ANKARA ÜNİVERSİTESİFEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

ÜZÜMDEN (Vitis vinifera L.) İZOLE EDİLEN POLİFENOL OKSİDAZENZİMİNİN ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Zehra ÖNEZ

KİMYA ANABİLİM DALI

ANKARA--------------

2006

Her hakkı saklıdır

Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI danışmanlığında, Zehra ÖNEZ tarafından hazırlanan buçalışma 17/02/2006 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oybirliği ile Kimya AnabilimDalı’nda yüksek lisans tezi olarak kabul edilmiştir.

Başkan : Prof. Dr. Murat ELÇİN Ankara Üniversitesi

Üye : Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI Ankara Üniversitesi

Üye : Prof. Dr. Selma ATEŞ Gazi Üniversitesi

Yukarıdaki sonucu onaylarım

Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLUEnstitü Müdürü

i

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

ÜZÜMDEN (Vitis Vinifera L.) İZOLE EDİLEN POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Zehra ÖNEZ

Ankara ÜniversitesiFen Bilimleri EnstitüsüKimya Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI

Polifenol oksidaz (PPO) enzimi İzmir üzümü (Vitis vinifera L.)’nden ekstrakte edilmiş

ve amonyum sülfat çöktürme, diyaliz, jel filtrasyon kromatografisi yöntemleri ile

saflaştırılmıştır. Amonyum sülfat çöktürme ve diyaliz işlemlerinden sonra elde edilen

örnek, PPO enziminin karakterizasyonu için kullanılmıştır. Bu amaçla, optimum pH ve

sıcaklık değerleri farklı substratlar kullanılarak belirlenmiştir. PPO enziminin en iyi

substratının katekol olduğu bulunmuştur. Bu substrat için optimum pH ve sıcaklık

değerleri sırasıyla 7,2 ve 25 oC olarak belirlenmiştir. Km ve Vmax değerleri katekol ile

sırasıyla 3,65 mM ve Vmax 507,2 ∆A dak-1 olarak bulunmuştur. Bu çalışmada altı adet

inhibitör ile çalışılmış ve en etkili olanların sodyum azid, sodyum dietilditiyokarbamat

ve tiyoüre oldukları bulunmuştur. Enzimin poliakrilamid jel elektroforez (PAGE)

çalışmaları da yapılmıştır.

2006, 87 sayfa

Anahtar Kelimeler: Vitis vinifera L., Üzüm, Polifenol Oksidaz, PPO, Bitki

Fenolikleri, Elektroforez.

ii

ABSTRACT

Master Thesis

ISOLATION AND PROPERTIES OF GRAPE (Vitis Vinifera L.)

POLYPHENOL OXIDASE

Zehra ÖNEZ

Ankara UniversityGraduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Chemistry

Supervisor: Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI

Polyphenol oxidase (PPO) of İzmir grape (Vitis vinifera L.) fruit was extracted and

purified through (NH4)2SO4 precipitation, dialysis, gel filtration. The sample obtained

from ammonium sulfate precipitation and dialysis was used for characterization of the

PPO. For this aim, optimum conditions, i.e., pH, temperature were determined with

different substrates. The best substrate of the PPO was found to be catechol. Optimum

pH and temperature were found 7,2 and 25 oC for this substrate. Km and Vmax values

were 3,65 mM and 507,2 ∆A dak-1 with catechol, respectively. Six inhibitörs were

tested in the study and the most effective was found to be sodium azide, sodium

diethyldithyocarbamate and tiourea. Polyacrylamide gel electrophoresis studies of this

enzyme were performed.

2006, 87 pages

Key Words: Vitis vinifera, Polyphenol Oxidase, PPO, Grape, Plant Phenolics,Electrophoresis.

iii

TEŞEKKÜR

Bu konuyu yüksek lisans tezi olarak öneren, çalışmalarım süresince yakın ilgi ve

desteğini gördüğüm önemli deneyim ve bilgilerinden faydalandığım hocam Sayın Prof.

Dr. Şule PEKYARDIMCI’ya içten teşekkürlerimi sunarım.

Ayrıca tez çalışmamın her aşamasında bana yardımcı olan Sayın Arş. Gör. Emine

KARAKUŞ’a çok teşekkür ederim. Elektroforez cihazını kullanmama izin veren ve

deneyin yapılışında yardımlarını esirgemeyen Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji

Enstitüsü Bölümünden Sayın Dr. Mitchell HALLORAN’a teşekkür ederim. Son olarak

bilimsel araştırma yapmam için beni her zaman destekleyen başta annem ve babam

olmak üzere tüm aileme teşekkür ederim.

Zehra ÖNEZ

Ankara, Şubat 2006

iv

İÇİNDEKİLER

ÖZET………………………………………………………………………….…..…..i

ABSTRACT…………………………………………………………………….…....ii

TEŞEKKÜR……………………...…………………………………………….…....iii

SİMGELER DİZİNİ……………………………………….………………….…...viii

ŞEKİLLER DİZİNİ……………………………………………………………........ix

ÇİZELGELER DİZİNİ………………………………………....………………......xi

1. GİRİŞ…………………………………………………………………………......1

2. KAYNAK ÖZETLERİ...............................................………………………........3

2.1 Enzimler Hakkında Genel Bilgi…………………………………………..........6

2.1.1 Enzim kinetiği ……………………………………………………….………......................7

2.1.2 Enzim aktiflik birimleri …………………………………………...................9

2.1.3 Enzim inhibisyonu …………………………………………….......................10

2.1.3.1 Yarışmalı inhibisyon (Kompetitif inhibisyon) …..................................….11

2.1.3.2 Yarışmasız inhibisyon (Nonkompetitif inhibisyon)……........................…12

2.1.3.3 Yarı yarışmalı inhibisyon (Ankompetitif inhibisyon)….......................….13

2.2 Polifenol Oksidaz (PPO) Enzimi …………………………………….…..........15

2.2.1 PPO enziminin substratları ……………………………………....................15

2.2.1.1 Katekinler ………………………………………..........................…...…....16

2.2.1.2 Lökoantosiyanidinler ……………………………..........................…..…...17

2.2.1.3 Antosiyanidinler………………………………….........................………...17

2.2.1.4 Flavonoller …………………………………..........................…...…....…...18

2.2.1.5 Sinamik Asit Türevleri ………………………….......................………….19

2.2.1.6 Basit Fenoller ………………………………….........................…………...19

2.2.2 PPO enziminin katalizlediği tepkimeler ……………..............………..…....20

2.2.3 Bakırın reaksiyondaki rolü ………………………………...............…..……21

2.2.4 Esmerleşme reaksiyonları……………….. ……………..............……...……24

2.2.4.1 Enzimatik esmerleşme …………………………………........................…..24

2.2.4.2 Enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonları ………........................…..24

2.2.5 PPO enziminin inhibitörleriyle enzimatik kararmanın önlenmesi…..........25

2.2.5.1 Enzimi birinci derecede etkileyen inhibitörler ………….................….....25

v

2.2.5.2 Reaksiyon ürünleri veya substratlar ile reaksiyona giren bileşikler .......26

2.2.6 PPO enziminin doğadaki ve gıda işletmeciliğindeki rolü ….……......….....27

2.2.7 PPO enziminin tıptaki kullanım alanları ………...………………..............28

3. MATERYAL VE YÖNTEM ……………………………………….…...…..…30

3.1 Kullanılan Materyal ve Maddeler …………………………………...........….30

3.1.1 Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler.......................................................30

3.1.2 Kullanılan alet ve cihazlar ………………………………….............…….....30

3.1.3 Tampon çözeltilerin hazırlanması …………………………...............……...31

3.1.3.1 0,1 M Sitrat tamponunun hazırlanması ……………........................….....31

3.1.3.2 0,2 M Fosfat tamponunun hazırlanması …………………........................31

3.1.3.3 0,05 M tris tamponunun hazırlanması ………………….......................…32

3.2 Polifenol Oksidaz (PPO) Enziminin İzolasyonu …………………….....….....33

3.2.1 Amonyum sülfat çöktürmesi …………………………………............….….33

3.2.2 Diyaliz işlemi ………………………………………………………............…34

3.2.3 Jel fitrasyon Kromotografisi ………………………………...........…….…..35

3.3 Enzim Aktivitesinin Tayini ………………………………………....…....……37

3.3.1 Enzim ünitesinin tanımı ………………………………………..............……37

3.3.2 Stok enzim çözeltisinin hazırlanması …………………………........…..…...37

3.4 Polifenol Oksidaz (PPO) Enziminin Karakterizasyonu …………...…..……38

3.4.1 Substrat spesifikliği ………………………………………….........……..…..38

3.4.2 Optimum substrat konsantrasyonu ………………………..........……...…..38

3.4.3 pH etkisi ……………………………………………….........….…………..…38

3.4.4 Sıcaklığın etkisi ……………………………………………...........……….…38

3.4.5 Enzimin termal kararlılığı ……………………………..........………….…...39

3.4.6 Protein tayini ……………………………………………………..............….39

3.4.7 Enzim kinetiği …………………………………………………..........….…...41

3.4.8 Aktivasyon enerjisinin tayinin........................................................................41

3.4.9 İnhibitörlerin etkisi ……………………………………………..............…...42

3.4.10 Enzimin depolama süresince kararlılığı ……………………....................42

3.4.11 Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ………………….…….................42

3.4.11.1 Native-PAGE ile enzimin aktivite tayini ……………................….…....45

3.4.11.2 Native-PAGE ile PPO izozimlerinin belirlenmesi ……..........................46

vi

3.4.11.3 SDS-PAGE ile enzimin molekül kütlesinin belirlenmesi ..............…......46

4. BULGULAR VE TARTIŞMA ………………………..............................……..48

4.1 Polifenol Oksidaz (PPO) Enziminin İzolasyonu ve Saflaştırılması ….……..48

4.1.1 Jel filtrasyon kromotografisi ………………………………………......……50

4.2 Enzim Aktivitesinin Tayini ………………………………………....….……...51

4.3 PPO Enziminin Karakterizasyonu ………………………………...………….52

4.3.1 Substrat spesifikliği ………………………………………………........…….52

4.3.2 Optimum substrat konsantrasyonu ……………………………….....……..53

4.3.3 pH etkisi ………………………………………………………......……...…...54

4.3.4 Sıcaklığın Etkisi …………………………………………………......…….....59

4.3.5 Enzimin termal kararlılığı ……………………………………………......…60

4.3.6 Protein tayini..............................……………………………………......….....61

4.3.7 Enzim kinetiği …….………………………………………………......……...62

4.3.8 Aktivasyon enerjisinin tayini............................................................................63

4.3.9 İnhibitörlerin etkisi ………………………………………………......……....63

4.3.10 Enzimin depolanma süresince kararlılığı ………………………......…….67

4.3.11 Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) …………………………......…….68

4.3.11.1 Native-PAGE ile enzimin aktivite tayini .......……………................….68

4.3.11.2 SDS-PAGE ile enzimin molekül ağırlığının belirlenmesi…....................70

5. SONUÇLAR……………………………………………………………….…......72

KAYNAKLAR………………………………………………………………....……74

EKLER…………………………… …………………………………....………...…82

EK 1. Poliakrilamid Jel Elektroforezde Kullanılan Tampon ve Çözeltiler.........82

1.1 Akrilamid + N,N'-Metilen Bisakrilamid çözeltisi…….………….........…..…..82

1.2 Ayırma Jel Tamponu (1,5 M Tris-HCI, pH 8,6) ……………………........…...82

1.3Yığma Jel Tamponu (0,5 Tris-HCI, pH 6,8) …………………..…........…...….82

1.4 Koşturma Tamponu …………………………………………….........…..…….83

1.5 Örnek Tampon (4X) ………………………………………………....................83

1.6 Boyama Çözeltisi …………………………………………………….................83

1.7 Boya Çıkarıcı Çözelti …………………………………………….........….........84

1.8 Saklama Çözeltisi ………………………………………………...............….....84

1.9 % 10'luk Amonyum Persülfat (APS) ……………………………...........….....84

vii

1.10 Molekül Ağırlık Standartları …………………………………….........….....84

1.11 % 10'luk SDS-PAGE Ayırıcı Jelin İçeriği ……………………...........……..85

1.12 % 4’lük SDS-PAGE Yığma Jel İçeriği …………………………...........…...86

1.13 % 7,5’lik Native-PAGE Ayırıcı Jel İçeriği …………………............……....86

1.14 % 4’lük Native-PAGE Yığma Jel İçeriği ……………………...........….......86

ÖZGEÇMİŞ………………………………………..…………………….…….…...87

viii

SİMGELER DİZİNİ

APS Amonyum Persülfat

N-PAGE Native-Poliakrilamid Jel Elektroforez

PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforez

PPO Polifenol Oksidaz

PVP Polivinil Pirolidon

SDS Sodyum Dodesil Sülfat

SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforez

TEMED Tetra Etil Metilen Diamin

ix

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1 Michaelis-Menten grafiği …………………………………………….…...8

Şekil 2.2 Lineweaver-Burk grafiği…………………………………………...….…..9

Şekil 2.3 Yarışmalı (Kompetitif) inhibisyon………………… ……………………12

Şekil 2.4 Yarışmasız (Nonkompetitif) inhibisyon ……… ..……………………….13

Şekil 2.5 Yarı yarışmalı (Ankompetitif) inhibisyon ……….........................………14

Şekil 2.6 O-kinon oluşum mekanizması …………………………………………...22

Şekil 2.7 Melanin pigmentinin oluşum mekanizması ………………………….…..23

Şekil 3.1 Genel diyalizin uygulanış şekli..................................................................34

Şekil 3.2 Farklı büyüklükteki moleküllerin jel filtrasyon kromatografisi ile

ayrılması ………………………………………………………………....35

Şekil 3.3 Bradford yönteminin standart eğri grafiği .................................................40

Şekil 4.1 Jel filrasyon kromatografisi sonucu elde edilen fraksiyon……………….50

Şekil 4.2 PPO enziminin aktivite tayin grafiği ……………………………………..51

Şekil 4.3 Katekol substratının üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine pH’ın

etkisi..........................................................................................................55

Şekil 4.4 4-metil katekol substartı ile üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine

pH’ın etkisi...............................................................................................55

Şekil 4.5 Kafeik asit substratı ile üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine pH’ın

etkisi..........................................................................................................56

Şekil 4.6 Pirogallol substratının üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine pH’ın

etkisi ... ......................................................................................................56

Şekil 4.7 D-tirozin substratının üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine

pH’ın etkisi….............................................................................................57

Şekil 4.8 p-Krezol substratı ile üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine

pH’ın etkisi…..............................................................................................57

Şekil 4.9 Gallik asit substratı ile üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine

pH’ın etkisi…..............................................................................................58

Şekil 4.10 Üzümdeki PPO enzimi üzerine sıcaklığın etkisi…......................................59

Şekil 4.11 PPO enziminin termal kararlılığı……………………………………...........60

Şekil 4.12 Bradford yöntemiyle protein tayin grafiği ……...........................….…....... 61

x

Şekil 4.13 Katekol substratı kullanılarak elde edilen Lineweaver- Burk grafiği ….....62

Şekil 4.14 Aktivasyon enerjisinin tayini ......................................……………….…...63

Şekil 4.15 L-Sistein inhibitörü kullanılarak elde edilen Lineweaver- Burk grafiği .…..65

Şekil 4.16 L-Askorbik asit inhibitörü kullanılarak elde edilen Lineweaver- Burk

grafiği…………………………………………………………………….. 66

Şekil 4.17 β-Merkaptoetanol inhibitörü kullanılarak elde edilen Lineweaver-Burk

grafiği……………………………………………………………………....66

Şekil 4.18 4 oC ve 20 oC’de depolama şartlarında enzim aktivitesinin zamanla

değişimi…………………………………………………………………...67

Şekil 4.19 Ham enzim ekstraktının Native-PAGE ile elde edilen bant profili............68

Şekil 4.20 SDS-PAGE ile PPO enziminin molekül ağırlığının belirlenmesi ……..….70

xi

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 3.1 0,1 M Sitrat tamponu hazırlaması …………………….............................31

Çizelge 3.2 pH’ları 5,7-7,2 arasındaki çözeltilerin hazırlaması……………………....32

Çizelge 3.3 0,05 M Tris tamponunun hazırlanması .....................................................32

Çizelge 4.1 PPO enzimin saflaştırma aşamalarından elde edilen sonuçlar …………..48

Çizelge 4.2 PPO enziminin substrat spesifikliği …………………………………….52

Çizelge 4.3 Üzüm PPO enzimi için optimum katekol substratı konsantrasyonu ….. .53

Çizelge 4.4 İzmir üzümünden elde edilen PPO enziminin farklı substratlara karşı

optimum pH değerleri...............................................................................54

Çizelge 4.5 PPO enziminin inhibisyon türleri ve Ki değerleri …………………...…..64

1

1. GİRİŞ

Tüketicinin giderek daha bilinçlenmesi sonucu tüketilen besinlerin hem çevre ve insan

sağlığına, hem de damak zevkine uygun olması talep edilmektedir. Bu nedenle gıda

endüstrisi alanında, üretim ve pazarlama ile ilgili yeni yöntemler geliştirilmektedir

(Erzengin 2002). Meyve ve sebzelerde, ayrıca kabuklu deniz hayvanlarında çarpma,

kesme, kabuk soyma ve dilimleme gibi mekanik zedelenme ve işlemlerle bazı renk

değişmeleri ortaya çıkmaktadır. Pembeden, mavimsi-siyaha kadar olan farklı tondaki bu

renk değişmelerine "esmerleşme" denir. Bir çok meyve ve sebze ürünlerinde bu renk

değişmeleri bir dereceye kadar istenir, ancak çoğu kez istenilen seviyede durdurulamaz.

Enzimatik esmerleşme denilen bu reaksiyon, hem polifenoloksidaz (PPO) enziminin

aktivitesi, hem de fenolik madde konsantrasyonu ile ilgilidir (Coseteng and Lee 1987).

PPO enziminin neden olduğu esmerleşmeler, ürünün sadece renginde bozulmaya neden

olmamakta, aynı zamanda lezzetini ve kalitesini de düşürmektedir. Bu nedenle olayın

önlenmesi ve sınırlandırılması amacı ile PPO enziminin nitelikleri üzerinde çok çeşitli

araştırmalar yürütülmektedir.

PPO enziminin neden olduğu bu esmerleşme reaksiyonlarının önlenebilmesi için bu

enzimin inhibe edilmesi gerekmektedir (Ponting 1960, Golan-Goldhirsh and Whitaker

1984, Pekyardımcı and Balaban 1992). PPO enziminin özellikleri izole edildiği kaynağa

göre değişmektedir (Vamos-Vigyazo 1981). Bu nedenle uygun inhibisyon

yöntemlerinin bulunabilmesi için öncelikle meyve ve sebzelerde bulunan PPO

enziminin kinetik özelliklerinin, aktivatör ve inhibitörlerinin, optimum pH ve sıcaklık

değerlerinin, sıcaklığa dayanıklılığının iyi bilinmesi gerekmektedir. PPO enziminin

özeliklerini belirleyebilmek amacı ile birçok kaynaktan enzim izolasyonu yapılmıştır.

Bu kaynaklardan bazıları; elma (Oktay et al. 1995, Walker et al. 1964), kiraz (Benjamin

and Montgomery 1973), şeftali (Wong et al. 1971, Flurkey and Jen 1978, Luh et al.

1972), üzüm (Cash et al. 1976 , Valero et al. 1988), kuşburnu (Şakiroğlu et al. 1996)

gibi meyveler, patates (Patil et al. 1965, Hsu et al. 1988), mantar (Golan-Goldhirsh et

al. 1984), patlıcan (Knapp 1965) gibi sebzelerdir.

2

Bu çalışmanın amacı, PPO enziminin İzmir (Bergama) bölgesinde yetişen üzümden

izolasyonu, saflaştırılması ve karakterize edilmesidir. Bu amaçla önce PPO enzimi,

İzmir üzümünden izole edilmiş; daha sonra amonyum sülfat çöktürmesi yöntemiyle

çöktürülen PPO enzimi, diyalizlenerek kısmen saflaştırılmıştır. Enzimin kinetik

özellikleri, optimum pH ve optimum sıcaklığı, termal kararlılığı, inhibisyon çalışmaları

diyalizlenen enzim ekstraktıyla yapılmıştır. Daha sonraki saflaştırma aşamaları ise jel

filtrasyon kromatografisi ve poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile yapılmıştır.

