Pencegahan Herpes SimplexVirus diinduksi Stroma Keratitis oleh
Glycoprotein B-Spesifik Antibodi monoklonalABSTRAK
Meningkatnya insiden asiklovir (ACV) dan strain resisten pada
pasien dengan kornea HSV-1 infeksi yang menyebabkan herpes stroma
Keratitis (HSK) merupakan masalah kesehatan utama di negara-negara
industri dan sering mengakibatkan kebutaan. Untuk mengatasi kendala
ini, kami sebelumnya telah mengembangkan antibodi monoklonal
HSV-gB-spesifik (mAb 2c) yang terbukti sangat protektif di
imunodefisiensi NOD / SCID-tikus terhadap infeksi genital. Dalam
penelitian ini, kami menguji efektivitas mAb 2c dalam mencegah
penyakitimmunopathological HSK dalam model mouse / c HSK BALB. Oleh
karena itu, tikus diinokulasi dengan HSV-1 regangan KOS pada kornea
diskarifikasi untuk menginduksi HSK dankemudianbaik secara sistemik
atau topikal diperlakukan dengan mAb 2c. Pengobatan sistemik
dilakukan dengan pemberian intravena mAb 2c 24 jam sebelum infeksi
(pre-exposure prophylaxis) atau 24, 40, dan 56 jam setelah infeksi
(post-exposure imunoterapi). Pengobatan topikal dilakukan oleh
inokulasi berkala (5 kali per hari) dari antibodi yang mengandung
tetes mata sebagai kontrol, mulai dari 24 jam pasca infeksi.
Pengobatan antibodi sistemik nyata mengurangi viral load pada
tempat infeksi dan benar-benar melindungi tikus dari mengembangkan
HSK. Administrasi antibodi infeksi sebelumnya atau posting
antivirus sama-sama efektif. Pengobatan topikal tidak berpengaruh
meningkatkan pada tingkat keparahan HSK. Kesimpulannya, data kami
menunjukkan bahwa mAb 2c terbukti menjadi obat yang sangat baik
untuk pengobatan infeksi HSV kornea dan untuk pencegahan HSK dan
kebutaan. Selain itu, rekan manusiawi (mAb hu2c) sama-sama efektif
dalam melindungi tikus dari HSV-induced HSK jika dibandingkan
dengan antibodi tikus tua. Hasil ini menjamin pembangunan masa
depan antibodi ini sebagai pendekatan baru untuk pengobatan kornea
HSV-infeksi pada manusia.Introduksi
Okular Herpes Simplex Virus tipe 1 (HSV-1) diinduksi keratitis
adalah salah satu penyebab utama kebutaan menular di dunia
industri. Insiden global HSV disebabkan penyakit mata kira-kira 1,5
juta, termasuk perkiraan jumlah 40.000 kasus baru gangguan
penglihatan bermata parah atau kebutaan setiap tahun [1]. HSV-1
infeksi kornea sering mengakibatkan penyakit mulai dari radang
epitel ringan sampai ulserasi kronis kornea yang dimediasi system
imun, seperti keratitis stroma nekrotik berat, juga disebut herpes
stroma Keratitis (HSK) [2, 3]. Setelah infeksi primer kornea virus
bereplikasi di epitel kornea dan bermigrasi ke ganglion trigeminal
dengan memindahkan langsung antara sel-sel epitel yang berdekatan,
dari sel epitel ke neuron, dengan transportasi aksonal intraseluler
dan melalui transfer di sinapsis saraf untuk menyebar dari perintah
pertama ke perintah kedua neuron rangka[4]. Kedua, penyebaran
sel-sel dan transportasi aksonal intraseluler adalah mekanisme
kunci dari HSV untuk memfasilitasi penyebaran virus secara cepat
dan melarikan diri dari host sistem pertahanan imun seluler dan
humoral [5]. HSV terjadinya laten, infeksi asimtomatik dalam neuron
dari sistem saraf perifer. Reactivasi berkala virus laten dan
transmisi dari ganglia trigeminal ke menyebar ke pinggiran melalui
sel ke sel dapat menyebabkan infeksi berulang dari kornea
berhubungan dengan lesi inflamasi dimediasi sel T yang parah yang
akhirnya dapat mengakibatkan HSK [6 ] dan kebutaan [7]. Saat ini,
pengobatan sistemik atau topikal dengan acyclovir (ACV) berhasil
digunakan untuk menekan replikasi virus pada pasien dengan berulang
