vežejo na njo in se zlijejo v en kompleks. Tako kot pri

endokrinih celicah, pri spenjanju veziklov na plazmalemo sodelujejo proteini SNARE. Zlitje s

plazmalemo se ne zgodi takoj, celica more zagotoviti, da ta kompleks ostane stabilen. K

stabilizaciji pripomorejo aktinski filamenti na apikalni membrani acinusne celice in protein

latrunkulin-A, ki preprečuje polimerizacijo aktina. Ko je tak kompleks stabilen vsaj štiri

minute, pride do zlitja membrane s plazmalemo. Takšnemu načinu eksocitoze pravimo

sestavljena (angl. compound) eksocitoza (Pickett in Edwardson, 2006).

Sekrecijo zimogenih granul stimulirata acetilholin in holecistokinin. Oba spodbujata

sproščanje kalcijevih ionov iz intracelularnih zalog. Povišana koncentracija kalcija spodbudi

spenjanje zimogenih granul in nadaljnjo zlitje membrane s plazmalemo ter sprostitev vsebine

v prebavni trakt (Wäsle in Edwardson, 2002).

Izloček, ki nastane z eksocitozo je zelo gost. Acinarna celica proteinsko gost izloček hidrira

tako, da iz okolice sprejme vodo in elektrolite. Za to ima mehanizem privzema, ki temelji na

skoziceličnem prehodu klorovih ionov. Bazolateralna Na+/K+ ATPaza s svojo aktivnostjo

ustvarja gradient za energijsko ugoden bazolateralen tok natrijevih ionov v celico. S tem

pride do kotransporta klorovih in kalijevih ionov v celico. Klorovi ioni izhajajo apikalno v

acinuse skozi Cl- -kanale. Apikalni prehod klorovih ionov v acinusu povzroči negativni

potencial. Negativni potencial pa povzroča obcelični prehod natrijevih ionov v svetlino

acinusa. Zaradi osmoze prehod natrijevega klorida povzroči prehod vode. Tako hidriran

izloček lažje steče v izvodilo trebušne slinavke (Stožer et al., 2010).

1.5 Eksokrino izločanje celic izvodil trebušne slinavke

Glavna naloga celic izvodil je izločanje tekočine bogate z bikarbonatom. Del bikarbonata

celica izvodil privzame z elektrogenim Na+/HCO3- kotransportom na bazalni membrani. Zaradi

delovanja Na+/K+ ATPaze je tok natrijevih ionov ugoden, kar sklopi privzem bikarbonata v

celico. Bikarbonat delno nastaja tudi v celici med aktivnostjo citosolne karbonske anhidraze.

Izločanje elektrolitov iz celice, torej izločanje klorovih ionov in posledično natrijevih ionov,

povzroča izhajanje bikarbonata skozi klorove kanale iz celice in tako prehod vode v svetlino


zaradi osmoze. Izhajanje bikarbonata pa spodbujata tudi hormon sekretin in parasimpatični

avtonomni živčni sistem (Stožer et al., 2010).

1.6 Primerjalna endokrinologija po sistemu vretenčarjev (Vertebrates)

Funkcija trebušne slinavke je pri vseh skupinah vretenčarjev enaka. Eksokrini del izloča

prebavne encime, ki so v pomoč pri prebavi, endokrini del pa hormone, ki uravnavajo

koncentracijo glukoze v krvi in drugih energetsko bogatih snovi. Čeprav je funkcija žleze

enaka, pa se zgradba endokrinega dela trebušne slinavke zelo razlikuje. Citoarhitekturna

ureditev različnih celičnih tipov endokrinih celic je pomembna zaradi medsebojnih

funkcionalnih povezav, saj sekretorna vsebina vpliva na funkcijo okoliških celic in na

povezave z drugimi sekretornimi celicami (Etayo et al., 2000). Primerjali bomo endokrini del

trebušne slinavke ptic (predstavnica domača kokoš, Gallus domesticus), plazilcev

(predstavniki iz reda želv, Testudines, krokodilov, Crocodilia, luskarjev, Squamata – kuščarji,

Lacertilia in kače, Serpentes), rib iz skupine pravih kostnic, Teleostei (predstavniki iz nadreda

Osteoglossomorpha), dvoživk (predstavnica sekulja, Rana temporaria) in glodavcev

(predstavnici podgana, Rattus sp. in miš, Mus sp.).

1.6.1 Endokrini del trebušne slinavke pri pticah (Aves)

Pri ptičih je trebušna slinavka na desni strani celomske votline. Je režnjat organ, ki leži ob

dvanajstniku (Golob, 2011). Trebušna slinavka domače kokoši (Gallus domesticus) ima 1 - 2

% endokrinega tkiva. Za razliko od sesalcev imajo ptice drugačno razporeditev tako

sekretornih celic kot otočkov v posameznih režnjih žleze (Golob, 2011).

Kokošjo trebušno slinavko delimo na štiri režnje: vranični, dorzalni, ventralni (Ruffier et al.,

1998 in Golob, 2011) in tretji reženj (Ruffier et al., 1998). Razporeditev otočkov znotraj

režnjev je naključna (Golob, 2011). Ruffier et al. (1998) so zapisali, da se v določenih režnjih

pogosteje pojavljajo različni tipi otočkov. Opisali so dva osnovna tipa otočkov in mešani tip.

Osnovna tipa otočkov sta otoček A (Ruffier et al., 1998) ali temni (Golob, 2011) s celicami

alfa, ki izločajo glukagon ter nekaj celicami delta, ki izločajo somatostatin in z nekaj celicami

beta, ki izločajo inzulin (Ruffier et al., 1998). Golob (2011) je ovrednotil delež celic alfa na 72

%, delež celic delta pa na 28 %. Drugi osnovni tip, tip otočka B (Ruffier et al., 1998) ali svetli

otoček (Golob, 2011), je sestavljen iz večjega števila celic beta z manjšim številom celic alfa

in delta (po Golobu (2011); in sicer 86 % celic beta in 14 % celic delta). Tretji tip otočka je

mešani ali sesalčji tip otočka, kjer so celice pomešane, vendar je v primerjavi s celicami alfa

in delta več celic beta. Svetli (tip otočka B) in mešani tip otočkov se nahajajo predvsem v

vraničnem in tretjem režnju. Temni otočki pa se pojavljajo po celotni trebušni slinavki

(Ruffier et al., 1998). Golob (2011) opisuje endokrini del s štirimi tipi sekretornih celic. Opisal

je še celice F, ki izločajo aviarni pankreatični polipeptid. Ti tipi celic so razporejeni posamično

ali kot majhne skupine po celotnem endokrinem delu trebušne slinavke.

1.6.2 Endokrini del trebušne slinavke pri plazilcih (Reptilia)

Plazilci (Reptilia) imajo zelo različno obliko in postavitev trebušne slinavke. V glavnem je

trebušna slinavka ob dvanajstniku in v bližini vranice (slika 10). Takšno postavitev imajo


pretežno želve (Testudines), krokodili (Crocodilia) in kuščarji (Lacertilia). Pri kačah

(Serpentes) pa je Moscona (1990) ugotovil in opisal pet različnih tipov trebušne slinavke.

Opisal jih je glede na strukturo režnjev in kanalov ter glede na prostorsko povezavo z vranico

in žolčnikom.

Slika 10: Skica položaja trebušne slinavke (črno) pri različnih predstavnikih plazilcev : želvi (a), krokodilu (b), kuščarju (c) in kači (d). Prirejeno po Yadav (2008)

V splošnem trebušno slinavko plazilcev (Reptilia) delimo na tri režnje imenovane glava, telo

in vranični reženj (Miller, 1962).

Miller (1962) je endokrini del trebušne slinavke želv (Testudines) opisal kot nepravilne

okrogle strukture, obdane z eksokrinim delom trebušne slinavke. V otočkih so celice alfa in

beta naključno porazdeljene, čeprav so celice beta v skupkih in bolj v sredini otočka. Celice

variirajo po obliki od kubičnih do piramidastih oblik in so primerljive v številu. Langerhansovi

otočki krokodilje (Crocodilia) trebušne slinavke so podaljšani. Skupki celic so nepravilnih

oblik, ki se razširjajo v eksokrini del trebušne slinavke. Eksokrini elementi trebušne slinavke

so ob kapilarah, obdajajo jih ekso-endokrine strukture. Celice beta endokrinega dela so v

sredini otočka in okroglih oblik, celice alfa pa so nepravilnih oblik (Miller, 1962). Rhoten

(1971) je opisal, da so v endokrinem delu trebušne slinavke kuščarjev (Lacertilia) trije tipi

celic: celice A (45 %), celice B (40 %) in celice D (10 - 15 %). Celice B so okrogle, celice A so

podaljšane in številčnejše od celic B. Celice D pa so ovalne ali klinaste oblike. Langerhansovi


otočki so v bližini kapilar in so povezani z eksokrinim tkivom (Rhoten, 1971). V trebušni

slinavki kač (Serpentes) so otočki locirani periferno, so kompaktna masa nepravilne oblike s

pomešanimi celicami alfa in beta. Oblika celic variira od kubičnih do pravokotnih. Celice alfa

in beta si istoštevilčne. Celice alfa so večje od celic beta in imajo gostejšo vsebino (Miller,

1962).

