Kuliah 2 Isolasi Polifenol

8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol

1/28

FITOKIMIA II

METODE ISOLASI POLIFENOL

Lusi Indriani, M.Farm, Apt


2/28

Senyawa Fenolik atau Polifenol

sekelompok metabolit sekunder yang

mempunyai cincin aromatik terikat satu atau

lebih substituen gugus hidroksil (OH) yang

berasal dari jalur metabolisme asam sikimat dan

fenil propanoid.

Kelompok senyawa fenolik/polifenol :

Fenol sederhana, asam fenolat, kumarin, tannin,

dan flavonoid.

Dalam tanaman berada dalam bentuk glikosida

atau esternya.


3/28

Golongan senyawa fenolik sederhana

antara lain meliputi guaiakol, vanilli dan

kresol.


4/28

Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air

karena umumnya berikatan dengan gula sebagai

glikosida dan biasanya terdapat dalam vakuola

sel.

Bagi tanaman, senyawa fenol berperan sbg:

(misalnya lignin sebagai bahan pembangundinding sel, antosianin sebagai pigmen bunga).

Senyawa fenolik sangat penting untuk

pertumbuhan dan reproduksi tanaman, di mana

diproduksi sebagai respon untuk mempertahankan tanaman dari serangan

patogen.


5/28

Pada industri makanan dan minuman,

senyawa fenolik berperan dalam memberikanaroma yang khas pada produk makanandan

minuman, sebagai zat pewarna makanan dan

minuman, dan sebagai antioksidan.

Pada industri farmasi, senyawa ini

banyak digunakan sebagai antibakteri,

antijamur, antioksidan, sedatif, antikanker dan

lain-lain. Senyawa ini juga banyak digunakan

sebagai insektisida dan fungisida.


6/28

Namun, kemampuannya membentuk kompleks dengan protein melalui ikatantunggal dapat mengganggu dalam penelitian.

Selain itu, fenol sendiri sangat peka terhadapoksidasi enzim dan mungkin hilang padaproses isolasi akibat kerja enzim fenolaseyang terdapat dalam tumbuhan.


7/28

Senyawa fenol dan asam fenolat lebih baik dibahas bersama karena biasanya, padaanalisa tumbuhan, mereka diidentifikasi

bersama. Senyawa asam fenolat ada hubungannya

dengan lignin terikat sebagai ester atauterdapat pada daun di dalam fraksi yang

tidak larut dalam etanol, atau mungkinterdapat di dalam fraksi yang larut dalametanol, yaitu sebagai glikosida sederhana.


8/28

Fenil propanoid adalah senyawa fenol alamyang mempunyai cincin-cincin aromatik

dengan rantai samping terdiri atas tiga

atom karbon.

Secara biosintesis senyawa ini turunan

asam amino protein aromatik, yakni

fenilalanina dan fenil propanoid, dapat

mengandung satu sisi C6 – C3 atau lebih.


9/28

Struktur Fenil propanoid


10/28

Yang paling tersebar luas adalah asamhidroksisinamat, suatu senyawa yang penting,bukan saja sebagai bangunan dasar lignintetapi juga sebagai pertahanan terhadap

penyakit.

Yang termasuk fenil propanoidhidroksikumarin, fenil propena, dan lignan.

Empat macam asam hidroksisinamat terdapatumum dalam tumbuhan adalah asam fenolat,sinapat, kafeat, dan p-kumarat.


11/28

Pada prinsipnya,sifat-sifat kimia dari semuasenyawa fenol adalah sama, tetapi dari segibiogenetik senyawa-senyawa ini dapat dibedakanatas dua jenis utama:

1. Senyawa fenol yang berasal dari asam shikimatatau jalur shikimat.

2. Senyawa fenol yang berasal dari jalur asetatmalonat.

Namun ditemukan pula senyawa fenol yangberasal dari kombinasi kedua antara jalurbiosintesa ini, antara lain ialah senyawa flavonoid.


12/28

Sejumlah besar senyawa aromatik alam dapatdianggap turunan fenilpropan, karenamempunyai cicin benzene yang terikat padarantai 3 karbon.

