BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Trần Quang Vinh

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẾ PHẨM VI SINH

VẬT ĐẾN CHẤT LƯỢNG NƯỚC AO NUÔI TÔM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Thành phố Hồ Chí Minh 07- 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Trần Quang Vinh

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẾ PHẨM VI SINH

VẬT ĐẾN CHẤT LƯỢNG NƯỚC AO NUÔI TÔM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Phúc

Thành phố Hồ Chí Minh 07- 2019

I

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được sự hướng dẫn tận

tình của thầy TS. Nguyễn Hữu Phúc. Các số liệu và kết quả nêu trong luận

văn chưa từng được công bố trong công trình nào khác. Các số liệu và trích

dẫn trong Luận văn đảm bảo tính chính xác, tin cậy và trung thực.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

TP. Hồ Chí Minh, ngày …. tháng 7 năm 2019

Tác giả

Trần Quang Vinh

II

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian theo học tại Học Viện Khoa Học và Công Nghệ, tôi đã

được tạo điều kiện tốt nhất trong học tập, nghiên cứu từ Học Viện Khoa Học

và Công Nghệ và Viện Sinh Học Nhiệt Đới.

Tôi đã nhận được sự tận tình chỉ dẫn của Quý Thầy Cô trong Học Viện,

sự chu đáo của cán bộ, nhân viên ở các đơn vị của Học Viện.

Đây cũng là thời kỳ gắn bó và giúp đỡ đầy thiện chí của tập thể bạn bè tôi

ở lớp Cao học Sinh học thực nghiệm 2017A, Học Viện Khoa Học và Công

Nghệ, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.

Để có được bản luận văn thạc sĩ này, tôi vô cùng biết ơn Thầy Tiến sĩ

Nguyễn Hữu Phúc luôn tận tâm, hết lòng nâng bước cho nhiều thế hệ học trò,

người đã gắn bó không mệt mỏi với sự nghiệp trồng người, đã cho tôi nhiều ý

kiến quí báu trong quá trình thực hiện đề tài.

Tôi không quên lòng nhiệt tình, sâu sát, lo lắng, chia sẻ của Ban lãnh đạo

Viện Sinh Học Nhiệt Đới, và các đồng nghiệp đã quan tâm tạo điều kiện, giúp

đỡ, cũng như sự tiếp sức chân tình và hiệu quả từ gia đình nhỏ của tôi.

Em xin chân thành cảm ơn !

Tp. Hồ Chí Minh, ngày … tháng 07 năm 2019

Tác giả

Trần Quang Vinh

III

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Từ viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt

VPAHPND Vibrio parahaemolyticus Acute

hepatopancreatic necrosis disease

Bệnh hoại tử gan cấp tính

do V. parahaemolyticus

EMS Early Mortality Syndrome Bệnh hoại tử gan tụy cấp

FAO Food and Agriculture

Organization

Tổ chức Nông lương Liên

Hiệp Quốc

GSMC Global Seafood Market

Conference

Hội nghị Thị trường Thủy

sản Toàn cầu

VASEP Vietnam Association of Seafood

Exporters and Producers

Hiệp Hội chế biến và Xuất

khẩu thuỷ sản Việt Nam

BOD Biochemical oxygen demand Nhu cầu oxy sinh học

COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa học

TSA Tryptic Soy Agar Môi trường ban đầu nuôi

cấy khuẩn lạc

TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts

Sucrose

Môi trường phân lập chọn

lọc Vibrio sp

DO Dissolved oxygen oxygen hòa tan

TOC Total organic carbon Tổng cacbon hữu cơ

FCR Feed Conversion Ratio Hệ số chuyển đổi thức ăn

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic

Acid

Acid hữu cơ mạnh

IV

Danh mục các bảng

Bảng 1.1: Hiệu quả sử dụng Probiotic trong nuôi thủy sản: ............................. 9

Bảng 2.1: Phương pháp phân tích chất lượng nước: ....................................... 46

Bảng 3.1: Một số chủng vi sinh phân lập đã được chọn lọc : ......................... 51

Bảng 3.2: Đặc điểm phát triển và tạo acid lactic của các chủng

vi khuẩn lactic: ................................................................................................ 63

Bảng 3.3 : Số lượng vi sinh trong EM: ........................................................... 73

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến tỷ lệ sống và năng suất

tôm: .................................................................................................................. 75

Bảng 3.5: Báo cáo giai đoạn các kết quả thử nghiệm chế phẩm trong ao nuôi

tôm sú: ............................................................................................................. 76

Bảng 3.6: Biến động các yếu tố chất lượng nước trong ao nuôi tôm: ............ 77

V

Danh mục các hình

Hình 1.1: Sơ đồ ảnh hưởng của các chế phẩm vi sinh sử dụng trong thủy sản: . 10

Hình 2.1: máy đo DO, pH,… ........................................................................ 49

Hình 2.2: Máy phá mẫu COD ....................................................................... 50

Hình 2.3: Máy đo BOD5 ............................................................................... 50

Hình 2.4: Máy đo chỉ tiêu Amonium, nitrate, nitrite,... ................................. 51

Hình 3.1: Khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus sp ............ 53

Hình 3.2: Khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng Bacillus sp ............. 54

Hình 3.3: Ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp amylase. ........................ 55

Hình 3.4. Hoạt lực enzym protease của các chủng Bacillus sp ......................... 56

Hình 3.5: Hoạt lực enzym amylase của chủng Bacillus sp ................................. 57

Hình 3.6: Hoạt lực emzyme protease của chủng Bacillus sp .............................. 58

Hình 3.7: Sự biến động số lượng Vibrio sp. ....................................................... 59

Hình 3.8: Sự biến động Bacillus sp trong nước nuôi tôm. .................................. 60

Hình 3.9: Sự biến động của Vibrio sp trong tôm theo thời gian ......................... 61

Hình 3.10: Sự biến động số lượng Bacillus sp trong tôm ................................... 62

Hình 3.11: Lactobacillus sp. Lac 1 ; Lactobacillus acidophilus Lac 2 ............. 65

Hình 3.12: Lactobacillus sp. Lac 3 ; Lactobacllus acidophilus Lac 4 ............... 65

Hình 3.13: Lactobacillus sp. Lac 5 ; Lactobacillus sp. Lac 6 ............................. 66

Hình 3.14: Lactobacillus sp. Lac 7 ; Lactobacillus sp. Lac 8 ............................. 66

Hình 3.15: Streptococcus sp. Lac 9 ; Streptococcus sp. Lac 10 ....................... 67

Hình 3.16: Lactobacillus sp. Lac 11 ; Lactobacillus sp. Lac 12......................... 67

Hình 3.17: Streptoccocus sp. Lac 13; Streptococcus sp. Lac 14 ........................ 67

Hình 3.18: Lactobacillus sp. Lac 16 ; Lactobacillus sp. Lac 17......................... 68

Hình 3.19: Lactobacillus sp. Lac 18 ; Tế bào vi khuẩn Lactobacillus sp .......... 68

VI

Hình 3.20: Sự biến động pH của khi nuôi EM ................................................... 72

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ khối chế tạo EM gốc và các loại EM khác .............................. 71

VII

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4

1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC: ........................................ 5

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC: ........................................ 7

1.3. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG AO NUÔI TÔM: ....... 8

1.3.1. Các chế phẩm vi sinh sản xuất từ các loài vi khuẩn Bacillus sp và

các vi khuẩn khác: .......................................................................................... 10

1.3.2. Chế phẩm EM: ................................................................................. 10

1.3.3. Vi sinh quang tự dưỡng: ................................................................... 12

1.3.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn quang tự dưỡng: ............................ 12

1.3.3.2. Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi khuẩn

quang hợp tía không lưu huỳnh: ................................................................ 14

1.3.3.3. Ứng dụng của VKQH tía trong nuôi trồng thuỷ sản: ................... 15

1.4. DỊCH BỆNH TÔM: ............................................................................... 19

1.4.1.Tình hình bệnh tôm trên thế giới: ..................................................... 19

1.4.2. Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam: ........................................... 20

1.4.3. Vi khuẩn Vibrio sp: .......................................................................... 23

1.5. CHẤT HỮU CƠ TRONG CÁC AO NUÔI TÔM: ................................ 24

1.5.1. Nguồn gốc chất hữu cơ trong các ao thủy sinh: ............................... 24

1.5.2. Chất hữu cơ từ nguồn nước cấp: ...................................................... 24

1.5.3. Chất hữu cơ từ thức ăn : ................................................................... 24

1.5.4. Chất hữu cơ từ phân bón: ................................................................. 25

1.5.5. Chất hữu cơ hình thành trong quá trình nuôi tôm: ........................... 25

1.6. VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG CÁC QUÁ TRÌNH BIẾN

ĐỔI VẬT CHẤT TRONG AO NUÔI THỦY SẢN:..................................... 28

1.6.1. Phân huỷ các hợp chất carbon:......................................................... 28

VIII

1.6.2. Vai trò vi sinh vật trong việc chuyển hóa các hợp chất chứa

nitrogen: ......................................................................................................... 30

1.6.2.1. Phân giải protein amon hóa : ....................................................... 30

1.6.2.2. Vi sinh vật tham gia vào quá trình nitrat hóa (Nitrification) : .... 30

1.6.3. Biến đổi sulfur: ................................................................................ 34

1.7. CÁC YẾU TỐ HÓA LÝ TỚI MÔI TRƯỜNG NUÔI TÔM: ................ 35

1.7.1. Yếu tố vật lý: .................................................................................... 35

1.7.2. Yếu tố hóa học: ................................................................................ 36

1.7.3. Yếu tố sinh học: .............................................................................. 37

CHƯƠNG 02: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 38

2.1 . VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU: .................................................................. 38

2.1.1. Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu hiện có tại Viện Sinh

học nhiệt đới. .................................................................................................. 38

2.1.2. Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm: .............................................. 39

2.1.2.1. Đánh giá sơ bộ khả năng sinh tổng hợp amylase, protease của

một số chủng Bacillus sp. ............................................................................... 39

2.1.2.2 Xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng

hợp enzym amylase của các chủng Bacillus sp: ............................................ 39

2.1.2.3. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng

hợp enzym protease của các chủng Bacillus: ................................................ 40

2.1.2.4. Xác định hoạt tính emzyme amylase theo phương pháp Smith và

Roe (1946). ..................................................................................................... 40

2.1.2.5. Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Anson. ... 41

2.1.3. Thử nghiệm chế phẩm sinh học vi sinh trong

phòng thí nghiệm: .................................................................................... 44

2.1.4. Thử nghiệm tại ao nuôi: ................................................................... 45

2.1.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm: .................................................... 45

2.1.4.2. Phương pháp quản lý chất lượng nước: ....................................... 46

IX

2.1.4.2.1. Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý nước: ............................. 46

2.1.4.2.2. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn trong nước: ................ 47

2.1.4.2.3. Phương pháp phân tích tăng trưởng và năng suất tôm nuôi: .... 47

2.1.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: .......................................... 47

2. 2. MỘT SỐ HÓA CHẤT, THIẾT BỊ DÙNG TRONG PHÂN TÍCH

MẪU VI SINH, HÓA LÝ: ............................................................................ 48

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 51

3.1. CHỌN LỌC CÁC CHỦNG BACILLUS SP SỬ DỤNG TRONG

NUÔI TÔM. ................................................................................................... 51

3.1.1. Chọn lọc các chủng đối kháng với Vibrio........................................ 51

3.1.2. Xác định khả năng sinh tổng hợp emzyme của các

chủng vi sinh: ............................................................................................. 53

3.1.2.1. Xác định khả sinh tổng hợp amylase của

các chủng Bacillus sp: ............................................................................... 53

3.1.2.2. Khả năng sinh tổng hợp emzym protease của các chủng Bacillus

sp sử dụng trong nuôi tôm : ........................................................................... 54

3.1.2.3. Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym

amylase của các chủng Bacillus sp sử dụng trong nuôi tôm sú: ................... 55

3.1.2.4. Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym

protease của các chủng Bacillus sp: .............................................................. 56

3.1.2.5. Xác định hoạt tính amylase của chủng Bacillus sp: ..................... 57

3.1.2.6. Hoạt tính enzym protease của một số chủng Bacillus sp: ............ 58

3.1.3. Thử nghiệm tính đối kháng các chủng với vi khuẩn Vibrio sp trong

phòng thí nghiệm: .......................................................................................... 59

3.1.3.1. Sự biến động số lượng vi khuẩn Vibrio sp: ................................... 59

3.1.3.2. Sự biến động số lượng vi khuẩn Bacillus sp: ............................... 60

3.1.3.3. Sự biến động Vibrio sp trong tôm thử nghiệm: ............................. 61

3.1.3.4. Sự biến động Bacillus sp trong ruột tôm: ..................................... 62

X

3.2. NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM EM : ................................................ 63

3.2.1. Chọn chủng vi khuẩn lactic: ............................................................. 63

3.2.2. Chọn chủng nấm men: ..................................................................... 69

3.2.3. Chế tạo chế phẩm EM: ..................................................................... 69

3.2.3.1.Nguyên liệu: .................................................................................. 69

3.2.3.2. Sơ đồ khối tạo chế phẩm EM: ....................................................... 71

3.2.3.3. Sự biến đổi pH khi nuôi EM: ........................................................ 72

3.2.3.4. Kết quả kiểm tra vi sinh trong EM: .............................................. 73

3.3. KẾT QUẢ SO SÁNH ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM EM VÀ

BACILLUS ĐẾN CHẤT LƯỢNG NƯỚC VÀ HIỆU QUẢ NUÔI TÔM: .. 74

3.3.1 Ảnh hưởng chế phẩm Bacillus sp đến chất lượng nước ao nuôi tôm

tại Cần Giờ và Nhà Bè: .................................................................................. 74

3.3.1.1. Khảo nghiệm chế phẩm tại Cần Giờ: ........................................... 74

3.3.1.2. Khảo nghiệm chế phẩm ở huyện Nhà Bè:. .................................... 76

3.3.1.3. Một số chỉ tiêu hóa lý phân tích ao thử nghiệm: .......................... 77

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. 78

4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................. 78

4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 79

PHỤ LỤC ....................................................................................................... 83

1

MỞ ĐẦU

Ngành nuôi tôm nước lợ chiếm vị trí đặc biệt quan trọng trong

chiến lược phát triển kinh tế ngành thủy sản Việt Nam hơn 10 năm qua.

Cụ thể: theo báo cáo Tổng cục thủy sản năm 2018, giá trị sản xuất thủy

sản năm 2018 đạt khoảng 228.139,8 tỷ đồng, tăng 7,7% so với năm 2017,

tổng sản lượng đạt khoảng 7,74 triệu tấn, tăng 7,2%, trong đó sản lượng

sản lượng khai thác đạt 3,59 triệu tấn, tăng 6,0%, nuôi trồng đạt 4,15 triệu

tấn, tăng 8,3%. Đối với tôm nước lợ: Từ cuối quý II/2018, giá tôm

nguyên liệu đã tăng lên, người nuôi tiếp tục thả giống nuôi tôm, góp phần

đưa sản lượng tôm các loại đạt khoảng 800 nghìn tấn trong năm 2018,

tăng 10,5% so với năm 2017, theo dự báo của Tổng cục thủy sản năm

2019, ngành thủy sản Việt Nam sẽ tiếp tục tăng trưởng xuất khẩu đạt mức

10 tỷ USD, trong đó xuất khẩu tôm phấn đấu đạt 4,2 tỷ USD tiến tới nhu

cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu đạt 508 nghìn tấn vào năm 2020 và

678 nghìn tấn vào năm 2030 [1].

Hiện nay, vẫn còn rất nhiều kẽ hở trong việc quản lý sản xuất tôm.

Quản lý môi trường, dịch bệnh trong nuôi tôm còn nhiều hạn chế,... đã

dẫn tới lây lan dịch bệnh. Thực tế người dân chưa áp dụng mà chỉ biết

nuôi theo quy trình của các công ty bán giống, thức ăn, chế phẩm sinh

học tổ chức tập huấn tận vùng nuôi. Các quy trình này đều hướng người

nuôi đến sử dụng sản phẩm của họ càng nhiều càng tốt nên tình trạng lạm

dụng thuốc, hóa chất, chất kháng sinh rất phổ biến, làm ô nhiễm môi

trường, lờn thuốc, không an toàn và ảnh hưởng tới chất lượng và khả

năng cạnh tranh của sản phẩm. Trong khi đó hiện nay, thị trường thức ăn

nuôi tôm, thuốc và hóa chất các loại phụ thuộc trên 80% vào các doanh

nghiệp có vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài. Nghề nuôi trồng thủy sản

chúng ta đang đương đầu với nhiều loại bệnh khác nhau: bệnh phát sáng,

bệnh đầu vàng, trong đó bệnh EMS nguyên nhân là do vi khuẩn Vibrio sp

gây ra trên tôm, vi khuẩn Vibrio sp chịu được nồng độ muối cao cho nên

chúng có thể sống được ở môi trường nước lợ hoặc nước mặn, Vibrio sp

là vi khuẩn phát sáng sống bám trên động vật giáp xác và ruột của động

vật nước. Theo báo cáo FAO khẳng định (Food and Agriculture

2

Organization of the United Nations FAO, 2013) chỉ ra rằng độc tính của

Vibrio sp được phát hiện trên động vật thủy sinh, đặc biệt là họ penaeids

ở Châu Á, vi khuẩn Vibrio sp là nguyên nhân chủ yếu đối với bệnh EMS

và báo cáo mới đây nhất của (Anuphap Prachumwat et al., 2018) công bố

tại tạp chí thủy sản thế giới cũng chỉ ra rằng nguyên nhân cũng vậy. Theo

(Han et al., 2017) tác nhân gây bệnh đã được báo cáo vào năm 2013

Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) mà sau này đều mang một

plasmid (PVA) mã hóa các Pir - như gen độc tố nhị phân Pir VPA và Pir

VPB. VPAHPND phân lập khuẩn lạc trong dạ dày tôm và giải phóng độc

tố nhị phân gây ra sự bong tróc lớn của các tế bào biểu mô ống hình ống

và tử vong, plasmid và các biến thể xảy ra ở nhiều loại huyết thanh V.

parahaemolyticus và cả ở các loài Vibrio khác như V. harveyi, V.

campbellii, và V. owensii., dịch bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên

toàn thế giới, ở Việt Nam trong những năm gần đây diện tích bị bệnh

không ngừng gia tăng trên diện rộng,... Ngày nay FAO đã xác định sử

dụng probiotic là biện pháp chủ yếu để cải thiện chất lượng môi trường

thủy sản. Để phòng trị bệnh hoại tử gan tụy, biện pháp hàng đầu là phòng

và trị bệnh cho tôm nuôi hiệu quả, cần thay thế thuốc kháng sinh trong

nuôi trồng thủy sản, bổ sung các chất khoáng và sử dụng probiotic trong

thức ăn (Gomez-Gil et al., 2000), xử lý nước của thủy sản nuôi là lựa

chọn tốt nhất trong xu thế hiện nay. Mặc dù ngày nay người nuôi tôm

Việt nam đang sử dụng khá nhiều các chế phẩm vi sinh, nhưng phần lớn

đều là các sản phẩm nhập nội.

Các chế phẩm vi sinh là nguyên liệu hết sức quan trọng hiện nay thay

thế phương pháp dùng kháng sinh, số lượng các chế phẩm vi sinh phổ

biến trên thị trường hiện nay một phần lớn là nhập khẩu và một phần còn

lại là sản xuất trong nước. Vì vậy trong chương trình thực hiện luận văn

thạc sĩ chúng tôi chọn đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của một số chế

phẩm vi sinh vật đến chất lượng nước ao nuôi tôm”

3

MỤC TIÊU:

- Nghiên cứu và sản xuất hai chế phẩm xử lý môi trường nước ao nuôi

tôm và phòng chống vi khuẩn gây bệnh cho tôm.

- Đánh giá hiệu quả của hai loại chế phẩm vi sinh đang sử dụng nhiều

trong nuôi tôm là chế phẩm Bacillus nhiệt đới và chế phẩm EM gốc

nhiệt đới đến chất lượng nước ao nuôi tôm và phòng chống Vibrio sp gây

bệnh cho tôm nuôi ở trong phòng thí nghiệm .

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

- Chọn lọc một số chủng vi khuẩn Bacillus sp để tạo chế phẩm

Bacillus nhiệt đới kháng Vibrio sp dùng trong nuôi tôm.

- Phân lập và chọn một số chủng vi khuẩn Lactic để tạo chế phẩm EM

gốc nhiệt đới.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của 02 chế phẩm vi sinh Bacillus nhiệt đới

và EM gốc nhiệt đới đến chất lượng nước và hiệu quả tôm nuôi trong

phòng thí nghiệm và ngoài ao nuôi tôm thương phẩm.

4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Theo nhóm nghiên cứu về thị trường tôm tại Hội nghị Thị trường

Thủy sản Toàn cầu (GSMC), sự tăng trưởng mạnh từ Ấn Độ và Trung

Quốc, sự phục hồi sản lượng từ các nước Mỹ Latinh và châu Á khác sẽ

thúc đẩy sản lượng tôm thế giới vượt qua 3,5 triệu tấn năm 2018 [1].

Cùng với sản lượng tăng từ Ấn Độ và Ecuador, sản lượng tôm Việt

Nam cũng dự báo tăng trong năm 2018. Trung Quốc, Thái Lan và

Indonesia cũng dự kiến phục hồi sản lượng.

Ngành nuôi (tôm thẻ “Litopenaeus vannamei” và tôm sú “Penaeus

monodon”) gọi chung là nuôi tôm nước lợ chiếm vị trí đặc biệt quan

trọng trong chiến lược phát triển kinh tế ngành thủy sản Việt Nam hơn 10

năm qua. Cùng với quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng vật nuôi và

chuyển đổi đất nông nghiệp, đất làm muối năng suất thấp sang nuôi tôm ở

các tỉnh ven biển, nhờ vậy mà ngành tôm có sự tăng trưởng vượt bậc cả

về diện tích, sản lượng và giá trị xuất khẩu.

Việt Nam đang là nước xuất khẩu thủy sản đứng thứ 3 thế giới sau

Trung Quốc và Na Uy và sản phẩm thủy sản đã có mặt ở 160 thị trường.

Theo báo cáo mới đây của Tổng cục thủy sản năm 2018, giá trị sản xuất

thủy sản năm 2018 đạt khoảng 228.139,8 tỷ đồng, tăng 7,7% so với năm

2017, tổng sản lượng đạt khoảng 7,74 triệu tấn, tăng 7,2%, trong đó sản

lượng sản lượng khai thác đạt 3,59 triệu tấn, tăng 6,0%, nuôi trồng đạt

4,15 triệu tấn, tăng 8,3% (trong đó, cá tra đạt 1,251 triệu tấn, tôm các loại

723,8 nghìn tấn: tôm nước lợ 683,4 nghìn tấn gồm tôm sú 256,4 nghìn

tấn, tôm chân trắng 427,0 nghìn tấn); giá trị xuất khẩu thủy sản đạt 8,317

tỷ USD. Diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 721,1 nghìn ha, trong đó tôm sú

622,4 nghìn ha, tôm chân trắng 98,7 nghìn ha [1].

