Lehet ségek és kihívások a modern bioNMR spektroszkópia ... · 20 Cél a mérhet makroszkopikus mágnesezettség-vektor (M) nagyságának és moduláltságának meghatározása:

1

ELTE/TTK/FI/Ortvay kollokvium2010. december 9.

Perczel András és munkatársaiSzerkezeti Kémia és Biológia Laboratórium

és

ELTE-MTA Fehérjemodellez Kutatócsoport

Lehetségek és kihívások a modern bioNMR spektroszkópia területén

2

"for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith“

Felix Bloch(1905-1983)

Edward Mills Purcell(1912-1997)

The Nobel Prize inThe Nobel Prize inPhysics 1952Physics 1952

3

The Nobel The Nobel PrizePrize ininChemistryChemistry 19911991

"for his contributionsto the developmentof the methodologyof high resolutionnuclear magneticresonance (NMR)spectroscopy"

Richard R. Ernst

4

Fehérje NMR: kémiai Nobel-díj,

2002

Kurt Wüthrich

A dinamikára és a bels mozgásra is reflektáló szerkezeti sokaság

Fehérjék oldatban: NMR-spektroszkópia

5

spinrendszerekspinrendszerekazonosazonosííttáásasa

spinrendszerekspinrendszerekszekvenciszekvenciáális lis

rendezrendezéésese

kkéényszerfeltnyszerfeltéételek telek alapjalapjáán n

szerkezetszszerkezetszáámolmolááss

NMR NMR spspektrumektrum

6

Miért az NMR? Powerful modern structural toolsPowerful modern structural tools for looking at complexesfor looking at complexes

!"

#

7

Küls mágneses tér hiányában a magok spinjei rendezetlenül állnak

Küls mágneses tér hatására rendezdött és precesszáló magok

Az NMR-spektroszkópia szükséges feltétele a nullától különböz magspin (I≠≠≠≠0)1) I=0, ha mind a protonok mind a neutronok száma páros: (12C, 16O)2) I=1/2, ha tömegszáma páratlan (1H, 3H, 13C, 15N, 19F, 57Fe, 113Cd)

vagy a protonok, vagy a neutronok száma páratlan. 3) I=k (k=1,2,..) mind a protonok mind a neutronok száma páratlan (2H, 14N)

8

Feles spin esetén az impulzusmomentum (perdület) z-komponensének operátora: ÎZ

- két sajátfüggvénye: +½ és –½

- két sajátértéke van: +½ és –½A megfelel két sajátérték egyenlet: ÎZ +½= +½ +½ és ÎZ –½= +½ –½

vagy röviden ÎZm= mm ahol m ±½.

A feles-spin Hamilton-operátorának sajátértékei: Az impulzusmomentum z-komponense (ÎZ) és a B0 indukciójú mágneses tér (B0||z) kölcsönhatását egyetlen spin esetében leíró H-operátor:

egy-spin = –B0Îz ( ahol = giromágneses együttható)

a +½ és–½ függvények a egy-spin –nek is sajátfüggvényei (hiszen ÎZ –tl csak a –B0 konstansban tér el. ).

A megfelel egyik sajátérték egyenlet tehát : one-spin +½= –B0[ÎZ +½]= –B0[+½ +½]= –½ B0 +½

Tehát egy-spin egyik sajátfüggvénye a +½ , melyhez tartozó sajátérték a –½ B0,míg a másik sajátfüggvénye a –½ , melyhez tartozó sajátérték a +½ B0.

9

Az egy-spin spektruma: Spin ½ esetén tehát 2 energiaszint van: Em = –m B0 ahol m ±½.Tehát E+½ = –½ B0 (E vagy spin up),illetve E–½ = +½ B0. (E vagy spin down)

A kiválasztási szabály értelmében (mivel m = +1 vagy -1) a m = (–½) –+(½) = –1, tehát az az -ból -ba való átmenet megengedett.