herpes reaktivasi. Selain itu, kortikosteroid digunakan untuk
menekan respon kekebalan pada kornea untuk menghindari jaringan
parut kornea. Studi terbaru menunjukkan bahwa kejadian resistensi
asiklovirHSV-1 strain telah secara dramatis meningkat menjadi
sekitar 6,4% pada pasien imunokompeten dengan HSK [1, 8]. Karena
beberapa efek samping yang serius penggunaan gansiklovir (GCV) atau
foscarnet (FOS) terbatas [9]. Selanjutnya, resistensi silang
terhadap GCV, FOS atau sidofovir (CDV) semakin terlihat [10]. Oleh
karena itu penting untuk mengembangkan seri, ditoleransi pilihan
pengobatan untuk pasien dengan asiklovir berulang atau resisten
silang HSV-1 infeksi kornea.Dalam penelitian sebelumnya, kami telah
melaporkan bahwa monoklonal antibodi mAb 2c dikembangkan sebagai
senyawa yang sangat ampuh untuk netralisasi obat resistensi Herpes
Simplex Virus [11, 12]. Antibodi ini mengakui epitop umum pada
glikoprotein B dari HSV-1 dan HSV-2 dan terlihat lebih dari
biasanya khasiat antivirus tinggi in vitro dan pada tikus sangat
imunodefisiensi NOD / SCID. Urutan epitope dikenali oleh mAb 2c
sangat dibiakan di isolasi HSV-1 dan HSV-2 dan terbukti menjadi
penting untuk virulensi dan kebugaran virus [13]. Berbeda dengan
sebagian besar antibodi manusia yang dihasilkan selama infeksi HSV
atau disebabkan oleh vaksinasi dengan vaksin protein rekombinan,
antibodi ini tidak hanya menetralisir virus yang beredar, tetapi
juga menghambat HSV penyebaran transmisi oleh sel ke sel [11].
Mekanisme ini dikenal menjadi penting selama pembentukan laten dan
juga selama reaktivasi [5, 14]. Karena sifat unik dari mAb 2c, kami
merancang derivate mAb hu2c mansia untuk pengobatan infeksi HSV
resisten terhadap obat antivirus standar [11, 12]. Baik antibody
manusia dan antibodi mencit memperlihatkan sifat yangsama mengikat
dan mampu menetralisir berbagai klinis isolat resisten terhadap
ACV, FOS atau CDV. In vivo, mAb hu2c juga mencegah NOD / tikus SCID
terhadap mematikan infeksi HSV-1 dengan multidrug resisten isolat
klinis [15]. Berdasarkan data-data yang menjanjikan, kami
menyimpulkan bahwa antibodi ini harus menjadi pilihan perawatan
yang tepat untuk infeksi kornea berat HSV-1 menginduksi
HSK.Akibatnya, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji
kapasitas netralisasi dari antibodi monoklonal HSV-gB-spesifik
terhadap mata-patogen HSV-1 galur KOS dan isolat klinis ACV
resisten in vitro dan kemanjurannya dalam pencegahan HSK di
imunokompeten pada mencit BALB model / c.Bahan danMetodePernyataan
EtikaHewan percobaanyang dipakai sesuai dengan peraturan ketat
Masyarakat Jermanuntuk Laboratorium Ilmu Hewan(GV-SOLAS) danUU
Kesehatan Eropa dari Federasi Laboratorium Hewan Asosiasi
Ilmu(FELASA). Protokolini disetujuioleh Badan Westphalia Negara
Rhine Alam, Lingkungan Hidup danPerlindungan Konsumen (LANUV) (Izin
nomor: G1194-1111). Persiapan neuronsensorik mencit dilakukan
sesuai dengan Undang-UndangJerman Animal Welfare. Semuaupaya
dilakukanuntuk meminimalkan penderitaan. Untukimunofluoresensi
percobaan mikroskop(lihat di bawah), kami
menggunakanserummanusiayang sehat, HSV-1
seronegatifvolunteers.Writteninformed consent dari donor darah
diperoleh. Izin diberikan oleh Lembaga Review Boarddari Hannover
Medical School(persetujuan nomor893).HewanMencit BALB/c betina, 8
minggu usia, yang dibeli dari Charles River Laboratories (Charles
River Laboratories, Sulzfeld, Jerman) dan dipelihara dalam kondisi
bebas patogen. Semua in vivo percobaan dilakukan sesuai dengan
persyaratan hukumJerman dengan persetujuan fasilitas hewan
University Hospital Essen.