1.6.3 Endokrini del trebušne slinavke pri ribah (prave kostnice, Teleostei)

Prave kostnice (Teleostei) imajo trebušno slinavko ob pilorusu želodca in ob slepem črevesu

in je delno ugreznjena v jetra. Endokrini del trebušne slinavke je sestavljen iz štirih primarnih

tipov celic (celice A izločajo glukagon, celice B izločajo inzulin, celice D izločajo somatostatin

in celice F, ki izločajo peptid iz družine pankreatičnih peptidov). Ugotovljeno je bilo, da

obstajata dva tipa celic D (D1 in DX). Celice A ležijo periferno v Langerhansovem otočku,

nekatere tudi v sredini otočka. Celice B imajo granule z različno molekularno koncentracijo

inzulina, ki je odvisna od količine cinka ob inzulinu. Celic D nimajo vse ribe, število celic D je

odvisno od evolucijskega razvoja rib, nekatere nimajo prisotnih celic D, druge imajo samo en

tip celic D, pri pravih kostnicah pa obstajata prej omenjena dva tipa celic D. Celice D1 so

okrogle oblike z okroglimi granulami, celice DX pa so podaljšane in imajo drugače oblikovano

jedro kot celice D1. Celice F se prav tako nahajajo na periferiji ob celicah A, vendar so granule

veliko manjše kot v celicah A (Al – Mahrouki in Youson, 1999).

1.6.4 Endokrini del trebušne slinavke pri dvoživkah (Amphibians)

Žabja trebušna slinavka je razvejan, nepravilen in sploščen organ. Trebušna slinavka žab leži

med želodcem in dvanajstnikom (Kotpal, 2010). Etayo et al. (2000) so opazili in opisali štiri

različne tipe celic. Celice z inzulinom ali celice B so v centru Langerhansovega otočka ob

krvnih žilicah, so okrogle oblike, sekretorne granule so v skupkih, predstavljajo pa 37 %

endokrinega dela trebušne slinavke. Celice z glukagonom in pankreatičnim peptidom ali

celice A/PP so okrogle oblike s centralnim jedrom, ležijo na periferiji okrog otoških celic v

eksokrinem tkivu, citoplazma je zapolnjena z gosto sekretorno vsebino podolgovatih

sekretornih granul, predstavljajo 49 % endokrine trebušne slinavke. Celice s

stomatostatinom ali celice D so podolgovate do nepravilne polimorfne oblike z velikimi

sekretornimi granulami, nahajajo se v bližini celic A/PP na periferiji Langerhansovega otočka

in predstavljajo 14 % endokrine trebušne slinavke. Zadnji tip celic pa so celice X. Celice so

majhne in okrogle, imajo zelo različne sekretorne granule z neprepoznavno peptidno

vsebino. Celice X najdemo ob krvnih žilicah v stiku s celicami B v središču otočka. Zraven

tipičnih celičnih tipov pa so še mešane celice. To so endo-eksokrine celice z eksokrinimi

organeli, hkrati pa vsebujejo še endokrine sekretorne granule (Etayo et al., 2000).

Pri dvoživkah obstajajo vrstno specifične razlike v endokrinem delu trebušne slinavke. Te

razlike so v lokaciji sekretornih celic v Langerhansovem otočku. Do razlik pa prihaja tudi pri

celicah. Sekulja (Rana temporaria) ima celice A/PP, nekatere druge vrste dvoživk pa imajo

tovrstne celice ločene v celice A in celice PP (Etayo et al., 2000).


1.6.5 Endokrini del trebušne slinavke pri glodavcih (podgana, Rattus sp. in miš,

Mus sp.)

Trebušna slinavka pri podganah je sploščen organ med želodcem in tankim črevesjem

(Biologycorner.com, 2016). Langerhansovi otočki se pri podganah pojavljajo po celotni žlezi,

so pa številčnejši (Prado de Franca Carvalho et al., 2006) in večji (Elayat et al., 1995) v repu

žleze kot v telesu in glavi trebušne slinavke (Prado de Franca Carvalho et al., 2006). Elayat et

al. (1995) so opisali dva tipa Langerhansovih otočkov, ki bi se naj pojavljala tako pri

podganah kot pri človeku. Ta dva tipa sta: 1. otočki bogati z pankreatičnim polipeptidom (PP)

in revni z glukagonom in 2. otočki bogati z glukagonom. Odrasli osebki podgan imajo ovalne

do okrogle Langerhansove otočke s tipično ureditvijo endokrinih celic, ki ležijo v ukrivljeni

liniji ob kapilarnih žilah. Celice beta so v središču otočka (Prado de Franca Carvalho et al.,

2006), celice alfa pa so v skupkih na periferiji otočka (Elayat et al., 1995). Pri podganah

(Rattus sp.), območja s celicami beta trebušne slinavke, v povprečju zajemajo 72 %, ostalo so

druge neinzulinske celice (Prado de Franca Carvalho et al., 2006). Celice delta so prav tako na

periferiji otočka, nekaj pa jih je vmes med celicami beta. Celice PP so posamezne ali v

skupkih na periferiji Langerhansovega otočka (Elayat et al., 1995).

Med glodavce spada tudi miš (Mus sp.), ki je predmet raziskave v tej nalogi. V primerjavi s

podgano imajo miši en tip otočka, ovalne do okrogle oblike v bližini krvne žile in izločalnega

voda. Pojavlja se pet tipov celic: celice alfa, ki izločajo glukagon, celice beta, ki izločajo

inzulin, celice delta, ki izločajo somatostatin, celice PP, ki izločajo pankreatični polipeptid in

celice epsilon, ki izločajo grelin. Celice alfa in delta tvorijo plašč, medtem ko so celice beta v

središču Langerhansovega otočka (Dolenšek et al., 2015).


2 Namen in cilji magistrskega dela

Namen naloge je raziskati:

strukturne značilnosti endokrinega in eksokrinega dela trebušne slinavke miši;

topološki odnos med tipi endokrinih celic oziroma razporejenost različnih tipov celic

v otočku;

morfologijo in velikost granul v različnih tipih celic;

polariziranost celic.

Cilj naloge je kvantitativno oceniti:

najdaljše premere Langerhansovih otočkov v različnih delih trebušne slinavke;

najdaljše premere glukagonskih veziklov in granul znotraj otočka v različnih delih

trebušne slinavke;

najdaljše premere inzulinskih veziklov in granul znotraj otočka v različnih delih

trebušne slinavke;

najdaljše in najkrajše premere somatostatinskih granul znotraj otočka v različnih delih

trebušne slinavke;

deleže različnih tipov endokrinih granul na izbrani površini 10 µm2 citosola brez

ostalih organelov znotraj otočka v različni delih trebušne slinavke;

najdaljše premere zimogenih granul acinusa v različnih delih trebušne slinavke;

delež zimogenih granul acinusa na izbrani površini 10 µm2 citosola brez ostalih

organelov v različnih delih trebušne slinavke.

Delovne hipoteze:

Velikosti Langerhansovih otočkov niso enake v različnih strukturnih delih trebušne

slinavke;

Velikosti glukagonskih veziklov in granul niso enake v različnih strukturnih delih

trebušne slinavke;

Velikosti inzulinskih veziklov in granul niso enake v različnih strukturnih delih

trebušne slinavke;

Velikosti somatostatinskih granul niso enake v različnih strukturnih delih trebušne

slinavke;

Deleži endokrinih granul v različnih tipih endokrinih celic niso enaki v različnih

strukturnih delih trebušne slinavke;

Velikosti zimogenih granul acinusa niso enake v različnih strukturnih delih trebušne

slinavke;

Deleži zimogenih granul acinusa niso enaki v različnih strukturnih delih trebušne

slinavke;

Med različnimi deli trebušne slinavke se ne pojavljajo strukturne razlike.


3 Material in metode Osnovni material magistrskega dela je trebušna slinavka miši (Mus musculus). Žrtvovanim

živalim smo laparotomsko vstopili v trebušno votlino, na kar smo retrogradno skozi duktalni

vod v trebušno slinavko vbrizgali tekočo in segreto 1,9 % agarozo z nizkim tališčem. Po

vbrizganju smo organ ohladili z ledeno hladno zunajcelično raztopino. Nato smo trebušno

slinavko in agarozo previdno odstranili iz trebušne votline in izprali z ledeno hladno

zunajcelično raztopino. Organ je bil razdeljen na tri osnovne dele trebušne slinavke:

duodenalni, splenični in gastrični reženj. Vsak del je bil ustrezno pripravljen za pripravo

histoloških preparatov.