E

Eβ

0 = B0 /2

–0

E =EE = +½ B0 – (–½ B0) =B0

h = (h/2)B0

= –0= B0/2 ami a Larmor-frekvencia

Pl. Ha B0= 9,4T és= 2,67522.108 rad s-1 T-1

(protonra) akkor a Larmor-frekvencia = 4,00229. 108 Hz~ 400MHz

E

Eβ

B0

10

Két csatolt spin spektruma: Ha az egy-spin: egy-spin= 0Îz, akkor

két csatolatlan spin esetében: két-spin, csatolatlan= 0,1Î1z + 0,2Î2z = IÎz + Sz, illetve

két csatolatlan spin esetében: két-spin, csatolat = IÎz + Sz + J12Îzz , ahol J12 a skaláris csatolási állandó spin1 és spin2 között.

Két-spin rendszer energiadiagramja, a megengedett átmenetek és a spektrum:

α β β α

α α

β β

1

2 3

4

–I –S

12

átmenet spin állapotok frekvencia12 αα –S –½J12

12

J12J12

13

13

13 –I –½J12

34

34

34 –S +½J1224

24

24 –I +½J12

11

Küls B0 indukciójúmágneses térben a makroszkopikus mágnesezettség (M) gerjesztése, annak precessziójához vezet, amely mérhetindukált feszültséget (mV) eredményez.

12

A Vektor modell és a Bloch-egyenletek

z-irányú mágnesezettség idbeni alakulása:dMz'/dt= –(Mz'–Mo)/T1 Mz'(t)=Mo(1–exp(–t/T1)

az x,y-síkban zajló csillapított amplitúdójú precesszió alakulása:dMx'/dt= (ωo–ω)My'–Mx'/T2dMy'/dt= –(ω o–ω)Mx'–My'/T2Csatolt differenciál-egyenletrendszer megoldásaként a következt kapjuk:

Mx'(t)=Moexp(–t/T2)sin(ωo–ω)My'(t)=Moexp(–t/T2)cos(ωo–ω),

ahol (ωo–ω) a forgó referencia rendszerben a precesszió szögsebessége.

csatolási állandó

(J érték)

terület

félértékszélességmultiplicitás

kémiai eltolódás δ=[(υM -υR)/ υR]106

A nagy felbontású NMR-spektrumok öt jellemz paramétere:

13

14

1H-spektrum

Ix sin(ΩIt2)és

Sxsin(ΩSt2)

A spektrumban a JIS okozta modulációtól eltekintünk

I

S-Iy

és

-Sy

sspinrendszerekpinrendszerek azonosazonosííttáásasa

I SF1(ppm)

Iz és Sz

15(ppm)

0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.0

Egy ~17 kDa globuláris fehérje1H-spektruma

H2O/D2O 9/1, T=300K, c 1mM


amid Hαααα metilaromás alifás

16

1. 1. spinrendszerekspinrendszerekazonosazonosííttáásasa

2. 2. spinrendszerekspinrendszerekszekvenciszekvenciáális lis


3. 3. kkéényszerfeltnyszerfeltéételek telek alapjalapjáán n


17


Homonukleáris eljárás (homonukleáris 3J, M<8kDa)

(1H-1H COSY, 1H-1H RELAY, 1H-1H TOCSY )

Heteronukleáris eljárás (heteronukleáris 1J, 2J, 3J) 15N-szerkesztés (M <15kDa)

(1H-15N TOCSY-HSQC, 1H-15N NOESY-HSQC )

15N, 13C-szerkesztés (M <20kDa)

(HNCA, HNCOCA, ….)

15N, 13C-szerkesztés (2H) (M <30kDa)

18

PeptidekbenPeptidekben éés a fehs a fehéérjrjéékben az aminosavak kben az aminosavak hidroghidrogéénatomjai elknatomjai elküüllöönnüüll spinrendszereketspinrendszereket alkotnakalkotnak

– Ala – Ser – Glu – Gly – Phe – Cys –

13J


19

A Vektor modell és a Bloch-egyenletek helyett a szorzatoperátor-elmélet

Alapfogalmak:magspin-operátor vagy impulzusnyomaték-operátor: Î Î = Îx, Îy, Îz

az idtl függ spinsrség-operátor σ(t)az idtl függ Hamilton-operátor !(t)az idtl függ, normalizált állapotfüggvény ψ(t)

Az alapegyenlet: dσσσσ(t)/dt = –i–1[!(t),σσσσ(t)] Liouville- von Neumann-egyenlet

Mi kerül a Hamilton-operátorba?Az I és S spinek (AX spinrendszer) esetén, oldatfázisban:Zeeman-effektust + a skaláris csatolást + a rádiófrekvenciás gerjesztést leíró három

tag.

