Biochimie - Curs 11 - 2019

1

Imunitatea şi anticorpii

Vertebratele posedă un sistem imunitar capabil atât să selecteze cât şi să distrugă

entităţile (virusurile, bacteriile) diferite prezente într-un organism. La mamifere, după ce

aceşti patogeni penetrează prin bariera fizică (piele, membranele celulare) sunt

identificaţi de către organism şi distruşi. Astfel, sistemul nostru imunitar are două

componente: sistemul imunitar nespecific (“înnăscut” sau congenital) și sistemul imunitar

specific (adaptabil). Sistemul imunitar nespecific constituie prima linie de apărare

împotriva microorganismelor invadatoare în timp ce sistemul imunitar specific a doua

linie de apărare și deasemenea asigură protecția în cazul reexpunerii la același agent

patogen.

Ambele linii de apărare posedă două componente prin care își exercită funcțiile

protective (Figura 1, pagina 2):

1. Imunitatea celulară, care se manifestă împotriva celulelor infectate, ciupercilor,

paraziţilor şi a ţesuturilor străine, este mediată de limfocitele T (sau celulele T;

T=timus)

2. Imunitatea umorală (humor = fluid), care se manifestă împotriva infecţiilor

bacteriene şi în fazele extracelulare ale infecţiilor virale, este mediată de o serie de

proteine numite anticorpi (imunoglobuline). Aceste proteine sunt produse de

limfocitele B (sau celulele B), care se află în măduva spinării la adulţi. Anticorpii

(imunoglobulinele, IgG) constituie 20% din totalul proteinelor aflate în sânge.

Celulele sistemului imunitar își au originea și în măduva spinării și includ celulele

mieloblastice (neutrofile, bazofile, eozinofile, macrofagele și dendritice) și limfoblaste

(celulă embrionară, precursoarea limfocitelor B, limfocitelor T sau celulelor ucigașe

naturale).

Imunitatea nespecifică este asigurată de o serie de bariere anatomice. Aceste

bariere includ factorii mecanici (suprafața epitelială – descuamarea epiteliului pielii ajută

la îndepărtarea bacteriilor sau a altor agenți infecțioși care aderă la suprafața epitelială,

peristaltismul tractului gastro-intestinal, acțiunile de curățare a ochilor și gurii prin

intermediul lacrimelor și a salivei), chimici (acizii grași inhibă creșterea bacteriilor,

lizozimul și fosfolipaza din lacrimi, salivă sau secrețiile nazale pot scinda peretele celular

bacterian, valoarea pH-ului - slab acid al transpirației și mai acid al sucului gastric-

previne dezvoltarea bacteriilor, defensinele-proteine cu masă moleculară mică din tractul

gastro-intestinal sau plămâni – au acțiune antibacteriană, transpirația conține peptide

antimicrobiene cu mase moleculare mici).

În situația în care agenții infecțioși penetrează țesuturile, intervine un alt

mecanism de apărare numit inflamație acută. Factorii umorali (sistemul complement,

sistemul de coagulare, lactoferina și trasferina, interferonii – proteine care limitează

replicarea virusurilor, interleukina-1 o proteină care induce febra și produce proteine

antimicrobiene în faza acută) joacă un rol important în inflamație, care este caracterizată

prin edeme ale pielii sau recrutarea celulelor fagocitate. De asemenea, recrutarea

eozinofilelor și macrofagelor la locul infecției constituie o modalitate de răspuns la

inflamații.

Biochimie - Curs 11 - 2019

2

Figura 1. Tipuri de imunitate (umorală şi celulară)

Imunitatea speficică se manifestă atât la nivel celular sau umoral. Răspunsul imun

este datorat prezenţei unei molecule străine (proteină, carbohidrat etc) cunoscută sub

denumirea de antigen. Celulele B conţin la suprafaţă anticorpi sau imunoglobuline.

Aceste imunoglobuline formează un complex cu antigenul, complex care este degradat de

celulele B. Celulele T stimulează proliferarea celulelor B. Acestea din urmă secretă o

mare cantitate de anticorpi, care complexează cu alţi antigeni permițând distrugerea

acestora. Majoritatea celulelor B sunt viabile doar câteva zile după ce au fost stimulate de

prezența unui antigen, însă există şi celule B cu viaţă lungă (cu memorie) care recunosc

antigenul după un timp îndelungat (săptămâni până la ani) permiţând mai târziu inducerea

unui răspuns imunitar secundar.