3

2. KAYNAK ÖZETLERİ

Polifenol oksidazlar, bitkilerde, kabuklu deniz hayvanlarında, mikroorganizmalarda

özellikle de funguslarda yaygın olarak bulunmaktadırlar (Vamos-Vigyazo 1981). PPO

enziminin bitki hücrelerinde bulunduğu yerler farklılık göstermekle birlikte genellikle

bitki hücrelerinin plastitlerinde bulunmaktadır. Dolayısıyla, vakuollerde bulunan fenolik

substratlarından ayrı bölgelerdedir (Vaughn et al. 1988).

Üzümdeki enzim aktivitesi, pulp veya özsuya nazaran kabukta daha fazla bulunmuştur

ve olgunlaşma esnasında aktivite azalması kabukta daha belirgin olmuştur (Parish

1972). Bazı araştırmacılar kabukta daha yüksek aktivite bulurken (Voigt et al. 1996),

bazıları çekirdek bölgesinde daha fazla aktivite olduğunu belirlemiştir (Bleslermann

1956). Elmadaki polifenol oksidaz aktivitesinin büyük oranda elmanın cinsine bağlı

olduğu bazı araştırmacılar tarafından rapor edilmiştir (Walker 1962, Vamos-Vigyazo

1977). Amasya ve Golden türü elmalar üzerinde yapılan bir çalışmada, Amasya türünün

Golden’e göre daha fazla PPO enzim aktivitesine sahip olduğu bulunmuştur (Keleş

1986). Çay bitkisinin (özellikle filizlerinin) polifenoller ve PPO enzimi bakımından

oldukça zengin olduğu ve PPO enziminin çayın fermentasyonunda anahtar enzim

olduğu bildirilmiştir (Mayer and Harel 1991).

Elma kabuğundan hazırlanan mitokondrial PPO enziminin; polivinilpirolidon (PVP) ile

inaktive edildikten sonra, sodyumdodesil sülfat (SDS) gibi anyonik deterjanlarla

reaktive olduğu bulunmuştur (Halim and Montgomery 1978). Aynı zamanda sodyum

dodesilsülfatın, kısmen saflaştırılmış PPO enzimini aktive ettiği bulunmuştur (Kohn

1977). PPO enzim aktivitesinde süreli asidik pH veya üreyle muamele edildiğinde 4-10

kat artış gözlenmiştir. Ortama Cu+2 iyonlarının katılması patatesteki PPO enzimine etki

etmezken, turptaki enzimin aktivitesini arttırdığı bulunmuştur (Isbiguro and Anyama

1970, Weaver and Steen 1968). Bu enzimde aktivatörlerin rolü enzim için gerekli

konformasyonun oluşumunu kolaylaştırmak şeklindedir (Mathen and Parpia 1971,

Şakiroğlu 1994).

4

Corsini ve arkadaşları patatesten (Solanum tuberosum) saflaştırarak elde ettikleri PPO

enziminin aktivitesi üzerine yaptıkları çalışmalarda enzim aktivitesinin patatesin yumru,

kök ve çiçeklerinde oldukça yüksek olmasına rağmen yaprak ve saplarında daha düşük

seviyelerde olduğunu tespit etmişlerdir. PPO enzimi tarafindan meydana gelen

enzimatik esmerleşmenin özellikle patatesin yumrularında daha fazla olduğu

bildirilmiştir (Corsini et al. 1992). Bununla birlikte, Thygesen ve arkadaşları patatesten

saflaştırılarak elde ettikleri PPO enzimi ile yaptıkları çalışmalarda doku hasarını takiben

patatesin yumrularında PPO enziminin aktivitesinin yüksek düzeylere ulaştığını

saptamışlar ve bu enzimin bitki savunma sisteminde rol oynayabileceğini

bildirilmişlerdir (Thygesen et al. 1994).

Cano ve arkadaşları tarafından yapılan başka bir çalışmada ise tropik bitkilerden biri

olan papaya meyvelerinde de PPO enziminin varlığı bildirilmiştir (Cano et al. 1995). Bu

meyvelerden kısmen izole edilen PPO enziminin türlere göre değişimi incelenmiş ve

toplam PPO enzim aktivitesinin dişi meyvelerde diğerlerine göre çok daha yüksek

olduğunu belirtilmiştir. Bu meyvelerden elde edilen enzimlerin elektroforetik özellikleri

incelendiğinde, hermafrodit meyvelerde 6 izoenzimin varlığı gözlenmesine rağmen dişi

meyvelerde dört izoenzimin varlığını gösteren bandlar belirlenmiştir (Cano et al. 1996).

Mayer ve arkadaşları çay bitkisinden saflaştırdıkları PPO enziminin, çayın

fermantasyonunda ve çay bileşenlerinden olan flavonollerin oksidasyonunda önemli rol

oynadığını belirtmişlerdir (Mayer et al. 1991).

Fujita ve Tono patlıcandaki polifenol oksidaz enzimini amonyum sülfat çöktürme ve

Sephadeks G-100 gibi kromatografik yöntemlerle saflaştırmışlar ve enzimin substratı

olan klorogenik asitle hızlı bir şekilde oksitlendiğini bulmuşlardır. Klorogenik asit

kullanılarak enzimin Km değeri 0.50 mM olarak belirlenmiştir. Optimum pH’sı 4,0,

enzimin kararlı olduğu pH aralığı ise 5,0 ile 8,0 arasında bulunmuştur. Ayrıca termal

kararlılık deneyleri de yapılmış ve enzimin 75 ºC’de 30 dakikada, 80 ºC’de ise 5

dakikada aktivitesini kaybettiği bildirilmiştir (Fujita and Tono 1988).

Valero ve arkadaşları PPO enzimini üzümden izole ederek karakterizasyonunu

yapmışlar ve saflaştırılan enzimin hem kresolaz hem de katekolaz aktivitesine sahip

5

olduğunu belirtmişlerdir. Enzimin optimum pH aralığının 3.5-4.5 arası olduğu ve termal

kararlılığının yüksek olduğu bulunmuştur (Valero 1988).

Simpson, polifenol oksidaz enzimini beyaz karides (Panaeus setiferus) ve pembe

karides’den (P.duorarum) izole ederek saflaştırmıştır. Her iki kaynaktaki enzim de

poliakrilamid jel elektroforezinde tek bir protein bandı olarak gözlenmiştir. Beyaz

karidesdeki polifenol oksidaz enziminin molekül kütlesi 30.000 Da, pembe karidesdeki

enziminin molekül kütlesi ise 40.000 Da olarak bulunmuştur. Her iki kaynaktaki

polifenol oksidaz enziminin p-amino benzoik asit tarafından inhibe olduğu gözlenmiştir.

Pembe karidesdeki polifenol oksidaz enziminin aktivitesinin beyaz karidese göre 1.8 kat

daha fazla olduğu bulunmuştur. Ayrıca pembe karidesdeki esmerleşmenin doğal

substratlarından olan tirosin ve fenilalanin miktarının beyaz karidese göre çok daha

fazla olduğu belirtilmiştir (Simpson 1988).

Satjawatcharaphong ve arkadaşları kırmızı elmadaki (Malus domestica) polifenol

oksidaz enzimini saflaştırmışlar ve poliakrilamid jel elektroforeziyle (PAGE) katekol

substratı kullanarak 2 aktif izoenzim bandı belirlemişlerdir. Ham enzim ekstraktının

optimum pH’sı 6,2, optimum sıcaklığı ise 30 ºC olarak bulunmuştur. Km ve Vmax

değerleri sırasıyla; 2.2x10-1mM ve 4.8x10-1ΔA390 µmolmin-1 olarak hesaplanmıştır

(Satjawatcharaphong 1983).

Arslan ve arkadaşları Malatya kayısısından amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz

işlemleriyle polifenol oksidaz enzimini izole etmişler ve katekol, L-DOPA ve gallik asit

substratları ile yüksek aktivite gösterdiğini bildirmişlerdir (Arslan 1998). Malatya

kayısısındaki polifenol oksidaz enzimi için en iyi substratın katekol olduğu bulunmuş ve

bu substratlarla optimum pH 8.5 olarak hesaplanmıştır. Termal kararlılık deneyleri

sonucu 40 ºC de 40 dakika sonunda enzim aktivitesinde bir azalma gözlenmiş 80 ºC da

16 dakikalık bir uygulama sonucu aktivitenin %50 düştüğü belirtilmiştir (Arslan 1998).

Kimberly ve arkadaşları polifenol oksidaz enzimini Batı Avrupada yetişen Ravat ve

Niagara üzümlerinden izole ederek karakterize etmişlerdir. Her iki enzim için de

optimum sıcaklık ve optimum pH aralıkları sırasıyla 25 ºC ve 5,5 olarak

6

belirlenmiştir. Termal kararlılık deneylerinde de Niagara PPO enziminin, Ravat

enzimine göre daha kararlı olduğu görülmüştür. Her iki enzim için de en fazla

inhibisyona yol açan inhibitörlerin L-sistein ve sodyumdietilditiyokarbamat olduğu

bildirilmiştir (Kimberly et al. 1981).

2.1 Enzimler Hakkında Genel Bilgi

Enzimler canlı organizmalardaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen ve protein

yapısında olan biyolojik katalizörlerdir. Enzimlerin aktif merkez adı verilen küçük ve

özel bölgeleri katalizde rol almaktadır. Laboratuvarda gerçekleşmesi çok zaman alan

bazen de yüksek basınç, yüksek sıcaklık, asidik veya bazik ortam gerektiren

reaksiyonlar, enzimler kullanılarak birkaç saniye gibi çok kısa zamanda ve hücre içi

koşullarda yürüyebilmektedir. Enzimler oldukça spesifik moleküllerdir. Ancak bazı

durumlarda genel olarak grup reaksiyonlarını katalizleyen enzimler de bulunmaktadır.

Enzimlerin katalizleme gücü diğer kimyasal katalizörlere göre çok daha fazladır.

Reaksiyon hızını 106-1016 kez arttırabilirler ve enzimle katalizli bir reaksiyonda ürünün

meydana gelme verimi %100’dür ve bu reaksiyonlarda hiçbir zaman yan ürün oluşmaz.

Enzimler katalizledikleri reaksiyonlarda reaksiyonların denge konumunu ve sabitini

değiştirmezler sadece dengeye daha çabuk erişmesini sağlarlar. Enzimlerin üzerinde

etkili oldukları ve ürüne dönüştükleri bileşiklere substrat; reaksiyon sonucu substrattan

oluşan madde veya maddelere ürün denir. Bazı enzimler substrat adının sonuna –az eki

getirilerek adlandırılırken bir kısmı da enzimi bulan bilim adamının koyduğu isimlerle

tanınmaktadır. Örneğin; fosfataz, üreaz, lipaz ve tripsin gibi.

Az da olsa bazı enzimler tek başlarına aktivite gösterebilirken, büyük bir çoğunluğu

aktivite gösterebilmek için başka moleküllere gerek duymaktadır. Bu maddelere

"kofaktör" denir. Kofaktörler metal iyonları veya vitamin yapısında, veya bu yapıya

benzeyen organik moleküller olabilirler. Kofaktörle birlikte olan enzim molekülüne

"haloenzim", kofaktörsüz protein kısmına ise "apoenzim" denir. Protein kısmı her

enzim için farklı aminoasit diziliminde olduğu için enzimin özelliğini ve özgüllüğünü

7

belirleyen kısım apoenzimdir. Apoenzimler tek başlarına aktivite gösteremezler, ancak

koenzimle birlikteyken katalitik aktivite kazanırlar. Biyolojik açıdan önemli olan Mn+2,

Mg+2, Zn+2, Cu+2 ve Fe+2 gibi metal iyonları Lewis bazı gibi davranan gruplara

bağlandıklarında koordinasyon komplekleri oluştururlar. Bu tip katalize bir örnek olarak

karboksipeptidaz A enzimi verilebilir. Bu enzim, proteinlerin peptid bağlarını karboksil

ucundan hidrolizler. Enzimin aktif bölgesini oluşturan histidin 69, 196 ve glutamat 72

ile bir koenzim olan Zn+2 arasında koordinasyon kompleksi oluşur. Metal iyonu ile

oluşan bu koordinasyon kompleksinin konformasyonu sonucu optimum kataliz

gerçekleştirilir.

Koenzim olarak kullanılan önemli maddelerden birisi de vitaminler veya onların

türevleridir. Bu amaçla genellikle B vitaminleri kullanılır. Nikotinamid adenin

dinükleotid (NAD+), birçok yükseltgenme-indirgenme tepkimesinde yer alan bir

koenzimdir. Yükseltgenme-indirgenme reaksiyonu nikotinamid halkasındaki amid

üzerinden yürür. B6 vitaminleri olan piridoksal, piridoksamin ve piridoksin de amino

gruplarının bir molekülden diğerine transferinde görev alırlar (Campbell 1991).

2.1.1 Enzim kinetiği

Enzim, substratı ürüne dönüştürürken önce onunla bir enzim-substrat kompleksi

oluşturur, daha sonra da bu kompleks ürün ve enzime dönüşür.

k1 k3

E+S ES E+P k2

Burada ES kompleksi, E ve S’dan k1 hızı ile oluşur; ES’nin ayrışması ise k2 hızındaki

geri reaksiyonla tekrar substrat oluşumu şeklinde yürüyebilir. Ancak asıl reaksiyon k3

reaksiyon hızı ile ilerleyen ürün oluşumu reaksiyonudur. Reaksiyon kararlı duruma

ulaşınca (steady-state) ES’nin oluşması ayrışmasına eşit olur, yani sıcaklık aynı kaldığı

sürece konsantrasyonda değişme olmaz.

8

Enzim reaksiyonları ile ilgili ilk geniş kinetik çalışmalar 1913 yılında Michaelis-Menten

tarafından yapılmıştır. Michaelis-Menten kinetiğine göre başlangıç enzim derişimi sabit

alınıp reaksiyon hızının substrat derişimine bağlılığı incelenir. Sonuçta hiperbolik bir bir

eğri elde edilir (Şekil 2.1).

Şekil 2.1 Michaelis- Menten grafiği

Vmax, hiperbolün y eksenini kestiği noktadır ve maksimum hız olarak belirtilir.

Maksimum hızın yarısına (Vmax/2) karşılık gelen substrat derişimi Km (Michaelis-

Menten sabiti) olarak belirtilir. Vmax ve Km , bir enzimin aktivitesini belirleyen önemli

sabitlerdir.

Michaelis-Menten grafiği 3 bölgeden oluşmaktadır. Birinci bölgede substrat

konsantrasyonu düşüktür ([S] << Km) ve substrat derişimi arttıkça hız 1. dereceden

enzim kinetiğine göre artmaktadır. İkinci bölgede ise substrat konsantrasyonu ve hız

arasındaki reaksiyon karışık dereceden yürür. Üçüncü bölgede [S] >> Km’dir ve substrat

konsantrasyonu artsa da artık hızda bir değişme olmaz, sıfırıncı dereceden bir enzim

V=Vmax [S]

[S]+Km

(Michaelis-Menten Denklemi)

9

kinetiği gözlenir (V = Vmax).

Michaelis-Menten grafiği ile bir hiperbol elde edildiğinden, uygulamalarda kolaylık

sağlamak amacı ile bunun bir doğru denklemi haline getirilmesi gerekmektedir. Bu

amaçla eksen ölçekleri uygun şekilde değiştirilerek, değişik yollardan doğru denklemine

dönüştürülebilir. Bundan en çok kullanılanı Lineweaver-Burk denklemidir (Lineweaver

and Burk, 1934).

1 Km 1 1— = ——. —— + —— (Lineweaver- Burk Denklemi) V Vmax [S] Vmax

Bu denkleme göre ordinatta 1/V, absiste 1/[S] değerleri olmak üzere bir doğru elde

edilir. Bu doğrunun eğimi ise Km/Vmax’dır (Şekil 2.2).

Şekil 2.2 Lineweaver-Burk grafiği

10

2.1.2 Enzim aktiflik birimleri

Enzimler biyolojik ortamda çok az miktarda bulundukları için miktar ölçümleri yerine

aktivite ölçümleri yapılmaktadır.

Enzim Aktivitesi: optimum koşullarda, birim zamanda substratı ürüne dönüştüren

enzim miktarı olarak tanımlanmaktadır.

Enzim Ünitesi (IU): 25 ºC’de, bir dakikada, optimum koşullarda 1 mikromol substratı

ürüne çeviren enzim miktarıdır.

Katal: 1 saniyede 1 mol substratı reaksiyona sokan enzim miktarıdır. Uluslararası

enzim komisyonu tarafından belirlenen yeni bir birim olan katal çok büyük bir miktarı

gösterir.

Spesifik Aktivite: 1 miligram protein başına düşen enzim aktivitesine denir. Spesifik

aktivite, enzim ünitesi/mg protein olarak hesaplanmaktadır.

Turnover sayısı: Birim zamanda bir mol enzimi ürüne dönüştüren substratın mol

sayısıdır.

2.1.3 Enzim inhibisyonu

Enzimlerin hem in vivo, hem de in vitro aktivitelerinin bazı bileşikler tarafından

azaltılmasına veya tamamen yok edilmesine enzim inhibisyonu denir. Buna sebep olan

bileşiklere de inhibitör adı verilir. İnhibitörler genellikle düşük molekül ağırlığına sahip

bileşik veya iyonlardır. Enzimatik aktivitenin inhibisyonu biyolojik sistemlerde başlı

başına bir kontrol mekanizması oluşturduğundan oldukça önemlidir.

11

İnhibisyon araştırmaları ile enzimatik reaksiyonların mekanizmaları, aktif merkezde rol

oynayan fonksiyonel gruplar, aktif merkezin yapısı ve enzimin substrat spesifikliği

açıklanabilir. Ayrıca ilaçların ve toksik maddelerin etkisi de bu yolla incelenebilir.

İki tip inhibisyon vardır, birincisi tersinir (geri dönüşlü) inhibisyon, ikincisi tersinmez

(geri dönüşsüz) inhibisyondur. Tersinmez inhibisyon’da, inhibitör aktif merkeze

kovalent olarak bağlanarak enzimi inaktive eder. Tersinmez inhibisyonlara örnek

olarak, aktif merkezlerinde serin bulunan enzimlerin di-izopropilflorofosfat tarafından

inaktivasyonları verilebilir. Tersinir inhibisyonda ise inhibitör enzimle veya enzim

substrat kompleksi ile kovalent olmayan şekilde bağlanır. Üç çeşit tersinir inhibisyon

türü vardır (Robyt and White 1990). Bunlar;

1) Yarışmalı inhibisyon ( Kompetitif İnhibisyon)

2) Yarışmasız inhibisyon (Nonkompetitif İnhibisyon)

3) Yarı Yarışmalı inhibisyon (Unkompetitif İnhibisyon)

2.1.3.1 Yarışmalı inhibisyon (Kompetitif inhibisyon)

Bu tür inhibisyon, yapı bakımından substrata benzeyen maddeler tarafından yapılır.

İnhibitör aktif merkeze bağlanarak enzim-inhibitör kompleksini oluşturur. Bu kompleks

ürüne dönüşemeyeceğinden inhibitör bağlamış olan enzim molekülleri boşa harcanmış

olur. Fakat substrat konsantrasyonunu arttırmakla inhibisyon etkisi ortadan kaldırılabilir.

Yani enzimin Vmax değeri değişmezken, Km değeri artar. Kompetitif inhibitör varlığında

reaksiyon şeması aşağıda verilmektedir.

Kp

E+S ES E+P + Ks I

Ki

EI

12

Şekil 2.3 Yarışmalı (Kompetitif) inhibisyon

2.1.3.2 Yarışmasız inhibisyon (Nonkompetitif inhibisyon)

Yarışmasız inhibisyonda inhibitör ya serbest enzime veya enzim-substrat kompleksine

aktif merkez dışındaki bir bölgeden bağlanır ve iki farklı kompleks meydana gelir.