= –ωωωω1Îx –ωωωω2x + JÎzz –ΩΩΩΩIÎz –ΩΩΩΩSz

20

Cél a mérhet makroszkopikus mágnesezettség-vektor (M) nagyságának és moduláltságának meghatározása:

A megfigyelhet makroszkopikus mágnesezettség pl. My összetevje a következ:

My(t) = Nγ Tr[ΣIkyσ(t)]k ahol γ és mellett, N az egységnyi

térfogatban vett spinek darabszáma.

A feladat: A magspin operátor (I) valamint a srségoperátor σσσσ(t) szorzatának valamilyen bázison vett mátrixreprezentációjának a spurját (Tr) kell meghatároznunk!

A nagy kérdés: mi legyen az alkalmas bázis? Mi legyen az s elembl álló báziskészletet (Bs) ? σ(t) =Σ bs(t)Bs

s

B Is

q

kl

a

k

n

sk= −

=

∏2 1

1

( ) ( )

A megoldás: a Bs báziskészlet legyen a spin impulzusmomentum-operátor. Sorensen korábbi javaslata értelmében a Descartes-típusú Ikl bázisoperátorok használata az alábbiak szerint felettébb eredményes:

21

2IzSz2IzSy2IzSxIzIz

2IySz2IySy2IySxIyIy

2IxSz2IxSy2IxSxIxIx

SzSySxEE

SzSySxE

Az I és S spinek (AX spinrendszer) 16 bázisoperátort táblázatos alakban:

Bs elemeihez milyen fizikai kép rendelhet?

mágnesezettség (populáció, NOE)

szin-fázisú egyszeres kvantumkoherenciáik.

S spinen lokalizálható ellentétesfázisúkoherenciák

I spinhez tartozó ellentétesfázisú koherenciák

22

Tipikus transzformációk a 16 bázisoperátor által kifeszített koherencia-térben:

σ(t=0) = hB0 (γIIy + γSSz)/(8πkT)H = ΩIIz + ΩSSz –πJISIzSz

σ(t=0) IySz[Ωst]

Iy

Iz[ΩIt]

+ Iy cos(ΩIt) - Ix sin(ΩIt)2IzSz(JISπt)

+ Iy cos(ΩΩΩΩIt)cos(JISππππt)- 2IxSz cos(ΩIt) sin(JISπt)- Ix sin(ΩIt) cos(JISπt)

σ(t) - 2IySz sin(ΩIt) sin(JISπt)

Iy

σ(t=0) σ(t)

23

+ Iy cos(ΩΩΩΩIt)cos(JISππππt):cos(A)cos(B) = 1/2[cos(A+B)+cos(A–B)]

következen a spektrum alakja: +1/2Iy[ +cos(ΩI+πJIS)t + cos(ΩI−πJIS)t ]Iy [ +a, +a] ΩI kémiai eltolódásértéknél

memo: az spektrum a Bloch-egyenlet alapján: S(t) = C*exp(–t/T2)cos(ΩIt).