Việc nghiên cứu một căn bệnh do vi khuẩn tương tự gây ra cũng rất

quan trọng. Ví dụ: vi khuẩn phát quang Vibrio có tên gọi là “Vibrio

harveyi” đã phá hủy ngành nuôi tôm ở Philippines vào đầu những năm

1990. Một số bài học liên quan cũng được rút ra từ nghiên cứu này. Ví

5

dụ, ở trại ương giống, người ta phát hiện Vibrio harveyi tấn công trứng

tôm. Người ta buộc phải rửa trứng để khi ấu trùng được ươm, ấu trùng sẽ

có tỉ lệ sống nhiều hơn. Điều này có nghĩa là việc kiểm soát cơ sở ương

giống sẽ rất quan trọng trong việc ngăn ngừa EMS phát tán từ giống bố

mẹ sang tôm post.

Cơ chế tác dụng của các chế phẩm vi sinh theo một số cơ chế sau

đây thường được nói đến [2]:

- Sinh ra các chất ức chế.

- Cạnh tranh các chất dinh dưỡng.

- Cạnh tranh các vị trí bám trong hệ thống đường ruột.

- Tăng cường đáp ứng miễn dịch.

- Đóng góp các enzym đường ruột.

- Là nguồn chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng.

- Cải thiện chất lượng nước.

- Quan hệ với phytoplanton.

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC:

Việc sử dụng chủng Vibrio alginolyticus phân lập từ nước biển để

thử trên ấu trùng tôm Litopenaeus vannamei. Kết quả là tôm không bị

chết ở lô thử nghiệm có nhiễm vi khuẩn gây bệnh, trong khi ở đối chứng

tôm chết 100% sau 96 giờ cho nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus ở mật

độ 2 103 tế bào/ml [3].

Ngo, Hai & Fotedar, Ravi. (2010) [4]. Đã chỉ ra ba chủng vi

khuẩn, Bacillus, Lactobacillus và Pseudomonas, thường được dùng làm

men vi sinh trong nuôi tôm. Việc bổ sung vào thức ăn có hiệu quả hơn

trong việc chuyển chế phẩm sinh học vào động vật so với việc áp dụng

trực tiếp vào hệ thống nuôi. Dùng quá liều hoặc sử dụng men vi sinh kéo

dài có thể gây ức chế miễn dịch. Mật độ tế bào của 10 đơn vị hình thành

khuẩn lạc (CFU) mỗi ml được khuyến nghị rộng rãi. Một sự kết hợp của

6

các chế phẩm sinh học mang lại kết quả tốt hơn cho vật chủ so với các

chế phẩm sinh học riêng lẻ. Probiotic cải thiện chất lượng nước trong khi

giảm vi khuẩn gây bệnh. Probiotic cho thấy tác dụng tích cực thông qua

sự cải thiện các phản ứng sinh lý và miễn dịch của tôm. Probiotic đang

ngày càng trở nên quan trọng và phổ biến hơn trong bất kỳ nghề nuôi tôm

hữu cơ nào [5].

Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm vi sinh

trong nuôi tôm, đặc biệt ở Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan.

Jiravanichpaisal et al.(1997) đã sử dụng Lactobacillus sp. trong nuôi tôm

sú (P. monodon Fabrius)[6].

Ở Trung Quốc, nghiên cứu probiotic trong nuôi thủy sản được tập

trung vào vi khuẩn quang hợp. QIAN Dayi et al. (2005) nghiên cứu 3

chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng cho tôm (P. chinensis) bằng cách cho

vào thức ăn hoặc cho và nước nuôi tôm cho thấy có sự gia tăng khả năng

phát triển của tôm, loại trừ nhanh chóng NH3-N, H2S, acid hữu cơ và

những chất có hại, cải thiện chất lượng nước, cân bằng độ pH [7].

Một số nghiên cứu mới đây được thực hiện để nghiên cứu in vitro tác

dụng đối kháng của Lactobacillus sp,. chống lại vi khuẩn Vibrio harveyi

gây bệnh trên tôm. Với mục đích này, các mẫu tôm được thu thập từ ba

nơi khác nhau tại Batiaghata upazilla, Khulna. Mang và ruột được lấy ra

từ các mẫu để xác định đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus sp,. và

Vibrio sp. Kết quả cho thấy vi khuẩn Lactobacillus spp. đã được tìm thấy

nhiều hơn Vibrio sp. cả trong mang và ruột; mang tôm chứa vi khuẩn

Vibrio sp cao hơn trong ruột. V. harveyi được tách ra khỏi Vibrio sp. với

các loại xét nghiệm sinh hóa khác nhau: ( nhuộm Gram, xét nghiệm

Motility, xét nghiệm Indole, xét nghiệm VP, xét nghiệm MR, Arginine

dihydrolase, thử nghiệm dung nạp muối, tăng trưởng ở các khoảng nhiệt

độ khác nhau và màu khuẩn lạc trên môi trường thạch TCBS). Đã tuyển

chọn các V. harveyi và cấy giống. Trong thử nghiệm trong ống nghiệm,

tác dụng đối kháng tiềm tàng của Lactobacillus sp. chống lại V. harveyi

dần dần đạt được vào 0, 4, 8, 12 giờ thí nghiệm. Phát hiện thú vị là, cùng

với thời gian, tải trọng của V. harveyi đã giảm dần và thấp nhất đạt được

7

sau 12 giờ thử nghiệm. Nghiên cứu hiện tại đã tiết lộ một tác dụng sinh

học đối kháng in vitro tuyệt vời của Lactobacillus sp. trên V. harveyi [8].

Qua kết quả cho thấy rằng điều trị bằng chế phẩm sinh học có thể là sự

thay thế hiệu quả cho việc sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh do

vi khuẩn trong nuôi tôm.

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC:

Ở Việt nam những nghiên cứu về việc sử dụng các chế phẩm vi

sinh để cải thiện môi trường nuôi tôm, phòng trừ bệnh, xử lý môi trường

ô nhiễm còn tương đối ít, và chỉ mới được chú ý trong những năm gần

đây.

Khác với động vật trên cạn, môi trường nước bao quanh các động

vật thủy sinh giúp cho các vi sinh vật gây bệnh cho chúng sống được độc

lập với động vật chủ, kết quả là các vi sinh vật gây bệnh cơ hội có thể

phát triển đạt đến mật độ rất cao xung quanh các động vật thủy sinh, các

vi sinh vật gây bệnh cho động vật thủy sinh ở môi trường ngoài đi vào cơ

thể động vật thủy sinh dễ dàng qua con đường thức ăn, hoặc qua mang

(hô hấp). Việc kiểm soát tốt hệ vi sinh vật trong môi trường nuôi sẽ giảm

thiểu được nhiều dịch bệnh cho động vật thủy sinh.

Năm 2013, Viện nghiện cứu nuôi trồng thủy sản 02 nghiên cứu đề

tài “ Một số yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh hoại tử gan trên tôm thẻ

(Penaeus vannamei) nuôi công nghiệp quy mô nông hộ tại huyện Đầm

Dơi, Cà Mau” kết quả cho thấy dịch bệnh xảy ra trên 54,8% số hộ theo

dõi và có liên quan đến mật độ vi khuẩn Vibrio sp. [9].

Báo cáo tạp chí thủy sản năm 2014, Viện nghiện cứu nuôi trồng

thủy sản 02 nghiên cứu đề tài “ Các giải pháp kỹ thuật kiểm soát bệnh

hoại tử gan tụy cấp trên tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi

thâm canh quy mô trang trại ở Đồng bằng Sông cửu long” các thí nghiệm

tiến hành bổ sung chế phẩm vi sinh nhằm hạn chế mật độ vi khuẩn gây

bệnh Vibrio parahaemolyticus kết quả cho thấy ao đối chứng đạt tỷ lệ

8

sống 87,53% so với ao đối chứng 60,69 % kết luận việc bổ sung chế

phẩm vi sinh kiểm soát được bệnh do Vibrio sp. gây ra [9].

Từ năm 2000 đến nay các tỉnh thành trong cả nước ứng dụng thử

nghiệm chế phẩm vi sinh trên địa phương mình và ghi nhận có hiệu quả

kinh tế, xã hội. Các địa phương đã sử dụng chế phẩm vi sinh như Hà Nội,

thành phố Hồ Chí Minh, Bình Định, Quãng Ngãi, Ninh Thuận, Bình

Thuận, Bình Dương, Tiền Giang, An Giang, Bạc Liêu.

Các chế phẩm sử dụng trong nuôi thủy sản và xử lý môi trường

hiện nay có thể chia làm 3 loại [11]:

Nhóm thứ 1: Các chế phẩm có tính chất probiotic gồm những vi sinh vật

sống như các vi khuẩn thuộc giống Bacillus sp, Lactobacillus sp,

Saccharomyces sp, … người ta thường trộn vào thức ăn hoặc qua trung

gian như Artemia, Rotifer.

Nhóm thứ 2: Gồm các vi sinh vật có tính đối kháng hoặc cạnh tranh với

vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn Bacillus licheniformis sp, Bacillus sp.

Vibrio alginolyticus,…

Nhóm thứ 3: gồm các vi sinh vật cải thiện chất lượng môi trường như vi

khuẩn Nitrosomonas sp, Nitrobacter sp, Actinomyces sp, các loài Bacillus

sp khác nhau, các loại tảo, các vi khuẩn tía không lưu huỳnh như

Rhodobacter sp. Rhodospirillum sp, Rhodopseudomonas viridis,

Rhodopseudomonas palutris, Rhodomicrobium vanniell, các loại nấm

Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Rhizopus sp,…

1.3. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG AO NUÔI TÔM:

Vi sinh vật và các chế phẩm enzym đưa vào ao nuôi hoặc ao xử lý

sinh học thực hiện các chức năng khác nhau: probiotic (dành riêng cho

các chủng có giai đoạn ngắn hoặc tồn tại lâu dài trong ruột động vật),

Biocontrol (áp dụng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh cho tôm) cải

thiện sinh học (bioremediation = phân hủy các chất gây ô nhiễm trong

môi trường biến chúng thành các chất vô hại, không gây ô nhiễm.

Nhiều nghiên cứu sử dụng probiotic để phục vụ ngành thủy sản.

Probiotic được xác định như là thức ăn vi sinh vật sống bổ sung để cải

9

thiện sức khoẻ của động vật. Hệ vi sinh vật trong dạ dày của cá và tôm sò

phụ thuộc vào môi trường bên ngoài do nước vào ra hệ thống đường ruột.

Bảng 1.1: Hiệu quả sử dụng Probiotic trong nuôi thủy sản [10]:

Ở Việt nam trong những năm gần đây đã được bộ thủy sản cho lưu

hành sử dụng hàng loạt các chế phẩm vi sinh nhằm cải thiện môi trường

và giúp tôm chống lại các tress.

10

1.3.1. Các chế phẩm vi sinh sản xuất từ các loài vi khuẩn Bacillus

sp và các vi khuẩn khác:

Các chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus sp: B. subtilis, B. licheniformis,

B. polymyxa, B. megaterium.

Sinh ra các chất ức chế, cạnh tranh các chất dinh dưỡng, cạnh tranh

các vị trí bám trong hệ thống đường ruột, tạo các enzym giúp tôm tiêu

hoá tốt và phân huỷ chất thải trong môi trường, cải thiện chất lượng nước.

Hình 1.1: Sơ đồ ảnh hưởng của các chế phẩm vi sinh sử dụng trong

nuôi thủy sản [2].

1.3.2. Chế phẩm EM:

Ý tưởng sử dụng vi khuẩn probiotic đã được Élie Metchnikoff

(EM) đưa ra năm 1907. Chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu – EM là tập hợp

các loài vi sinh vật có ích (vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men,

Cải thiện chất

lượng nước

Các chế phẩm vi sinh

Đối kháng vi sinh vật

gây bệnh

Có mặt nhất thời hay cư trú thường

xuyên trong ruột

Không nhất thiết Nhất thiết

Probiotic

Biocontrol

Cải thiện sinh

học

(Bioremediation)

11

xạ khuẩn, nấm mốc) sống cộng sinh trong cùng môi trường [11]. Tập

đoàn vi sinh vật có tác dụng tăng cường tính đa dạng vi sinh vật, bổ sung

các vi sinh vật có ích vào môi trường tự nhiên, giảm thiểu ô nhiễm môi

trường do các vi sinh vật có hại gây ra. Chế phẩm EM được sản xuất từ

Nhật Bản do giáo sư – Tiến sĩ Teuro Higa trường đại học Tổng hợp

Ryukyus, Okinawa sáng chế và được áp dụng vào thực tiễn năm 1980

[12]. Hiện nay, trên 80 nước sử dụng EM trong nông nghiệp và môi

trường [13].

Ngày nay các chế phẩm probiotic được sử dụng khá rộng rãi và có

hiệu quả ở người, động vật nuôi trên cạn và xử lý môi trường. Tuy nhiên

việc áp dụng các chế phẩm probiotic trong nuôi thủy sản, xử lý môi

trường, sản xuất phân hữu cơ thì chỉ mới bắt đầu từ vài chục năm trở lại

đây tại Việt Nam.

Chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu là tập hợp các loài vi sinh vật có ích

(vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm mốc) sống

cộng sinh trong cùng môi trường [13]. Tập đoàn vi sinh vật có tác dụng

tăng cường tính đa dạng vi sinh vật, bổ sung các vi sinh vật có ích vào

môi trường tự nhiên, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do các vi sinh vật có

hại gây ra.

Chế phẩm EM làm tăng khả năng phân hủy chất hữu cơ, thức ăn dư

thừa, giảm lượng bùn tích tụ, giảm mùi hôi, lượng khí độc H2S, Nitrite,

Nitrate, Amoni,.. Việc sử dụng các vi khuẩn có lợi để quản lý hệ vi sinh

trong ao nuôi có tác dụng: làm sạch nền đáy ao, phân hủy chất hữu cơ hấp

thu xác tảo, làm giảm sự gia tăng lớp bùn ao; ức chế sự hoạt động và phát

triển của các vi khuẩn có hại; chuyển hóa các khí độc gây hại cho tôm

như NH3+, NO2

-, H2S…. Giúp ổn định tảo và màu nước ao nuôi; một số

chủng vi khuẩn khi sử dụng sẽ làm tăng hàm lượng ôxy, ổn định pH và

các chỉ số môi trường trong ao nuôi.

Hệ vi sinh vật trong chế phẩm còn tăng khả năng tiêu hoá và hấp

thụ thức ăn, nâng cao sức đề kháng bệnh tật trên tôm, tăng năng suất thu

hoạch và giảm chi phí sản xuất,…

12

1.3.3. Vi sinh quang tự dưỡng:

1.3.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn quang tự dưỡng:

Nhóm vi khuẩn có khả năng quang hợp nhờ có sắc tố lục. Chất diệp

lục vi khuẩn khác với chất diệp lục của thực vật. Vi khuẩn quang hợp

(VKQH) không sử dụng nước làm nguồn hidro như thực vật và không

tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi. Chúng sử dụng nguồn hidro là sunfit

thiosunfat, hidro tự do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sản phẩm phụ

dạng oxi hóa. Bao gồm: vi khuẩn lưu huỳnh lục, vi khuẩn tía lưu huỳnh

và vi khuẩn tía không lưu huỳnh.

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài chỉ sử dụng vi khuẩn quang

hợp tía không lưu huỳnh chi Rhodopseudomonas sp, và Rhodospirillium sp.

Tác dụng của quang hợp thực vật là dùng H2O để cung cấp H, dùng

CO2 để cung cấp nguồn C, qua tác dụng quang hợp mà sản sinh ra chất

hữu cơ và nhả ôxy, còn tác dụng quang hợp của vi khuẩn quang hợp là

dùng H2S để cung cấp H, dùng CO2 để cung cấp nguồn C, qua phản ứng

quang hợp sản sinh ra chất hữu cơ, không thể nhả ôxy. Phương trình phản

ứng của chúng như sau:

Phương trình tác dụng quang hợp thực vật là:

H2SO + CO2 ánh sáng (CH2O) + O2

Phương trình tác dụng quang hợp của vi khuẩn quang hợp là:

H2SO + CO2 ánh sáng (CH2O) + H2O + 2S

Về mặt phân loại, vi khuẩn quang hợp thuộc ngành vi khuẩn, lớp chân

khuẩn, bộ khuẩn ốc hồng. Hiện đã biết vi khuẩn quang hợp của bộ khuẩn

này gồm hai bộ phụ, bốn họ, mười chín giống, khoảng 49 loài. Hiện nay,

vi khuẩn quang hợp, sử dụng trong nuôi thuỷ sản thông thường phần lớn

là một loại vi khuẩn trong họ khuẩn Bradyrhizobiaceae, nhất là khuẩn giả

đơn bào mầu hồng ở ao đầm có nhiều.

13

Vi khuẩn quang hợp là loại vi sinh vật trong thuỷ quyển, phân bố rộng

rãi ở ruộng nước ao hồ, sông ngòi, hồ, biển và trong đất, đặc biệt là trong

đất bùn dưới nước bị vật hữu cơ ô nhiễm số lượng tương đối nhiều.

Vi khuẩn quang hợp do sự khác nhau về giống loài và môi trường mà

hình dạng không như nhau, có loại hình que, hình lưỡi liềm, hình tròn,

hình cầu v.v Vật bồi dưỡng dịch thể của chúng vì chứa sắc tố khác nhau

mà có nhiều màu đỏ, nâu, vàng,… Ðặc điểm của loại vi khuẩn này là tính

thích ứng mạnh, bất kể là trong nước biển hay trong nước ngọt, trong

những điều kiện khác nhau có ánh sáng mà không có ôxy hoặc tối tăm mà

có ôxy đều có thể lợi dụng chất hữu cơ (axit béo cấp thấp amino axít,

đường) để phát triển. Trong điều kiện không có ôxy, có ánh sáng, có thể

lợi dụng các sunfit, phân tử H hoặc vật hữu cơ khác làm thành dioxide

carbon CO2 cố định tiến hành tác dụng quang hợp; trong điều kiện có ôxy

và tối tăm, chúng có thể lợi dụng vật hữu cơ như axit béo cấp thấp tạo

nguồn carbon để tiến hành tác dụng quang hợp. Hai phương thức quang

hợp này có thể biểu thị bằng phương trình dưới đây :

Trong điều kiện không có oxy - có ánh sáng:

2H2S+ CO2 tác dụng quang hợp -> (CH2O) + H2O + 2S

Trong điều kiện có ôxy mà tối tăm:

C4H6O5 + H2O ánh sáng 2(CH2O) + 2CO2 + 2H2

Phương trình tổng quát quá trình quang hợp:

CO2 + 2H2A + hV [CH2O]n + 2A + H2O

Ở tảo hay thực vật bậc cao: H2O đóng vai trò của H2A. Ở vi khuẩn

quang hợp: H2A có thể là các chất hữu cơ đơn giản các hợp chất khử của

lưu huỳnh hoặc hydro phân tử. Trong đó, các chất hữu cơ vừa đóng vai

trò làm chất điện tử, vừa làm nguồn cacbon trong quá trình quang hợp dị

dưỡng.

14

Từ phương trình trên có thể thấy rằng tác dụng quang hợp mà vi

khuẩn quang hợp tiến hành về hình thức có sự sai khác rất lớn với thực

vật, đồng thời tương đối phức tạp. Ưu điểm của nó là có thể lợi dụng

phương thức quang hợp kiểu phi thực vật này để thích ứng với môi

trường sinh tồn khác nhau [15].

Hiện nay, ở Trung Quốc qua hơn hai mươi năm nghiên cứu, phát triển

đã phát triển vi khuẩn quang hợp thành chế phẩm sinh vật thương mại

hoá vừa có các dạng nước, vừa có dạng bột. Ngoại quan của dạng nước là

chất lỏng màu nâu hồng, dạng bột khác nhau theo sự khác nhau của vật

mang, hàm lượng khuẩn cũng khác nhau tuỳ theo nhà sản xuất, số lượng

khuẩn sống ở mỗi ml là mấy chục triệu hoặc mấy trăm triệu con.

Ở nước ta nhiều cơ sở trong nước sản xuất đưới dạng dung dịch.

1.3.3.2. Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi

khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh:

a. pH:

Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra trong môi trường có pH

3 – 11 (Hunter và cs, 2009) . Vi khuẩn tía sinh trưởng và phát triển ở pH

tối ưu khoảng 6 – 7[17].

b. Cường độ ánh sáng:

Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía sử dụng ánh sáng để quang hợp, phát

triển mạnh ở môi trường có ánh sáng đỏ. Vi khuẩn không lưu huỳnh màu

tía có thể phát triển quang dưỡng và trong bóng tối (Hunter và cs,

2009)[17].

c. Nhiệt độ:

Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra ở nhiệt độ lên tới 570C và

xuống tới 00C (Castenholz và Pierson, 1995). Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn tía ở 300C[18].

15

d. Các yếu tố khác

Nhiều loài vi khuẩn tía có thể sinh trưởng quang dưỡng với sulfide

như là chất cho điện tử với nồng độ nhỏ hơn 2 mM (tương đương

64mgS2-/L). Nếu trong môi trường sống có nồng độ sulfide quá cao sẽ ức

chế sự sinh trưởng của chúng (Hunter và cs, 2009). Ngoài ra, nồng độ

NaCl trong môi trường cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn

tía. Có loài sống được trong môi trường nước biển có độ mặn từ 8 –

11%NaCl[17].

1.3.3.3. Ứng dụng của VKQH tía trong nuôi trồng thuỷ sản:

Ứng dụng của vi khuẩn quang hợp và nguyên lý của nó trong nghề

nuôi trồng thuỷ sản chủ yếu có mấy mặt sau:

a. Làm sạch chất nước của nước nuôi trồng thủy sản:

Trong quá trình nuôi trồng thuỷ sản, do sự tăng lên của cặn bã thức ăn

vật phế thải của đối tượng nuôi tăng lên, chất nước bị ô nhiễm. Phương

pháp truyền thống trước đây là thay một lượng nước lớn, xả bỏ nước cũ

bị ô nhiễm, bơm vào nước sạch mới. Song do sự hạn chế của hàng loạt

nguyên nhân, biện pháp này chỉ trị ngọn chứ không trị từ gốc, theo sự ô

nhiễm ngày càng nghiêm trọng của sông, cái gọi là thay nước chỉ là nói

một cách tương đối thôi, nước ô nhiễm thải ra từ trên thượng du, ở hạ du

lại trở thành nước sạch được đưa vào nguồn nước nuôi. Cứ tiếp tục như

thế, không ngừng ô nhiễm, nước sau khi bị ô nhiễm, vật hữu cơ tăng lên,

nồng độ các ion NH3+, N tăng lên có thể ảnh hưởng đến việc kiếm mồi

sinh trưởng của tôm cá mà dẫn đến bệnh tật. Cho nên nói nuôi cá trước

hết là nuôi nước là vì vậy, nước trong sạch, loài cá ăn mồi nhiều, sinh

trưởng nhanh, bệnh tự nhiên ít, và ngược lại. Nếu trong quá trình nuôi,

định kỳ cho một lượng vi khuẩn quang hợp thích hợp vào nước nuôi, có

thể làm mất ion N trong nước và các vật sinh ra do phân giải vật hữu cơ

khác từ đó đạt tới việc không thay nước mà vẫn có thể giữ được môi

trường nước tốt. Ðiều đó chủ yếu là do vi khuẩn quang hợp ở trong nước

có thể lợi dụng vật hữu cơ làm vật cung ứng H để tiến hành tác dụng

quang hợp, đồng thời với việc loại bỏ vật ô nhiễm, bản thân vi khuẩn

16

quang hợp cũng sinh sôi tăng trưởng, đạt tới tác dụng tuần hoàn ưu việt.