Anticorpii au o afinitate ridicată pentru antigen. Interacţiile hidrofobe, forţele

ionice şi van der Waals sunt acelea care fac posibilă legarea anticorpilor de antigen.

În situația în care un anticorp recunoaște o proteină (antigen) acesta se leagă la un

segment din acea proteină care poartă denumirea de epitop. În general un epitop are o

lungime de circa 5-6 aminoacizi. Din acest motiv proteinele conțin un număr considerabil

de epitopi la care se pot lega anticorpi diferiți. Într-o secvență proteică se pot afla epitopi

continui (care sunt sub forma unor secvențe liniare ale aminoacizilor) sau discontinui

(care există numai în situația în care proteina este împachetată într-o anumită

conformație).

Interacțiunea epitop-anticorp are loc la nivelul situsurilor de legare ale

antigenului. Această porțiune a anticorpului, caracterizată prin regiuni variabile (a căror

secvență de aminoacizi este diferită), se numește paratop. Acest paratop este capabil să

se lege la un singur epitop.

Biochimie - Curs 11 - 2019

3

Structura anticorpilor

Toate imunoglobulinele posedă în structura terțiară cel puțin 4 subunităţi:

- 2 lanţuri ”uşoare” (eng. L-light) identice (23 KDa);

- 2 lanţuri ”grele” (eng. H-heavy) identice (53-73 KDa).

Aceste subunităţi pot fi asociate prin intermediul legăturilor disulfidice sau

interacţiilor necovalente. Din interacțiunea acestor lanțuri rezultă o moleculă simetrică

având forma literei “Y” (Figura 2).

Figura 2. Reprezentarea schematică a lanţurilor grele şi uşoare

din imunoglobuline şi a punților disulfidice dintre acestea

Se cunosc 5 clase de imunoglobuline (IgA, IgD, IgE, IgG si IgM), proteine care

diferă prin lanţul ”greu” şi câteodată prin structura terțiară și modul de asamblare al

subunităţilor (structura cuaternară).

IgM este un pentamer (conţine 5 subunităţi de forma literei “Y”). Polimerizarea

IgM este iniţiată de o proteină numită lanț J (Eng. joining chain = lanţ de unire).

Subunităţile IgM se atașează prin punți disulfidice. Datorită numărului mare de situsuri

de legare (în număr de 10), IgM are o afinitate ridicată pentru microorganismele (viruşii)

care sunt acoperite de epitopi identici. IgM activează macrofagele şi o grupă de proteine

(numite complement) care sunt capabile să distrugă celulele la care s-a legat anticorpul.

IgA se găşeste sub forma unui monomer, dimer sau trimer. Ultima formă

(trimerul) se leagă de un receptor aflat pe suprafaţa exterioară a celulelor epiteliale şi este

transportată (sub forma unui dimer) prin celulele epiteliale spre lumenul intestinal. IgM

se leagă la acelaşi receptor. Astfel, persoanele care nu au capacitatea de a produce IgA

secretă IgM, care de asemenea joacă un rol hotărâtor în mecanismul de apărare. IgA (sau

IgM) este secretată în salivă, lacrimi, plămâni sau intestine şi constituie prima linie de

apărare impotriva infecţiilor datorate microorganismelor.

Biochimie - Curs 11 - 2019

4

Figura 4. Scindarea enzimatica a

IgG de către papaină

IgG, cea mai comună imunoglobulină este distribuită în mod egal între sânge şi

fluidul extravascular. IgG este principalul anticorp din ser. Se întâlneşte sub forma unui

monomer (Figura 3). Anticorpii IgG pot trece prin placentă la făt în decursul perioadei

intrauterine. Figura

3.