İnhibitörün bağlanması enzimi deforme edeceğinden ES oluşması ve ayrışması normal

hızlar ile yürümez. Burada substrat ve inhibitör arasında yarışma söz konusu değildir.

Substrat konsantrasyonunu artırmakla inhibisyon kaldırılamaz. Bu tür inhibisyonda

substrat ve inhibitör gelişi güzel bir tarzda birbirinden bağımsız ve tersinir olarak aynı

anda farklı merkezlere bağlanarak ES ve EI komplekslerini oluştururlar. Ayrıca ES, I ile

EI, S ile birleşerek ESI üçlü kompleksini meydana getirir. Yarışmasız inhibitör etkisini,

bir enzimin turnover sayısını, yani katalitik aktivitesini düşürerek gösterir.

13

Kp

E+S ES E+P + Ks + I I

Ki

EI+S ESI

Farklı inhibitör konsantrasyonları için aşağıda çizilen Şekil 2.4’de 1/V-1/S doğrularının

eğimi şekilden de görüldüğü gibi farklıdır, fakat hepsi x eksenini aynı noktada keserler.

Bu nedenle Km değerleri aynıdır. Maksimum hız ise inhibisyondan dolayı azalmıştır.

Şekil 2.4 Yarışmasız (Nonkompetitif) inhibisyon

2.1.3.3 Yarı yarışmalı inhibisyon (Unkompetitif inhibisyon)

Yarı yarışmalı inhibisyonda, inhibitör direkt olarak enzime değil enzim-substrat

kompleksine bağlanır. Böylece kompleksin yapısı bozulmuş olacağından ürün meydana

14

gelmez. Bu inhibisyon çeşidinde inhibitör serbest enzime bağlanamaz. Bunun için tek

substratlı sistemlerde yarı yarışmalı inhibisyona daha az rastlanır. Reaksiyon şeması;

Kp

E+S ES E+P Ks + I

ESI

ESI kompleksi ortamda sürekli var olacağından yarı yarışmalı inhibitör varlığında Vmax

değeri azalır. ESI kompleksinin oluşumu vasıtasıyla ES kompleksi ortamdan sürekli

çekildiğinden enzim ve substrattan ES kompleksinin oluşum dengesi daha fazla sağa

kayar ve Km değeri küçülür.

Şekil 2.5 Yarı yarışmalı inhibisyon

15

Farklı inhibitör konsantrasyonlarında 1/V-1/S grafikleri çizilirse yukarıdaki Şekil 2.5’de

görüldüğü gibi birbirine paralel doğrular elde edilir. Yarı yarışmalı inhibisyonda hem

Vmax hem de Km değerleri değişmektedir. Bu tip inhibisyon daha çok iki substratlı

reksiyonlarda gözlenmektedir.

2.2 Polifenol Oksidaz (PPO) Enzimi

Polifenol oksidaz enzimi oksidoredüktaz sınıfının bir üyesidir (EC 1.14.18.1). Bu enzim

bakır içeren bir metallo enzimdir ve oksijen varlığında iki farklı reaksiyonu

katalizleyebilir. Bunlardan birisi, monofenolik bileşiklerin o-difenollere hidroksilasyonu

(kresolaz aktivitesi), diğeri ise o-difenollerin o-kinonlara oksidasyonudur (katekolaz

aktivitesi). Kresolaz ve katekolaz aktiviteleri sonucu oluşan kinoid maddeler

polimerleşerek kahverengi, kırmızı veya siyah pigmentler oluşturur (Whitaker 1972,

Friedman 1996,1997). Son yıllarda enzim isimlerindeki karışıklığını gidermek amacıyla

uluslararası terminolojide bitki polifenol oksidazlarının adlandırılmasında bazı

değişiklikler yapılmıştır. Tirozinaz (monofenol monooksijenaz) EC.1.14.18.1 enzim

kodu ile, katekol oksidaz (difenoloksidaz, difenol oksijen oksidoredüktaz) EC.1.10.3.2

enzim kodu ile, lakkaz ise EC.1.10.3.1. enzim kodu ile belirtilmiştir. Ancak bu yeni

sınıflandırma aynı enzim önceleri krezolaz ve katekolaz aktiviteleri olarak bilinen iki

reaksiyon arasında ayrımı getirdiği için pek tercih edilmemektedir.

Üzümdeki enzim aktivitesi, pulp veya özsuya nazaran kabukta daha fazla bulunmuştur

ve olgunlaşma esnasında aktivite azalması kabukta daha belirgin olmuştur (Parish

1972). Bazı araştırmacılar kabukta daha yüksek aktivite bulurken (Voigt et al. 1996),

bazıları çekirdek bölgesinde daha fazla aktivite olduğunu belirlemiştir (Bleslermann

1956). Elmadaki polifenol oksidaz aktivitesinin büyük oranda elmanın cinsine bağlı

olduğu bazı araştırmacılar tarafından rapor edilmiştir (Walker 1962, Vamos-Vigyazo

1977). Amasya ve Golden türü elmalar üzerinde yapılan bir çalışmada, Amasya türünün

Golden’e göre daha fazla PPO enzim aktivitesine sahip olduğu bulunmuştur (Keleş

1986). Çay bitkisinin (özellikle filizlerinin) polifenoller ve PPO enzimi bakımından

oldukça zengin olduğu ve PPO enziminin çayın fermentasyonunda anahtar enzim

16

olduğu bildirilmiştir (Mayer and Harel 1991).

2.2.1 PPO enziminin substratları

Sebze ve meyveler çok çeşitli fenolik bileşikler içerirler. PPO enziminin meyve ve

sebzelerdeki en önemli substratları, flavonoid tipi bileşikler, sinamik asit türevleri ve

basit fenollerdir Bu bileşikler, bitkilerin hemen hemen her bölgesinde bulunmaktadır

(Hermann 1974, Swain 1962).

Flavonoid omurgası

Flavonoid omurgasına sahip fenolik bileşikleri 4 grupta toplamak mümkündür:

2.2.1.1 Katekinler

Katekinler; doğada (+) katekin ve onun stereoizomeri olan (-) epikatekin olarak iki

formda bulunmaktadır. Diğer formları tabii katekinlerin sıcak seyreltik sodyum

karbonat ile muamele edilmesiyle elde edilir (Frudenberg et al. 1962).

17

(+) - Katekin (R1=H, R2=OH)

(-) - Epikatekin (R1=OH, R2=H)

2.2.1.2 Lökoantosiyanidinler

Lökoantosiyanidinlerin ilk göze çarpan özelliği asidik ortamda ısıtılarak

antosiyanidinlere dönüşebilmeleridir. Lökoantosiyanidinlerden (5,7,3',4'-tetrahidroksi-

3.4-dial) (IV) Lökosiyanid (5,7,3',4',5' -pentahidroksi-34 dial) (V) ve Lökopelargonidini

(5,7,4' trihidroksiflavon-3,4-dial) (VI) izole edebilmişlerdir (Ganguly and Seshada

1958).

(IV) Lökosiyanidin (R1=OH, R2=H)

(V) Lökodelfinidin (R1=R2=OH)

(VI) Lökopelargonidin (R1=R2=H)

18

2.2.1.3 Antosiyanidinler

Antosiyanidinler, antosiyaninlerden oluşmaktadır. Antosiyaninlerin aglikon kısmını

oluşturan fenolik bileşiklerde -OH grubu sayısı arttıkça renkte mavilik, -OCH3 grubu

sayısı arttıkça renkte kırmızılık artmaktadır. Üzümlerde ve doğal olarak şaraplarda en

yaygın olarak bulunan antosiyanidinlerdir (Acar 1998).

Pelargonidin (R1=R2=H)

Siyanidin (R1=OH, R2=H)

Delfinidin (R1=R2=OH)

2.2.1.4 Flavonoller

Siyah ve beyaz üzüm kabukları üzerinde yapılan çalışmalar siyah üzümlerin hepsinde ,

kemferol, quersetin ve mirisetin, beyaz üzümlerde ise yalnız kemferol ve quersetin

pigmentlerinin bulunduğunu göstermektedir (Austin 1968, Canbaş 1985, Acar 1998).

19

(X) Quercetin (R1= OH, R2=OH)

(XI) Myricetin ( R1= R2=OH)

(XII) Kaempferol (R1=R2=H)

2.2.1.5 Sinamik asit türevleri

Sinamik asit esterlerinden klorogenik asit, polifenol oksidazın en yaygın doğal

substratıdır. Klorogenik asitin bir bölümünü oluşturan kafeik asit, p-kumarik asitin PPO

enzimi tarafından hidroksilasyonu sonucu elde edilir. Oluşan kafeik asit de quinik asit

ile bir ester bağı yaparak klorogenik asiti meydana getirir. Klorogenik asitin izomerleri

olan izoklorogenik asit, neoklorogenik asit, pseudoklorogenik asit ve "Band 510" PPO

enziminin doğal substratlarındandır (Sato 1962).

Klorogenik asit

2.2.1.6 Basit fenoller

Tabii olarak oluşan flavonoidlerin bir çoğu, katekole benzemektedir. Katekol bu yüzden

en basit o-dihidroksi fenol olarak düşünülebilir.

20

Gallik asit, hidroliz olabilen taninlerin temelini oluşturur ve bu bileşikler örneğin, m-

digallat ve ellagic asit hidroliz olabilen ester bağlarıyla birleşirler. Hidroliz olabilen

tanninler meyvelerde yaygın olarak bulunmazlar. Ancak gallik asit ile birlikte, birkaç

meyvede az miktarda bulunurlar (Roberts 1962).

Tirozin gıdaların çoğunda bulunan önemli bir amino asittir ve melanin oluşumunda

oldukça önemli bir substrattır. Tirozinin hidroksilasyon ürünü olan dihidroksifenil

alanin (DOPA) ve dihidroksifenil etilamin (dopamin) bitkilerde bulunmaktadır (Walker

1964, Stelzig et al. 1972).

2.2.2 PPO enziminin katalizlediği tepkimeler

Polifenol oksidaz enzimi meyve ve sebzelerdeki moleküler oksijen varlığında fenolik

bileşikleri yükseltgeyen bir enzimdir. PPO enzimi, moleküler oksijen ile iki tür

reaksiyonu katalizler.

Hidroksilasyon reaksiyonu: Monofenollerin hidroksilasyonu ile o-dihidroksifenollere

yükseltgenmesi (Kresolaz aktivitesi).

Oksidasyon reaksiyonu:o-Dihidroksifenollerin o-kinonlara yükseltgenmesi (Katekolaz

aktivitesi) (Valero et al. 1988).

Patates, elma, şeker pancarı yaprağı, bakla ve mantardan elde edilen PPO enzimi her 2

aktiviteyi de göstermektedir. Ancak çay yaprağı, tütün yaprağı, mango, muz, armut gibi

bitkilerden elde edilen PPO enziminin monofenollerle reaksiyon göstermediği

21

belirtilmiştir. Yani bunlar sadece katekolaz aktivitesi göstermektedir (Zemel 1989).

Meyvelerde bulunan fenolik substratların çoğu dihidroksifenoller olduğundan kararma

reaksiyonlarının çoğu PPO enziminin katekolaz aktivitesi sonucu meydana gelmektedir.

PPO enziminin katalizlediği reaksiyonun aydınlatılması için uzun yıllar çalışılmıştır.

Ancak günümüzde, bu reaksiyonun PPO enziminin aktif merkezinde bulunan bakırın

redoks reaksiyonları sonucu meydana geldiği kabul edilmektedir (Zemel 1989).

2.2.3 Bakırın reaksiyondaki rolü

Çeşitli kaynaklardan izole edilen PPO enziminin içerdiği bakır miktarı da farklıdır.

Muz, patates ve tütünden elde edilen PPO enziminin bakır konsantrasyonları sırasıyla %

0,3, % 0,2 ve % 0,32’dir (Vamos-Vigyazo 1981).

Monofenollerin hidroksilasyonu sırasında ortamda bulunan 1 molekül O2 aktif bakırdan

2 elektron alarak H2O’ya indirgenir. Bu reaksiyon sonucunda bakır, inaktif (+2

değerlikli) durumdadır. Yeniden aktiflik kazanması için oluşan o-dihidroksifenolün o-

kinona yükseltgenmesi gerekmektedir.

22

Enzim -2 Cu+ + O2 → Enzim - 2 Cu+- O2

aktif

Enzim - 2 Cu+ - O2 + Monofenol + 2 H+ → Enzim - 2 Cu+2 + o-difenol + H2O

inaktif

Enzim - 2 Cu+2 + o-difenol → Enzim -2 Cu+ + o-kinon + 2 H+

aktif

Şekil 2.6 o-kinon oluşum mekanizması

23

Şekil 2.7 Melanin pigmentinin oluşum mekanizması

Melanin pigmentinin oluşumunda, çiftleşmemiş elektronlar, kolayca yeni kovalent

bağları oluştururlar ve yeni bağlanmış karbonlar üzerindeki hidrojenler tekrar

oksitlenecek olan hidrokinona göç ederler. Sonuçta kompleks yapıdaki büyük

polimerler oluşur (Singleton 1987).

24

2.2.4 Esmerleşme reaksiyonları

2.2.4.1 Enzimatik esmerleşme

Enzimatik esmerleşme, esas olarak oksijenin varlığında fenollerle polifenol oksidazlar

arasındaki ilişkiden kaynaklanmaktadır (Nicolas et al. 1994). Bu reaksiyonlarda oluşan

o-kinonlar, renksiz bileşiklerdir ve herhangi bir renk bozulmasına neden olmazlar.

Ancak oluşan o-kinon ve türevlerinden daha sonra dimer oluşmakta ve bunlar daha

büyük moleküllü bileşiklere polimerize olmaktadır. Renk bozulmalarının esas nedeni

esmer renkli olan bu polimerlerdir. Reaksiyon sonunda oluşan renk tonu ve yoğunluğu,

çevresel faktörlerin ve ortamdaki fenollerin türüne bağlı olarak farklılık göstermektedir.

2.2.4.2 Enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonları

Meyve ve sebzelerden üretilen birçok ürünün enzimlerin rolü olmadan, özellikle ısı

etkisiyle artan bir esmerleşmeye uğradıkları gözlenmektedir. Kurutulmuş ürünlerde renk

esmerleşmesi daha çok enzimatik olmayan bir yolla meydana gelmektedir. Esmerleşme

olayı, üretim sırasında uygulanan ısıl işlem sonucu oluştuğu gibi depolama sırasında da

yavaş bir hızda devam etmektedir. Buna göre bu tip esmerleşme reaksiyonları ısı ile

şiddetlenen ve düşük sıcaklıklarda zamana bağlı olarak sürekli artan bir olaydır

(Wetherilt et al. 1992).

Enzimatik olmayan esmerleşme diye bilinen renk değişmeleri, amino asitlerle indirgen

şekerler arasında meydana gelen Maillard reaksiyonu olarak da bilinen bir dizi

reaksiyonun sonucudur ve oksijensiz ortamda da yürüyebilir. Koku ve renkte bir

iyileştirme sağlayan bu reaksiyonlar lezzet endüstrisinde oldukça önemlidir. Olayın ilk

aşamasında, amino grubu, şekerin indirgen hidroksil grubuna bağlanarak N-glikozitleri

oluşturmaktadır. Bunu izleyerek gelişen karmaşık polikondensasyon olayları

25

sonucunda, esmer renkli "melanoidin" adı verilen bileşikler oluşmaktadır. Enzimatik

olmayan renk bozulmaları, ısı, ışık, metaller ve oksijen gibi faktörlerin etkisiyle

meydana gelmektedir (Cemeroğlu ve Acar 1986 , Bolin and Steele 1987).

2.2.5 PPO enziminin inhibitörleriyle enzimatik kararmanın önlenmesi

PPO enziminin inhibisyonu ve enzimatik kararmanın önlenmesi genelde aynı başlık

altında incelenir. Ancak kararmanın önlenmesi, yalnızca enzimin inaktivasyonu ile değil

aynı zamanda reaksiyon için gerekli olan iki substrattan (02 ve fenolik substrat) birinin

uzaklaştırılması ile gerçekleştirilebilir. Gıda teknolojisinde kararma inhibitörleri

kullanılacaksa bu inhibitörün toksik olmaması, tadı ve görünüşü bozmaması

gerekmektedir. Enzimatik inhibitörler aşağıdaki gibi sınıflandırmıştır (Walker 1975).

2.2.5.1 Enzimi birinci derecede etkileyen inhibitörler

PPO enzimi, kofaktör olarak Cu içeren bir metalloprotein olduğu için, siyanür,

karbonmonoksit, sodyumdietilditiyokarbamat (DIECA), merkaptotiyazol,

dimerkaptopropanol, azid ve potasyum metil ksantat gibi metal şelatlayıcı reaktiflerle

inhibe edilebilir (Roberts 1962, Mathen and Parpia 1971, Wildanger 1973, Sapers 1990

,Şakiroğlu 1994).

Florür ve azotür gibi inorganik iyonlar asidik ortamda enzimi genellikle inhibe

etmektedir. Bakla PPO enzimi üzerinde florür yarışmasız inhibisyon etkisi gösterirken

azotür karışık tip inhibisyon göstermektedir. Borat gibi bazı inorganik iyonlar substratla

kompleks yaparak inhibisyon etkilerini gösterirler. Substrat olarak L-Dopa veya L-

adrenalin kullanıldığında boratın inhibisyonu yarışmalı inhibisyondur (Yosunobu 1957

,Weser 1968, Şakiroğlu 1994).

Benzoik asit ve sinamik asidin bazı türevleri; tatlı kiraz, elma, armut, kayısı ve

26

patateslerden elde edilen enzimler üzerinde yarışmalı inhibisyon etkisi göstermiştir

(Soler-Mahnez and Lozona 1965, Pifferi and Cultrera 1974, Walker and Wilson 1975,

Walker 1976, Şakiroğlu 1994).

Polivinilpirolidon (PVP) gibi çözünebilen polimerler, PPO enzimine yarışmalı bir

inhibitör olarak etki eder (Jones and Waoltorton 1965, Pierpoint 1966, Walker 1975,

Şakiroğlu 1994 ). Bu etki anyonik deterjanlarla kaldırılabilir.

2.2.5.2 Reaksiyon ürünleri veya substratlar ile reaksiyona giren bileşikler

1) O-dihidroksifenollerden oluşan kinonlar üzerine indirgeyici reaktif olarak etki eden

bileşikler inhibisyon esnasında tükenirler. Ve bunlar yüksek konsantrasyonlarda

kullanılmadıkça renk değişimine karşı geçici bir koruma sağlarlar. Bu özelliği gösteren

bazı maddeler, askorbik asit, S02, potasyum metabisulfat, 2-merkaptoetanol, 2-

merkaptobenzotiyazol ve tiyoglikolattır (Şakiroğlu 1994).

Askorbik asit, enzimatik kararma inhibitörü olarak en çok kullanılanlardan biridir.

Çünkü askorbik asit gıda ürünlerinin biyolojik değerini artırmaktadır. Antosiyaninlere

karşı koruyucu görev yapar ve aynı zamanda kırmızı meyvelerin renklerini korumasına

da yardımcı olur. Askorbik asitin etkisi enzimatik reaksiyon sonucu oluşan ve kinonları

indirgeme şeklindedir. Ayrıca Cu’ı şelatlama reaktifi olarak da görev yapar. Bunların

yanında enzim tarafından direkt oksitlenerek yarışmalı bir inhibitör olarak da kullanılır.

Kinetik çalışmalar üstün bir inhibitör olduğunu göstermiştir. Bazı fenollerde gözlendiği

gibi (rezorsinol gibi), PPO enziminin yarışmalı inhibisyonu askorbik asitle artırılabilir

(Taufel and Voigt 1964, Singh and Ahlawati 1974, Şakiroğlu 1994).