Tư liệu cho biết, tưới đều toàn ao từ 5 - 15ppm vi khuẩn quang hợp (nồng

độ là 40 triệu con/ml), 3 tiếng đồng hồ có thể cố định được vật hữu cơ,

làm cho nước trong sạch, Một ao có diện tích nuôi 30 mẫu nuôi bốn loại

cá nuôi lớn, liên tục ba ngày cá nổi đầu, ngay cả cá rô phi, cá chép vây đỏ

cũng nổi lên mặt nước. Chiều ngày thứ ba tưới đều 200 kg vi khuẩn

quang hợp (nồng độ 300 triệu con/ml), sau ngày thứ tư thì không thấy nổi

đầu, nước trở nên trong sạch. Ngoài ra, trong ao nuôi tôm sử dụng vi

khuẩn quang hợp, có thể làm cho tổng lượng nitrogen cơ bản ổn định ở

dưới 20 mg/m3, độ pH, hàm lượng ôxy giữ ở mức bình thường. Trong

thời kỳ nuôi tôm giống, cho vi khuẩn quang hợp làm cho suốt thời gian

nuôi giống không cần thay nước vẫn bảo đảm chất nước tốt, tỷ lệ giống

nuôi có thể nâng cao 66,6%, dùng để làm sạch nước nuôi cá chình

NH3+ có thể giảm 57,1%, hàm lượng ôxy tăng cao 54,6%[17] .

Trong công nghiệp, vi khuẩn quang hợp thường dùng để xử lý nước ô

nhiễm. Trong tự nhiên, nước bẩn nồng độ cao, trước tiên do vi khuẩn dị

dưỡng phân giải các carbohydrate, lipid, protein thành vật chất phân tử

cấp thấp như axit béo cấp thấp, aminô axit. Tiếp đó vi khuẩn quang hợp

lợi dụng chất hữu cơ phân tử, lượng nhỏ như axit béo cấp thấp mà sinh

sôi rất nhanh, xử lý nước bẩn BOD 95% trở lên. Sau đó, do loài tảo và vi

sinh vật bùn đất hoạt tính làm cho BOD xuống tới tiêu chuẩn xả bỏ. Quá

trình làm sạch nước bẩn vật hữu cơ trong công nghiệp chia thành 3

bước[18]:

* Vật hữu cơ cao phân tử nồng độ cao khuẩn dị dưỡng axit béo phân tử

thấp.

* Axit béo phân tử thấp vi khuẩn quang hợp vật hữu cơ nồng độ thấp.

* Vật hữu cơ nồng độ thấp loài tảo, bùn đất hoạt tính nước thải được làm

sạch.

b. Dự phòng và điều trị bệnh:

Do sự sinh sôi nhanh chóng của vi khuẩn quang hợp, mà hạn chế sự

sinh sôi của khuẩn khác gây bệnh. Vi khuẩn quang hợp có tác dụng rõ rệt

17

đối với bệnh đỏ vỏ tôm, bệnh đen mang, bệnh khuẩn dạng sợi. Và khuẩn

quang hợp trong quá trình chuyển hoá có thể sinh ra loại men chống độc

tố bệnh (men phân giải trypsin, có tác dụng dự phòng và chữa trị bệnh

tôm cá). Vi khuẩn quang hợp có thể điều trị bệnh loét mang của cá chép

do vi khuẩn dính gây nên. Theo thông báo khác, dùng vi khuẩn quang

hợp ít hơn 10 lần, đối với cá chép bị bệnh có lỗ, cá chình bị bệnh mốc

nước và đỏ vây, bệnh cảm nhiễm do bị sát thương của cá trác đen, tắm

thuốc từ 10 -15 phút, sau lại đem nuôi trong nước có thả một lượng thích

hợp vi khuẩn quang hợp, độ nửa tháng có thể chữa khỏi. Sử dụng lâu dài

trong ao nuôi cua, có thể tránh xảy ra bệnh thiếu máu.

c. Làm thức ăn cho ấu thể tôm, cá:

Vi khuẩn quang hợp có giá trị dinh dưỡng rất cao hàm lượng prôtêin

đạt trên 60%, đồng thời còn chứa vitamin nhóm B phong phú và folacin,

sinh vật tố và chất thúc lớn sinh vật chưa biết, chấy lượng của nó thì men

không có cách gì so sánh được. Còn khuẩn thể của vi khuẩn quang hợp

rất nhỏ (chỉ là 1/20 của tảo tiểu cầu), do đó, còn là thức ăn vừa miệng

nhất của ấu thể cá, tôm, nhuyễn thể có vỏ. Trong quá trình nuôi ấu thể cá,

tôm, nhuyễn thể có vỏ ứng dụng vi khuẩn quang hợp có thể nâng cao tỷ lệ

sống, tăng nhanh sự sinh trưởng, giảm bớt lượng nước thay.

Cuối cùng nguyên nhân của nó:

- Một là làm sạch nước, cải thiện môi trường nước.

- Hai là làm thức ăn cho ấu thể.

- Ba là vi khuẩn quang hợp sau khi trở thành loài ưu thế của môi

trường nước do vật chất sinh trưởng do nó giải phóng ra có thể làm cho

một số nguyên nhân bệnh khó tồn tại, có thể giảm bớt bệnh của ấu thể, từ

đó nâng cao tỷ lệ sống của ấu thể.

d. Làm chất phụ gia cho thức ăn có chất lượng:

Vi khuẩn quang hợp gồm vật chất sống có nhiều loại công năng thúc

đẩy sinh trưởng và vật hoá hợp chất béo (nhân tố sinh trưởng) v.v Do đó,

nó có thể trực tiếp làm chất phụ gia cho thức ăn. nếu trong thức ăn cho

thêm vi khuẩn quang hợp thì không cần phải thêm chất phụ gia vào thức

18

ăn nưã. Vì giá thành không cao, thông thường trong thức ăn tăng 0,5 -1%

là có thể tăng rõ rệt hiệu quả thức ăn và tỷ lệ tăng trọng. Căn cứ kết quả

thí nghiệm cho biết, vi khuẩn quang hợp dùng cho nuôi cá chình Nhật

Bản tỷ lệ tăng trọng có thể cao tới 10%, dùng để nuôi tôm he dưới 8 mm,

mỗi mẫu có thể tăng sản lượng 12% dùng để nuôi cá nước ngọt, mỗi mẫu

có thể tăng sản lượng 25%.

Nói chung:

Vi khuẩn tía được coi là nhóm quang dưỡng quan trọng bởi vì chúng

có thể khử một chất làm hôi môi trường sulfide, và đóng góp vật chất

hữu cơ trong các môi trường thiếu ôxy do năng lực tự dưỡng của chúng.

Hơn nữa chúng còn có khả năng tiêu thụ các hợp chất hữu cơ, trong đó

vai trò của chúng là vi sinhvật quang dị dưỡng. Ngoài ra, chúng còn là vi

sinh vật mô hình cho các nhà khoa học nghiên cứu sự đa dạng phân tử

của quá trình quang hợp (Hunter và cs, 2009). Sinh khối của chúng còn

được sử dụng để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học có giá trị như

ubiquinine, các chất kháng sinh, enzyme và làm thức ăn trong chăn nuôi

gia cầm và nuôi trồng thủy sản (Sasikala và Ramana, 1995)[18][29].

Chung et al., (2006) đã nghiên cứu sử dụng chủng vi khuẩn quang

hợp tía Chlorobiaceae để xử lý Sulfide trong khí biogas với hiệu xuất đạt

được 99,9%. Theo kết quả nghiên cứu khi nồng độ Sulfide từ 10 – 150

ppm thì hiệu quả xử lý của chủng vi khuẩn quang hợp tía Pseudomonas

Putida đạt 96%[20].

Năm 2017 nghiên cứu hệ sinh thái vi sinh vật của hồ Cadagno

(Ticino, miền nam Thụy Sĩ) đã được nghiên cứu chuyên sâu để tìm hiểu

cấu trúc và hoạt động của cộng đồng vi khuẩn lưu huỳnh quang hóa

anoxygenic sống trong kỵ khí. Người ta đã phát hiện ra rằng vi khuẩn

lưu huỳnh màu tím ( Thiodictyon syrophicum ) chủng Cad16 T, thuộc họ

Chromatiaceae, đã khắc phục khoảng 26% tổng số carbon vô cơ, cả ban

ngày và ban đêm [21].

Ngoài ra, sinh khối của vi khuẩn tía rất giàu protein và vitamin, đặc

biệt là vitamin B12. Tại Ấn Độ có công nghệ sản xuất sinh khối của vi

khuẩn tía ở dịch ly tâm từ phân gia súc dùng để làm thức ăn (cùng vi tảo)

19

cho tôm hoặc cho ngao đạt hiệu quả rất khả quan. Có lẽ đây là thức ăn

rất thích hợp cho thủy sản thân mềm và đang được ưa chuộng trên thị

trường thế giới (Lương Đức Phẩm, 1998)[22].

Ở Việt Nam, nhóm vi khuẩn này đã và đang được chú trọng phân lập

và tuyển chọn để ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau như xử lý nước

thải đậm đặc hữu cơ (Đỗ Thị Tố Uyên và cs, 2003)[23], phân hủy các

hydrocacbon mạch vòng (Đinh Thị Thu Hằng và cs, 2003)[23].

1.4. DỊCH BỆNH TÔM:

1.4.1. Tình hình bệnh tôm trên thế giới:

Cùng với sự ra đời của việc sản xuất tôm công nghiệp, dịch bệnh

cũng xuất hiện. Từ cuối thập niên 60 đến nay nhiều công trình đã được

công bố (Fujimura 1966, Linh 1969, Fujimura và Linh 1969, Johnson

1977, 1980....), nhiều bệnh tôm đã được miêu tả đầy đủ và một số

phương pháp phòng trừ hữu hiệu, tuy nhiên vẫn còn nhiều bệnh chưa phát

hiện hoặc chưa biết cách phòng trị.

Năm 1988 do sự xuất hiện của bệnh tôm, sản lượng tôm ở Đài Loan

chỉ còn 45.000 tấn, giảm 50% so với các năm 1980 -1987 (90.000

tấn/năm), hiện nay các nước có nghề nuôi tôm rất phát triển như: Thái

Lan, Indonesia, Philippin, Đài Loan...đang phải đương đầu với một số trở

ngại lớn đó là dịch bệnh.

Theo một cuộc khảo sát của Hiệp hội Nuôi trồng Thủy sản Toàn cầu

[24], dịch bệnh đã vượt qua chi phí sản xuất để trở thành thách thức lớn

nhất đối với ngành tôm thế giới. Tại Hội nghị Lãnh đạo Nuôi trồng Thủy

sản Toàn cầu tại Dublin, Jim Anderson, Giáo sư tại Đại học Florida, cho

thấy những vấn đề với dịch bệnh ở các trang trại tôm đã trở thành nỗi lo

lớn nhất cho các nhà sản xuất tôm được khảo sát vào năm 2017. Các bệnh

chính ảnh hưởng đến tôm nuôi bao gồm hội chứng tôm chết sớm (EMS),

hội chứng đốm trắng, hội chứng Taura, virus hoại tử phổi và hoại tử

nhiễm trùng, bệnh đầu vàng và nhiễm trùng vibrio.

20

Đầu năm nay, Australia đã cấm nhập khẩu tôm nguyên liệu sau khi

quốc gia này báo cáo trường hợp đầu tiên của họ về bệnh đốm trắng.

Trong khi đó, Mỹ ghi nhận trường hợp đầu tiên của EMS vào mùa hè

này. Anderson lưu ý năm ngoái, dịch bệnh không nằm trong ba thách

thức hàng đầu.

Theo cuộc khảo sát, ngành tôm Châu Á đang quan tâm nhiều đến dịch

bệnh hơn ngành tôm ở châu Mỹ Latinh. Ở Trung Quốc, các vấn đề về

dịch bệnh đã làm cho sản lượng tôm có thể suy giảm.

Xếp hạng thứ hai trong số các thách thức trên toàn cầu là chất lượng và

sự sẵn có của tôm giống, trong khi đứng thứ ba là sự tiếp cận với tôm bố

mẹ sạch bệnh.

Bệnh xuất hiện là một vấn đề tất yếu trong nghề nuôi tôm công

nghiệp bởi do sự hiểu biết thiếu đồng bộ về kỹ thuật nuôi và phương pháp

phòng trị. Mầm bệnh tích tụ dần trong quá trình nuôi, mức phát triển đã

vượt quá khả năng tái sinh của nguồn tự nhiên, làm ô nhiễm môi trường,

môi trường bị thoái hoá và dịch bệnh xảy ra. Một số tác nhân gây bệnh.

- Do virus: các họ Baculoviridae, Pikornoridae, Reoviridae....

- Do vi khuẩn: các giống Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas....

- Do động vật đơn bào: Zoothamnium, Epistylis, Vorticella....

- Một số tác nhân khác: Nấm (Lagenidium), tảo trùng

(Haematonidium), rong tảo (Schiothrix Calcida), giun tròn, giáp xác chân

bèo (Caligus epidemicus)[24].

1.4.2. Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam:

Từ năm 1987 – 1993 cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm công

nghiệp dịch bệnh tôm tại Việt Nam bắt đầu xuất hiện.

Cuối năm 1993 đến nay dịch bệnh tôm đã báo động trên toàn quốc,

làm thiệt hại hàng nghìn tỷ đồng (1994 thống kê của Bộ Thủy Sản), thiệt

hại lớn nhất là khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.

Cuối tháng 04-1994 và từ tháng 06-1994 đến 08-1994 tôm nuôi bị

chết hàng loạt ở các tỉnh phía Nam và trên toàn quốc. Năm qua dịch bệnh

21

xảy ra trên toàn quốc, các tỉnh từ Nam, Phú Yên trở vào đều không nuôi

được tôm sú (Penaeus monodon), tôm bị bệnh và chết khoảng 1-1,5 tháng

tuổi.

Theo Cục Thú y, tính đến hết tháng 5/2014 [25], dịch bệnh trên tôm

nuôi đã gây hại trên địa bàn 232 xã, phường, thị trấn của 60 huyện, thị,

thành phố thuộc 19 tỉnh, thành. Tổng diện tích thiệt hại khoảng 14.000

ha, trong đó do dịch bệnh gây hại 10.000 ha, còn lại là do tác nhân môi

trường. Đến nay, đã xác định diện tích bị nhiễm bệnh đốm trắng khoảng

5.000 ha, bệnh hoại tử gan tụy cấp 1.700 ha và một số bệnh khác. Tuy

nhiên, một điều đáng lưu ý là hiện vẫn còn 6 tỉnh có dịch bệnh bùng phát

trên tôm nuôi, nhưng lại chưa xác định được tác nhân gây bệnh. Đây là

mối nguy lớn của ngành tôm Việt Nam.

Dịch bệnh được cảnh báo nhiều, đã có dự phòng từ trước, tuy nhiên,

không ít người nuôi tôm vẫn điêu đứng vì tôm chết dẫn đến trắng tay, nợ

nần. Năm trước, nhà quản lý cho rằng “do người nuôi tôm” bởi nóng vội

thả nuôi nên không đảm bảo các khâu kỹ thuật. Tuy nhiên, sang năm nay,

khi các khâu kỹ thuật được đảm bảo thì lại xuất hiện yếu tố môi trường và

con giống chưa đảm bảo chất lượng. Điều này thì nằm ngoài tầm kiểm

soát của người nông dân, và lý do này thì cũng chẳng biết quy trách

nhiệm vào đâu. Tuy nhiên, kết quả điều tra 5 tháng đầu năm 2017 cho

thấy, diện tích tôm trên cả nước bị bệnh đốm trắng là 1.656,2ha, chiếm

khoảng 14,5% diện tích thiệt hại, trong đó tỉnh Cà Mau có diện tích bị

bệnh đốm trắng lớn nhất (chiếm 24,4% tổng diện tích bị bệnh của các

tỉnh), sau đó đến tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng, Bến Tre và các địa phương

khác. Đối với bệnh hoại tử gan tụy, diện tích bị bệnh là 1.557ha, chiếm

khoảng 13,6%, trong đó tỉnh Bạc Liêu có diện tích bị bệnh lớn nhất

(chiếm hơn 25,7% tổng diện tích tôm bị bệnh), tiếp đó là các tỉnh Sóc

Trăng, Kiên Giang, Trà Vinh... Ngoài ra, thời gian qua tôm nuôi cũng

xuất hiện các bệnh khác như đỏ thân, bệnh còi, bệnh phân trắng…[24].

Chương trình khảo sát nguyên nhân gây chết tôm nuôi ở khu vực

phía Nam và đề ra các giải pháp khắc phục đưa nghề nuôi tôm tiếp tục

phát triển do Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ Sản II chủ trị với sự tham

22

gia của Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản I, trường Đại học Thủy sản

Nha Trang, Chi cục Thú y Tp.Hồ Chí Minh. Tại Hội thảo, PGS - TS

Trang Sĩ Trung (Hiệu trưởng Trường ĐH Nha Trang) cho biết, tôm nuôi

hiện nay ngày càng phát sinh nhiều bệnh nguy hiểm, chính vì vậy việc

ngăn chặn hiệu quả các loại dịch bệnh trên tôm là nhiệm vụ quan trọng

quyết định đến đời sống của hàng vạn người nuôi trồng thủy sản và kim

ngạch xuất khẩu. Theo các chuyên gia, bà con ngư dân, chủ trang trại

muốn tránh thiệt hại cần điều trị đúng bệnh cho tôm nuôi. Để phòng trị

bệnh hoại tử gan tụy (gọi tắt là AHPND), biện pháp hàng đầu là dùng dầu

của các loài thực vật như Lavandula, Pinus sylvestris, Viola odorata,

Cosos nucifera... trộn với thức ăn. Hỗn hợp dầu thực vật này đã được

kiểm chứng cho thấy kiểm soát tốt bệnh AHPND. Bên cạnh đó, để phòng

và trị bệnh cho tôm nuôi hiệu quả, cần thay thế thuốc kháng sinh trong

nuôi trồng thủy sản, bổ sung các chất khoáng và probiotic trong thức ăn

của thủy sản nuôi,… Cùng với việc tăng cường phòng, trị bệnh tốt cho

tôm, Trung tâm Khuyến nông quốc gia và các nhà khoa học khuyến cáo

người nuôi tôm nên áp dụng các mô hình hiệu quả như mô hình nuôi tôm

thẻ chân trắng theo VietGAP, mô hình nuôi tôm theo công nghệ Biofloc,

mô hình nuôi luân canh tôm sú - rong câu,...Tuy có đạt được một số kết

quả nhất định nhưng vẫn còn nhiều vấn đề phải nghiên cứu tiếp [24] .

Dịch bệnh tôm đã gây thiệt hại lớn về kinh tế trong năm qua và ảnh

hưởng rất sâu rộng về mặt xã hội. Theo nguồn tin của Bộ Thủy Sản

nguyên nhân gây chết tôm hàng loạt trong thời gian qua là do 50% từ con

giống, còn lại do môi trường (bao gồm cả yếu tố hữu sinh và vô sinh)

trong đó sự biến động về thủy lý hoá môi trường là chủ yếu (Nhiệt độ,

S%0, pH...).

Các bệnh thường gặp ở Việt Nam:

Bệnh phát sáng; Bệnh hoại tử các phần phụ; Bệnh đỏ trên ấu trùng

tôm; Bệnh vi khuẩn dạng sợi; Bệnh nấm Lagenidium ở ấu trùng; Bệnh do

nấm Fusarium; Bệnh động vật đơn bào; Bệnh tảo bám trên tôm ; Bệnh ở

mang tôm; Bệnh mềm vỏ Kitin; Bệnh đỏ; Bệnh hoại tử cơ; Bệnh bọt khí;

Bệnh cong thân tôm; Bệnh do pH thấp [26].

23

1.4.3. Vi khuẩn Vibrio sp:

Hiện nay chúng ta đang đương đầu với bệnh phát sáng do Vibrio gây

ra trên tôm, vi khuẩn Vibrio chịu được nồng độ muối cao cho nên chúng

có thể sống được ở môi trường nước lợ hay nước mặn, thường sống ở

tầng nước biển ấm, sống trên bề mặt động vật biển, Vibrio là vi khuẩn

phát sáng sống bám trên động vật chân đầu và ruột của động vật nước.

khoảng 10 năm gần đây độc tính của Vibrio được phát hiện trên động vật

thủy sinh, đặc biệt là họ penaeids ở Châu Á và Châu Úc.

Một loại enzym ngoại bào được sản xuất bởi một vài loài Vibrio

được cô lập từ nước biển, cá và động vật vỏ giáp, quan sát thấy rằng loài

enzym protease này có độc tính. Phần lớn enzym này được tìm thấy trên

loài Vibrio anguillarum bởi vì chúng là nguyên nhân gây bệnh cho cá. Có

2 loại protease được sản xuất bởi Vibrio alginolyticus 1939. Một loại

protease kim loại sản xuất bởi Vibrio anguillarum Szy và một loại serin

protease sản xuất bởi Vibrio alginolycucs chúng gây độc trên ấu trùng

Ostrea edulis, Epinephelus malabaricus và Penaeus japonicus. Có 3 loại

protease kim loại kiềm ngoại bào dễ nhạy cảm với EDTA được tạo ra bởi

loài Vibrio harveyi được cô lập từ nước biển . Tuy nhiên chưa có thông

tin nào cho biết về việc những protein từ Vibrio harveyi gây bệnh cho

động vật biển.

Gần đây trên loài tôm có những đốm trơn do nhiễm những loài

Vibrio phát sáng được phát hiện ở nông trại Taiwan. Loài Vibrio harveyi

có khả năng gây bệnh và tạo ra sản phẩm ngoại bào khác nhau. Mới đây

các nhà nghiên cứu đã tìm ra loại cystein protease được sản xuất bởi loài

Vibrio 820514 thuần khiết và có đặc điểm chính yếu là gây độc.

Khảo sát sự ảnh hưởng của vi khuẩn, sản phẩm ngoại bào và cystein

protease thuần khiết của loài 820514 trên máu và thành phần nguyên sinh

chất của Penaeus monodon ở trong phòng thí nghiệm và ngoại thực tế.

Phản ứng cystein protease với ảnh hưởng chủ yếu thành phần nguyên

sinh chất, sự đông tụ máu và sự gây bệnh ở tôm sú đang được thảo luận

[2][27].

24

1.5. CHẤT HỮU CƠ TRONG CÁC AO NUÔI TÔM:

1.5.1. Nguồn gốc chất hữu cơ trong các ao thủy sinh:

Nguồn chất hữu cơ trong ao một phần là xác của thảm thực vật ở

vùng đất ngập nước, chất mùn là phần chính của khoáng chất hữu cơ.

