SNGELE 10.9. Numrarea globulelor roii i albe In sngele circulant al organismului fiziologic normal, numrul elementelor figurate: hematii, leucocite, trombocite se menine la valori constante, dependente de specie i de sex. La unul i acelai individ, numrul elementelor figurate se modific semnificativ n cazul modificrii brute a condiiilor de mediu i n stri patologice. Principiul lucrrii: determinarea numrului de elemente figurate din snge sau alte lichide biologice se bazeaz pe numrarea direct, la microscop, a celulelor dintr-un volum cunoscut de lichid care a fost diluat n prealabil ntr-o proporie cunoscut. Diluarea prealabil a sngelui este necesar n vederea evitrii coagulrii lui i pentru a permite numrarea elementelor figurate, care sunt foarte multe ntr-un volum mic de snge. A. Numrarea globulelor roii Materiale necesare: lichid de diluie (Hayem, Marcano sau Gower), pipet Potain pentru hematii, hemocitometre, microscop, ace pentru puncie, vat, alcool, eter. a) lichidul de diluie trebuie s ndeplineasc urmtoarele caliti: - s fie izotonic cu sngele, pentru a nu produce hemoliza sau ratatinarea eritrocitelor; - s conin un fixator, care s conserve forma hematiilor i s mpiedice autoliza i aglutinarea lor. Se utilizeaz diferite lichide de diluie: Lichidul Hayem - clorur mercuric (sublimat) HgCl2...........5,0 g se dizolv n 100 ml ap - clorur de sodiu NaCl ..............................10,0 g - sulfat acid de sodiu NaHSO4 ....................37,5 g Se completeaz cu ap la 1000 ml. Dup preparare, lichidul Hayem se filtreaz prin hrtie de filtru. Pentru obinerea de rezultate bune, soluia nu trebuie s fie mai veche de trei sptmni. n cazuri de disproteinemii, aceast soluie poate produce precipitarea i aglutinarea hematiilor. Acelai lucru se poate ntmpla n ciroze i pneumonii atipice. Lichidul Gower - sulfat de sodiu Na2SO4 ...........................12,5 g - acid acetic glacial .....................................33,3 ml Acest lichid este superior soluiei Hayem, deoarece mpiedic formarea rulourilor de hematii n disproteinemii. Lichidul Marcano - sulfat de sodiu Na2SO4 ...........................5,0 g - formol 40% ............................................1,0 ml Se completeaz cu ap distilat la 100 ml. Ca lichid de diluie se poate folosi i ser fiziologic. b) pipeta de diluie Potain pentru hematii (fig. 1) conine n total 101 volume, din care un volum revine capilarului, subdivizat n 10 uniti egale, cu inscripiile 0,5 i

1,0, iar 100 de volume revin bulei de diluie n care se afl o bil de culoare roie. La partea de sus a pipetei se adapteaz un tub de cauciuc, care permite o aspiraie uniform a lichidelor. Dac sngele este tras n tubul capilar pn la diviziunea 0,5, respectiv 1,0, i apoi completat cu lichidul de diluie pn la diviziunea 101, se obine o diluie a sngelui de 200, respectiv 100 ori. De unde rezult acest calcul? n bula de diluie se vor afla 101 - 1 volume, din care 0,5, respectiv 1 volum de snge, iar restul pn la 100 - lichid de diluie. Un volum din cele 101 rmne pe tubul capilar i nu particip la diluarea sngelui. Deci, factorul de diluie va fi: 100 vol. lichid + snge ------------------------- = 100 , sau: 1 vol. snge 100 vol. lichid + snge ------------------------- = 200 1 vol. snge 0.5 vol snge

Fig. 1. Pipeta Potain pentru hematii

Fig. 2. Pipete Potain pentru hematii (dreapta) i pentru leucocite (stnga).