Tkivo je bilo ustrezno fiksirano, izprano, postfiksirano, dehidrirano in preneseno v intermedij

in epoksidno smolo. Histološke preparate smo nato narezali na poltanke in ultratanke tkivne

rezine. Poltanke tkivne rezine smo obarvali s toluidinskim modrilom, prekrili tkivne rezine s

krovnim stekelcem in pregledali s svetlobnim mikroskopom. Za transmisijsko elektronsko

mikroskopijo smo pripravili ultratanke tkivne rezine, ki smo jih kontrastirali s svinčevim

acetatom in uranil citratom ter jih analizirali s transmisijskim elektronskim mikroskopom.

3.1 Žrtvovanje živali

Tkivne rezine so iz trebušnih slinavk pet mesecev starih C57BL/6 miši obeh spolov. Po

usmrtitvi smo z laparotomijo vstopili v trebušno votlino in injicirali 1,9 % agarozo z nizkim

tališčem (Lonza Rockland Inc., Rockland, Maine, ZDA), ki smo jo raztopili v zunajcelični

raztopini (vsebuje v mM, 125 NaCl, 26 NaHCO3, 6 glukoza, 6 laktozna kislina, 3 mioinozol, 2,5

KCl, 2 Na-piruvat, 2 CaCl2, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 0,5 askorbinska kislina) na temperaturi 40ᵒ

C retrogradno skozi duktalni vod. Po injiciranju glukoze smo trebušno slinavko ohladili z

ledeno hladno zunajcelično raztopino. Nato smo ohlajeno trebušno slinavko in agarozo

odstranili iz trebušne votline in ju nežno sprali z ledeno hladno zunajcelično raztopino

(Stožer et al., 2013, Skelin Klemen et al., 2014).

3.2 Priprava histoloških preparatov

Vzorce smo pripravili iz treh delov trebušne slinavke. Način priprave tkiva in ustrezne

kemikalije za izdelavo tkivnih rezin po Glauertu (1987) so prikazani v tabeli 2.


Tabela 2: Način priprave tkiva za histološki pregled po Glauertu (1987)

Dan Stopnja Kemikalije Čas (ura) Temperatura

1.

FIKSACIJA

2,45% PA 2,45% GA v 0,1 M kakodilatnem pufru

3

sobna temperatura

2,45% PA 2,45 GA v 0,1 M kakodilatnem pufru

12

4 ᵒC

2.

IZPIRANJE 0,1 M kakodilatni pufer 2

sobna temperatura

POSTFIKSACIJA OsO4 2

sobna temperatura

IZPIRANJE 0,1 M kakodilatni pufer 0,1 M kakodilatni pufer

1 12

sobna temperatura 4 ᵒC

3.

DEHIDRACIJA

50 % etanol 60% etanol 70% etanol 80% etanol 96% etanol

vsaka koncentracija 0,5

sobna temperatura

INTERMEDIJ

propilenoksid propilenoksid: TAAB = 1:1 propilenoksid: TAAB = 1:2

2 x 0,5 1 12

sobna temperatura sobna temperatura 4 ᵒC

4.

KONČNI MEDIJ

TAAB TAAB TAAB

1 1 72

48 ᵒC 48 ᵒC 60 ᵒC

Odvzeto tkivo je treba takoj fiksirati, saj s tem preprečimo postmortalne procese, delovanje

hidrolitskih encimov, morfološke spremembe in bakterijski razkroj tkiva (Burck, 1982). Nato

tkivo izpiramo, da odstranimo odvečen fiksativ. V stopnji dehidracije z etanolom tkivu

odvzamemo vodo. Tkivo se nato prepoji z zmesjo propilenoksida in epoksidne smole (1:1,

nato 1:3). Epoksidna smola je bila pripravljena iz desetih delov smole TAAB, devetih delov

trdilca DDSA (anhidrid 2-dodecenil-jantarjeva kislina), enega dela trdilca MNA (anhidrid

metil-norborena 2,3-fenol) in 0,4 dela pospeševalca DMP 30 (2,4,6-tri-dimetilaminofenil-

fenol). Po končanem postopku je tkivo pripravljeno za rezanje.

3.3 Rezanje in barvanje tkiva za svetlobno mikroskopijo

Za svetlobno mikroskopijo smo pripravili poltanke tkivne rezine na Medicinski fakulteti,

Univerze v Mariboru, v Laboratoriju za biologijo celice. Pred začetkom rezanja vzorcev smo

odvečno epoksidno smolo obrusili (Leica EM TRIM2, Nemčija). Tako pripravljene vzorce smo

nato rezali s steklenim nožkom na ultramikrotomu (Leica EM UC7 RT, Nemčija), debeline 500

nm. Poltanke tkivne rezine smo s stekleno palčko polovili in prenesli na kapljico destilirane

vode na objektnem steklu, počakali, da se je kapljica z vzorcem posušila in obarvali s

toulidinskim modrilom (0,5 % raztopina toulidinskega modrila v destilirani vodi). Vzorec z

barvilom smo segrevali na grelni plošči (Medite OTS 40, Nemčija) pri 80 ᵒC. Ko se je barvilo


ob robovih začelo sušiti in je bil viden temno srebrnkast rob, smo stekelce sprali z destilirano

vodo in ponovno posušili na grelni plošči. Sveže poltanke tkivne rezine smo nato pregledali s

svetlobnim mikroskopom (Nikon Eclipse Ci-L, Japonska) pri 400x povečavi.

Langerhansove otočke v poltankih tkivnih rezinah smo ponovno poiskali s svetlobnim

mikroskopom Nikon Eclipse E800 pri 400x in 600x povečavi v Laboratoriju za mikroskopijo na

Fakulteti za naravoslovje in matematiko, Univerze v Mariboru in fotografirali s kamero Nikon

DN100, pred tem pa smo poltanke tkivne rezine zaščitili s kanadskim balzamom in prekrili s

krovnim stekelcem.

3.4 Rezanje in barvanje tkiva za transmisijsko elektronsko mikroskopijo

Ultratanke tkivne rezine (75 nm) smo narezali z diamantnim nožkom, jih prenesli na bakrene

mrežice in jih kontrastirali s 3 M uranil acetonom (20 minut pri sobni temperaturi) in z 0,08

M svinčevim citratom (20 sekund pri sobni temperaturi).

Ultratanke tkivne rezine smo analizirali s pomočjo transmisijskega elektronskega mikroskopa

Zeiss EM 902 v Laboratoriju za biologijo celice, histologijo in embriologijo na Medicinski

Univerzi v Gradcu. Ultratanke tkivne rezine smo fotografirali na 3000x, 4400x, 7000x in

12000x povečavi.

3.5 Analiza fotografij

Fotografije, ki smo jih pridobili s svetlobno mikroskopijo in transmisijsko elektronsko

mikroskopijo, smo analizirali s programom pyCellCounter (Selčan, 2016). S fotografij

svetlobne mikroskopije pri 400x povečavi smo izmerili velikosti Langerhansovih otočkov v

različnih delih trebušne slinavke miši (slika 11).

Slika 11: Merjenje premera Langerhansovega otočka v programu pyCellCouneter


Izmerili smo premere glukagonskih in inzulinskih granul in veziklov. Pri celicah delta smo

izmerili najdaljši in najkrajši del somatostatinskih granul tako, kot je opisano v delu Lipovšek

et al. (2013). Premere smo merili na fotografijah s 12000x povečavo zaradi lažje določitve

roba granule in vezikla. Premere granul acinusa eksokrinega dela trebušne slinavke smo

merili pri različnih povečavah, uporabili smo predvsem fotografije s 7000x povečavo,

nekatere tudi s 4400x povečavo.

Površino endokrinih in eksokrinih granul smo prav tako analizirali s programom

pyCellCouner, ki vsebuje program pyCellAnalyser, ki omogoča merjenje površin. Vse površine

endokrinih granul smo merili na fotografijah s 12000x povečavo, površine granul eksokrinega

dela trebušne slinavke pa smo merili na fotografijah pri 7000x povečavi. Program omogoča

izračun površine celotne fotografije glede na merilo, v katerem je posneta fotografija.

Površino označenih granul poda glede na piksle fotografije. Sam program zazna večino

granul (Automate), manjkajoče granule pa smo ročno narisali s tipko Draw. Vsi podatki se

izpišejo na zaslonu programa, kot je prikazano na spodnji sliki.

Slika 12: Merjenje ploščin granul v programu pyCellAnalyser

3.6 Statistična obdelava podatkov

Podatke, ki smo jih pridobili s programom PyCellCounter, smo sproti zbirali v programu

Microsoft Excel 2010. Po predhodnem pregledu pridobljenih podatkov smo ugotovili, da v

primeru velikosti Langerhansovih otočkov nismo dobili zadostnega števila vzorcev za

parametrično statistično obdelavo. V ta namen smo podatke obdelali v dveh ločenih sklopih.