Chất hữu cơ trong bùn ao cũng chứa một lượng sợi gỗ. Theo Chotiputta

et.al chất hữu cơ trong bùn ao cho sự phát triển của quá trình nuôi tôm ở

Peachuab Khirikhkan, Nakorn Sri Thamarat tỉnh Surattai ở Thái Lan

khoảng 0,002 và 8,12%. Trong hồ nuôi tôm chất hữu cơ chứa khoảng 10

– 40% (Boyd và cộng sự, 1998 ). Chất hữu cơ ở khu vực nông trại tôm ở

tỉnh Trad Thái Lan chứa khoảng 20,66% [28].

1.5.2. Chất hữu cơ từ nguồn nước cấp:

Chất hữu cơ được đưa vào các ao nuôi thay đổi theo vị trí của ao

nuôi. Trong nước tự nhiên chất hữu cơ có hàm lượng 1-30mg/lít. Chất

trầm tích trong đất ở nông trại tỉnh Samutrongkron chứa trung bình 3,1%

chất hữu cơ. Tỉ lệ chất trầm tích trong đất khoảng hơn 4 tháng dày 8,5cm

[29].

1.5.3. Chất hữu cơ từ thức ăn:

Các ao nuôi tôm thâm canh có môi trường rất phú dưỡng, nguyên

nhân là do việc chúng ta đưa quá nhiều thức ăn nhân tạo vào ao nuôi. Các

loại thức ăn cho tôm thường có hàm lượng rất cao (30-40%). Vì vậy trên

92% đạm trong các ao nuôi tôm có nguồn gốc từ thức ăn (Briggs &

Funge – Smith) [30].

Điều đáng quan tâm là thức ăn được tôm giữ lại để tạo sinh khối là

rất thấp (dưới 17%). Người ta tính toán thấy rằng: 15% thức ăn của tôm

bị thất thoát do tôm không ăn được, 48% bị bài tiết ra ngoài, do lột vỏ,

hoặc để duy trì các hoạt động sống và 20% thải ra qua phân (Primavera).

Theo Briggs & Smith đưa ra chỉ 14% thức ăn đưa vào cơ thể của tôm còn

86% là chất thải.

25

Với một lượng lớn chất dinh dưỡng thải ra môi trường hàng ngày

như vậy nên kích thích phytoplankton và vi khuẩn phát triển mạnh, tiếp

theo đó là macrozooplankton phát triển theo. Hậu quả là quá nhiều chất

hữu cơ tích tụ trong nước và trong bùn đáy[30].

1.5.4. Chất hữu cơ từ phân bón:

Trong quá trình nuôi tôm để gia tăng các phiêu sinh thực vật cũng

như các động vật nhỏ dưới đáy ao phát triển tạo thêm nguồn thức ăn thiên

nhiên người ta thường cho thêm phân hữu cơ. Bón phân cho ao cũng có

mục đích thay cho chất dinh dưỡng đã bị đẩy ra khỏi ao khi ta thay nước

trong ao. Các loại phân bón hữu cơ thường được dùng cho ao hồ là: Phân

gà, phân trâu bò, phân heo, phân vịt, cám gạo, bột hạt bông, các phụ

phẩm của công nghệ mía đường v.v…

Phân hữu cơ cung cấp thức ăn bằng cách nhả dần các chất dinh

dưỡng qua hoạt động của các vi khuẩn, nhờ vậy các ấu trùng của tôm có

thể sử dụng ngay được khi chúng vừa được chuyển vào ao. Tuy nhiên khi

bón phân phải sử dụng đúng liều lượng, nếu bón quá nhiều sẽ gây ô

nhiễm môi trường nước vì phân của động vật có chứa 15-25% chất khô

và 93-95% chất hữu cơ [28].

1.5.5. Chất hữu cơ hình thành trong quá trình nuôi tôm:

Cường độ chất hữu cơ trong hồ nuôi tôm lớn hơn nhiều trong hồ

nuôi cá. Chất hữu cơ trong hồ nuôi tôm chứa từ 10-40%, những loại chất

này thường chứa axit, có nồng độ Nitơ thấp. Khi cải tạo hồ nuôi người ta

cần bón cần bón vôi, thông khí nhằm tăng lượng Nitơ. Sự phân huỷ chất

hữu cơ thay đổi theo thời gian và giảm dần về cuối vụ [28].

Chất hữu cơ lắng trong hồ nuôi tôm do từ thức ăn, phân và sản phẩm

trao đổi chất của tôm, số lượng thức ăn lắng xuống có liên quan đến

lượng thức ăn trong ngày và mật độ nuôi. Thức ăn cung cấp từ 400

kg/ha/ngày với mật độ 50con/m2 [28] và khoảng 607 kg/ha/ngày nuôi với

mật độ cao hơn (Wyban et.al 1988) [31 ]. Mức độ chất dinh dưỡng cao và

26

tiếp tục cung cấp CO2 có thể là nguyên nhân kích thích sự phát triển của

phytoplankton và hậu quả là làm tăng chất hữu cơ ở đáy ao.

Các nhà nuôi tôm đã tăng mật độ nuôi cùng với việc cung cấp thức

ăn cho chúng, khi mật độ tôm dày đặc thì thức ăn lắng xuống càng nhiều

vì một số lượng lớn thức ăn không tiêu thụ cùng với phân của chúng và

vỏ do tôm lột xác lắng xuống đáy ao. Các vi sinh vật có khả năng phân

huỷ chất hữu cơ giải phóng ra chất hữu cơ hoà tan trong nước tiếp theo

phytoplanktonphát triển và tạo sự nở hoa nước. Tế bào phytoplankton có

quãng đời ngắn, chúng chết tạo ra nhiều chất lắng xuống đáy hồ.

Kết quả của quá trình trên là môi trường hồ nuôi bị ô nhiễm, làm cho

tôm tăng trưởng kém, bị bệnh. Sự tích luỹ chất hữu cơ quá mức được coi

là sự nguy hiểm trong quá trình sản xuất tôm. Sự phân giải chất hữu cơ

đòi hỏi phải sử dụng nhiều Oxygen và sản phẩm tạo ra là chất độc, sự tích

luỹ chất độc như NH3 và CO2 gây hại cho tôm. Tỷ lệ sử dụng Oxygen cao

trong suốt quá trình phân giải chất hữu cơ của vi khuẩn làm cho môi

trường ao nuôi bị thiếu oxy, ở tình trạng này các vi khuẩn dị dưỡng có thể

sử dụng Sulfate và hợp chất oxy Sunfur tạo ra chất nhận điện tử và

Sulfide. Chất H2S là chất độc cao đối với nước. Nồng độ chất hữu cơ cao

tạo ra nhiều phiêu sinh thực vật phát triển ở trong hồ. Sự nở hoa nước là

nguyên nhân làm thay đổi lượng O2 và pH. Chất hữu cơ tích lũy gây hại

cho tôm và có lợi cho vi sinh vật [31].

Dựa trên nghiên cứu động học chất hữu cơ trong hệ thống nuôi tôm

thâm canh khép kín tại Thái Lan đã đưa ra một số kết luận sau :

- Thức ăn không tiêu hóa được là nguồn chất hữu cơ quan trọng nhất

gây ra các vấn đề về môi trường trong các ao nuôi thâm canh. Khoảng

61,7 – 68,1% thức ăn thừa bỏ lại trong ao như là chất bài tiết của tôm và

xác vỏ tôm .

- Chất dinh dưỡng giải phóng ra từ sự phân huỷ chất thải hữu cơ tạo

ra sinh khối tảo gấp 1,4 – 1,6 lần chất thải hữu cơ.

- Khoảng 18,4 đến 25% cacbon hữu cơ trong thức ăn tiêu hóa được

đồng hoá và sử dụng trong quá trình hô hấp của tôm.

27

- Chỉ còn khoảng 11,7- 13% cacbon hữu cơ trong thức ăn tiêu hóa

được đồng hoá và tạo năng suất tôm nuôi.

- Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến tỷ lệ hô hấp của tôm sú

(Penaeus monodon). Tỷ lệ hô hấp khác nhau ở các cỡ tôm khác nhau ở

nhiệt độ 200C; 250C và 300C có thể được miêu tả theo phương trình:

R = 0,352 W0,4770 200C

R = 0,3791W0,6810 250C

R = 1,0060W0,5376 300C

Với:

R: Tỷ lệ hô hấp (mgO2/h)

W: Trọng lượng tươi của cơ thể tôm (g)

- Sự gia tăng tốc độ dòng nước chảy tạo ra sự gia tăng tỷ lệ hô hấp

của tôm.

- Tôm hô hấp mạnh hơn khi nuôi với nền đáy bằng cát so với nền

đáy là đất hoặc chất dẻo plastic.

- Có sự tương quan thuận giữa tỷ lệ quang hợp trung bình với mật độ

tôm nuôi và tỷ lệ hô hấp trung bình với tỷ lệ tôm nuôi.

- Không có sự liên quan giữa số lượng chất hữu cơ đưa vào đáy ao

nền đất với mật độ tôm nuôi, giữa tỷ lệ hô hấp bùn đáy với mật độ tôm

nuôi, giữa lượng chất hữu cơ tích luỹ ở bùn đáy với mật độ tôm nuôi. Có

sự gia tăng quan trọng chất hữu cơ trong đáy ao khi nuôi với mật độ 60

con/m2.

- Thức ăn và sự quang hợp của phytoplankton là 2 nguồn chất hữu

cơ quan trọng nhất được đưa vào trong ao.

- Sự hô hấp của nước là một quá trình quan trọng nhất để giảm chất

hữu cơ trong ao tôm tiếp theo là sự hô hấp của bùn đáy và hô hấp của

tôm.

28

- Chỉ có một phần trăm nhỏ của toàn bộ chất hữu cơ đưa vào ao (5,6

– 6,8%) được giữ lại trong hồ khi thu hoạch tôm và lượng nhỏ hơn (2,1 –

3,4%) được thoát ra ngoài qua nước thải.

- Một lượng lớn chất hữu cơ cho vào (24,2 – 40%) tích lũy trong lớp

bùn đáy ao và hầu hết các chất hữu cơ tích luỹ lại nằm ở lớp trên cách

đáy ao 2 cm.

- Sự gia tăng mật độ tôm nuôi lên 60 con/m2 đã làm tăng lượng chất

hữu cơ đưa vào và phần lớn chất hữu cơ tích lũy trong ao. Điều này ảnh

hưởng quan trọng đến tỉ lệ sống, phát triển và hệ số chuyển hóa thức ăn

(FCR).

- Mật độ nuôi trong các hệ thống thâm canh khép kín. Dựa trên kết

quả nghiên cứu của tác giả nếu nuôi 40-45 con/m2 là thích hợp[32][33].

1.6. VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG CÁC QUÁ TRÌNH BIẾN

ĐỔI VẬT CHẤT TRONG AO NUÔI THỦY SẢN:

1.6.1. Phân huỷ các hợp chất carbon:

Vi sinh vật có vai trò hết sức quan trọng trong hệ thống tuần hoàn

vật chất trong thiên nhiên. Chúng phân hủy các chất thải, biến chúng

thành những chất vô hại. Hệ vi sinh vật trong các ao nuôi tôm rất phong

phú và chúng có khả năng rất lớn trong việc phân giải các chất hữu cơ.

Tuy nhiên chúng có phát huy tác dụng hay không còn tùy thuộc vào

môi trường xung quanh nơi chúng tồn tại: Nồng độ quá lớn các chất hữu

cơ trong ao, sự có mặt của các chất độc như các kim loại nặng, các loại

hóa chất độc hại ở nồng độ quá cao, độ pH, nhiệt độ quá thấp hoặc quá

cao, nhu cầu oxygen không thích hợp,… là những yếu tố rất quan trọng

ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý của vi sinh vật.

Phân giải cellulose: Cellulose là một trong những thành phần chủ

yếu của tổ chức thực vật. Trong xác thực vật thì thành phần chất hữu cơ

chiếm tỷ lệ cao nhất là cellulose. Hàm lượng cellulose trong xác hữu cơ

thay đổi từ 30 - 80 %. Cellulose là một hợp chất rất bền vững. Đó là loại

29

polysacchrit cao phân tử. Chúng cấu tạo bởi nhiều gốc -D-Glucose, liên

kết với nhau nhờ dây nối 1,4 glucozit.

Mỗi phân tử cellulose thường chứa 1.400 đến 10.000 gốc glucose.

Trọng lượng phân tử cellulose thay đổi khác nhau phụ thuộc vào từng

loại thực vật, thí dụ trọng phân tử cellulose ở bông là 150.000 -500.000

dalton còn ở cây gai là 1.840.000.

Trong tự nhiên có nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải celllulose.

Chúng có ý nghĩa rất lớn đối với vòng tuần hoàn cacbon trên trái đất và

làm sạch môi trường, tăng độ phì nhiêu của đất. Trong điều kiện hiếu khí

nhiều nhóm nấm mốc, nấm thượng đẳng, xạ khuẩn, vi khuẩn tham gia

phân giải cellulose.

Các nghiên cứu cho thấy có hai loại enzym chính để phân giải

cellulose là cellulase C1 và cellulase Cx. Enzym cellulase C1 tác động sơ

bộ và các phân tử cellulose thiên nhiên và biến chúng thành các các chuỗi

cellulose mạch thẳng, sau đó dưới tác động của cellulase Cx cellulose bị

phân hủy thành celobiose (hai phân tử glucose), loại đường này có thể tan

trong nước, và dưới tác dụng của glucosidase biến thành glucose.

Ngoài các vi sinh vật hiếu khí phân giải cellulose còn có các vi sinh

vật yếm khí, chúng thuộc các loài Clostridium thermocellum, Clostridium

omelianskii…

Phân giải tinh bột: Tinh bột (C6H10O5)n là những hợp chất

hydrocacbon cao phân tử, chúng có trong các loại nước thải sinh hoạt và

một số loại nước thải công nghiệp có dùng tới các nguyên liêu có tinh

bột. Tinh bột cấu tạo bởi hai thành phần chính là amyloz và amylopectin,

amyloz tan được trong nước nóng còn amilopectin tạo thành hồ keo trong

nước nóng. Trong tinh bột tỷ lệ amylose thường vào khoảng 25% còn

amylopectin chiếm khoảng 75 %.

Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột do chúng có hệ

enzym amylase như:

- amylase: (-1,4 D-glucan-4 glucanohydrolase ) thủy phân liên kết

1,4 trong tinh bột, tạo ra dextrin phân tử thấp và một lượng maltose.

30

- amylase: (-1,4 D-glucan- maltohydrolase) thủy phân liên kết 1,4

trong tinh bột,tạo ra malto và một lượng nhỏ các dextrin cao phân tử.

- amylase: (glucoamylase, -1,4 D-glucan gluchydrolase): thủy phân

liên kết 1,4 trong tinh bột và tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose [34].

1.6.2. Vai trò vi sinh vật trong việc chuyển hóa các hợp chất chứa

nitrogen:

Vi sinh vật là tác nhân hết sức quan trọng tham gia vào quá trình phân

hủy các hợp chất nitrogen, làm giảm nguồn đạm trong ao nuôi.

1.6.2.1. Phân giải protein amon hóa:

Protein: Protein là một trong những thành phần quan trọng của phiêu

sinh vật bị chết. Protein thường chứa 15,0 - 17,5 % nitơ (tính theo chất

khô). Muốn phân giải protein trước tiên vi sinh vật phải tiết ra các men

ngoại bào và phân cắt protein thành các phân tử nhỏ hơn (polipeptit,

oligopeptit, peptit). Các chất này tiếp tục được phân hủy thành các axit

amin nhờ các enzym peptidase, hoặc có thể được các vi sinh vật hấp thu

trực tiếp và phân hủy thành axit amin sau khi vào tế bào. Một phần các

axit amin được các vi sinh vật sử dụng trong quá trình sinh tổng hợp

protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải thành các sản

phẩm khác nhau như NH3, CO2,…

Các vi sinh vật không có hệ enzym ngoại bào phân hủy protein đòi

hỏi phải được cung cấp các peptit, oligopeptit, hoặc axit amin[37].

1.6.2.2. Vi sinh vật tham gia vào quá trình nitrat hóa (Nitrification):

Sau quá trình phân hủy protein amon được sinh ra, trong điều kiện

hiếu khí nhờ các vi khuẩn tự dưỡng amon được oxy hoá thành nitrate để

cung cấp cho tảo và thực vật bậc cao. Quá trình tự dưỡng của vi khuẩn

nitríte hóa (Nitrosomonas, Nitrobacter ) tiến hành như sau :

NH4+ + 1,5 O2 Nitrosomonas NO2

- + 2 H + + H2O + 273 kJ

31

NO2- + 0,5 O2 Nitrobacter NO3

- + 75 kJ

Và toàn bộ :

NH4 + 2 O2 NO3 + 2H+ + H2O + 350 kJ

Năng lượng sinh ra được sử dụng để thực hiện các qúa trình sinh tổng

hợp, tạo tế bào mới, và một phần thoát nhiệt. Điều kiện chung cho sự phát

triển các vi khuẩn nitrite hóa là pH: 5,5 - 9 nhưng tốt nhất là 7,5, khi pH

dưới 7 vi khuẩn phát triển chậm lại, oxy hòa tan 0,5 mg/l, nhiệt độ từ 5 -

40oC.

Nitrat là quá trình oxy hóa NH3 thành HNO3. Vi sinh vật nhận được

năng lượng cho hoạt động sống của mình thông qua quá trình này. Việc

oxy hóa đi kèm với việc đồng hóa CO2. Các vi sinh vật thực hiện quá

trình này là các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng vô cơ và thuộc loại hiếu

khí bắt buộc.

Nitrate hóa được thực hiện qua hai giai đoạn:

Giai đoạn đầu oxy hóa NH3 thành nitrite và được thực hiện bởi một số

giống vi khuẩn gọi chung là vi khuẩn nitrite hoá. Một số giống sau đây

thường được nhắc tới:Nitrosomonas; Nitrosocystis; Nitrosococcus;

Nitrosolobus; Nitrosospira. Tất cả các vi sinh vật này đều giống nhau về

mặt sinh lý - sinh hóa, nhưng khác nhau về đặc điểm, hình thái và cấu

trúc tế bào.

Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào

nhỏ, hình bầu dục, kích thước 0,4-1,0x0,9-2,0m. Trên môi trường lỏng

Nitrosomonas trải qua một số phase phát triển tùy thuộc vào một số điều

kiện. Hai pha chủ yếu là: phase di động - khi đó tế bào có một tiên mao

hay một chùm tiên mao và pha tập đoàn khuẩn nhầy (zooglea) - cấu tạo

bởi các tế bào không di động.

Giai đoạn thứ hai của quá trình nitrate hóa liên quan với việc oxy hóa

HNO2, thành HNO3. Các vi khuẩn gây ra quá trình này gồm có:

32

Nitrobacter winogradskyi, Nitrobacter agilis, Nitrospina gracilis,

Nitrococcus mobilis. Tế bào Nitrobater có đặc điểm đa hình thái

(polymorphism): trong dịch nuôi cấy thường có dạng hình que tròn, hình

hạt đậu, hình trứng, hình quả lê, di động bằng đơn mao hoặc không di

động. Điều đó liên quan đến sự tồn tại ở chung một chu kỳ phát triển xác

định đặc trưng đối với các vi khuẩn mọc chồi. Trong những điều kiện

không thuận lợi Nitrobacter có thể tạo thành capsule. Việc tạo thành tập

đoàn khuẩn nhầy được coi là đặc trưng đối với giống Nitrospina gracilis

là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ có kích thước 0,30,4 x 2,76,5m,

thỉnh thoảng hình thành những dạng hình cầu, không di động.

Nitrococcus mobilis là những tế bào tròn, đường kính 1,5m, có 12 tiêm

mao.

Vi khuẩn nitrate hóa không sử dụng các hợp chất hữu cơ và chuyển

hóa một cách chặt chẽ đối với việc oxy hóa cơ chất thành NH3+ và

Nitrate.

Quá trình biến đổi từ amoniac thành nitrate liên quan tới một loạt các

phản ứng phức tạp, chúng kiểm soát toàn bộ quá trình chuyển hóa tạo ra

sự thiếu hụt của các hợp chất có khả năng sinh ra nitrite trong hệ thống.

Vi khuẩn nitrate hóa là những cơ thể nhạy cảm đặc biệt đối với nhiều

chất ức chế. Nhiều tác nhân vô cơ và hữu cơ có thể gây ức chế phát triển

và hoạt động của chúng. Nồng độ cao của amoniac và axit nitrate cũng

gây ức chế. Ảnh hưởng của pH rất quan trọng, khoảng pH thích hợp nhất

cho việc nitrat hóa rất hẹp khoảng 7,5-8,6. Tuy nhiên các hệ thống đã

được làm quen với điều kiện pH thấp cũng có thể nitrat hóa một cách

hoàn hảo. Nhiệt độ cũng có thể ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của

vi khuẩn nitrate hóa. Tuy nhiên việc đánh giá các ảnh hưởng này là vấn

đề khó khăn. Nồng độ oxy hòa tan trên 1mg/l là rất cần thiết cho quá trình

nitrate hóa. Nếu hàm lượng oxy hòa tan thấp dưới 1mg/l thì khi đó oxy

trở thành yếu tố giới hạn, và quá trình nitrite hóa sẽ xảy ra chậm chạp

hoặc dừng hẳn.

33

Vi sinh vật tham gia vào quá trình phản nitrate (denitrification ): Phản

nitrat là bước thứ ba của quá trình loại bỏ đạm sau giai đoạn amon hóa,

giai đoạn nitrate hóa.

Việc khử nitrogen bằng vi sinh vật thực hiện việc khử nitrate thành

nitrogen phân tử gắn liền với việc oxy hóa các chất hữu cơ như đường,

rượu, acid hữu cơ thành CO2 và H2O được thực hiện trong điều kiện thiếu

oxygen “anoxic”, chất nhận hydrogen cuối cùng là NO3. Năng lượng sinh

ra khi oxy hóa cơ chất được vi sinh vật sử dụng trong quá trình hoạt động

sống của mình. Quá trình loại nitrat có thể xảy ra cả trong điều kiện hiếu

khí lẫn trong điều kiện kỵ khí nhưng đặc biệt mạnh trong điều kiện thiếu

khí .

Vi sinh vật thực hiện quá trì loại bỏ nitrate phân bố rất rộng rãi trong

tự nhiên. Chúng phần lớn thuộc các giống: Achromobacter, Aerobacter,

Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium,Lactobacillus,

Micrococcus, Proteus, Pseudomonas, và Spirillum. Vi khuẩn loại bỏ

nitrate thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí không bắt buộc, có

khả năng khử nitrate đồng hóa (dissimilatory nitrat reduction). Trong điều

kiện hiếu khí, vi khuẩn oxy hóa chất hữu cơ, chúng sử dụng oxy không

khí làm chất nhận hydrogen cuối cùng. Quá trình khử nitrate chia làm hai

bước. Bước đầu tiên biến đổi nitrat thành nitrit, và bước thứ hai tạo ra

oxit nitric, oxit nitrat, và khí nitrogen. Ba chất cuối cùng là các sản phẩm

dạng khí có thể thải ra khí quyển. Trong hệ thống khử nitrat, hàm lượng

oxy hòa tan là một thông số quyết định (critical parameter). Sự có mặt

của DO (oxygen hòa tan) sẽ ức chế hệ thống enzym tham gia vào quá

trình khử nitrate. Các chất kiềm tạo ra trong quá trình chuyển hóa nitrat

thành nitơ dạng khí sẽ làm tăng pH. Độ pH thích hợp nhất nằm trong

khoảng giữa 7 và 8 là những điểm tối ưu khác nhau cho các quần thể vi

khuẩn khác nhau. Nhiệt độ cũng ảnh hưởng tới tốc độ khử nitrat và sinh

trưởng của vi sinh vật. Các vi sinh vật kể trên rất mẫn cảm đối với những

thay đổi nhiệt độ.