Structura imunoglobulinelor (IgD, IgE si IgG sunt monomeri;

IgA este dimer, iar IgM este pentamer)

IgE există sub forma unui monomer și este prezentă în fluxul circulator la

concentrații modeste (de 300 ori mai mici față de IgG). Acest tip de imunoglobulină este

prezent în sânge (cu o durată de viaţă de ordinul minutelor) protejând împotriva

infecţiilor induse de paraziţi (viermilor intestinali). Concentrații mari de IgE pot fi

asociate cu diverse boli: imunodeficiențe, reacţii alergice sau inflamatorii (iritaţii ale

pielii, instalarea astmului sau febrei).

O funcție distinctă a IgE este aceea de a induce activarea mastocitelor și

bazofilelor prin intermediul unor receptori situați la suprafața acestor celule. Această

interacțiune induce o activare celulară, fapt care determină eliberarea unor componente

pregranulare (histamine și triptaza) și producerea mediatorilor de tip lipidic (prosta-

glandinelor și leucotrienelor) respectiv a

citokinelor.

IgD este un anticorp care apare sub

formă monomerică în membrana plasmatică a

limfocitelor imature de tip B. Multe celule au

această imunoglobulină localizată pe suprafaţa

acestora în schimb se regăseşte mai puţin în

lichidele din organism. Se pare că acest anticorp

este capabil să se lege de mastocite sau bazofile

și să activeze aceste celule în scopul producerii

factorilor antimicrobieni care intervin în siste-

mul imunitar de apărare la nivelul tractului

respirator. Funcţiile IgD nu au fost complet

elucidate.

IgG (Figura 4) a fost clivată cu ajutorul

enzimei papaina în trei fragmente distincte de

Biochimie - Curs 11 - 2019

5

aproximativ 50 KDa fiecare: două fragmente Fab (ab = antigen binding = legarea

antigenului) şi un fragment Fc (c = care poate fi cristalizat mai uşor). Fragmentele Fab

sunt “braţele” anticorpului “Y” şi conţin tot lanţul L şi jumătate din lanţul H. “Piciorul”

anticorpului conţine partea C-terminală a lanţului H. Braţele sunt conectate cu piciorul

prin intermediul unor regiuni flexibile. Imunoglobulinele care recunosc diferiţi antigeni

diferă prin jumatatea N-terminală (reprezentată prin culoarea roşie) a lanţului L.

Legarea antigenului de anticorp

Imunoglobulinele se împachetează sub forma unui sandwich care constă din 3

respectiv 4 lanțuri antiparalele care sunt conectate prin punți disulfidice (Figura 5).

Abilitatea de a recunoaşte moleculele antigenului rezidă din faptul că aceste 3 bucle a

căror domenii sunt variabile (determinând specificitatea faţă de antigen). Complexul

anticorp-antigen se remarcă printr-o constantă de disociere a cărei valoare variază între

10-4 şi 10-10 M având

aproximativ acelaşi ordin de

mărime cu constantele de

disociere ale complecşilor

enzima-substrat.

Figura 5. Modul de împachetare al domeniului “uşor” al

imunoglobulinelor (structura sandwich antiparalelă)

O substanţă / un organism străin(ă) are regiuni

multiple care pot fi recunoscute de diferiţi

anticorpi. Posibilitatea de legare bivalentă a

anticorpilor determină formarea unui complex

reticulat care permite îndepărtarea antigenului şi

accentuează proliferarea celulelor B.

Modalități de obținere și aplicațiile anticorpilor a) Anticorpii policlonali

Iepurele este animalul standard pentru obţinerea anticorpilor policlonali. Acesta

produce până la 500 ml ser (pentru hamster şi porcul de Guineea 20-30 ml, iar pentru

şoarece 0,5 ml). Răspunsul imunitar diferă de la un organism la altul, de aceea

cercetătorii trebuie să imunizeze cel puţin 2 exemplare. Iepurii trebuie imunizaţi cu cel

puţin 10-100 µg antigen (hamsterul cu 2-10 µg). Cu o săptămână înainte de injectarea

Figura 5. Reticularea moleculelor de

antigen cu ajutorul anticorpilor

Biochimie - Curs 11 - 2019

6

antigenului cercetătorii trebuie să colecteze “aşa-zisul” ser preimun (din sângele

iepurelui). După 10 zile de la imunizare se ia o altă probă şi se testează dacă aceasta

conţine anticorpi. După alte 10 zile se injectează antigenul solubilizat în adjuvant

Freunds. La două săptămâni se analizează din nou serul extras şi se poate repeta încă o

dată operaţiunea în situația în care cantitatea de anticorp obţinută este insuficientă.

