INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO CIÊNCIA E TECNOLOGIA GOIANO –

CAMPUS RIO VERDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - AGRONOMIA

ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Psidium guajava: CONTROLE

DE Sclerotinia sclerotiorum EM SOJA, ATIVIDADE BACTERICIDA E

ANTICARIOGÊNICA

Autora: Elizabeth Aparecida Josefi da Silva

Orientador: Dr. Edson Luiz Souchie

Rio Verde, GO

Julho, 2019

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO CIÊNCIA E TECNOLOGIA GOIANO –

CAMPUS RIO VERDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - AGRONOMIA

ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Psidium guajava: CONTROLE

DE Sclerotinia sclerotiorum EM SOJA, ATIVIDADE BACTERICIDA E

ANTICARIOGÊNICA

Autora: Elizabeth Aparecida Josefi da Silva

Orientador: Dr. Edson Luiz Souchie

Tese apresentada como parte das exigências

para obtenção do título de DOUTOR EM

CIÊNCIAS AGRÁRIAS - AGRONOMIA

no Programa de Pós-Graduação em Ciências

Agrárias do Instituto Federal de Educação,

Ciência e Tecnologia Goiano – Campus Rio

Verde, Área de concentração em Produção

Vegetal Sustentável no Cerrado.

Rio Verde, GO

Julho, 2019

A Deus, pelas bênçãos concedidas:

Aos meus pais Fernando e Nelci, por todo amor e dedicação:

Ao meu irmão Gustavo, por tudo que significa para mim:

Ao meu esposo Ernany, pelo amor, paciência e compreensão nos momentos de ausência,

Com Amor,

AGRADECIMENTOS

Desafio tão grande quanto escrever esta Tese, foi utilizar apenas duas páginas

para agradecer às pessoas que fizeram parte desta minha trajetória de 4 anos (duração do

doutorado), mas que completa 13 anos no Instituto Federal Goiano – Campus Rio Verde.

Sempre achei esta a pior parte da Tese para escrever, talvez porque a vida não se

coloca em análise de regressão e não é pelo valor p que descobrimos a significância das

pessoas em nossa trajetória.

Agradeço primeiramente a Deus, por estar comigo em todos os momentos de

minha vida me guiar, iluminar e dar tranquilidade para seguir em frente com meus

objetivos e não desanimar com as dificuldades. Só Ele sabe quantas vezes pensei em

desistir.

Agradeço a minha família, irmão, queridos pais e queridos sogros que me

incentivaram e apoiaram nos momentos difíceis e me orientaram e apoiaram nos estudos.

Obrigado por entenderem minhas faltas e momentos de afastamento e reclusão. Obrigado

por mostrarem o quanto era importante estudar, mesmo sem terem tido esta mesma

oportunidade no passado.

Agradeço imensamente ao meu esposo Ernany, por me apoiar, incentivar e

ajudar em alguns experimentos com todo carinho e amor. O tempo todo ao meu lado,

incondicionalmente. Nos momentos mais difíceis, que não foram raros nestes últimos

anos, sempre me fez acreditar que chegaria ao final desta difícil, porém gratificante etapa.

Este período nos mostrou a verdade sobre nosso relacionamento: somos uma Família!

Sou grata por cada gesto carinhoso, cada sorriso, e cada bronca também e ansiosa por

estar ao seu lado, o resto da minha vida.

Ao meu querido orientador Dr. Edson Luiz Souchie, pela confiança em me

orientar neste projeto que sempre acreditou em minha capacidade intelectual, confiou em

meu potencial para ingressar na pesquisa e muito me ensinou com dedicação, sabedoria

e, principalmente, pela sua eterna amizade.

Agradeço a minha querida Coorientadora e professora, Drª. Cassia Cristina

Fernandes Alves. Resumi-la à coorientadora é muito pouco e tenho certeza de que ela

sente a importância que teve e tem para mim, não só no auxílio da condução do trabalho,

mas também como conselheira e até nas horas que parece que nada está dando certo e que

preciso não só de um consolo, mas de um colo. Agradeço pela amizade que completa 12

anos, desde as aulas do Técnico em Alimentos, por onde nos conhecemos.

Ao professor Dr. José Milton Alves, pela paciência, ensinamentos e colaboração.

Ao professor Dr. Alaerson Maia Geraldine, pela colaboração e ensinamentos

como também a todos de seu Laboratório pela paciência e colaboração para realização

dos experimentos.

À Larissa e ao Weber, meus alunos de Iniciação científica, pela imensa

colaboração na coleta das folhas e extração do óleo essencial, como também pela ajuda

na realização dos experimentos.

Aos meus colegas do Laboratório de Química de Produtos Naturais e do

Laboratório de Microbiologia Agrícola: Ana Carolina, Josemar, Cíntia e de todos os

outros que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.

Aos meus colegas de Doutorado, que não irei citar nomes para não esquecer de

ninguém, obrigada pelos momentos compartilhados nessa jornada.

A todos os professores da Pós-Graduação em Ciências Agrárias - Agronomia,

cujas disciplinas contribuíram para realização desta pesquisa através de inúmeras leituras,

discussões e trabalhos, recebam minha admiração, respeito e meu muito obrigado. Apesar

de me tirarem o sono - pensa numa Química estudando Fisiologia Vegetal – obrigado

porque, ao final, deu tudo certo.

À FAPEG e CAPES, pela concessão da bolsa de estudos, providencial para

viabilizar o desenvolvimento desta pesquisa.

Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Agrárias - Agronomia e ao IF

Goiano – Campus Rio Verde, pela oportunidade de aprimoramento profissional,

intelectual e pessoal.

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para mais uma etapa de minha

vida.

Obrigada!

BIOGRAFIA DA AUTORA

ELIZABETH APARECIDA JOSEFI DA SILVA, filha de Fernando Carlos da

Silva e Nelci Maria Josefi, nasceu no dia 18 de novembro de 1988, na cidade de Uruará,

Pará. Em dezembro de 2005, concluiu o ensino médio no Colégio Metropolitano em

Goiânia. Em 2006, iniciou no curso Técnico em Alimentos pelo CEFET – Rio Verde,

concluindo-o em 2007. No IF Goiano - Campus Rio Verde, graduou-se em Licenciatura

e Bacharelado em Química (2012), tornou-se Mestre em Agroquímica (2015) e Doutora

em Ciências Agrárias – Agronomia (2019). Em julho de 2014, ingressou no curso de

Bacharelado em Agronomia no IF Goiano - Campus Rio Verde, com formação prevista

para julho de 2020.

ÍNDICE

Página

AGRADECIMENTOS ...................................................................................... ix

BIOGRAFIA DA AUTORA .............................................................................. xi

ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................... xiv

ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................... xv

LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS, ABREVIAÇÕES E UNIDADES ............ xvi

RESUMO ....................................................................................................... xviii

ABSTRACT ..................................................................................................... xx

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................ 22

1.1. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................. 24

1.2. Goiabeira (Psidium guajava L.) ............................................................ 24

1.3. Bioatividade dos óleos essenciais ......................................................... 26

1.4. Emulsões ............................................................................................... 29

1.5. Mofo Branco - Sclerotinia sclerotiorum ............................................... 31

1.6. Referências Bibiográficas ..................................................................... 34

2. OBJETIVOS ............................................................................................. 46

2.1. Geral ...................................................................................................... 46

2.2. Específicos ............................................................................................ 46

3. CAPÍTULO I – Ação antifúngica do óleo essencial das folhas de Psidium

guajava in vitro e in vivo no controle de Sclerotinia sclerotiorum em plantas de soja . 47

RESUMO ...................................................................................................... 47

ABSTRACT .................................................................................................. 48

3.1. INTRODUÇÃO .................................................................................... 48

3.2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 50

O Material Vegetal ........................................................................................ 50

Extração do óleo essencial ............................................................................ 50

Emulsão contendo óleo essencial de Psidium guajava ................................. 51

Microcápsulas contendo óleo essencial de Psidium guajava........................ 51

Cultura do fungo Sclerotinia sclerotiorum .................................................... 51

Material vegetal Glycine max ....................................................................... 51

Teste da folha destacada ................................................................................ 52

Teste antifúngico in vivo em soja .................................................................. 52

Análise estatística .......................................................................................... 53

3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................... 53

3.4. CONCLUSÃO ...................................................................................... 58

3.5. AGRADECIMENTOS .......................................................................... 58

3.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 58

4. CAPÍTULO II – Anticariogenic and antiproliferative activities of the fresh

leaf essential oil of Psidium guajava L. (Myrtaceae) .................................................... 62

Abstract ......................................................................................................... 62

Resumo ......................................................................................................... 63

4.1. Introduction ........................................................................................... 63

4.2. Material and Methods ........................................................................... 64

4.2.1. Plant material ..................................................................................... 64

4.2.2. Essential oil extraction ...................................................................... 65

4.2.3. Chemical analysis of essential oil ...................................................... 65

4.2.4. Antibacterial assays ........................................................................... 65

4.2.5. Cell lines and culture conditions ....................................................... 66

4.2.6. Antiproliferative assay ....................................................................... 66

4.3. Results and Discussion .......................................................................... 67

Table 1 ........................................................................................................... 67

Table 2 ........................................................................................................... 68

Table 3 ........................................................................................................... 69

4.4. Conclusion ............................................................................................. 69

4.5. References ............................................................................................. 69

ÍNDICE DE TABELAS

Página

Tabela 1 - Constituintes do óleo essencial das folhas de Psidium guajava. ................... 53

Table 1 - Compounds identified in the leaf essential oil of P. guajava (Myrtaceae)......73

Table 2 - Anticariogenic activity of P. guajava leaves (PG-EO) essential oil against oral

bacteria ............................................................................................................................ 73

Table 3 - IC50 and selectivity index (SI) of P. guajava leaves (PG-EO) essential oil against

diferent cell lines. ............................................................................................................ 74

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1 - Esquema simplificado dos tipos de emulsões.. ............................................. 30

Figura 2 - Sintomas e sinais de mofo-branco em hastes de soja, causados por Sclerotinia

sclerotiorum. ................................................................................................................... 32

Figura 3 - Estutura dos escleródios do mofo branco. .................................................... 33

Figura 1 - Percentual de inibição micelial da emulsão e das microcápulas contendo óleo

essencial de folhas de goiabeira a 300µL/mL sobre o fungo Sclerotinia sclerotiorum.

Controle 1 (controle negativo microcápsulas), controle 2 (controle negativo

emulsão)...........................................................................................................................55

Figura 2 - Percentual de inibição micelial in vivo em folhas de soja da emulsão contendo

óleo essencial de folhas de goiabeira sobre o fungo Sclerotinia

sclerotiorum.....................................................................................................................56

LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS, ABREVIAÇÕES E UNIDADES

°C ......................... Graus Celsius Temperatura

% .......................... Porcentagem Percentual

µL ......................... Microlitro Volume

m ......................... Metro Comprimento

Cm ....................... Centímetro Comprimento

µm ........................ Micrômetro Comprimento

mL ........................ Mililitro Volume

g ........................... Gramas Massa

Kg......................... Quilogramas Massa

b.u......................... Base úmida Umidade

C.V ....................... Coeficiente de variância Estatística

CG ......................... Cromatografia gasosa Análise

CG/EM ..................

Cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massas

CG-DIC ................ Cromatografia gasosa acoplada ao detector

de ionização de chamas

CH2Cl2 ................... Diclorometano Solvente

CO2 ........................ Dióxido de carbono Gás

C-C......................... Carbono- carbono Ligação

h............................. Horas Tempo

m/v......................... Massa/volume Medida

eV .......................... Eletronvolt Energia

He .......................... Hélio Gás

IK .......................... Índice de Kovats Identificação

kPa......................... Quilopascal Pressão

m s-1 ....................... Metro por segundo Tempo

m/z......................... Massa/carga Energia

m3 .......................... Metro cúbico Volume

mg ......................... Miligrama Massa

min ........................ Minuto Tempo

mL.min-1................ Mililitro por minuto Vazão

T............................ Temperatura Temperatura

mm........................... Milímetro Comprimento

PIC.......................... Percentual de inibição de crescimento

BDA........................ Batata dextrose ágar

UR........................... Umidade relativa

Rt............................. Tempo de retenção

P. guajava................ Psidium guajava

S. sclerotiorum........ Sclerotinia sclerotiorum

Ss BRM 29673,

29870......................

Código do fungo

C. albicans.............. Candida albicans

C. Krusei............... Candida kusei

C. parapsilosis........ Candida parapsilosis

C. tropicalis............. Candida tropicalis

S. aureus................. Staphylococcus aureus

S. anatum................ Staphylococcus anatum

LASA...................... Laboratório de Análise e Síntese de

Agroquímicos

α ............................ Alfa

β ............................ Beta

δ............................ Delta

γ ............................ Gama

RESUMO

SILVA, ELIZABETH APARECIDA JOSEFI. Instituto Federal de Educação, Ciência e

Tecnologia Goiano – Campus Rio Verde – GO, julho de 2019. Óleo essencial das folhas

de Psidium guajava: controle de Sclerotinia sclerotiorum em soja, atividade

bactericida e anticariogênica. Orientador: Edson Luiz Souchie. Coorientadora: Cassia

Cristina Fernandes Alves.

O gênero Psidium que pertence à família Myrtaceae abriga diversas espécies

importantes, como a goiabeira (Psidium guajava L.). O óleo essencial (OE) das folhas

desta planta tem levado a diversos estudos pela sua composição química e por suas

propriedades, destacando-se sua atividade antimicrobianas, e sua ação antifúngica. Esta

vem sendo comprovada sobre fungos fitopatogênicos como o Sclerotinia sclerotiorum,

causador da doença mofo branco, que é uma das mais importantes na cultura da soja e

possui difícil controle, pois uma vez instalada na lavoura é de difícil erradicação. Com

este trabalho, objetivou-se testar o OE das folhas de Psidium guajava, na forma de

emulsão, e determinar seu efeito fungicida no controle do fungo Sclerotinia sclerotiorum

in vivo, na cultura da soja, bem como avaliar sua atividade anticariogênica e antitumoral.

A extração do OE foi realizada por hidrodestilação e sua composição analisada por CG-

EM. Para aplicação do OE sobre o micro-organismo foram utilizados dois veículos, por

emulsão, e por microcápsulas a 300 µl.mL-1. O teste in vivo em plantas de soja foi

realizado utilizando a emulsão em discos de 7 mm do fungo Sclerotinia sclerotiorum, que

foram incubadas a 22ºC e 90% UR e observadas até o crescimento total do controle

negativo. Como controle negativo, foi utilizado apenas o fungo sem nenhum tratamento

e, como positivo, o fungicida frowcide. O teste em folha destacada foi realizado seguindo

a mesma metodologia descrita para o teste in vivo, tanto para emulsão quanto para as

microcápsulas. Foram identificados como compostos majoritários no OE o trans-

cariofileno e α-humuleno. As microcápsulas no teste da folha destacada possibilitaram

taxa de inibição micelial do mofo branco de 34,6%, enquanto a emulsão possibilitou

96,4% e 92,5% no teste in vivo em plantas de soja, comprovando seu potencial

antifúngico. Em um segundo momento foi realizada a atividade anticariogênica do OE

das folhas de P. guajava foi determinada em termos de suas concentrações mínimas

inibitórias (MIC), usando o método de microdiluição em caldo em microplacas de 96

cavidades. O OE das folhas de Psidium guajava teve atividade moderada contra

Streptococcus mutans (MIC = 200 μg / mL), S. mitis (MIC = 200 μg / mL), S. sanguinis

(MIC = 400 μg / mL), S. sobrinus (MIC = 100 μg / mL) e S. salivarius (MIC = 200 μg /

mL). A atividade antiproliferativa foi avaliada em linhagens de células tumorais:

adenocarcinoma de mama (MCF-7), adenocarcinoma cervical humano (HeLa) e

gliobastoma humano (M059J). Foi incluída uma linha celular humana normal

(GM07492A, fibroblastos pulmonares). A atividade antiproliferativa foi avaliada,

utilizando o ensaio XTT e os resultados expressos como IC50. As linhas MCF e MO59J

mostraram menores valores de IC50 que os obtidos para a linha normal, mostrando

seletividade. Tais resultados sugerem que o OE de Psidium guajava L. tem atividades

biológicas promissoras e pode ser considerado uma nova fonte de compostos bioativos.

PALAVRAS-CHAVE: Atividade antifúngica, mofo branco, goiaba, metabólitos

secundários.

ABSTRACT

SILVA, ELIZABETH APARECIDA JOSEFI. Instituto Federal de Educaão, Ciência e

Tecnologia Goiano – Campus Rio Verde, July 2019. Psidium guajava leaf essential oil:

Sclerotinia sclerotiorum control in soybean, bactericidal and anticariogenic activity

Advisor: Edson Luiz Souchie. Co-advisor: Cassia Cristina Fernandes Alves.

The genus Psidium belonging to the family Myrtaceae comprises several

important species, such as guava (Psidium guajava L.). The essential oil (EO) from leaves

of this plant, has led to several studies due to its chemical composition and properties,

highlighting its antimicrobial activity, and antifungal action. This has been proven on

phytopathogenic fungi such as Sclerotinia sclerotiorum, which causes the white mold

disease, which is one of the most important in soybean crop and also of difficult control.

Once installed in the field, it is difficult to eradicate. The objective of this work was to

test the EO of Psidium guajava leaves as emulsion and to determine its fungicidal effect

on control of fungus Sclerotinia sclerotiorum in vivo in soybean, as well as to evaluate its

anticaryogenic and antitumor activity. EO extraction was performed by hydrodistillation

and its composition analyzed by GC-MS. For the EO application on the microorganism,

two vehicles were used, emulsion and by microcapsules at 300 µl.mL-1. The in vivo test

on soybean plants was performed using the emulsion over 7 mm Sclerotinia sclerotiorum

fungus discs, which were incubated at 22 ºC and 90% RH and observed until the total

negative control growth. As negative control, only the untreated fungus was used and, as

positive control, the frowcide fungicide. The detached leaf test was performed following

the same methodology as described for the in vivo test for both emulsion and

microcapsules. The major EO compounds were trans-caryophyllene and α-humulene. The

microcapsules in the detached leaf test allowed 34.6% white mold mycelial inhibition

rate, while the emulsion allowed 96.4% and 92.5% in vivo test in soybean plants, proving

its antifungal potential. Secondly, the EO anticancer activity of P. guajava leaves was

determined in terms of their minimum inhibitory concentrations (MIC) using the broth

microdilution method in 96-well microplates. The EO of Psidium guajava leaves had

moderate activity against Streptococcus mutans (MIC = 200 μg / mL), S. mitis (MIC =

200 μg / mL), S. sanguinis (MIC = 400 μg / mL), S. sobrinus ( MIC = 100 μg / mL) and

S. salivarius (MIC = 200 μg / mL). Antiproliferative activity was evaluated in tumor cell

lines: breast adenocarcinoma (MCF-7), human cervical adenocarcinoma (HeLa) and

human gliobastoma (M059J). A normal human cell line (GM07492A, pulmonary

fibroblasts) was included. Antiproliferative activity was evaluated using the XTT assay

and results expressed as IC50. The MCF and MO59J lines showed lower IC50 values

than those obtained for the normal line, showing selectivity. These results suggest that

EO Psidium guajava L. has promising biological activities and may be considered a new

source of bioactive compounds.

KEYWORDS: antifungal activity, white mold, guava, secondary metabolites.

22

1. INTRODUÇÃO

Dentro do gênero Psidium pode-se destacar a goiabeira (Psidium guajava L.)

que pertence à família Myrtaceae, que possui cerca de 3.800 espécies sendo apontada

como uma das maiores famílias botânicas (LANDRUM E KAWASAKI, 1997;

OLIVEIRA, 2018). A goiabeira é considerada uma planta nativa do México se estendendo

por toda a América do Sul, Europa, África e Ásia (SHAH et al., 2011; ETEMADIPOOR

et al., 2019). Ela cresce em todas as regiões tropicais e subtropicais do mundo, adapta-se

as diferentes condições climáticas e está amplamente difundida e bem adaptada no

território brasileiro, inclusive no Domínio Cerrado (AMORIM et al., 2017;

ETEMADIPOOR et al., 2019).

A goiabeira é uma espécie bastante utilizada na medicina popular, suas cascas

têm sido empregadas no tratamento de diarreia em crianças; as folhas são usadas para o

alívio da tosse, distúrbios pulmonares, feridas, úlceras, agente hipoalergênico e analgésica

e o fruto utilizado como tônico, laxante e anti-helmíntico (FLORES et al., 2015; NUNES

et al., 2016). Resultados comprovam que os extratos de suas folhas possuem propriedades

antimicrobianas, antimutagênica, atividade hipoglicêmica, hepaprotetora, anti-

inflamatória, antioxidante, antinociceptiva, antidiabéticos, antiproliferativa (NORA et al.,

2014; SILVA et al., 2019; VASCONCELOS et al., 2017) entre outras. Ademais, seus

extratos e óleos essenciais têm mostrado atividade inibitória in vitro para diferentes

microrganismos dentre eles bactérias e fungos, incluindo Sclerotinia sclerotiorum

(GONÇALVES et al., 2008; MENEZES, 2013; SILVA et al., 2018).

Os fungos fitopatogênicos possuem expressivo potencial para causar perdas nas

lavouras já que, em sua maioria, produzem grandes quantidades de esporos, podem ser

disseminados facilmente por longas distâncias, levam plantas à morte e são de difícil

erradicação (VELOSO, 2016). Tais fungos são responsáveis por grandes perdas agrícolas

em todo o mundo, gerando considerável impacto negativo na economia, com perdas de

produtividade entre 30-60% em culturas de interesse econômico, como a soja, milho,

arroz, trigo, cana-de-açúcar, café, entre outros (VELOSO, 2016).

O fungo Sclerotinia sclerotiorum é um fungo fitopatogênico causador de uma

doença chamada mofo branco, de expressiva importância em grandes culturas, como a

soja. É considerada a segunda doença mais importante nesta cultura, atrás apenas da

ferrugem asiática, e que se traduz em grande desafio para ser controlada, devido ao seu

desenvolvimento e resistência em culturas de interesse econômico no Brasil

(MACHADO, 2017). Há relatos de reduções de 21% na produtividade da soja que em

lavouras isoladas pode chegar a 70% (MEYER et al., 2015).

Desde os primeiros relatos da agricultura, os produtores buscam por alternativas

para o controle de organismos nocivos às plantas e grande quantidade de fungicidas

convencionais é utilizada para combater estes fungos, sendo muitos destes compostos

nocivos ao homem e ao ambiente. O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de

alimentos, algodão, celulose e biocombustíveis, sendo líder no mercado do agronegócio,

mas também é o maior consumidor mundial de agrotóxicos para o controle de pragas e

doenças agrícolas (PIGNATI et al., 2017). Por isso, é necessária a busca de estratégias

para o controle de fungos fitopatogênicos. Tendo em vista que as plantas são fontes

promissoras de compostos bioativos, que podem controlar estes organismos, diversas

pesquisas com óleos essenciais e extratos brutos têm sido realizadas (ALCANTARA,

2015; HAGSTRUM E PHILLIPS, 2017; RADUNZ, 2017; TAVARES et al., 2018).

Em virtude da grande diversidade de plantas presentes na flora do Cerrado

brasileiro e sabendo-se que a espécie goiabeira possui compostos biologicamente ativos

e com ação fungitóxica, como relatado por SILVA et al. (2018), justificam-se estudos mais

detalhados sobre estes metabólitos secundários, como também de uma forma de sua

aplicação in vivo para gerar alternativas de controle para este fungo fitopatogênico em

questão.

A veiculação de óleos essenciais para sua utilização como possível biofungicida

tem sido um grande desafio devido sua volatilidade, baixa solubilidade em água, oxidação

e estabilidade. Uma alternativa para este fim é a microencapsulação como também a

utilização de sistemas emulsionados para veicular óleos essenciais, sendo que este último

apresenta algumas dificuldades de preparação pelas características dos óleos essenciais,

tornando-se um desafio obter novas formulações (SONG et al., 2015; LOPES, 2016).

Desta forma, o estudo de plantas com propriedades antifúngicas é estratégico,

pois pode reduzir a dependência das culturas por fungicidas convencionais, como também

reduzir o efeito tóxico de suas aplicações sobre o ambiente e à saúde humana, e as folhas

de goiabeira têm se mostrado com potencial para tal fim (LIMA et al., 2010; FREITAS,

2018; SILVA et al., 2018). A forma de aplicação destes produtos naturais bioativos

também deve ser estudada para melhor aproveitamento de sua ação biológica. O uso de

sistemas emulsionados contendo óleos essenciais pode ser uma alternativa para a

veiculação do óleo essencial de Psidium guajava para a aplicação na cultura da soja.

1.1. REVISÃO DE LITERATURA

A utilização de plantas medicinais é uma das mais antigas armas empregadas no

tratamento de enfermidades e combate a doenças e pragas na agricultura. Seu uso vem

através da sabedoria popular, e este conhecimento vem sendo transmitido de geração em

geração (BRUNING et al., 2012; LOPES, 2016).

As plantas são ricas fontes de produtos biologicamente ativos que podem gerar

novos produtos. Alguns dos constituintes isolados de folhas, raízes, caule, flores e frutos

são os princípios ativos responsáveis pelas ações, analgésicas, antimicrobianas,

antifúngicas, antiproliferativas e antialérgicas (CARNEIRO et al., 2015). Assim, este fato

instigou a pesquisa sobre plantas medicinais em diversas áreas como agronomia,

botânica, farmacologia e fitoquímica, visando seu aperfeiçoamento. Contudo, o

conhecimento é escasso sobre a composição química de 99,6% das plantas da flora

brasileira, estimadas entre 40 a 55.000 espécies (BANDEIRA, 2011). Neste contexto,

destaca-se a flora da região do Cerrado brasileiro que possui uma das maiores

diversidades taxonômicas e bioquímicas do planeta (PEREIRA et al., 2009; FREITAS,

2018), para a descoberta de novos compostos químicos capazes de controlar o

desenvolvimento de fitopatógenos.

O fato que gera interesse nos produtos encontrados na natureza é que esses

possuem alta diversidade em termos de estrutura e propriedades físico-químicas e

biológicas. A diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior àquela

derivada dos processos de síntese que, apesar dos avanços consideráveis, ainda é muito

limitada. Portanto, surge a necessidade de novos estudos com plantas produtoras de óleos

essenciais, como o presente estudo focado no uso do óleo essencial extraído das folhas

da goiabeira e aplicado em sistema emulsionado para aplicação in vivo na soja como

possível agente de controle para Sclerotinia sclerotiorum.

1.2. Goiabeira (Psidium guajava L.)

A goiabeira pertence à família Myrtaceae, sendo composta por mais de 70

gêneros e 2.800 espécies, distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo,

principalmente na América, Austrália e Peru (FENG et al., 2015; THORNHILL et al.,

2015; DIAZ-DE-CERIO et al., 2016; AMORIM et al., 2017). O gênero Psidium apresenta

cerca de 120-150 espécies, dentre as quais destacam-se P. guajava L.(goiaba), P.

catleyanum Sabine (araçá-doce, araçá-de-praia ou araçá-de-coroa) e P. guineense Swartz

ou P. araça Raddali (araçá-verdadeiro ou araçá-azedo) (FENG et al., 2015).

A goiabeira apresenta em forma de árvore ou arbusto pequeno, medindo entre 3

a 5 m de altura, com ramos grandes e folhas oblongas ou ovaladas, de 5 a 15 cm de

comprimento, com veias pinadas proeminentes e possuem em sua estrutura canais

oleríferos em que está armazenado o seu óleo essencial (SANTOS, 2017).

No Brasil, a goiabeira é cultivada em escala comercial em quase todas as regiões,

com destaque para os Estados de São Paulo, Minas Gerais, Rio de Janeiro, Bahia,

Pernambuco, Paraíba, Goiás, Rio Grande do Sul e Paraná, sendo o país o terceiro maior

produtor mundial desta fruta (BATISTA et al., 2015; CARAMÊS et al., 2017; TAVARES

et al., 2018). Nessas regiões, são encontradas, aproximadamente 3.024 espécies

conhecidas, distribuídas e cultivadas principalmente em países de clima tropical e

subtropical, pela sua capacidade de dispersão e rápida adaptação aos diferentes

ambientes.

Alguns autores relatam que a goiabeira é nativa do Brasil, de onde foi levada

para todas as regiões tropicais e subtropicais do mundo, em razão de sua fácil adaptação

às diferentes condições edafoclimáticas, bem como da facilidade de propagação por meio

de sementes (GONZAGA e SOARES, 1994).

A utilização do chá das folhas de goiabeira é popularmente conhecida, sendo

utilizado contra cólica e diarreias, inflamação gastrointestinais, hipertensão, diabetes,

tosse, doenças pulmonares, antitérmico, bronquite, laxante, sangramento nas gengivas,

cólera, reduzir vômitos, atividade antimicrobiana, atividade anti-inflamatória, anticárie,

no tratamento de feridas oculares, anticancerígenas e hepaprotetora, efeitos comprovados

com inúmeros estudos a esse respeito (ALMEIDA et al., 1995; LOZOYA et al., 2002;

BEGUM et al., 2002; OH et al., 2005; FERNANDES et al., 2014; FLORES et al., 2015;

FENG et al., 2015; DIAZ-DE-CERIO et al., 2017; JIAO et al., 2017; BORAH et al.,

2019).

A análise da composição química do extrato das folhas revelou a presença de

aminoácidos, triterpenos e esteroides, ácidos, fenóis e saponinas (CUELLAR et al., 1984;

SANTOS et al., 2017; BORAH et al., 2019) e de importantes carotenoides

(MERCADANTE et al., 1999; SANTOS et al., 2017; BORAH et al., 2019). Estudos

revelam que os óleos essenciais extraídos das folhas de goiabeira apresentam inúmeras

atividades, dentre elas ação antimicrobiana contra vários micro-organismos, como

Candida albicans, e contra algumas bactérias como Staphylococcus aureus

(NASCIMENTO et al., 2000; SANTOS et al., 2017; BORAH et al., 2019). Também

possuem poder antioxidante, pela presença de vitaminas, carotenoides polifenóis e,

principalmente, de ácido ascórbico (SANTOS et al., 2017; BORAH et al., 2019).

Nas folhas de goiabeira, também foram encontrados ácidos voláteis, (E)-ácido

cinâmico e (Z)-3-ácido hexenoico (IDSTEIN et al., 1985) e ácidos graxos (OPUTE, 1978;

BORAH et al., 2019). No óleo essencial, foram encontrados vários compostos como α-

pineno, p-9-mentenol, trans-cariofileno, β-bisaboleno, α-humuleno, α-santaleno, d-

limoneno, óxido de cariofileno, eugenol, mirceno, aromadendreno, β-selineno e 1,8-

cineol (CRAVEIRO et al., 1981; PINO et al., 2001; SILVA, 2015; ARAIN et al., 2017;

BORAH et al., 2019), sendo que estudos comprovaram a eficácia do 1,8-cineol como

potente antimicrobiano e antifúngico. Dessa forma, no óleo essencial das folhas de

Psidium guajava existe um potencial antifúngico, antimicrobiano a ser estudado.

1.3. Bioatividade dos óleos essenciais

As plantas medicinais produzem uma variedade de compostos orgânicos, dentre

eles estão os metabólitos secundários, podendo citar os óleos essenciais (MARTINS et

al., 2010; MENDES et al., 2018; VAZQUEZ et al., 2019), que são considerados fontes

para o desenvolvimento de novos produtos naturais que são utilizados como

antibacterianos, anticancerígenos, analgésicos, sedativos, expectorantes, estimulantes,

antioxidantes, inseticidas, antiviral etc, e na composição de diversos medicamentos

(PEDROSA, 2016; RAMOS et al., 2017; SOUZA et al., 2017; MENDES et al., 2017;

KUMAR et al., 2019). Além de possuir atividade direta sobre fitopatógenos como

bactérias, nematoides e fungos, possuem ação indireta, ativando mecanismos de defesa

das plantas aos patógenos (MENDES et al., 2018; VAZQUEZ et al., 2019).

Denominado como “Quinta Essência” pelo suíço Paracelsus von Hohenheim, a

palavra óleo essencial foi utilizada para referenciar um componente ativo de uma droga

(GUENTHER, 1950). São compostos orgânicos de baixo peso molecular, muito voláteis

e sintetizados pelo metabolismo secundário das plantas, como uma forma de defesa contra

predadores e micro-organismos patogênicos. Podem ser obtidos de diversas partes da

planta, como folhas, raízes, caule, flores, frutos e sementes. Os óleos essenciais

apresentam qualidade, quantidade e composição de acordo com a região e clima que a

planta se encontra, do órgão coletado, da idade da planta, do método de extração do

mesmo, entre outros fatores (PEDROSA et al., 2016; KUMAR et al., 2019; SOUZA et

al., 2017; MENDES et al., 2018; VAZQUEZ et al., 2019).

Os constituintes dos óleos essenciais são uma mistura muito complexa em que

se tem a mistura de diversos componentes com concentrações distintas, distribuída em

quatro grandes grupos: terpenos, terpenoides, fenilpropenos e outros. A classe dos

terpenos e tepenoides são responsáveis geralmente pela alta atividade antifúngica e

antibacteriana dos óleos essenciais (DA SILVA et al., 2017; MENDES et al., 2018;

KUMAR et al., 2019; VAZQUEZ et al., 2019).

A habilidade dos óleos essenciais em se difundir através da parede celular e

membrana plasmática de patógenos é pela sua constituição hidrofóbica podendo alterar

estruturas de polissacarídeos, ácidos graxos e fosfolipídeos e com suas propriedades

antioxidantes, causando a lise celular tornam plausíveis a sua utilização contra estes. Os

compostos geralmente responsáveis por estas propriedades são: 1,8 cineol, timol,

carvona, carvacrol (SHAO et al., 2013; MARQUES, 2014; MENDES et al., 2017).

Atualmente, as doenças de plantas são responsáveis por relevantes perdas na

agricultura, podendo chegar a perdas entre 20 a 100% da safra anual. Tais perdas podem

reduzir o fornecimento de alimento, gerar produtos agrícolas de baixa qualidade, elevar

os preços e comprometer economicamente o produtor (CASTRO et al., 2016;

MACHADO, 2017).

Como tentativa para evitar as perdas causadas pelas doenças e pragas agrícolas,

o controle destas é realizado de maneira tradicional com o controle químico que nem

sempre são eficazes ou economicamente viáveis, além dos riscos que oferecem ao

ambiente e ao ser humano (MENDES et al., 2017). O uso indiscriminado e excessivo de

agrotóxicos gera crescente resistência de doenças e pragas aos mesmos, aumentando a

dependência de insumos químicos por parte de produtores (COUTINHO, 1996). A

redução na utilização de agrotóxicos no controle de doenças de plantas é uma necessidade

atual, econômica e ambiental (SCHWAN-ESTRADA et al., 2000), o que têm motivado

pesquisas a formulação de novos princípios ativos, formando um ciclo vicioso de alto

custo econômico e ambiental, contaminação e degradação de solos e águas, redução da

biodiversidade e desequilíbrios ecológicos, levando à insustentabilidade dos sistemas de

produção agrícola (COUTINHO, 1996; MENDES et al., 2017).

Frente a estes problemas, a necessidade de se preservar o ambiente tem instigado

o estudo de produtos naturais, visando um controle alternativo de fitopatógenos.

Metabólitos secundários que estão presentes no extrato bruto ou óleo essencial em plantas

medicinais podem desempenhar funções importantes em interações planta-patógeno,

através da ação antimicrobiana direta, ou indireta, ativando mecanismos de defesa das

plantas que venham a ser tratadas com estes compostos (SCHWAN-ESTRADA;

STANGARLIN, 2000; VAZQUEZ et al., 2019; MENDES et al., 2017; MENDES et al.,

2018). Os óleos essenciais são compostos biodegradáveis, seguros, viáveis e eficientes

no controle de fitopatógenos, e contribuem para a diminuição das perdas de produtividade

e redução dos custos de produção (COSER, 2018).

Dentre as plantas medicinais que apresentam características farmacológicas,

pode-se destacar a família Myrtaceae. Dentre as espécies, destacam-se a goiabeira, já que

suas folhas apresentam taninos, óleos essenciais, triterpenoides, β-sitosterol, flavonoides

fenóis, saponinas, carotenoides, lectinas, vitaminas, fibras e ácidos graxos, resinas,

glicosídeos etc (AJAIKUMAR et al., 2005; KARIAWASAM et al., 2017; SOUZA et al.,

2018; WELI et al., 2018).

A goiabeira é uma planta de fácil acesso podendo ser encontrada em quintais

residenciais e suas propriedades terapêuticas têm sido amplamente utilizadas na medicina

popular, como estimulante, anti-inflamatório, antibacteriano, antidiarreico, antitumoral,

antiproliferativo e seu óleo essencial extraído de suas folhas tem sido estudado como

poderoso antifúngico contra patógenos e fitopatógenos (SCGWAN-ESTRADA et al.,

2000; MANOSROI et al., 2006; WANG et al., 2017; QIN et al., 2017; SOUZA et al.,

2018; NGBOLUA et al., 2018; NEGREIROS et al., 2019).

A variabilidade na produção e teor de óleos essenciais é conhecida por ser

afetada por fatores ambientais tais como luz, temperatura, pluviosidade, vento, solo,

latitude, altitude, estações do ano (CHAGAS et al., 2011; WANG et al., 2017; HANIF et

al., 2018; NGBOLUA et al., 2018; NEGREIROS et al., 2019), como também fatores

genéticos. Assim sendo, a padronização da composição e dos efeitos de extratos vegetais

para o controle pragas e doenças, depende também do conhecimento deste metabolismo

em cada espécie a ser utilizada bem como o conhecimento das alterações na sua

composição como consequência das variações ambientais (WANG et al., 2017; HANIF

et al., 2018; NGBOLUA et al., 2018; NEGREIROS et al., 2019).

Estudos relatam a utilização e a eficiência do óleo essencial extraídos das folhas

de goiaba contra patógenos e fitopatógenos. Silva et al. (2019) relataram a utilização do

óleo essencial para o controle de bactérias cariogênicas do gênero Streptococcus e como

antiproliferativo em células tumorais indicando ação moderada contra as bactérias e uma

fonte promissora de compostos com atividade anticancerígena, pela alta quantidade de

terpenos em sua composição. Outros autores relataram atividade antimicrobiana,

antimutagênica, hipoglicêmica, antioxidante, antifúngica, repelente contra baratas,

moderado efeito repelente contra o mosquito Anopheles stephens Liston, atividade anti-

inflamatória, efeito larvicida sobre Aedes aegypti (THAVARA et al., 2007; RAJKUMAR,

JEBANESAN, 2007; RATTANACHAIKUNSOPON, PHUMKHACHORN, 2007;

GONÇALVES et al., 2008; CHEN et al., 2010; BUVANESWARI et al., 2011; SHRUTHI

et al., 2013; FLORES et al., 2015; KARIAWASAM et al., 2017; MENDES, 2017; QIN

et al., 2017; WANG et al., 2017; WELI et al., 2018; HANIF et al., 2018; NGBOLUA et

al., 2018; VAZQUEZ et al., 2019).