Quá trình khử nitrate sinh hóa là giai đoạn khử nitơ chính trong các hệ

thống xử lý nước thải công nghiệp, và các hệ thống tự làm sạch trong tự

34

nhiên trên mặt đất và hệ thống nước ngầm. Để đạt được việc khử nitrat

tối đa, các điều kiện cần thiết là: thiếu khí, tỷ lệ carbon/ nitơ tối thiểu là

2/1 (dựa vào TOC và tổng số N)[36].

1.6.3. Biến đổi sulfur:

Sự chuyển hóa sulfur trong các hệ thống ao nuôi thủy sinh được

nghiên cứu nhiều, nhằm tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình

thành sulfide. Do sự dư thừa sulfide ở trạng thái tự do làm tăng mùi thối

khó chịu và ức chế hoạt động của các vi sinh vật. Giống như nitrogen sự

chuyển hóa sulfur khá phức tạp, có sự tham gia của nhiều quá trình, một

số là sự oxy hóa hóa học và số khác là sinh học.

Trong các lớp lắng phía trên của quá trình yếm khí hoặc yếm khí tùy

nghi các vi sinh vật thường phân hủy protein và các axit amin thành

amoniac và giải phóng H2S từ các axit amin chứa sulfur (Methinin,

Cystin, Cystein). Lượng sulfur sinh ra ở con đường này phụ thuộc vào

hàm lượng sulfur hữu cơ có trong ao.

Hydrogen sulfide đồng thời cũng được sinh ra từ sulfat trong các lớp

lắng yếm khí do hoạt động của các vi khuẩn khử sulfate ( Desulfovibrio ).

Giới hạn hoạt động của nó phụ thuộc vào các chất hữu cơ, nhiệt độ, vì tỷ

lệ khử sulfat giảm mạnh khi nhiệt độ xuống dưới 15oC.

Sự giảm nồng độ sulfide trong những giờ chiếu sáng là do sự oxy hóa

sulfide mạnh, khi có sự quang hợp sinh ra oxygen, cũng như sự quang

hợp của các vi khuẩn yếm khí để khử nồng độ sulfide trong ao hồ.

Các nhóm vi sinh vật tham gia vào quá trình chuyển hóa sulfur có thể

kể đến các nhóm :

+ Vi khuẩn lưu huỳnh :

Đặc điểm của nhóm này thường có chứa các giọt lưu huỳnh trong tế bào.

Những giống vi khuẩn lưu huỳnh có vai trò quan trọng là :

- Loại hình sợi : Beggiatoa, Thiothrix, Thiospirilopsis và Thioploca

35

- Loại không phải hình sợi ( hình cầu, hình bầu dục, hình que hay hình

xoắn) : Achromatium, Thiovorum, Macromonas, Thiospira, Thiophysa.

Đặc điểm chung của nhóm này oxy hóa lưu huỳnh như sau :

H2S + 1/2 O2 S + H2O + naêng löôïng.

Löu huyønh ñöôïc sinh ra tích luõy trong teá baøo sau ñoù coù theå tieáp tuïc oxy

hoùa thaønh sulfate:

2 S + 3 O2 + 2H2O 2H2SO4 + naêng löôïng

Năng lượng sinh ra được vi khuẩn dùng để đồng hóa CO2.

+ Vi khuẩn Sulfate :

Nhóm vi khuẩn này có khả năng oxy hóa H2S, S và các hợp chất khác

chứa lưu huỳnh. Chúng khác với vi khuẩn lưu huỳnh ở chỗ không chứa S

trong tế bào. Vi khuẩn lưu huỳnh chỉ gồm một giống Thiobacillus thuộc

họ Nitrobacteriaceae.

1.7. CÁC YẾU TỐ HÓA LÝ TỚI MÔI TRƯỜNG NUÔI TÔM:

1.7.1. Yếu tố vật lý:

- Nhiệt độ: Tôm cũng như tất cả các động vật sống dưới nước thuộc loại

máu lạnh. Nhiệt độ ảnh hưởng tới nhiều phương diện trong đời sống của

tôm: hô hấp tiêu thụ thức ăn, đồng hóa thức ăn, miễn nhiễm đối với bệnh

tật, sự tăng trưởng,… Nhiệt độ thay đổi theo khí hậu mỗi mùa, vì thế tại

miền Nam nước ta nhiệt độ có thể nuôi tôm quanh năm, trong khi miền

Bắc nước chỉ khai thác được vào mùa nóng. Nhiệt độ thích hợp tại các ao

hồ vùng nhiệt đới khoảng 28-30oC, tôm lớn nhanh hơn nhưng dễ mắc

bệnh.

- Độ mặn: Tôm sú có thể chịu được độ mặn từ 3-45‰ nhưng độ mặn lý

tưởng cho tôm sú là 18-20‰.

Độ mặn thích hợp nuôi tôm thẻ chân trắng từ 5 – 15‰ , khi độ mặn

tăng quá cao sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn, virus gây hại phát triển dẫn

36

đến các dịch bệnh như: các bệnh virus đốm trắng, đầu vàng, phát sáng và

EMS… đặc biệt là ảnh hưởng đến chu kỳ lột vỏ của tôm nuôi.

Ở độ mặn thấp (5–15 ‰) tôm sẽ tăng trưởng nhanh hơn so với độ

mặn cao. Đó là do ở độ mặn thấp thấp sẽ khiến sự trao đổi (protein) trong

cơ thể tôm tốt hơn và khi độ mặn thấp thì tôm bắt buộc phải sử dụng tổng

acid amin tự do để bù vào sự thay đổi thể tích tế bào vì thế mà thời gian

nuôi tôm ngắn và có thể nuôi được ở mật độ cao.

- Độ đục: Độ đục của nước được xác định bởi đĩa secchi, độ đục của nước

ao thích hợp nếu đĩa secchi được đọc ở trong khoảng 25-40cm. Điều này

có nghĩa là nếu độ đọc trên đĩa secchi mà ngắn hơn 25cm thì nước ao quá

đục, ngược lại nếu độ đọc này ở mức xa hơn 40cm thì nước ao lại quá

trong, đồng nghĩa với nước quá nghèo chất dinh dưỡng .

Trong ao, độ đục thường do các phiêu sinh vật phát triển. Độ đục

trong nước sẽ bất lợi nếu gây ra bởi đất sét hoặc các vật vô cơ, chúng cản

trở sự xuyên qua của ánh sáng, làm giảm khả năng sản xuất của ao. Nếu

độ đục gây ra bởi các chất vô cơ mà quá cao thì sẽ ảnh hưởng đến bộ

phận hô hấp của tôm[27].

1.7.2. Yếu tố hóa học:

- Oxy hòa tan trong nước: là yếu tố quan trọng nhất trong kỹ thuật

nuôi tôm. Lượng dưỡng khí thấp trong ao dễ gây chết cho tôm. Trong ao,

hiện tượng quang tổng hợp của các phiêu sinh vật là yếu tố chính tạo nên

oxygen hòa tan trong nước. Vì hiện tượng này chỉ xảy ra ban ngày, dưới

ánh nắng mặt trời nên về ban đêm và ngay cả về ban ngày nhưng thời tiết

âm u kéo dài làm ao không đủ oxygen cho tôm. Để giải quyết vấn đề này,

người ta sử dụng máy tạo oxygen (quạt, máy sục khí). Các triệu chứng

của tôm khi ao thiếu oxygen làm tôm tập trung gần mặt nước, gần vị trí

dẫn nước vào ao hoặc dọc theo bờ ao, tôm giảm di chuyển nhưng gia tăng

tốc độ hô hấp, có thể hôn mê và chết .

- Độ pH: pH có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tôm nuôi, pH

thấp có thể làm tổn thương các phần phụ, mang, ảnh hưởng quá trình lột

37

xác và cứng vỏ tôm. Tôm sú có khả năng chịu được pH 6-9, nhưng pH

thích hợp cho ao nuôi tôm khoảng 7,5-8,5. Một sự thay đổi nhỏ của pH

cũng gây ảnh hưởng quan trọng cho ao nuôi tôm. Độ pH của ao thường

tăng vào ban ngày và giảm vào ban đêm.

- Cacbondioxyde (CO2): Cacbon dioxyde là thành phần tự nhiên trong

nước, lớp đất đáy ao hồ và các lớp nước sâu thường có nhiều

cacbondioxyde do sự oxy hóa các chất hữu cơ của vi khuẩn hiếu khí cũng

như kỵ khí. CO2 cần thiết cho sự quang tổng hợp để tạo ra phiêu sinh

cũng như oxygen cần thiết cho tôm trong ao. CO2 không phải là độc tố

khi ta cung cấp đủ oxygen. Nếu trong ao mà lượng CO2 quá nhiều người

ta có thể thêm vôi vào, nhưng điều này không cần thiết lắm vì gia tăng

máy sục khí ta có thể đẩy CO2 ra khỏi môi trường .

- Hợp chất Nitrogen: gồm ba chất chính là Amonia, Nitrite và Nitrate.

Amonia trong ao xuất hiện như một sản phẩm do sự biến dưỡng của động

vật trong nước cũng như từ sự phân hủy các chất hữu cơ với tác dụng của

vi khuẩn. Lượng amonia gây ra không đáng lo ngại lắm trong ao hồ vì

phytoplankton sẽ sử dụng chúng.

Dưới tác dụng của vi khuẩn NH3 sẽ trở thành Nitrite (NO2) tiếp theo

là Nitrate (NO3). Ở dạng NO3 thì vô hại.

Chất Hydro sulfide (H2S): H2S là chất khí được tạo thành dưới điều

kiện kỵ khí. pH rất có ảnh hưởng tới độ độc của H2S. Với pH=5, nhiệt

độ=24oC có 99,1% H2S ở dạng chất độc, pH=8 với nhiệt độ=24oC chỉ có

8% H2S ở dạng chất độc. Dù lượng độc sulfide rất nhỏ (0,001 ppm) mà

hiện diện trong một thời gian liên tục vẫn làm giảm sự sinh sản của tôm

[27].

1.7.3. Yếu tố sinh học:

Trong ao hồ nuôi tôm, ngoài các yếu tố vật lý và hóa học còn có

những yếu tố sinh học như các loại cá tạp, giáp xác các loại, phiêu sinh

thực vật (phytoplankton), phiêu sinh động vật (zooplankton), nấm, vi

khuẩn và virus [27].

38

CHƯƠNG 02: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 . VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU:

2.1.1. Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu:

Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu được phân lập từ tôm sú

phát triển tốt tại các ao nuôi tôm tại Cần Giờ, Nhà Bè Thành phố Hồ Chí

Minh và một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, nước ao và bùn trong ao

nuôi tôm có năng suất cao, các sản phẩm lên men có vi sinh vật hữu ích,

các chủng vi sinh vật hiện có tại Viện Sinh học Nhiệt đới.

- Nhóm chế phẩm quang tự dưỡng:

+ Thành phần vi sinh vật: Rhodopseudomonas sp., và Rhodospirillium

sp.,

+ Mật độ: 1x108-9cfu/ml.

- Nhóm chế phẩm EM gốc thủy sản:

+ Thành phần vi sinh vật: Bacillus sp,. , Lactobacillus acidophilus

và nấm men Saccharomyces boulardii.

+ Mật độ: 1x108-9cfu/ml.

- Hoạt hoá EM gốc TS: Khuấy đều 1 lít EM gốc cộng 18 lít nước và cộng

với 1 kg rỉ đường và 20 gram phân DAP cho vào can 20 lít đậy nắp, sau

1-2 ngày mở nắp cho thoát khí, để lên men tiếp tục sau 3-4 ngày đem sử

dụng.

+ Trong các ao thực nghiệm: sử dụng khoảng 20 lít EM đã hoạt hoá

cho 1.000-2.000m3 nước ao, mỗi tuần một lần tới khi kết thúc thí nghiệm.

+Nhóm chế phẩm quang tự dưỡng: Sử dụng trực tiếp với nồng độ 2-3 lít

chế phẩm cho 1.000-2.000 m3 nước ao.

39

2.1.2. Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm:

2.1.2.1. Đánh giá sơ bộ khả năng sinh tổng hợp amylase, protease

của một số chủng Bacillus sp.

- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus sp:

Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus

sp chúng tôi sử dụng môi trường agar số 1 (phụ lục). Giống được trẻ hoá

trước 24 giờ trên môi trường số 5 (phụ lục). Lượng giống cấy vào thành

điểm với đường kính 2mm. Mỗi đĩa thạch cấy 3 chủng, và được lập lại 3

lần. Để vi sinh vật phát triển chúng tôi nuôi trong tủ ấm 30oC trong thời

gian 72 giờ. Để xác định tinh bột được thủy giải chúng tôi dùng dung

dịch lugol đổ lên đĩa và được đưa vào tủ ấm sau 30 phút tiến hành đo

vòng thủy giải.

- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzym protease của các chủng

Bacillus sp:

Với cách làm tương tự như trên để xác định khả năng sinh protease

của các chủng Bacillus sp chúng tôi sử dụng môi trường số 2 (phụ lục).

Các chủng vi khuẩn trước đó được hoạt hoá trên môi trường số 5. Các

chủng vi khuẩn nuôi trên môi trường số 2 sau 3 ngày ở nhiệt độ 30oC

được đưa ra để xác định khả năng thủy giải casein bằng dung dịch HgCl2.

2.1.2.2 Xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng

hợp enzym amylase của các chủng Bacillus sp:

Để xác định ảnh hưởng của các pH môi trường đến khả năng sinh

tổng hợp enzym amylase chúng tôi sử dụng môi trường số 1(phụ lục) với

pH 7,8,9.

Phương pháp tiến hành trình bày trong mục (2.1.2.1.)

40

2.1.2.3. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng

hợp enzym protease của các chủng Bacillus sp:

Để xác định ảnh hưởng của các pH môi trường đến khả năng tổng hợp

enzym protease của các chủng Bacillus sp chúng tôi sử dụng môi trường

cơ sở số 2 với pH thay đổi =7,8,9.

Phương pháp tiến hành như mục (2.1.2.2.)

2.1.2.4. Xác định hoạt tính emzyme amylase theo phương pháp Smith và

Roe (1966).

Dùng các ống nghiệm có đánh dấu sẵn và lần lượt cho vào các ống

nghiệm các dịch và hoá chất như sau:

Ống chuẩn Ống thử

1ml H2O cất 1 ml dịch enzym các mẫu

1ml đệm phosphat 1/15 M(pH 5,6 đối

với amylase nấm mốc và 6,5 đối với

vi khuẩn)

1ml đệm phosphat 1/15 M(pH 5,6

đối với amylase nấm mốc và 6,2 đối

với vi khuẩn)

1ml hồ tinh bột 1% 1ml hồ tinh bột 1%

0,5ml NaCl 3% 0,5ml NaCl 3%

1ml HCl 1N

Tất cả đem ủ ở 400C trong 30 phút, sau đó ở các ống thử cho vào mỗi

ống 1ml HCl 1N để kìm hãm ngay sự hoạt động enzym. Tiếp theo thêm

nước cất cho đủ mỗi ống 10ml, và mỗi ống 1 giọt lugol 1%.

Đem đo mật độ quang ở bước sóng = 600nm

41

Đơn vị hoạt tính được tính theo công thức:

IU =(E0 -EK).C.L

E0.t

Trong đó:

E0 : mật độ quang học của ống chuẩn

EK : mật độ quang học của ống thử

C : lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng

L : hệ số pha loãng

t : thời gian phản ứng

2.1.2.5. Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Anson.

Nguyên tắc:

Protein (casein, hemoglobin) bị thuỷ phân dưới tác dụng của enzym

protease. Sản phẩm là các đoạn peptit ngắn hoà tan trong axit tricloacetic

(TCA) và một số các axit amin. Các peptit và sản phẩm tạo thành có chứa

tyrosin, trytophan khi cho tác dụng với thuốc thử Folin tạo dung dịch có

màu. Cường độ màu tăng tỷ lệ với chất đem phản ứng, cường độ màu

được ghi nhận bằng giá trị mật độ quang OD ở = 660nm.

Phản ứng thuỷ phân liên kết peptid theo dạng tổng quát sau:

R – CH – CO – NH – CH – R’ + H2O R – CH –COOH + H2N –CH – R’

NH2 COOH NH2 COOH

Liên kết peptid

Hoá chất:

- Dung dịch NaOH 0,5N – 1N

- Dung dịch HCl 0,2N – 2N

42

- Dung dịch đệm phosphat (1/15 M; pH 7,6): trộn dung dịch KH2PO4

1/15M với Na2HPO4 theo tỷ lệ nhất định để tạo dung dịch có pH = 7,6.

- Dung dịch casein 1%: cân 1g casein hoà tan trong 100ml dung dịch đệm

phosphat pH = 7,6 đun cách thuỷ đến khi casein tan hoàn toàn định mức

lại nước cất thành 100ml, bảo quản tủ lạnh.

- Dung dịch hemoglobin 1%: cân 1gam hemoglobin + 18gam Ure + 4ml

dung dịch NaOH 1M hoà tan trong 20ml nước cất. Để ở 250C trong 60

phút, thêm 5ml dung dịch đệm KH2PO4 1M, điều chỉnh lại pH = 6 với

dung dịch HCl 2M, thêm nước tới vạch mức 100ml, bảo quản trong tủ

lạnh.

- Dung dịch albumin 1%: cân 1g albumin hoà tan trong nước cất. Sau đó

định mức thành 100ml. Bảo quản tủ lạnh.

- Dung dịch TCA 5%

- Thuốc thử Folin được pha theo phương pháp đã trình bày trong tài liệu.

Trước khi dùng pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:3

- Dung dịch Tyrosin chuẩn 1M: cân 18, 119 mg Tyrosin hoà tan trong

HCl 0,2M thành 100ml.

Thí nghiệm:

Dựng đường chuẩn Tyrosin: để xác định lượng Tyrosin trong dung

dịch nghiên cứu ta cần dựng đường chuẩn Tyrosin. Trình tự tiến hành

theo bảng sau:

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Lượng Tyrosin tương ứng 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

HCl 0.2N (ml) 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0

NaOH 0.5N (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

Folin (1:3) (ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

43

Lắc mạnh sau 5 đến 10 phút, đo OD ở bước sóng = 660 nm. Ống 0 là

ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là các ống thí nghiệm (TN).

Từ kết quả trên thu được ta vẽ đường chuẩn Tyrosin biểu diễn sự

tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và OD = ODTN - ODKC

Xác định lượng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu:

Dùng hai ống nghiệm A và B cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch cơ chất

là casein 1% hay hemoglobin 1% giữ ở nhiệt độ 35oC.

Cho vào ống A 1 ml dung dịch enzym, lắc đều và giữ ở nhiệt độ 35oC

chính xác 20 phút. Sau đó thêm vào 30 ml dung dịch TCA 5%.

Ống B là ống kiểm chứng, thực hiện như ống A nhưng cho 3 ml dung

dịch TCA 5% vào cùng với dung dịch cơ chất trên và dung dịch enzym.

Sau khi cho TCA vào xong, để yên 30 phút rồi đem lọc kết tủa, lấy

1ml dịch lọc, thêm 2ml NaOH 0.5 và 0.6 ml thuốc thử Folin (đã pha

loãng 1:3). Lắc mạnh sau 5-10 phút, đo mật độ quang (OD) ở cả 2 ống A

và B ở bước sóng =660 nm.

Tính OD =ODA - ODB, dựa vào đồ thị chuẩn suy ra lượng Tyrosin

tương ứng.

* Cách tính:

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là một lượng enzym tối

thiểu trong điều kiện chuẩn về pH, nhiệt độ…thuỷ phân casein (hay

hemoglobin) ở nhiệt độ 35oC trong một phút tạo thành sản phẩm hoà tan

trong TCA và khi phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở

bước sóng =660 nm .

Công thức tính: số đơn vị hoạt tính protease ở nhiệt độ 35oC theo công

thức:

MolTyr. V

Hoạt tính protea/gam (ml) chế phẩm E = ___________

v.t.m (v’)

Với:

44

V: thể tích toàn bộ dung dịch A hay B (ml)

v: thể tích dung dịch đem đi xác định (ml)

v’: thể tích enzym đem đi xác định hoạt tính (ml)

m: khối lượng enzym đem xác định hoạt tính (gam)

t: thời gian thuỷ phân (phút)

2.1.3. Thử nghiệm chế phẩm sinh học vi sinh trong phòng thí

nghiệm:

Chế phẩm probiotic được tiến hàng thử nghiệm trong bể nuôi tôm tại

phòng thí nghiệm, chế phẩm được pha loãng và cho vào bể có sục khí.

Thử nghiệm này nhằm xác định hiệu qủa của chế phẩm trước khi tiến

hành thử nghiệm tại ao nuôi.

Bắt ngẫu nhiên 3 con tôm trong mỗi nghiệm thức, rửa 2 lần với nước

muối 2% vô trùng, cho vào ống nghiệm nghiền nát rồi thêm 10 ml nước

muối 2% vô trùng. Mẫu tôm được hòa loãng ở nhiều nồng độ khác nhau,

ở mỗi nồng độ chúng tôi hút 0,1 ml trải đều trên môi trường TCBS và

môi trường TTP để định lượng vi khuẩn Vibrio sp và Bacillus sp sao cho

số khuẩn lạc nằm trong khoảng 20 – 300 khuẩn lạc / đĩa.

Môi trường định lượng vi khuẩn Vibrio sp là môi trường TCBS

(Thiosulphate citrat bilesal sucrose agar).

Xác định khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn “probiotic” đối

với Vibrio harveyi: thực hiện trong môi trường agar và môi trường dịch

thể.

Xác định vi khuẩn tổng số trong bùn và trong nước: Thực hiện bằng

phương pháp hoà loãng, cấy trên môi trường TSA.

Xác định số lượng vi khuẩn Vibrio sp trong bùn và trong nước: Thực

hiện theo phương pháp hoà loãng và cấy trên môi trường TCBS.

Mẫu nước được hòa loãng ở nhiều nồng độ khác nhau, 0,1 ml nước ở

các độ hòa loãng được trải đều trên môi trường TCBS để xác định số

45

lượng Vibrio sp và trải đều trên môi trường TSA để xác định số lượng

Bacillus sp.

2.1.4. Thử nghiệm tại ao nuôi:

Tất cả các ao nuôi được lót bạt bờ, có diện tích từ 1.000-3.000m2 .

Mật độ thả giống từ 80-100con/m2. Độ sâu mực nước giao động các ao từ

0,8-1,4 m. Hệ thống quạt được lắp đặt theo hệ thống trục dài có tổng công

suất từ 6-12 HP/ao. Ao lớn khoảng 3000m2 lắp đặt 04 hệ thống quạt, mỗi

hệ thống có 12 cánh bố trí đều ở 04 góc ao. Hệ thống quạt chạy liên tục

24 giờ/ ngày đảm bảo cung cấp đủ oxy và tránh phân tầng nhiệt trong ao

nuôi tôm.

Thí nghiệm này được thực hiện tại một trong các địa điểm, Huyện

Cần Giờ, Nhà Bè Tp. Hồ Chí Minh.

2.1.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm:

Ao thực nghiệm (TN): Sử dụng các chế phẩm vi sinh định kỳ đánh

xuống ao hàng tuần từ trước lúc thả tôm tới khi thu hoạch chiếm khoảng

50% tổng lượng ao thí nghiệm.

Ao đối chứng (ĐC): không sử dụng chế phẩm vi sinh dự kiến

chiếm 10- 50% tổng lượng ao thí nghiệm.

Loại thức ăn được sử dụng trong thí nghiệm là loại thức ăn thương

mại thông thường có sẵn trên thị trường với hàm lượng Protein cao 30-35

%.

46

2.1.4.2. Phương pháp quản lý chất lượng nước:

2.1.4.2.1. Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý nước:

Một số chỉ tiêu nước được quan trắc trực tiếp một số tại ao và một

số chỉ tiêu còn lại được mang về phòng thí nghiệm phân tích theo TCVN

6663-1-2010, mẫu được lấy định kỳ hàng tuần/lần từ trước lúc thả tôm

tới khi thu hoạch.

Các chỉ tiêu như: pH, Độ mặn, Nhiệt độ, Độ kiềm, Oxy hòa

tan,Amonia,Nitrate, Nitrite, Hydro Sulfua, Cond, Nhu cầu oxy hóa học,

nhu cầu oxy sinh học,…

Bảng 2.1: Phương pháp phân tích chất lượng nước

STT Các chỉ tiêu Tần suất đo Phương pháp phân tích

1 pH Hàng ngày Máy đo pH hoặc Test

2 Độ mặn S %o 07 ngày/lần Tỷ trọng Angel Test hay máy

3 Nhiệt độ oC 07 ngày/lần Máy Sigma 950 của Hach

4 Kiềm (mg/l) 07 ngày/lần TCVN 6636-1-2000

hoặc Test hộp so mầu

5 DO (mg/l) 07 ngày/lần Máy Sigma 950 của Hach

6 NH3+-N

(mg/l)

07 ngày/lần Máy DR 2400 của Hach

7 NO3--N

(mg/l)

07 ngày/lần Máy DR 2400 của Hach

8 NO2--N

(mg/l)

07 ngày/lần Máy DR 2400 của Hach

9 H2S (mg/l) 07 ngày/lần Máy DR 2400 của Hach

47

10 Cond

(mS/cm)

07 ngày/lần Máy Sigma 950 của Hach

11 COD (mg/l) 07 ngày/lần Máy phá mẫu COD Reactor

và DR 2400 của Hach

12 BOD5 (mg/l) 07 ngày/lần Máy đo BOD Track của Hach

2.1.4.2.2. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn trong nước:

Môi trường sử dụng để đánh giá sử dụng những môi trường thông

thường hay môi trường chuyên biệt (TSA, TCBS,…) trong nghiên cứu vi

sinh của thủy sản và môi trường.

Mẫu nước được thu đều ở các vị trí trong ao trộn lại thành một mẫu

chứa trong bình nhựa 01 lít. Xác định các chỉ tiêu vi sinh trong nước ao

nuôi bằng phương pháp pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý vô trùng

với dẫy nồng độ: 1:10 ; 1:100 ; 1:1000 lần. Lấy 01 ml từ mẫu các nồng độ

này cấy trên môi trường chọn lọc thích hợp cho từng chủng vi sinh (mỗi

nồng độ cấy 03 đĩa) sau đó được ủ trong tủ ấm với nhiệt độ thích hợp. Số

khuẩn lạc mọc trên đĩa được tính sau 24 giờ ủ.

2.1.4.2.3. Phương pháp phân tích tăng trưởng và năng suất tôm nuôi:

Tăng trọng bình quân ngày (g) = Trọng lượng cơ thể (g) / số ngày

Tỷ lệ sống(%) =100 x(số tôm còn lại/số tôm ban đầu).

2.1.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:

Số liệu chỉ tiêu chất lượng nước, mật độ vi khuẩn trong nước, tỷ lệ

sống, năng suất, thời gian nuôi, diện tích, trọng lượng trước và sau thu

hoạch được tính trung bình. Sử dụng phần mềm Excel phiên bản 6.0.

48

2.2. MỘT SỐ HÓA CHẤT, THIẾT BỊ DÙNG TRONG PHÂN TÍCH

MẪU VI SINH, HÓA LÝ:

- Các hoá chất sử dụng trong thí nghiệm, thuộc loại hoá chất tinh

khiết (sử dụng trong phân tích), loại hoá chất kỹ thuật (dùng trong nuôi

cấy vi sinh vật).

- Các thiết bị dùng trong phòng nghiệm như : autoclave, tủ ấm, tủ sấy,

máy do OD, máy đo pH, cân điện tử … hiện có tại Viện Sinh Học Nhiệt

Đới.

* pH được đo bằng máy đo pH Sigma 950- Flow Meter.

* Nồng độ oxy hòa tan (DO)được đo bằng máy Sigma 950-

Flow Meter, HACH, Mỹ.

Hình 2.1: máy đo DO, pH,…

49

* Định lượng COD (Chemical Oxygen Demand): Được phá mẫu

bằng máy COD Reactor, HACH, Mỹ và đo trên máy DR/2400, HACH,

Mỹ bằng test.

Hình 2.2: Máy phá mẫu COD

Hình 2.3: Máy đo BOD5

50

* Định lượng Amonium (N-NH4), Nitrat (N-NO3), H2S,…: được đo

trên máy DR/2400, HACH, Mỹ bằng test.

Hình 2.4: Máy đo chỉ tiêu Amonium, nitrate, nitrite,...

51

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. CHỌN LỌC CÁC CHỦNG BACILLUS SP SỬ DỤNG TRONG

NUÔI TÔM.

3.1.1. Chọn lọc các chủng đối kháng với Vibrio sp.

Chúng tôi đã xác định khả năng đối kháng vi khuẩn Vibrio sp của trên

30 chủng vi khuẩn Bacillus sp., Lactobacillus sp và nấm men mà chúng

tôi có được từ việc phân lập trong ruột các con tôm khỏe mạnh, trong

bùn, nước các ao nuôi tôm, trong các chế phẩm vi sinh thương mại sử

dụng trong nuôi tôm, cùng với các chủng hiện có tại tủ giống vi sinh vật

của Viện Sinh học Nhiệt đới. Kết quả trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Một số chủng vi sinh phân lập đã được chọn lọc :

STT Ký hiệu Tên chủng Đối kháng với

Vibrio sp

1 B1.1 Bacillus subtilis +

2 B1.3 Bacillus sp +

3 B1.4 Bacillus sp +

4 B2.2 Bacillus subtilis +

5 B4.5 Bacillus sp +

6 B4.6 Bacillus sp +

7 B4.7 Bacillus sp +

8 B6.3 Bacillus sp +

9 B6.5 Bacillus sp +

10 B8.3 Bacillus sp +

52

11 B9.1 Bacillus subtilis +

12 B10.1 Bacillus subtilis +

13 B10.2 Bacillus sp +

14 B11.4 Bacillus subtilis +

15 B12.1 Bacillus sp +

16 B13.1 Bacillus coagulans +

17 B13.2 Bacillus sp +

18 B13.7 Bacillus sp +

19 B13.9 Bacillus sp +

20 B13.11 Bacillus sp +

21 B14.1 Bacillus subtilis +

22 B14.2 B. licheniformis +

23 B14.3 B. pumilus +

24 B14.4 B. polymyxa +

25 B14.5 B.megaterium +

26 B14.6 B.stearothermophilus +

27 B19.2 Bacillus sp +

28 B20.1 Bacillus subtilis +

29 B20.2 B. coagulans

30 B22.1 Bacillus subtilis +

31 S22.2 S.cerevisiae

53

3.1.2. Xác định khả năng sinh tổng hợp emzyme của các chủng vi

sinh:

3.1.2.1. Xác định khả sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus

sp:

Nhằm tìm hiểu khả năng sinh tổng hợp enzym amylase của các chủng

Bacillus sp sử dụng trong nuôi tôm sú. Chúng tôi đã kiểm tra 16 chủng vi

khuẩn Bacillus sp trên môi trường tinh bột hòa tan. Kết quả trình bày ở

(Hình 3.1) cho thấy tất cả các chủng đều mọc tốt, đường kính khuẩn lạc

sau 3 ngày nuôi cấy đạt 10-20mm. Đường kính vòng phân giải thấp nhất

là 12mm và cao nhất là 30mm, tỷ lệ giữa đường kính vòng phân giải so

với khuẩn lạc thấp nhất là 1,08 ở chủng 9.1 và cao là 1,76 ở chủng 2.2.

Căn cứ vào tỷ lệ đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc

chúng tôi chọn ra một số chủng có khả năng sinh tổng hợp cao để nghiên

cứu tiếp theo là 2.2, 11.4, 4.5, 4.7, 4.6, 10.2.

Hình 3.1: Khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus sp

32 L23 Lactobacillus sp +

0

5

10

15

20

25

30

35

1.1

1.3

1.4

2.2

4.5

4.6

4.7

6.3

6.5

8.3

9.1

10.1

10.2

11.4

12.1

13.1

Caùc chuûng vi khuaån

Ñö

ôøn

g k

ín

nh

kh

uaån

laïc h

oaëc v

oøn

g p

haân

giaûi,

(m

m)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Ty

û le

ä D v

oøn

g p

haân

giaûi/ d

kh

uaån

laïc

d (mm)

D (mm)

D/d

54

3.1.2.2. Khả năng sinh tổng hợp emzym protease của các chủng

Bacillus sp sử dụng trong nuôi tôm:

Thức ăn nuôi tôm chứa hàm lượng protein rất cao trên 40%, vì vậy

các chất thải trong môi trường nuôi tôm rất giầu protein, nên việc tìm ra

những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải protein cao, cũng như các

chủng vi sinh vật nitrate hoá để biến Amonia (NH3+-N) thành nitrate là

mục tiêu của nhiều nghiên cứu. Mục đích nghiên cứu này của chúng tôi

nhằm tìm một số các chủng Bacillus sp có khả năng sinh tổng hợp cao

protease. Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường với cơ chất là

casein. Kết quả thí nhiệm trình bày ở Hình 3.2.

Hình 3.2: Khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng Bacillus sp

Qua Hình 3.2 cho thấy tất cả các chủng thử nghiệm đều có vòng phân

giải casein lớn hơn đường kính khuẩn lạc, điều đó chứng tỏ rằng các

chủng đều có sinh tổng hợp protease. Căn cứ vào tỷ lệ của đường kính

vòng thủy giải casein với đường kính khuẩn lạc chúng tôi đã chọn ra 06

chủng: 2.2, 11.4, 10.2, 1.4, 4.6, 4.7. Kết quả trên hoàn toàn phù hợp với

nghiên cứu của Sangeetha et al. (2008). Trong khi đó, Mussarat et al.

(2008) cho rằng casein là nguồn nitơ kích thích khả năng sinh tổng hợp

protease.

55

3.1.2.3. Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme amylase của các chủng Bacillus sử dụng trong nuôi tôm sú:

pH môi trường là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến

khả năng sinh tổng hợp enzym amylase của vi sinh vật. Để tìm hiểu mối

liên quan giữa pH của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

của các chủng amylase trong nuôi tôm sú, chúng tôi thực hiện trên môi

trường có tinh bột với các pH khác nhau là 7, 8, 9 kết quả trình bày ở

Hình 3.3.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

1.1

1.3

1.4

2.2

4.5

4.7

6.3

6.5

6.6

8.3

9.1

10.1

10.2

11.4

12.1

13.1

Ty

û le

ä D

/d

Caùc chuûng Bacillus

pH 7

pH 8

pH 9

Hình 3.3: Ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp amylase.

- Khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của các chủng Bacillus sp trên

3 môi trường có pH khác nhau là:7, 8, 9 thì khác nhau không nhiều.

- Phần lớn các chủng có khả năng sinh tổng hợp cao ở pH = 8 như ở

chủng 1.4, 2.2, 4.5, 6.3, 6.6, 8.3, 11.4.

- Một số chủng sinh tổng hợp amylase cao trên pH môi trường bằng 9

(trước khi thanh trùng) như: 4.7, 6.5, 9.1, 10.2, 11.4, 12.1.

- Chỉ có một số chủng sinh tổng hợp amylase cao ở pH = 7 như các chủng

1.1, 1.3.

56

3.1.2.4. Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym

protease của các chủng Bacillus sp:

Nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi là xác định ảnh hưởng của pH môi

trường đến khả năng sinh tổng hợp protease. Thí nghiệm thực hiện trên

môi trường agar với cơ chất là casein. pH môi trường được điều chỉnh

bằng 7, 8, 9. Các vi khuẩn thử nghiệm được cấy vào đĩa với đường kính

ban đầu là 1mm, sau 72 giờ nuôi ở nhiệt độ 30oC, sau đó xác định vòng

phân giải bằng dung dịch HgCl2. Kết quả được trình bày ở Hình 3.4.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

1.1

1.3

1.4

2.2

4.5

4.6

4.7

6.3

6.5

8.3

9.1

10.1

10.2

11.4

12.1

13.1

Ty

û le

ä D/d

Caùc chuûng Bacillus

pH 7

pH 8

pH 9

Hình 3.4. Hoạt lực enzym protease của các chủng Bacillus sp.

- Khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng Bacillus sp thử nghiệm

không khác nhau nhiều trên 3 môi trường pH=7, 8, 9.

- Một vài chủng sinh tổng hợp protease cao ở pH=7 như :2.2, 11.4, 12.1.

- Một số chủng sinh tổng hợp protease cao ở pH=8 như :1.3, 1.4, 4.7 và

13.1.

57

- Một số chủng có khả năng sinh tổng hợp cao ở pH=9 như: 1.1, 4.6, 6.3,

8.3, 10.2, 11.4.

3.1.2.5. Xác định hoạt tính amylase của chủng Bacillus sp:

Sau thí nghiệm sơ bộ chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định hoạt

tính amylase của một số chủng Bacillus sp. Hoạt tính xác định theo

phương pháp Smith và Roe (1946). Kết quả thí nghiệm trình bày ở Hình

3.5.

Hình 3.5: Hoạt lực enzym amylase của chủng Bacillus sp

- Trong số 8 chủng Bacillus sp nghiên cứu, chủng có hoạt tính amylase

mạnh nhất là chủng 2.2 (17,25UI/ml) tiếp theo là các chủng 11.4

(16,15UI/ml), 10.2 (14,36UI/ml), 4.5 (12,3UI/ml), 4.7 (12,11UI/ml), 1.3

(10,5UI/ml), 4.6 (10,15UI/ml) và thấp nhất là chủng 1.1 (6,18UI/ml).

- Các chủng khi xác định sơ bộ bằng vòng phân giải tinh bột cao, đồng

thời là các chủng có hoạt lực amylase cao, các khuẩn lạc có khả năng

phân hủy tinh bột (Amy+ ) tạo ra một vòng sáng rộng xung quanh khuẩn

lạc và vòng sáng này không cho phản ứng màu với dung dịch Iod. Sự

hiện diện của vòng halo thủy phân tinh bột bao quanh khuẩn lạc có thể sử

dụng để đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân tinh bột của các dòng vi

khuẩn.

58

3.1.2.6. Hoạt tính enzym protease của một số chủng Bacillus sp:

Để xác định hoạt tính protease của 8 chủng Bacillus sp chúng tôi đã

nuôi cấy trên môi trường có nguồn protein là casein. Hoạt tính enzym

protease theo phương pháp Anson. Kết quả được trình bày ở Hình 3.6.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2.2 4.5 4.6 4.7 1.1 1.3 11.4 10.2

Ho

aït t

ính P

ro

tease

(U

I/m

l)

Caùc chuûng vi khuaån Bacillus

Hình 3.6: Hoạt lực emzyme protease của chủng Bacillus sp

- Hoạt tính protease của 8 chủng Bacillus sp nghiên cứu, chủng có hoạt

tính mạnh nhất là chủng 2.2 (40,2UI/ml) tiếp theo là các chủng 11.4

(35,28UI/ml), 1.3 (32,15UI/ml), 4.7 (30,25UI/ml), 4.6 (25,21UI/ml), 10.2

(15,26UI/ml), 1.1 (15,24UI/ml) và thấp nhất là chủng 4.5 (10,03UI/ml).

- Hai chủng 2.2 và 11.4 là những chủng cho hoạt tính amylase cao đồng

thời là những chủng cho hoạt tính protease cao. Hai chủng 10.2 và 4.5 là

những chủng có hoạt tính amylase cao nhưng hoạt tính protease thấp.

Chủng 4.6 có hoạt tính amylase thấp nhưng hoạt tính protease cao. Chủng

1.1 vừa có hoạt tính protease, amylase thấp. Thức ăn nuôi tôm chứa hàm

lượng protein rất cao trên 40%, vì vậy các chất thải trong môi trường nuôi

tôm rất giầu protein, nên việc tìm ra những chủng vi sinh vật có khả năng

phân giải protein cao, cũng như các chủng vi sinh vật nitrate hoá để biến

Amonia (NH3+-N) thành nitrate là mục tiêu của nhiều nghiên cứu.

59

3.1.3. Thử nghiệm tính đối kháng các chủng với vi khuẩn Vibrio sp

trong phòng thí nghiệm:

Từ kết quả thử nghiệm trên chúng tôi chọn ra 02 chủng vi sinh B2.2

và B.11.4 tối ưu nhất để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.

3.1.3.1. Sự biến động số lượng vi khuẩn Vibrio sp:

Thí nghiệm này nhằm xác định sự biến động số lượng vi khuẩn Vibrio

harveyi dưới tác động của Bacillus B2.2 và Bacillus B11.4 trong nước

nuôi tôm và trong cơ thể tôm.

Mẫu nước và mẫu tôm được phân tích lúc 0h, 48 giờ, 96 giờ, 144h.

Kết quả trình bày ở Hình 3.7.

Hình 3.7: Sự biến động số lượng Vibrio sp.

- Số lượng tế bào trong nghiệm thức đối chứng tăng dần theo thời gian,

37 cfu/ml lúc 0h, 406 cfu/ml lúc 48h, 3896 cfu/ml lúc 96h và 5730 cfu/ml

lúc 144h. Ở nghiệm thức đưa Vibrio sp vào môi trường lúc 0h có 135

cfu/ml đã tăng lên 2.600 cfu/ml lúc 48 giờ, 7.845 cfu/ml sau 96 giờ và

25.275 cfu/ml sau 144 giờ. Ở nghiệm thức ngoài Vibrio sp còn cho thêm

60

Bacillus B2.2 số lượng Vibrio sp từ 138 cfu/ml lúc 0h, tăng lên 9.915

cfu/ml lúc 48h, nhưng đến đến 96 giờ giảm xuống còn 1.550 cfu/ml và

đến 144h chỉ còn 230 cfu/ml. Ở nghiệm thức V. harveyi + Bacillus B11.4

cũng biến động số lượng Vibrio sp tương tự như ở nghiệm thức cho thêm

Bacillus B2.2. Số lượng Vibrio sp trong môi trường nước từ 140 cfu/ml

lên 12.775 cfu/ml sau 48 giờ, sau đó số lượng giảm dần xuống 6.085

cfu/ml ở 96 giờ và còn 450 cfu/ml sau 144 giờ. Trong hai nghiêm thức có

Bacillus sp và Vibrio sp đề có vẻ làm tăng lượng Vibrio sp sau 48h sau đó

giảm xuống so với đối chứng. Trong hai nghiêm thức có Bacillus sp và

Vibrio sp đề có vẻ làm tăng lượng Vibrio sp sau 48h sau đó giảm xuống

so với đối chứng điều đó chứng tỏ rằng các chủng vi khuẩn có lợi có tác

động tích cực là ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại cụ thể là vi

khuẩn Vibrio harveyi là tác nhân gây bệnh dịch chết sớm EMS ở tôm

nuôi hiện nay.

3.1.3.2. Sự biến động số lượng vi khuẩn Bacillus sp:

Theo dõi số lượng Bacillus sp trong nước cho thấy Bacillus sp đều có

khả năng tồn tại trong nước nuôi tôm Hình 3.8.

0.00E+00

5.00E+05

1.00E+06

1.50E+06

2.00E+06

2.50E+06

3.00E+06

0 giôø 48 giôø 96 giôø 144 giôø

cfu/ml

V. harveyi + Bacillus 2.2 V. harveyi + Bacillus 11.4

Hình 3.8: Sự biến động Bacillus sp trong nước nuôi tôm.

61

Theo thời gian số luợng tế bào vi khuẩn Bacillus B2.2 trong nghiệm

thức I tăng từ 2,18x104 cfu/ml tăng lên 5,98x104 cfu/ml ở 48 giờ, tăng lên

3,38x105 cfu/ml ở 96 giờ và tăng lên 2,18x106 cfu/ml ở 144 giờ. Số lượng

tế bào Bacillus B11.4 trong nghiệm thức II cũng tăng dần theo thời gian

từ 2,6 x104 cfu/ml lên 5,24x104 cfu/ml ở 48 giờ, 2,5x105cfu/ml ở 96 giờ

và đạt 2,61x106 cfu/ml sau 144 giờ chứng tỏ rằng vi khuẩn Bacillus sp

hoàn toàn thích nghi với môi trường giả lập nuôi tôm trong điều kiện

phòng thí nghiệm và phát triển tốt theo thời gian.

3.1.3.3. Sự biến động Vibrio sp trong tôm thử nghiệm:

Hình 3.9: Sự biến động của Vibrio sp trong tôm theo thời gian

Dựa trên kết quả hình 3.9, chúng tôi nhận thấy sự biến động số lượng

tế bào Vibrio sp trong cơ thể tôm không theo một chiều hướng nhất định.

+ Trong nghiệm thức đối chứng số lượng tế bào Vibrio sp tăng từ 68x103

cfu/ml ở 48 giờ lên 3,55x105 cfu/ml ở 96 giờ và lên 2x107 cfu/ml ở 144

giờ. Trong nghiệm thức I, ở 48 giờ số lượng tế bào Vibrio sp là 122x105

cfu/ml, đến 96 giờ số lượng tế bào giảm còn 120x105 cfu/ml và đến 144

giờ số lượng tế bào tăng lên đạt 227x105 cfu/ml.

+ Trong nghiệm thức V. harveyi + Bacillus B2.2, số lượng tế bào Vibrio

sp đạt được ở 48 giờ là 140x105 cfu/ml nhưng đến 96 giờ số tế bào chỉ

0,00E+00

5,00E+06

1,00E+07

1,50E+07

2,00E+07

2,50E+07

48 giôø 96 giôø 144 giôø

cfu/ml

Ñoái chöùng V. harveyi V. harveyi + Bacillus 2.2 V. harveyi + Bacillus 11.4

62

còn 35 x 105 cfu/ml và tăng lên 77,4x105 cfu/ml ở 144 giờ. Trong nghiệm

thức V. harveyi + BacillusB11.4, số lượng tế bào Vibrio sp biến động từ

176x105 cfu/ml ở 48 giờ giảm còn 28x105 cfu/ml ở 96 giờ và tăng lên

78,5x105 ở 144 giờ, điều đó cho thấy rõ việc nghiên cứu sử dụng vi khuẩn

có lợi có tính chất probiotic hoàn toàn đúng hướng, trong giai đầu các

chủng Bacillus sp thích nghi dần và sau một thời gian nhất định có sự gia

tăng về mật độ và kiểm soát sự tăng trưởng vi khuẩn Vibrio sp hơn 60 %

so với đối chứng giúp cân bằng hệ sinh thái.

3.1.3.4. Sự biến động Bacillus sp trong ruột tôm:

Hình 3.10: Sự biến động số lượng Bacillus sp trong tôm

Dựa trên kết qủa trình bày ở hình 3.10 chúng tôi có một số nhận xét sau:

Vi khuẩn Bacillus sp tồn tại được trong cơ thể tôm sú. Số lượng tế bào

Bacillus B2.2 từ 95 cfu/ml ở 48 giờ tăng lên 6,57x104cfu/ml ở 96 giờ và

giảm xuống còn 2,3x104 cfu/ml ở 144 giờ. Số lượng tế bào Bacillus

B11.4 trong cơ thể tôm đạt 96 cfu/ml ở 48 giờ, sau đó tăng lên đến

6,52x104cfu/ml ở 96 giờ và ở 144 giờ giảm còn 3,92x104 cfu/ml các

chủng vi sinh vật hữu ích này đã chứng tỏ cho chúng ta thấy rõ là có sự

tồn tại, giúp cân bằng hệ thống vi khuẩn có ích trong đường ruột ức chế

vi khuẩn có hại, giúp thúc đẩy quá trình tiêu hoá và hấp thu dinh dưỡng

vật nuôi.

63

3.2. NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM EM :

3.2.1. Chọn chủng vi khuẩn lactic:

Nhằm có hệ vi khuẩn lactic thích hợp để sử dụng trong sản xuất EM,

chúng tôi đã phân lập vi khuẩn lactic từ nước dưa chua các lọai. Tiếp theo

xác định khả năng sinh acid lactic của từng chủng bằng phương pháp cấy

trên môi trường MRS có CaCO3 1% và glucose được thay bằng mật rỉ

đường mía. Sau thời gian nuôi 3-5 ngày, đo vòng phân giải CaCO3 để

đánh giá khả năng sinh acid lactic. Kết quả trình bày ở bảng 3.2 cho thấy:

có sự khác nhau về khả năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn

lactic đã phân lập được. Các chủng cho nhiều acid lactic là Lac 1, Lac 5,

Lac 8, Lac 16, Lac 19, Lac 20.

Bảng 3.2: Đặc điểm phát triển và tạo acid lactic của các chủng vi khuẩn

lactic.

Ký hiệu Kiểu tế bào Phân loại Vùng

phân giải

CaCO3,

mm

Mầu sắc môi trường

EM-1

Lac 1 Hình que Lactobacillus sp 10,5 Vàng, đồng đều

Lac 2 Hình que L. acidophilus 8,0 Vàng, đồng đều

Lac 3 Hình que Lactobacillus sp 4,5 Ít vàng, tế bào lắng

Lac 4 Hình que L. acidophilus 9,0 Vàng, đồng đều

Lac 5 Hình que, nhỏ Lactobacillus sp 12,5 Vàng, đồng đều

Lac 6 Hình que Lactobacillus sp 5,5 Ít vàng, tế bào lắng

Lac 7 Hình que Lactobacillus sp 5,0 Vàng, đồng đều

Lac 8 Hình que Lactobacillus sp 12,5 Vàng, đồng đều

Lac 9 Hình cầu Streptococcus sp 0,5 Ít vàng

Lac 10 Hình cầu Streptococcus sp 0,5 Ít vàng

64

Lac 11 Hình que nhỏ Lactobacillus sp 7,5 Vàng, đồng đều

Lac 12 Hình que Lactobacillus sp 7,5 Vàng, đồng đều

Lac 13 Hình cầu Streptococcus sp 1,0 Ít vàng

Lac 14 Hình cầu Streptococcus sp 1,0 Ít vàng

Lac 15 Hình que Lactobacillus sp 1,0 Ít vàng

Lac 16 Hình que, nhỏ Lactobacillus sp 11,5 Vàng, đồng đều

Lac 17 Hình que mảnh Lactobacillus sp 8,5 Vàng, đồng đều

Lac 18 Hình que Lactobacillus sp 8,5 Vàng, đồng đều

Lac 19 Hình que, ngắn Lactobacillus sp 13,5 Vàng, đồng đều

Lac 20 Hình que Lactobacillus sp 13,5 Vàng, đồng đều

Các kết quả định danh của chúng tôi và của viện Pasteur Tp Hồ Chí

minh cho thấy các chủng Lac 1, Lac 2, Lac 5 , Lac 8, Lac 19, Lac 20 đều

thuộc giống Lactobacillus sp, các chủng Streptococcus sp. Phát triển

chậm trên môi trường rỉ đường và sinh acid lactic kém hơn các chủng

Lactobacillus sp.

65

Hình 3.11: Lactobacillus sp. Lac 1 ; Lactobacillus acidophilus Lac 2

Hình 3.12: Lactobacillus sp. Lac 3 ; Lactobacllus acidophilus Lac 4

66

Hình 3.13: Lactobacillus sp. Lac 5 ; Lactobacillus sp. Lac 6

Hình 3.14: Lactobacillus sp. Lac 7 ; Lactobacillus sp. Lac 8

67

Hình 3.15: Streptococcus sp. Lac 9 ; Streptococcus sp. Lac 10

Hình 3.16: Lactobacillus sp. Lac 11 ; Lactobacillus sp. Lac 12

Hình 3.17: Streptoccocus sp. Lac 13; Streptococcus sp. Lac 14

68

Hình 3.18: Lactobacillus sp. Lac 16 ; Lactobacillus sp. Lac 17

Hình 3.19: Lactobacillus sp. Lac 18 ; Tế bào vi khuẩn Lactobacillus sp

3.2.2. Chọn chủng nấm men:

Để sản xuất EM còn cần hai thành phần khác là vi khuẩn quang hợp

chọn lọc và nấm men. Hai nhóm vi sinh này chúng tôi sử dụng các chủng

có sản trong phòng thí nghiệm, đó là các chủng chúng tôi đã phân lập

được từ các nghiên cứu trước đây, như chủng Saccharomyces cerevisiae

TN 14 chúng tôi phân lập từ bánh men thuốc bắc, còn các chủng vi khuẩn

quang hợp Rhodobacter TN 10 và Rhodopseudomonas TN 11 chúng tôi

đã phân lập từ nước ao hồ .

Candida utilis là chủng nấm men thường xuất hiện trong các mẫu EM

được kiểm tra, tuy nhiên tôi cho rằng không cần đưa Candida utilis vào

69

trong quá trình sản xuất vì chúng có khá nhiều trong rỉ đường, nên trong

quá trình sản xuất với điều kiện không thật vô trùng Candida utilis sẽ

luôn có mặt trong sản phẩm. Nồng độ Candida trong sản phẩm sẽ tăng

lên nhanh chóng khi sản phẩm để lâu và không đảm bảo sự yếm khí, và ở

đây sẽ là điều bất lợi vì Candida sẽ sử dụng mất acid lactic làm sản phẩm

bị thối.

3.2.3. Chế tạo chế phẩm EM

3.2.3.1. Nguyên liệu:

Nguyên liệu sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh trong EM gồm

các thành phần sau:

• Nguồn cacbon: Vi sinh vật quang tự dưỡng tía không lưu huỳnh có thể

nhận năng lượng nhờ quá trình photophosphoryl hóa, và cố định carbon

từ CO2 qua chu trình Calvin –Benson trong điều kiện yếm khí có ánh

sáng, ngược lại ở điều kiện trong tối thì nhóm vi khuẩn này sử dụng các

hợp chất hữu cơ qua hô hấp hiếu khí hoặc lên men trong điều kiện yếm

khí.

• Nấm men, xạ khuẩn, vi khuẩn lactic là vi sinh vật hóa dị dưỡng sử dụng

sử dụng các phân tử hữu cơ làm nguồn carbon và nguồn năng lượng.

Nguồn cácbon sử dụng để nuôi cấy các vi sinh vật thuộc nhóm này là rỉ

đường.

• Rỉ đường: Mật mía không kết tinh được trong quá trình sản xuất đường

thường gọi là rỉ đường. Tỷ lệ rỉ đường chiếm 3-3,5% trọng lượng của

mía. Rỉ đường là nguồn cacbon rẻ tiền, bên cạnh hàm lượng đường cao

trong rỉ đường còn chứa một lượng đáng kể nitrogen, vitamin và các

muối vi lượng. Trong rỉ đường có chứa một số chất keo, vi sinh vật tạp

nhiễm làm bất lợi cho quá trình lên men sau này.

• Rỉ đường trước khi sử dụng cần phải xử lý để loại các chất độc hại như

các kim loại nặng, các chất keo vi sinh vật không sử dụng được hoặc hệ

vi sinh vật tạp nhiễm có trong rỉ đường. Trong rỉ đường có 15 - 20 %

nước và 80-85% chất khô hòa tan. Trong chất khô có tới >=50 % là

70

đường, thường gọi là đường tổng số hay đường lên men được, trong đó

có 30 -35% là đường saccharose ( C12) và 15 -20 % là đường khử

(glucose, fructose ) (C6), phần còn lại 50 % chất khô là những chất không

phải đường, trong đó có 30-32 % là chất hữu cơ và 18 -20 % là chất vô

cơ.

Các lọai muối vô cơ loại thường sử dụng trong công nghiệp hoặc

nông nghiệp có thể sử dụng làm môi trường để đảm bảo các yếu tố N,P,K

và các nguyên tố vi lượng cho sự phát triển của vi sinh vật trong EM như

: (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, H3PO4, KH2PO4, K2HPO4, KCl, K2SO4,

MgSO4, MnSO4, HCl.

Malt trích ly: Dịch trích ly malt rất thích hợp để nuôi cấy nấm men,

xạ khuẩn. Hàm lượng chất khô chiếm 90-92%, trong đó có đường đơn

(glucose, fructose), đường đôi (sacchrose, maltose), đường ba

(maltotriose) và dextrin. Ngoài ra còn có protein, peptit, axit amin, purin,

pirimidin, vitamin. Thành phần hóa học của malt trích ly thay đổi theo

các loại hòa thảo sử dụng.

Nấm men trích ly: Vi khẩn lactic, nấm men, vi khuẩn quang dưỡng, xạ

khuẩn, vi khuẩn acetic… phát triển tốt trong môi trường khi có mặt của

nấm men trích ly. Để trích ly nấm men chúng ta có thể sử dụng các loại

enzym, sử dụng acid HCL hay phương pháp tự ly ở 50-55oC, tiêu nguyên

sinh chất bằng muối ăn ở nồng độ cao. Nấm men chứa nhiều axit amin,

peptid, vitamin nhóm B và các hyratcacbon. Các glycogen và trehalose

trong quá trình xử lý thủy phân thành glucose. Thành phần hóa học của

các chế phẩm nấm men trích ly phụ thuộc vào nguyên liệu và công nghệ

sản xuất.

Pepton: Trong giai đoạn nhân giống cần sử dụng pepton. Thành phần

của các loại pepton thay đổi tùy theo nguyên liệu (thịt, cazein, gelatin, bột

đậu nành, bột hạt bông, hoặc bột hạt hướng dương). Pepton sản xuất từ

gelatin có nhiều prolin, hydroxiprolin nhưng lại thiếu các axit amin chứa

lưu huỳnh, còn pepton sản xuất từ keratin thì lại có nhiều prolin, và

cistein nhưng thiếu lizin.

71

• Các pepton sản xuất từ nguyên liệu thực vật (đậu nành, hạt bông đã nảy

mầm để làm thuốc) lại có nhiều hydrat cacbon. Công nghệ sản xuất cũng

ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng sản phẩm, pepton sản xuất bằng

phương pháp thủy phân bằng enzim khác với phương pháp thủy phân

bằng axit.

3.2.3.2. Sơ đồ khối tạo chế phẩm EM

Giống vi sinh sử dụng trong sản xuất EM:

Để tạo chế phẩm EM gốc chúng tôi sử dụng 3 nhóm vi sinh vật chính

là vi khuẩn lactic, vi khuẩn quang hợp và nấm men. Các vi sinh vật này

đều được tách từ tự nhiên có ở Việt nam như từ dưa chua, từ đất vườn,

đất rừng, không phải là các biến chủng.

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ khối chế tạo EM gốc và các loại EM khác

Giống: vi khuẩn

lactic các loại

Giống: Vi khuẩn

quang hợp các loại

Giống: Nấm

men các loại

Giống : Xạ

khuẩn các loại

Nhân giống vi khuẩn

lactic Nhân giống vi

khuẩn quang

hợp

Nhân

giống nấm

men

Nhân

giống xạ

khuẩn

EM- gốc

EM hoạt hóa EM Bokashi Các loại EM khác EM X, EM 5, EM F.P.E

72

Các chủng sử dụng có tên khoa học là: Lactobacillus acidophilus,

Lactobacilus sp. , Rhodobacter sp., Rhodopseudococcus sp. ,

Actinomyces sp. ,Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis.

3.2.3.3. Sự biến đổi pH khi nuôi EM:

pH là một trong những chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm EM, vì vậy

chúng tôi đã theo dõi sự biến động pH trong quá trình lên men EM, mặt

khác pH giảm chũng chính là acid lactic được sinh ra.

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Thôøi gian, ngaøy

pH

Hình 3.20: Sự biến động pH của khi nuôi EM .

Sự biến động pH trình bày ở hình 20 cho thấy: pH đã giảm mạnh từ

ngày thứ nhất đến ngày thứ 4 và sau đó pH giữ ở mức 3,6 gần như không

đổi. Điều này có thể lý giải được là hầu hết các chủng vi khuẩn lactic đều

bị ức chế phát triển khi pH ở 4,5. Vì vậy trong sản xuất acid lactic người

ta luôn luôn phải sử dụng CaCO3 để giữ cho môi trường ở pH gần trung

tính, acid lactic sinh ra sẽ tạo thành lactat canci, hoặc bằng phương pháp

thẩm tích để tách acid lactic ra khỏi môi trường lên men. Trong sản xuất

EM hiện nay người ta chưa chú ý đến hàm lượng acid lactic trong sản

phẩm mà chỉ yêu cầu pH dưới 4 để giữ sản phẩm được ổn định.

73

3.2.3.4. Kết quả kiểm tra vi sinh trong EM :

Kết quả kiểm tra thành phần vi sinh trong chế phẩm EM gốc cho thấy:

tất cả các chỉ tiêu đều đạt, không có vi sinh vật gây bệnh. Số lượng vi

khuẩn lactic đạt khá cao 1010, Ở Việt nam riêng Bộ Thủy Sản đưa ra yêu

cầu các chế phẩm vi sinh được phép sử dụng trong nuôi thủy sản là 109.

Các kết quả phân tích của chúng tôi về vi khuẩn quang hợp đạt trên 104

MPN/ml. Riêng nấm men trong chế phẩm EM của chúng tôi giữ ở mức

thấp, vì theo chúng tôi không cần đưa nấm men lên cao, tác dụng của

nấm men là cung cấp vitamin cho vi khuẩn lactic và vi khuẩn quang hợp

phát triển và sử dụng oxy để tạo điều kiện yếm khí cho vi khuẩn lactic và

vi khuẩn quang hợp lên men. Điều kiện lên men sản xuất EM-1 tại Trung

tâm ứng dụng Khoa học Công nghệ Tây Ninh đã đưa nấm men trích lý và

nước chiết giá cung cấp vitamin cho vi khuẩn lactic và vi khuẩn quang

hợp phát triển và điều kiện yếm khí tốt nên số lượng nấm men thấp là một

điều dễ hiểu.

Bảng 3.3 : Số lượng vi sinh trong EM

STT Các chỉ tiêu xét nghiệm Kết quả,

CFU/ml

Phương pháp

thử

1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí 83.000 NF V08-051

2 E. coli giả định < 0,3 NF V08-020

3 Salmonella Âm tính/25ml NF V08-052

4 Staphylococcus aureus <1 NF V08-057-1

5 Tổng số nấm mốc <1 ISO 7954

6 Tổng số nấm men 160 ISO 7954

7 Tổng số vi khuẩn Lactic 4,6 × 1010 NF V04-503:88

74

3.3. KẾT QUẢ SO SÁNH ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM EM VÀ

BACILLUS SP ĐẾN CHẤT LƯỢNG NƯỚC VÀ HIỆU QUẢ NUÔI

TÔM:

3.3.1 Ảnh hưởng chế phẩm Bacillus đến chất lượng nước ao nuôi

tôm tại Cần Giờ và Nhà Bè:

Dùng chế phẩm sinh học trong nuôi tôm điều quan trong nhất là giải

quyết vấn đề môi trường nuôi tôm và tăng sức đề kháng cho con tôm hạn

chế tối đa việc phát sinh mầm bệnh trong quá trình nuôi, tạo cho con tôm

có môi trường thiên nhiên bền vững nhờ vi sinh hấp thụ các thức ăn dư

thừa, các chất bài tiết, hấp thụ các loại khí độc và tạo nên sinh vật phù du

có ích cho tôm.

Trong quá trình nuôi thâm canh thì việc dùng chế phẩm vi sinh trở

nên đặc biệt quan trọng, tuy nhiên sau quá trình thu hoạch nếu ta không

xử lý và cải tạo đáy ao cho thiệt tốt thì trong quá trình nuôi vuông tôm rất

bẩn. Vì vậy việc xử dụng chế phẩm vi sinh xử lý ao là điều quan trọng và

rất cần thiết. Lượng chế phẩm mà chúng ta đưa vào không những phụ

thuộc vào mật độ mà còn phụ thuộc vào hệ sinh thái của đáy ao, độ nhiễm

bẩn của nguồn nước và môi trường tự nhiên.

3.3.1.1. Khảo nghiệm chế phẩm tại Cần Giờ:

Các thí nghiệm đánh giá hiệu quả của các chế phẩm vi sinh probiotics

được tiến hành thử nghiệm tại xã Lý Nhơn, xã Tam Thôn Hiệp, Huyện

Cần Giờ Tp. HCM, thời gian sử dụng bắt đầu nuôi tới khi thu hoạch. Mật

độ tôm nuôi là 40 con/m2.

75

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến tỷ lệ sống và năng suất

tôm.

STT Ao nuoâi toâm A1

Thöû

nghieäm

A2

Thöû

nghieäm

A3

Ñoái

chöùng

1 Dieän tích ao (m2) 3300 3400 2500

2 Soá löôïng thaû, PL15. 148500 153000 112500

3 Tyû leä soáng sau 7 ngaøy thaû,

%.

90 80 80

4 Tyû leä soáng, %. 44,9 56,6 32

5 Naêng suaát, kg/ha. 3030 3235 1200

6 Toác ñoä taêng tröôûng, g/ngaøy. 0,15 0,14 0,07

7 Soá toâm trong moät kg thöông

phaåm (con/kg)

60 63 120

Nhận xét:

- Tỷ lệ sống ở các ao thử nghiệm chế phẩm vi sinh cao hơn ao đối

chứng.

- Tốc độ tăng trưởng (ADG) ở ao A1, A2 và A3, cao gấp đôi ao đối

chứng.

- Năng suất tôm thu hoạch ở ao đối chứng chỉ bằng một phần ba so với ao

thử nghiệm.

- Các chỉ tiêu hoá lý của các ao nuôi tôm thử nghiệm có probiotic đều đạt

các tiêu chuẩn cho phép.

76

3.3.1.2. Khảo nghiệm chế phẩm ở huyện Nhà Bè:

Các thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩm được tiến hành thử

nghiệm tại xã Hiệp Phước, Huyện Nhà Bè Tp. HCM. Thí nghiệm được

tiến hành như sau:

Bảng 3.5: Báo cáo giai đoạn các kết quả thử nghiệm chế phẩm trong

ao nuôi tôm sú:

STT Chæ tieâu theo doõi Hoï vaø teân chuû ao nuoâi toâm

Thanh Truùc

01 Dieän tích(m2) 2.000 3.000

02 Maät ñoä thaû toâm (con/m2) 20 20

03 Thôøi gian thöû nghieäm 80 ngày 80 ngày

04 Kích côõ toâm (con/kg) 70 80

05 Naêng suaát (kg/ha) 5.280 3.333

06 Löôïng thöùc aên (kg) 1.000 1.500

07 Ghi chuù Toâm thu hoaïch do

ñöôïc giaù

Toâm thu hoaïch do

ñöôïc giaù (ao ñoái

chöùng)

77

3.3.1.3. Một số chỉ tiêu hóa lý phân tích ao thử nghiệm:

Một số chỉ tiêu nước được quan trắc trực tiếp một số tại ao và một

số chỉ tiêu còn lại được mang về phòng thí nghiệm phân tích theo TCVN

6663-1-2010, kết quả trình bày bảng 3.4 cho thấy có sự biến động liên tục

tăng/giảm không theo một qui luật nhất định trong suốt quá trình nuôi,

điều này phụ thuộc nhiều yếu tố tác động như kỹ thuật nuôi, nhiệt độ, thời

tiết,…Tuy nhiên nhìn chung ở những ao thí nghiệm có sử dụng chế phẩm

sinh học thì chất lượng nước tương đối ổn định và tôm có tỷ lệ sống, tốc

độ tăng trưởng tốt các chỉ tiêu nằm trong giới hạn cho phép trong nuôi

trồng thủy sản.

Bảng 3.6: Biến động các yếu tố chất lượng nước trong ao nuôi tôm.

STT Chỉ tiêu theo dõi Min Max

1 pH 6,5 8,7

2 Độ mặn S %o 3,5 11,9

3 Nhiệt độ oC 28 32

4 Kiềm (mg/l) 51 102

5 DO (mg/l) 0,35 7,7

6 NH3+-N (mg/l) 0,015 0,06

7 NO2--N (mg/l) KPH KPH

8 H2S (mg/l) KPH Vết

9 Cond (mS/cm) 0,64 2,07

10 COD (mg/l) 25,24 50,4

11 BOD5 (mg/l) 9,6 34,5

78

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN:

Đã chọn lọc từ 30 chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả năng đối kháng

với vi khuẩn Vibrio sp và khả năng phân giải protein và tinh bột đã chọn

lọc được 2 chủng Bacillus 2.2, 11.4 vừa có tính đối kháng mạnh Vibrio sp

và có khả năng phân giải tinh bột và protein cao để tạo chế phẩm Bacillus

sp sử dụng trong nuôi tôm.

Đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn lactic có khả

năng sử dụng để chế tạo chế phẩm EM gốc, chất lượng của chế phẩm EM

gốc đã được đánh giá về thành phần vi sinh có ích và vi sinh gây bệnh.