Dup ntrebuinare, pipetele se spal cu ap, apoi cu alcool i eter, se usuc, se sterilizeaz la cldur uscat. c) hemocitometrul (fig. 3) este format dintr-o lam de sticl groas, care are

gravat pe ea o reea cu dimensiuni cunoscute. Zona lamei pe care se afl reeaua gradat se gsete la o adncime de 0,1 mm fa de restul lamei, aa nct, atunci cnd acoperim camera cu o lamel, ea delimiteaz un spaiu nalt de 1/10 mm. In acest spaiu ptrunde sngele diluat, iar globulele se dispun ntr-un singur strat, permind numrarea lor. Mai des folosite sunt urmtoarele tipuri de lame (fig. 4):

Fig. 3. Hemocitometru (camer de numrare). - camera Thoma

Fig. 4. Camera Thoma. Reeaua lamei Thoma are latura de 1 mm i suprafaa de 1 2. Suprafaa central este subdivizat cu linii triple n 16 patrate de ordinul al II-lea cu mm suprafaa de 1/25 mm2, care la rndul lor sunt subdivizate prin linii simple n 16 patrate

de ordinul al III-lea cu suprafaa de 1/400 mm2. - camera Burker Fig.5. Camera Burker. Are o suprafa de 9 mm2, mprit n 9 patrate de cte 1 mm2, delimitate prin linii triple. Fiecare mm2 este subdivizat prin linii duble n 16 patrate cu suprafaa de 1/25 mm2. La ntretierea liniilor duble se nscriu patrate mici, cu suprafaa de 1/400 mm2.

- camera Burker-Trk Fig. 6. Camera BurkerTurk are o suprafa de 9 mm2, gravat dup tipul Burker combinat cu tipul Thoma. Partea central a reelei, n form de cruce, este de tip Thoma, iar colurile, de tip Burker.

- camera Goreaev Are un cadrilaj n care alterneaz cte un grup de 16 patrate cu suprafaa de 1/400, cu grupuri de patrate cu suprafaa de 1/25 mm2.

La toate tipurile de lame, patratele cu suprafaa de 1/400 se folosesc pentru numrarea hematiilor, iar cele cu suprafaa de 1/25 mm2 pentru numrarea leucocitelor. Curirea lamei i a lamelei se face imediat dup utilizare, prin splare cu ap rece sau cldu. Dac s-a uscat sngele pe lam, se spal cu ap cldu i spun, se cltete cu ap de robinet i se usuc la temperatura camerei, sau se terge cu o crp ce nu las scame. Dup curire, camera i lamela se apuc numai de margini. d) microscopul: se lucreaz cu obiectiv uscat mare 40, ocular 10 sau 7, lumin slab. Desfurarea lucrrii: a) recoltarea sngelui: se terge degetul (inelar sau mijlociu) cu alcool i eter pentru dezinfecie i ndeprtarea grsimii. Cu un ac de sering flambat i ters cu alcool, se face o neptur n pulpa degetului n partea lateral, brusc i suficient de profund, nct sngele s curg spontan sau cel mult dup o uoar presiune de-a lungul laturii degetului, la o oarecare distan de locul nepturii. Stoarcerea degetului duce la diluarea sngelui cu limf i la obinerea unor rezultate eronate. Prima pictur de snge se terge, iar a doua se aspir n pipet pn la diviziunea 0,5 (n anemii pn la 1), citirea fcnduse cu pipeta n poziie aproape orizontal. Dac sngele depete uor diviziunea, prin atingerea vrfului pipetei cu o hrtie de filtru se poate aduce coloana de lichid la diviziunea dorit. Se terge sngele de pe exteriorul pipetei i se aspir foarte rapid lichidul de diluie pn la diviziunea 101. Se aeaz pipeta n poziie orizontal, se astup cele dou capete cu policele i indexul i se agit timp de 5 min pentru omogenizare. Pn la numrarea globulelor, pipeta rmne n poziie orizontal. b) umplerea camerei de numrat. Se aplic lamela pe lama de numrat, fie prin adeziune, fie cu ajutorul cavalerilor. Dac lama nu are cavaleri, lamela se va aburi uor la margini pentru a adera bine. Aderena dintre lam i lamel este asigurat cnd se formeaz inelele lui Newton (inele colorate de refracie). Se agit pipeta, apoi primele picturi care se scurg sunt lsate s cad pe o hrtie de filtru. Vrful pipetei se apropie de marginea camerei acoperit cu lamela i se las s intre prin capilaritate n camer o cantitate de lichid, n spaiul de 1/10 mm format ntre lam i lamel. Spaiul dintre lam i lamel trebuie s fie umplut n ntregime, fr ca lichidul s treac n anurile laterale, fr s intre bule de aer n camer. In caz contrar, operaia se repet dup tergerea camerei. Camera se aeaz orizontal pe platina microscopului, unde va sta cteva minute n repaus pentru stabilizarea hematiilor. c) numrarea hematiilor se face pe patratele de ordinul III, astfel: se numr nti globulele care se afl pe latura stng a patratului, apoi cele care se afl pe latura lui superioar i n sfrit cele din interiorul patratului. Nu se numr globulele situate pe laturile dreapt i inferioar ale patratului, deoarece acestea intr n numrtoarea patratului aflat lateral, respectiv dedesubt. Se face astfel citirea tuturor celor 16 patrate de ordinul III de pe un patrat de ordinul II, apoi se trece la alt patrat de ordinul II. Se citesc astfel patratele de ord. III de pe 2 pn la 5 patrate de ord. II (de obicei 5). d) calcularea rezultatului se face dup formula: N x 4000 x 200 3 snge = -----------------nr. hematii/mm , unde: n