Purificarea anticorpilor se face prin intermediul cromatografiei de afinitate. De exemplu,

proteina A (M = 42 KDa) din S. Aureus leagă reversibil anticorpii prin intermediul

domeniului Fc.

b) Anticorpii monoclonali

Introducerea unei molecule străine

într-un animal determină sinteza unui set

de anticorpi heterogeni (policlonali).

Pentru obţinerea unui singur anticorp se

poate folosi strategia hibridizării limfoci-

telor (Figura 6). Astfel limfocitele dintr-un

şoarece sunt imunizate cu un antigen

specific, extrase din splină şi fuzionate cu

celule de mielom. Celulele rezultate sunt

apoi crescute pe un mediu selectiv care

permite numai dezvoltarea celulelor

hibride (care

conţin anticorpul). Celulele care produc anticorpi sunt apoi produse la scară mai mare sub

forma unor culturi de ţesuturi sau a unor tumori semisolide.

Anticorpii monoclonali sunt utilizaţi pentru purificarea macromoleculelor, pentru

identificarea bolilor infecţioase, pentru a testa prezenţa unor medicamente în ţesuturi sau

chiar pentru combaterea cancerului. De exemplu, anticorpul monoclonal herceptina se

leagă specific la receptorul factorului de creştere Her2 a cărui concentraţie este mărită în

aproape un sfert din cancerele de sân. Prin această interacţiune se blochează activitatea

receptorului cauzând regresul sau chiar stagnarea tumorii.

Tehnica ELISA (Enzyme-linked immunoabsorbent assay)

ELISA permite detectarea şi cuantificarea rapidă a prezenţei unui antigen într-o

probă. Proteinele din proba de analizat sunt absorbite pe o suprafaţă inertă (un suport

pentru 96 de probe; matrice din plastic pe care sunt grefate grupări hidrofile sau

hidrofobe). Proteinele polare, dizolvate în soluţii tampon, se leagă în mod deosebit de

Figura 6. Obţinerea anticorpilor monoclonali

prin hibridizarea limfocitelor

Biochimie - Curs 11 - 2019

7

suporturile hidrofile. În comparaţie cu legăturile clasice (ionică, covalentă) aceste legături

sunt de 10 ori mai slabe. Legăturile necovalente stau la baza interacţiunilor imunologice.

Este cunoscut faptul că încărcarea unei suprafeţe joacă un rol important în aceste

interacțiuni. Astfel pH-ul şi tăria ionică a soluţiei influenţează în mod hotărâtor procesul

de legare. Cercetătorii aleg pentru acoperirea matricei o soluţie tampon a cărei valoare a

pH-ului este cu 2 unităţi mai mare decât punctul izoelectric al proteinei (pI). În cele mai

multe cazuri se utilizează o soluţie tampon de carbonat de sodiu (pH 9,6).

Există 3 variante de ELISA:

o testul care permite legarea anticorpului (captura anticorpului). În acest test

molecula de antigen este absorbită, iar mai târziu un anticorp marcat se leagă de

aceasta;

o testul cu doi anticorpi (anticorpi sandwich). Primul anticorp este imobilizat pe

matrice. Antigenul se leagă de acest anticorp. Al doilea anticorp (marcat) se poate

lega de antigen (la un alt epitop de pe suprafața acestuia) interacţiune care poate fi

monitorizată spectral sau prin alte medode (radiometric);

o testul care permite legarea antigenului (captura antigenului). În acest test

anticorpul este fixat pe suprafaţă, după care antigenul se poate lega la anticorp.

Proteina (antigenul) care s-a legat nespecific este îndepărtată după mai multe

spălări. Antigenii (marcaţi) care fixaţi pe anticorp permit detecţia acestuia.

1. Testul care permite legarea anticorpului (determinarea antigenului imobilizat)

Legarea unei proteine pe un suport este un proces care necesită un anumit interval

de timp pentru a se atinge limita de saturaţie (18 h). Timpul poate varia în funcţie de

temperatura la care are loc legarea.