Podatke o velikosti Langerhansovih otočkov smo statistično obdelali z uporabo programa R.

Določili smo minimum, maksimum, mediano in meje interkvartilnega razmika (IQR) velikosti

Langerhansovih otočkov v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne slinavke.

Nato smo z uporabo analize variance po metodi Kruskal–Wallis ter post hoc testiranja s

testom Mann–Whitney U med seboj primerjali posamezne podatke.

Na preostalih podatkih smo opravili statistično analizo s programom STATISTICA. Zbrane

podatke smo preverili s testom normalnosti. Razporeditev podatkov je bila normalna, zato

smo nadaljevali z opisno statistiko. Določili smo minimum, maksimum, povprečje in

standardno deviacijo za posamezne granule v duodenalnem, spleničnem, gastričnem in

eksokrinem delu trebušne slinavke. Nato smo z analizo variance (ANOVA) primerjali

posamezne podatke med seboj. Z uporabo F-testa smo naredili post hoc primerjavo parov

podatkov.

Površino posameznih granul, ki smo jih pridobili s programom PyCellAnalyser, smo zbrali v

programu Microsoft Excel 2010 in izračunali posamezne deleže granul celice alfa, celice beta,

celice delta in zimogenih granul acinusa na izbrano površino.


4 Rezultati

4.1 Strukturne značilnosti trebušne slinavke

Po pregledu poltankih tkivnih rezin smo v duodenalnem delu trebušne slinavke našli osem

Langerhansovih otočkov, šest otočkov v spleničnem delu in osem otočkov v gastričnem delu

trebušne slinavke miši. Oblika otočkov v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu

trebušne slinavke miši je bila primerljiva. Otočki so bili ovalne do okrogle oblike, v bližini

krvne žile in izločalnega voda.

4.1.1 Velikost Langerhansovih otočkov

Za določitev velikosti Langerhansovih otočkov smo skupno izmerili 22 otočkov. Mediana

najdaljših premerov Langerhansovih otočkov je znašala 95,8 (IQR 72,6 – 104,2) µm v

duodenalnem delu trebušne slinavke, otočki v spleničnem delu so merili 61,3 (IQR 53,2 –

73,4) µm in otočki v gastričnem delu trebušne slinavke so merili 80,5 (IQR 63,6 – 100,9) µm.

Na sliki 13 so prikazani Langerhansovi otočki iz duodenalnega, spleničnega in gastričnega

dela trebušne slinavke miši. Na podlagi pridobljenih podatkov nismo odkrili statistično

pomembnih razlik med velikostmi otočkov v različnih delih trebušne slinavke.


Slika 13: Langerhansovi otočki (LO) v duodenalnem (a,b), spleničnem (c, d) in gastričnem (e, f) delu trebušne slinavke miši. AC – acinus eksokrinega dela, D – izločalni vod, KŽ – krvna žila.

Tabela 3: Mediana, interkvartilni razmik (IQR), minimum in maksimum velikosti (v μm) Langerhansovih otočkov.

mediana (IQR) (min – max)

duodenalni del splenični del gastrični del

velikost Langerhansovega

otočka

95,8 (IQR 72,6 –

104,2) (56,9 – 132,3)

61,3 (IQR 53,2 –

73,4) (41,0 – 87,5)

80,5 (IQR 63,6 –

100,9) (40,8 – 134,4)


Tabela 4: Analiza variance velikosti Langerhansovih otočkov duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke

Skupen Kruskal-Wallis test: p vrednost = 0,1251

Mann-Whitney U test [p vrednosti]


duodenalni del

splenični del 0,0452

gastrični del 0,5632 0,2284

Slika 14: Velikosti Langerhansovih otočkov v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne slinavke miši

4.2 Granule v endokrinih in eksokrinih celicah duodenalnega, spleničnega

in gastričnega dela trebušne slinavke miši

Po pregledu ultratankih tkivnih rezin s transmisijskim elektronskim mikroskopom smo celice

alfa in celice delta našli ob robu otočka, celice beta pa so bile v središču. V vseh tipih celic je

bilo jedro na sredini celice. Okrog jedra smo opazili zrnati endoplazemski retikulum (RER).

Granule so bile naključno razporejene po površini celotne celice, vmes pa so bili Golgijevi

aparati in mitohondriji. Opazili smo tudi, da so inzulinske granule v celicah beta veliko večje

kot glukagonske granule v celicah alfa in somatostatinske granule v celicah delta.

Somatostatinske granule so med vsemi granulami najmanjše in vidno variirajo v obliki, so

okrogle, ovalne do trikotne oblike. Glukagonske in inzulinske granule so okrogle oblike.

Istovrstne granule imajo podoben izgled v različnih delih trebušne slinavke miši. V celicah

alfa smo opazili več mitohondrijev, kot v ostalih dveh tipih celic.

Izmerili smo premere 350 granul za vsak tip endokrinih in eksokrinih granul v različnih

strukturnih delih trebušne slinavke. Pregledali smo 10 – 20 endokrinih celic enega


Langerhansovega otočka iz vsakega dela trebušne slinavke. Prav tako smo pregledali 10 – 20

vidnih polj/lobulov eksokrinega dela v vseh treh različnih delih trebušne slinavke na 3000x

povečavi.

Slika 15: Ultratanka tkivna rezina duodenalnega dela trebušne slinavke miši. CA – celica alfa, CB – celica beta, CD – celica delta, ET – eksokrino tkivo, N – jedro, RER – zrnati ER, M - mitohondrij. Merilo: 2 µm.

Slika 16: Ultratanka tkivna rezina celice alfa (a), celice beta (b) in celice delta (c) duodenalnega dela trebušne slinavke miši. G- glukagonska granula, I- inzulinska granula, M- mitohondrij, S- somatostatinska granula, RER – zrnati ER, N – jedro, CD – celica delta, CA – celica alfa. Merilo: 0,5 µm.


Slika 17: Ultratanka tkivna rezina spleničnega dela trebušne slinavke miši. CA – celica alfa, CB – celica beta, CD – celica delta, N – jedro, M – mitohondrij, RER – zrnati ER. Merilo: 2 µm.

Slika 18: Ultratanka tkivna rezina celice alfa (a), celice beta (b) in celice delta (c) spleničnega dela trebušne slinavke miši. CA- celica alfa, CD – celica delta, G- glukagonska granula, I- inzulinska granula, M- mitohondrij, S- somatostatinska granula, N - jedro. Merilo: 0,5 µm.


Slika 19: Ultratanka tkivna rezina gastričnega dela trebušne slinavke miši. CA – celica alfa, CB – celica beta, CD – celica delta, N – jedro, RER – zrnati ER, KŽ – krvna žila. Merilo: 2 µm.

Slika 20: Ultratanka tkivna rezina celice alfa (a), celice beta (b) in celice delta (c) gastričnega dela trebušne slinavke miši. G- glukagonska granula, M- mitohondrij, I- inzulinska granula, CA – celica alfa, CD – celica delta, S- somatostatinska granula. Merilo: 0,5 µm.

4.2.1 Glukagonske granule

Premeri glukagonskih granul in glukagonskih veziklov v različnih delih trebušne slinavke so

prikazani v tabelah 3, 4 in 5 ter na slikah 20 in 21. V duodenalnem delu glukagonske granule

merijo 152 ± 29 nm, v spleničnem delu 196 ± 42 nm in v gastričnem 185 ± 41 nm. Premeri


granul se v vseh delih trebušne slinavke statistično razlikujejo. Premeri glukagonskih veziklov

v duodenalnem delu trebušne slinavke miši merijo 231 ± 47 nm, premeri veziklov v

spleničnem delu so 269 ± 49 nm in v gastričnem delu merijo 251 ± 51 nm. Premeri se v vseh

treh delih trebušne slinavke statistično razlikujejo. Tabela 5: Povprečje, standardna deviacija, minimum in maksimum premerov (v nm) glukagonskih granul in veziklov.

povprečje ± StDev (min – max)

Duodenalni del Splenični del Gastrični del

granula

152 ± 29 (84 – 246)

196 ± 42 (100 – 308)

185 ± 41 (83 – 308)

vezikel

231 ± 47 (135 – 455)

269 ± 49 (152 – 413)

251 ± 51 (139 – 501)

Tabela 6: Analiza variance glukagonskih granul duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke

Fisherjev LSD test [p vrednosti]


duodenalni del

splenični del < 0,0001

gastrični del < 0,0001 0,0002

Slika 21: Premeri glukagonskih granul v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne slinavke miši.


Tabela 7: Analiza variance glukagonskih vezikolov duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke



duodenalni del


gastrični del < 0,0001 0,000003

Slika 22: Premeri glukagonskih veziklov v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne slinavke miši.