N = numrul hematiilor gsite n total n cele 5x16=80 ptrele de ord. III n = numrul ptrelelor de ord. III de pe care au fost numrate hematiile (de obicei 80); 1/4000 = volumul unui ptrel de ord. III, cu suprafaa de 1/20 x 1/20 = 1/400 mm2 i nlimea de 1/10 mm. 200 = factorul de diluie al sngelui n pipeta Potain, n cazul n care s-au aspirat 0,5 volume de snge. Rezultatele se vor trece n urmtorul tabel: Nr. hematii/mm3 snge (x 106) femeie brbat nou-nscut bovine cabaline Se vor compara corespunztoare. valorile valori normale 4,2 - 4,5 4.5 - 5,0 5,0 - 6,0 5,9 - 6,5 7,4 - 7,7 experimentale obinute cu valorile normale valori experimentale

B. Numrarea globulelor albe Materiale necesare: pipeta pentru diluia leucocitelor, lichid de diluie (Hayem pentru leucocite sau Trk), hemocitometre, microscop, ace pentru puncie, vat, alcool, eter. a) lichidul de diluie. Pentru globulele albe se folosete: Lichidul Hayem pentru hematii, la care se mai adaug 0,4 g violet de metil (sau albastru crezil, sau albastru de toluidin). Lichidul Trk - violet de genian 1% ................1 ml - acid acetic glacial .....................3 ml - ap distilat ..........................300 ml Aceste lichide au proprietatea de a distruge stroma globulelor roii (mai ales lichidul Trk) i de a colora nucleul globulelor albe. Astfel n cmpul microscopic rmn numai leucocite. b) pipeta pentru diluia leucocitelor conine n total 11 volume, din care 1 volum revine capilarului subdivizat n 10, iar 10 volume se afl n bula de diluie. Bila de omogenizare este de culoare alb. Diluia sngelui recoltat pn la diviziunea 0,5 este de 1/20, iar a celui recoltat pn la diviziunea 1 - de 1/10. c) hemocitometre - cele utilizate i pentru hematii. d) microscopul - se utilizeaz obiectivul 40, condensatorul microscopului cobort. Desfurarea lucrrii: a) recoltarea sngelui - ca i pentru hematii, aspirnd snge pn la diviziunea 0,5 i lichid de diluie pn la diviziunea 11. Se agit pipeta timp de 3 min. b) umplerea camerei de numrat - la fel ca pentru hematii. c) numrarea leucocitelor - se face pe patratele de ord. II (cu suprafaa de 1/25

mm2). Se numr leucocitele din 125 patrate de ord. II (care reprezint 5 patrate de ord. I, fiecare cu o suprafa de 1 mm2). Tehnica de numrare este cea folosit i pentru hematii. d) calcularea rezultatelor se face dup formula: N x 10 x 20 nr. leucocite/mm3 snge = --------------n N = numrul total de leucocite de pe 5 patrate de ord. I (sau 125patrate de ordinul II); n = numrul patratelor de ord. I citite; 1/10 = nlimea camerei (mm); 20 = factorul de diluie pentru leucocite, n cazul n care s-a aspirat snge pn la diviziunea 0,5 a pipetei. Nr. leucocite/mm3 snge valori normale valori experimentale 4.000 - 9.000 8.000 - 12.000 12.000 - 20.000 7.000 - 9.000 8.000 - 11.000 , n care:

adult sugar nou-nscut bovine cabaline

Rezultatele se vor trece n urmtorul tabel: Discuii: - De ce sugarul i nou-nscutul au un numr mai mare de hematii i de leucocite dect adultul? Rspuns:

- De ce numrul de hematii crete - postprandial - n vasoconstricie periferic? Rspuns:

- De ce numrul de hematii scade dup hemoragii? Rspuns: