UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

Facultad de Ingeniería Ambiental

LABORATORIO N°2

Tema: Uso de Microscopio – Coloración de BacteriasCurso: Microbiología Sanitaria IProfesor: Jorge Gilberto Tello CebrerosAlumno:

Vaca Vasquez, Jhonatan

“Uso del Microscopio – Coloración de Bacterias”2015 - II

I. OBJETIVOS

Para la coloración de bacterias: Interpretar el fundamento de las coloraciones en la práctica microbiológica. Identificar el tipo de bacterias mediante el método de tinción de Gram. Describir las características de las diferentes formas observadas.

Para el microscopio: Aprender a utilizar el microscopio compuesto. Conocer las partes mecánicas y ópticas del microscopio. Saber de los cuidados que se debe tener al manejar el microscopio.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

El Microscopio:

El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original.

Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio electrónico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magnético.

Los microscopios ópticos generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000 veces.

Las lentes de un microscopio óptico son el colector, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el

sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final.Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador.La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. En general, los aumentos del objetivo son 10x, 40x y 100x (objetivo de inmersión) y los del ocular 5x, 10x y 15x. Por lo tanto, si se trabaja con un ocular de 10x y un objetivo de 100x, el aumento total será 10 x 100 = 1000 veces el tamaño original. El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se usa principalmente como lupas y cristales de aumento.Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder resolutivo; esto es, la distancia mínima a la que se pueden ver dos objetos separados. Viene definido por una fórmula en la que las principales variables son la longitud de onda de la luz y la apertura numérica del objetivo, pero en la práctica, y asumiendo la máxima calidad de las lentes, es aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz con la que se observa. En microscopía de campo claro es 0,2 micras, el microscopio óptico de efecto túnel cuántico permite superar esta barrera y aumentar la resolución por debajo de 0,1 micras.

Apertura numérica. Es la capacidad de recoger luz de una lente. Para lentes secas su valor máximo es de 1, pero por las limitaciones físicas de la calidad de las lentes, raras veces sobrepasan el valor de 0,95. Cuanto mayor sea la apertura podremos conseguir mayor resolución y brillo en la imagen. Si queremos usar lentes con una apertura mayor de 1 (máximo 1,6) estas deben ser de inmersión en aceite con el mismo índice de refracción que la lente.

Coloración de Bacterias:

Una de las características más importante de las bacterias es su morfología, definida por el tamaño, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias en forma redondeada denominadas cocos, en forma cilíndrica, denominadas bacilos y una tercera morfología como son las que tienen forma de espirales, denominadas espirilos. A su vez cada categoría pue- de subclasificarse con base a diferentes arreglos.

Estas características pueden determinarse examinando muestras al microscopio. Las células no teñidas son prácticamente transparentes, pero pueden observarse al microscopio de luz haciendo preparaciones entre lámina y laminilla o con microscopios especiales como por ejemplo: de contraste de fases o de campo oscuro.

Cuando se dispone de un microscopio de luz, se pueden teñir las bacterias para facilitar su visualización. Si se tiñe una muestra del cultivo extendida y fijada en una lámina portaobjeto con un colorante da- do, las células adquirirán el color del colorante añadido y podrá observarse la forma, tamaño y el arreglo de las mismas. Este tipo de coloración se conoce con el nombre de coloración simple.

Para obtener mayor información sobre la morfología y composición química de las bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que involucran el uso de varios reactivos y éstas pueden diferenciarse con base al color que retienen. Ej. Tinción de Gram y Tinción de Ziehl Neelsen.

PREPARACIÓN ENTRE LÁMINA Y LAMINILLA:Este tipo de preparación permite observar vivos a los microorganismos y resulta muy útil cuando se quiere determinar su motilidad. Estas preparaciones son muy fáciles de realizar, pues sólo se coloca sobre la lámina portaobjeto la suspensión de microorganismos a observar y luego ésta se cubre con una laminilla. Entre los principales inconvenientes que tiene esta preparación, es que al no estar los microorganismos teñidos, se dificulta su observación al microscopio y se puede con- fundir el movimiento microbiano con las corrientes internas que se producen a causa de la evaporación del medio a través del borde de la laminilla.