Kelompok senyawa ini berasal dari shikimat. Senyawa-senyawa fenol ditemukan dalam

berbagai organisme,mulai darimikroorganisme sampai pada tumbuhan

tinggi dan hewan. Kapang merupakan sumber yang kaya

akan senyawa fenol yang berasal dari jalurshikimat.


13/28

Beberapa jenis senyawa yang termasuk fenilpropanoid ialah turunan asam

sinamat,turunan alifenol,turunan

propilfenol,turunan kumarin.

Turunan sinamat : asam sinamat, asam

kafeat

Turunan kumarin : kumarin, umbeliferon

Turunan alifenol : Cavicol, eugenol, miristin

Turunan propilfenol : anitol, isoeugenol


14/28

JALUR SHIKIMAT

Jalur shikimat untuk biosintesafenilpropanoid ditemukan pertama kalidalam mikroorganisme seperti

bakteri,kapang dan ragi. Asam shikimat sendiri pertama kali

ditemukan pada tahun 1885 daritumbuhan IIIicium religiosum,yang dalam

bahasa jepang disebubut shikiminoki,dankemudian ditemukan pula dalam banyak tumbuhan.


15/28

Metode standar yang digunakan dalampenentuan kandungan polifenol atau Total

Phenolic Content (TPC) adalah Folin-

Ciocalteu dengan asam galat sebagaisenyawa standarnya.


16/28

Uji Fitokimia Polifenol

Sebanyak 4 gram sampel segar dirajang halus dandididihkan dengan 25 ml etanol selama lebih kurang25 menit, disaring dalam keadaan panas, kemudianpearut diuapkan sampai kering.

Ekstrak dikocok kuat dengan kloroform lalu

ditambahkan air suling, biarkan sampai terbentuk dualapisan, yakni lapisan kloroform dan lapisan air.

Beberapa tetes dalam tabung reaksi ditambahkan besi(III) klorida 1% dalam air dan etanol warna hijau,merah, ungu, biru atau hitam yang kuat (hijau sampai

ungu) menandakan positif mengandung fenolik. Ekstraksi senyawa fenol tumbuhan dengan etanol

mendidih biasanya mencegah terjadinya oksidasienzim.


17/28

◦ Skema Uji Fitokimia


18/28

Metode Ekstraksi Polifenol

Metode ekstraksi yang sering digunakanadalah maserasi dan refluks

Hasil penelitian metode refluks lebih

optimal. Pelarut : heksana, metanol


19/28

ISOLASI SENYAWA FENOLAT DARI FRAKSI

ETIL ASETAT KULIT BATANG TUMBUHAN

GANDARIA

Fraksi etil asetat kulit batang tumbuhan

Gandaria pemilihan eluen melalui krom

atografi lapis tipis (KLT)

kromatografikolom gravitasi.


20/28

Fraksi etil asetat sebanyak 0,9 gramdilakukan kromatografi kolom gravitasimenggunakan silika gel G 60 (35-70 mesh)sebagai fase diam.

Sampel disiapkan secara preabsorbsi dengan0,9 gr silika gel G 60 (35-70 mesh).

Sampel dielusi menggunakan eluen etil asetat

dan metanol dengan komposisi sebagaiberikut: etil asetat: metanol; 9,5 : 0,5 sampaietil asetat : metanol ;4:6.


21/28

Hasil KLT yang menunjukan pola noda yangsama dikelompokkan menjadi satu fraksi.

Pemisahan ini menghasilkan 3 fraksi yaitu F1-F3.

Berdasarkan pola noda dari kromatogramKLT yang diperoleh maka noda pada F3 danF2 yang akan dipisahkan lebih lanjut.

Pemisahan selanjutnya dilakukan terhadap

fraksi F2. Fraksi F2 sebanyak 29,1 mgdipisahkan dengan kromatografi kolomgravitasi menggunakan fase diam silika gel G60 (35-70 mesh).