Suprafaţa este spălată cu soluţia unei proteine (caseina din lapte praf, gelatină,

albumina serica bovină) pentru a impiedica legarea proteinelor ulterioare de suprafaţă.

Suprafaţa este apoi tratată cu o soluţie care conţine primul anticorp (anticorpul proteinei

de interes). Anticorpul nelegat este îndepărtat prin spălare şi suprafaţa este tratată cu o

soluţie conținând anticorpi pentru primul anticorp (care este antigenul pentru cel de-al

doilea anticorp). Aceşti anticorpi secundari au de regulă grefată o enzimă. Produsul

format (monitorizat prin intensitatea culorii sau fluorescenței) este proporţional cu

concentraţia proteinei de interes din proba de analizat.

Figura 7. Testul ELISA pentru detecţia unui

anticorp dintr-o probă

proba de analizat

proteine nespecifice

primul anticorp

al doilea anticorp

substratul enzimei

grefate pe anticorpul 2

produsul de reactie

colorat care indica

prezenta antigenului

Biochimie - Curs 11 - 2019

8

Cea mai cunoscută variantă de ELISA foloseşte o matrice (placă din plastic) prevăzută cu

96 de lăcaşuri, fiecare dintre acestea cu o capacitate maximă de 200-300 µl. După ultima

etapă de incubare reacţia poate fi monitorizată cu un spectrofotometru special adaptat

pentru acest tip de matrice.

2. Testul cu doi anticorpi (anticorpi sandwich)

Acest test este recomandat pentru detectarea şi

cuantificarea unei molecule de antigen (care are cel

puţin doi epitopi) dintr-o proba necunoscută. Datorită

folosirii anticorpilor monoclonali acest test este extrem

de specific. Această modalitate de testare este

recomandată când antigenul analizat se află în soluţie

cu o serie de alte proteine. După legarea antigenului la

anticorpul monoclonal, celelalte proteine din soluţie pot

fi îndepărtate prin spălare.

Sensibilitatea testului depinde de mai mulţi

factori:

- numărul de molecule de anticorp fixat;

- afinitatea anticorp-antigen;

- modalitatea de marcarea a celui de-al doilea

anticorp, care permite cuantificarea comple-

xului antigen-anticorp.

3. Testul care permite cuantificarea antigenului

Acest poate fi utilizat pentru detecţia şi cuantificarea antigenului utilizat.

Determinarea antigenului se poate face direct prin folosirea unui antigen marcat în proba

de analizat sau indirect prin competiţia dintre un antigen marcat şi unul nemarcat. În

ultimul caz dacă proba testată (care are o cantitate mare de antigeni nemarcati) induce

scăderea numărului de molecule de antigen marcat.

În testele ELISA se apelează la anticorpi sau antigeni marcaţi. De obicei, se

folosesc anticorpi marcaţi (se pot procura de la companii specializate în producerea

acestora). De obicei cuplarea se face cu o enzimă (fosfataza alcalină sau peroxidaza) a

cărui substrat este incolor. Produsul de reacţie este colorat/fluorescent şi poate fi citit la

cititor (spectrofotometru / spectrofluorimetru) în plăci cu 96, 384 sau 1536 godeuri.

Antigenii sau anticorpii pot fi marcaţi si cu substanţe radioactive (enzime marcate

cu 125I). În determinările radioimunologice (RIA – radioimmunoassay) poate fi masurată

radioactivitatea complexului. De asemenea, teste similare (LIA – light immunoloassay)

se pot face şi prin utilizarea substanţelor fluorescente sau a anticorpilor biotinilaţi (care se

leagă specific de streptavidină-o proteină care are afinitate pentru biotină).

Figura 8. Testul ELISA cu doi anticorpi

Biochimie - Curs 11 - 2019

9

Aplicațiile tehnicii ELISA

Testele ELISA pot fi folosite cu succes pentru:

- detecția Leptospirozei - prin cuantificarea nivelului anticorpilor IgM (specifici

leptospirelor) din serul uman;

- screening-ul donatorilor de sânge în vederea evidențierii unei contaminări cu

virusul HIV-1 sau HIV-2 (prezenta anticorpilor anti-HIV);

- screening-ul donatorilor de de sânge în vederea evidențierii unei contaminări cu

Hepatita C (prezența anticorpilor, Ab) și hepatita B (prezența anticorpilor, Ab sau

antigenilor, Ag);

- măsurarea nivelului hormonului luteinizant (HL) sau hormonului stimulator

tiroidian (TSH);

- depistarea infecțiilor cu transmitere sexuală (HIV, sifilis, clamidiozei) sau cu

Toxoplasma gondii;

- prezența alergenilor alimentar (gluten).