Askorbik asit yanında S02 ya da sülfit çok sık olarak sebze ve meyvelerdeki enzimatik

kararmayı önlemek için kullanılır. Bu bileşikler, PPO-polifenol sistemi üzerine

kompleks bir etkiye de sahiptirler. Sülfit, kinonları renksiz bileşiklere çevirerek

dönüşümsüz bir inhibisyonla kararmayı önler. Aynı zamanda bu inhibitör mono ve

dihidroksi fenollere karşı enzimin aktivitesini azaltır (Markakis 1966, Şakiroğlu 1994).

27

2) Kinonlar ile kararlı renksiz bileşik oluşturan maddeler: Bunlar tükenmediği müddetçe

devamlı koruma sağlarlar. Sistein, glutatyon, benzensülfonik asit, DIECA ve Na-

etilksantat bu şekilde etki gösterir.

2.2.6 PPO enziminin doğadaki ve gıda işletmeciliğindeki rolü

PPO enziminin gıda, sağlık ve kozmetik endüstrisinde birçok uygulama alanı vardır.

PPO enzimi meyve ve sebzelerde enzimatik kararmaya yol açarak gıdaların pazar

değerini düşürdüğünden öncelikle gıda sektörünün ilgisini çekmiş ve buna yönelik

çalışmalar yapılmıştır. Bu alandaki çalışmalar enzimin aktivitesini minimuma

indirebilmek şeklindedir (Eskin 1990).

Polifenol oksidaz enziminin bitkilerde önemli rolleri vardır. Bunlardan birisi, bitkilerin

viral veya mikrobiyal enfeksiyonlara karşı direncinde rol oynamasıdır. Örneğin virüs

enfeksiyonundan etkilenen dokular, sağlıklı dokulara oranla daha fazla PPO enzimi

içermekte ve enzimatik kararmaya karşı daha fazla hassas olmaktadır. Yaralı dokuda

oluşan kinonların triptofan ile etkileşerek indol asetik asit oluşturdukları ve böylece

kallus dokusu oluşturarak o bölgeyi korudukları düşünülmektedir (Yavru 1997).

Polifenol oksidaz enzimi ayrıca bitkilere stres şartlarına karşı direnç ve dayanıklılık

özelliği kazandırır. Örneğin kışa dayanıklı bitki dokuları, dayanıksız olanlara nazaran

daha fazla PPO enzim aktivitesine sahiptirler. Mesela kış şartlarına dayanıklı bir erik

türü olan Prunus ussuriensis yapraklarında yüksek seviyede aktivite bulunmuştur

(Khuruskeheva and Krehin 1965). Yine kış şartlarına dayanıklı üzüm asmalarında,

dayanıklı olmayanlara göre daha fazla enzim aktivitesi gözlenmiştir (Molchanova

1966).

Ayrıca polifenol oksidazın faaliyeti sonucu oluşan kinonlar, enzimatik olmayan

kararma ve humuslaşmayla toprağın organik maddelerinin oluşmasına katkıda

bulunurlar.

Enzimatik kararma elma, armut, şeftali ve muz gibi meyvelerde, patates ve yemeklik

28

mantar gibi sebzelerde daha fazla görülür. Ancak yeterli seviyede fenolik madde ve

PPO enzimi içermeyen domates, limon, turunçgillerde yüksek asit nedeniyle enzimatik

kararma problem oluşturmamaktadır (Ponting 1960, Vamos-Vigyazo 1981). Öte yandan

bazı tahıllardan elde edilen unlardaki yüksek PPO enzim aktivitesinden dolayı, ekmek

ve makarna ürünlerinin kararma gösterdiği ve oluşan kinonların proteinlerle birleşerek

gıdaların sindirimini zorlaştırdığı ve bu arada lizin amino asidinin etkisini azalttığı

bildirilmiştir (Vamos-Vigyazo 1981).

Siyah çay üretiminde enzimatik kararma istenen bir olaydır. Kinon, çaya içim tadı ve

kalitesini kazandıran teaflavinin ön maddesidir. Bu nedenle çay PPO enzimi üzerinde

çok çalışma yapılmıştır (Gregory and Bendall 1966). Benzer şekilde çekirdeksiz kuru

üzüm, incir ve hurmaların beğenilen güzel renkleri enzimatik esmerleşme sonucudur.

Kakao ve kahvenin renk ve aroması, siyah zeytinin renk ve lezzetinde enzimatik

kararmanın rolü büyüktür (Vamos-Vigyazo 1981, Cemeroğlu 1982, Walker 1977,

Oktay 1992).

2.2.7 PPO enziminin tıptaki kullanım alanları

PPO enzimi, melanin oluşumunda görev alması nedeniyle tıbbi alanda da dikkatleri

üzerine çekmiştir. Suda çözünmeyen heteropolimer yapıdaki melanin, 5,6

dihidroksiindol ve 5,6-dihidroksiindol-2-karboksilik asit birimlerinden oluşur ve

özellikle kozmetik sanayi tarafından güneşin ultraviyole ışığından korunmak amacıyla

üretilir. Ayrıca, ilaç tutuklamada myopolimer olarak da melaninden yararlanılmaktadır.

Bundan başka, bazı kanser türlerinde kanserli hücrede tirosinaz aktivitesinin oldukça

arttığı gözlemlenmiş ve bu kanser türlerinin tedavisinde enzimin bu özelliginden

faydalanılması gündeme gelmiştir (Çiçek 2000).

Memelilerde tirosinazın aktif biçimi, melanositler içerisinde bulunan özelleşmiş

sitoplazmik granüller olan melanozomlarda bulunmaktadır. Dewey et al. (1977)

tirozinazın bir substratı olan 4-hidroksianizolün farelerde Harding-Passey

melanomasının gerilemesine sebep olduğunu bildirmişlerdir.

29

Tirosinazın kullanıldığı bir başka önemli alan ise Parkinson hastalığının tedavisinde

kullanılan L-DOPA’nın üretimidir (Whitaker 1995).

30

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1 Kullanılan Materyal ve Maddeler

Bu çalışmada, İzmir (Bergama) üzümünden izole edilen polifenol oksidaz

(PPO:E.C.1.14.18.1.) enzimi kullanılmıştır. Çalışmamızda kullanılan İzmir üzümünün

(Vitis vinifera L.) Türk Patent Enstitüsü tarafından onaylanan bazı özellikleri şöyledir:

"Salkımları konik, uzun silindirik yapıda ve normal sıklıkta olup 250-500 gram

ağırlığındadır. Ekolojik seçiciliği vardır, soğuğa hassastır. Taneleri çekirdeksiz, sulu,

etli ve gevrektir."

3.1.1 Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler

Çalışmalarımızda kullanılan kimyasal maddeler; Polivinil pirolidon, askorbik asit, p-

krezol, L- Dopa, D-tirozin, kafeik asit, L-sistein, sodyum dietil ditiyo karbamat, β-

merkaptoetanol, sefadeks G-100, (NH4)2SO4, Na2HPO4, NaH2PO4 Sigma firmasından

sağlanmıştır. 4-metil katekol, sitrik asit, sodyum sitrat Fluka firmasından; katekol,

pirogallol, gallik asit, sodyum azid, potasyum tartarat, sodyum tungstat, sodyum

molibdat, CuSO4. 5H2O, Li2SO4, NaOH, HCI ise Merck firmasından temin edilmiştir..

3.1.2 Kullanılan alet ve cihazlar

Bu çalışmadaki spektrofotometrik ölçümler, UV-1601 Shimadzu marka

spektrofotometre ile yapılmıştır. pH ölçümleri Orion 720A model pH metre ile, santrifüj

işlemleri Beckmann Optima XL-100K model ultrasantrifüj kullanılarak yapılmıştır.

Homojenizasyon işlemi Waring Commercial Blender ile yapılmıştır. İzolasyon

işleminde kullanılan diyaliz torbaları (1200 Dalton) Sigma firmasından temin edilmiştir.

Termostatlı ve karıştırmalı su banyosu Nüve BM 101, vorteks ise Nüve N 110 modeldir.

31

3.1.3 Tampon çözeltilerin hazırlanması

Araştırmada kullanılan tampon çözeltilerinin hazırlanmaları aşağıdaki gibi yapılmıştır.

3.1.3.1 0,1 M sitrat tamponunun hazırlanması

0,1 M Sitrat tamponu, pH 4,2 ve 4,4’deki çözeltilerin hazırlanması için kullanılmıştır.

10,51 gram sitrik asit monohidrat saf su ile 500 ml’ye tamamlanır (A çözeltisi). 14,705

gram sodyum sitrat saf su ile 500 ml’ya tamamlanır (B çözeltisi).

A ve B çözeltileri Çizelge 3.1’de belirtilen miktarlarda karıştırılarak saf su ile 100

mL’ye tamamlanmış ve istenilen pH’ta tampon çözeltiler elde edilmiştir.

Çizelge 3.1 0,1 M Sitrat tamponu hazırlanması

pH A (mL) B (mL)

4,2 35 15

4,4 28 22

3.1.3.2 0,2 M fosfat tamponunun hazırlanması

pH’ları 5,7-7,2 arasındaki çözeltileri hazırlamak için kullanılmıştır.

24 gram (0,2 mol) NaH2PO4 saf suda çözülerek 1000 mL’ye tamamlanır (A çözeltisi).

28,4 gram (10,2 mol) Na2HPO4 suda çözülerek 1000 mL’ye tamamlanır (B çözeltisi).

A ve B çözeltilerinin Çizelge 3.2’de verilen miktarlarda karıştırılması ile istenilen

pH’larda tampon çözeltiler hazırlanmıştır.

32

Çizelge 3.2 pH’ları 5,7-7,2 arasındaki çözeltilerin hazırlanması

pH A (mL) B (mL)

5,7 467,5 6,5

6,4 367,5 132,5

6,7 282,5 217,5

7,0 195 305

7,2 140 360

3.1.3.3 0,05 M tris tamponunun hazırlanması

pH’ları 7,4-9,0 arasındaki çözeltileri hazırlamak için kullanılmıştır. 0,05 M Tris

tamponu, Trizma-HCI ve Trizma-Base’den Çizelge 3.3’de verilen miktarlarda tartılıp

saf su ile 1000 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır.

Çizelge 3.3 0,05 M Tris tamponunun hazırlanması

pH Trizma-HCI (g) Trizma Base (g)

7,4 3,305 0,485

7,8 2,66 0,985

8,0 2,22 1,325

8,5 1,105 2,18

9,0 0,38 2,735

33

3.2 Polifenol Oksidaz (PPO) Enziminin İzolasyonu

Çalışmamızda izolasyon işlemi için 2 kg çekirdeksiz İzmir üzümü 1 hafta süresince 4oC’de depolanmıştır. İlk olarak 200 g üzüm temizlenmiş ve % 0,5 polivinil pirolidon

(PVP) ve 10 mM (0,528 g) askorbik asit içeren 100 ml 0,2 M fosfat tamponu (pH 7,2)

ile homojenizatörde 2 dakika karıştırılmış ve ince bir tülbentten süzülmüştür. Bu

homojenat ham enzim ekstraktı (crude enzim) olarak adlandırılmıştır.

3.2.1 Amonyum sülfat çöktürmesi

Ham enzim ekstraktı ultrasantrifüjde 5 oC’da 48000 g’de 15 dakika santrifüjlenmiştir.

Daha sonra supernatant alınmış ve amonyum sülfat çöktürmesi ile %80 doygunluğa

getirilmiştir. Amonyum sülfat çöktürme işlemleri için kullanılacak olan amonyum sülfat

miktarları için aşağıdaki formül kullanılmıştır.

533 (S2-S1)

g(amonyum sülfat) = ¾¾¾¾¾

100-0,3 S2

S1 = mevcut amonyum sülfat doygunluğu

S2 = istenilen amonyum sülfat doygunluğu

Amonyum sülfat çöktürmesi sırasında, ham enzim ekstratına katı amonyum sülfat yavaş

yavaş ve az miktarlarda ilave edilmiş ve her ilave sonrasında daha önce eklenen katı

amonyum sülfatın çözünmüş olmasına dikkat edilmiştir. Çöken PPO enzimleri 5 oC’da

48000 g’de 30 dakika santrifüjlenmiş ve daha sonra çöken PPO enzimi, az miktarda

fosfat tamponunda (pH 7,2) çözülmüştür.

34

3.2.2 Diyaliz işlemi

Biyolojik moleküllerin ayrımında kullanılan en eski yöntemlerden biri diyalizdir. Bu

teknik seyreltik bir çözeltideki moleküllerin boyutlarına göre ayrılması temeline

dayanır. Bu teknikte kullanılan diyaliz torbasının porları genellikle molekül ağırlığı

10.000’den daha fazla olan makromoleküllerin geçişine izin vermeyecek kadar

küçüktür. Bu nedenle, diyaliz tüpünün içindeki küçük iyonlar dışarı çıkarken, içeride

ayrımı istenen molekülün konsantre bir çözeltisi kalır. Küçük moleküllerin çıkışı tüpün

içi ile dıştaki tamponun konsantrasyonları eşit oluncaya kadar devam eder. Dengeye ise

çalışılan hacme bağlı olarak, genellikle 4-6 saatte ulaşılır. Dengeye ulaşıldıktan sonra,

eğer dışarıdaki çözelti taze tamponla değiştirilir ve diyalize devam edilir. Böylece,

istenilen ayırım tamamlanıncaya kadar diyaliz 1-2 gün sürdürülebilir (Temizkan ve

Arda 2004).

(a) (b) (c)

Şekil 3.1 Genel diyalizin uygulanış şekli a.Diyaliz tüpünün bağlanması, b.Diyaliztüpünün doldurulması, c.Tuzların uzaklaştırılması

Diyaliz için kullanılan yarı geçirgen zarlar (diyaliz tüpleri veya torbaları) çeşitli

materyallerden (sellofan, selüloz) yapılmış malzemelerdir. Por çapı zardan geçecek

moleküllerin büyüklüğüne göre belirlenir. Diyaliz yöntemi, iyonik olan ve olmayan,

tüm küçük molekülleri yok etmek veya konsantre etmek için basit, ucuz ve etkin bir

yöntemdir. Genellikle çözeltilerdeki tuzları ve diğer küçük molekülleri ortamdan

35

uzaklaştırmakta kullanılır. Ayrıca, biyolojik moleküllere zayıf şekilde bağlı olan küçük

iyonlar ve molekülleri de bu yöntemle ortadan kaldırmak mümkündür.

Çalışmamızda elde edilen enzim çözeltisi diyaliz torbasına (1200 Dalton) doldurulmuş

ve 4 oC’da (pH 7,2) fosfat tamponu kullanılarak diyaliz işlemi yapılmıştır. 24 saat

boyunca işleme devam edilmiş ve her 8 saatte bir diyaliz tamponu değiştirilmiştir.

Amonyum sülfat ve diyaliz işlemleri sonucu elde edilen enzim artık kısmen saf hale

getirilmiştir. Elde edilen bu enzim çözeltisi, yapacağımız diğer işlemlerde kullanılmak

üzere 3’er mililitrelik tüplere konmuş ve -20 oC’da derin dondurucuda depolanmıştır.

Bu enzimler daha sonra kinetik çalışmalar, substrat çalışmaları, optimum pH belirleme,

optimum sıcaklık, termal kararlılık, depolama kararlılığı, jel filtrasyon kromatografisi,

poliakrilamid jel elektroforezi gibi çalışmalarda kullanılmak üzere derin dondurucuda

saklanmıştır.

3.2.3 Jel fitrasyon kromatografisi

Şekil 3.2 Farklı büyüklükteki moleküllerin jel filtrasyon kromatografisi ile ayrılması

36

Jel filtrasyonu veya moleküler elek kromatografisi olarak da adlandırılan jel geçirgenlik

kromatografisinde ayırma, molekülün büyüklüğüne göre yapılır. Bu teknik binlerce

protein, nükleik asit, polisakkarid ve diğer biyolojik moleküllerin saflaştırılmasında

önem taşımaktadır (Temizkan ve Arda 2004).

Jel filtrasyonu için kullanılan bir kolonda durağan faz, küçük porlu inert partiküllerden

oluşur. Farklı boyutlarda moleküller içeren çözelti, devamlı bir çözücü akışıyla

kolondan geçirilir. Porlardan daha büyük olan moleküller jeldeki partiküllerin içerisine

giremezler ve partiküllerin arasında sınırlı bir alanda kalırlar. Sonuçta bu moleküller

yavaşlamazlar ve kolondan hızla çıkarlar. Partiküllerin içinde ve dışında yayılabilen

küçük moleküllerin kolondaki hareketleri ise daha yavaş olur.

Bu çalışmada 2,125 g Sefadeks G-100 40 mL 0,2 M fosfat tamponunda (pH 7,2) 2 gün

bekletilerek jelin oluşması sağlanmıştır. Üzümden izole edilen PPO enzimi için 0,5 cm

çapında 17,5 cm boyundaki kuru bir kolonun dibine cam pamuğu yerleştirilmiş ve

üzerine fosfat tamponu (pH 7,2) ilave edilerek kolondaki hava kabarcıkları giderildikten

sonra kolonun dip kısmına az miktarda kum ilave edilmiştir. Sefadeks G-100 bir huni

vasıtasıyla kolona uygulandıktan sonra kolonun musluğu açılarak jelin kum üzerine

homojen bir şekilde yerleşmesi sağlanmıştır. Daha sonra kolonun üst kısmına cam

pamuğu ve kum yerleştirilerek bir gün boyunca fosfat tamponu geçirilerek akış hızı

belirlenmiştir (akış hızı: 0,20 ml/dk). Bu işlemlerden sonra amonyum sülfat çöktürme

ve diyaliz işlemleri sonucu elde edilen 3’er ml’lik kısmen saflaştırılmış enzim çözeltisi

kolona uygulanmış ve kolonun musluğundan belli hacimde eluatlar alınmıştır.

Kolondan alınan her çözeltinin, 25 oC’da 280 nm’de spektrofotometrik olarak absorbans

değerleri okunmuştur. Protein hiç gözlenilmeyinceye kadar (0) hatta (-) değerlere kadar

ayırma işlemine devam edilmiştir. Bu işlemlerden sonra 3’er mL’lik olarak alınan

çözeltiler tüplere konularak numaralandırılmış ve absorbans değerleri spektrofotometrik

olarak ölçülerek grafiğe geçirilmiştir. Belli yerlerde pik gösteren tüpler birleştirilerek

PPO enziminin aktivitesine bakılmıştır. PPO aktivitesi gösteren çözeltilerdeki protein

miktarı Bradford yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır.

37

3.3 Enzim Aktivitesinin Tayini

Polifenoloksidaz enziminin aktivite tayini, spektrofotometrik olarak 420 nm’deki

absorbans artışı kaydedilerek yapılmıştır. Kuvartz numune küvetlerine 0,2 mL kısmen

saflaştırılmış enzim çözeltisi ve 0,2 M fosfat tamponu (pH 7,2) kullanılarak hazırlanan

2,8 mL katekol çözeltisi karıştırılmış ve 25 oC’da 3 dakika süresince absorbans artışları

kaydedilmiştir. Kör olarak 0,2 M fosfat tamponunda (pH 7.2) hazırlanan 3 mL substrat

çözeltisi kullanılmıştır. Daha sonra absorbans değerleri zamana karşı grafiğe geçirilerek

eğimden enzim aktivitesi bulunmuştur.

3.3.1 Enzim ünitesinin tanımı

Bir ünite PPO enzim aktivitesi, 25 oC’da 1 dakikada absorbansta 0,001 kadar artışa yol

açan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır.

Spesifik Aktivite (IU/mg) =Aktivite /mg protein

3.3.2 Stok enzim çözeltisinin hazırlanması

Diyalizlenen enzimler 3’er mL’lik hacimler halinde tüplere konulmuş ve daha sonra

kullanılmak üzere derin dondurucuda -20 oC’da depolanmıştır. Çalışmalardaki enzimler

kullanılmadan bir gün önce derin dondurucudan alınmış ve 4 oC’da bekletilerek

çözüldükten sonra kullanılmıştır.

Tez çalışmasında kullanılan enzim çözeltisi stok enzimin 0,2 M fosfat tamponu (pH 7,2)

ile 1/2 (v/v) oranında seyreltilmesiyle hazırlanmıştır.