22/28

Sampel disiapkan secara preabsorbsimenggunakan silika gel G 60 (35-70 mesh)sebanyak 29,1 mg, kemudian dielusi menggunakaneluen etil asetat dengan komposisi 100%, eluat

ditampung didalam vial-vial yang masing-masingberisi ±50 ml.

Vial-vial yang memberikan pola noda yang samadikelompokan kedalam satu fraksi . Pemisahan ini

menghasilkan 4 fraksi yaitu F2.1 - F2.4.Berdasarkan pola noda pada KLT maka nodautama yang dipisahkan adalah noda pada F2.4.


23/28

Fraksi F2.4 sebanyak 19,7 mg dipreabsorbsi,kemudian dipisahkan dengan kromatografi

kolom gravitasi dengan menggunakan silika

gel G 60 (35-70 mesh) sebagai fase diam,kemudian dielusi dengan menggunakan etil

asetat 100 %.

Eluat ditampung di dalam vial-vial. Pemisahan

dengan kromatografi kolom gravitasi ini

menghasilkan 4 fraksi yaitu F2.4.1 − F2.4.4.


24/28

Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukandengan menggunakan KLT dengan berbagaieluen, KLT dua dimensi serta pengukurantitik leleh.

Identifikasi hasil senyawa hasil isolasidilakukan dengan uji fitokimia,spektrofotometer UV dan IR.

Pemurnian dilakukan dengan cara pencucian

dengan menggunakan eluen yang sesuai. Pemurnian dilakukan dengan cara pencucian

kristal menggunakan eluen etil asetat : aseton(9:1) pada masing - masing fraksi.


25/28

Uji kemurnian dilakukan dengankromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan

eluen yang berbeda yaitu etil asetat : aseton

(9:1 dan 7:3) dan etil asetat : metanol (8:2)dengan harga Rf 0,5; 0,75; dan 0,7.

Hasil KLT menunjukan noda tunggal pada

lampu UV dan berwarna kuning setelah

diberi pereaksi penampak noda serium sulfat

pada plat KLT.


26/28

Spektrum UV dari kristal dalam pelarut etil asetatmemberikan serapan maksimum (nm) (absorbansi) :289 (0,989).

Adanya absorbsi pada panjang gelombang 289 nmmengindikasikan bahwa senyawa hasil isolasi ini

mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi yang lazimnyamerupakan cincin aromatis, dimana muncul padapanjang gelombang yang lebih panjang dengankenaikan intensitas yang besar (200-400 nm).

Hasil uji KLT dua dimensi terhadap kristal FE dengan

eluen etilasetat metanol 8:2 dan etilasetat aseton 9:1dengan penampak noda lampu UV.

Hasil uji KLT dua dimensi terhadap kristal FE denganpereksi penampak noda serium sulfat.


27/28

Adanya sistem aromatis ini dikuatkan oleh spektrumIR yang menunjukan adanya serapan karakteristik aromatik pada bilangan gelombang 1465-1519 cm−1.

Hasil pengukuran spektroskopi IR memperlihatkanadanya serapan karakteristik pada daerah bilangan

gelombang (cm−

1). Identifikasi senyawa hasil isolasi dengan spektrometer

IR menunjukan adanya serapan pada bilangangelombang 3417 cm−1 dengan satu puncak serapanagak melebar dengan intensitas yang kuat yang

mengindikasikan adanya gugus hidroksil. Gugus hidroksil ini merupakan OH terikat (dapat

berikatan hidrogen).


28/28

Adanya gugus hidroksil diperkuat denganmunculnya ulur C-O alkohol pada daerah 1165-1033 cm−1.

Serapan gugus karbonil terlihat pada bilangangelombang 1643 cm−1 sedangkan untuk sistemaromatis dengan serapan pada bilangan gelombang1465-1519 cm−1.

Munculnya serapan pada bilangan gelombang 2931cm−1 berasal dari vibrasi ulur C-H alifatik yang

didukung dengan vibrasi tekuk C-H alifatik padabilangan gelombang 1381-1288 cm−1.

Documents

Kuliah 2 Isolasi Polifenol