COLORACION SIMPLE Las tinciones se basan en la utilización de colorantes que pueden clasificarse como naturales o sintéticos. Los naturales se utilizan principalmente con fines histológicos. La mayor parte de los colorantes que se utilizan para teñir bacterias son sintéticos, muchos de ellos son las anilinas y los derivados del benceno.

Se habla de coloración simple cuando una muestra extendida se tiñe con un solo colorante. Si la preparación se tiñe con safranina, las bacterias adquirirían un color rojo, si se utiliza azul de metileno, se teñirán de azul, si por el contrario se tiñen con cristal violeta, las bacterias aparecerán teñidas de color violeta, es decir adquirirán el color del único colorante que se utilizó. Este procedimiento permite distinguir la morfología y estructuras internas de la célula bacteriana, como por ejemplo, la presencia de endospora bacteriana. Existen coloraciones especiales que permiten poner de manifiesto estructuras bacterianas como por ejemplo: flagelo, cápsula, endosporas, etc.

TINCION DE GRAM En 1884, un bacteriólogo danés, Christian Gram, desarrolló una técnica de tinción que permite separar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas, basados en si retienen o no, el colorante primario (cristal violeta) luego del proceso de decoloración. Los organismos que retienen el cristal violeta luego de la adición del agente decolorante, el alcohol, aparecen como azul oscuro o violeta, y se designan como Gram positivos; aquellos que pierden el cristal violeta y se tiñen con el colorante secundario, la safranina, aparecen como rojos y se de- signan como Gram negativos.

Un examen minucioso de un extendido bacteriano teñido diferencialmente, provee una información muy importante sobre la caracterización morfológica e identificación de la muestra. Por ejemplo, una reacción positiva o negativa a la Tinción de Gram es sumamente importante como medio primario de clasificación.

El procedimiento puede resumirse de la siguiente manera: una vez que la prepa- ración ha sido fijada a la lámina portaobjeto, se añade el colorante cristal violeta, el cual se deja en contacto por 1 minuto y las células se tiñen de color violeta, posteriormente se lava el exceso de colorante con agua destilada, luego se añade la solución de lugol, que actúa como mordiente, y se deja en contacto por un 1 minuto. El yodo se combina con el cristal violeta y forma un compuesto que precipita en el interior de la célula; este complejo puede extraerse fácilmente con alcohol etílico de las gram negativas, pero no se remueve fácilmente de las gram positivas. Una vez realizada la decoloración se añade el colorante de contraste, la safranina, la cual se deja en contacto por 30 segundos; el exceso de colorante se elimina con agua destilada. Las láminas así preparadas se secan a temperatura ambiente o con la ayuda de toallas absorbentes. Este procedimiento se esquema- tiza en la siguiente figura:

El por qué las bacterias gram positivas retienen el complejo cristal violeta-yodo y las gram negativas no, ha sido un tema muy controversial. Una de las explicaciones que se dan, está relacionada con la naturaleza química de la pared celular de las bacterias gram positivas que previenen la remoción del complejo con el alcohol. Otra teoría mantiene que la gruesa envoltura celular de las gram positivas, específicamente la capa gruesa de peptidoglucano, se deshidrata y al encogerse por el efecto del alcohol, ocasiona el cierre de los poros lo cual impide la salida del complejo cristal violeta-lugol.En definitiva la pared celular es la barrera para la decoloración. Si se altera la pared celular de las bacterias gram positivas se transforman en gram negativas.

III. METODOLOGÍA

Procedimiento para coloración de bacterias:1. Usar láminas limpias y pasarlas varias veces cortando la llama del mechero

Bunsen. No tocar con los dedos la superficie plana del portaobjetos.

2. Dejar enfriar la lámina y colocar sobre ella una gotita de suero fisiológico.

3. Con inoculador estéril, tocar ligeramente el cultivo que ha de ser examinado y transferir un poquito de él sobre la gotita de suero.

4. Esterilizar el inoculador y dejarlo enfriar.

5. Frotar el cultivo con el inoculador hasta extenderlo sobre la parte central del portaobjetos, cuidando de que se forme una película muy delgada.