A bioatividade de óleos essenciais sobre fitopatógenos também tem sido

estudada segundo dados da literatura em que os autores constataram ação antimicrobiana,

antifúngica, bioinseticidas, pesticidas, bactericida de diversos óleos essenciais extraídos

de plantas medicinais e, ou aromáticas (ALCANTARA, 2015; RADUNZ, 2017;

TAVARES et al., 2018). O óleo essencial extraído das folhas de goiaba apresentou ação

antifúngica in vitro sobre o fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum, como relatado por Silva

et al. (2018). Portanto, justificam-se estudos visando sua possível utilização in vivo contra

este fungo fitopatogênico que ataca culturas de grande importância econômica como a

soja.

Mesmo com grande uso de plantas medicinais no Brasil, e o Domínio Cerrado

apresentar alta biodiversidade e 44% da flora endêmica, essas espécies vegetais são pouco

utilizadas, pela escassez de informações na literatura (CASTELO et al., 2010; PAULA et

al., 2012; CORTEZ et al., 2015; CHAVES et al., 2018). Apesar de haver alguns trabalhos

realizados até o momento, ainda há carência de estudos sobre as espécies de plantas

medicinais no Cerrado que podem produzir óleo essencial com alto potencial

antimicrobiano e antifúngico sobre fitopatógenos de importância econômica.

1.4. Emulsões

Sistemas termodinamicamente instáveis e heterogêneos compostos por dois

líquidos que não se misturam entre si, em que se tem uma das partes intimamente dispersa

na outra em forma de gotículas esféricas são denominados emulsões, que apresentam

tamanho entre 0,1 a 1 μm envolvidos por um dispersante (LI et al., 2012; LAM e

NICKERSON, 2013; PEREIRA e GARCIA-ROJAS, 2015; MILLÉO et al., 2019). As

emulsões são uma alternativa para incorporar, proteger e, ou liberar compostos insolúveis

ou pouco solúveis em água (PEREIRA e GARCIA-ROJAS, 2015; MILLÉO et al., 2019).

As emulsões podem ser divididas em emulsões do tipo simples e do tipo

múltiplas (PEREIRA e GARCIA-ROJAS, 2015). São do tipo simples quando a emulsão

contém água em óleo (A/O), e as gotículas de água estão dispersas no óleo ou quando se

tem óleo em água (O/A) e as gotículas de óleo estão dispersas na água. Já as emulsões do

tipo múltiplas, é quando há sistemas multicompartimentalizados, formados por três ou

mais fases, como água/óleo/água (A/O/A) ou óleo/água/óleo (O/A/O) (HILL, 1996;

BENICHOU et al., 2004; HERZI et al., 2014; PEREIRA e GARCIA-ROJAS, 2015;

LOPES, 2016). Na Figura 1, pode-se observar a estrutura de emulsões simples e

múltiplas.

Figura 1 - Esquema simplificado dos tipos de emulsões. Fonte: Própria Autora.

Para a estabilização das emulsões são utilizados os agentes tensoativos, que são

moléculas anfifílicas que têm como a finalidade promover essa estabilidade cinética da

mesma formando uma película na superfície da gotícula (PEREIRA, GARCIA-ROJAS,

2015; LOPES, 2016). A escolha desse tensoativo depende de seu EHL (Equilíbrio

Hidrófilo-Lipólifo). Para a formação de emulsões, são utilizados geralmente tensoativos

hidrofílicos com EHL ≥ 7,0 por terem maior afinidade para formar emulsões do tipo O/A

e com EHL ≤ 7,0 para formar emulsões do tipo A/O, fator que influencia diretamente a

estabilidade da emulsão a ser preparada (LOPES, 2016).

Os sistemas emulsionados são alternativas para liberação controlada de

compostos bioativos, como a de óleos essenciais que são substâncias lipofílicas muito

complexas, odoríferas, líquidos a temperatura ambiente, muito voláteis e fotodegradáveis

(BRUNETON, 1999; NERIO et al., 2010; ASBAHANI et al., 2015). Para a veiculação

destes compostos tão sensíveis como os óleos essenciais, a utilização de emulsões vem

aumentando, pois estas são capazes de propagar o óleo essencial sem desestabilizá-lo,

fornecendo maior biodisponibilidade dos compostos ativos tornando-o mais eficaz, como

também, postergando o seu efeito bioativo (PEREIRA, GARCIA-ROJAS, 2015; LOPES,

2016).

1.5. Mofo Branco - Sclerotinia sclerotiorum

A soja é uma cultura de grande importância econômica mundial, e as doenças

que lhe acometem são causadas por agentes bióticos e abióticos e são um dos principais

empecilhos para sua produção, podendo causar danos irreversíveis à cultura e gerar

grandes prejuízos aos agricultores. Para um controle eficaz dessas doenças, é necessário

que se adote um manejo integrado com ações em conjunto, como o controle cultural,

biológico, químico e genético (GUERRA, 2017; GOMES et al., 2017; RANJAN et al.,

2019).

Dentre as principais doenças que atacam a cultura da soja, o mofo branco é a

segunda mais importante, de difícil controle, ficando atrás apenas da ferrugem asiática.

Desde seu surgimento em lavouras de soja brasileiras, tem causado danos, mas teve sua

incidência aumentada deste a década de 1990, sendo que a infestação por escleródios

deste fitopatógeno pode estar entre 23 e 100%, reduzindo a produção em até 37%

(DILDEY et al., 2014; MEYER et al., 2014; GOMES, 2017). Áreas entre 100 e 300

hectares em Goiás, com incidência desta doença superior a 50%, são facilmente

detectadas (FILHO, 2012; GUERRA, 2017; MACHADO et al., 2017)

O mofo branco ou podridão branca da haste que acomete a soja é causado pelo

fungo Sclerotinia sclerotiorum, pertencente à classe dos Ascomicetos, subclasse

Discomicetos, Ordem Helotiales, à família Sclerotiniaceae e ao gênero e espécie

Sclerotinia sclerotiorum. Este é um fungo de solo, necrotrófico, cosmopolita e

inespecífico que pode provocar perdas em diversas espécies, entre monocotiledôneas e

dicotiledôneas (BOLAND, HALL, 1994). O ataque deste patógeno ocorre no estádio de

floração da cultura, pela presença no solo dos escleródios que são as estruturas de

resistência, com tamanho de 1 a 30 mm de comprimento, geradas por este fungo e que

permanecem viáveis no solo por um longo período de tempo nas condições mais adversas

de temperatura, umidade, luz e nutrientes, pela presença de melanina em sua estrutura,

assim conservando intacto seu poder patogênico (MC LEAN, 1958; PAVAN et al., 1997;

KUHN, 2006; XIMENES, 2013; GOMES, 2017; GUERRA, 2017; WANG et al., 2018).

Quando as condições de umidade (acima de 75%) e temperatura (13 a 22 ºC)

estão ideais e na presença de um hospedeiro, os escleródios germinam e se reproduzem

por forma miceliogênica (o próprio escleródio produz o micélio que infecta o hospedeiro)

ou capogênica (ocorre a produção de apotécios que produzirão os ascósporos que se

disseminam até o hospedeiro causando a infecção) (MC LEAN, 1958; PURDY, 1979;

GERALDINE et al., 2010; GOMES, 2017; GUERRA, 2017; HU et al., 2018).

A doença mofo branco provoca sintomatologia que se caracteriza pelas lesões

encharcadas coberta por um micélio variando de coloração de branca a parda

(pardacenta), septado, muito ramificado de aspecto cotonoso na superfície dos órgãos

atacados (Figura 3) (DILDEY et al., 2014; NA et al., 2018; JIA et al., 2019). Após a

infecção e a formação do micélio, este produz suas estruturas de resistência que são

inicialmente brancos e quando se formam totalmente, apresentam coloração preta e

estrutura rígida e são denominados escleródios que se instalam tanto na superfície, como

no interior das hastes e vagens infectadas, sementes infectadas tem aparência opaca e de

baixo peso (Figura 4) (DILDEY et al., 2014; GUERRA, 2017; NA et al., 2018; LIU et al.,

2019).

Figura 2 - Sintomas e sinais de mofo branco em hastes de soja, causados por Sclerotinia sclerotiorum.

Fonte: Arquivo pessoal

Figura 3 - Estrutura dos escleródios do mofo branco. Fonte: Arquivo pessoal.

A soja é atacada pelo mofo branco, principalmente em seu estádio de floração

plena e no início da formação das vagens, mas pode ser atacada em qualquer estádio de

seu desenvolvimento. O que favorece sua infestação é a alta densidade de plantio, com

condições favoráveis para os escleródios germinarem e, por pressão mecânica, via

apressório e, ou secreção de enzimas e ácido oxálico alteram o funcionamento dos

estômatos e as hifas penetram o hospedeiro. Após ocorrer a infecção nas flores de soja,

os sintomas passam para as axilas das folhas, ramos e vagens, podendo afetar e levar a

morte toda a planta, pois, após o aparecimento das lesões aquosas estas evoluem para

podridão mole dos tecidos com crescimento do micélio branco cotonoso, assim podendo

ocorrer a formação dos escleródios nas hastes e vagens da soja fora ou em seu interior,

acarretando na murcha, seca e morte da planta (MC LEAN, 1958; ABAWI, GROGAN,

1979; PURDY, 1979; BOLAND, HALL, 1994; ALMEIDA et al., 2005; DILDEY et al.,

2014; WUTZKI, 2017; NA et al., 2018; LIU et al., 2019).

A erradicação do mofo branco e seus escleródios uma vez instalados em uma

área de cultivo é muito difícil. Desta forma, o melhor método de controle é evitar sua

infestação na área de cultivo de soja. Porém, uma vez detectada a infestação deve-se

tomar algumas medidas de manejo, tais como rotação de cultura, aplicação de produtos

biológicos nas culturas exploradas, maior espaçamento entrelinhas, menor densidade de

semeadura, cobertura do solo com palhada, época de semeadura desfavorável ao mofo

branco e escolha por variedades com resistência parcial ao patógeno. Além disso,

recomenda-se a aplicação de fungicidas específicos para seu controle, sendo que este

último, pela sua intensiva utilização indiscriminada, tem aumentado a resistência do

patógeno aos mesmos (JACCOUD-FILHO et al., 2016; WUTZKI et al., 2016; BERGER-

NETO et al., 2017; NA et al., 2018; ZANATTO et al., 2018).

Os fungicidas para o mofo branco podem prevenir a infecção pelos ascósporos,

mas pela alta densidade de plantio, podem não penetrar o dossel da cultura e o controle

da doença não ser efetivo. Com o intensivo uso de fungicidas químicos industrializados

convencionais, tem ocorrido contaminação do solo, dos alimentos, da água e do ambiente

e também aumento da resistência do fitopatógeno aos mesmos (XIE et al., 2011; MEYER

et al., 2015; WUTZKI et al., 2016). Isto tem favorecido a busca por métodos alternativos

de controle desta doença, principalmente, com produtos vegetais, como óleos essenciais

com propriedades antifúngicas que sejam eficientes e com reduzido ou isento impacto

ambiental negativo (DILDEY et al., 2014, COSER, 2018).

Diversos estudos têm comprovado o efeito de metabólitos secundários, obtidos

de plantas, como os óleos essenciais, demonstrando seu potencial antifúngico a

fitopatógenos, incluindo S. clerotiorum (STANGARLIN, 1999; FERRAZ et al., 2003;

ATTI-SANTOS, 2010; PANSERA et al., 2013). Por exemplo, foi comprovada a ação

antifúngica do óleo essencial de Azadirachta indica, Melaleuca arternifolia, Pongamia

glabra, Piper aduncum, Psidium guajava, Cinnamomum sp., Cymbopogon sp., Panax

ginseng, Salvia officinalis, entre outros sobre o mofo branco (MARTINS et al., 2010;

GARCIA et al., 2012; PANSERA et al., 2013 SILVA et al., 2018; VALADARES et al.,

2018; MORAES et al., 2018).

Tendo em vista que o mofo branco é uma doença importante para a cultura da

soja, no Brasil, justifica-se a busca por métodos alternativos de controle. O uso de óleo

essencial, extraído das folhas de Psidium guajava, no controle deste fitopatógeno, motiva

o desenvolvimento de pesquisas, já que sua eficácia in vitro foi comprovada.

1.6. Referências Bibliográficas

ABAWI, G.S.; GROGAN, R.G. Epidemiology of diseases caused by Sclerotinia species.

Phytopathology, v.69, p.899-904. 1979.

AJAIKUMAR, K. B.; ASHEEF, M.; BABU, B. H.; PADIKKALA, J. The inhibition of

gastric mucosal injury by Punica granatum L.(pomegranate) methanolic extract. Journal

of Ethnopharmacology, v. 96, p.171,2005.

ALCANTARA, J. M. Composição química e potencial biológico dos óleos essenciais de

Annonaceae dos campi INPA e UFAM. 2015. 151f. Tese (Doutorado em Química)

Universidade Federal do Amazonas – AM, 2015.

ALMEIDA, C. E.; KARNIKOWSKI, M. G.; FOLETO, R.; BALDISSEROTTO, B.

Revista Saúde Pública, v. 29, p. 428-33, 1995.

AMORIM, A. G. N.; SOUZA, J. M. T.; SANTOS, R. C.; GULLÓN, B.; OLIVEIRA, A.;

SANTOS, L. F. A. VIRGINO, A. L. E.; MAFUD, A. C.; PETRILLI, H. M.;

MASCARENHAS, Y. P.; DELERUE-MATOS, C.; PINTADO, M. E.; LEITE, J. R. S. A.

HPLC-DAD, ESI - MS/MS and NMR of lycopene isolated from P. guajava L. and its

biotechnological applications. European Journal of Lipid Science and Technology, 2017.

ARAIN, A., SHERAZI, S. T. H., MAHESAR, S. A., SIRAJUDDIN. Spectroscopic and

chromatographic evaluation of solvent extracted guava seed oil. International Journal of

Food Properties, v. 20, p. 556–563, 2017.

ASBAHANI, A. E., MILADI, K., BADRI, W., SALA, M., ADDI, E. H. A.,

CASABIANCA, H., ELAISSARI, A. Essential oils: from extraction to encapsulation.

International Journal of Pharmaceutics, v. 483, p. 220–243, 2015.

ATTI-SANTOS, A.C.; ROSSATO, M.; SERAFINI, L.A.; BUENO, M.; CRIPPA, L.B.;

SARTORI, V.; DELLACASSA, E.; MOYNA, P. Efeito fungicida dos óleos essenciais de

Schinus molle L. e Schinus terebinthifolius Raddi, Anacardiaceae, do Rio Grande do Sul.

Brazilian Journal of Pharmacognosy. v. 20, p.154-159, 2010.

BANDEIRA, J.M; BARBOSA, F. F.; BARBOSA, L. M. P.; RODRIGUES, I. C. S.;

BACARIN, M. A.; PETERS, J. A.; BRAGA, E. J. B. Composição do óleo essencial de

quatro espécies do gênero Plectranthus. Revista Brasileira de Plantas Medicinais,

v.13, 2011.

BATISTA, P. F., LIMA, M. A. C., TRINDADE, D. C. G., ALVES, R. E. Quality of

different tropical fruit cultivars produced in the Lower Basin of the São Francisco Valley.

Revista Ciência Agronômica, v. 46, n. 1, p. 157-164, 2015.

BERGER-NETO, A.; JACCOUD-FILHO, D.D.S.; WUTZKI, C.R.; TULLIO, H.E.;

PIERRE, M.L.C.; MANFRON, F.; JUSTINO, A. Effect of spray droplet size, spray

volume and fungicide on the control of white mold in soybeans. Crop Protection, v. 92, p.

190-197, 2017.

BEGUM, S.; HASSAN, S. I.; SIDDIQUI, B. S.; SHAHEEN, F.; GHAYUR, M. N.;

ANWAR H. GILANI, A. H. Triterpenoids from the leaves of Psidium guajava.

Phytochemistry, v. 61, p. 399 - 403, 2002.

BENICHOU, A.; ASERIN, A.; GARTI, N. Double emulsions stabilized with hybrids

natural polymers for entrapment and slow release of active matters. Advances in Colloid

and Interface Science, v.108/109, p.29-41, 2004.

BOLAND, G.J.; HALL, R. Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum. Canadian

Journal Plant Pathology, v.16, p. 93–108, 1994.

BORAH, A., PANDEY, S. K., HALDAR, S., LAL, M. Chemical Composition of Leaf

Essential Oil of Psidium guajava L. from North East India. Journal of Essential Oil

Bearing Plants, v. 22, p. 248-253, 2019.

BRUNING, M. C. R.; MOSEGUI, G. B. G.; VIANNA, C. M. M., A utilização da

fitoterapia e de plantas medicinais em unidades básicas de saúde nos municípios de

Cascavel e Foz do Iguaçu - Paraná: a visão dos profissionais de saúde. Ciência e Saúde

Coletiva, v.17, n.10, 2012.

BRUNETON, J. 1999. Pharmacognosy: Phytochemistry, Medicinal Plants. Intercept

Limited, 1999.

BUVANESWARI, S.; RAADHA, C. K.; KRISHNAVENI, N.; JAYASHREE, S. In-vitro

antimicrobial activity of Psidium guajava against clinically important strains, European

Journal of Legal Studies, v.1, p. 14-22, 2011.

CARAMÊS, E. T. S.; ALAMAR, P. D.; POPPI, R. J.; PALLONE, J. A. L. Quality control

of cashew apple and guava nectar by near infrared spectroscopy. Journal of Food

Composition and Analysis, v. 56, p. 41-46, 2017.

CARNEIRO, F. M., M. J. P. DA SILVA, L. L. BORGES, L. C. ALBERNAZ, J. D. P.

COSTA. Tendências dos estudos com plantas medicinais no brasil. Revista Sapiência:

sociedade, saberes e práticas educacionais, v. 3, p. 44-75, 2015.

CASTELO, A. V. M.; MENSEZZI, C. H. S. D.; RESCK, I. S. Rendimento e análise

espectroscópica (RMN 1H, 13C; IV) da composição química dos óleos essenciais de

quatro plantas do cerrado. Cerne, v.16, p. 573-584, 2010.

CASTRO, L.H.S., FIGUEIRO, A. A., NOGUEIRA, A. P., CLOUGH, S. J., JULIATTI,

F. C. Resistance of soybean genotypes to Sclerotinia sclerotiorum isolates in different

incubation environments. Genetics and Molecular Research, v. 15, n. 4, p. 1-13, 2016.

CHAGAS, J. H.; PINTO, J. E. B. P.; BERTOLUCCI, S. K. V.; SANTOS, F. M., Produção

de biomassa e teor de óleo essencial em função da idade e época de colheita em plantas

de hortelã-japonesa, Acta Scientiarum - Agronomy, v. 33, p. 327-334, 2011.

CHAVES, M. R. V., OLIVEIRA, G. M. G., NETO, M. J., NEVES, F. M. L., BARBOSA,

I. M. L. POTENCIAL FUNGICIDA DE PLANTAS MEDICINAIS DO CERRADO DA

COSTA LESTE DO ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL. Resma, v. 6, n.1, 2018.

CHEN, K.C.; PENG, C.C.; CHIU, W.T.; CHENG, Y.T.; HUANG, G.T.; HSIEH, C.L.

Action mechanism and signal pathways of Psidium guajava L. aqueous extract in killing

prostate cancer LNCaP cells, Nutrition and Cancer, v. 62, p. 260-270, 2010.

CORTEZ, L. E. R., YAMAGUCHI, M. U., CORTEZ, D. A. G., & PESCP, D. C. S.