Untukmengisolasineuronprimer,tikusC57BL/6JHanZtmdibiakkandan
dipeliharadiFasilitasHewan LaboratoriumHannoverMedical
School.Sel
Sel Vero (American Type Culture Collection, ATCC, CCL81,
Rockville, MD) yangdikultur di Dulbecco'sModified EagleMedium
(DMEM, Life Technologies Gibco,Darmstadt, Jerman) yang mengandung
10% (v / v) serum janin anak sapi (FCS; Life Technologies Gibco),
100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin. BHK-21 sel (ATCC
CCL-10) dikultur in minimum EssentialMedium (MEM, Cytogen, Sinn,
Jerman) ditambah dengan 10% FCS (v / v), 100 U / ml penisilin dan
0,1 mg / ml streptomisin. Sel epitel C127I (ATCC CRL-1616) dikultur
dalam DMEM (Life Technologies Gibco) yang mengandung 10% (v / v)
FCS (PAA, Saarbrcken, Jerman), 100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml
streptomisin. Budaya utama akar dorsal ganglion (DRG) neuron
disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [16, 17]. Neuron
tersebut terinfeksi dalam perjalanan manusia dan murine HSV-1
infeksi [18-21]. Secara singkat, dewasa C57BL / 6J tikus
dikorbankan, DRG dari serviks, tingkat toraks dan lumbal hewan yang
dibedah dan dikumpulkan dalam 1x Hank Seimbang Salt Solution (HBSS,
mengandung 5 mMHEPES, 10 MMD-Glukosa, pH 7,4). Ganglia pertama kali
dicerna selama 20 menit pada 37 C dengan 20 mg / ml papain
(Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Jerman) di papain solusi aktivasi (0,4
mg / ml L-sistein, 0,5 mMEDTA, 1,5 mMCaCl2 2H2O, pH 7,4) diikuti
oleh pencernaan dengan 10 mg / ml kolagenase IV (Invitrogen) dan 12
mg / ml dispase II (Sigma-Aldrich) di 1xHBSS. Ganglia yang pellet
dan diresuspensi dalam 1 ml 1xHBSS dan triturated menggunakan pipet
Pasteur dengan ujung menyempit. Neuron-suspensi itu berputar selama
8 menit pada 381 g melalui bantal yang terdiri dari 20% (v / v)
Percoll di media CO2-independen (Life Technologies Gibco) yang
mengandung 10 MMD-glukosa, 5 mMHEPES, 10% FCS, 100 U / ml penisilin
dan 0,1 mg / ml streptomisin. Setelah menghapus supernatan, pelet
sel resuspended dalam 2 ml CO2-independen menengah dan akhirnya
disentrifugasi selama 2 menit pada 1000 g.The pelet diresuspensi
dalam medium F-12 campuran nutrisi Ham mengandung 10% FCS, 50 ng /
ml 2,5 S NGF (Promega Corporation, Fitchburg, WI, AS), 100 U / ml
penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin dan unggulan ke slip penutup
dilapisi dengan 0,01% (b / v) dalam H2Opoli-L-lisin
(150,000-300,000 gmol-1Sigma-Aldrich) dan laminin mencit alami(0,8
gpercoverslip,Invitrogen) dalam 24piring. Neuron yang ditanam pada
37Cdan5% CO2dalam inkubator dilembabkandan sedangberubah dua
kaliperminggu. Obatantimitosis 1--D-arabinofuranosylcytosine
(Sigma-Aldrich) ditambahkan kekonsentrasi akhir 2Mto menekan
proliferasi membagi, sel-selnon-saraf dan dicuci sebelum infeksi.
Setelahsatu minggu budidaya, neuronyang digunakan untuk melakukan
eksperimen.VIRUSStrain patogen mata HSV-1 strain KOS dan isolat ACV
resisten yang disebarkan pada sel Vero dan disimpan pada -80 C.