1H-spektrum

Ix sin(ΩIt2)és

Sxsin(ΩSt2)


I

S-Iy

és

-Sy

I SF1(ppm)

Iz és Sz

24

Iy

1H-1H COSY (homonukleáris korrelációs spektrum)

Sxsin(ΩI t1)cos(ΩSt2)

–2IzSysin(ΩIt1)

ΩS

ΩI ΩS

ΩI

2IySzsin(ΩIt1)

I

S


25

1H-1H COSY

ΩS

ΩI ΩS

ΩI

NH

H

Hββββ

Hγ1γ1γ1γ1

Hγ2γ2γ2γ2NH

H

Hββββ

Hγ1γ1γ1γ1

Hγ2γ2γ2γ2

F2(ppm)

F1 (p

pm

)



26

Fehérje modul 1H-1H COSY spektrumasspinrendszerekpinrendszerek azonosazonosííttáásasa

27

1H-1H TOCSY protonok teljes korrelációját létrehozó spektrum


Iy

I

βod = diagonálison kívüli intenzitások

K

Skx βodsin(ΩI t1)cos(ΩSt2)k=1

S1 S2

3S4

3S3

NH

H

Hββββ

Hγ1γ1γ1γ1

Hγ2γ2γ2γ2

NH

H

Hββββ

Hγ1γ1γ1γ1

Hγ2γ2γ2γ2

F2(ppm)

F1 (pp

m)


diagonális

jelek

diagonálisonkívüli jelek

28

Fehérje modul 1H-1H TOCSY spektrumasspinrendszerekpinrendszerek azonosazonosííttáásasa

29

Heteronukleáris egyszeres-kvantum koherencia spektrumHSQC = Heteronuclear Single-Quantum Coherence

Hz-2HzNy

+2HzNy cos(ΩNt1)Hx cos(ΩNt1)

Hx cos(ΩNt1)cos(ΩHt2)ΩN

ΩH

1,1J~90Hz

30(ppm)

5.25.66.06.46.87.27.68.08.48.89.29.610.010.410.8

A kalmodulin 1H spektrumánakamid NH és aromás tartománya

A kalmodulin 1H-15N HSQCspektruma

(ppm) 9.6 8.8 8.0 7.2 6.4

144

136

128

120

112

104

96

(ppm)

J ≈ 90 Hz

31βod = off diagonális intenzitásA JIK okozta modulációtól eltekintünk


ΩH

ΩNH

ΩN

IN

K

-Iy

–2Izcos(ΩIt1)–2Izβod cos(ΩKt1)

–2IzNy βodcos(ΩKt1)

–2IzNy βodcos(ΩKt1)cos(Nt2)

–Ix βodcos(ΩKt1)cos(Nt2)

–Ix βod sin(It3)cos(Nt2)cos(ΩKt1)

3D-TOCSY-HSQC15N-szerkesztéssel

32

15N-szerkesztett TOCSY spektrum

Homonukleáris 2D TOCSY

1H-1H TOCSY amid NH

(ujjlenyomat) tartománya


33

15N-szerkesztett 2D TOCSY

EVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAACTLKACPQ

1H-15N 3D TOCSY-HSQC csíkok

1H-1H TOCSYamid NH

(ujjlenyomat) tartománya 1H

1H

15N


34






(AMX) Ser(AX) Gly

(A3X) Ala (A2M2X) Glu

35

A szekvenciA szekvenciáális hozzlis hozzáárendelrendeléés s éés a s a szerkezetszszerkezetszáámolmoláás alapja s alapja a a nuklnukláárisris OverhauserOverhauser-- effektus (NOE)effektus (NOE)

(NOE)

Távolság jelleg adatok

6Å

36

Fehérje modul 1H-1H NOESY spektrumasspinrendszerekpinrendszerek azonosazonosííttáásasa

37

– Ala – Ser – Glu – Gly – Phe – Cys –

A sA spinrendszerekpinrendszerek szekvenciszekvenciáális rendezlis rendezéésséét t biztosbiztosííttóó HHαααααααα

ii--11--HHNHNHii NOENOE--kk

sspinrendszerekpinrendszerek szekvenciszekvenciáális rendezlis rendezéésese

38

Ser

Ala Glu

Phe

CysGly

A szekvenciA szekvenciáális lis hozzhozzáárendelrendelééss

Ala Ser Glu Gly Phe Cys

sspinrendszerekpinrendszerek szekvenciszekvenciáális rendezlis rendezéésese

39






(AMX) Ser(AX) Gly

(A3X) Ala (A2M2X) Glu

- Ala – Ser – Glu - Gly -

40

Fehérje modul 1H-1H NOESY spektrumaszerkezetszszerkezetszáámolmolááss

41

Fehérjék NMR-szerkezetvizsgálata

OmpX bakteriális membránfehérje térszerkezete

Kurt Wüthrich(ETH, Zürich)