6. Dejar que la película seque al aire.

7. Fijar la preparación sobre el portaobjetos pasándola por la llama del mechero tres veces, manteniendo la película hacia arriba de la llama. Dejar enfriar

8. Cubrir la película con el colorante cristal violeta (Gram #1) y dejar así cubierto por espacio de 20 segundos.

9. Lavar con agua durante 20 segundos.

10. Tratar la lámina con la solución lugol (Gram #2) durante 1 minuto.

11. Decolorarla con alcohol etílico de 95° (Gram #3) durante 15 a 20 segundos.

12. Lavar con agua la lámina, durante 2 segundos.

13. Contracolores con safranina (Gram #4) y dejar que se tiña por espacio de 20 segundos.

14. Lavar la lámina con agua, durante 2 segundos.

15. Dejar secar y examinar al microscopio la preparación.

Procedimiento para el uso del microscopio:

1. Debes colocar tus microscopios en una mesa fija, de modo tal que puedas sentarte con comodidad para ver el ocular sin estirarte o apoyarte. trata que la mesa sea lo suficientemente grande como para colocar sobre ella todo el material que necesites para trabajar. El objeto que se desea examinar debe colocarse en un portaobjetos, que se una lámina de vidrio de 1mm d espesor y a continuación se cubre con un cubreobjetos, un cuadrado de 2cm de lado o un circulo con esa medida de diámetro.

2. La distancia del microscopio al filo de la mesa no debe ser menor a 15 cm. Además de limpiar los oculares, objetivos, condensador y espejo para una mejor visualización en el microscopio.

3. Practica hasta que tengas la certeza de saber para qué lado debes mover el macrómetro, para hacer subir o bajar las lentes. Para comenzar, seleccione siempre la lente de menor aumento que te permite ver mejor el objeto y encontrar fácilmente la parte que más te interesa observar.

4. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre las láminas teñidas y secas y examinarlas bajo un microscopio de luz, utilizando el objetivo de inmersión. (90X-100X)

5. Coloca el portaobjetos sobre la platina de manera tal que la parte que quieres observar se encuentre bajo la lente. Utiliza los broches para fijar el portaobjetos en su sitio. Observa desde un costado la platina y mueve la perilla de enfoque para acercar la lente .Luego mira a través del microscopio y sube las lentes girando el micrómetro hasta que el objeto entre en foco y su imagen se vuelva nítida y clara.

6. Observar varios campos hasta encontrar aquél, donde las células están adecuadamente separadas, para permitir la visualización de la morfología, arreglo de las células, presencia de endosporas y su reacción al Gram.

IV. RESULTADOS

A) USO DEL MICROSCOPIO

OBSERVACIONES A LA CEBOLLA:

LAMINA : CELULA LAMINA: CELULA DE LA CEBOLLA

OBJETIVO:10X

OCULAR:10X

AUMENTO:100X

DESCRIPCION DE LO OBSERVADO:

núcleo de la cebolla

retícula endoplasmática

LAMINA : CEL LAMINA: CELULA DE LA CEBOLLA

OBJETIVO:43X

OCULAR:10X

AUMENTO:430X

DESCRIPCION DE LO OBSERVADO:

núcleo de la cebolla con una

mayor nitidez

retícula endoplasmática

pigmentación de la cebolla

(color violeta)

B) COLORACIÓN DE BACTERIAS

V. DISCUSIÓN

Algunos grupos no pudieron observar sus muestras en los microscopios, esto debido a que pudieron haber realizado mal los procedimientos para la coloración de bacterias (no dispersaron bien la muestra).

Algunos grupos realizaron mal la coloración de bacterias, pues al momento de añadir el alcohol etílico de 95° se excedieron e hicieron que el colorante primario (violeta) salga de las células gram positivas.

VI. CONCLUSIONES

Si bien la manipulación del microscopio es sencilla necesita del debido cuidado y la práctica necesaria para lograr un verdadero adiestramiento.

No siempre será posible visualizar la muestra con todos los objetivos debido a la potencia de aumento.

La diferencia entre los colores obtenidos de las bacterias Gram. Se basa en las diferencias que existen entre sus paredes celulares y su resistencia a la decoloración, la membrana externa Gram negativa es soluble al alcohol /acetona, la delgada capa de peptidoglicanos es incapaz de retener el cristal violeta y la célula se decolora. Al contrario de la Gram positivas que posee una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicano , los cuales no son permeables al alcohol/cetona, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolo, atrapando el cristal violeta y la célula se decolora.