Untuk pemeriksaan virus titer supernatan sel atau organ yang
homogenizates dititrasi pada sel Vero seperti yang dijelaskan
sebelumnya [22]. Tiga isolat klinis dengan resistensi terhadap ACV
[10] yang baik yang disediakan oleh GeorgesM.GM Verjans (Departemen
Virologi, Erasmus Medical Centre, Rotterdam, Belanda). Reporter
virus HSV-1 (17 +) LoxpMCMVmCherry, HSV-1 pendek (17 +) Lox-Che,
telah diturunkan dari HSV-1 (17 +) Lox-pMCMVGFP [23]. Gen GFP dari
HSV-1 (17 +) Lox-GFP telah mengganti dengan gen untuk monomer
Cherry (R. Budida, A. Pohlmann, B. Sodeik, dan G. Behrens, yang
akan diterbitkan di tempat lain); kedua strain mengekspresikan
protein fluorescent GFP atau mCherry sebagai penanda pengganti
dapat digunakan untuk memantau HSV-1 ekspresi gen virus awal. HSV-1
(17 +) Lox-Che itu disebarkan menggunakan BHK-21 sel dan dimurnikan
seperti yang dijelaskan sebelumnya [24, 25]. Titer ditentukan oleh
tes plak, genom untuk membentuk plak unit (PFU) rasio ditentukan
dengan real time PCR [24, 25].AntibodiAntibodi monoklonal mAb 2c
dan mAb hu2c dimurnikan dari hibridoma bebas serum atau supernatan
SP2 / 0 sel dengan protein kromatografi A seperti yang dijelaskan
sebelumnya [11, 15]. Purity telah dikonfirmasi oleh FPLC? 95%.
Konsentrasi diukur dengan NanoDrop 2000 spektrometerNetralisasi
AssayKapasitas netralisasi dari mAb2c ditentukan pada sel Vero oleh
end point pengenceran seperti yang dijelaskan sebelumnya[11].
Secara singkat, pengenceran serial antibodi diinkubasi dengan 100
TCID 50 dari HSV-1 KOS atau isolat klinis resistenACVselama 1 jam
pada37Cdalam mediumkultur sel. Virus antibodi inokulum
diaplikasikan mono layers sel Vero tumbuh baik di96piring, dan efek
sitopatik(CPE) yangtercipta setelah48jam inkubasipada 37C.
Konsentrasi antibodiyang diperlukan untuk penghambatan lengkap
virus yang disebabkan CPE ditentukan sebagai titer netralisasi.
[11, 15].Inhibisi penyebaran sel ke selEfektivitas mAb 2c untuk
menghambat transmisi sel ke sel dari strain patogen mata HSV-1 KOS
dianalisis dengan imunofluoresensi seperti yang dijelaskan
sebelumnya [11]. Secara singkat, monolayers konfluen sel Vero,
tumbuh di 24-baik piring kultur jaringan, terinfeksi 100 TCID50
dari HSV-1 KOS. Setelah 4 jam adsorpsi pada 37 C inokulum virus
telah dihapus. Sel diinkubasi selama 48 jam dalam DMEM yang
mengandung 2% FCS di hadapan 500 nM (75 g / ml) mAb 2c, dikumpulkan
sera manusia (1:40 diencerkan dalam medium) yang berasal dari donor
dengan titer tinggi imunoglobulin anti HSV (penetral titer 1: 256
total netralisasi 100 TCID50 dari HSV-1 KOS), atau media saja.
Konsentrasi antibodi dalam supernatant sel mewakili konsentrasi
berlebih diperlukan untuk netralisasi lengkap virus yang
dikeluarkan. Pembentukan plak terdeteksi oleh imunofluoresensi.