Đã tiến hành thử nghiệm trong phòng và thử nghiệm trên ao nuôi tôm

về ảnh hưởng của hai chế phẩm Bacillus 18 và EM 18 đến chất lượng

nước trong ao nuôi tôm cũng như hiệu quả phòng chống Vibrio sp cho

thấy cả hai chế phẩm đều có hiệu quả cao trong cải thiện chất lượng nước

ao nuôi tôm và phòng chống Vibio sp gây bệnh cho tôm nuôi.

4.2. KIẾN NGHỊ:

Mong được ứng dụng hai chế phẩm vi sinh Bacillus 18 và EM 18

trong môi hình nuôi tôm siêu thâm canh (Biofloc).

79

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Báo cáo tổng cục thủy sản, 2018. Hội nghị tổng kết công tác năm

2018 và triển khai nhiệm vụ năm 2019 của Tổng cục Thủy sản.

2. Nguyễn Hữu Phúc. 2001-2002. Ứng dụng công nghệ sinh học trong

phòng chống bệnh vi khuẩn, virus bảo vệ môi trường nuôi tôm vùng

duyên hải đồng bằng sông Cửu Long. Đề tài NCKH cấp Trung tâm

KHTN &CNQG.

3. Gomez-Gil, Bruno & Roque, Ana & F. Turnbull, James. The use and

selection of probiotic bacteria in the larval culture of aquatic

organisms. Aquaculture. No. 191. p259-270, 2000.

4. Ngo, Hai & Fotedar, Ravi, 2010. A Review of Probiotics in Shrimp

Aquaculture. Journal of Applied Aquaculture. No. 22. p. 251-266.

5. Maeda, M. and IC Liao, 1992. Influence of microbial communities to

the development of the larvae,Penaeus . Aquaculture 21: (25-29).

6. Jiravanichpaisal P, P Chuaychuwong and P Menasveta. The use of

Lactobacillus sp. as the probiotic bacteria in the giant tiger shrimp,

Penaeus monodon. Proceedings of the poster session of the 2nd Asia-

Pacific marine biotechnology conference and 3rd Asia-pacific

conference on algal biotechnology,no. 2, p. 13-16, 1997.

7. QIAN Dayi, ZHU Yidan, SONG Cunyi, PAN Jiantong Civil and

Environmental Engineering School, University of Science and

Technology Beijing, Beijing 100083, China; Growth conditions of

photosynthetic bacteria[J];Journal of University of Science and

Technology Beijing; 2005-02.

8. Ahmmed, Fatema & Ahmmed, Mirja & Saifuddin Shah, Md & Banu,

Ghausiatur. Use of indigenous beneficial bacteria (Lactobacillus spp.)

as probiotics in shrimp (Penaeus monodon) aquaculture. Research in

Agriculture Livestock and Fisheries. No. 5. p. 127-135, 2018.

9. Tạp chí số 04 2014. Nghề cá sông Cửu Long. Viện Nghiên Cứu Nuôi

trồng Thủy Sản 2, ISSN 1859-1159.

80

10. Bestha Lakshmi, Buddolla Viswanath and D.V.R.Sai Gopal Journal

of Pathogens. Probiotics as Antiviral Agents in Shrimp Aquaculture.

Vol 2013, Article ID 424123, 13 pages.

11. Anukam, Kingsley & Reid, Gregor. (2007). Probiotics: 100 years

(1907-2007) after Elie Metchnikoff's Observation. Communicating

Current Research and Educational Topics and Trends in Applied

Microbiology.

12. Higa, T. 1995, “What is EM technology”, College of Agriculture,

University of Ryukyus, Okinawa, japan.

13. Higa, T. & Chinen, N. 1998, “EM treatments of odor, waste water,

and environmental problems”, College of Agriculture, University of

Ryukyus, Okinawa, japan.

14. Higa, T. 1993, An Earth saving revolution, Sunmark Publishing

Tokyo, Japan.

15. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Tỵ (2005), Vi

sinh vật học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

16. Smith, B. W., and J. H. Roe.1949. A. Photometric methol for the

determinatoo of α-amylase in blood and urine with use of starch-

iodine color. J. Biol. Chem. 179:53-56, 1949.

17. Hunter CN, Daldal F, Thurnauer MC and Beatty JT (2009), The

Purple Phototrophic Bacteria, Chapter 1: An Overview of Purple

Bacteria: Systematics, Physiology, and Habitats, pp 2-12.

18. Castenholz RW and Schneider AJ (1993) Cyanobacterial dominance

at high and low temperatures: Optimal conditions or precarious

existence? In: Guerrero R and Pedros-Alio C (eds), Trends in

Microbial Ecology, pp19–24. Spanish Society for Microbiology,

Barcelona.

19. Sasikala C, Ramana CV 1995). Biotechnological potentials of

anoxygenic phototrophic bacteria. I. Production of single-cell protein,

vitamins, ubiquinones, hormones, and enzymes and use in waste

treatment. Adv Appl Microbiol. No. 41: p.173-226.

81

20. Chung, Ying-Chien & Ho, Kuo-Ling & Tseng, Ching-Ping. (2006).

Treatment of High H2S Concentrations by Chemical Absorption and

Biological Oxidation Process. Environmental Engineering Science.

23. 942-953. 10.1089/ees.2006.23.942.

21. Luedin Samuel M., Storelli Nicola, Danza Francesco, Roman

Samuele, Wittwer Matthias, Pothier Joël F., Tonolla Mauro (2019).

Mixotrophic Growth Under Micro-Oxic Conditions in the Purple

Sulfur Bacterium “Thiodictyon syntrophicum”. p. 384.

22. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản nông

nghiệp, Hà Nội, 358 tr.

23. Đinh Thị Thu Hằng, Đỗ Thị Tố Uyên, Văn Thị Như Ngọc và Trần

Văn Nhị ( 2003), Sinh trưởng của một số chủng vi khuẩn quang hợp

tía phân lập tại Việt Nam trong môi trường chứa benzoate và phenol.

Báo cáo khoa học Hội nghị Toàn quốc lần thứ 2, Nghiên cứu cơ bản

trong sinh học, nông nghiệp và y học “ Những vấn đề nghiên cứu cơ

bản trong khoa học sự sống ”, Huế 25, 26/07/2003. Nhà xuất bản

Khoa học và Kỹ thuật, tr 90 – 93.

24. Báo cáo của tổng cục thủy sản “Ngành nuôi tôm toàn cầu thay đổi

theo hướng sản xuất tôm nhỏ hơn”, năm 2017.

25. Cục thú y, Báo cáo tổng kết công tác thú y và kế hoạch công tác thú y

2014-2015.

26. Nguyễn Văn Hảo. năm 2000. Một số vấn đề nuôi tôm sú công nghiệp.

Nhà xuất bản nông nghiệp.

27. Đỗ Thị Hòa. 1996. Nghiên cứu một số bệnh chủ yếu trên tôm sú

(Penaeus monodon) nuôi ở khu vực Nam trung bộ. Luận án tiến sĩ.

28. Boyd, C.E., A. Gross. 1998. Use of Probiotics for improving soil and

water quality in aquaculture ponds. Proceeding to the special session

on shrimp biotechnology 5th Asian fisheries forum Chiengmai,

Thailand 11-14 November 1998, pp102-106.

82

29. Nguyễn Minh Niên. 1994. Current status, constraints and potential of

shrimp seed production in central Vietnam. Master thesis, AIT,

Bangkok, Thailand.

30. Briggs, M.R.P. and Funge-Smith, S-l., 1996. The potential of

Gracilaria spp. meal for supplementation of diets for juvenile

Penaeus monodon Fabricius. Aquaculture Research 27, 345-354.

31. Wyban, Jim & Lee, Cheng-Sheng & T Sato, V & N Sweeney, J &

K Richards, W. (1987). Effect of Stocking Density on Shrimp

Growth Rates in Manure-Fertilized Ponds. Aquaculture. No. 61. p.

61-84.

32. Musig, Y., and Ruttangosrigit, W., 1982. Effect of Salinity on

Survival Rate of Penaeus monodon Larvae, Brakish Water Fish

Diversity. Bangkok, Thailand: Department of Fish., 5: 10.

33. Abu Hena, M.K., Shari fuzzaman, S.M., Hishamuddin, O., Misri,

K., and Abdullah, F., 2008. Pond health Management of black

tiger shrimp Penaeus monodon (Fabricius) using bacterial

products. Diseases in Asian Aquaculture VI, pp.469-476.

34. Muthuwan, V. 1998. A green water recirculation system for

intensive culture of marine shrimp. PhD thesis, AIT, Bangkok,

Thailand.

35. Food and Agriculture Organization of the United Nations. (2013, June

25–27). Report of the FAO/MARD Technical Workshop on early

mortality syndrome (EMS) or acute hepatopancreatic necrosis

syndrome (AHPND) of cultured shrimp (under TCP/-VIE/3304)

(Rep. No. 1053). FAO Fisheries and Aquaculture, Rome, Italy.

36. Han, J., Tang, K., Aranguren, L., & Piamsomboon, P. (2017).

Characterization and pathogenicity of acute hepatopancreatic necrosis

disease natural mutants, pirAB vp (−) V. parahaemolyticus, and

pirAB vp (+) V. campbellii strains. Aquaculture, 470, 84–90.

37. Anuphap Prachumwat, Suparat Taengchaiyaphum, Natthinee

Mungkongwongsiri, Diva J. Aldama-Cano, Timothy W. Flegel and

Kallya Sritunyalucksana. Journal of the World Aquaculture Society-

Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease. Volume 50, Issue 1,

Pages 5-17, September 4, 2018.

83

PHỤ LỤC

Phụ lục các môi trường sử dụng:

Môi trường 1: (môi trường xác định khả năng tạo enzym amylase của vi

khuẩn)

-Pepton 5g

-Thịt bò 50g

-Tinh bột 3g

-NaCl 10g

-Nấm men trích ly 1g

-MgSO4.7H2O 0.123g

-MnSO4.4H2O 0.002g

-CaCl2.4H2O 0.0183g

-ZnSO4 0.014g

-FeSO4 0.02g

-Agar 20g

-Nước cất 1000 ml

-pH = 7,5

Môi trường 2: (môi trường xác định khả năng tạo enzym protease của vi

khuẩn)

-Gluco 8g

-Thịt bò 50g

-NaCl 10g

-Casein 3g

-Nấm men trích ly 1g

-MgSO4.7H2O 0.123g

84

-MnSO4.4H2O 0.002g

-CaCl2.4H2O 0.0183g

-ZnSO4 0.014g

-FeSO4 0.02g

-Agar 20g

-Nước cất 1000 ml

-pH = 7,5

Môi trường 3: (trích ly enzym - amylase)

-Pepton 10g

-Tinh bột 30g

-Nấm men trích ly 2g

-KH2PO4 7g

-MgSO4.7H2O 0.123g

-MnSO4.4H2O 0.002g

-CaCl2.4H2O 0.0183g

-ZnSO4 0.014g

-FeSO4 0.02g

-Agar 20g

-Nước cất 1000 ml

-pH = 7,5

Môi trường 4: (trích ly enzym protease)

-Đậu nành 30g

-Gluco 10g

-Nấm men trích ly 2g

-KH2PO4 7g

85

-MgSO4.7H2O 0.123g

-MnSO4.4H2O 0.002g

-CaCl2.4H2O 0.0183g

-ZnSO4 0.014g

-FeSO4 0.02g

-Agar 20g

-Nước cất 1000 ml

-pH = 8

Môi trường 5: (môi trường nuôi cấy, hoạt hoá giống, cấy chuyền)

-Pepton 15g

-Thịt bò 100g

-Nấm men trích ly 5g

-Na-Citrat 10g

-NaCl 10g

-Saccharoz 10g

-Glucose 20g

-KH2PO4 2g

-MgSO4.7H2O 0.123g

-MnSO4.4H2O 0.002g

-CaCl2.4H2O 0.0183g

-ZnSO4 0.014g

-FeSO4 0.02g

-Agar 20g

-Nước cất 1000 ml

-pH = 8

86

Môi trường MRS (giữ giống vi khuẩn lactic):

Peptone 10g

Cao thịt 8g

Cao nấm men 4g

Glucose 20g

Tween 80 1ml

KH2PO4 2g

Diammonium hydrogen citrate 2g

Sodium acetate 5g

MgSO4 0,2g

MnSO4 0,04g

Nước cất 1000ml

pH =5,8

Thanh trùng 1210C/20 phút

Môi trường 802 ( giữ giống và nuôi vi khuẩn quang hợp) :

Pepton 10g

Yeast extract 5g

MgSO4 1g

Meat extract 5g

Agar 20g

Nước 1lít

pH-7,2

Thanh trùng 1210C/20 phút

87

Môi trường Czapek Dox (giữ giống và nuôi nấm men, nấm sợi):

NaNO3 5g

K2HPO4 1g

KCl 0,5g

MgSO4.7H2O 0,5g

FeSO4.7H2O 0,01g

Saccharose 30g

Agar 20g

Streptomycin., penicillin 0,1 g , 01g

Nước 1 lít

pH=6,6

Thanh trùng 1210C/20 phút

MT Gauze (nuôi và giữ giống xạ khuẩn ):

Tinh bột 20

NaCl 0,5

(NH4)2SO4 1,0

KH2PO4 1,0

MgSO4.7H2O 1,0

Agar 20g

Nước máy 1000ml

pH=7

Thanh trùng 1210C/30 phút

88

CÁC MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG

Môi trường nhân giống vi khuẩn lactic

Pepton 5g

Yeast extract 5g

Glucose 50g

Nước chiết gía 200g

KCl 2g

KH2PO4 2g

MgSO4 0,5g

Nước chiết thịt từ 100g

(NH4)2SO4 1g

Nước đủ 1000ml

pH=5,8 trước khi thanh trùng

Thanh trùng 0,8kg/cm2 /20 phút

Môi trường nhân giống vi khuẩn quang hợp

Pepton 10g

Glucose 10g

Yeast extract 5g

MgSO4 1g

Nước chiết thịt bò từ 100g

Nước 1lít

pH-7,2

Thanh trùng 1210C/20 phút

89

Môi trường nhân giống nấm men

Pepton 5g

(NH4)2 SO4 2g

K2HPO4 1g

MgSO4.7H2O 0,5g

Saccharose 30g

Nước 1 lít

pH=6,6

Thanh trùng 1210C/20 phút

Môi trường sản xuất EM gốc:

Rỉ đường 100g

Nước chiết thịt 50g

Nước chiết giá 100g

Yeast extract 2g

KH2PO4 5g

(NH4)2SO4 2g

Nước 1000ml

pH=5,8

90

Phụ lục 1: Sự biến động số lượng vi khuẩn Vibrio sp trong nước theo thời

gian.

Nghiệm thức Số lượng tế bào theo thời gian (cfu/ml)

0h 48h 96h 144h

Đối chứng 37 7 406 12 3.896 55 5.730 114

Vibrio harveyi 135 2 2.600 60 7.845 74 25.275 407

V. harveyi + Bacillus B2.2 138 2 9.915 112 1.550 89 230 91

V. harveyi + Bacillus B11.4 140 2 12.775 175 6.085 73 450 18

Phụ lục 2: Sự biến động Bacillus sp trong nước nuôi tôm theo thời gian

Nghiệm thức Số lượng tế bào theo thời gian (x 104 cfu/ml)

0h 48h 96h 144h

V. harveyi + Bacillus

B2.2

2,18 1 5,98 1 33,8 3 218 21

V. harveyi + Bacillus

B11.4

2,6 1 5,24 1 25 9 261 76

Phụ lục 3: Sự biến động của Vibrio sp trong tôm theo thời gian:

Nghiệm thức Số lượng tế bào theo thời gian (x 105 cfu/con)

48h 96h 144h

Đối chứng 0,68 0,113 3,55 0,71 200 39,6

Vibrio harveyi 122 14,1 120 13,4 227 2,12

91

V. harveyi + Bacillus B2.2 140 0,71 35 17 77,4 2,26

V. brio + Bacillus B11.4 176 18,4 28 4,6 78,5 12

Phụ lục 4: Sự biến động số lượng Bacillus sp trong tôm theo thời gian:

Nghiệm thức Số lượng tế bào theo thời gian (x 102 cfu/con)

48h 96h 144h

V. harveyi + Bacillus B2.2 0,95 0,71 657 85 230 12

V. harveyi + Bacillus

B11.4

0,96 0,71 652 10,61 392 20

96

Phụ lục 5: Thành phần vi sinh vật trong một số ao nuối tôm tại Cần giờ Tp HCM.

Thöù töï Kí hieäu

chuûng

Hình thaùi khuaån laïc Hình thaùi teá baøo Gram

1 A2.1 Kích thöôùc 1-2mm, traéng môø, troøn boùng, meùp raêng cöa Teá baøo hình oval, xeáp chuoãi -

2 A2.2 Kích thöôùc 4-5mm, vaøng nhaït, boùng deïp, meùp raêng cöa Oval daøi, ñôn, thænh thoaûng

xeáp chuoãi

-

3 A3.1 Kích thöôùc 2.3-4mm, naâu saãm, boùng, troøn, meùp goïn Teá baøo hình oval -

4 A4.2 Kích thöôùc 1.5-2mm, khuaån laïc troøn, traéng ñuïc, boùng,

meùp goïn.

Que to, daøi, keát ñoâi, thænh

thoaûng tuï ñaùm, chuyeån

ñoäng

+

5 A8.1 Kích thöôùc 1mm, khuaån laïc troøn, traéng trong, boùng,

öôùt, loài, meùp goïn.

Teá baøo hình oval nhoû -

6 B1.1 Kích thöôùc 2-3mm, khuaån laïc traéng ñuïc, maët kho, Que nhoû, chuyeån ñoäng +

97

nhaên, meùp raêng cöa nhoû. nhanh

7 B3.1 Kích thöôùc 5-6mm, khuaån laïc traéng ñuïc, ngaû naâu, maët

öôùt nhaên, meùp raêng cöa

Que daøi, xeáp chuoãi, chuyeån

ñoäng nhanh

+

8 B4.1 Kích thöôùc 3-4mm, khuaån laïc troøn, phôùt hoàng, boùng,

meùp goïn.

Teá baøo hình oval daøi, ñôn,

thænh thoaûng xeáp chuoãi

-

9 B4.2 Kích thöôùc 1.5-2mm, khuaån laïc troøn, traéng ñuïc, boùng,

meùp goïn.

Teá baøo hình que, keát ñoâi +

10 B4.3 Khuaån laïc lan, hình caønh caây, khuaån laïc traéng ñuïc,

meùp raêng cöa.

+

11 B5.3 Khuaån laïc lan, maøu ñoû nhaït, boùng, meùp raêng cöa. Hình que nhaùnh, daøi, xeáp

chuoãi

-

12 B5.4 Kích thöôùc 0.5-1mm, khuaån laïc troøn, traéng ñuïc, boùng,

meùp goïn, ôû giöõa loõm.

Hình que daøi, xeáp chuoãi +

98

A: maãu nöôùc B: maãu buøn

13 B6.1 khuaån laïc vaøng, maët nhaên, meùp raêng cöa Hình que daùi +

14 B6.2 Khuaån laïc lan, môø, giöõa naâu, meùp raêng cöa nhoû Oval, xeáp chuoãi -

15 B7.1 Kích thöôùc 4-5mm, traéng trong, troøn, meùp goïn, maët khoâ +

16 B7.3 Kích thöôùc 6-7mm, khuaån laïc lan, maët thaïch, maët khoâ Hình que, thuoân hai ñaàu,

xeáp chuoãi

-

17 B8.1 Kích thöôùc 2-3mm, khuaån laïc troøn, hoàng nhaït, maët

boùng, meùp goïn

Hình que ngaén +

18 B8.2 Khuaån laïc lan, vaøng tranh, maët boùng, meùp raêng cöa Hình que ngaén, xeáp chuoãi +

19 B8.3 Kích thöôùc 4-5mm, khuaån laïc troøn, traéng ñuïc, maët

boùng, meùp goïn

Hình que daøi, ngaén, xeáp

chuoãi

+

99

Phụ lục 6: Các chỉ tiêu phân tích hóa lý theo thời gian thử nghiệm tại Cần Giờ:

STT Ngaøy ño Ao

ño

pH DO

mg/l

ToC NH3

+ NO2

+ kieàm SS

mg/l

S%o EC Ñoä

trong

Möïc

nöôùc

1 18/12 A1 7,68 0,51 30,1 KPH KPH 51 12 3,4 0,64 45cm 1m

2 A2 7,68 0,35 29,3 KPH KPH 51 14 3,9 0,8 45cm 0,8 m

3 A3 7,81 0,4 29 KPH KPH 68 16 5 0,84 40cm 0,9m

4 26/12 A1 7,2 4,3 30 - - 60 15 3,4 0,64 40cm 0,9m

5 A2 7,1 3 31,7 - - - 15 3,9 0,8 40cm 0,65m

6 A3 7,53 3,1 29,6 - - - 17 5 0,84 30cm 0,8 m

7 3/1 A1 7,94 5,9 31 - - - 2 3,9 0,73 40cm 0,7m

8 A2 8,43 10 31,7 - - - 6 4,3 0,8 30cm 0,65m

9 A3 7,1 8,1 30,5 - - - 8 4,7 0,8 35cm 1,1m

10 9/1 A1 7,9 2 30,1 - - - 2 4,2 0,78 40cm 0,7 m

11 A2 8,5 2,4 30 - - - 2 4,5 0,84 30cm 0,6m

12 A3 - - - - - - 6 - - - -

13 17/1 A1 - - - - - - 8 - - - -

14 A2 7,5 2,5 32,2 - - - 4 4,6 0,85 30cm 0,6m

15 A3 - - - 15 - - - -

16 24/1 A1 8,57 1,9 29,8 - - 51 1 5,1 0,94 30cm 0,7m

17 A2 8,48 1,8 29,7 - - 119 4 5 0,93 30cm 0,6m

18 A3 7,76 1,5 29,4 - - 51 12 5,5 1,02 30cm 0,9m

19 31/1 A1 8,26 2,5 30,9 KPH KPH 68 2 6,4 1,15 40cm 0,9m

20 A2 7,6 2,8 27 KPH KPH 102 0 6,3 1,13 40cm 0,9m

21 A3 7,99 2,5 30,5 KPH KPH 51 10 6,4 1,18 20cm 0,8m

100

Phụ lục 7: Các chỉ tiêu phân tích hóa lý ao anh Thanh Trúc theo thời gian

thử nghiệm tại Nhà Bè:

STT Ngaøy phaân tích 19/7 26/7 02/8 9/8

01 pH 8,11 7,78 8,37 7

02 S%o 6,3 5,9 5,4 5

03 TDS (g/l) 6,06 5,69 5,22 4,89

4 Cond (mS/cm) 11,73 11,06 9,99 9,78

5 ToC 29,1 28,50 28,27 30,1

6 COD (mg/l) 53 - 37 35

7 NO2--N (mg/l) 0,03 0,027 0,047 0,057

8 NO3--N (mg/l) 1,9 1 1,1 1,6

9 BOD5 (mg/l) 13 5 - 6,4

10 NH3+-N(mg/l) 0,32 1,05 1,69 1,9

11 S2- (g/l) 117 84 98 55

12 DO (mg/l) 7,96 8,43 6,23 4,8

13 Coliform toång soá (tb/ml) 8,1x104 - - 1,1

14 H (m) - - - 1,02