38

3.4 Polifenol Oksidaz (PPO) Enziminin Karakterizasyonu

3.4.1 Substrat spesifikliği

Optimum substratı belirliyebilmek amacı ile PPO enziminin 7 farklı substrata karşı

aktiviteleri belirlenmiştir. Bu amaçla katekol, kafeik asit, 4-metil katekol, pirogalol, D-

tirozin, gallik asit, p-krezol substrat olarak kullanılmış. En yüksek aktiviteyi gösteren

substrat, enzim karakterizasyonu deneylerinde kullanılmıştır.

3.4.2 Optimum substrat konsantrasyonu

En yüksek aktiviteyi gösteren katekol substratının 6 farklı konsantrasyondaki (0,01 M,

0,02 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,06 M) çözeltileri kullanılarak en fazla aktivite

gösterdikleri konsantrasyon belirlenmiştir.

3.4.3 pH etkisi

PPO enzim aktivitesi farklı pH’larda hazırlanmış yedi farklı substrat kullanılarak

(katekol, kaffeik asit, 4- metil katekol, pirogallol, D-tirozin, gallik asit, p-krezol) tayin

edilmiştir. Belirli pH değerlerini elde edebilmek için substratlar farklı 12 tampon çözelti

içinde çözülerek hazırlanmıştır. Böylece yedi substratın 4,2, 4,4, 5,7, 6,4, 6,7, 7,0, 7,2,

7,4, 7,8, 8,0, 8,5, 9,0 pH değerlerindeki çözeltileri hazırlanmıştır. Bunların enzim

aktivite tayinleri de spektrofotometrik yöntemle yapılmıştır.

3.4.4 Sıcaklığın etkisi

PPO enziminin optimum sıcaklığını belirlemek için 10, 20, 30, 35, 40, 45, 55, 65, 75oC’deki 9 farklı sıcaklıktaki enzim aktiviteleri hesaplanmıştır. 20 oC’nin üzerindeki

39

sıcaklıklar için karıştırmalı ve termostatlı su banyosu, 10 oC için ise buz banyosu

kullanılmıştır. Bu çalışmada substrat olarak yüksek enzim aktivitesi gösteren katekol

(20mM) kullanılmıştır. Substrat çözeltisinin küvete boşaltılması esnasında meydana

gelebilecek sıcaklık kayıplarını önlemek amacıyla substrat çözeltisi bir kaç dakika

süreyle su banyosu içinde bekletilmiş ve mümkün olduğu kadar hızlı bir şekilde enzim

çözeltisi pipetlenerek aktivite ölçümleri yapılmıştır.

3.4.5 Enzimin termal kararlılığı

Sıcaklığın enzim kararlılığı üzerindeki etkisini gözlemek için enzim 10-75 oC arasındaki

sıcaklıklarda karıştırmalı su banyosunda 45 dakika süresince inkübe edilmiştir. Bu işlem

için sıcaklığı ayarlanmış termostata 45 ml enzim çözeltisi konulmuş ve 45 dakika

süresince her 15 dakikada bir olmak üzere örnek alınarak spektrofotometrede

aktivitesine bakılmıştır. Bu çalışmalarda substrat olarak katekol (20 mM, pH 7,2)

kullanılmıştır.

3.4.6 Protein tayini

Protein miktarları Bradford yöntemi (1976) kullanılarak belirlenmiştir. Bu yöntem,

Coomassie brilliant blue G-250 boyasının farklı konsantrasyonlardaki protein

çözeltilerinde değişik şiddette mavi renk oluşturmasına dayanır. Boyanın özellikle

arginin gibi bazik amino asitlere ve bazı aromatik aminoasitlere bağlandığı

gösterilmiştir. Dolayısıyla bu yöntemde proteinin primer yapısının önemi vardır.

Duyarlılık sınırları, 5-100 mg/ml olan bu yöntemde, asidik boya, proteine bağlanır ve

595 nm arasında maksimum absorbsiyon değerleri elde edilir. Bu deneyde standart

protein çözeltileri, sığır serum albumini (BSA) kullanılarak hazırlanmış ve standart

grafikleri çizilmiştir (Temizkan ve Arda 2004).

40

Şekil 3.3 Bradford yönteminin standart grafiği

Belirtecin hazırlanması : 25 mg Coomassie brilliant blue G-250, 12,5 ml % 95

etanolde çözüldükten sonra, 25 ml % 85 H3PO4 (veya perklorik asit) eklenir. Daha sonra

saf su ilave edilerek 250 ml’te tamamlanır. Kullanılacağı zaman 5 kez seyreltilir ve

Whatman No.1 filtreden geçirilir.

Yöntem:

1) 0,12 ml kör (ekstraksiyon tamponu veya saf su), konsantrasyonu duyarlılık sınırları

içinde kalan standartlar (örneğin 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.2, 1.4 mg/ml) ve protein örneği

çözeltisi üzerine 5’er ml belirteç hızla eklenip hemen vorteks ile hızla karıştırılır.

2) En az 5 dakika bekledikten sonra, en geç 1 saat içinde, 595 nm’deki absorbsiyon

değerleri okunur.

3) Standart eğri grafiği hazırlanarak örnekteki protein derişimi bulunur (Bradford 1976).

41

3.4.7 Enzim kinetiği

Enzimin maksimum hızı (Vmax) ve Michaelis- Menten sabiti (Km) bulunması için kinetik

çalışmalar 1.00, 1,25, 2.50, 4.00, 7.50, 10.00 mM’lık katekol çözeltisi (pH 7,2)

kullanılarak yapılmıştır. Her konsantrasyon için enzimin hızı ilk 3 dakika süresince

izlenmiş ve her 15 saniyede bir ölçüm alınmıştır. Daha sonra absorbans-zaman

grafiğinin eğiminden ∆A dak-1 olarak ilk hızlar hesaplanmıştır. Bu ilk hız değerleri

Lineweaver- Burk grafiğinde 1/V’ye karşı 1/[S] değerleri yerine konularak buradan Km

ve Vmax değerleri bulunmuştur (Lineweaver and Burk 1934).

3.4.8 Aktivasyon enerjisinin tayini

Polifenol oksidaz enzimi için aktivasyon enerjisi çalışması 0,2 M katekol substratı ile

20-75 oC’da ve pH 7,2’de yapılmıştır. Yapılan termal kararlılık çalışmasından elde

edilen aktivite değerlerinin logaritması, (1/T)’ye karşı grafik çizilmiştir. Arrhenius

denkleminden yararlanılarak grafiklerin eğiminden (Ea/2.303 R) aktivasyon enerjisi

hesaplanmıştır.

Arrhenius denklemi;

k = Ae –Ea/RT

logk = logA -Ea/2.303RT

Burada k, hız sabiti; A, Arrhenius sabiti; Ea, Aktivasyon Enerjisi; R, 1,937 cal/molK;T,

mutlak sıcaklıktır.

42

3.4.9 İnhibitörlerin etkisi

PPO enzim aktivitesi üzerine inhibitörlerin etkisini incelemek için 6 adet inhibitör (L-

sistein, L-askorbik asit, sodyum azid, sodyum dietil ditiyo karbamat, merkapto etanol,

tiyoüre) kullanılmıştır. Bu deneylerde 5 farklı katekol konsantrasyonu (1.00, 1.25, 2.50,

4.00, 7.50, 10.00 mM ) ve her inhibitör için 2 farklı konsantrasyonda PPO aktiviteleri

belirlenmiş, inhibisyon dereceleri ve inhibisyon türleri bulunmuştur.

Enzim kinetiği deneylerinde olduğu gibi ilk hızları bulmak için inhibitör ilave edilmiş

enzimin aktivitesi 3 dakika boyunca spektrofotometrik olarak izlenmiştir. Daha sonra

Lineweaver- Burk grafiğinden Ki değerleri bulunmuştur.

3.4.10 Enzimin depolama süresince kararlılığı

Enzimin 4 oC ve 20 oC’da ki depolama süresince kararlılığını incelemek amacı ile

katekol (pH 7,2) substratı kullanılarak 420 nm’deki absorbans değişimleri izlenmiştir.

Her 3 günde bir olmak üzere 1 ay süresince ölçüm alınarak kaydedilmiş, elde edilen

absorbans değerleri zamana karşı grafiğe geçirilmiştir.

3.4.11 Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE)

Elektroforez, yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki hareketlerinin izlendiği bir

tekniktir. Çözünmüş durumdaki moleküllerin elektrik yüklerinin kütlelerine oranıyla

belirlenen hızlarda elektriksel alanda hareket (göç) etmeleri prensibine dayanır.

Bu sistemde analiz yapılacak örnek, bir destek (matriks) ortamına uygulanır. Modern

elektroforetik tekniklerde destek ortamı olarak daha çok jeller tercih edilmektedir.

Jeller, içerisinde uygun bir tampon bulunan bir elektroforez aygıtına yerleştirilerek

işlem gerçekleştirilir. Analiz edilecek örnek jele çok küçük miktarda uygulanır. Katı jel

desteği ile ayrımı yapılacak moleküllerin hareketi, moleküllerin yüküne, boyutuna,

43

biçimine, kimyasal içeriğe ve uygulanan elektriksel alana bağlıdır.

Çoğunlukla basit elektriksel devreleri olan elektroforez aygıtlarında iki temel eşitlik

önem taşır:

1) Ohm yasası

V = IR: bu eşitlikte; elektrik alanı (voltaj) (V, volt), akım ( I, miliamper) ile direncin (R,

ohm) çarpımına eşittir Bir başka ifadeyle, elektrik akımı, elektrik alanı (voltaj) ile

doğru, direnç ile ters orantılıdır. Basit bir devreye belli bir miktarda voltaj uygulanırsa,

sabit akımın sistemdeki geçişi sırasında bir direnç oluşur; bu da uygulanan toplam

voltajda düşmeye yol açar. Elektroforez aygıtında oluşan direncin hemen tamamı jel

tarafından ortaya konulur. Direnç akımın geçtiği bölgenin alanının ve kullanılan

tamponun iyonik kuvveti ile ters orantılıdır. Belli bir akım için, jelin kalınlığının veya

tamponun miktarının ve iyonik kuvvetin azalması direnci arttırır, böylece jel boyunca

oluşan voltaj ve jelde hareket eden molekülün elektroforetik göç hızı artar.

2) P = I2.R

Elektroforezde önemli ikinci eşitliğe göre, sistemin ürettiği güç (P, Watt), direnç ile

akımın karesinin çarpımına eşittir. Üretilen güç ısı şeklinde ortaya çıkar ve elektroforez

aygıtı, jelin sıcaklığını artırmaksızın, ancak belli miktarda gücü dağıtabilir. Bu nedenle,

voltajın üst sınırı genellikle elektroforez aygıtının ısıyı dağıtma yeteneğine bağlıdır.

Belli bir noktanın üstünde, voltajdaki ufak artışlar bile jelin sıcaklığında önemli ve

zararlı bir yükselmeye yol açar. Kullanılan aygıtın kolaylıkla dağıtabileceği gücün

miktarının iyi bilinmesi ve buna göre jelin sıcaklığının dikkatle izlenmesi gerekir.

44

Elektroforezde elektriksel değişkenliklerden biri (akım, voltaj ya da güç) daima sabit

tutulur. Yukarıdaki eşitliklerden de anlaşılabileceği gibi, işlem sırasında eğer direnç

artarsa sabit akımda göç hızı düşer ancak ısı açığa çıkar; sabit voltajda ise göç hızı düşer

ama yeni bir ısı oluşmaz. Güç sabit tutulduğunda ise hareket hızı yavaş olur ama ısı

artışı olmaz (Temizkan ve Arda 2004).

Bu çalışmada uygulanan poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) yöntemi ikiye

ayrılmaktadır. Birincisi native-poliakrilamid jel elektroforez (native-PAGE), ikincisi

sodyum dodesilsülfat-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE)’dir. Native-PAGE

yönteminde proteinler jel boyunca denature olmadan (üç boyutlu formda) yüklerine ve

molekül ağırlıklarına göre ilerlerler. SDS-PAGE yönteminde ise proteinler denature

edilerek üç boyutlu yapılarından primer yapıya dönüştürülür. Daha sonra PAGE

uygulanır. SDS-PAGE’de proteinler jelde molekül ağırlıklarına göre koşarlar (Laemmli,

1970).

Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), akrilamid polimerizasyonuyla hazırlanan

poliakrilamid jellerin elektroforetik ayrımlarda çeşitli üstünlükleri vardır. Küçük ya da

orta boydaki nükleik asitler ve proteinler için yüksek ayrıştırma gücüne sahiptir.

Oldukça büyük boyuttaki örnekler için de uygundur, göç eden moleküllerle destek

materyali arasındaki etkileşim en düşük düzeydedir. Poliakrilamid jellerle yapılan

elektroforez, örnekteki bileşenlerin daha iyi ayrışmalarına yol açar, çünkü bu yöntemde

hem moleküler elekleme hem de elektroforetik hareket söz konusudur.

Poliakrilamid jeller, akrilamid ve çapraz bağlayıcı N,N'-metilenbisakrilamidin

polimerizasyonuyla hazırlanır. Kimyasal polimerizasyon başlatıcı-katalizör sistemi

(amonyum persülfat-TEMED) tarafından kontrol edilir. Proteinlerin ayrılması için

kullanılan standart bir jel genelde %7,5 poliakrilamid içerir. Jelin ayrıştırma gücü ve

molekül boyutu aralığı akrilamidin ve bisakrilamidin konsantrasyonuna bağlıdır. Düşük

konsantrasyonda daha büyük porlar oluşur ve yüksek molekül ağırlıklı biyolojik

moleküllerin analizi yapılabilir; yüksek konsantrasyonlarda ise, daha küçük porların

oluşumu düşük molekül ağırlıklı olanların analizine izin verir.

45

Native jel elektroforezinde (N-PAGE) kullanılan tamponlar, deterjan ve diğer

denatüre edici maddeleri içermediğinden, prosedür doğal koşullarda gerçekleşir. Bu

yöntem, protein içeren karışımların ayrılmasında, bir protein ya da protein kompleksinin

aktivitesi veya yapısı ile ilgili elektroforetik çalışmalarda, proteinin saflığının

kontrolünde ve oligomerik proteinlerin ayrılmasında kullanılır.

Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), polipeptidlerin

ilerleme hızları, sadece iç elektriksel yükleri tarafından değil, aynı zamanda molekül

ağırlıkları tarafından da belirlenmektedir. SDS, polipeptidlerin ana iskeletini

çevreleyerek proteinleri denatüre eden anyonik bir deterjan olduğu için moleküllere

negatif bir yük kazandırmaktadır. SDS-PAGE’nin en önemli yararı, polipeptidlerin

molekül ağırlıklarının belirlenmesine olanak vermesidir. Molekül ağırlığı bilinmeyen

protein örnek, molekül ağırlığı bilinen standart proteinlerle birlikte, aynı jel üzerinde

yanyana kuyucuklara uygulanır ve elektroforetik olarak ayrılır. Boyama sonrasında

jelde gözlenen bantların karşılaştırılması ile proteinin molekül ağırlığı hakkında bir fikir

edinilir.

Bu çalışmada hem native-PAGE, hem de SDS-PAGE teknikleri uygulanmıştır. Gerek

SDS-PAGE, gerekse native-PAGE Laemmli tekniğine göre yapılmıştır.

Bu teknikte kullanılan tamponlar ve hazırlanışları Ek l 'de verilmiştir.

3.4.11.1 Native-PAGE ile enzimin aktivite tayini

3 kısım stok enzim çözeltisi ile 1 kısım native örnek tamponu ependorf tüpünde

karıştırıldı.

Ayırıcı jel % 7,5, yığma jel % 4 konsantrasyonda hazırlandı. Ayırıcı jel, monomer

çözeltisi (akrilamid+bisakrilamid, %30), distile su, ayırıcı jel tamponu (pH 8,6),

amonyum persülfat (APS) ve tetraetilmetilendiamin (TEMED) ilave edilerek

hazırlanmıştır. Bu karışım daha önceden hazırlanan cam plaklar (0,75 mm x 16 cm x 21

46

cm) arasına üstte yaklaşık 4 cm kalacak şekilde dökülerek üzerine doymuş butanol ilave

edilmiş ve polimerizasyon için 30 dk beklenmiştir. Polimerizasyondan sonra monomer

solüsyonu, distile su, yığma jel tamponu (pH 6,8), APS ve TEMED’den oluşan yığma

jel (% 4’lük) ayırıcı jelin üzerine dökülmüştür. Yığma jelin polimerizasyonu

tamamlandığında tarak çıkarılmış ve aparat tanka yerleştirilmiştir. Tank koşturma

tamponu ile doldurulduktan sonra örnekler yüklenmiş ve yığma jel boyunca 42 mA,

(bromofenol boya ayırıcı jele ulaşıncaya kadar) ayırıcı jel boyunca 30 mA’da 4 ºC’de

yapılmıştır.

Koşturma işlemi tamamlandıktan sonra ayırıcı jel kesilmiş ve 0,1 M fosfat tamponunda

(pH 7.0) hazırlanmış olan 30 mM katekol çözeltisinde 100 dk bekletilmiştir. Bekletme

süresi sonunda PPO enziminin aktif bandları görülmüştür. Daha sonra jel, 1 mM

Askorbik asit çözeltisinde 4 dk bekletilmiş ve %30’luk etanolde saklanarak jelin

fotoğrafları çekilmiştir.

3.4.11.2 Native-PAGE ile PPO izozimlerinin belirlenmesi

3 kısım stok enzim çözeltisi ile bir kısım Native örnek tamponu bir ependorf tüpte

karıştırıldı. Ayırıcı ve yığma jeller aktivite tayininde olduğu gibi hazırlanarak jel

oluşturuldu. Örnek jele uygulandı. Elektroforez 4 °C’de, yığma jel boyunca 42 mA

ayırıcı jel boyunca 30 mA’lık sabit akım uygulanarak yapıldı. Jel, elektroforez

tamamlandıktan sonra, izozim bandlarının görülebilmesi için 1 gece boyama

çözeltisinde bekletildi. Ertesi gün boya çıkarıcı çözelti ile boyası çıkarılarak fotoğrafı

çekildi. Jeller % 7’lik asetik asit çözeltisinde saklandı.

3.4.11.3 SDS-PAGE ile enzimin molekül kütlesinin belirlenmesi

Kısmen saflaştırılmış enzim çözeltisinden 3 ml alınarak 10 dakika santrifüjlendi ve

buzun içinde bekletildi. Daha sonra 3 adet ependorf tüpüne koyuldu. Üç kısım stok

enzim çözeltisi ile 1 kısım SDS örnek tamponu karıştırılıp 5 dk kaynatılarak denatüre

47

edildi ve standart proteinlerle (Ek-I) birlikte %10’luk SDS-PAGE ile koşturuldu. Bu

işlemde, bir kuyucuğa 95 μl enzim çözeltisi, diğerine de moleküler kütle belirteçleri

(marker 60 μl) uygulanmıştır.

Ayırıcı jel (% 10’luk), monomer solüsyonu (akrilamid+bisakrilamid), distile su, ayırıcı

jel tamponu (pH 8,6), APS (% 10’luk) ve TEMED ilave edilerek hazırlanmıştır. Bu

karışım daha önceden hazırlanan cam plaklar (0,75 mm x 16 cm x 21 cm) arasına üstte

yaklaşık 4 cm kalacak şekilde dökülüp üzerine doymuş butanol eklenerek

polimerizasyon için yarım saat bırakıldı.

Polimerizasyondan sonra monomer solüsyonu distile su, yığma jel tamponu (pH 6,8),

APS ve TEMED’den oluşan yığma jel (% 4’lük) ayırıcı jelin üzerine dökülmüştür.