4.2.2 Inzulinske granule

Premeri inzulinskih granul in inzulinskih veziklov v različnih delih trebušne slinavke so

prikazani v tabeli 6, 7 in 8 ter na slikah 22 in 23. V duodenalnem delu inzulinske granule

merijo 158 ± 28 nm, v spleničnem delu 194 ± 37 nm in v gastričnem 189 ± 40 nm. Premeri

granul se v vseh delih trebušne slinavke statistično razlikujejo. Premeri inzulinskih veziklov v

duodenalnem delu trebušne slinavke miši merijo 294 ± 71 nm, premeri veziklov v spleničnem

delu so 351 ± 70 nm in v gastričnem delu merijo 336 ± 72 nm. Premeri se v vseh treh delih

trebušne slinavke statistično razlikujejo.


Tabela 8: Povprečje, standardna deviacija, minimum, maksimum premera inzulinskih granul in inzulinskih veziklov v treh delih trebušne slinavke miši.



granula

158 ± 28 (85 – 235)

194 ± 37 (109 – 326)

189 ± 40 (94 – 326)

vezikel

294 ± 71 (140 – 520)

351 ± 70 (191 – 647)

336 ± 72 (162 – 625)

Tabela 9: Analiza variance inzulinskih granul duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke



duodenalni del



Slika 23: Premer inzulinskih granul v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne slinavke miši

Tabela 10: Analiza variance inzulinskih veziklov duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke



duodenalni del




Slika 24: Premeri inzulinskih veziklov v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne slinavke miši

4.2.3 Somatostatinske granule

Premeri najdaljših in najkrajših premerov somatostatinskih granul v različnih delih trebušne

slinavke so prikazani v tabelah 9, 10 in 11 ter na slikah 24 in 25. Somatostatinske granule v

duodenalnem delu merijo na najkrajšem delu 130 ± 28 nm in najdaljšem delu 205 ± 48 nm. V

spleničnem delu najkrajši deli granul merijo 141 ± 29 nm in najdaljši deli 203 ± 40 nm. V

gastričnem delu najkrajši deli merijo 117 ± 30 nm in najdaljši deli 163 ± 39 nm. Premeri

granul se v vseh delih trebušne slinavke statistično razlikujejo, razen pri najdaljših delih

somatostatinskih granul se duodenalni in splenični del ne razlikujeta.

Tabela 11: Povprečje, standardna deviacija, minimum, maksimum premera inzulinskih granul in inzulinskih veziklov v treh delih trebušne slinavke miši.



najkrajši del

130 ± 28 (95– 225)

141 ± 29 (62 – 227)

117 ± 30 (46 – 225)

najdaljši del

205 ± 48 (109 – 368)

203 ± 40 (107 – 375)

163 ± 39 (89 – 315)


Tabela 12: Analiza variance najdaljšega dela somatostatinskih granul duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke



duodenalni del

splenični del 0,4563

gastrični del 0,00 < 0,0001

Slika 25: Dolžina najdaljšega dela somatostatinske granule v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne slinavke miši.

Tabela 13: Analiza variance najkrajšega dela somatostatinskih granul duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke



duodenalni del


gastrični del < 0,0001 < 0,0001


Slika 26: Dolžina najkrajšega dela somatostatinske granule v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne slinavke miši.

4.3 Granule eksokrinega dela trebušne slinavke

Premeri zimogenih granul v različnih delih trebušne slinavke so prikazani v tabeli 12 in 13 ter

na sliki 27. V duodenalnem delu zimogene granule merijo 623 ± 149 nm, v spleničnem delu

723 ± 223 nm in v gastričnem 581 ± 130 nm. Premeri granul se v vseh delih trebušne slinavke

statistično razlikujejo.


Slika 27: Ultratanka rezina eksokrinega dela trebušne slinavke miši. Gr – granula acinusa, N – jedro, RER – zrnati endoplazemski retikulum. Merilo: 1 µm.

Tabela 14: Povprečje, standardna deviacija, minimum, maksimum zimogenih granul v treh delih trebušne slinavke miši.



zimogene granule

623 ± 149 (298– 1051)

723 ± 223 (262 – 1648)

581 ± 130 (268 – 994)

Tabela 15: Analiza variance zimogenih granul duodenalnega, spleničnega in gastričnega dela trebušne slinavke



duodenalni del


gastrični del 0,0014 < 0,0001


Slika 28: Premer granul acinusa v duodenalnem, spleničnem in gastričnem delu trebušne slinavke miši.

4.4 Površine granul endokrinih in eksokrinih celic

Površine različnih endokrinih in eksokrinih granul smo podali v odstotkih granul na izbrani

površini 10 µm2 citosola, brez organelov. V duodenalnem delu trebušne slinavke je 18 %

glukagonskih granul, 14 % inzulinskih granul, 30 % somatostatinskih granul. V spleničnem

delu: 25 % glukagonskih granul, 12 % inzulinskih granul, 30 % somatostatinskih granul.

Gastrični del trebušne slinavke ima 21 % glukagonskih granul, 16 % inzulinskih granul, 19 %

somatostatinskih granul.

Površina zimogenih granul v duodenalnem delu znaša 42 %, v spleničnem delu je acinusnih

granul 48 %. Gastrični del pa ima 45 % granul eksokrinega dela trebušne slinavke miši.

Tabela 16: Deleži endokrinih in eksokrinih granul na 10 µm

2 tkiva

PLOŠČINA GRANUL [%] (merjeno na 10 µm2)


glukagonske granule 18 25 21

inzulinske granule 14 12 16

somatostatinske granule

30 30 19

zimogene granule 42 48 45


5 Razprava

5.1 Strukturne značilnosti trebušne slinavke

Trebušna slinavka miši je razdeljena na tri strukturne dele: duodenalni, splenični in gastrični

del. Vsi omenjeni deli trebušne slinavke so po strukturi tkiva primerljivi z opisanimi deli

trebušne slinavke drugih raziskav (Dolenšek et al., 2015). Zanimali so nas najdaljši premeri

Langerhansovih otočkov, premeri granul in veziklov celic alfa, celic beta, celic delta in

acinusnih granul. Prav tako nas je zanimala površina granul celic alfa, celic beta, celic delta in

acinusnih granul na izbrano površino citosola brez ostalih organelov.

V vseh delih trebušne slinavke smo našli Langerhansove otočke okroglih in ovalnih oblik,

obdane z eksokrinim tkivom. Ugotovili smo, da so najdaljši premeri otočkov v različnih delih

trebušne slinavke med 60 µm in 100 µm. V uporabljeni literaturi nismo zasledili opisa

velikosti Langerhansovih otočkov v različnih delih trebušne slinavke miši ali glodavcev. Lahko

pa potrdimo, da so rezultati skladni s podatki drugih raziskovalcev, če se ne oziramo na

posamezni anatomski del trebušne slinavke (tabela 17). Analiza variance ni pokazala

statistične razlike med velikostjo otočkov v treh različnih delih trebušne slinavke.

Tabela 17: Pregled rezultatov velikosti Langerhansovih otočkov drugih raziskovalcev

Avtor Revija Leto Material Velikost Langerhansovega

otočka (µm)

Reaven et al. Journal of clinical Investigation

1979 podgana 145 – 609

Liu et al. American Journal of Phsiology – Endocrinology

and Metabolism

2004

divji tip miši

84,5 ± 11,5

Morini et al. Journal of Anatomy

2006 podgana 153,02 ± 58,51

Kim et al. Islets 2009 divji tip miši 116 ± 80

Nam et al. Biomed Microdevices

2010 glodavci 100 – 200

Kilimnik et al. Plos One 2011 miš 50 - 250

5.2 Granule v endokrnih in eksokrinih celicah duodenalnega, spleničnega

in gastričnega dela trebušne slinavke miši

V otočkih smo ob robu našli celice alfa in delta, celice beta so bile v sredini otočka, tako

arhitekturo Langerhansovih otočkov opisujejo tudi Kim et al. (2009) in Dolenšek et al. (2015).

Kim et al. (2009) navajajo tudi, da lahko pride do razlik v arhitekturi otočka, ko pride do


fizioloških ali patoloških sprememb v telesu osebka. V pregledanih tkivnih vzorcih razlik v

arhitekturi otočkov nismo opazili.

Jedro endokrinih in eksokrinih celic se je nahajalo v sredini celice, obdajal ga je zrnati ER. Po

celotni površini citosola so bili naključno razporejeni endokrini vezikli oziroma zimogene

granule, med njimi pa so se nahajali Golgijevi aparati in mitohondriji. Oblika granul

omenjenih veziklov je enaka obliki granul, opisanih v predhodnih raziskavah (Ekholm et al.,

1962; Lipovšek et al, 2013). Granule celic alfa in beta so okrogle oblike, granule celic delta po

obliki variirajo. Inzulinske granule so večje od glukagonskih in somatostatinskih granul, ki so

med granulami najmanjše. Ekholm et al. so leta 1962 zimogene granule opisali kot ovalne

oblike, katerih velikost proti robu acinusa narašča. Statistična analiza variance je pokazala, da

so si glukagonski vezikli in granule, inzulinski vezikli in granule ter zimogene granule acinusa

različne. Razlike nismo mogli potrditi pri najdaljših premerih somatostatinskih granul.