Boala celiatică (enteropatia glutenică) este provocată de intoleranța la gluten

(amestec de proteine). Anticorpii anti-transglutaminazei sunt prezenți în entero-

patia glutenică și pot interveni în procesul de distrugere a intestinului subțire ca

raspuns la gliadina din dietă.

În dermatita herpetiformă, în care au loc schimbări minore la nivelul intestinului

subțire, transglutaminaza epidermală este autoantigenul majoritar. Tratamentul

constă în excluderea produselor de grâu (care conțin gliadina).

Un test care se bazează pe un principiu similar celui utilizat în tehnica ELISA este

testul de sarcină care permite detecția unui hormon (gonadotrofina corionică umană,

HCG, care este secretată de placentă la începutul sarcinii). Astfel, pe suprafața benzii

folosită în acest test sunt grefați trei anticorpi la distanțe diferite. Primul anticorp este

marcat (colorat) având drept antigen HCG, este adsorbit pe suprafață. Ceilalți doi

anticorpi (anticorpul pentru HCG respectiv anticorpul secundar care recunoaște specific

primul anticorp) sunt imobilizați pe matrice. Antigenul (HCG) din proba de analizat

(urină) este preluat de către anticorpul marcat (colorat) și migrează până la cel de-al

doilea respectiv al treilea anticorp. În primul caz are loc o interacțiune de tip sandwich,

iar în cel de-al doilea anticorpul secundar are drept antigen primul anticorp (care la rândul

său are situsurile de legare libere, disponibile pentru interacțiunea cu HCG).

Bolile autoimune

O proprietate remarcabilă a sistemului imunitar constă în capacitatea acestuia de a

se dezlănțui numai împotriva substanțelor străine și nu a moleculelor proprii (endogene).

Teoretic toate macromoleculele sunt potențiali antigeni după cum poate fi demonstrat

prin transplantul țesuturilor de la un individ la altul, în cadrul aceleiași specii. Această

incompatibilitate prezintă o serie de provocări în cazul terapiilor care presupun transfuzii

de sânge sau transplantul de organe.

Mecanismul prin care un sistem imunitar individual distinge între substanțele

proprii și străine este mai puțin cunoscut. Începe să opereze de la naștere și se desfășoară

până când apar noi limfocite de-a lungul vieții.

Biochimie - Curs 11 - 2019

10

Toate sistemele organelor sunt susceptibile teoretic la atacul sistemului imunitar

dacă acesta și-a pierdut autotoleranța, dar unele țesuturi sunt atacate mai frecvent decât

altele. Unele dintre cele mai cunoscute boli autoimune sunt enumerate în Tabelul 1.

Tabel 1. Exemplu de boli autoimune

Boala Țesutul/ moleculele

țintă

Sintome majore

Addison cortexul suprarenal nivel de glucoză ↓

slăbirea musculaturii

pierderea Na+, retenție K+

creșterea susceptibilității la stres

Crohn tractul intestinal Inflamații intestinale, diaree

cronică

Graves glanda tiroidă hormon tiroidian↑

creșterea apetitului

scăderea în greutate

Diabetul zaharat

insulino-dependent

celule β-pancreatice pierderea abilității de a produce

insulină

Scleroza multiplă plăcile de mielină ale

fibrelor nervoase din

creier și măduva

spinării

pierderea progresivă a controlului

motoriu

Myastenia gravis receptorii acetil-

colinei la nivelul

sinapselor nervoase

musculare

slăbirea progresivă a mușchilor

Psoriasis epidermă hiperproliferarea pielii

Artrita reumatoidă țesut conjuctiv inflamarea și degenerarea

articulațiilor

Lupus eritmatos

sistemic

ADN, fosfolipidele,

alte componente

tisulare

eczeme, dureri articulare și

musculare, anemie, afecțiuni ale

rinichiului, disfuncții mentale