Avaliação da atividade antifúngica dos óleos essencias de Lippia alba (Mill.) NE Brown

(Verbenaceae) e Cymbopogon citratus (DC) Stapf (Poaceae). Mundo saúde (Impr.), v. 39,

n. 4, p. 433-440, 2015.

COSER, E. Potencial de óleos essenciais no controle do fungo Sclerotinia rolfsii in vitro

e em plantas de tomate. 2018. 39p. Trabalho de conclusão de curso – Agronomia-

Universidade Federal de Santa Catarina – SC, 2018.

COUTINHO, H. L. C. Diversidade microbiana e desenvolvimento sustentável:

diversidade microbiana e agricultura sustentável. In: WORKSHOP SOBRE

BIODIVERSIDADE: PERSPECTIVAS E OPORTUNIDADES TECNOLÓGICAS,

1996, Campinas, SP.

CRAVEIRO, A. A.; FERNANDES, A. G.; ANDRADE, C. H. S.; MATOS, F. J. A.;

ALENCAR, J. W.; MACHADO, M. I. L. Óleos essenciais de plantas do Nordeste. [S. l.]:

UFC, 1981. 210 p, 1981.

CUELLAR, A. C.; LARA, R. A.; ZAYAS, J. P. Psidium guajava L. Tamizaje fitoquímico

y estudio del aceite esencial. Revista Cubana de Farmacia, v. 18, p. 92-99, 1984.

DÍAZ-DE-CERIO, E.; GÓMEZ-CARAVACA, A. M.; VERARDO, V.; FERNÁNDEZ-

GUTIÉRREZ, A.; SEGURA-CARRETERO, A. Determination of guava (Psidium

guajava L.) leaf phenolic compounds using HPLC-DAD-QTOF-MS. Journal of

Functional Foods, v. 22, p. 376 - 388, 2016.

DILDEY, O.D.F.; BARBIAN, J.M.; GONÇALVES, E.D.V.; BROETTO, L.; ETHUR,

L.Z.; KUHN, O.J.; BONETT, L.P. Inibição do crescimento in vitro de Sclerotinia

sclerotiorum, causador de mofo branco, por isolados de Trichoderma spp. Revista

Brasileira de Biociências, v. 12, p. 132-136, 2014.

ETEMADIPOOR, R., RAMEZANIANA, A., DASTJERDIB, A. M., SHAMOLIB, M.

The potential of gum arabic enriched with cinnamon essential oil for improving the

qualitative characteristics and storability of guava (Psidium guajava L.) fruit. Scientia

Horticulturae, v. 251, p. 101-107, 2019.

FENG, X.; WANG, Z.; MENG, D.; LI, X. Cytotoxic and antioxidant constituents from

the leaves of Psidium guajava. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, v. 25, p.

2193–2198, 2015.

FERNANDES, M. R. V.; DIAS, A. L. T.; CARVALHO, R. R.; SOUZA, C. R. F.;

OLIVEIRA, W. P. Antioxidant and antimicrobial activities of Psidium guajava L. spray

dried extracts. Industrial Crops and Products, v. 60, p. 39 – 44, 2014.

FERRAZ, L.C.L., BERGAMIN, F. A., AMORIN, L.; NASSER, L.C.B. Viabilidade de

Sclerotinia sclerotiorum após a solarização do solo na presença de cobertura morta.

Fitopatologia Brasileira, v. 28, p. 17-26, 2003.

FILHO, D.S.J. Globalizando o Problema, Fundamentando Soluções. In: ENCONTRO

INTERNACIONAL DE MOFO BRANCO, 1., 2012, Ponta Grossa. Anais do 1º Encontro

Internacional de Mofo Branco. Ponta Grossa: UEPG, 82 p., 2012.

FLORES, G.; WU, S.; NEGRIN, A.; KENNELLY, E. J. Chemical composition and

antioxidant activity of seven cultivars of guava (Psidium guajava) fruits. Food Chemistry,

v. 170, p. 327 - 335, 2015.

FREITAS, S. T. F. POTENCIAL DE EXTRATOS DE PLANTAS NO CONTROLE DE

INSETOS-PRAGA: UM LEVANTAMENTO CIENCIOMÉTRICO E ANÁLISES DE

EFEITOS BIOLÓGICOS...], 2018. 88 p. Dissertação (Mestrado em BIODIVERSIDADE

E CONSERVAÇÃO) -- Instituto Federal Goiano - Campus Rio Verde, GO, 2018.

GARCIA, R.A.; JULIATTI, F.C.; BARBOSA, K.A.G.; CASSEMIRO, T.A. Antifungal

activity of vegetable oils and extracts against Sclerotinia sclerotiorum. Bioscience

Journal, v. 28, p. 48-57, 2012.

GERALDINE, A.M.; LOBO JUNIOR, M.; MARCELI, H. Influência da temperatura e da

umidade do solo na germinação carpogênica e parasitismo de escleródios de Sclerotinia

sclerotiorum. In: WORKSHOP DE EPIDEMIOLOGIA DE DOENÇAS DE PLANTAS,

3., 2010, Bento Gonçalves. Anais... Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho, p.75, 2010.

GOMES, R. S. S., ARAUJO, A. E., NASCIMENTO, L. C., FEITOZA, E. D. A.,

DEMARTELAERE, A. C. F. Caracterização da Sclerotinia sclerotiorum, transmissão e

qualidade fisiológica em sementes de algodoeiro. Acta Iguazu, v.6, p. 105-113, 2017.

GONCALVES, F.A.; ANDRADE NETO, M.; BEZERRA, J. N. S.; MACRAE, A.;

SOUSA, O. V.; FONTELES-FILHO, A. A.; VIEIRA, R. H.S.F. Antibacterial activity of

guava, Psidium guajava Linnaeus, leaf extracts on diarrhea-causing enteric bactéria

isolated from seabob shrimp, Xiphopenaeus kroyeri (HELLER). Revista do Instituto de

Medicina Tropical de São Paulo, v. 50, p.11-15, 2008.

GONZAGA NETO, L.; SOARES, J.M. Goiaba para exportação: aspectos técnicos da

produção. Brasília: EMBRAPA-SPI, 1994. 49 p.

GUENTHER, E. The essential oils: Individual essential oils of the plant families

Gramineae, Lauraceae, Burseraceae, Myrtaceae, Umbelliferae and Geraniaceae. Van

Nostrand, v. 4, 1950.

GUERRA, R. C. Patogenicidade de isolados de Sclerotinia sclerotiorum sobre genótipos

de soja. 2017. 56p. Dissertação (Mestrado em Agronomia), Universidade Federal de Santa

Maria –SC, 2017.

HAGSTRUM, D. W.; PHILLIPS, T. W. Evolution of stored-product entomology:

protecting the world food supply. Annual Review of Entomology, v. 62, p. 379-397, 2017.

HANIF, M.U.; HUSSAIN, A. L.; CHATHA, S. A. S.; KAMAL, G. M.; AHMAD, T.

Variation in composition and bioactivities of essential oil from leaves of two different

cultivars of Psidium guajava L. Journal of Essential Oil Bearing Plants, v. 21, p. 65-76,

2018.

HERZI, S.; W. ESSAFI, S.; BELLAGHA, F.; LEAL-CALDERON. Influence of the inner

droplet fraction on the release rate profiles from multiple W/O/W emulsions. Colloids and

Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v. 441, p. 489-495, 2014.

HILL, S. E. Emulsion. In: HALL, G. M. Methods of testing protein functionality. London:

BlackieAcademic & Professional, 1996. Cap.6, p.153-185, 1996.

HU, S.; ZHANG, J.; ZHANG, Y.; YE, S.; ZHU, F. Baseline sensitivity and toxic actions

of boscalid against Sclerotinia sclerotiorum. Crop Protection, v.110, p.83-90, 2018.

IDSTEIN, H.; BAUER, C.; SCHREIER, P. Volatile acids in tropical fruits: cherimoya

(Annona cherimolia, Mill.), guava (Psidium guajava, L.), mango (Mangifera indica, L.,

var. Alphonso), papaya (Carica papaya, L.). Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung

und -Forschung, v. 180, p. 394-397, 1985.

JACCOUD-FILHO, D. S.; SARTORI, F.F.; MANOSSO-NETO, M.; VRISMAN, C.M.;

PIERRE, M.L.C.; BERGER-NETO, A.; TÚLLIO, H.E.; JUSTINO, A.; FONSECA, A.;

ZANON, S. Influence of row spacing and plant population density on management of

“white mould” in soybean in southern Brazil. Australian Journal of Crop Science, v. 10,

p. 161-168, 2016.

JIA, W.; HU, C.; XU, J.; MING, J.; ZHAO, Y.; CAI, M.; SUN, X.; LIU, X.; ZHAO, X.

Dissolved organic matter derived from rape straw pretreated with selenium in soil

improves the inhibition of Sclerotinia sclerotiorum growth. Journal of Hazardous

Materials, v. 369, p. 601-610, 2019.

JIAO, Y.; ZHANG, M.; WANG, S.; YAN, C. Consumption of guava may have beneficial

effects in type 2 diabetes: A bioactive perspective. International Journal of Biological

Macromolecules, v. 101, p. 543 - 552, 2017.

KARIAWASAM, K. W. J. C.; PATHIRANA, R. N.; RATNASOORIVA, W. D.;

HANDUNNETTI, S.; ABEYSEKERA, W. P. K. M. Phytochemical profile and in vitro

anti-inflammatory activity of aqueous leaf extract of Sri Lankan variety of Psidium

guajava L. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v. 6, p. 22–26, 2017.

KUHN, O. J.; PORTZ, R. L.; STANGARLIN, J. R.; DEL ÁGUILA, R. M.; SCHWAN-

ESTRADA, K. R. F.; FRANZENER, G. Efeito do extratoaquoso de cúrcuma (Curcuma

longa) em Xanthomonas axonopodis pv. manihotis. Ciências Agrárias, v. 27, p.13-20,

2006.

KUMAR, V.; VARSHA, S.; RANI, B.; TUSHAR, K.; SHIVANJALI, K.; NARENDRA,

K. Phytochemical profile, anti-oxidant, anti-inflammatory, and antiproliferative activities

of Pogostemon deccanensis essential oils. 3Biotech, v.9, p.31, 2019.

LAM, R. S. AND M. T. NICKERSON. Food proteins: a review on their emulsifying

properties using a structure–function approach. Food Chemistry v. 141, p. 975-984, 2013.

LANDRUM, L.R., KAWASAKI, M.L. The genera of Myrtaceae in Brazil: na illustrated

synoptic treatment and identification Keys. Brittonia, v. 49, p. 509-536, 1997.

LI, Y., J. ZHENG, H. XIAO, D. J. MCCLEMENTS. Nanoemulsion-based delivery

systems for poorly water-soluble bioactive compounds: Influence of formulation

parameters on polymethoxyflavone crystallization. Food Hydrocolloids v. 27, p. 517-528,

2012.

LIMA, R.K.; CARDOSO, M.G.; ANDRADE, M.A.; NASCIMENTO, E.A.; MORAIS,

S.L.; NELSON, D.L. Composition of the essential oil from the leaves of tree domestic

varieties and one wild variety of the guava plant (Psidium guajava L., Myrtaceae)

Brazilian Journal of Pharmacognosy v. 20, p. 41-44, 2010.

LIU, S.; JIANG, J.; CHE, Z.; TIAN, Y.; CHEN, G. Baseline sensitivity and control

efficacy of fluazinam against Sclerotinia sclerotiorum in Henan Province, China. Journal

of Phytopathology, v.167, p. 75-77, 2019.

LOPES, P. Q. Desenvolvimento de sistemas emulsionados para veiculação dos óleos

essenciais de Eucalyptus globulus, Schinus terebinthifolius e Plectranthus amboinicus.

2016, 183f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas). Universidade Federal de

Pernambuco – PE, 2016.

LOZOYA, X.; REYES-MORALES H.; CHÁVEZ-SOTO M. A.; MARTÍNEZGARCÍA

M. DEL C.; SOTO-GONZÁLEZ Y.; DOUBOVA, S. V. Intestinal anti-spasmodic effect

of a phytodrug of Psidium guajava folia in the treatment of acute diarrheic disease Journal

of Ethnopharmacology, v. 83, p. 19-24, 2002.

MACHADO, B. Q. V. Diversidade genética em soja com diferentes níveis de resistência

ao Sclerotinia sclerotiorum, correlações, análise de trilha e população de plantas. 2017.

103 p. Dissertação (Mestrado em Agronomia/Fitotecnia) – Universidade Federal de

Uberlândia – MG. 2017.

MANOSROI, J., DHUMTANOM, P., MANOSROI, A., Anti-proliferative activity of

essential oil extracted from Thai medicinal plants on KB and P388 cell lines. Cancer

Letters, v. 235, p.114-120, 2006.

MARQUES, J. S. Compostos ativos de folhas de Eugenia uniflora e seus efeitos contra

mofo branco causado por Sclerotinia sclerotiorum em plantas de feijoeiro. 2014. 81p.

Dissertação (Mestrado em Biologia) – Universidade Federal de Goiás – GO. 2014.

MARTINS, A. G. L. A.; NASCIMENTO, A. R.; FILHO, J. E. M.; FILHO, N. E. M.;

SOUZA, A. G.; ARAGÃO, N. E.; SILVA, D. S. V. Atividade antibacteriana do óleo

essencial do manjericão frente a sorogrupos de Escherichia coli enteropatogênica isolados

de alfaces. Ciência Rural, v. 40, p.791-1796, 2010.

MC LEAN, D. Role of dead flower parts in infection by certain crucifers by Sclerotinia

sclerotiorum. Plant Disease, v. 42, p. 663–666, 1958.

MENDES, L. A., MARTINS, G. F., VALBON, W. R., SOUZA, T. S., MENINI, L.,

FERREIRA, A., FERREIRA, M. F. S. Larvicidal effect of essential oils from Brazilian

cultivars of guava on Aedes aegypti L. Industrial Crops and Products, v. 108, p. 684–689,

2017.

MENDES, L. A., SOUZA, T. S., MENINI, L., GUILHEN, J. H. S., BERNARDES, C.

O., FERREIRA, A., FERREIRA, M. F. S. Spring alterations in the chromatographic

profile of leaf essential oils of improved guava genotypes in Brazil. Scientia Horticulturae,

v. 238, p. 295–302, 2018.

MENEZES, J. S. Ação Antimicroniana in vitro de Psidium guajava L. contra

Staphylococcus aureus isolados de leite mastítico. 2013. 64 f. Dissertação (Mestrado em

Ciência Animal) – Universidade José do Rosário Vellano, Alfenas- MG. 2013.

MERCADANTE, A. Z.; STECK, A.; PFANDER, H. Carotenoids from guava (Psidium

guajava L.): isolation and structure elucidation. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, v. 47, p. 145-15, 1999.

MEYER, M.C.; et al. Eficiência de fungicidas para controle de mofo-branco (Sclerotinia

sclerotiorum) em soja, na safra 2014/2015: resultados sumarizados dos 24 ensaios

cooperativos. Londrina: Embrapa Soja, 2015. 4 p. (Embrapa Soja. Circular Técnica, 114).

MILLÉO, J., ANTUNES, C. H., PETTRES, E. B., AYUB, R. A., FARAGO, P. V. Óleo

essencial de citronela (Poaceae) e seus componentes para controle do brasileirinho

(Coleoptera: Chrysomelidae) em olerícolas. Entomo Brasilis, v. 12, p. 06-10, 2019.

MORAES, S. P. C. B.; MORAES, W. B.; MORAES, W. B.; CAMARA, G. R.; MACIEL,

K. S.; LIMA, P. A. M.; FERREIRA, A.; ALEXANDRE, R. S.; LOPES, J. C. Cinnamon

and citronella essential oils in the in vitro control of the fungi Aspergillus sp. and

Sclerotinia sclerotiorum. African Journal of Agricultural Research, v. 13, p. 1811-1815,

2018.

NA, R.; LUO, Y.; BO, H.; ZHANG, J.; JIA, R.; MENG, Q.; ZHOU, H.; HAO, J.; ZHAO

J. Responses of sunflower induced by Sclerotinia sclerotiorum infection. Physiological

and Molecular Plant Pathology, v.102, p.113-121, 2018.

NASCIMENTO, G. G. F.; JULIANA LOCATELLI, J.; FREITAS, P. C.; SILVA, G. L.

Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria,

Brazilian Journal of Microbiology, v. 31, p. 247-256, 2000.

NEGREIROS, P. S.; COSTA, D. S.; SILVA, V. G.; LIMA, I. B. C.; NUNES, D. B.;

SOUSA, F. B. M.; ARAUJO, T. S. L.; MEDEIROS, J. V. R.; SANTOS, R. F.;

OLIVEIRA, R. C. M. Antidiarrheal activity of α-terpineol in mice. Biomedicine and

Pharmacotherapy, v. 110, p. 631–640, 2019.

NERIO, L.S., OLIVERO-VERBEL, J., STASHENKO, E. Repellent activity of essential

oils: a review. Bioresource and Technology, v. 101, p. 372–378, 2010.

NGBOLUA, K., LUFULUABO, G.L., MOKE, L.E., BONGO, G.N., LIYONGO, C.I.,

ASHANDE, C.M., SAPO, B.S., ZOAWE, B.G., MPIANA, P.T. A review on the

phytochemistry and pharmacology of Psidium guajava L. (Myrtaceae) and future

direction. Discovery Phytomedicine, v. 5, p. 7–13, 2018.

NORA, C. D.; MULLER, C. D.; BONA, G. S.; RIOS, A. O.; HERTZ, P. F.; JABLONSKI,

A.; JONG, E. V.; FLÔRES, S. H. Effect of processing on the stability of bioactive

compounds from red guava (Psidium cattleyanum Sabine) and guabiju (Myrcianthes

pungens). Journal of Food Composition and Analysis, v. 34, p.18-25, 2014.

NUNES, J. C.; LAGO, M. G.; CASTELO-BRANCO, V. N.; OLIVEIRA, F. R.;

TORRES, A. G.; PERRONE, D.; MONTEIRO, M. Effect of drying method on volatile

compounds, phenolic profile and antioxidant capacity of guava powders. Food Chemistry,

v. 197, p. 881-890, 2016.

OH, W. K.; LEE, C. H.; LEE, M. S.; BAE, E. Y.; SOHN, C. B.; OH, H.; KIM, B. Y.;

AHN, J. S. Antidiabetic effects of extracts from Psidium guajava. Journal of

Ethnopharmacology, v. 96, p. 411 - 415, 2005.

OLIVEIRA, M. L. F., 2018. Aspectos reprodutivos da goiabeira (Psidium guajava) e de

araçazeiros (Psidium guineense e Psidium cattleyanum) visando o desenvolvimento de

cultivares. Tese (Doutorado em Agronomia), Universidade Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro – RJ, 2018.

OPUTE, F. I. The component fatty acids of Psidium guajava seed fats. Journal of Science

and Food Agriculture, London, v. 29, p. 737-738, 1978.

PANSERA, M.R., PAULETTI, M., FEDRIG, C.P., SARTORI, V.C. and RIBEIRO,

R.T.S. Utilization of essential oil and vegetable extracts of Salvia officinalis L. in the

control of rot sclerotinia in lettuce. Applied Research and Agrotecnology, v. 6, p. 83-88,

2013.

PAULA, J. A. M.; SILVA, M. R. R.; COSTA, M. P.; DINIZ, D. G. A.; ALVES, F. S. F.;

COSTA, E. A.; LINO, R. C.; PAULA, J. R. Phytochemical analysis and antimicrobial,

antinociceptive, and anti-inflammatory activities of two chemotypes of pimenta

pseudocaryophyllus (myrtaceae), evidence-based complementary and alternative

medicine, p.15, 2012.