Najdaljši premeri somatostatinskih granul v duodenalnem in spleničnem delu trebušne

slinavke, ne kažejo statistične razlike, v primerjavi z najdaljšimi premeri somatostatinskih

granul v gastričnem delu trebušne slinavke. Najkrajši premeri somatostatinskih granul se v

različnih strukturnih delih trebušne slinavke med seboj statistično razlikujejo.

Opazili smo, da so endokrini vezikli in granule ter zimogene granule v spleničnem delu

trebušne slinavke miši večje kot v duodenalnem in gastričnem delu. Anatomsko je splenični

reženj največji in zavzema več kot polovico celotne trebušne slinavke miši in morda je to v

zvezi z razvojem večjih celic z večjimi vezikli in granulami v primerjavi z ostalima režnjema.

Tabela 18: Pregled rezultatov velikosti endokrinih in eksokrinih granul naše raziskave in drugih raziskovalcev

Avtor Revija Leto Material Tip granul Velikost granul (nm)

Ekholm et al.

Journal of Ultrastructure

research

1962 podgana zimogene granule cca. 3000

Leiter et al.

Diabetologia 1979 C57BL/Ks miš somatostatinske granule

160 – 450

Barg et al.

Diabetologia 2000 NMRI miši glukagonske granule

274 ± 14

Pende et al.

Nature 2000 miš z manjkajočim S6K1 genom

inzulinske granule 214,5 ± 0,8

Olofsson

et al.

Pflügers Archiv European Journal of

Physiology

2002

NMRI miš

inzulinske granule

357 ± 11



Göpel et al.

Journal of Physiology

2004

NMRI miši

glukagonske granule 236 ± 70

inzulinske granule 305 ± 10

najdaljši premer somatostatinske

granule

216 ± 16

najkrajši premer somatostatinske

granule

124 ± 10

Noske et al.

Journal of structural biology

2008 miš inzulinske granule 280 ± 8

Huang et

al.

Diabetes

2013

GYY miši


Lipovšek et al.

General and comparative

Endocrinology

2013

Rab3a miš

glukagonski vezikli 236 ± 30


inzulinski vezikli 235 ± 43


najdaljši premer somatostatinskih

granul

212 ± 31

najkrajši premer somatostatinskih

granul

174 ± 29

Pfeifer et al.

Journal of structural biology

2015

DKO miši

glukagonski vezikli

300 ± 50


inzulinski vezikli 410 ± 97


Brereton et al.

Journal of Histochemistry and

Cytochemistry

2015 βV59M miši

somatostatinske granule

Veliko manjše in podaljšane od človeških (250

nm)



Sever - to magistrsko delo

/

2017

C57BL/6

glukagonski vezikli 250 - 270

glukagonske granule 150 - 200

inzulinski vezikli 290 - 350

inzulinske granule 150 - 200

najdaljši premer somatostatinske granule

160 - 210

najkrajši premer somatostatinske granule

120 - 140

zimogene granule 580 - 730

Glede na rezultate ostalih avtorjev, navedenih v zgornji tabeli, so naši rezultati v primerjavi z

njihovimi, skladni. Prihaja pa do manjših razlik, predvsem zato, ker so za raziskave uporabili

miši, ki so imele drugačno gensko osnovo kot C57BL/6 miši. Predvidevamo, da je vzrok

velikostnih razlik ugotovljenih iz rezultatov različnih raziskav posledica hormonskih potreb za

uravnavanje glukozne homeostaze.

Motivacija za prihodnje raziskave: Zanimivo bi bilo preučiti razlike na večjem vzorcu.

Uporabili bi več miši, tako pridobili več Langerhansovih otočkov, pregledali velikosti celic v

otočkih, premerili več endokrinih veziklov in granul, premerili več eksokrinih granul in zraven

še preučili velikostne razlike spremljajočih organelov (zrnatega ER, Golgijevih aparatov in

mitohondrijev).

5.3 Površine granul endokrinih in eksokrinih celic

Površino glukagonskih granul sta obravnavala Barg et al. (2000) in Huang et al. (2013). Ker v

omenjenih raziskavah niso bili podani deleži glukagonskih granul, smo le-te ustrezno

preračunali. Iz raziskave Barg et al. (2000) smo povzeli podatka za premer glukagonske

granule (0,274 µm) in število granul na prostorninsko enoto (9,3 granule/µm3 ). Tako smo po

enačbi volumna krogle izračunali delež glukagonskih granul, ki znaša 10 %. Iz raziskave Huang

et al. (2013) smo povzeli podatka za premer glukagonske granule (195 nm) in število granul

na površinsko enoto (3,0 ± 0,3 granule/µm2). Tako smo z enačbo za površino kroga izračunali

delež, ki znaša 9 %.

Rezultati naše raziskave so pokazali, da glukagonske granule zavzamejo 18 – 25 % na izbrano

površino 10 µm2 citosola brez ostalih organelov. To razliko v deležih pripisujemo načinu

analize. Rezultate smo podali kot izmerjeno površino na fotografijah, kjer so bile glukagonske

granule strjene. Medtem ko so Barg et al. (2000) in Huang et al. (2013) podali rezultate o

velikosti in številu glukagonskih granul na celotno površino oziroma prostornino celice alfa.

Pende et al., so leta 2000 ocenili površino inzulinskih granul na 15,4 ± 1,8 %. Leta 2012 so

Fava et al. ocenili, da je na citosolno površino brez organelov 11,7 ± 5,3 % inzulinskih granul.

Tudi rezultati naše raziskave kažejo, da je 12 – 16 % inzulinskih granul v citosolu brez

organelov, kar je v skladu s primerjalnima raziskavama.


O karakterizaciji somatostatinskih granul smo zasledili samo raziskavi Göpel et al. (2000) in

Göpel et al. (2004). V obeh raziskavah nismo našli ustreznega podatka, ki bi nam omogočil, z

izračuni, oceniti delež somatostatinskih granul na površinsko enoto. Ugotovili smo, da

somatostatinske granule zavzemajo 20 – 30 % na izbrano površino 10 µm2 citosola brez

organelov.

Leta 1994 so Lew et al. ocenili, da je 53 % zrelih zimogenih granul na izbrano površino v

celotni populaciji različnih tipov zimogenih granul. Pri analizi naših fotografij smo upoštevali

vse tipe zimogenih granul, ne samo zrelih zimogenih granul. Tako se naši rezultati gibljejo

okrog 40 – 50 % na izbrano površino 10 µm2 citosola brez organelov. Glede na to, da so na

fotografijah večinoma zrele zimogene granule, lahko sklepamo, da sta rezultata naše

raziskave in raziskave Lew et al. (1994) skladna.


6 Zaključki Diabetes, pankreatitis, rak na trebušni slinavki so samo nekatere od številnih bolezni, ki so

vzrok za raziskovanje trebušne slinavke. Modelni organizem teh raziskav je miš (Mus

musculus), ki veliko prispeva k znanju v humani medicini. Trebušna slinavka je druga največja

prebavna žleza v trebušni votlini. Je eksokrina žleza, ki izloča prebavne sokove in endokrina

žleza, ki regulira glukozno homeostazo. Zanimale so nas struktura in ultrastruktura

duodenalnega, spleničnega in gastričnega režnja trebušne slinavke miši. Trebušno slinavko

miši smo odstranili iz trebušne votline in jo razdelili na tri različne režnje. Tkivo smo ustrezno

pripravili za izdelavo tkivnih rezin in analizo opravili s svetlobno in transmisijsko elektronsko

mikroskopijo. Rezultate smo preverili z različnimi statističnimi analizami. Navajamo glavne

ugotovitve.

Hipotezo – Velikosti Langerhansovih otočkov niso enake v različnih delih trebušne

slinavke – zavrnemo. Velikosti Langerhansovih otočkov v različnih delih trebušne

slinavke so primerljive.

Hipotezo - Velikosti glukagonskih veziklov in granul niso enake v različnih strukturnih

delih trebušne slinavke – potrdimo. Velikosti glukagonskih veziklov in granul so

statistično različne v različnih delih trebušne slinavke.

Hipotezo - Velikosti inzulinskih veziklov in granul niso enake v različnih strukturnih

delih trebušne slinavke – potrdimo. Velikosti inzulinskih veziklov in granul so

statistično različne v različnih delih trebušne slinavke.

Hipotezo - Velikosti somatostatinskih granul niso enake v različnih strukturnih delih

trebušne slinavke – potrdimo. Najkrajši premeri somatostatinskih granul so

statistično različni. Pri najdaljšem premeru somatostatinskih granul v duodenalnem in

spleničnem delu nismo mogli dokazati statistične razlike. Najdaljši premeri

somatostatinskih granul gastričnega dela trebušne slinavke so statistično različni od

najdaljših premerov somatostatinskih granul duodenalnega in spleničnega dela.

Hipotezo pa sprejmemo na podlagi statističnih razlik pri najkrajših premerih

somatostatinskih granul.

Hipotezo - Deleži endokrinih granul v različnih tipih endokrinih celic niso enaki v

različnih strukturnih delih trebušne slinavke – zavrnemo. Deleži endokrinih granul so

medsebojno primerljivi.

Hipotezo - Velikosti zimogenih granul acinusa niso enake v različnih strukturnih delih

trebušne slinavke – potrdimo. Velikosti zimogenih granul acinusa so statistično

različne v različnih delih trebušne slinavke.

Hipotezo - Deleži zimogenih granul acinusa niso enaki v različnih strukturnih delih

trebušne slinavke – zavrnemo. Deleži zimogenih granul acinusa so medsebojno

primerljivi.

Hipotezo - Med različnimi deli trebušne slinavke se ne pojavljajo strukturne razlike –

potrdimo. Vsi omenjeni deli trebušne slinavke so po strukturi tkiva primerljivi med


seboj in tudi z opisi trebušnih slinavk miši v drugih raziskavah. Velikosti

Langerhansovih otočkov v različnih strukturnih delih trebušne slinavke miši so

primerljive.


7 Zahvale Zahvaljujem se mentorici dr. Saški Lipovšek in somentorju dr. Andražu Stožerju za pomoč in

strokovno vodenje pri izdelavi magistrskega dela.

Profesorju dr. Francu Janžekoviču se zahvaljujem za pomoč pri statistični obdelavi podatkov

in razlagi.

Za sproščeno delo v laboratoriju in pomoč se zahvaljujem Tini Osovnikar, dr. Barbari Dariš in

Marjani Knez.

Hvala, Tjaši Zrimšek in Mii Prosenica, prijateljicama, ki sta mi je vedno stala ob strani.

Zahvalila bi se tudi družini Selčan in babici Slavici, ki so zmeraj našli čas za mene in

spodbudno besedo.

V prvi vrsti pa je seveda moja draga mamica, ki mi je vedno stala ob strani. Hvala za podporo

in potrpljenje, ko moja pot ni potekala v skladu z mojimi/najinimi načrti. Rada te imam.

Moj dragi David, hvala, da me znaš spravit na pravo pot v času neodločnosti. Hvala ti, da si

naredil vse kaj si lahko, da si mi olajšal izdelavo magistrske naloge. Da si napisal program za

analizo fotografij in, da mi stojiš ob strani pri vsaki moji odločitvi in me spodbujaš, da jo

izpeljem tako kot si želim. Rada te imam.


8 Literatura Al–Mahrouki, A. A., Youson, J. H. (1999). Ultrastructure and Immunocytochemistry of the

Islet organ of Osteoglossomorpha (Teleostei), General and Comparative Endocrinology, 116,

409 – 421.

Atherton, J. C., Atherton, H. L. (2007). Anatomy of the Digestive System. Anatomy &

Physiology (str. 925 – 960). Združene države Amerike in Kanada: Elsevier Ltd.

Barg, S., Galvanovskis, J., Göpel, S., Rorsman, P., Eliasson, L. (2000). Tigh coupling between

electrical activety and exocytosis in mouse glucagon-secreting α-cells, Diabetes, 49, 1500-

1510.

Boel, E., Schwartz, T. W., Norris, K. E., Fiil, N. P. (1984). A cDNA encoding a small common

precursor for human pancreatic polypeptide and pancreatic icosapeptide, The EMBO

Journal, 4 (3), 909-912.

Biologycorner.com. (2016). Rat Anatomy - Head, Thoracic, and Abdominal Organs.

Pridobljeno 21.4.2016 iz http://www.biologycorner.com/worksheets/rat_head.html.

Borgonovo, B., Ouwenddijk, J., Solimena, M. (2006). Biogenesis of secretory granules, Curent

Opinion in Cell Biology, 18, 365 – 370.

Braun, M., Ramracheya, R., Amisten, S., Bengtsson, M., Moritoh, M., Zhang, Q., Johnson, P.

R., Rorsman, P. (2009). Somatostatin release, eletrical activety, membrane currents and

exocytosis in human pancreatic delta cells, Diabetologia, 52, 1566- 1578, DOI: 10.1007/s-

00125-009-1382-z.

Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. (2015). Alpha-, delta- and PP-cells: are they

the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination?, Journal of

Histochemistry and Cytochemistry, 63 (8), 575-591.

Burck, H.C. (1982). Histologische Tehnik. Stuttgart: Georg Thieme Verlag.

Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P., Caicedo, A. (2006). The

unique cytoarchitecture of human pancreatic has implications for islet cell function, PNAS,

103 (7), 2334 – 2339, DOI: 10.1073/pnas.0510790103.

Cvetko, E. (2016). Prebavila. V: Martinčič Štiblar, D., Cvetko, E., Cör, A., Marš, T., Dolenšek, J.

(ur.), Anatomija, histologija, fiziologija (str. 115 – 121). Ljubljana: Medicinska fakulteta

Univerze v Ljubljani.

DiGruccio, M. R., Mawla, A. M., Donaldson, C. J., Noguchi, G. M., Voughan, J., Cowing Zitron,

C., Van der Meulen, T., Huising, M. O. (2016). Comprehensive alpha, beta and delta cell

transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes

somatostatin release from pancreatic islets, Molecular metabolism, 1 - 10, DOI:

10.1016/j.molmet.2016.04.007.


Dolenšek, J., Rupnik Slak, M., Stožer, A. (2015) Structural similarities and differences

between the human and the mouse pancreas, Islets, 7 (1), doi:

10.1080/19382014.2015.1024405.

Ekholm, R., Zelander, T., Edlund, Y. (1962). The ultrastructural organisation of the rat

exocrine pancreas, I. Acinar cells, J. Ultrastructure research, 7, 61 – 72.

Elayat, A. A., El –Naggar, M. M., Tahir, M. (1995). An immunocytochemical and

morphometric study of the rat pancreatic islets, J. Anat., 186, 629 – 637.

Etayo, J. C., Montuenga, L. M., Sesma, P., Diaz de Rada, O., Rovira, J. (2000). Charaterization

of Pancretic Endokrine Cells of thr European Common Frog Rana temporaria, General and

Comparative Endocrinology, 117, 366 – 380.

Fava, E., Dehghany, J., Ouwendijk, J., Müller, A., Niederlein, A., Verkade, P., Meyer Hermann,

M., Solimena, M. (2012). Novel standards in the measurement o frat insuline granules

combining electron microscopy, high – content image analysis and in silico modelling,

Diabetologia, 55, 1013 – 1023, DOI: 10.1007/s00125-011-2438-4.

FutureTimeline.net. (2015). Pridobljeno 16.7.2016 iz

http://www.futuretimeline.net/blog/2015/06/27.htm#.V4o_IKJfPK0.

Glauert, A. M. (1987). Practical Methods in Electron Microscopy. Elsevier, Amsterdam.

Pridobljeno 12.4.2016 iz http://www.lepidoptera.eu/show.php?ID=824&countrey=GB.

Golob, Z. (2011). Funkcionalna anatomija ptičev z osnovami ornitologije. Maribor: Univerza

v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko.

Göpel, S. O., Kanno, T., Barg, S., Rorsman, P. (2000). Patch – clamp characterisation of

somatostatin – secreting δ-cells in intact mouse pancreatic islets, Journal of Physiology, 528

(3), 497 – 507.

Göpel, S., Zhang, Q., Eliasson, L., Ma, X.- S., Galvanovskis, J., Kanno, T., Salehi, A., Rorsman, P.

(2004). Capacitance measurements of exocytosis in mouse pancreatic α-, β- and δ- cells

within intact islets of Langerhans, Journal of Physiology, 556 (3), 711 – 756.

Gylfe, E. (2016). Glucose control of glucagon secretion – There' s a brand-new gimmick every

year, Upsala Journal of Medical Sciences, 121 (2), 120 – 132, DOI:

10.3109/03009734.2016.1154905.

Henquin, J. C., Nenquin, M., Stiernet, P., Ahren, B. (2006). In vivo and in vitro glucose-

induced biphasic insulin secretion in the mouse, Diabetes, 55 (2), 441-451.

Huang, Y. C., Rupnik Slak, M., Karimian, N., Herrera, P. L., Gilon, P., Feng, Z. P., Gaisano, H. Y.

(2013). In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-

induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion, Diabetes, 62

(2), 519-530.

Kawai, K., Yokota, C., Ohashi, S., Watanabe, Y., Yamashita, K. (1995). Evidence that glucagon

stimulates insulin secretion through its own receptor in rats, Diabetologia, 38 (3), 274-276.