Yığma jelin polimerizasyonu tamamlandığında tarak çıkarılmış ve aparat tanka

yerleştirilmiştir. Tank, koşturma tamponu ile doldurulduktan sonra örnekler yüklenmiş

ve yığma jel boyunca 46 mA, ayırıcı jel boyunca 30 mA’da 4 oC’de uygulanarak

elektroforez tamamlanmıştır. Jeldeki örnekler yaklaşık 4-5 saat koşturulmuştur. Daha

sonra jelde koşan standart protein ve izoenzim bandlarının görülebilmesi için jel % 10

metanol + % 7 asetik asitten oluşan fiksasyon çözeltisinde 1 gece bekletilmiştir. 1 gece

sonra jel fiksasyon çözeltisinde alınarak Comassie Blue R250 ile boyama işlemi

yapılmıştır. Bantların gözlenebilmesi için yaklaşık yarım saat beklenmiştir. Daha sonra

boya çıkarıcı çözelti ile boyası çıkarılarak fotoğrafı çekilmiştir.

48

4. BULGULAR VE TARTIŞMA

4.1 Polifenol Oksidaz (PPO) Enziminin İzolasyonu ve Saflaştırılması

PPO enziminin izolasyonu, bölüm 3.2’de anlatıldığı gibi % 0,5 polivinil pirolidon

(PVP) ve 0,05 M askorbik asit içeren 0,2 M fosfat tamponu (pH 7,2) kullanılarak

yapılmıştır. İzolasyon aşamasında kullanılan PVP, İzmir üzümünde bulunan fenolik

maddeleri bağlayarak, PPO enziminin aktivite göstermesini engellemek amacıyla

kullanılmıştır. Çünkü fenolik maddelerin oksidasyonu sonucu oluşan kinonlar, enzimi

inhibe edebilmektedir (Walker 1964). Askorbik asit ise izolasyon sırasında oluşan o-

kinonları indirgeyerek fenolik substratları oluşturur ve kendisi yükseltgenir (Zemel

1989). Katı (NH4)2SO4 ile %80 doygunlukta çöktürülen PPO enzimi daha sonra 4 oC’da

diyalizlenmiş ve 45 mL kısmen saf enzim elde edilmiştir. Diyaliz işlemi sonucunda

molekül ağırlığı 12 000 daltondan küçük moleküller dışarı çıktığından protein

molekülleri ve PPO enzimi diyaliz tüpü içinde bulunmaktadır. PPO enziminin

saflaştırma aşamalarından elde edilen sonuçlar Çizelge 4.1’de görülmektedir.

Çizelge 4.1 PPO enzimin saflaştırma aşamalarından elde edilen sonuçlar

Saflaştırma

Adımları

Hacim

(mL)

Toplam

Aktivite

(IU/mL)

Toplam

Protein

Spesifik

Aktivite(IU/mg

Protein)

Verim Saflaştırma

n-kat

Ham enzim

ekstraktı

255 4187 587 7,13 100 1,0

(NH4)2SO4

çöktürme ve

diyaliz işlemi

45 1917 120,4 15,92 45,8 2,23

Jel Filtrasyon

Kromatografisi

20 880 4,72 186,44 21,0 26,15

49

Çizelge 4.1’de belirli saflaştırma aşamaları sonucu ele edilen hacimler, toplam

aktiviteler, toplam protein, spesifik aktivite, verim ve saflaştırma değerleri verilmiştir.

Çizelge 4.1’den de görüldüğü gibi homojenizasyon sonucu elde edilen ham enzim

miktarı 255 mL, amonyum sülfat ve çöktürme diyaliz sonrası elde edilen enzim miktarı

45 mL, jel filtrasyon kromatografisi sonucu elde edilen enzim miktarı ise 20 mL olarak

bulunmuştur. Ham enzim ekstraktıyla yapılan saflaştırmada 1,0 kat saflaştırma,

amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz işlemleri sonucu 2,23 kat saflaştırma ve jel

filtrasyon kromatografisiyle de 26,15 kat saflaştırma sağlanmıştır.

Şakiroğlu ve arkadaşlarının kuşburnu meyvesinden (Rosa Dumalis Rechst.) polifenol

enzimini saflaştırarak yaptıkları çalışmada, jel filtrasyon kromatografisinin birinci ve

ikinci fraksiyonlarında sırasıyla 1,4 ve 1,3 kat saflaştırma sağlanmıştır (Şakiroğlu 1994).

Ziyan ve Pekyardımcı’nın Ankara armudundan (Pyrus communis) polifenol oksidaz

enzimini saflaştırarak yaptığı çalışmada ise jel filtrasyon kromatografisinin birinci ve

ikinci fraksiyonlarında da sırasıyla 8,6 ve 9,6 kat saflaştırma sağlanmıştır (Ziyan ve

Pekyardımcı, 1998). Bizim çalışmamızda ise jel filtrasyon kromatografisi sonucu elde

edilen enzim çözeltisinin 26,15 kat saflaştırılabileceği gösterilmektedir.

Valero ve arkadaşlarının Airen üzümünden (V. Vinifera cv. Airen) polifenol oksidaz

enzimini saflaştırarak yaptıları çalışmada, ham enzim ekstraktıyla yapılan saflaştırmada

1,0 kat, Triton X-100 ile 48 kat, amonyum sülfat çöktürmesiyle de 30,6 kat saflaştırma

sağlanmıştır (Valero et al. 1988).

Fujita ve Tono’nun patlıcandan (Solanum melongena) polifenol oksidaz enzimini

saflaştırarak yaptıkları çalışmada, amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz işlemleri

sonucu 1,6 kat saflaştırma, DEAE-seluloz çalışmasında 5,5 kat, jel filtrasyon

kromatografisinin birinci ve ikinci fraksiyonlarında ise sırasıyla 43 ve 111,0 kat

saflaştırma sağlanmıştır. Jel filtrasyon kromatografisiyle elde edilen bu saflaştırma

değeri bizim çalışmamızdaki saflaştırma değerinden çok daha yüksektir (Fujita and

Tono 1988).

50

4.1.1 Jel filtrasyon kromotografisi

Bölüm 3.2.3’te anlatıldığı şekilde yapılan jel filtrasyon kromatografisi sonucunda üzüm

PPO enzimi için sadece tek bir fraksiyon elde edilmiştir (Şekil 4.1).

Şekil 4.1 Jel filrasyon kromatografisi sonucu elde edilen fraksiyon

Jel filtrasyon kromatografisi sonucunda birbirine yakın absorbans gösteren tüpler

birleştirilmiş ve protein miktarı Bradford yöntemiyle bulunmuştur (1976). Şakiroğlu et

al. (1996) yaptıkları çalışmada, kuşburnu meyvesinden (Rosa Dumalis Rechst.) PPO

enzimi saflaştırılmasında Sephadex G-100 ile jel filtrasyon kromatografisinde 2

fraksiyon elde edilmiştir.

Fujita and Tono (1988)’nun patlıcandan (Solanum melongena) saflaştırarak elde

ettikleri PPO enzimi üzerinde yaptıkları jel filtrasyon kromatografisinde (Sephadex G-

100) iki fraksiyon elde edilmiştir.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 2 4 6 8 10 12 14

Tüp No

Abs

orba

ns (2

80 n

m)

51

Erat (1997) Doğu Anadolu’da çokça kullanılan Çaşır bitkisinden polifenol oksidaz

enzimini Sephadex G-100 ile saflaştırdıktan sonra jel filtrasyon kromatografisi ve

poliakrilamid jel elektroforez çalışmaları ile enziminin tek izoenzimi olduğunu

göstermiştir.

4.2 Enzim Aktivitesinin Tayini

Kısmen saflaştırılmış enzimin, Bölüm 3.3’te 420 nm’de spektrofotometrik olarak

yapılan aktivite tayini sonucu elde edilen değerlerden bir tanesi örnek olarak verilmiştir

(Şekil 4.2).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

Zaman (sn)

Abs

orba

ns (4

20 n

m)

Şekil 4.2 PPO enziminin aktivite tayin grafiği

Şekil 4.2 incelendiğinde 2 dakikaya kadar enzim aktivitesinin orantılı olarak arttığı daha

sonra aktivitenin sabit bir değer aldığı görülmektedir.

52

4.3 PPO Enziminin Karakterizasyonu

4.3.1 Substrat spesifikliği

Bölüm 3.4.1’de anlatıldığı şekilde, PPO enziminin o-difenolik ve monofenolik yapıdaki

substratları ile aktivitesindeki değişim incelenmiştir. Sonuçlar Çizelge 4.2’de

gösterilmiştir.

Çizelge 4.2 PPO enziminin substrat spesifikliği

Çizelge 4.2’den de görüldüğü gibi İzmir üzümünden elde edilen PPO enziminin en iyi

aktivite gösterdiği substrat katekol’dür. Daha sonra substratları bağıl aktivite

değerlerine göre sıralayacak olursak sırasıyla; 4-metil katekol, kafeik asit, D-tirozin,

pirogallol ve son olarak da p-krezol gelmektedir.

Bu sonuçlara göre, çalışmamızda kullandığımız İzmir üzümden izole edilen PPO

enziminin o-dihidroksifenollerle ise daha fazla aktivite gösterdiği, monohidroksi ve

trihidroksi fenollere aktivitesinin hemen hemen hiç olmadığı gözlenmiştir.

Substrat Konsantrasyon(M) Konfigürasyon Bağıl Aktivite

Katekol 0,01 Orto-dihidroksi 100

4-Metil katekol 0,01 Orto-dihidroksi 82,4

Kafeik asit 0,005 Orto-dihidroksi 18,4

Pirogallol 0,01 Trihidroksi 0,8

Gallik asit 0,005 Trihidroksi 0,72

D-tirozin 0,002 Monohidroksi 1,08

p-krezol 0,002 Monohidroksi 0,32

53

Kimberly et al. (1981) Ravat 51 ve Niagara üzümünlerinden PPO enzimini karakterize

ederek o-difenollere karşı yüksek aktivite gösterdiklerini belirlemişlerdir. Barlett

armudunda da PPO enziminin o-difenollere karşı aktivitesinin yüksek olduğu

bildirilmiştir (Tate et al. 1964).

Oktay et al. (1995), Amasya elmasından elde ettikleri PPO enziminin en yüksek

aktiviteyi katekol substratı ile gösterdiği, daha sonra 4-metil katekol, pirogallol ve L-

dopa substratlarının geldiğini belirlemişlerdir.

Şifalı bitkilerden Allium sp.’den izole edilen PPO enziminin aktivitesi çeşitli

substratlarla incelenmiş ve enzimin en fazla katekol substratına karşı aktivite gösterdiği

bulunmuştur (Arslan 1997).

4.3.2 Optimum substrat konsantrasyonu

Bölüm 3.4.2’de anlatıldığı gibi PPO enziminin en yüksek aktivite gösterdiği substrat

olan katekolün 6 farklı konsantrasyondaki çözeltileri kullanılarak en yüksek aktivitenin

gözlendiği konsantrasyon belirlenmiştir. Sonuçlar Çizelge 4.3’te yer almaktadır.

Çizelge 4.3 Üzüm PPO enzimi için optimum katekol substratı konsantrasyonu

Katekol Konsantrasyonu (mM) Bağıl Aktivite

0,01 82,6

0,02 100

0,03 95,7

0,04 78,3

0,05 69,6

0,06 87

54

Çizelgede 4.3’den görüldüğü gibi en büyük aktivite artışı 0,02 M katekol çözeltisi ile

olmuştur. Bu nedenle diğer çalışmalarda kullanılan katekol 0,02 M olarak

hazırlanmıştır.

4.3.3 pH etkisi

Bölüm 3.4.3’te anlatıldığı gibi katekol, 4-metil katekol, kafeik asit, pirogalol, D-Tirozin,

p-krezol, gallik asit olmak üzere 7 adet substrat kullanılarak PPO enziminin optimum

pH belirlenmiştir.

Elde edilen değerler Çizelge 4.4’de ve Şekil 4.3-4.9’da verilmiştir. Bu elde edilen

verilerden katekol, 4-metil katekol, piragallol, D-tirozin substratlarının optimum pH

değerleri 7,0-7,4 arasında bulunmuştur. Gallik asit ve p-krezolün optimum pH değerleri

de sırasıyla 6,7 ve 6,4 olarak bulunmuştur. Kafeik asidin optimum pH’sı ise 5,7’ dir.

Çizelge 4.4 İzmir üzümünden elde edilen PPO enziminin farklı substratlara karşı optimum pH değerleri

Substrat Substrat

konsantrasyonu (M)

Optimum pH

Katekol 0,02 7,2

4-Metil katekol 0,01 7,0

Kafeik asit 0,01 5,7

Pirogallol 0,1 7,2

Gallik asit 0,1 6,7

D-tirozin 0,02 7,4

p-krezol 0,02 6,4

55

0

20

40

60

80

100

120

4 5 6 7 8 9 10pH

Bağıl

Akt

ivite

Şekil 4.3 Katekol substratı üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine pH’ın etkisi

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

2 4 6 8 10

pH

Bağıl

Akt

ivite

Şekil 4.4 4-metil katekol substratı ile üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine pH’ın etkisi

56

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH

Bağıl

Akt

ivite

Şekil 4.5 Kafeik asit substratı ile üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine pH’ın etkisi

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH

Bağıl

Akt

ivite

Şekil 4.6 Pirogallol substratı ile üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine pH’ın etkisi

57

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH

Bağıl

Akt

ivite

Şekil 4.7 D-tirozin substratı ile üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine pH’ın etkisi

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10

pH

Bağıl

Akt

ivite

Şekil 4.8 p-Krezol substratı ile üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine pH’ın etkisi

58

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH

Bağıl

Akt

ivite

Şekil 4.9 Gallik asit substratı ile üzüm PPO enziminin aktivitesi üzerine pH’ın etkisi

Park et al. (1980) yaptıkları çalışmada mangodan elde edilen PPO enziminin pH’sının

5,6-6,0 değerleri arasında olduğu belirtilmiştir.

Kimberly and Lee (1981)’nin Ravat 51 ve Niagara üzümünden saflaştırdıkları PPO

enzimi üzerinde yaptıkları çalışmalarda her iki üzüm türünün de maksimum aktivite

gösterdiği pH’ının 5,5 olduğu bildirilmiştir.

d’Anjou armudu (Halim and Montgomery 1978), kayısı ve kuru erik (Josly and Ponting

1951), Clingstone şeftalisi (Wong et al. 1971), erik (Sıddıq et al.1992), Concord üzümü

(Cash et al. 1976) gibi meyvelerde bulunan PPO enziminin optimum pH’ının nötral

veya veya buna yakın pH’lar olduğu belirtilmiştir.

Şakiroğlu et al. (1996) tarafından yapılan çalışmalarda, enzimin optimum pH’sı katekol

substratı ile 8,5, L-Dopa ile 8,0 olarak bulunmuştur.

59

4.3.4 Sıcaklığın etkisi

Bölüm 3.4.4’de anlatıldığı şekilde, katekol substratı (20 mM) kullanılarak enzim

aktivitesi 9 farklı sıcaklıkta (10-75 oC) belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar sıcaklığa

karşı bağıl aktivite cinsinden grafiğe alınmış ve optimum sıcaklık bulunmuştur (Şekil

4.10). Şekilden de görüldüğü gibi optimum sıcaklık değeri 25 ºC olarak belirlenmiştir.

Şekil 4.10 Üzümdeki PPO enzimi üzerine sıcaklığın etkisi

Şekil 4.10 incelendiğinde üzümden elde edilen PPO enzimin 10 oC, 20 oC, 25 oC 30 oC,

40 oC’ye kadar aktivitesinin çok azalmadığı 40 oC’den sonra yavaş yavaş azaldığı, 65oC’den sonra ise çok hızlı azaldığı görülmektedir. Enziminin 25 ºC’de maksimum

aktivite gösterdiği Şekil 4.10’da görülmektedir.

Kimberly and Lee (1981)’nin Ravat 51 ve Niagara üzümünlerinden saflaştırdıkları PPO

enzimleri üzerinde yaptıkları sıcaklık çalışmalarında da optimum sıcaklık değeri her iki

tür için 25 ºC olarak bulunmuştur.

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Sıcaklık (oC)

Bağ

ıl A

ktiv

ite

60

4.3.5 Enzimin termal kararlılığı

Bölüm 3.4.5’de anlatıldığı gibi yapılan termal kararlılık deneylerinde elde edilen

sonuçlar zamana karşı bağıl aktivite cinsinden grafiğe alınmıştır (Şekil 4.11).

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50

Zaman (Dakika)

Bağıl

Akt

ivite

20 30 40 45 55 65 75

Şekil 4.11 PPO enziminin termal kararlılığı

Şekil 4.11’de görüldüğü gibi üzümdeki PPO enziminin 20 oC ve 30 oC’de aktivitesinin

zamanla değişmediği, 40 oC ve 45 oC’de 30 dakikadan itibaren enzim aktivitesinin çok

az değiştiği, 55 oC, 65 oC, 75 oC’de 45. dakikadan itibaren enzim aktivitesinin tamamen

bittiği görülmektedir.

Kimberly and Lee (1981)’nin Ravat 51 ve Niagara üzümünlerinden saflaştırdıkları PPO

enzimleri üzerinde yaptıkları termal kararlılık çalışmalarında aktivitenin Ravat üzümü

için 68,1 oC’de 15 dak.’da, Niagara üzümü için ise yine 15 dakikada 76,1 oC’de %50

azaldığı belirtilmiştir.

61

Şakiroğlu et al. (1996) yaptıkları termal kararlılık çalışmalarında PPO enziminin

80oC’de 1 saatlik inkübasyon sonunda % 100 inaktive olduğu bulunmuştur.

Fujita and Tono (1988) patlıcandan (Solanum melongena) saflaştırdıkları PPO enzimi

ile yaptıkları çalışmada, 75 oC’de 30 dakika ve 80 oC’de 5 dakikalık inkübasyon sonucu

enzimin tamamen inaktive olduğunu belirtmiştir.

Oktay et al. (1998) Malatya kayısısından saflaştırdıkları enzimle yaptıkları çalışmalarda

enziminin 60 oC’de 47. dakikada, 80 oC ise 17. dakikada enzim aktifliğinin %50

azaldığını belirtmişlerdir.

4.3.6 Protein tayini

Bölüm 3.4.6’da anlatıldığı gibi ekstraksiyon ve saflaştırma işlemlerinin her

basamağında Bradford yöntemiyle protein tayinleri yapılmıştır. Aşağıdaki Şekil 4.12’de

görüldüğü gibi BSA (bovine serum albumin) kullanılarak standart grafikler

hazırlanmıştır.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

Konsantrasyon (mg/ml)

Abs

orba

ns (5

95nm

)

Şekil 4.12 Bradford yöntemiyle protein tayin grafiği

62

4.3.7 Enzim kinetiği

Bölüm 3.4.7’de de anlatıldığı gibi enzim kinetiği paramatreleri olan Vmax ve Km değeri

Lineweaver–Burk grafiğinden belirlenmiştir (Şekil 4.13). Bu deneylerde substrat olarak

katekolün farklı konsantrasyonları kullanılmıştır. Enzimin maksimum hızı (Vmax) ve

Michaelis- Menten sabiti (Km) bulunması için kinetik çalışmalar 1.00, 1.25, 2.50, 4.00,

7.50, 10.00 mM’lık katekol çözeltisi (pH 7,2) kullanılarak yapılmıştır. Lineweaver-

Burk grafiğinde 1/V’ye karşı 1/[S] değerleri yerine konularak buradan Km 3,65 mM ve

Vmax 507,2 ∆A dak-1 olarak bulunmuştur.

00,5

11,5

22,5

33,5

4

-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0 0,3 0,6 0,9 1,2

1/[S] (mM-1)

1/V

x10

-3

Şekil 4.13 Katekol substratı kullanılarak elde edilen Lineweaver- Burk grafiği

Satjawatcharaphong et al. (1983) kırmızı elmadan (Malus domestica) saflaştırdıkları

PPO enziminin Km ve Vmax değerlerini sırasıyla; 2.2x10-1 ve 4.8x10-1 ∆A dak-1 olarak

bulmuşlardır.

63

4.3.8 Aktivasyon enerjisinin tayini

lnk-1/T grafiğinden aktivasyon enerjisi 12,4 kcal/mol olarak bulunmuştur (Şekil 4.14).

(Eğim: -Ea/R.T)

y = -6,2738x + 15,976

-6,00

-5,00

-4,00

-3,00

-2,00

-1,00

0,00

2,80 3,00 3,20 3,40 3,60

1/Tx10-3

lnk

Şekil 4.14 Aktivasyon enerjisinin tayini

Simpson ve arkadaşları beyaz ve pembe karidesten saflaştırdıkları PPO enzimi üzerine

yaptıkları aktivasyon enerjisi çalışmasında, 20-35 oC aralığında 5 oC’lik sıcaklık

artışlarıyla yapılan termal kararlılık çalışmalarından elde edilen verilerle beyaz ve

pembe karidesteki PPO enzimlerinin aktivasyon enerjilerini (Ea) sırasıyla; 13,9

kkal/mol, 11,5 kkal/mol olarak bulmuşlardır (Simpson et al.1988).

4.3.9 İnhibitörlerin etkisi

Bölüm 3.4.8’de de anlatıldığı gibi PPO enzim aktivitesi üzerine inhibitörlerin etkisini

incelemek için 6 adet inhibitör (L-sistein, L-askorbik asit, sodyum azid, sodyum dietil

ditiyo karbamat, merkapto etanol, tiyoüre) kullanılmıştır. Bu deneylerde 5 farklı katekol

konsantrasyonu (1.00, 1.25, 2.50, 4.00, 7.50, 10.00 mM ) ve her inhibitör için 2 farklı

64

inhibitör konsantrasyonları hazırlanmış ve PPO enzim aktiviteleri belirlenerek

inhibisyon sabitleri (Ki) ve inhibisyon türleri bulunmuştur.

Çizelge 4.5 PPO enziminin inhibisyon türleri ve Ki sabitleri

İnhibitör Konsantrasyon

(M)

İnhibisyon Türü Ortalama Ki

L-Askorbik asit 2,0.10-4

2,5.10-4

Yarışmasız 4,34.10-9

L-Sistein 6,5.10-5

2,0.10-4

Yarışmalı 3,3.10-16

β-

Merkaptoetanol

2,0.10-4

6,5.10-4

Yarışmalı 3,04.10-16

Tiyoüre 1,5.10-1

6,0.10-2

%100 inhibe ---

Sodyum dietil

ditiyo karbamat

2,5.10-5

3,5.10-5

%100 inhibe ---

Sodyum azid 5,0.10-2

1,5.10-1

%100 inhibe ---

En etkili inhibitörler; sodyum azid, sodyum dietilditiyokarbamat ve tiyoüre olarak

bulunmuştur. L-Askorbik asit’in yarışmasız (non-kompetitif) inhibisyona, L-Sistein ve

β-Merkaptoetanolün ise yarışmalı (kompetitif) inhibisyona neden oldukları

belirlenmiştir.

Kimberly and Lee (1981)’nin Ravat 51 ve Niagara üzümünlerinden saflaştırdıkları PPO

enzimi üzerinde yaptıkları inhibisyon çalışmalarında 9 tane inhibitör kullanılmıştır.

Niagara ve Ravattaki PPO enzimlerinin en güçlü inhibitörlerinin sistein ve sodyum

dietilditiyokarbamat olduğu bulunmuştur. Bizim çalışmamızda da sodyum

dietilditiyokarbamat en kuvvetli inhibitör olarak bulunmuştur.

65

Şakiroğlu et al. (1996), kuşburnu meyvesinden saflaştırdıkları PPO enzimi üzerinde

yaptıkları inhibisyon çalışmalarında L-sistein, askorbik asit, sodyum azid’in yarışmalı,

sodyum dietil ditiyo karbamatın yarışmasız inhibisyon gösterdiğini belirtmişdir.

Sıddıq et al. (1992) Stanley eriğinden PPO enzimini saflaştırmışlar ve yaptıkları

çalışmalarda, sodyum metabisülfit (Na2S2O5), L-sistein ve askorbik asitin enzimin

neredeyse tamamını inhibe ettiğini gözlemlemişlerdir. Ayrıca enziminin tiyoüre

inhibitörüne karşı da %81 hassas olduğu bulunmuştur.

L-sistein ve L-askorbik asit doğal olarak bulunan maddeler olduklarından meyve ve

sebzelerdeki enzimatik kararmanın önlenmesi amacı ile kullanılabileceği bildirilmiştir

(Oktay et al. 1995).

Şekil 4.15 L-Sistein kullanılarak elde edilen Lineweaver- Burk grafiği

66

Şekil 4.16 L-askorbik asit kullanılarak elde edilen Lineweaver- Burk grafiği

Şekil 4.17 β-Merkaptoetanol kullanılarak elde edilen Lineweaver-Burk grafiği

67

4.3.10 Enzimin depolanma süresince kararlılığı

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

1 4 7 10 13 16 19 22 25 29 32 35

Günler

Akt

ivite

4 oC20 oC

Şekil 4.18 4 oC ve 20 oC’de depolama şartlarında enzim aktivitesinin zamanla değişimi

Bölüm 3.4.9’da da anlatıldığı gibi enzimin 4 ºC ve 20 ºC’da depolama süresince

kararlılığını incelemek amacı ile katekol (pH 7,2) substratı kullanılmış; 4 ºC ve 20 ºC’da

3 günde bir olmak üzere 1 ay boyunca ölçüm alınarak elde edilen aktivite değerleri

kaydedilmiştir.

4 oC’de yapılan depolama kararlılığı çalışması sonucunda , PPO enziminin aktivitesi ilk

üç günde % 4, yedinci günde % 4, onuncu günde % 8, onüçüncü günde % 12, onaltıncı

günde % 16 azalarak bir ay sonunda PPO enzimi aktivitesinin % 60’ını kaybetmiştir.

20 oC’de ise PPO enziminin aktivitesi ilk üç günde % 0, yedinci günde % 5, onuncu

günde % 10, onüçüncü günde % 15, onaltıncı günde % 20 azalarak bir ay sonunda PPO

enzimi aktivitesinin % 90’ını kaybetmiştir.

68

Ziyan (1998) Ankara armudundan saflaştırdığı PPO enzimi üzerinde yaptığı depolama

kararlılığı çalışmasında, PPO enziminin 4 oC’de 25 gün, 20 oC’de ise 1 hafta

depolanması sonucunda aktivitedeki azalma incelenmiştir. 4 oC’de depolanan enzimin

ilk 4 günde aktifliğini %10 kaybettiği halde 20 oC’de depolanan enzim %20 kaybettiği

bulunmuştur. 7 günün sonunda 20 oC’de bekletilen enzimin aktivitesindeki kayıp %30

olarak belirlenmiştir. Aynı sürede 4 oC’de bulunan enzimin kaybı ise %20 olarak

hesaplanmıştır.

4.3.11 Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)

4.3.11.1 Native-PAGE ile enzimin aktivite tayini

Bölüm 3.4.11.1. ve 3.4.11.2’de anlatıldığı şekilde yapılan çalışmalar sonucunda katekol

substratı ve Comassie Brillant R-250 kullanılarak, PPO enziminin aktif bandları şekil

4.19’da (A ve B şeklinde) gösterilmiştir. .

(A) (B)

Şekil 4.19 Ham enzim ekstraktının Native-PAGE ile elde edilen band profili (A:Katekol substratı ile elde edilen band profili; B: Coomassie Brillant R-250boyası ile elde edilen band profili)

(1)

(2)

(1)(2)(3)(4)

69

Şekil 4.19 (A) incelendiğinde katekol substratı kullanılarak yapılan elektroforez işlemi

sonucu iki tane PPO aktif bandı elde edildiği görülmektedir

Şekil 4.19 (B)’de görüldüğü gibi Coomassie Brillant R-250 boyası kullanılarak 4 tane

PPO aktif bandı elde edilmiştir. PPO enzimi en fazla aktiviteyi 1 ve 2 numaralı bandda

göstermiştir. PPO enziminin 3 numaralı banddaki aktivitesinin daha az olduğu ve 4.

bandda ise aktivitenin çok daha az olduğu görülmektedir.

Constantinides ve Bedford substrat olarak L-dopa kullanarak Golden türü elmalarda üç

aktif bant bulmuşlardır (Constantinides and Bedford 1967).

Satjawatcharaphong ve arkadaşları kırmızı elmadan aseton tozuyla PPO enzimini

ekstrakte etmişler ve yaptıkları poliakrilamid jel elektroforezi sonucunda Coomassie

Blue boyasıyla yapılan çalışmada altı değişik bant elde etmişlerdir. Fakat bu bantların

sadece iki tanesi katekol substratı ile boyanmıştır. Buda altı değişik elektroforetik

harekete sahip proteinden yalnızca ikisinin PPO enzim aktivitesine sahip olduğunu ve

değişik elmalardaki esmerleşme reaksiyonlarına katılabileceklerini gösterir. İlginç olan

şudur ki bu iki izoenzim elektroforetik özellikler bakımından farklı olmalarına rağmen

pH ve sıcaklık ihtiyaçları bakımından fark göstermemeleridir (Satjawatcharaphong et al.

1983).

70

4.3.11.2 SDS-PAGE ile enzimin molekül ağırlığının belirlenmesi

Bölüm 3.4.11.3.’de anlatıldığı şekilde yapılan çalışma sonucunda elde edilen band

paterni Şekil 4.20’de görülmektedir.

Şekil 4.20 SDS-PAGE ile PPO enziminin molekül ağırlığının belirlenmesi

Şekil 4.20 incelendiğinde PPO enziminin; 34, 30, 22, 18, 16, ve 13 kD molekül ağırlıklı

6 tane alt birimi olduğu görülmektedir.

Simpson ve arkadaşları beyaz ve pembe karidesten saflaştırarak elde ettikleri PPO

enzimi üzerinde uyguladıkları PAGE yönteminde (pH 8,8 ve %7,5 akrilamid), pembe

ve beyaz karidesdeki PPO enzimlerinin tek bir band olarak göç ettikleri gözlenmiştir.

Bununla birlikte pembe karidesdeki PPO enziminin molekül ağırlığı 40 kDa, beyaz

71

kardidesdeki PPO enziminin molekül ağırlığı ise 30 kDa olarak bulunmuştur. Boyuttaki

bu farklılık iki protein molekülü arasındaki olası farklılıklardan kaynaklanır. Bunlar;

proteinlerin amino asit kompozisyonu, polipeptid zincirlerinde ikincil ve üçüncül

yapılarındaki; hidrojen bağı, iyonik bağ ve/veya disülfit bağları arasındaki molekül içi

bağlanmalardır (Sımpson et al. 1988).

72

5. SONUÇLAR

PPO enzimi, İzmir üzümünden % 0,5 polivinil pirolidon ve 0,05 M askorbik asit

kullanılarak izole edilip (NH4)2SO4 ile çöktürülmüş ve diyalizlenmiştir. Diyaliz

işleminden sonra elde edilen çözelti kısmen saf enzim çözeltisi olarak adlandırılmıştır.

Enzim, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılmış ve sonuçta 1 tane fraksiyon elde

edilmiştir. Ayrıca elektroforez ile aktivite çalışmaları yapılmıştır. Doğal poliakrilamid

jel elektroforez ile katekol substratı kullanılarak 1 tane aktif PPO bandı elde edilmiştir.

SDS-PAGE uygulanarak 6 izozim bandı elde edilmiştir.

PPO enziminin optimum substratlarının belirlenmesi amacı ile çeşitli difenolik ve

monofenolik substratlar kullanılmış ve enzimin aktifliğinin difenolik substratlarla daha

fazla olduğu görülmüştür. PPO enziminin optimum substratı katekoldür.

PPO enziminin katekol substratı ile en yüksek aktivite gösterdiği konsantrasyon 20 mM

olarak belirlenmiştir.

Katekol, 4-metil katekol, pirogalol, D-tirozin, kafeik asit, p-krezol, gallik asit

substratları kullanılarak PPO enziminin elde edilen optimum pH değerleri sırasıyla; 7,2,

7,0, 7,2, 7,4, 5,7, 6,4, 6,7 dir.

Enzim aktivitesine sıcaklığın etkisi katekol substratı kullanılarak incelenmiş ve

optimum sıcaklığın 25 ºC olduğu belirlenmiştir.

Termal kararlılık çalışmasında, PPO enziminin 20 oC ve 30 oC da aktivitesinin zamanla

değişmediği, 40 oC ve 45 oC de 30 dakikadan itibaren enzim aktivitesinin çok az

değiştiği, 55 oC, 65 oC, 75 oC de 45. dakikadan itibaren enzim aktivitesinin kalmadığı

bulunmuştur.

Enzimin Vmax ve Km değerleri Lineweaver-Burk grafiğinden 507,2 ∆A dak-1 ve 3,65

mM olarak bulunmuştur.

73

İnhibitör çalışmasında 6 adet inhibitör kullanılmıştır. Her bir inhibitör için Ki değerleri

Lineaweaer-Burk grafiğinden hesaplanmıştır. Ki değerleri L-Askorbik asit, L-Sistein ve

β-Merkaptoetanol için sırasıyla; 4,34.10-9, 3,3.10-16, 3,04.10-16 olarak bulunmuştur.

L-Askorbik asitin non-kompetitif inhibisyon, L-Sistein ve β-Merkaptoetanolün

kompetitif inhibisyon yaptığı bulunmuştur. Tiyoüre, Sodyum dietil ditiyo karbamat, ve

Sodyum azid kullanıldığında ise PPO enziminin %100 inhibe olduğu belirlenmiştir.

4 oC’de yapılan depolama kararlılığı çalışması sonucunda , PPO enziminin aktivitesi ilk

üç günde % 4, yedinci günde % 4, onuncu günde % 8, onüçüncü günde % 12, onaltıncı

günde % 16 azalarak bir ay sonunda PPO enzimi aktivitesinin % 60’ını kaybetmiştir. 20oC’de ise PPO enziminin aktivitesi ilk üç günde % 0, yedinci günde % 5, onuncu günde

% 10, onüçüncü günde % 15, onaltıncı günde % 20 azalarak bir ay sonunda PPO enzimi

aktivitesinin % 90’ını kaybetmiştir.

lnk-1/T grafiğinden PPO enziminin aktivasyon enerjisi 12,4 kcal/mol olarak

bulunmuştur

Native-PAGE ile enzimin aktivite tayininde katekol substratı kullanılarak yapılan

elektroforez işlemi sonucu iki tane PPO aktif bandı elde edildiği görülmektedir.

Coomassie Brillant R-250 boyası kullanılarak ise 4 tane PPO aktif bandı elde edilmiştir.

SDS-PAGE ile yapılan enzimin molekül ağırlığının belirlenmesi çalışmasında PPO

enziminin; 34, 30, 22, 18, 16, ve 13 kD molekül ağırlıklı 6 tane alt birimi olduğu

görülmüştür.

74

KAYNAKÇA

Acar, J. 1998. Fenolik Bileşikler ve Doğal Renk Maddeleri. Gıda Kimyası I. Şaldamlı,Hacettepe Üniversitesi Yayını, 435-452, 550s, Ankara.

Arslan, O., Temur, A. and Tozlu, İ. 1997. Polyphenol oxidase from allium sp. J. Agric.Food Chem., 45; 2681-2683.

Arslan, O., Temur, A. and Tozlu, İ. 1998. Polyphenol oxidase from Malatya apricot(Prunus armeniaca L.)., J. Agric. Food Chem., 1239-1241.

Austin, C. 1968. The Science of Wine. University of London Press Ltd.1-41, 205-214.

Benjamin, N. D. and Montgometry, M. W. 1973. Polyphenol Oxidaze of Royal AnnCherries: Purification and Characterization. J. Food Sci, 38, 799.

Bleslermann, W. 1956. Oxydation in obst. and obstsuffen. Mit Geb. LebensmitChmters., Hyg, 47-86.

Bolin, H.R. and Steele, R. J. 1987. Nonenzymatic Browning in Dried Apples DuringStorage. Journal of Food Science, 52(69); 1654-1657.

Bradford, M. 1976. Arapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.,72, 248.

Constantinides, S.M. and Bedford, C.L. 1967.Multiplle forms of phenoloxidase. J.FoodSci. 32: 446.

Campbell, M.K. 1991. Biochemistry. Saunders College Publishing. Chicago.

Canbaş, A. 1985. Şaraplarda fenol bileşikleri ve bunların analiz yöntemleri. C.Ü. ZiraatFak., 15s, Adana.

Cano, M. P., Ancos, B. and Lobo, G. 1995. Peroxidase and polyphenol oxidaseactivities from Spanish Hermaphrodite and female papaya fruits. J. Agric FoodChem., 44, 3057-3079.

Cano, M.P., Lobo, M.G., Ancos, B., Galeazzi, M.A.M., 1996. Polyphenol oxidase fromSpanish Hermaphrodite and female papaya fruits. J. Agric Food Chem., 44, 3075-3079.

Cash, J. N., Sistrunk, W. A. and Stutte, C.A. 1976. Characteristics of Concord GrapePolyphenol Oxidase Involved in Juice Color Loss. J. Food Sci., 41, 1398.

75

Cemeroğlu, B. 1982. Meyve suyu üretim tenolojisi. Ankara Teknik Basım SanayiiMatbaası.

Cemeroğlu, B. and Acar, J. 1986. Meyve ve Sebze İşleme Teknolojisi. Gıda TeknolojisiDerneği, Yayın No: 6, 512s., Ankara.

Çiçek, H. 2000. Beyaz-çürükçül fungus kültürlerinde tirosinaz enziminin sentezinintaranması ve optimizasyonu.(Bilim Uzmanlık Tezi) , Hacettepe Üniversitesi.

Corsini, D. L., Pavek, J. J. and Deab, B. 1992. Difference in free and protein-boundtyrosine among potate genotypes and their relationship to internal balackspotresistance, Am. Pot. J. 69, 423-434.

Coseteng, M.Y., Lee, C.Y. 1987. Changes in Apple Polyphenoloxidase and PolyphenolConcentrations in Relayion to Degree of Browning. Journal of Food Science, 52 (4);985-989.

Dewey, D. L., Butcher, F. W. and Galpine, A. R. 1977. Hydroxyanisole-inducedregression of the Harding-Passey melanoma in mice. J. Pathol., 122, 117-128.

Erat, M. 1997. Çaşır bitkisinden izole edilen polifenol oksidaz enziminin kinetik ve bazıbiyokimyasal özelliklerinin incelenmesi. (Yüksek Lisans Tezi), AtatürkÜniversitesi.

Erzengin, M. 2002. Farklı kaynaklardan afinite kromotografisi ile polifenol oksidazenziminin saflaştırılması, kinetik ve elektroforetik özelliklerininincelenmesi.(Doktora Tezi), Balıkesir Üniversitesi.

Eskin, N. A. M. 1990. Bichemistry of foods. Academic Press, New York.

Euclides, J. L., Souza, L. J. and Valdir, A. N. 1990. Heat Inactivation and Kinetics ofPolyphenol Oxidase from Plmito. J. Sci. Food Agric., 52, 249.

Flurkey, W. H. and Jen, J. J. 1978. Peroxidase and Polyphenol Oxidase Activities indeveloping Peaches. J. Food Sci., 43, 1826.

Friedman, M. 1996. Food Browning and Its Preventing. J. Agric. Food Chem., 44; 631-653.

Friedman, M. 1997. Chemistry, Biochemistry, and dietary role of potato polyphenols. J.Agric. Food Chem., 45; 1523-1540.

Frudenberg, K. and Weinges, K. 1962. Catechins and flavonoid compounds in: Thechemistry of flavonoid compounds. Pergamon press, 197.

Fujita, S. and Tono, T. 1988. Purification and some properties of polyphenoloxidase inEggplant (Solanum melongena). J. Sci. Food Agric., 115-123.

76

Ganguly, K. and Seshado T. R. 1958. Isolation of the more commanly occurringleucoanthocyanidins of plants. J. Sci. Ind. Res. Sect. B., 17,168.

Golan-Goldhirsh, A. and Whitaker, J. R. 1984. Effect of Ascorbic Acid, SodiumBisulfite, and Thiol Compounds on Mushroom Polyphenol Oxidase. J. Agric. FoodChem., 32, 1003.

Gregory, R. P. F. and Beendall, D. S. 1966. The purification and some properties of thepolyphenol oxidase from tea (Camellia sihensis, L.). Biochem. J., 101, 569.