PAVAN, M.A.; KUROZAWA, C. Doenças da alface (Lactuca sativa). KIMATI, H.;

AMORIN, L.; BERGAMIN, F.A.; CAMARGO, L.E.A.; REZENDE, J.A.M. Manual de

fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. São Paulo: Ed Agronômica Ceres, 1997.

v.2, cap. 4, p.18-25, 1997.

PEDROSA, F. P. C. PedBioatividade de óleos essenciais frente a bactérias fitopatogênicas

(Solanum lycopersicum L.) 2016. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Alimentos) –

Universidade Estadual de Campinas-SP, 2016.

PEREIRA, L. J. B., ROJAS, E. E. G. Multiple emulsions: formation and application in

microencapsulation of bioactive componentes. Ciência Rural, v.45, p.155-162, 2015.

PEREIRA, Z. V.; MUSSURY, R. M.; ALMEIDA, A. B.; SANGALLI, A. Medicinal

plants used by Ponta Porã community, Mato Grosso do Sul State. Acta Scientiarum -

Biological Sciences, v. 31, p. 293-299, 2009.

PIGNATTI, W. A., SOUZA E LIMA, F. A. N., LARA, S. S., CORREA, M. L. M.,

BARBOSA, J. R., LEAO, L. H. C., PIGNATTI, M. G. Spatial distribution of pesticide

use in Brazil: a strategy for Health Surveillance. Ciência & Saúde Coletiva, v. 22, p. 3281-

3293, 2017.

PINO, J. A.; AGUERO, J.; MARBOT, R.; FUENTES, V. Leaf oil of Psidium guajava L.

from Cuba. Journal of Essential Oil Research, v. 31, p. 61-62, 2001.

PURDY, L.H. Sclerotinia sclerotiorum: history, diseases and symptomatology, host

range, geographie distribution, and impact. Phytopathology, v. 69, p. 875-880, 1979.

QIN, X. J., YU, Q., YAN, H., KHAN, A., FENG, M. Y., LI, P. P., HAO, X. J., AN, L.

K., LIU, H. Y. Meroterpenoids with Antitumor Activities from Guava (Psidium guajava).

Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 65, p. 4993−4999, 2017.

RAJKUMAR, S.; JEBANESAN, A. Repellent activity of selected plant essential oils

against the malarial fever mosquito Anopheles stephensi. Tropical Biomedicine, v. 24, p.

71–75, 2007.

RAMOS, R. R. S., RODRIGUES, A. B. L., FARIAS, A. L. F., SIMOES, R. C.,

PINHEIRO, M. T., DOS ANJOS, R. M. F., BARBOSA, L. M. C., SOUTO, R, N, P.,

FERNANDES, J.B., AS SILVAS, L. S., DA SILVA, S. S. M. A. Chemical composition

and in vitro antioxidant, cytotoxic, antimicrobial, and larvicidal activities of the essential

oil of Mentha piperita L. (Lamiaceae). The Scientific World Journal, v. 17, p. 1-8, 2017.

RANJAN, A.,WESTRICK, N. M., JAIN, S., PIOTROWSKI, J. S., RAJAN, M.,

KESSENS, R., STIEGMAN, L., GRAU, C. R., CONLEY, S. P., SMITH, D. L.,

KABBAGE, M. Resistance against Sclerotinia sclerotiorum in soybean involves a

reprogramming of the phenylpropanoid pathway and up-regulation of antifungal activity

targeting ergosterol biosynthesis. Plant Biotechnology Journal, v. 17, n. 8, pág. 1567-

1581, 2019.

RANDUZ, M., Óleo essencial de cravo-da-índia (Syzygium aromaticum, L.): extração,

encapsulação, potencial antimicrobiano e antioxidante. 2017. 146 f. Dissertação

(Mestrado em Nutrição e Alimentos, Universidade Federal de Pelotas –RS, 2017.

RATTANACHAIKUNSOPON, P.; PHUMKHACHORN, P. Bacteriostatic effect of

flavonoids isolated from leaves of Psidium guajava on fish pathogens. Fitoterapia, v. 78,

p. 434–436, 2007.

SANTOS, R. C., Atividade do extrato rico em licopeno da goiaba vermelha (Psidium

guajava L.) em células de adenocarcinoma mamário in vitro. 2017. 115p. Tese

(Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Piauí – PI, 2017.

SCHWAN-ESTRADA, K. R. F.; STANGARLIN, J. R.; CRUZ, M. E. Uso de extratos

vegetais no controle de fungos fitopatpgênicos. Floresta, v. 30, p. 129-137, 2000.

SHAH, A., S. BEGUM, S. HASSAN, S. ALI, B. S., GILANI, A.H. “Pharmacological

Basis for the Medicinal Use of Psidium Guajava Leave in Hyperactive Gut

Disorders”. Bangladesh Journal of Pharmacology, v. 6, p. 100-105, 2011.

SHAO, X., CHENG, S., WANG, H., HU, D., MUNGAI, C. The possible mechanism of

antifungal action of tea tree oil on Botrytis cinerea. Journal of Applied Microbiology, v.

114, p. 1642-1649, 2013.

SHURUTHI, S. D.; ROSHAN, A.; TIMILSINA, S. S.; SUNITA, S. A Review on the

medicinal plant Psidium guajava Linn. (Myrtaceae). Journal of Drug Delivery and

Therapeutics, v.3, p. 162-168, 2013.

SILVA, E. A. J. Extração de óleo essencial das folhas de Pisidium guajava, análise da

influência da secagem do material vegetal sobre o teor e a composição química do óleo

essencial e avaliação antifúngica sobre Sclerotinia sclerotiorum. 2014. 104p. Dissertação

(Mestrado em Agroquímica) – Instituto Federal Goiano Campus Rio Verde – GO. 2015.

SILVA, E. A. J.; ESTEVAM, E. B. B., SILVA, T. S., NICOLELLA, H. D., FURTADO,

R. A., ALVES, C. C. F., SOUCHIE, E. L., MARTINS, C. H. G., TAVARES, D. C.,

BARBOSA, L. C. A., MIRANDA, M. L. D. Antibacterial and antiproliferative activities

of the fresh leaf essential oil of Psidium guajava L. (Myrtaceae). Brazilian Journal of

Biology, v. 79, p. 697-702, 2019.

SILVA, E. A. J., SILVA, V. P., ALVES, C. C. F., ALVES, J. M., SOUCHIE, E. L.,

BARBOSA, L. C. A. Chemical composition of the essential oil of Psidium guajava leaves

and its toxicity against Sclerotinia sclerotiorum. Semina: Ciências Agrárias, v. 39, p. 865-

874, 2018.

SONG, X.; PEI, Y.; QIAO, M.; MA, F.; REN, H.; ZHAO, Q. Preparation and

characterizations of Pickering emulsions stabilized by hydrophobic starch particles. Food

Hydrocolloids, v. 45, p. 256-263, 2015.

SOUZA, T. S., FERREIRA, M. F. S., MENINI, J., SOUZA, J. R. C. L., PARREIRA, L.

A., CECON, P. R., FERREIRA, A. Essential oil of Psidium guajava: influence of

genotypes and environment. Scientia Horticulturae, v. 216, p. 38–44, 2017.

SOUZA, T. S., FERREIRA, M. F. S., MENINI, J., SOUZA, J. R. C. L., BERNARDES,

C. O., FERREIRA, A. Chemotype diversity of Psidium guajava L. Phytochemistry, v.

153, p. 129-137, 2018.

STANGARLIN, J.R., et al. Plantas medicinais e o controle alternativo de fitopatógenos.

Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento, v. 11, p. 16-21, 1999.

TAVARES, L. R., ALMEIDA, P. P., GOMES, M.F. Avaliação físico-química e

microbiológica de goiaba (Psidium guajava) revestida com cobertura comestível à base

de O-carboximetilquitosana e óleo essencial de orégano (Origanum vulgare). Multi-

Science Journal, v. 1, p. 20-26, 2018.

THAVARA, U.; TAWATSIN, A.; BHAKDEENUAN, P.; WONGSINKONGMAN, P.;

BOONRUAD, T.; BANSIDDHI, J.; CHAVALITTUMRONG, P.; KOMALAMISRA,

N.; SIRIYASATIEN, P.; MULLA, M.S. Repellent activity of essential oils against

cockroaches (Dictyoptera: Blattidae, Blattellidae, and Blaberidae) in Thailand. Southeast

Asian Journal Tropical Medicine Public Health, v. 38, n. 4, p. 663-673, 2007.

THORNHILL, A. H., SIMON, Y. W., HO, C. K., MICHAEL, D. C. Interpreting the

modern distribution of Myrtaceae using a dated molecular phylogeny. Molecular

Phylogenetics and Evolution, v. 93, p. 29-43, 2015.

VALADARES, A.C. F., ALVES, C. C. F., ALVES, J. M., DEUS,I. P.B., FILHO, J. G.

O., SANTOS, T. C. L., DIAS, H. J., CROTTI, A. E. M., MIRANDA, M. L. D. Essential

oils from Piper aduncum inflorescences and leaves: chemical composition and antifungal

activity against Sclerotinia sclerotiorum. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v.

90, p. 2691-2699, 2018.

VASCONCELOS, A. G.; AMORIM, A. G. N.; SANTOS, R. C.; SOUZA, J. M. T.;

SOUZA, L. K. M.; ARAÚJO, T. S. L.; NICOLAU, L.A. D.; CARVALHO, L.L.;

AQUINO, P. E. A.; MARTINS, C. S.; ROPKE, C. D.; SOARES, P. M. G.;

KUCKELHAUS, S. A. S.; MEDEIROS, J. R.; LEITE, J. R. S. A. Lycopene rich extract

from red guava (Psidium guajava L.) displays anti-inflammatory and antioxidant profile

by reducing suggestive hallmarks of acute inflammatory response in mice. Food Research

International, p. 1-10, 2017.

VAZQUEZ, M. J. B., CHINCHILLA, F. G., MOLINA, A. Chemical composition and

antimicrobial activity of the essential oil of Psidium guajava and Cymbopogon citratus

Agronomía Mesoamericana, v. 30, p.147-163, 2019.

VELOSO, R. A. Óleos essenciais como controle alternativo de fitopatógenos. 2016. 140f.

Tese (Doutorado em Produção Vegetal) - Universidade Federal do Tocantins – Câmpus

Universitário de Gurupi- TO, 2016.

WANG, L., WU, Y., HUANG, T., SHI, K., WU, Z. Chemical compositions, antioxidant

and antimicrobial activities of essential oil of Psidium guajava L. leaves from different

geographic regions in China. Chemistry and Biodiversity, v. 114, n. 9, p. 179-189, 2017.

WANG, Z., WAN, L., XIN, Q., CHEN, Y., ZHANG, X., DONG, F., HONG, D., YANG,

G. Overexpression of OsPGIP2 confers Sclerotinia sclerotiorum resistance in Brassica

napus through increased activation of defense mechanisms. Journal of Experimental

Botany, v. 69, p.3141-3155, 2018.

WELI, A., KAABI, A., JAMAL, A., SAID, S., HOSSAIN, M.A. Chemical composition

and biological activities of the essential oils of Psidium guajava leaf. Journal of King

Saud University, 2018.

WUTZKI, C. R. Análise espacial e quantificação de inóculo de mofo branco (Sclerotinia

sclerotiorum (Lib) de Bary) na cultura da soja (Glycine max (L) Merril. 2017. 76f. Tese

(Doutorado em Agronomia - Área de Concentração: Agricultura), Universidade Estadual

de Ponta Grossa-RS. 2017.

WUTZKI, C. R.; JACCOUD FILHO, D. S.; BERGER NETO, A.; TULLIO, H. E.;

JULIATTI, F. C.; NASCIMENTO, A. J. Reduction of white mold level on soybean by

fungicide management strategies. Bioscience Journal, v. 32, n. 3, p.642-651, 2016.

XIE, J.; XIAO, X.; FU, Y.; LIU, H.; CHENG, J.; GHABRIAL, S.A.; LI, G.; JIANG, D.,

A novel mycovirus closely related to hypoviruses that infects the plant pathogenic fungus

Sclerotinia sclerotiorum, Virology, v. 418, p. 49–56, 2011.

XIMENES, L.R. A importância e o manejo da Sclerotinia sclerotiorum (Mofo Branco)

em cultivos de espécies suscetíveis. Brasília: Faculdade de Agronomia e Medicina

Veterinária, Universidade de Brasília, 2013, 59 f. Monografia, 2013.

ZANATTO, I. B., BONALDO, S. M., PEREIRA, C. S. Fungicidas e extrato etanólico de

própolis no controle de doenças de final de ciclo da cultura da soja. Revista de Ciências

Agrárias, v. 41, p. 171-180, 2018.

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Avaliar o efeito do óleo essencial das folhas de Psidium guajava na forma

de emulsão e determinar seu efeito fungicida no controle do fungo Sclerotinia

sclerotiorum in vitro e in vivo na cultura da soja.

2.2. Específicos

Avaliar uma emulsão simples contendo óleo essencial das folhas de goiabeira;

Avaliar o efeito antifúngico do óleo essencial extraído das folhas da goiabeira

emulsionado no controle do fungo fitopatogênico Sclerotinia sclerotiorum

causador do mofo branco in vitro e in vivo na soja;

Avaliar a atividade bactericida, anticariogênica e antitumoral do óleo essencial

extraído das folhas de Psidium guajava.

3. CAPÍTULO I

(Artigo submetido de acordo com as normas da Revista Pesquisa Agropecuária

Tropical)

Ação antifúngica do óleo essencial das folhas de Psidium guajava in vitro e in vivo

no controle de Sclerotinia sclerotiorum em plantas de soja

Essential oil antifugal action of Psidium guajava leaves in vitro and in vivo on the

Sclerotinia sclerotiorum control in soybean plants

RESUMO

Mofo branco é uma das doenças mais importantes que ataca a cultura da soja, atrás apenas

da ferrugem asiática. Este incide sobre várias culturas de grande importância econômica,

e possui difícil controle, aumentando o uso de agrotóxicos. A busca por biofungicidas

extraídos de plantas eficientes e biodegradáveis tem crescido bastante como alternativa

para o controle de fitopatógenos. Com este trabalho objetivou-se avaliar a ação

antifúngica do óleo essencial (OE) extraído das folhas de goiabeira in vitro e in vivo em

plantas de soja sobre o mofo branco. O OE foi extraído por hidrodestilação e sua

composição analisada por CG-EM. Para aplicação do OE, foi formulada uma emulsão e

microcápsulas a 300 µl.mL-1. O teste in vivo em plantas de soja foi realizado utilizando a

emulsão em 7 repetições e discos de 7 mm do fungo Sclerotinia sclerotiorum, que foram

incubadas a 22ºC e UR 90% e observadas até o crescimento total do controle negativo.

Como controle negativo, foi utilizado apenas o fungo sem nenhum tratamento e como

positivo o fungicida frowcide. O teste em folha destacada seguiu a mesma metodologia

descrita acima, tanto para emulsão quanto para as microcápsulas. Foram identificados

como compostos majoritários no OE o trans-cariofileno e α-humuleno. As microcápsulas

no teste da folha destacada apresentaram taxa de inibição micelial do mofo branco de

34,62%, enquanto a emulsão possibilitou 96,4% e de 92,5% no teste in vivo em plantas

de soja, o que comprova seu potencial antifúngico.

Palavras-chave: Goiabeira, fungos fitopatôgenicos, Glycine max, metabólitos

secundários.

ABSTRACT

White mold is one of the most important diseases affecting soybean crop, behind only

Asian rust. This focuses on several crops of great economic importance, and has difficult

control, increasing the pesticides use. The search for biofungicides extracted from

efficient and biodegradable plants has grown considerably as an alternative for

phytopathogens control. The objective of this work was to evaluate the antifungal action

of essential oil (OE) extracted from guava tree leaves in vitro and in vivo on soybean

plants on white mold. The OE was extracted by hydrodistillation and its composition

analyzed by GC-MS. For OE application, an emulsion and microcapsules were

formulated at 300 µl.mL-1. The in vivo test on soybean plants was performed using 7

repetition emulsion and 7 mm discs of the fungus Sclerotinia sclerotiorum, which were

incubated at 22 ºC and 90% RH and observed until the total negative control growth. As

negative control, only the untreated fungus was used and as positive the frowcide

fungicide. The detached sheet test followed the same methodology described above for

both emulsion and microcapsules. The major OE compounds were trans-caryophyllene

and α-humulene. The microcapsules in the detached leaf test presented 34.62% white

mold mycelial inhibition rate, while the emulsion allowed 96.4% and 92.5% in the in vivo

test in soybean plants, which proves its antifungal potential.

Keywords: guava, phytopathogenic fungi, Glycine max, secondary metabolites.

3.1. INTRODUÇÃO

O fungo Sclerotinia sclerotiorum é um fungo fitopatogênico causador de uma

grave doença chamada mofo branco em grandes culturas como a soja, sendo a segunda

doença mais importante, atrás apenas da ferrugem asiática. Acarreta perdas em diversas

espécies, entre monocotiledôneas e dicotiledôneas, sendo responsável por perdas de

rendimento anuais expressivas em culturas agrícolas. Representa, portanto, grande

desafio para ser controlada, devido ao seu desenvolvimento e resistência (NA et al., 2018;

LIU et al., 2019). Esta doença recebe essas denominações em função de sua

sintomatologia que se caracteriza pelas lesões encharcadas, coberta por um micélio

variando de coloração de branca a parda, septado, muito ramificado e de aspecto cotonoso

na superfície dos órgãos atacados (BOLAND, HALL, 1979; JIA et al., 2019).

A erradicação do mofo branco e seus escleródios, que são suas estruturas de

resistência, uma vez instalados em área de cultivo torna-se complexa. Assim, o melhor

método de controle é evitar a entrada do mesmo na área de cultivo de soja. Uma vez

detectada sua infestação, deve-se tomar algumas medidas de manejo para esta doença,

como o controle cultural, a rotação de cultura, a adição de produtos biológicos nas

culturas exploradas, maior espaçamento entre linhas, menor densidade de semeadura,

escolha por variedades com resistência parcial ao patógeno, aplicação de fungicidas

específicos para seu controle entre outros. Este último, pela sua utilização indiscriminada,

tem aumentado a resistência do patógeno para aos fungicidas químicos convencionais

(WUTZKI et al., 2016; NA et al., 2018; RANJAN et al., 2019).

Os fungicidas para o mofo branco podem prevenir a infecção pelos ascósporos,

mas por causa da alta densidade de plantio este pode não penetrar no dossel da cultura e

o controle torna-se ineficiente. Com o aumento da utilização do controle químico

convencional, consequentemente, há contaminação do solo, dos alimentos, da água, do

ambiente e também aumento à resistência do fitopatógeno (WUTZKI et al., 2016). Isto

tem motivado a busca por métodos alternativos para seu controle, como a utilização de

óleos essenciais com propriedades antifúngicas que sejam eficientes e provoquem o

mínimo de impacto ambiental negativo, além de serem facilmente adquiridos e terem

baixo custo (BOMFIM et al., 2015).

Diversos estudos na literatura têm provado o efeito de metabólitos secundários

obtidos de plantas como os óleos essenciais, demonstrando seu potencial de controle a

fungos fitopatogênicos (ATTI-SANTOS, 2010; PANSERA et al., 2013). Um exemplo, é

o caso do óleo essencial extraído das folhas da Psidium guajava, que pertence à família

Myrtaceae, que cresce em todas as regiões tropicais e subtropicais do mundo, adapta-se

as diferentes condições climáticas e está amplamente difundida e bem adaptada no

território brasileiro, inclusive no Domínio Cerrado (ETEMADIPOOR et al., 2019).

A análise da composição química das folhas revelou a presença de aminoácidos,

triterpenos e esteroides, ácidos, fenóis, saponinas, carotenoides (CUELLAR et al., 1984;

SANTOS et al., 2017), óleos essenciais, triterpenoides e β-sitosterol (CRAVEIRO et al.,

1981; ARAIN et al., 2017; BORAH et al., 2019). A utilização do chá das folhas de

goiabeira é popularmente conhecida, sendo utilizado contra cólica e diarreias, inflamação

gastrointestinais, hipertensão, diabetes, tosse, doenças pulmonares, antitérmico, laxante,

sangramento nas gengivas, cólera, reduzir vômitos, atividade antimicrobiana, atividade

anti-inflamatória, anticárie, no tratamento de feridas oculares, anticancerígenas e

hepaprotetora, efeitos comprovados com inúmeros estudos a esse respeito (FENG et al.,

2015; FLORES et al., 2015; JIAO et al., 2017; SOUZA et al., 2017; BORAH et al., 2019).

No óleo essencial das folhas de goiaba, foram encontrados vários compostos

como α-pineno, trans-cariofileno, β-bisaboleno, α-humuleno, d-limoneno, óxido de

cariofileno, eugenol, mirceno, aromadendreno, β-selineno e 1,8-cineol (CRAVEIRO et

al., 1981; PINO et al., 2001; ARAIN et al., 2017; SILVA et al., 2018; BORAH et al.,

2019), sendo que estudos comprovaram a eficácia do 1,8-cineol como potente

antimicrobiano, inseticida e antifúngico. Dessa forma, o óleo essencial das folhas de

Psidium guajava possuem potencial bioativo a ser estudado (LIMA et al., 2010; SOUZA

et al., 2017).

Tendo em vista que o mofo branco é uma doença importante para a cultura da

soja no Brasil, justifica-se a busca por métodos alternativos de controle. Sendo assim,

com este trabalho objetivou identificar os compostos presentes no óleo essencial das

folhas de Psidium guajava bem como avaliar o seu efeito antifúngico in vitro e in vivo no

controle de Sclerotinia sclerotiorum em plantas de soja.

3.2. MATERIAL E MÉTODOS

Material Vegetal

As coletas das folhas de Pisidum guajava ocorreram em março e abril de 2018,

na cidade de Rio Verde, nas coordenadas S 17º47’26.43", W 50º54'49.597" a uma altitude

de 682 m entre 06 e 08h da manhã. O material foi coletado da parte superior e inferior do

dossel da planta e, em seguida, identificado de forma inicial por suas características

morfológicas e, na sequência, confirmada pelo biólogo Marcelo Nogueira Xavier na

Universidade Estadual de Montes Claros, MG, onde foi registrado (exsicata nº de adesão

4481) e depositada em seu herbário.

Extração do óleo essencial

A extração do óleo essencial ocorreu por hidrodestilação utilizando um aparelho

do tipo Clevenger, segundo Silva et al. (2018), em que foi utilizado um total de 20 kg de

folhas in natura. Após a obtenção do óleo e medida sua massa em balança analítica, este

fora armazenado em frasco de vidro âmbar a 4ºC, para posterior análise de sua

composição química, conforme Silva et al. (2018).

Emulsão contendo óleo essencial de Psidium guajava

A emulsão O/A foi preparada utilizando óleo essencial com o tensoativo de

natureza hidrofílica (Tween 80, EHL= 15), segundo Kang et al. (2019). A emulsão foi

preparada utilizando 20mL de água deionizada, juntamente com 1 mL de Tween 80

(quantidade definida em testes prévios) e 6 mL de óleo essencial das folhas de goiabeira,

sob agitação em agitador magnético a 500 rpm, por 10 min, para se obter uma emulsão

com concentração final de 300 µl/mL de óleo essencial, dose esta pré-estabelecida

segundo resultados obtidos em experimento por Silva et al. (2018).

Microcápsulas contendo óleo essencial de Psidium guajava

As microcápsulas foram produzidas pelo método de coacervação simples,

segundo adaptação de Sharma, Goel (2018). As microcápsulas foram preparadas

utilizando 0,3 g de alginato de sódio como polímero, 6 mL de óleo essencial, 1 mL de

tween 80 e 20 mL de água destilada, para se obter a mesma concentração da emulsão.

Posteriormente, a solução de alginato de sódio, óleo essencial e tween 80 foram

homogeneizadas com agitação a 500 rpm, por 45min, em agitador magnético. Logo após,

a solução foi colocada em seringa com agulha 0,3x13 mm e gotejada em solução de

cloreto de cálcio a 1,5% p/v para formação das microcápsulas que ficaram, sob agitação,

por 20 min, para sua reticulação. Posteriormente, foram filtradas e lavadas com água

destilada e secadas em estufa a 35ºC, até peso constante. Foram então armazenadas em

frasco âmbar, até a utilização no teste da folha destacada.

Cultura do fungo Sclerotinia sclerotiorum

Os isolados de S. sclerotiorum Ss12 (BRM 29673) e Ss 43 (BRM 29870)

utilizados no experimento foram cedidos pela Embrapa Arroz e Feijão, localizada em

Santo Antônio de Goiás, GO e mantidos em estufa de crescimento a 23ºC, até sua

utilização nos ensaios.

Material vegetal de soja

Plantas de soja (cultivar NS6906 IPRO) de ciclo superprecoce foram cultivadas

em vasos de 6 kg, contendo como substrato formado por solo (Latossolo Vermelho

distrófico) de textura média, fertilizado com NPK (4-30-16), sendo mantidas em casa de

vegetação a temperatura ambiente, com fotoperíodo de 12 h e irrigação automatizada por

15 dias.

Teste da folha destacada

O teste da folha destacada foi realizado segundo Marques (2014) com algumas

adaptações. Folhas com 15 dias após a emergência das plantas de soja foram destacadas,

desinfectadas com água sanitária e álcool 70% e colocadas em placa de Petri com papel

de filtro e água para manter a umidade. Em seguida, as folhas foram inoculadas com

discos de 7 mm de diâmetro da cultura do fungo S. sclerotiorum crescido em meio BDA

por 4 dias, e incubadas em câmara de germinação a 22 ± 3ºC por 24 h, com fotoperíodo

de 12 h. Após o período de incubação, as folhas foram aspergidas com água destilada e

tween 80, sendo o controle negativo 1 para a emulsão e com as microcápsulas contendo

apenas tween 80, alginato de sódio como controle negativo 2 para as microcápsulas. O

controle positivo foi realizado com o fungicida frowncide, na concentração de 10 μg.mL-

1 do ingrediente ativo, e os tratamentos aplicados foram a emulsão e as microcápsulas

ambos com óleo essencial de folhas de P. guajava a 300µl.mL-1, concentração escolhida

por testes anteriores. Logo após a pulverização dos mesmos, que se deu até o completo

molhamento das folhas sem que ocorresse escorrimento dos tratamentos, as placas de

Petri foram novamente incubadas à temperatura de 22 ± 3ºC e fotoperíodo de 12 h, sendo

a primeira avaliação realizada após 12 h de incubação. Avaliações foram feitas até o

crescimento total dos controles negativos. A formação da lesão foi mensurada com auxílio

de um paquímetro digital e o percentual de inibição calculado por valores de Percentual

de Inibição do Crescimento Micelial (PIC), conforme Edginton (1971).

Teste antifúngico in vivo em soja

Para o teste antifúngico in vivo foi utilizada a metodologia de Marques (2014),

em que as plantas de soja, com 15 dias após emergência, foram levadas para o Laboratório

de Microbiologia Agrícola da instituição, para a inoculação do fungo em suas folhas. A

inoculação se deu com a inserção de discos com 7 mm de diâmetro da cultura do fungo,

crescido em meio BDA por 4 dias, na porção adaxial de folhas. Após a inoculação, as

plantas foram mantidas em 22ºC ± 3ºC com 90% de umidade e fotoperíodo de 12 h, por

24 horas para o crescimento inicial do fungo. Após as 24 horas, o fungo já havia iniciado

seu crescimento e assim as plantas de soja foram pulverizadas com o controle negativo

(água + tween), controle positivo (fungicida frowncide) e com a emulsão contendo óleo

essencial das folhas de goiabeira, até o molhamento completo das folhas sem ocorrer

escorrimento. Logo após a aplicação dos tratamentos, as plantas foram mantidas a 22ºC

± 3ºC com 90% de umidade e fotoperíodo de 12 horas. As áreas das lesões foram

mensuradas com um paquímetro digital após 24 horas da aplicação dos tratamentos até o

crescimento total do fungo nas folhas das plantas do controle negativo. Os testes foram

feitos com sete repetições, e cada repetição teve um conjunto de três plantas.

Análise estatística

O teste com a folha destacada foi executado, segundo esquema ao acaso

constituído de 5 tratamentos com 7 repetições: controle positivo (+), controle negativo (-

) 1 e 2, emulsão e microcápsulas. O teste in vivo foi feito segundo esquema ao acaso

constituído de três tratamentos: controle +, controle -, e emulsão do óleo essencial a

300µl/mL com sete repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e as

médias dos tratamentos comparadas pelo teste Tukey (5%), por meio do software

ASSISTAT.

3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise da composição química do óleo essencial das folhas P. guajava

identificou 17 compostos que estão listados na Tabela 1. Dentre estes compostos, foram

identificados dois compostos majoritários: o trans-cariofileno (18,18%) e o α-humuleno

(26,37%). Estes resultados são similares aos de Craveiro et al. (1981), Cuellar et al.

(1984), Pino et al. (2001) e Silva et al. (2018), indicando a presença de importantes

compostos com bioatividade, como a ação fungicida, como o 1,8- cineol, limoneno, trans-

cariofileno, α-humuleno, óxido de cariofileno, entre outros.

Tabela 1 - Constituintes do óleo essencial das folhas de Psidium guajava.

Compostos RI* RA(%)

Limoneno 1024 2,22 ± 0,2

1,8-cineol 1026 1,50 ± 0,3

α-copaeno 1374 1,05 ± 0,3

trans-cariofileno 1419 18,18 ± 0,4

α-humuleno 1454 26,37 ± 0,2

4,11-selinadieno 1475 1,19 ± 0,2

γ-muuroleno 1478 0,83 ± 0,2

Aromadendreno 1488 7,63 ± 0,2

α-selineno 1497 7,35 ± 0,3

α-panasinseno 1517 1,21 ± 0,2

trans-Nerolidol 1566 3,38 ± 0,2

óxido de cariofileno 1585 3,79 ± 0,2

epóxido de α-humuleno II 1612 4,18 ± 0,3

epóxido longipineno 1620 1,61 ± 0,2

epi-α-muurulol 1639 2,97 ± 0,2

α-cadinol 1651 0,78 ± 0,3

Selin-11-en-4α-ol 1662 7,20 ± 0,2

Total Identificado 91,44

Monoterpenos hidrocarbonados

1,8

Monoterpenos oxigenados

1,2

Sesquiterpenos hidrocarbonados 62,0

Sesquiterpenos oxigenados 14,8

*RI – Índice de retenção obtido com referência em série homologa de n-alcanos usando coluna SPB-5. *RA

– Área relativa (área do pico em relação ao pico total no cromatograma CG-MS), média de três repetições

± - desvio padrão.

O teste de folha destacada para verificar a atividade antifúngica da emulsão e

das microcápsulas, contendo óleo essencial das folhas de goiabeira sobre o crescimento

micelial de S. sclerotiorum foi realizado in vitro e resultou nos dados que podem ser

observados na Figura 5. A emulsão contendo 300µL.mL-1 de óleo essencial em estudo

possibilitou inibição de crescimento micelial de 96,4%, enquanto as microcápsulas

contendo a mesma concentração de óleo essencial, possibilitou apenas 34,62%.

No teste de folha destacada, ao comparar o percentual de inibição de crescimento

micelial das microcápsulas com o controle positivo (fungicida frowncide) e com a

emulsão (Figura 1), verifica-se que os valores diferiram entre si, indicando que as

microcápsulas possibilitaram apenas 34,62% de inibição em relação ao fungicida

comercial e a emulsão, que possibilitaram inibição de 100% e 96,4%, respectivamente.

Ao observar os resultados para a emulsão e comparar o percentual de inibição

de crescimento micelial da mesma com o controle positivo (fungicida frowncide) (Figura

2), verifica-se que os valores não diferiram estatisticamente. Isto confirma o potencial

fungicida dos compostos presentes no óleo essencial das folhas de goiabeira.

*Médias seguidas pela mesma letra não diferem pelo teste Tukey (5%).

Figura 1 - Percentual de inibição micelial da emulsão e das microcápsulas contendo óleo essencial de

folhas de goiabeira a 300µL.mL-1 sobre o fungo Sclerotinia sclerotiorum. Controle 1 (controle negativo

microcápsulas), controle 2 (controle negativo emulsão).

Essa discrepância nos resultados obtidos para a emulsão (PIC 96,4%) e para as

microcápsulas (PIC 34,62%), ambas a uma mesma concentração de óleo essencial, pode

ser por causa do polímero alginato de sódio utilizado para confecção das microcápsulas,

que pode ter impedido a liberação do óleo essencial. Não foram encontrados relatos para

tal fato, devendo-se realizar estudos posteriores para averiguar o ocorrido. Portanto, os

estudos prosseguiram com o teste in vivo em plantas de soja somente com a emulsão.

Quanto ao teste in vivo em plantas de soja, os resultados sobre a atividade

antifúngica da emulsão do óleo essencial das folhas de goiabeira sobre o crescimento

micelial de S. sclerotiorum estão na Figura 6. A emulsão contendo 300µL.mL-1 de óleo

essencial em estudo possibilitou porcentagem de inibição de crescimento micelial in vivo

em plantas de soja de 92,5%.

No teste antifúngico in vivo em plantas de soja, os resultados foram semelhantes

ao teste da folha destacada que foi realizado in vitro, em que o percentual de inibição da

a

b

cc

cc

a

c c

emulsão não diferiu do controle positivo realizado com o fungicida comercial frowncide,

já utilizado para o controle do mofo branco em lavouras de soja.

*Médias seguidas pela mesma letra não diferem pelo teste Tukey (5%). Figura 2 - Percentual de inibição micelial in vivo em folhas de soja da emulsão contendo óleo essencial

de folhas de goiabeira sobre o fungo Sclerotinia sclerotiorum.

A emulsão possibilitou percentual de inibição ao fungo de 92,5%, valor menor

comparado ao percentual de 96,5% obtido com o teste da folha destacada, mas que não

diferem estatisticamente. Novamente, este teste in vivo comprova a ação fungicida dos

metabólitos secundários presentes na composição química do óleo essencial das folhas de

P. guajava.

Na análise de composição química do óleo essencial das folhas de goiabeira, foi

possível encontrar importantes metabólitos especiais com potencial fungicida como o 1,8-

cineol, limoneno, trans-cariofileno, α-humuleno, óxido de cariofileno, entre outros

(CUELLAR et al., 1984; PINO et al., 2001; DE LIMA et al., 2010; KHADRIA et al.,

2014; ARAIN et al., 2017; HANIF et al., 2018; BORAH et al., 2019).

Uma maior bioatividade pode ser observada em estudos com óleos essenciais

com diversas plantas aromáticas que apresentam em sua composição alguns constituintes

em especial (citral, geraniol, α-pineno, 1,8-cineol, trans-cariofileno, furanodieno,

limoneno, eugenol e carvacrol) (TANG et al., 2018; PERVEEN et al., 2018; HANIF et

al., 2018; KANG et al., 2019). Ressalta-se, que pela grande complexidade da composição

química de um óleo essencial, é difícil relacionar sua bioatividade com apenas estas

a

b

substâncias, sendo que essa bioatividade pode ser resultado de sinergia entre os

componentes e não só apenas por um único composto químico.

Hanif et al. (2018) comprovaram a ação antifúngica do óleo essencial de P.

guajava contra fungos fitopatogênicos como Aspergillus niger, Aspergillus flavus,

Fusarium solani e Rhizopus solani. Igualmente, Silva et al. (2018) comprovaram a ação

antifúngica in vitro sobre S. sclerotiorum com a dose de 300µL inibindo mais de 90% de

sua germinação.

Não há nenhum relato sobre a ação antifúngica de emulsões contendo óleo

essencial das folhas de goiabeira, há apenas para bioatividade contra fitopatógenos de

outros óleos essenciais como: gerânio, orégano, canela, eucalipto, absinto, entre outros

(KANG et al., 2018; PARK et al., 2018; SONG et al., 2018; RIBES et al., 2018; KANG

et al., 2019). Portanto, o presente estudo é o primeiro relato sobre a atividade antifúngica

de emulsão contendo o óleo essencial das folhas de goiabeira contra o fungo S.

sclerotiorum.

De acordo com Perveen et al. (2018), a ação dos óleos essenciais sobre micro-

organismos pode ser atribuída à capacidade em modificar o crescimento geral dos

mesmos pelo achatamento das pontas das hifas, impedindo-as de se desenvolver e

podendo causar a morte do fungo. Além dos óleos essenciais possuírem caráter lipofílico,

que permite atravessar a parede celular e a membrana citoplasmática que são à base de

lipídios, assim destruindo a estrutura celular e causando danos a essas membranas. Tal

fato é uma citotoxidade característica dos óleos essenciais, que pode causar desequilíbrio

no metabolismo energético de toda a célula, levando ao acúmulo de espécies reativas de

oxigênio (ERO), inibindo a taxa respiratória e a fosforilação oxidativa, levando a

apoptose e a necrose celular do fitopatógeno (PERVEEN et al., 2018; SONG et al., 2018;

KANG et al., 2019).

Os resultados obtidos neste trabalho indicam o efeito fungicida da emulsão

contendo óleo essencial de folhas de goiabeira sobre o fungo Sclerotinia sclerotiorum,

tanto in vitro (teste da folha destacada) como in vivo (teste antifúngico em plantas de

soja). Dessa forma, a utilização de óleos essenciais pode se tornar uma ferramenta para o

controle de pragas agrícolas. Vale ressaltar que há necessidade de estudos posteriores

sobre o assunto para o desenvolvimento de um possível biofungicida que poderá ser

utilizado em campo para a cultura da soja, assim como outras afetadas pelo fitopatógeno.

3.4. CONCLUSÕES

No óleo essencial, extraído das folhas de goiabeira, há compostos com ação

antifúngica, como o 1,8-cineol, limoneno, trans-cariofileno, α-humuleno e óxido de

cariofileno.

A emulsão contendo óleo essencial das folhas de goiabeira, na concentração de

300µL.mL-1, demonstrou atividade antifúngica tanto in vitro como in vivo em plantas de

soja, com valor de IMC acima de 90%, comprovando seu potencial fungicida contra S.

clerotiorum.

3.5. AGRADECIMENTOS

À Embrapa Arroz e Feijão, pela doação dos isolados de mofo branco. À

Fapeg/Capes, ao IF Goiano - Campus Rio Verde e ao PPGCA–AGRO, pelo apoio

financeiro e estrutural fundamentais para realização desta pesquisa.

3.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARAIN, A., SHERAZI, S. T. H., MAHESAR, S. A., SIRAJUDDIN. Spectroscopic and

chromatographic evaluation of solvent extracted guava seed oil. International Journal of

Food Properties, v. 20, n.1, p.556–563, 2017.

ATTI-SANTOS, A.C.; ROSSATO, M.; SERAFINI, L.A.; BUENO, M.; CRIPPA, L.B.;

SARTORI, V.; DELLACASSA, E.; MOYNA, P. Efeito fungicida dos óleos essenciais de

Schinus molle L. e Schinus terebinthifolius Raddi, Anacardiaceae, do Rio Grande do Sul.

Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 20, p.154-159, 2010.

BOLAND, G.J.; HALL, R. Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum. Canadian

Journal Plant Pathology, v.16, p. 93–108, 1994.

BOMFIM, N. S.; NAKASSUGI, L. P.; OLIVEIRA, J.F.P.; KOHIYAMA, C. Y.;

MOSSINI, S. A. G.; GRESPAN, R.; NERILO, S. B.; MALLMAN, C. A.; FILHO, B. A.

A.; JR, M. M. Antifungal activity and inhibition of fumonisin production by Rosmarinus

officinalis L. essential oil in Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg. Food Chemistry.

v.166, p. 330-336, 2015.

BORAH, A., PANDAY, S. K., HALDAR, S., LAL, M. Chemical Composition of Leaf

Essential Oil of Psidium guajava L. from North East India, Journal of Essential Oil

Bearing Plants, v. 1, p. 248-453, 2019.

CRAVEIRO, A. A.; FERNANDES, A. G.; ANDRADE, C. H. S.; MATOS, F. J. A.;

ALENCAR, J. W.; MACHADO, M. I. L. Óleos essenciais de plantas do nordeste. [S. l.]:

UFC, 1981. 210 p, 1981.

CUELLAR, AC, LARA RA, ZAYAS JP 1984. Psidium guajava L. Tamizaje fitoquímico

y estudio del aceite esencial. Revista Cubana Farmacia, v. 18, p. 92-99, 1984.

LIMA, R. K. et al. Composition of the essential oil from the leaves of tree domestic

varieties and one wild variety of the guava plant (Psidium guajava L., Myrtaceae). Revista

Brasileira de Farmacognosia, v. 20, p. 41-44, 2010.

EDGINTON, L.V. Fungitoxic spectrum of benzimidazole compounds. Phytopathology,

v. 62, p. 42, 1971.

ETEMADIPOOR, R., RAMEZANIANA, A., DASTJERDIB, A. M., SHAMOLIB, M.

The potential of gum arabic enriched with cinnamon essential oil for improving the

qualitative characteristics and storability of guava (Psidium guajava L.) fruit. Scientia

Horticulturae, v. 251, p. 101-107, 2019.

FENG, X.; WANG, Z.; MENG, D.; LI, X. Cytotoxic and antioxidant constituents from

the leaves of Psidium guajava. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, v. 25, p.

2193–2198, 2015.

FLORES, G.; WU, S.; NEGRIN, A.; KENNELLY, E. J. Chemical composition and

antioxidant activity of seven cultivars of guava (Psidium guajava) fruits. Food Chemistry,

v. 170, p. 327 - 335, 2015.

HANIF, M. U., HUSSAIN, A. I., CHATHA, S. A. S., KAMAL, G. M., AHMAD, T.

Variation in composition and bioactivities of essential oil from leaves of two different

cultivars of Psidium guajava L. Journal of Essential Oil Bearing Plants, v. 21, p. 65–76,

2018.

JIA, W., HU, C., XU,J., MING, J., ZHAO, Y., CAI, M., SUN, X., LIU, X., ZHAO, X.

Dissolved organic matter derived from rape straw pretreated with selenium in soil

improves the inhibition of Sclerotinia sclerotiorum growth. Journal of Hazardous

Materials, v. 369, p. 601-610, 2019.

JIAO, Y.; ZHANG, M.; WANG, S.; YAN, C. Consumption of guava may have beneficial

effects in type 2 diabetes: A bioactive perspective. International Journal of Biological

Macromolecules, v. 101, p. 543 - 552, 2017.

KANG, J. H., SONG, K. B. Inhibitory effect of plant essential oil nanoemulsions against

Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, and Salmonella typhimurium on red

mustard leaves. Innovative Food Science Emerging Technologies, v. 45, p. 445–454,

2018.

KANG, J. H., PARK, S. J., PARK, J. B., SONG, K. B. Surfactant type affects the washing

effect of cinnamon leaf essential oil emulsion on kale leaves. Food Chemistry, v. 271, p.

122–128, 2019.

KHADRIA, A.; MOKNIB, R.E.; ALMEIDAC, C.; NOGUEIRA, J.M.F.; ARAUJO, E.M.

Chemical composition of essential oil of Psidium guajava L. growing inTunisia.

Industrial Crops and Products v. 52, p.29– 31, 2014.

LIU, S., JIANG, J., CHE, Z., TIAN, Y., CHEN, G. et al., Baseline sensitivity and control

efficacy of fluazinam against Sclerotinia sclerotiorum in Henan Province, China. Journal

of Phytopathology, v.167, p.75-77, 2019.

MARQUES, J. S. Compostos ativos de folhas de Eugenia uniflora e seus efeitos contra

mofo branco causado por Sclerotinia sclerotiorum em plantas de feijoeiro. 2014. 81p.

Dissertação (Mestrado em Biologia) – Universidade Federal de Goias – GO. 2014.

NA, R., LUO, Y., BO, H., ZHANG, J., JIA, R., MENG, Q., ZHOU, H., HAO, J., ZHAO,

J. Responses of sunflower induced by Sclerotinia sclerotiorum infection. Physiological

and Molecular Plant Pathology, v.102, p.113-121, 2018.

PANSERA, M. R., PAULETTI, M., FEDRIG, C. P., SARTORI, V. C., RIBEIRO, R. T.

S. Utilization of essential oil and vegetable extracts of Salvia officinalis L. in the control

of rot sclerotinia in lettuce. Applied Research and Agrotecnology, v. 6, p. 83-88, 2013.

PARK, J. B., KANG, J. H., SONG, K. B. Geranium essential oil emulsion containing

benzalkonium chloride as a wash solution on fresh-cut vegetables. Food and Bioprocess

Technology, v. 11, p. 2164-2171, 2018.

PERVEEN, K., BOKHARI, N. A., SIDDIQUE, I., AL-RASHID, S. A. I. Antifungal

activity of essential oil of commiphora molmol oleo gum resin. Journal of Essential Oil

Bearing Plants, v. 2, p. 667–673, 2018.

PINO, J. A.; AGUERO, J.; MARBOT, R.; FUENTES, V. Leaf oil of Psidium guajava L.

from Cuba. Journal Essential Oil Research, v. 31, p. 61-62, 2001.

RANJAN, A.,WESTRICK, N. M., JAIN, S., PIOTROWSKI, J. S., RAJAN, M.,

KESSENS, R., STIEGMAN, L., GRAU, C. R., CONLEY, S. P., SMITH, D. L.,

KABBAGE, M. Resistance against Sclerotinia sclerotiorum in soybean involves a

reprogramming of the phenylpropanoid pathway and up-regulation of antifungal activity

targeting ergosterol biosynthesis. Plant Biotechnology Journal, v. 17, n. 18, p. 1567-1581,

2019.

RIBES, S., FUENTES, A., TALENS, P., BARAT, J. M. Combination of different

antifungal agents in oil-in-water emulsions to control strawberry jam spoilage. Food

Chemistry, v. 239, p. 704–711, 2018.

SANTOS, R. C. Atividade do extrato rico em licopeno da goiaba vermelha (Psidium

guajava L.) em células de adenocarcinoma mamário in vitro. 2017. 115p. Tese

(Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Piauí – PI, 2017.

SILVA, E. A. J.; SILVA, V. P.; ALVES, C. C. F.; ALVES, J. M.; SOUCHIE, E. L.;

BARBOSA, L. C. A. Chemical composition of the essential oil of Psidium guajava leaves

and its toxicity against Sclerotinia sclerotiorum. Semina: Ciências Agrárias, v. 39, p. 865-

874, 2018

SOUZA, T. S. S., FERREIRA, M. F. S., MENINIA, L., SOUZA, J. R. C. L., PARREIRA,

L. A., CECOND, P., FERREIRA, A. Essential oil of Psidium guajava: influence of

genotypes and environment. Scientia Horticulturae, v. 216, p. 38–44, 2017.

SHARMA, R., GOEL, A. Development of insect repellent finish by a simple coacervation

microencapsulation technique. International Journal of Clothing Science and Technology,

v0. 30, p.152–158, 2018.

SONG, B., ZHU, W., SONG, R., YAN, F., WANG, Y. Exopolysaccharide from Bacillus

vallismortis WF4 as an emulsifier for antifungal and antipruritic peppermint oil emulsion.

International Journal of Biological Macromolecules, v. 15, p. 436-444, 2018.

TANG, X., SHAO, Y. L., TANG, Y. J., ZHOU, W. W. Antifungal activity of essential

oil compounds (geraniol and citral) and inhibitory mechanisms on grain pathogens

(Aspergillus flavus and Aspergillus ochraceus). Molecules, v. 23, p. 3-18, 2108.

WUTZKI, C. R.; JACCOUD FILHO, D. S.; BERGER NETO, A.; TULLIO, H. E.;

JULIATTI, F. C.; NASCIMENTO, A. J. Reduction of white mold level on soybean by

fungicide management strategies. Bioscience Journal, v. 32, n. 3, p. 642-651, 2016.

4. CAPÍTULO II

(Artigo submetido e publicado de acordo com as normas da Revista

Brazilian Journal of Biology)

Anticariogenic and antiproliferative activities of the fresh leaf essential oil of

Psidium guajava L. (Myrtaceae).

Keywords: Psidium guajava, essential oil, cariogenic bacteria, cancer cells

Palavras-chave: Psidium guajava, óleo essencial, bactérias cariogênicas, células

cancerígenas

Abstract

This study evaluated the anticariogenic and antiproliferative activities of

Psidium guajava leaves (PG-EO) essential oil, traditionally used in folk medicine. The

essential oil was obtained from fresh leaves by hydrodistillation, using a modified

Clevenger apparatus. The major PG-EO chemical constituents were identified by GC-MS

and GC-FID as being β-caryophyllene (16.1%), α-humulene (11.9%), aromadendrene

oxide (14.7%), δ-selinene (13.6%), and selin-11-en-4α-ol (12.5%). The EO anticariogenic

activity of P. guajava leaves was determined in terms of its minimum inhibitory

concentrations (MIC) using the broth microdilution method in 96-well microplates. PG-

EO had moderate activity against Streptococcus mutans (MIC = 200 µg/mL), S. mitis

(MIC = 200 µg/mL), S. sanguinis (MIC = 400 µg/mL), S. sobrinus (MIC = 100 µg/mL),

and S. salivarius (MIC = 200 µg/mL). The antiproliferative activity was evaluated against

different tumor cell lines: breast adenocarcinoma (MCF-7), human cervical

adenocarcinoma (HeLa), and human gliobastoma (M059J). A normal human cell line

(GM07492A, lung fibroblasts) was included. The antiproliferative activity was evaluated

using the XTT assay and the results were expressed as IC50. The MCF and MO59J lines

showed significantly lower IC50 values than that obtained for the normal line, showing

selectivity. Our results suggest that the essential oil of Psidium guajava L. has promising

biological activities and can be considered a new source of bioactive compounds.

Atividades anticariogênicas e antiproliferativas do óleo essencial de folhas

frescas de Psidium guajava L. (Myrtaceae).

Resumo

Este estudo avaliou as atividades anticariogênicas e antiproliferativas do óleo

essencial das folhas de Psidium guajava (PG-EO), tradicionalmente utilizadas na

medicina popular. O óleo essencial foi obtido a partir de folhas frescas por

hidrodestilação, utilizando um aparelho Clevenger modificado. Os principais

constituintes químicos de PG-EO foram identificados por GC-MS e GC-FID como β-

cariofileno (16,1%), α-humuleno (11,9%), óxido de aromadendreno (14,7%), δ-selineno

(13,6%) e selin-11-en-4α-ol (12,5%). A atividade anticariogênica do óleo essencial das

folhas de P. guajava foi determinada em termos de suas concentrações mínimas inibitórias

(MIC) usando o método de microdiluição de caldo em microplacas de 96 poços. PG-EO

teve atividade moderada contra Streptococcus mutans (MIC = 200 μg / mL), S. mitis (MIC

= 200 μg / mL), S. sanguinis (MIC = 400 μg / mL), S. sobrinus (MIC = 100 μg / mL) e S.

salivarius (MIC = 200 μg / mL). A atividade antiproliferativa foi avaliada em diferentes

linhagens de células tumorais: adenocarcinoma de mama (MCF-7), adenocarcinoma

cervical humano (HeLa) e gliobastoma humano (M059J). Foi incluída uma linha celular

humana normal (GM07492A, fibroblastos pulmonares). A atividade antiproliferativa foi

avaliada utilizando o ensaio XTT e os resultados foram expressos como IC50. As linhas

MCF e MO59J mostraram valores significativamente mais baixos de IC50 do que os

obtidos para a linha normal, mostrando seletividade. Os resultados sugerem que o óleo

essencial de Psidium guajava L. tem atividades biológicas promissoras e pode ser

considerado uma nova fonte de compostos bioativos.

4.1. Introduction

Essential oils are sources of natural substances with several biological activities

with antioxidant, antimicrobial, anticancer, antinociceptive, antiviral, and antiphlogistic

properties (Martins et al. 2015).

Tooth decay is an important public health problem that affects a large number of

people in many countries in the world. More than 700 species of bacteria are identified in

the oral cavity and some of them are responsible for caries and other periodontal diseases,

among them we can highlight the bacteria of Streptococcus genus (Melo et al. 2017).

Plant-derived materials such as plant extracts, essential oils, and pure

compounds have antimicrobial effects against oral pathogens and these materials have

attracted the interest of researchers worldwide. However, reports on the antimicrobial

activity of natural products against oral pathogens are still scarce (Estevam et al. 2016).

Currently, cancer treatment is considered one of the most challenging problems

in medicine and several experimental and epidemiological studies have shown that the

use of some plants may promote chemopreventive and/or antineoplastic action (Oliveira

et al. 2004). In this scenario, some essential oils extracted from different plants have

promising antitumor potential, both in vitro and in vivo (Lesgards et al. 2014).

The species Psidium guajava L., common name guava, belongs to the family

Myrtaceae, which is composed of more than 100 genera and 3800 species and is one of

the most studied species of this family (Haida et al. 2015). The essential oils and leaf

extracts of this plant have several biological activities, including antidermatophytic, anti-

inflammatory, antibiotic, analgesic, hepato-protective and antioxidant properties

(Bhushan et al. 2014; Ferdinand et al. 2014). However, this is the first study reporting the

anticariogenic and antiproliferative activities of the fresh leaves essential oil of P. guajava

occurring in the Cerrado of Goiás State, Brazil.

This work, continuing our line of research on chemical composition and the

biological activities of essential oils (Lemes et al. 2017; Oliveira et al. 2017), analyzes

the chemical composition and the anticariogenic and antiproliferative activities of the

fresh leaf essential oil of P. guajava L. collected in the southwest region of the Goiás

state.

4.2. Material and Methods

4.2.1. Plant material

The experiment was conducted at the Laboratory of Natural Products Chemistry

of the Instituto Federal Goiano - Campus Rio Verde, GO. In March 2014, fresh P. guajava

leaves were collected at 4:00 p.m from a native population in the Rio Verde region.

Collection took place at coordinates 17°48′12.006″S and 50°54′19.083″W, 715m altitude.

Plant material was identified, and the samples were deposited as desiccated specimens in

the Herbarium of the Universidade Estadual de Montes Claros, state of Minas Gerais,

Brazil under identification number 4481.

4.2.2. Essential oil extraction

The essential oil was extracted from fresh leaves of P. guajava (100 g) ground in

a knife mill by the hydrodistillation method using a Clevenger type apparatus at 100 ̊C

for 4 h (Xavier et al. 2016). Thereafter, the hydrolate was subjected to liquid-liquid

partition in a separatory funnel and three washes with three 10 mL portions of

dichloromethane. Essential oil samples were stored at −4°C until further chemical and

biological tests.

4.2.3. Chemical analysis of essential oil

Essential oil chemical composition was analyzed at the Laboratory of Analysis

and Synthesis of Agrochemicals of the Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais.

Quantitative analysis of the essential oil components was performed in a Shimadzu GC-

17A gas chromatograph equipped with a flame ionization detector (FID) and SPB-5 fused

silica capillary column (30 m×0.25 mm; 0.25-μm film thickness). Nitrogen was used as

the carrier gas (1.8 mL min-1), split 1/10, and injector and detector temperatures were

220 and 240 °C, respectively. The initial column temperature was 40 ºC isothermal for 4

minutes, followed by heating at 3 °C min-1 up to 240 °C; 1µL of the essential oil was

injected for analysis. Essential oil components were identified using a gas chromatograph

(CG-EM Shimadzu, QP-5050A) equipped with a mass-selective detector, operating by

electronic ionization (70 eV), with an RTX-5 fused silica column (30m×0.25mm; 0.25-μm

film thickness). Chromatographic conditions were identical to the conditions applied to the

CG-FID, except for the carrier gas, which in this case was helium at a 1mL min-1 flow. The

constituents dentification was based on retention indices relative to C9–C22 alkanes and

by comparing the mass spectra with a computer databank (Wiley 7 and Nist 62) and with

published data (Adams 2007).

4.2.4. Antibacterial assays

Bacteria were acquired from the American Type Culture Collection (ATCC) and

kept in the culture collection of the Laboratory of Research on Applied Microbiology

(LaPeMA) at Universidade de Franca, state of São Paulo, Brazil, at -80°C. The following

microorganisms were used: Streptococcus salivarius (ATCC 25975), Streptococcus

mutans (ATCC 25175), Streptococcus mitis (ATCC 49452), Streptococcus sanguinis

(ATCC 10556) and Streptococcus sobrinus (ATCC 33478).

Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) of essential oils were

determined by the broth microdilution method in 96-well microplates, following the

methodology of CLSI (2006). Samples were dissolved in 125 µL tryptic soy broth (TSB)

to yield compound concentrations between 50 and 400 µg/mL. The inoculum was

adjusted to 625 nm for every microorganism in a spectrophotometer to obtain cell

concentration of 5 x 105 colony-forming units (CFU/mL) (CLSI 2006). Chlorhexidine

digluconate (Sigma-Aldrich), at concentrations from 0.115 to 59.0 µg/mL, was used as

positive control. The microplates were incubated at 37 °C for 24 h; then, 30 µL 0.02 %

resazurin (Sigma-Aldrich) aqueous solution was added to every well (Sarker et al. 2007).

Resazurin is an oxireduction probe that enables microbial growth to be immediately

observed. Blue and red colors represent the absence and the presence of microbial growth,

respectively.

4.2.5. Cell lines and culture conditions

In this study, we used three different tumor cell lines: human breast

adenocarcinoma (MCF-7), human cervical adenocarcinoma (HeLa), and human

gliobastoma (M059J). A normal human cell line (lung fibroblasts, GM07492A) was

included to evaluate the possible selective activity of the natural product tested. The

different cell lines were maintained as monolayers in plastic culture medium (HAM-F10

+ DMEM, 1:1, Sigma-Aldrich) supplemented with 10 % fetal bovine serum (Nutricell),

antibiotics (0.01 mg/mL streptomycin and 0.005 mg/mL penicillin; Sigma-Aldrich), and

2.38 mg/mL Hepes (Sigma-Aldrich). The cells were incubated at 36.5 °C in a humidified

5% CO2 atmosphere.

4.2.6. Antiproliferative assay

The antiproliferative activity was measured using the in vitro Toxicology

Colorimetric Assay Kit (XTT; Roche Diagnostics) according to the manufacturer’s

instructions. For the experiments, the cells (104 cells/well) were plated onto 96-well

microplates. Each well received 100 µL HAM-F10/DMEM medium containing essential

oil at concentrations ranging from 3.91 to 500 µg/mL. Negative (no treatment), solvent

(0.02 % DMSO, dimethylsulfoxide, Sigma-Aldrich) and positive (doxorubicin, DXR,

Pharmacia Brasil Ltda.,) controls were included. After incubation at 36.5 °C for 24 h, the

culture medium was removed. The cells were washed with 100 µL of PBS (phosphate

buffered saline) to remove the treatments and exposed to 100 µL of culture medium

HAM-F10 without phenol red. Then, 25 µL of XTT was added, and the cells were

incubated at 36.5 °C for 17 h. The samples absorbance was determined using a multi-

plate reader (ELISA – Tecan – SW Magellan vs 5.03 STD 2P) at the wavelength of 450

nm and reference length of 620 nm. The antiproliferative activity was assessed using

IC50, the concentration able to inhibit 50% of cell line growth as a response parameter,

which was calculated with the GraphPad Prism program by plotting cell survival against

the respective concentrations of the natural product tested. One-way ANOVA was used

for the comparison of means (p≤0.05). The experiments were performed in triplicate. The

selectivity index was calculated by dividing the IC50 value of the essential oil obtained

for GM07492A cells by the IC50 value obtained for the cancer cell line.

4.3. Results and Discussion

The fresh leaves essential oil of P. guajava is composed mainly by hydrocarbon

sesquiterpenes (62.0%), followed by oxygenated sesquiterpenes (14.8%), hydrocarbons

monoterpenes (1.8%), and oxygenated monoterpenes (1.2%) (Table 1). Seventeen

compounds were identified in the essential oil of P. guajava, which corresponded to

94.1% of the total oil analyzed and the main components are: β-caryophyllene (16.1%),

α-humulene (11.9%), aromadendrene oxide (14.7%), δ-selinene (13.6%), and selin-11-

en-4α-ol (12.5%) (Table I).

Table 1

The chemical composition of the essential oil extracted from fresh leaves of P.

guajava, collected in the Goiás state, showed little similarity to other oils reported in the

literature for species occurring in other countries. For example, the major constituents

identified in the leaf essential oil of P. guajava from Nepal were E-nerolidol (35.6%) and

E-caryophyllene (15.8%) (Satyal et al. 2015), whereas in Tunisia, the major constituents

were viridiflorol (36.4%) and trans-caryophyllene (5.9%) (Khadhri et al. 2014) and, in

Nigeria, the predominant constituents were limonene (42.1%) and β-caryophyllene

(21.3%) (Ogunwande et al. 2003). The essential oil chemical composition of P. guajava

occurring in Lavras, a municipality in the southern region of Minas Gerais, showed

similarity with the chemical composition found in the present study, especially the

compound selin-11-en-4α-ol was present in both (Lima et al. 2010).

Regarding the antibacterial activity, several papers have reported the

antimicrobial potential of plant essential oils against oral pathogens over the last decade

(Sousa et al. 2015). Table 2 shows the anticariogenic activity of the fresh leaf essential oil

of P. guajava against a representative panel of oral pathogens, with MIC values ranging

from 400 to 100 μg/mL.

Table 2

According to Holetz et al. (2002), the antimicrobial activity can be considered

good when MIC values are below 100 µg/mL; moderate from 500 to 100 µg/mL; weak

from 1000 to 500 µg/mL; and inactive above 1000 µg/mL.

The PG-EO showed moderate anti-bacterial activity against all bacteria of the

genus Streptococcus assessed in this work. These promising data can be explained by the

chemical constituents of known antibacterial activity such as caryophyllene oxide (4.1%),

β-caryophyllene (16.1%), and α-humulene (11.9%) present in the oil (Moreira et al.

2014).

Several mechanisms are proposed to explain the essential oils antimicrobial

activity. It is believed that microbial growth inhibition by essential oils is due to the direct

damage to cell membrane integrity caused by their lipophilic components, which affects

cell pH maintenance and inorganic ion balance. According to the literature, the essential

oils inhibitory effects are consistent with the action of monoterpene and sesquiterpene

constituents on cell membrane, and the damage to membrane produces different effects

on microorganisms (Oliveira et al. 2016).

The PG-EO cytotoxicity was assessed against the GM07492A normal cell line,

with an IC50 of 126.4 ± 11.8 μg/mL, and against the MCF-7, HeLa, and MO59J tumor

lines with IC50 of 96.9 ± 8.4; 128.7 ± 1.5; and 103.6 ± 5.1 μg/mL, respectively (Table 3).

The IC50 of the lines MCF-7 and MO59J were significantly lower than that of the normal

line, with selectivity indices of 1.2 and 1.3, respectively. The IC50 values of PG-EO are

lower and have higher antiproliferative activity than the IC50 values of the leaf essential

oil of Rosmarinus officinalis against the cell lines MCF-7 (IC50 = 190.1 μg/mL) and

LNCaP (IC50 = 180.9 μg/mL) (Hussain et al. 2010). Hussain et al. (2010) classified IC50

values < 10 μg/mL as potentially very toxic, IC50 from 10 to 100 μg/mL as potentially

toxic, IC50 from 100 to 1000 μg/mL as potentially harmful, and IC50 > 1000 μg/mL as

potentially non-toxic.

Table 3

The evidence from this study, the high amount of terpenes, known for their

anticancer activity such as β-caryophyllene (16.1 %), aromadendrene oxide (14.7 %), δ-

selinene (13.6 %), selin-11-en-4α-ol (12.5 %), α-humulene (11.9 %), β-caryophyllene

oxide (4.1 %), and α-cadinol (1.6 %) (Table 1), suggests that P. guajava essential oil is a

significant potential source of pure compounds with promising anticancer activity

(Salvador et al. 2011; Quassinti et al. 2013; Fidyt et al. 2016; Guerrini et al. 2016).

Besides, despite the low concentration of hydrocarbon monoterpenes (1.8%) and

oxygenated monoterpenes (1.2%) in the essential oil of P. guajava (Table 1), this class of

compounds deserves special attention for its important antitumor activity (Sobral et al.

2014). Furthermore, it is worth mentioning that the anticariogenic and antiproliferative

activities of the leaf essential oil of P. guajava occurring in the southwestern region of

Goiás can also be explained by the synergistic effect among all its chemical constituents

(Lesgards et al. 2014; Casanova and Costa 2017).

4.4. Conclusion

The GC-MS analysis of the essential oil of P. guajava revealed the presence of

17 compounds, among which β-caryophyllene, α-humulene, aromadendrene oxide, δ-

selinene, and selin-11-en-4α-ol were the major components. Whit respect to testing the

antibacterial activity, the essential oil showed moderate anti-bacterial activity against all

bacteria of the genus Streptococcus assessed in this work. Regarding the anticancer

activity the essential oil is a significant potential source of pure compounds with

promising anticancer activity, for presenting in its chemical composition the high amount

of terpenes whith anticancer properties.

4.5. References

ADAMS, R.P., 2007. In Identification of essential oil components by gas

chromatography/quadrupole mass spectroscopy, 4th ed., Allured Publishing Corporation:

Carol Stream, 804 p.

BHUSHAN, G., SHARMA, S.K., KUMAR, S., TANDON, R. and SING, A.P., 2014. In-

vitro antidermatophytic activity of essential oil of Psidium guajava (L.). Indian Journal

of Pharmaceutical and Biological Research, vol. 2, n.2, pp. 57-59.

CASANOVA, L.M. AND COSTA, S.S., 2017. Interações sinérgicas em produtos

naturais: potencial terapêutico e desafios. Revista Virtual de Química. vol. 9, n. 2, pp.

575-595.

CLSI – CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. 2006. Methods

for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; Approved

Standard Seventh Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute document M7-A7.

ESTEVAM, E.B.B., MIRANDA, M.L.D., ALVES, J.M., EGEA, M.B., PEREIRA, P.S.,

MARTINS, C.H.G., ESPERANDIM, V.R., MAGALHÃES, L.G., BOLELA, A.C.,

CAZAL, C.M., SOUZA, A.F. and ALVES, C.C.F., 2016. Composição química e

atividades biológicas dos óleos essenciais das folhas frescas de Citrus limonia Osbeck e

Citrus latifolia Tanaka (Rutaceae). Revista Virtual de Química. vol. 8, n. 6, pp. 1842-

1854.

FERDINAND, N., CHRISTIANE, N.S., AUGUSTAVE, K., ALEX, T.C.D., RAPHAEL,

K.J., JEAN-MARC, K., BORICE, T., HERMAN, N.V., MARYVONE, N.T., HERMAN,

A., DJALIL, O.I.A., PIERRE, K., GALEOTTI, M. and JOSEPH, T., 2014. Effect of

Guava (Psidium guajava) leaves essential oil on some reproductive parameters in male

guinea pig (Cavia porcellus). Biological Systems: Open Acess. vol.3, n.1, pp. 1-4.

FIDYT, K., FIEDOROWICZ, A., STRZADALA, L. and SZUMNY, A., 2016. β-

Caryophyllene and β-Caryophyllene oxide – natural compounds of anticancer and

analgesic properties. Cancer Medicine. vol. 5, no. 10, p. 3007-3017.

GUERRINI, A., SACCHETTI, G., GRANDINI, A., SPAGNOLETTI, A., ASANZA, M.

and SCALVENZI, L., 2016. Cytotoxic effect and TLC bioautograph-guided approach to

detect healt properties of Amazonian Hedyosmum sprucei essential oil. Evidence Based

Complementary and Alternative Medicine. vol. 1, no. 1, pp. 1-8.

HAIDA, K.S., HAAS, J., MELLO, S.A., HAIDA, K.S., ABRÃO, R.M. and SAHD, R.,

2015. Compostos fenólicos e atividade antioxidante de goiaba (Psidium guajava L.)

fresca e congelada. Revista Fitos. vol. 9, no. 1, pp. 37-44.

HOLETZ, F.B., PESSINI, G.L., SANCHES, N.R., CORTEZ, D.A.G., NAKAMURA,

C.V. and DIAS FILHO, B.P., 2002. Screening of some plants used in the Brazilian folk

medicine for the treatment of infectious diseases. Memories the Instituto Oswaldo Cruz.

vol. 97, no. 1, pp. 1027-1031.

HUSSAIN, A.I., ANWAR, F., CHATHA, S.A.S., JABBAR, A., MAHBOOB, S. and

NIGAM, O.S., 2010. Rosmarinus officinalis essential oil: antiproliferative, antioxidant

and antibacterial activities. Brazilian Journal of Microbiology. vol. 41, no. 4, pp. 1070-

1078.

KHADHRI, A., MOKNI, R.E., ALMEIDA, C., NOGUEIRA, J.M.F. and ARAÚJO,

M.E.M., 2014. Chemical composition of Psidium guajava L. growing in Tunisia.

Industrial Crops and Products. vol. 52, no. 1, pp. 29-31.

LEMES, R.S., COSTA, G.C.S., SILVA, D.C.S., BECCENERI, A.B., BICALHO, K.U.,

MIRANDA, M.L.D., DINIZ, V.S.S. and CAZAL, C.M., 2017. Óleos essenciais dos frutos

e folhas de Kielmeyera coriaceae: atividade antitumoral e estudo químico. Revista Virtual

de Quimica. vol. 9, no. 3, pp.1245-1257.

LESGARDS, J.F., BALDOVINI, N., VIDAL, N. and PIETRI, S., 2014. Anticancer

activities of essential oils constituents and synergy with conventional therapies: review.

Phytotherapy Research. vol. 28, no. 10, pp. 1423-1446.

LIMA, R.K., CARDOSO, M.G., ANDRADE, M.A., NASCIMENTO, E.A., MORAIS,

S.A.L. and NELSON, D.L., 2010. Composition of the essential oil from leaves of tree

domestic varieties and one wild variety of the guava plant (Psidium guajava L.,

Myrtaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia. vol. 20, no. 1, pp. 41-44.

MARTINS, C.M., NASCIMENTO, E.A., MORAIS, S.A.L., OLIVEIRA, A., CHANG,

R., CUNHA, L.C.S., MARTINS, M.M., MARTINS, C.H.G., MORAES, T.S.,

RODRIGUES, P.V., SILVA, C.V. and AQUINO, F.J.T., 2015. Chemical constituents and

evaluation of antimicrobial and cytotoxic activities of Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.

Essential oils. Evidence Based Complementary Alternative Medicine. vol. 1, no. 1, pp. 1-

9.

MELO, D.C., MIRANDA, M.L.D., JÚNIOR, W.G.F., ANDRADE, P.M., ALCOBA,

A.E.T., SILVA, T.S., CAZAL, C.M. and MARTINS, C.H.G., 2017. Anticariogenic and

antimycobacterial activities of the essential oil of Siparuna guianensis Aublet

(Siparunaceae). Orbital: The Electronic Journal of Chemistry. vol. 9, no. 1, pp. 55-60.

MOREIRA, R.R.D., MARTINS, G.Z., BOTELHO, V.T., SANTOS, L.E., CAVALEIRO,

C., SANTOS, L.E., CAVALEIRO, C., SALGUEIRO, L., ANDRADE, G. and

MARTINS, C.H.G., 2014. Composition and activity against oral pathogens of the

essential oil Melampodium divaricatum (Rich.) DC. Chemistry and Biodiversity. vol. 11,

no. 3, pp. 438-444.

OGUNWANDE, I.A., OLAWORE, N.O., ADELEKE, K.A., EKUNDAYO, O. and

KOENING, W.A., 2003. Chemical composition of the leaf volatile oil of Psidium guajava

L. growing in Nigeria. Flavour and Fragrance Journal. vol. 18, no. 2, pp. 136-138.

OLIVEIRA, L.R.A., MACHADO, R.D. and RODRIGUES, A.J.L., 2014. Levantamento

sobre o uso de plantas medicinais com a terapêutica anticâncer por pacientes da unidade

oncológica de Anápolis. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. vol. 16, no. 1, pp. 32-

40.

OLIVEIRA, J.D., ALVES, C.C.F., MIRANDA, M.L.D., MARTINS, C.H.G., SILVA,

T.S., AMBROSIO, M.A.L.V., ALVES, J.M., SILVA, J.P. 2016. Rendimento,

composição química e atividades antimicrobiana e antioxidante do óleo essencial de

folhas de Campomanesia adamantium submetidas a diferentes métodos de secagem.

Revista Brasileira de Plantas Medicinais. vol. 18, no. 2, pp.502-510.

OLIVEIRA, J.D., ALVES, D.K.M., MIRANDA, M.L.D., ALVES, J.M., XAVIER, M.N.,

CAZAL, C.M. and ALVES, C.C.F., 2017. Chemical composition of essential oil extracted

from leaves of Campomanesia adamantium subjected to different hydrodistillation times.

Ciência Rural. vol. 47, no. 1, pp. 1-7.

QUASSINTI, L., LUPIDI, G., MAGGI, F., SAGRATINI, G., PAPA, F., VITTORI, S.,

BIANCO, A. and BRAMUCCI, M., 2013. Antioxidant and antiproliferative activity of

Hypericum hircinum L. subsp. Majus (Aiton) N. Robson essential oil. Natural Product

Research. vol. 27, no. 10, pp. 862-868.

SARKER, S.D., NAHAR, L. and KUMARASAMY, Y., 2007. Microtitre plate-based

antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its

application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. vol. 42, no.

4, pp. 321-324.

SALVADOR, M.J., CARVALHO, J.E., WISNIEWSKI-JR, A., KASSUYA, C.A.L.,

SANTOS, E.P., RIVA, D. and STEFANELLO, M.E.A., 2011. Chemical composition and

cytotoxic activity of the essential oil from the leaves of Casearia lasiophylla. Revista

Brasileira de Farmacognosia. vol. 21, no. 5, pp. 864-868.

SOBRAL, M.V., XAVIER, A.L., LIMA, T.C. and SOUSA, D.P., 2014. Antitumor

activity of monoterpenes found in essential oils. The Scientific World Journal. vol. 1, no.

1, pp.1-35.

SOUSA, R.M.F., MORAIS, S.A.L., VIEIRA, R.B.K., NAPOLITANO, D.R., GUZMAN,

V.B., MORAES, T.S., CUNHA, L.C.S., MARTINS, C.H.G., CHANG, R., AQUINO,

F.J.T., NASCIMENTO, E.A. and OLIVEIRA, A., 2015. Chemical composition,

cytotoxic, and antibacterial activity of the essential oil from Eugenia calycina Cambess.

leaves against oral bacteria. Industrial Crops and Products. vol. 65, no. 1, pp. 71-78.

XAVIER, M.N., ALVES, J.M., CARNEIRO, N.S., SOUCHIE, E.L., SILVA, E.A.J.,

MARTINS, C.H.G., AMBROSIO, M.A.L.V., EGEA, M.B., ALVES, C.C.F. and

MIRANDA, M.L.D., 2016. Composição química do óleo essencial de Cardiopetalum

calophyllum Schltdl. (Annonaceae) e suas atividades antioxidante, antibacteriana e

antifúngica. Revista Virtual de Química. vol. 8, no. 5, pp. 1433-1448.

TABLE 1 - Compounds identified in the leaf essential oil of P. guajava (Myrtaceae)

Table 1 - Compounds identified in the leaf essential oil of P. guajava (Myrtaceae)

Compound RI* %RA

Limonene 1024 1.8

1,8-Cineole 1026 1.2

α-Copaene 1374 1.3

β-Caryophyllene 1419 16.1

α-Humulene 1454 11.9

4,11-Selinadiene 1475 1.3

γ-Muurolene 1478 1.4

Aromadendrene oxide 1488 14.7

δ-Selinene 1499 13.6

α-Panasinsene 1517 1.3

trans-Nerolidol 1566 3.3

β-Caryophyllene oxide 1585 4.1

Humulene epoxide II 1612 1.4

Longipinene epoxide 1620 1.8

epi-α-Muurolol 1639 4.0

Selin-11-en-4α-ol 1645 12.5

α-Cadinol 1660 1.6

Total identified 94.1 Hydrocarbon monoterpenes 1.8

Oxygenated monoterpenes 1.2

Hydrocarbon sesquiterpenes 62.0

Oxygenated sesquiterpenes 14.8

RI*: Retention index from the literature. %RA: Relative area (peak area relative to the total peak in the

GC-MS chromatogram), average of three replicates.

Table 2 - Anticariogenic activity of essential oil of P. guajava leaves (PG-EO) against

oral bacteria

Minimum inhibitory concentration (MIC) - µg/mL

Species CHD*

Streptococcus salivariusa 400 0.922

S. mutansa 200 0.922

S. mitisa 200 3.688

S. sanguinisa 400 0.922

S. sobrinusa 100 0.922

aAerobic Gram-positive bacteria; *CHD: chlorhexidine dihydrochloride (positive control).

Table 3 - IC50 and selectivity index (SI) of essential oil of P. guajava leaves (PG-EO)

against diferent cell lines.

Cell line

Treatment (µg/mL)

PG-EO DXR

IC50 SI IC50 SI

GM07492A 126.4 ± 11.8 - 0.5 ± 0.2 -

MCF-7 96.9 ± 8.4a 1.3 62.1 ± 2.0 -

HeLa 128.7 ± 1.5 - 5.3 ± 1.3 -

MO59J 103.6 ± 5.1a 1.2 16.2 ± 2.5 -

Doxorubicin (DXR) was used as positive controls. GM07492A (human lung fibroblasts), MCF-7 (human

breast adenocarcinoma), HeLa (human cervical adenocarcinoma) and MO59J (human glioblastoma). The

selectivity index is the ratio between the IC50 value of the PG-EO obtained for GM07492A cells and the

value found for the tumor cell line. Values are mean ± SD, n = 3. aSignificantly different from the normal

cell line (GM07492A) (p≤0.05).