HSV-1 sel yang terinfeksi diwarnai dengan anti-HSV-1/2-gD-antibodi
tikus (Acris Antibodi, San Diego, CA, USA) dan Alexa Fluor 488
kambing anti IgG antibodi sekunder spesifik (Invitrogen). Baik
antibodi Manusia atau antibodi mencit diwarnai dengan Cy3 kambing
terkonjugasi anti IgG tikus atau antibodi sekunder IgG kambing anti
manusia (Invitrogen), masing-masing. Gambar imunofluoresensi
diperoleh dengan fluoresensi mikroskop Zeiss Pengamat Z1 (Carl
Zeiss, Oberkochen, Jerman) pada pembesaran 100 kali lipat.Analisis
penyebaran sel epitel ke neuron dan neuron ke epitel Sel C127Inaif
ditransfeksikan dengan GFP mengekspresikan plasmid pEGFP-N1
(Invitrogen) untuk identifikasi. Transfeksi dilakukan dengan reagen
GeneJuice sesuai dengan protokol produsen (Merck Millipore,
Darmstadt, Jerman). Sel terbalik transfected dan diinkubasi selama
24 jam sebelum digunakan. Untuk menguji pengaruh antibodi yang
berbeda pada HSV-1 transmisi sel neuron-to-epitel, neuron DRG
terinfeksi 2.5x107 PFU / ml HSV-1 (17 +) Lox-Che. Pada 24 jam pasca
infeksi, sel C127I transfected yang terpisah dengan accutase (GE
Healthcare Eropa, Freiburg, Jerman) dan dicampur dengan antibodi
hu2c, 2c atau dengan IgG manusia dikumpulkan (Anti-HSV-positif;
Sigma-Aldrich) di 75 g / ml atau pura-pura diobati. Campuran
sel-antibodi seperti kemudian diunggulkan di atas neuron DRG yang
terinfeksi. Untuk menguji dampak dari mAbs 2c dan hu2c pada epitel
sel-to-neuron menyebar, sel C127I terinfeksi dengan 7,5 106PFU / ml
selama 15 jam. Sel-sel kemudian terpisah dengan accutase, dicampur
dengan antibodi yang ditunjukkan seperti dijelaskan di atas, dan
unggulan di atas neuron DRG naif. Sel-sel cocultured yang tetap
pada titik waktu yang ditunjukkan dengan PHEMO-fix (68 mM PIPA, 25
mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mMMgCl2, 10% (v / v) DMSO, 3,7% (b / v)
paraformaldehyde (PFA) , 0,05% (v / v) glutaraldehid, 0,5% (v / v)
Triton X-100, pH 6,9) pada suhu kamar selama 10 menit, dan kemudian
dicuci selama dua kali 5 menit dengan PHEMO-buffer (68 mM PIPA, 25
mM HEPES, 15 mMEGTA, 3 mM MgCl2, 10% (v / v) DMSO, pH 6,9) selama 5
menit pada 37 C [26, 27]. Fiksatif sisa dipadamkan dengan 50
mMNH4Cl di PBS. Situs mengikat tidak spesifik dan Fc-reseptor dari
GE kompleks / GI dari HSV-1 [28] dilucuti oleh inkubasi dengan
memblokir reagen yang mengandung 5% (w / v) BSA dan 10% (v / v)
manusia HSV-1 seronegatif serum di PBS selama 30 menit. Antibodi
diencerkan dalam menghalangi reagen dan diinkubasi dengan sel dalam
ruang dilembabkan selama 30 sampai 60 menit. Antibodi monoklonal
yang ditujukan terhadap -tubulin-III (mab5564 mouse, Merck
Millipore, Darmstadt, Jerman) digunakan untuk mengidentifikasi
neuron. Antibodi sekunder untuk mikroskopi imunofluoresensi
terhadap tikus yang konjugasi Alexa Fluor (Life Technologies
Gibco). Akhirnya, sampel tertanam dalam pemasangan menengah (6 g
gliserol, 2.6 gMowiol 40-88, 6 ml H2O, 12 ml 0.2MTris, pH 8,5) yang
mengandung 0,1 g / ml DABCO (1,4-Diazabicyclo [2, 2, 2] oktan).
Sampel dianalisis dengan mikroskop Zeiss Axiovert 200M dilengkapi
dengan unit laser scanning LSM 510Meta confocal dengan argon
(Argon2, 488 nm) dan helium-neon (HeNe1, 543 nm, HeNe1, 633 nm)
laser menggunakan 63x minyak rencana-apochromatic Tujuan -immersion
dengan aperture numerik dari 1,4. Gambar diperoleh dengan Browser
Zeiss LSMImage (versi 4.2.0.121), dianalisis dengan ImageJ (Versi
1,45 h, Wayne Rasband, National Institute of Health, USA,
http://rsb.info.nih.gov/ij/) dan diproses dengan Adobe Photoshop
CS4 (Versi 11.0, Adobe Systems Inc, San Jose, CA, USA). Sebuah area
melingkar dari 85 m2 ditempatkan ke pusat neuron, seperti yang
diidentifikasi oleh -tubulin-III-label atau sel C127I transfected,
seperti yang diidentifikasi oleh ekspresi GFP.Infeksi kornea pada
tikus dan studi desain
Tikus dibius dengan injeksi intraperitoneal ketamin hidroklorida
(2 mg) dan mepivacaine hidroklorida (400 ng). Epitel mata kanan
menggaruk delapan kali dalam pola silang dan diinokulasi dengan 1
105PFU dariHSV-1 KOS di media 5l [29]. Tikus yang terinfeksi baik
sistemik atau topikal diperlakukan denganantibodimAb 2c mencit.