Halim, D. H. and Montgomery, M. W. 1978. Polyphenol oxidase of d’Anjou pears(Pyruse communis, L.). J.Food Sci., 43, 603-606.

Hermann, K. 1974. Uber die Phenolischen Inhaltsstoffe des Obstes. Erwerbsastbau, 16,1.

Hsu, A. F., Thomas, C. E. and Brauer, D. 1988. Evaluation of Several Methods forEstimation of the Total Activity of Potato Polyphnol Oxidase. 53, 1743.

Isbiguro, R. S. R. and Anyama, Y. 1970. Studies on the relationship between L-ascorbicacid and o-diphenol oxidase activity in radish. Etyo To Shukoryo, 23, 13.

Jen, J. J. and Kahler, K. R. 1974. Characterization of polyphenol oxidase in peachesgrown in the Soytheast. HortScience, 9; 590.

Jones, J. D., Halme, A. C. and Waoltorton, L.S.C. 1965. Use of polyvinyl pyrrolidinonein the isolaton of enzymes from chloplast. Phytochemistry, 4, 659. bitör ofphenolase. Phytochemistry, 3,447.

Josly, M. A. and Ponting, J. D. 1951. Enzymecatalyzed Oxidative Browning of FruitProducts. Adv. Food Res., 3,1.

Keleş, F. 1986. Amasya ve golden elmalarının polifenol oksidazları üzerine araştırmalarI. Genel Özellikler. Doğa, D2, 10(2); 224-234.

Khuruskeheva, E. P. and Krehin, N. Y. 1965. Certain, physiological-biologicalindicators in the leaves of various frost resistant varieties of plums. Agro Biologya,6, 921.

Kimberly, W., Wissemann, C. and Lee, Y. 1981. Characterization of polyphenoloxidasefrom Ravat 51 and Niagara grapes. J. Sci. Food. Agric., 506.

Knapp, F. W. 1965. Some Characteristics of Eggplant and Avocado Polyphenoloxidase.J.Food Sci., 30, 930.

Kohn, V. 1977. Latency properties polyhenol oxidase in two avocado cultivars differingin their rate of browning. J. Sci.Food Agr., 28, 233.

77

Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Headof Bacteriophage T4, Nature, 227, 680.

Lineweaver, H. and Burk, D. 1934. The Determination of Enzyme DissociationConstant. J. Am. Chem. Soc., 56, 658.

Luh, B.S. and Phithakpol, B. 1972. Characteristics of Polyphenoloxidase Related toBrowning in Cling Peaches. J. Food Sci., 37, 264.

Markakis, P. and Embs, R. J. 1966. Effect of sulfite and ascorbic acid on mushroomphenol oxidase. J.Food Sci., 31, 807.

Mathen, A. G. and Parpia, H. A. B. 1971. Food browning as a polyphenol reaction.Adv. Food Res., 19, 75.

Mayer, A. M., Harel, E. and Shain, Y. 1962. 2,3-Naphthalenediol a specific competitiveinhbitör of phenolase. Phytochemistry, 3, 447.

Mayer, A.M. 1987. Polyphenol oxidase in plants recent progress. Phytochemistyr,26(1); 11-20.

Mayer, A. M. and Harel, E. 1991. Phenoloxidases and their significance in fruit andvegetables. In Food Enzymology (Vol 1) ed. Fox PF, Elsevier Science PublishersLtd, pp 373-398, London, UK.

Mihalyi, K. and Vamos-Vigyazo, L. 1976.Amethod for determining polyphenol oxidaseactivitiy in fruits and vegetables applying a natural substrate. Acta Aliment. Acad.Sci. Hung., 5, 69.

Molchanova, Z. Y. 1966. The role of oxidase in the resistance of grapevines tounfavorable conditions of wintering.Vinodel. Vinograd, SSSR, 26(1); 21.

Nagai, T. and Suzuki, N. 2001. Partial purification of polyphenol oxidase from ChineseCabbage. J.Agric. Food Chem., 49, 3922.

Nicolas, J. J., Richard-Forget, F. C., Goupy, P. M., Amilot, M. J. and Aubert, S.Y.1994. Enzymatic Browning Reaction in Apple and Apple Products. CriticaalReviews in Food Science and Nutrion, 34(2); 109-157.

Oktay, M. 1992. Amasya elmasından izole edilen polifenol oksidaz enziminin kinetikve elektroforetik özelliklerinin araştırılması.(Doktora Tezi), Atatürk Üniversitesi.

Oktay, M., Küfrevioğlu, I., Kocaçalışkan, I. and Şakiroğlu, H. 1995. Polyphenoloxidasefrom Amasya apple. J. Food Sci., 60, 494-496.

Oktay, M., Temur, A. and Tozlu, İ. 1998. Polyphenol oxidase from Malatya apricot(Prunus armeniaca L.). J.Agric. Food Chem., 46, 1239-1241.

78

Parish, W. 1972. The intracellular location of phenol oxidases and peroxidase in stemsof spinach beet (Beta vulgaris L.). Z, Pflanzenphysiol, 66,176.

Park, Y. Sato, H. H., Almeida, D. and Moretti, R. H. 1980. Polyphenol Oxidase ofMango, J. Food Sci., (45); 1619.

Patil, S. S. and Zucker, M. 1965. Potato Phenolases. J. Biol. Chem, 240, 3938.

Pekyardımcı, Ş. and Balaban, M. O. 1992. High pressure CO2 treatment on polyphenoloxidase activity. Turkish Journal of Chemistry, 16(2); 153-163.

Pierpoint, W. S. 1966. Enzymic oxidation of chilorogenic acids and some reactions ofthe quinnone procuced. Biochem, 98, 567.

Piffrei, P. G., Baldassari, L. and Cultrera, R. 1974. Inhibition by carboxylic acids of ano-diphenol oxidase from prunus avium fruits. J.Sci.Food Agr., 25, 263.

Pomeranz, S.h. 1963. Separation, purification and properties of two tyrosinases fromhamster melanoma. J. Biol. Chem. 238:2351.

Ponting, J. D. 1960. The control of enzymatic browning of fruits, food enzymes. H.W.,Schultz, ed., Avi Publ. Co., Inc, Westport, c.t.

Roberts, E. A. H. 1962. Economic importance of flavonoid substances; teaFermentation in the chemistry of flavonoid compounds. Pergamon Press, 465.

Robyt, I. F. and White, B. J. 1990. Biochemical Techniques: Theory and Practice.Waveland Press, Inc. Illinois.

Satjawatcharaphong, C., Rymal, K. S., Dozier, J. R. and Smith, R. C. 1983. PolyphenolOxidase System in Red Delicious Apples. J.Food Sci., 48.

Sapers, G. M., Garzarella, L. and Pilizota, V. 1990. Application of browning inhibitorsto cut apple and potato by vacuum and pressure infiltration. J.Food Sci., 55, (4);1049-1053.

Sato, M. 1962. The conversion by phenolase of p-coumaric acid to caffeic acid withspecial reference to the role of ascorbic acid, Phytochemistry, 8, 353.

Simpson, B. K. 1988. Phenoloxidases from pink and white shrimp kinetic and otherproperties. Jounal of Food Biochemistry, 205-217.

Sıddıq, M., Sinha, N. K. and Cash, J. N. 1992. Characterization of Polyphenol Oxidasefrom Stanley plums. J. Food Sci., 57, 1177.

Singh, K. and Ahlawati, T. R. 1974. Effect of ascorbic acid on tyrosinase of dwarfMexican wheats. Food Sci Technol. Abstr., 6(10); 136.

79

Singleton, V. L. 1987. Oxygen with Phenols and Related Reactions in Musts, Wines,and Model Systems: Observations and Practical Implications. Am. J. End. Vitic.,38(1); 69.

Soler-Mahnez, A., Sabater-Garcia, F. and Lozona, J. A. 1965. Inhibitores estructuralesde fenolase de albaricique. Rev. Esp. Fisial., 21, 139.

Stelzig, D. A., Akhtar, S. and Riberio, S. 1972. Catechol oxidase of red delicious applepeel. Phytochemistry, 11, 575.

Swain. T. 1962. Economic importance of flavonoid compounds. In : The chemistry offlavonoid compounds, Pergamon Press, 513.

Szabo, M. T. 1999. Effect of polyphenols on digestion of proteins, Proc. 19th Hung.Annu. Meet. Biochem, 223.

Şakiroğlu, H. 1994. Kuşburnu meyvasından izole edilen polifenol oksidaz enzimininkinetik ve elektroforetik özelliklerinin incelenmesi. (Doktora Tezi), AtatürkÜniversitesi.

Şakiroğlu, H., Küfrevioğlu, Ö. I., Kocaçalışkan, I., Oktay, M. and Onganer, Y. 1996.Purification and Characterization of Dog-rose (Rosa Dumalis Rechst.) PolyphenolOxidase. J. Agric. Food Chem., 44, 2982-2986.

Tate, J. N., Luh, B. S. and York, G. K. 1964. Polyphenol Oxidase in Barlett Pears. J.Food Sci., 29, 829.

Taufel, K. and Voigt, J. 1964. Zur Inhibierenden Wirkung von Ascorbins AuereGegenüber der Polhenol Oxidase des Apfels. Z.Lebensm. Unters.For., 126,19.

Thygesen P. W., Dry, I. B. and Robinson, S. P. 1994. Polyphenol oxidase in potatotubers. The Molecular and Cellular Biology of the Potato, Ed 2. CAB International,151-159, Wallingford, UK,.

Temizkan, G. ve Arda, N. 2004. Moleküler biyolojide kullanılan yöntemler.Nobel TıpKitapevleri.

Valero, E., Varon, R. and Garcia-Carmona, F. 1988. Characterization of PolyphenolOxidase from Airen Grapes. J. Food Sci., 53(5); 1482.

Vamos-Vigyazo, L., Mihalyi, K., Gajzago, I. and Nadudvari-Markus, V. 1977. Studiesinto the enzymic browning and the polyphenol-phenol oxidase complex of applecultivars. Confructa, 21, 24.

Vamos-Vigyazo, L.1981. Polyphenoloxidase and peroxidase in fruits and vegetables.CRC Crit Rev. Food Sci.Nutr., 15, 49.

80

Vamos-Vigyazo, L. 1981. Polyphenol Oxidase and Peroxidase in Fruits and Vegetables.CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 49.

Vamos-Vigyazo, L. 1981. Polyphenol oxidase and peroxidase in fruits and Vegetables.CRC Critical Rewievs in Food Science and Nutrition, 14; 49-129.

Vaughn, K. C., Lax, A. R. and Duke, S. O. 1988. Polyphenol oxidase:the chloroplastoxidase with no established function. Physiol Plant, 72; 659-665.

Voigt, J. and Noske, R. 1996. Zur Bestimmung der Polyphenoloxidase Aktivitat II.Orientierende Versuch zur Anvendburkeid der Metode mit Besthorns Reagens inApfeln. Z.Lebensm Unters, For., 130, 9.

Walker, J. R. L. 1962. Studies on the enzymic browning of apple fruit. N. Z. J. Sci., 5,316.

Walker, J. R. L. 1964. Studies on the enzymic browning of apples II. Properties ofapple polyphenol oxidase. Aust. J. Biol. Sci., 17, 360.

Walker, J. R. L. 1975. Enzymic browning in food. A review., Technol. Deg.,48( 3),89.

Walker, J. R. L. 1975. Enzymic browning in food. A review. Technol. Deg., 4(3); 89.

Walker, J. R. L. and Wilson, E. L. 1975. Studies on the enzymic browning of apples-inhibition of apple o-diphenol oxidase by phenolic acids. J. Sci. Food Agr., 26,1825.

Walker, J. R. L. 1976. The control of enzymic browning in fruit juices by cinnamicacids. J. Food Technol., 11, 341.

Walker, J. R. L. 1977. Enzymic browning in foods : its chemistry and control. FoodTechnology ,12 (3); 19-25, New Zeland.

Weber, D. J. and Stahmenn. M. A. 1964. Ceratocystis infection in sweet potato; itseffect on proteins, isozyemes and acquired immunity. Science, 146, 929.

Weaver, M. L., Brown, R. C, and Steen, H. A. 1968. The association of gopper withtyrosinase activity and internal discoloration in Russel Burbank Potatoes.,Am.Potato J., 45, 132.

Weser, U. 1968. Hemmeng der o- Diphenol Oxydase Aktivitat Durch Borat undGermanat, Hoppe-Seyler’s. Z.Physiol. Chem., 349,982.

Wetherilt, H., Pala, M. and Başoğlu, N. 1992. Relationship Between Sulphur DioxideLevel and Inhibition of Browning inApricots Dried to Different Moisture Levels.Developments in Food Science-Food Science and Human Nutrition, (Ed.:G.Charalambous), Elsevier, London, Amsterdam.

81

Whitaker, J. R. 1972. Polyphenol Oxidase of In : Principles of enzymology for the foodsciences (Fennema, O.R.,Ed.). Marcel Dekker, pp. 571-582, New York.

Whitaker, J. R. 1995. Polyphenol oxidase. In: Food enzymes: Structure and Mechanism.Dominic W. S. Wong, ed., Chapman and Hall, 271-307, New York.

Wildanger, W. and Hermann, K. 1973. Die Phenolischen Inhaltsstoffe des Obstes, II.Die Flavonole des Obstes. Z.Lebensm. For., 151, 103.

Wong, T. C., Luh, B. S. and Whitaker, J. R. 1971. Isolation and Characterization ofPolyphhenol oxidase Clingstone Peach. Plant Physiol, 48, 19.

Yavru, İ. 1997. Karayemiş (Prunus laurocerasus L.) meyvelerinde gelişme veolgunlaşmaya bağlı olara bazı organik madde miktarları ile polifenol oksidazaktivitesindeki değişimlerin araştırılması.(Yüksek Lisans Tezi), Karadeniz TeknikÜniversitesi.

Yosunobu, K.T. and Norris, E. R. 1957. Mechanism of borate inhibition of diphenoloxidation by tyrosinase. J. Biol. Chem., 227, 473.

Zemel, G. P. 1989. Low pH Inactivation of Polyphenoloxidase. Master Thesis, FoodScience and Human Nutrition Department, University of Florida, Gainesville, Fl,USA.

Ziyan, E. 1998. Polifenol oksidaz enziminin Ankara Armudu (Pyrus communis)’ndanizole edilmesi, saflaştırılması ve kinetik özelliklerinin incelenmesi. (Yüksek LisansTezi), Ankara Üniversitesi.

82

EKLER

Ek 1. POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZDE KULLANILAN TAMPON

VE ÇÖZELTİLER

1.1 Akrilamid + N,N'-Metilen Bisakrilamid Stoğu

Akrilamid (Merck) 28,8 gr

Bis akrilamid (Merck) 1,2 gr

Maddeler tartılıp 75 ml distile su içerisinde çözülerek hacim 100 ml’ye tamamlanır.

Whatman No: 1 filtre kağıdından süzülerek renkli cam şişede 0 °C’de saklanır.

1.2 Ayırma Jel Tamponu (1,5 M Tris-HCI, pH 8,6)

Gerekli miktarda Trizma bazı tartılır, suda çözüldükten sonra 1 N HCl ile pH 8,6’ya

ayarlanır ve son hacimde tamamlandıktan sonra Whatman No: filtre kağıdından süzülür

ve 4 °C’de saklanır. SDS-PAGE için % 0,4 oranında SDS ilave edilir.

1.3 Yığma Jel Tamponu (0,5 Tris-HCI, pH 6,8)

Gerekli miktarda Trizma bazı tartılır, suda çözüldükten sonra 1 N HCl ile pH 6,8’e

ayarlanır ve son hacime tamamlandıktan sonra Whatman No: 1 filtre kağıdından süzülür

ve 4 °C’de saklanır. SDS-PAGE için % 0,4 oranında SDS ilave edilir.

83

1.4 Koşturma Tamponu

Trizma-Bazı (Sigma) 1,21 gr

Glisin (Merck) 5,76 gr

Maddeler 1000 ml distile suda çözülür. SDS-PAGE için % 0,1 oranında SDS ilave

edilir.

1.5 Örnek Tamponu (4X)

0,5 M Tris-HCl pH 6,8 5,12 ml

Gliserin (Merk) 8,00 ml

Distile su 7,00 ml

Bromofenol mavisi (Merk) Çok az kristal

SDS örnek tamponu için 2,0 g SDS, 4,0 ml 2-β Merkaptoetanol (ME) ilave edilir.

Distile su miktarı ise 3,0 ml’ye düşürülür. Işıktan korunarak oda sıcaklığında saklanır.

1.6 Boyama Çözeltisi

Coomassie Brillant Mavisi (Sigma) 1,5 g

İzopropil Alkol (Merk) 250 ml

Asetik Asit (Merk) 100 ml

Distile Su 650 ml

Boya çözüldükten sonra Whatman No: 1 filtre kağıdından süzülür ve renkli cam şişede

oda sıcaklığında saklanır.

84

1.7 Boya Çıkarıcı Çözelti

İzopropil alkol (Merk) 250 ml

Asetik asit (Merk) 100 ml

Distile su 650 ml

Hazırlanan çözelti oda sıcaklığında renkli cam şişede saklanır.

1.8 Saklama Çözeltisi

Jelleri saklamak amacıyla % 7’lik asetik asit çözeltisi kullanılır.

1.9 % 10'luk Amonyum Persülfat (APS)

APS 1 gr

Distile su 10 ml

Madde distile suda çözülür ve 4 °C’de saklanır. Bir haftadan sonra yeniden taze

hazırlanarak kullanılır.

1.10 Molekül Ağırlık Standardı

Proteinlerin molekül ağırlıklarını hesaplamak için Bradford yöntemi (1976)

kullanılmıştır. Molekül ağırlık standartlarında bulunan proteinler ve molekül ağırlıkları

sırasıyla şöyledir;

85

Yüksek molekül ağırlıklı standartlar:

Miyozin 200,000 Da

Β-galaktosidaz 116,250 Da

Fosforilaz-b 97,400 Da

Bovin serum albumin 66,200 Da

Ovalbumin 45,000 Da

Düşük molekül ağırlıklı standartlar:

Bovin serum albumin 66,000 Da

Ovalbumin 45,000 Da

Gliseraldehit-3-fosfat

dehidrogenaz 30,000 Da

Karbonik anhidraz 29,000 Da

Tripsinojen 24,000 Da

Tripsin inhibitörü 20.000 Da

α-Laktalbumin 14,200 Da

1.11 % 10'luk SDS-PAGE Ayırıcı Jelin İçeriği

Akrilamid/Bisakrilamid 5,78 ml

Distile su 7,13 ml

1,5 M Tris-HCl pH 8,6 4,33 ml

APS 8,16 µL

TEMED (Sigma) 86,70 µL

86

1.12 % 4’lük SDS-PAGE Yığma Jelin içeriği

Akrilamid/Bisakrilamid 0,82 ml

Distile su 2,93 ml

0,5 M Tris-HCI pH 6,8 1,25 ml

TEMED 5,00 µL

APS 30,00 µL

1.13 % 7,5’lik Native-PAGE Ayırıcı Jelin içeriği

Akrilamid/Bisakrilamid 4,37 ml

Distile su 8,56ml

0,5 M Tris-HCI pH 6,8 4,33 ml

APS 86,70 µL

TEMED 8,16 µL

1.14 % 4’lük Native-PAGE Yığma Jelin içeriği

Akrilamid/Bisakrilamid 0,82 ml

Distile su 2,93 ml

0,5 M Tris-HCI pH6,8 1 ,25 ml

APS 30,00 µL

TEMED 5,00 µL

87

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı: Zehra Önez

Doğum Yeri: İzmir

Doğum Tarihi: 09.10.1980

Medeni Hali: Bekar

Yabanci Dili: İngilizce

Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)

Lise: Denizli Anadolu Lisesi

Lisans: Osmangazi Üniversitesi Biyoloji Bölümü

Yüksek Lisans: Ankara Üniversitesi Kimya Bölümü Biyokimya Anabilim Dalı

Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl:

Sivas Cumhuriyet Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsünde Araştırma Görevlisi (2005

Aralık)