La mayor parte de las colonias analizadas resultaron agrupaciones de los cocos, los cuales pueden causar afecciones respiratorias y algunos procesos severos como la meningitis.

Comparando los resultados concluimos que la mayoría de las bacterias estudiadas eran Gram positivo.

Luego de conocer la morfología de las bacterias podemos reconocerlas.

VII. RECOMENDACIONES

Se debe tener cuidado al momento de pasar el portaobjetos en el mechero y evitar quemaduras o rupturas del material, además de la conservación de las colonias.

Se debe tener en cuenta la edad de las bacterias así como la debida esterilización de los instrumentos.

Hacer un adecuado uso del microscopio al observar los colores de las bacterias.

Tener en cuenta la limpieza para disminuir el crecimiento de las bacterias y así evitar algunas enfermedades que causan estas.

Siempre debemos trasladar el microscopio, agarrándolo con las dos manos una de ellas en el brazo, y la otra con la palma hacia arriba sosteniendo la base o pie.

Los tornillos (macrométrico y micrométrico) y el revólver deben moverse siempre con cuidado y sin apresuramiento, para evitar que los lentes se rompan o rayen.

Al acercar la lente del objetivo a la preparación, debemos mirar directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

Debemos utilizar una gota de aceite para realizar la observación con el objetivo de inmersión 97X.

Para limpiar la lente debe usarse solo papel lente. Puesto que otro material puede rayarlo.

Ningún líquido debe mojar pieza alguna del microscopio. Las láminas que se colocan en la platina deberán estar siempre secas.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA

Textos: Pelczar Michael J. Microbiología, editorial McGraw – Hill cuarta edición, México

1982. (Microscopio – Tinción de Gram) Biología de los microorganismos Brock- Michael T. Madigan (Estructura y función

celular- Microscopio)

Páginas Web: http://www.maristasourense.com/extras/materias/bioloxia/Microscopio.PDF http://www.agro.unlpam.edu.ar/catedras-pdf/biologia2010/Apuntes%20Te

%F3ricos%202010/Microscop%EDa%202010.pdf http://biologiamedica.blogspot.com/2010/09/bacterias-gram-positivas-y-

gram.html http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/

capitulo4_4.htm

IX. ANEXO

PARED CELULAR DE LOS PROCARIOTAS:

Las bacterias se dividen en dos grandes grupos: las gram positivas y las gram negativas. La distinción inicial entre estos dos tipos se llevó a cabo mediante una tinción diferencial denominada “Tinción de Gram”; pero la diferente reacción a la tinción de gram se basa en las diferencias que existen en la estructura de las paredes celulares. La morfología de las paredes celulares es muy distinta en las células gram positivas y negativas. La pared celular en las gram negativas está compuesta por varias capas y es bastante compleja, mientras que en la pared en las gram positivas está formada fundamentalmente por un solo tipo de moléculas y suele ser más ancha. Un examen detallado mediante microscopía electrónica de barrido permite detectar diferencias claras en la textura de la superficie de los dos tipos de paredes celulares.

Peptidoglicano:

En la pared celular de bacteria hay una capa rígida que es la responsable de la resistencia de la pared celular. En bacteria gram negativas existen capas adicionales que se sitúan en el exterior de esta. Esta capa rígida tiene una composición química muy similar tanto en bacteria gram positivas como en gram negativas. Se denomina capa de peptidoglicano, esta constituido por una lámina en la que las cadenas de derivados de azucares se conectan entre sí por puentes peptídicos a través de los aminoácidos. En batería gram positivas, el peptidoglicano representa hasta el 90% de la pared, aunque otra clase de componentes, los ácidos teicoicos, también suelen estar presentes en pequeñas cantidades. Aunque algunas bacterias poseen solo una capa de

peptidoglicano rodeando a la célula, muchas otras, en especial las bacteria gram positivas, presentan varias capas. En bacteria gram negativas, el peptidoglicano constituye solo alrededor del 10% de pared, estando constituido el resto por una membrana externa. Sin embargo, tanto en gram positivas como en gram negativas se cree que la forma de las bacterias viene determinada por la longitud de las cadenas peptidoglicano y por el número y tipo de puentes establecidos entre las cadenas.

Diagrama esquemático de paredes celulares Gram positivas y Gram negativas.