Pengobatan topikal dilakukan oleh inokulasi berkala (5 kali per
hari) dari mata yang terinfeksi dengan 5 l (28,5 g) solusi antibodi
(tetes mata) mulai 24 jam post infeksi (pi) sampai 7 p.i hari ini.
Pengobatan sistemik dilakukan oleh intravena 300 g mAb 2c atau mAb
hu2c 24 jam sebelum infeksi untuk profilaksis pra pajanan, atau 24,
40, dan 56 jam setelah infeksi pasca pajanan untuk imunoterapi.
Perjalanan penyakit yang ditandai dengan penentuan tingkat
keparahan penyakit (skor klinis blepharitis, cacat epitel dan HSK)
dengan mikroskop operasi (Zeiss, Oberkochen, Jerman), masing-masing
pada skala 0 sampai 4, yang konsisten dengan peradangan dari
kelopak mata, efek cytopathic dari sel-sel epitel kornea atau opak
kornea dengan neovaskularisasi, edema dan nekrosis [22]. Viral load
mata terinfeksi diukur pada hari ke 5 pasca infeksi dengan uji
standar plak (N = 6 dalam setiap kelompok) [30]. Sel-sel inflamasi
di kornea dihitung seperti yang dijelaskan sebelumnya [31]. Jumlah
sel total dalam limpa dan kelenjar getah bening dihitung setelah
homogenisasi organ dengan saringan sel 70 m (BD Biosciences,
Franklin Lakes, NJ, USA).Kuantifikasi Sitokin dengan
ELISAPengeringan kelenjar getah bening(DLN) dan limpa dari mencit
yang terinfeksi HSV-1 KOS yang menerimasalah satu pengobatan
antibodi atau PBS dikumpulkan pada hari ke-14 setelah infeksi.
Setelahorgan-organyangterhomogenisasidan5106seldikulturtiga
ulangandi hadapan2107PFUUV-tidak aktif HSV-1 KOSatau mediasaja.
Setelah24jam, jumlah IL-2 daninterferon(IFN) di supernatan sel yang
dihitung dengan ELISA (OptEIA, PharMingen, Hamburg, Jerman) seperti
yang dijelaskan sebelumnya[32].Floriferasi assayAntigen dan mitogen
diinduksi proliferasi dari splenosit atau sel pengeringan kelenjar
getah bening dinilai melalui aliran cytometry assay berdasarkan
seperti yang dijelaskan sebelumnya [33]. Secara singkat, limfosit
terwarnai dengan eFluor 670 (eBioscience, Frankfurt am Main,
Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik. 1 105sel / baik dikultur
dalam 96 cawan yang bawahnya bulat dengan media, UV-HSV-1 (2 107
PFU / ml sebelum UV-inaktivasi) atau Concanavalin A (Biochrom,
Berlin, Jerman). Karena pembelahan sel, sel-sel kehilangan setengah
dari fluoresensi dengan masing-masingpembelahan sel. Setelah 4
hari, sel-sel permukaan bernoda sesuai instruksi pabrik
(eBioscience) menggunakan antibodi monoklonal berikut: tikus-tikus
anti-CD4-PE, rat-anti-mouse CD8-FITC, tikus IgG2a kontrol k isotipe
FITC, dan tikus IgG2b K Kontrol isotipe PE. Untuk membedakan antara
sel-sel yang layak dan tidak layak, sel diwarnai dengan 7-AAD
menurut instruksi pabrik (BD, Heidelberg, Jerman). Proliferasi
dinilai melalui aliran cytometry (FACSCalibur, BD). Setidaknya
2.000 layak 7-AAD negatif (BD) CD4 + (eBioscience, Jerman) dan 1000
CD8 + (eBioscience) dimasukkan untuk analisis. Data
aliran-cytometric dianalisis melalui Cytomation Summit Offline
V3.1. software (Dako, Hamburg, Jerman).Trigeminal ganglia
Reaktivasi assay
Untukdeteksiviruslaten, gangliatrigeminal(TG) yang ditanamkan
pada hari ke-14setelah infeksi dan ditanam dengan mono layers sel
Vero selama tiga minggu seperti yang dijelaskan sebelumnya[34].