Mozgékony szekvenciarésszelrendelkez prion fehérje

42

Biomolekulák dinamikai vizsgálata

GCN4 éleszttranszkripciós faktor gerinc-dinamikájának

vizsgálata

Arthur G. Palmer III(Columbia University)

43

Fehérje feltekeredés vizsgálatok (ns és ms idskálán)

Alan Fersht(Cambridge University)

44

CalpastatinPéter Tompa

MASP-2Péter Gál

Our most recent targets:

dUTPaseBeáta Vértessy

InhibitorsLászló Gráf

DLCLászló Nyitray

CalmodulinOvádi Judit

HomeodomainsBotond Penke

P

APPaseLászló Polgár

Peptides and miniproteinsGábor Tóth

CCPPéter Gál

45

$%#&'(%

(Emil Fischer)

) !''*#+' ,

46

• A kalmodulin reorientációja

célfehérje vagy antagonista hatására

a molekula „összecsuklik” , - az N- és C-terminális közel kerül egymáshoz, - ám a D és az E -hélixeket összeköt részrl

az alacsony elektronsrség miatt nincs krisztallográfiai információ

együttmködésben Ovádi Judittal és

munkatársaival

(MTA SZBK Enzimológiai Intézet)

47

Vinblasztin

KAR-2

• Vinca alkaloidok (biszindol) mint CaM antagonisták

Catharantus (Vinca) roseus alkaloidjai (vinblasztin, vinkrisztin)

- sejtosztódásgátló hatás (kemoterápia)- célpontjuk a sejt mikrotubulárishálózata- jelents mellékhatások (neurotoxicitás)

- In vivo kísérletekben ugyanolyan hatékonynak bizonyult, mint a természetes vinca alkaloidok- Mellékhatása jóval kisebb

VBL

KAR

Orosz és mts. British J.Pharmacol. 1997, 121, 947Orosz és mts. British J.Pharmacol. 1997, 121, 955Orosz és mts. British J.Cancer 1999, 79, 1356

48(ppm)

5.25.66.06.46.87.27.68.08.48.89.29.610.010.410.8

A kalmodulin 1H spektrumánakamid NH és aromás tartománya

A kalmodulin 1H-15N HSQCspektruma

(ppm) 9.6 8.8 8.0 7.2 6.4

144

136

128

120

112

104

96

(ppm)

J ≈ 90 Hz

49

A kalmodulin KAR2 – vel való titrálása során kapott 1H-15N HSQC spektrumok összevetése

l5N

lH

50

Ligandkötés azonosítása

51

G

Az ERD-14 egy szerkezetnélküli fehérje:lombiktól az él sejtig

Tompa PéterSzalainé Ágoston Bianka

52

Dehidrin = abiotikus stressz (abszcizinsav) hatására fejezdik ki a növényben:

– vízhiány, magas sótartalom (NaCl), hideg

• ERD14 = Early Response to Dehydration 14

• 185 aminosav, 20 kDa

• rendezetlen fehérje

– sok poláris, töltött aminosav

– kevés hidrofób aminosav

53

J ≈ 90 Hz 800 MHz10 mM MES

pH 6.5

288 K

TROSY-HSQC spektrum

15N

1H

54

Az ERD14-nek nincs oldatban

térszerkezete (valójában túl sok is van neki)

• Relaxációs mérések:

hetN

OE

5 régió, amely 5-25 % helikális hajlammal rendelkezik

55

• Ez különösen igaz rendezetlen fehérjékre:

A fehérjezsúfoltság /„crowding” a sejten belül sokat számíthat!

Él sejtben kell mérni!