Kim, A., Miller, K., Jo, J., Klimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. (2009). Islet architecture, A

comparative study, Islets, 1 (2), 129 – 136.

Kilimnik, G., Zhao, B., Jo, J., Periwal, V., Witkowski, P., Misawa, R., Hara, M. (2011). Altered

Islet Composition and Disproportionate Loss of Large Islets in Patients with Type2 Diabetes,

PLoS ONE, 6 (11), e27445, DOI:10.1371/journal.pone.0027445.

Kilimnik, G., Jo, J., Periwal, V., Zielinski, M. C., Hara, M. (2012). Quantification of islet size and

architecture, Islets, 4 (2), 167 – 172, DOI: 10.4161/isl.19256 .

Kotpal, R.L. (2010). Modern Text Book of Zoology: Vertebrates [elektronska knjiga]. New

Delhi: Rekesh Kumar Rastogi. Pridobljeno 15.4.2016, iz https://books.google.si/books?id=m-

eQUEUjG2UC&pg=PA230&dq=lobe+of+frog+pancreas&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwjv5Yy44Z

DMAhUJG5oKHcXkD9kQ6AEINzAD#v=onepage&q=lobe%20of%20frog%20pancreas&f=false.

Leiter, E. H., Gapp, D. A., Eppig, J. J., Coleman, D. L. (1979). Utrastructural and morphometric

studies of delta cells in pancreatic islets from C57BL/Ks diabetes mice, Diabetologia, 17 (5),

297-309.

Lew, S., Hammel, I., Galli, S. J. (1994). Cytoplasmic granule formation in mouse pancreatic

acinar cells, Evidence for formation of immature granules (condensing vacuoles) by

aggregation and fusion of progranules of unit size, and for reductions in membrane surface

area and immature dranule volume during granule maturation, Cell Tissue Research, 278,

327 – 336.

Liu, J. – L., Caschigano, K.T., Robertson, K., Lipsett, M., Guo, Y., Kopchick, J. J., Kumar, U., Liu,

Y. L. (2004). Disruption of growth hormone receptor gene couses diminished pancreatic islet

size and increased insulin sensitivity in mice, American Journal of Phisiology, Endocrinology

and Metabolism, 287, E405 – E413, DOI: 10.1152/ajpendo.00423.2003.

Lonovics, J., Devitt, P., Watson, L. C., Rayford, P. L., Thompson, J. C. (1981). Pancreatic

polypeptide, Arch Surg, 116, 1256-1264.

Olofsson, C. S., Göpel, S. O., Barg, S., Galvanovskis, J., Ma, X., Salehi, A., Rorsman, P.,

Eliasson, L. (2002). Fast insulin secretion reflects exocytosis of docked granules in mouse

pancreatic B-cells, Pflügers Archiv European Journal of Physiology, 444 (1), 43-51.

Ma, X., Zhang, Y., Gromada, J., Sewing, S., Berggren, P., Buschard, K., Salehi, A., Vikman, J.,

Rorsman, P., Eliasson, L. (2005). Glucagon stimulates exocytosis in mouse and rat pancreatic

α- cells by binding to glucagon receptors, Molecular endocrinology, 19(1), 198-212, DOI:

10.120/me.2004-0059.

Miller, M. R. (1962). Observations on the comparative histology of the reptilian pancreatic

islet, General and Comparative Endocrinology, 2 (4), 407 – 414.

Morini, S., Braun, M., Onori, P., Cicalese, L., Elias, G., Gaudio, E., Rastellini, C. (2006).

Morphological changes of isolated rat pancreatic islets: a structural, ultrastructural and

morphometric study, Journal of anatomy, 209 (3), 381-392.


Moscona, A. A. (1990). Anatomy of the Pancreas and Langerhans Islets in Snakes and Lizards,

The Anatomical Record, 227 (2), 232 – 244.

Müller, W. A., Faloona, G. R., Unger, R. H. (1971). The effect of experimental insulin

deficiency on glucagon secretion, Journal of Clinical Investigation, 50 (9), 1992 - 1999, DOI:

10.1172/JCI106691.

Nam, K. – H., Yong, W., Harvat, T., Adewola, A., Wang, S., Oberholzer, J., Eddington, D. T.

(2010). Size – based separation and collection of mouse pancreatic islet for functional

analysis, Biomed Microdevices, 12, 865 – 874, DOI: 10.1007/s10544-010-9441-2.

Noske, A. B., Costin, A. J., Morgan, G. P., Marsh, B. J. (2008). Expedited approaches to whole

cell electron tomography and organelle mark-up in situ in high-pressure frozen pancreatic

islets, Journal of structural biology, 161 (3), 298-313.

Pende, M., Kozma, S. C., Jaquet, M., Oorschot, V., Burcelin, R., Le Marchand-Brustel, Y.,

Klemperman, J., Thorents, B., Thomas, G. (2000). Hypoinsulinaemia, glucose intolerance and

diminished β-cell size in S6K1-deficient mice, Nature, 408 (6815), 994-997, DOI:

10.1038/35050135.

Pfeifer, C. R., Shomorony, A., Aronova, M. A., Zhang, G., Cai, T., Xu, H., Notkins, A. L.,

Leapman, R. D. (2015). Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial

block-face SEM, Journal of structural biology, 189 (1), 44-52. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. (2006). Compound exocytosis: mechanisms and functional

significance, Traffic, 7, 109-116, DOI: 10.1111/j.1600-0854.2005.00372.x.

Prado de Franca Carvalho, C., Rebelo Martins, J. C., Andrade da Cunha, D., Boschero, A. C.,

Callares - Buzato, C. B. (2006). Histomorphology and Ultrastructure of pancreatic islet tissue

during in vivo maturation of rat pancreas, Ann Anat, 188, 221 – 234.

Reaven, E. P., Gold, G., Reaven, G. M. (1979). Effect of age on glucose-stimulated insulin

release by the beta-cell of the rat, Journal of clinical Investigation, 64 (2), 591 - 599.

Rhoten W. B. (1971). Light and electron microscopic studies on pancreatic islet of the lizard

Lygosoma laterale: I. Normal ang glucose –loaded animals, General and Comparative

Endocrinology, 17 (1), 203 – 219.

Rorsman, M., Renström, E. (2003). Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells,

Diabetologia, 46, 1029 – 1045, DOI: 10.1007/s00125-003-1153-1.

Ruffier, L., Simon, J., Rideau, N. (1998). Isolation of Functional Glucagon Islet of Langerhans

from the Chicken Pancreas, General and Comparative Endocrinology, 112, 153 – 162.

Rupnik, M. (2009). The phisology of rodent beta cells in pancreas slices, Acta physiologica,

195, 123 – 138.

Schuenke, M., schulte, E. (2006). Atlas of Anatomy, Neck and Internal organs. Nemčija:

Georg Thieme Verlag.


Selčan, D. (2016). PyCellCounter. Version 0.1. GitHub repository. Pridobljeno 26.9.2016 iz

https://github.com/dselcan/PyCellCounter.

Skelin, M. (2011). Fiziološko prilagajanje občutljivosti aparata za zlivanje sekretornih

mešičkov na kalcijeve ione celic beta trebušne slinavke. Doktorska disertacija. Medicinska

fakulteta, Univerza v Mariboru.

Skelin Klemen, M., Dolenšek, J., Stožer, A., Rupnik Slak, M (2014). Measuring excosytosis in

endokrine tissue slices. V: Thorn, P. (ur.), Exocytosis Methods (str. 127 – 146). New York,

Združene države Amerike: Humana Press.

Stožer, A. (2013). Vpliv presnovno pomembnih dejavnikov na funkcijo celic beta. Doktorska

disertacija. Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru.

Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. (2010). Fiziologija prebavne cevi, 1.del, Med Razgl, 49,

371-389.

Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik Slak, M. (2013). Glucose-Stimulated Calcium Dynamics in

Islets of Langerhans in Acute Mouse Pancreas Tissue Slices, PLoSONE, 8 (1), DOI:

10.1371/journal.pone.0054638.

Šegel, M. (2016). Ekofiziološke raziskave prezimovanja Scoliopteryx libatrix (Noctuoidea).

Magistrsko delo. Oddelek za biologijo, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Univerza v

Mariboru.

Tortora, G. J., Nielson, M. T. (2009). The digestive system. Principles of Human Anatomy (str.

781 -820). Združene države Amerike: John Wiley & Sons, Inc.

Volgemut, T. (2015). Avtomatizirana računalniška obdelava fotografij beta celic trebušne

slinavke pri miših. Magistrsko delo. Fakulteta za zdravstvene vede, Univerza v Mariboru.

Wäsle, B., Edwardson, J. M. (2002). The regulation of exocytosis in the pancreatic acinar cell,

Cellular Signalling, 14, 191-197.

WiseGEEK. (2017). Pridobljeno 13. 2. 2017 iz http://www.wisegeek.net/what-is-

pentagastrin.htm.

Documents

MAGISTRSKO DELO Petra SEVER