Untuk mendeteksi efek cytopathic kultur diperiksa pada interval
harian.Kuantifikasi DNA
HSV-1 genom yang diukur dengan real-time PCR seperti yang
dijelaskan sebelumnya [11]. Secara singkat, DNA dimurnikan dari
ganglia trigeminal dari HSV-1 KOS tikus yang terinfeksi menggunakan
magna Pure LC sistem ekstraksi asam nukleat otomatis (Roche,
Penzberg,Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik. Jumlah DNA virus
kemudian dihitung dengan real-time PCR (LightCycler; Roche)
menggunakan Artus HSV-1/2 LC PCR Kit (Qiagen, Hilden, Jerman).
Batas deteksi analisis untuk HSV-1-DNA diisolasi dari ganglia
trigeminal bertekad untuk menjadi 200 eksemplar / ganglion menurut
protokol pabrik.
Pewarnaan Histologi
Untuk analisismikroskop cahaya, mata difiksasi(64% isopropanol,
3,7% formaldehida, 2,5% asam asetat), dikeringkan dengan
isopropanol, dan ditanam dalam parafin seperti yang dijelaskan
sebelumnya[35]. Bagian lima mikro meter kemudian diwarnai dengan
hematoxylin-eosin dandianalisis dengan mikroskop cahayaDeteksi
antibody HSV-specifik pada sera and cairan air mataSera (60 l) dan
cairan air mata (10 l cairan yang berasal dari mata dibilas dengan
PBS) dari HSV-1 KOS mencit yang terinfeksi yang dipanen pada hari
ke-14 pasca infeksi dan diperiksa untuk pengikatan terhadap HSV-1
sel yang terinfeksi Vero oleh aliran cytometry seperti yang
dijelaskan sebelumnya [11]. Data dianalisis dengan menggunakan
Flowjo versi 7.2.5 (Pohon Bintang Inc, Ashland, OR, USA)Deteksi
sistemik diberikan antibodi manusia di HSV-1 KOS kornea yang
terinfeksiUntuk menyelidiki apakah antibodi sistemik diterapkan
dapat mencapai kornea terinfeksi, kami memeriksa bagian jaringan
kornea dari HSV-1 KOS tikus yang terinfeksi setelah injeksi
intravena mAb hu2c oleh imunofluoresensi. Oleh karena itu, tikus
korneanya terinfeksi seperti dijelaskan di atas dan dosis tunggal
300 g mAb hu2cantibodimanusia itu disuntikkanintravena 48 jam pasca
infeksi. Tikus kontrol menerima PBS. Enam jam kemudian mata telah
dihilangkan dan dibekukan dalam nitrogen cair. Mata beku yang
tertanam dalam media jaringan-Tek O.C.T. (Sakura, Alphen aan den
Rijn, Nederlands) dan dipotong (7 m) dengan Frigocut 2800 mikrotom
(Reichert-Jung, Nussloch, Jerman). Bagian beku dikeringkan selama
30 menit, tetap dengan didinginkan aseton selama 10 menit dan
diinkubasi dengan mencegah penyangga (10% FCS di PBS) selama 15
menit. Selanjutnya, bagian kornea yang terwarnai secara bersamaan
untuk HSV-1 infeksi dan terikat mAb hu2c dengan poliklonal anti-HSV
1 FITC antibodi kambing terkonjugasi (Bethyl laboratorium,
Montgomery, USA) dan antibodi sekunder IgG kambing Cy3-terkonjugasi
anti-manusia(Invitrogen, Darmstadt, Jerman). Inti diwarnai dengan
Hoechst (Hoechst 33342, 1 g / ml; Sigma, St. Louis, MO) selama 5
menit sesuai dengan protokol pabrik. Gambar imunofluoresensi
diperoleh dengan fluoresensi mikroskop Zeiss Observer Z1 dengan
perbesaran 200 kali lipatAnalisa StatistikData dianalisis dengan
menggunakan Graph Pad Prism5(GraphPad PrismSoftware, LaJolla, CA,
USA). Analisis statistik
dilakukandengannonparametrikANOVA(Kruskal-Wallis) da npost hoc Dunn
beberapa tes perbandingan atau parametrik ANOVA(analisis satu
arah)danpost hocTukey's beberapa perbandingan tes. Perbedaan antara
jumlah yang terinfeksi secara laten ganglion trigeminal dan jumlah
ganglion trigeminal menunjukkan reaktivasi diperiksa dengan uji
eksak Fisher. Perbandingan dianggap signifikan pada P