Vizes oldat vagy puffer sejt

E.coli az NMR csben

56

• „in cell NMR”

– E.coli

– ERD14 kifejeztetés

– Sr

sejtszuszpenzió az

NMR csben

• Pufferben

• Él sejtekben– Sejtek felülúszója

üres spektrumot ad

NMR él E.coli-ban

500 MHz

sejtekben

277 K

57

• Dextrán:

– Sejten belüli állapotot

(fehérjesrséget és

viszkozitást) utánoz

• Itt nem tnnek el a

jelek

• Puffer• Puffer + 150g/L

dextrán• Puffer + 300g/L

dextrán

Kontroll az in cell NMR-hez

=> Amit látunk, tényleges kötdés, kölcsönhatás!

58

• Eltn – Elmozduló – Helyükön maradó csúcsok

Szerkezet sejtben = Rendezetlen

5 régió, amely valamihez kötdik a sejtben

59

τlokális

RexH/D

τeffektiv= τC +τlok.aggregáció

1 s 1 év

feltekeredés

1ms 1h

másodlagos szerkezeti

elemek 10ns 1ms

hurkok és kanyarok

záródása

0.1ms 10ms

Rot. Dif.

korrel. id

1ns<τc< 10ns

oldallánc forgás

0.1ps 10 ps

gerinc dinamika

1ps 10ns

A molekuláris mozgás idskálái

Kiss Róbert

60

~ 1s

~ 100 ezer

~ 30 millió

1h

1év

61

10-12

ps

10-9

ns

10-6

µs10-3

ms100

s

102

~min

sec

kötések

mozgásai

domének, nagyobb

szerkezeti egységek

mozgásai

feltekeredés

Shifman J M et al. PNAS 2006;103:13968-13973

A fehérjék bels dinamikájaNMR

62

A fehérjék bels dinamikájaNMR

10-12

ps

10-9

ns

10-6

µs10-3

ms100

s

102

~min

sec

R1, R2, NOE R1ρρρρ

CPMG

Line-shape analízis

ZZ- csere

63

Fehérjék mozgása; µs-ms idskála

NMR /RDC

µs-ms idskálájúmozgások alapján

számolt S2

X-raykülönböz

partner-fehérjékkel

R1, R2, NOE

R1ρ

Ubiquitin; a „halál csókja”Lange és mts., Science, 2008, 320, 1471

Bels dinamikája „lefedi” a különböz partnerfehérjékkel alkotott komplexeiben észlelt konformációs variációkat.

64

Fehérjék mozgása; ns-ps idskálaNMR /NOE + S2

MUMO szerkezeti sokaság

X-ray a komplexrl

Az inhibitor bels dinamikájával számolt térszerkezetek „lefedik” az enzimmel alkotott komplexben (3 eltérkomplex) mért röntgen konformereket.

fkomponens-elemzés

R1, R2, NOE

R1ρ

Gráf László

Gáspári Zoltán

65

Köszönet minden munkatársamnak

és barátomnak

66

kristályban az egyes atomok helye térben jól meghatározott részletgazdag szerkezet

Fehérje röntgenkrisztallográfia: kémiai Nobel-díj, 1962

Max Perutz, John Kendrew

Fehérjék szerkezete: mit rejt a kristály?

67A skaláris csatolás okozta modulációktól eltekintünk


Cαααα(i-1)

H

NCαααα(i)

Hz

–Hxcos(Nt1)cos(C(i)t2)cos(Ht3)

és–Hxcos(Nt1)

cos(C(i-1)t2)cos(Ht3)

–2HzNycos(Nt1)

–2HzNxCz(i-1) cos(Nt1)

és–2HzNxCz

(i) cos(Nt1)

–2HyNxCy(i-1) cos(Nt1)

és–2HyNxCy

(i) cos(Nt1)

–2HyNxCy(i-1) cos(Nt1)

cos(C(i)t2)és–2HyNxCy

(i) cos(Nt1)cos(C(i-1)t2)

–2HzNy

ΩNH

ΩN

ΩC(i)

ΩC(i-1)

3D-NHCA

Documents

Lehet ségek és kihívások a modern bioNMR spektroszkópia ... · 20 Cél a mérhet makroszkopikus mágnesezettség-vektor (M) nagyságának és moduláltságának meghatározása: