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JULIANA TENSOL PINTO
ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DOS FRUTOS DE Hovenia dulcis Thunberg E
DA DIHIDROMIRICETINA NA HIPERCOLESTEROLEMIA
INDUZIDA EM RATOS.
Relatório de Qualificação
OURO PRETO
MINAS GERAIS – BRASIL
2013
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Ouro Preto,
como parte das exigências do
Programa de Pós-graduação em
Ciências Farmacêuticas, para
obtenção do título de “Magister
Scientiae”
i
"Ele (Deus) é o dono de tudo. Devo a Ele a oportunidade que tive de chegar aonde
cheguei. Muitas pessoas têm essa capacidade, mas não têm a oportunidade. Ele a deu à
mim, não sei por que. Só sei que não posso desperdiçá-la."
Ayrton Senna
ii
DEDICATÓRIA E AGRADECIMENTOS
Dedico essa dissertação ao meu Pai, pelos incentivos emocionais e intelectuais. À
minha Mãe, pela compreensão e apoio. Aos meus irmãos, pelo companheirismo. Ao
Cássio, pelo amor e carinho.
Agradeço imensamente à toda equipe do Laboratório Biofármacos e aos meus colegas
do mestrado, em especial ao Levi.
Agradeço ainda ao CNPq, pela bolsa e à rede TOXIFAR pelo financiamento.
iii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS...................................................................................................... v
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................vi
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................vii
RESUMO ........................................................................................................................ix
ABSTRACT .....................................................................................................................x
I- INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1
II- OBJETIVOS ................................................................................................................2
III- REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 3
III.1- Hovenia dulcis .........................................................................................................3
III.2- Hipercolesterolemia ..............................................................................................12
III.2.1- Aspectos gerais ..................................................................................................12
III.2.2- Hipercolesterolemia e estresse oxidativo ...........................................................15
III.2.2.1- Peroxidação lipídica ........................................................................................16
III.2.2.2- Modificação oxidativa da LDL e a aterosclerose ............................................17
III.2.3- Mecanismos antioxidantes e a hipercolesterolemia ...........................................19
III.2.3.1- Mecanismos endógenos ..................................................................................20
III.2.3.2- Antioxidantes exógenos ..................................................................................20
IV- MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................................24
IV.1- Obtenção do extrato ..............................................................................................24
IV.2- Determinação do teor residual de umidade ..........................................................24
IV.3- Triagem fitoquímica do extrato de H. dulcis.........................................................24
IV.4- Análise cromatográfica .........................................................................................25
IV.5- Atividade antioxidante .........................................................................................26
IV.6- Formulação das suspensões com substâncias teste ..............................................27
IV.7- Processamento da ração .......................................................................................28
IV.8- Ensaio biológico ...................................................................................................29
IV.8.1- Atividade farmacológica in vivo do extrato de H. dulcis....................................29
IV.8.2- Eutanásia ............................................................................................................30
IV.8.3- Dosagens bioquímicas .......................................................................................31
IV.8.4- Estatística ...........................................................................................................31
IV.8.5- Histopatologia do fígado ...................................................................................31
V. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..............................................................................33
iv
V.1- Determinação do teor residual de umidade ............................................................33
V.2- Triagem fitoquímica do extrato de H. dulcis...........................................................33
V.3- Análise cromatográfica ..........................................................................................35
V.4- Atividade antioxidante ...........................................................................................37
V.5- Atividade farmacológica in vivo do extrato de H. dulcis........................................39
V.5.1- Evolução ponderal ...............................................................................................39
V.5.2- Indução da hipercolesterolemia ...........................................................................40
V.5.3- Perfil lipídico........................................................................................................42
V.5.3.1- Colesterol total e LDLc.....................................................................................43
V.5.3.2- HDL-c e triglicérides ........................................................................................46
V.5.4- Transaminases (AST e ALT) e Fosfatase alcalin.................................................48
V.5.5- Histopatologia do fígado......................................................................................51
VI- CONCLUSÕES .......................................................................................................56
VII- REFERÊNCIAS .....................................................................................................57
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Composição do veículo utilizado para manipulação das substâncias teste....27
Tabela 2- Grupos experimentais ....................................................................................30
Tabela 3- Reagentes utilizados nas análises bioquímicas...............................................31
Tabela 4- Prospecção fitoquímica do extrato hidroalcoólico dos frutos de H. dulcis....33
Tabela 5- Atividade antioxidante in vitro do extrato hidroalcoólico de H. dulcis (EHD),
flavonóide dihidromiricetina (DHM) e padrão butilhidroxianisol..................................38
Tabela 6- Comparação dos perfis lipídicos dos grupos controle (C);
Hipercolesterolêmico (HC) e grupo satélite (SAT).........................................................40
Tabela 7- Perfil lipídico: colesterol total (COT), trigricérides (TG), colesterol HDL
(HDL-c), colesterol LDL (LDL-c) e as respectivas correlações (Corr.) entre os
grupos..............................................................................................................................42
Tabela 8- Parâmetros bioquímicos: aspartato aminotranferase (AST), alanina
aminotranferase (ALT), fosfatase alcalina (FALC), e suas respectivas correlações.......49
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- A: Árvore adulta de Hovenia dulcis; B: Frutos de H. dulcis............................4
Figura 2- Estruras químicas de (1) hovetrichoside A: 1R, 2S; (2) hovetrichoside B: 1S,
2R; (3) ácido hovênico......................................................................................................5
Figura 3- Estruturas químicas dos isômeros: (1) miricetina; (2) dihidromiricetina.........7
Figura 4- Estrutura química do Hovenodulinol...............................................................7
Figura 5- Tratamento da hipercolesterolemia.................................................................13
Figura 6- Mecanismo de peroxidação lipídica...............................................................16
Figura 7- Esquema da modificação oxidativa do LDL .................................................18
Figura 8- Curva de calibração da dihidromiricetina......................................................26
Figura 9- Equipamentos utilizados no processamento da ração hipercolesterolêmica..29
Figura 10- Tubos de reações de identificação fitoquímica no extrato de H. dulcis.......34
Figura 11- Perfil cromatográfico do padrão de dihidromiricetina.................................36
Figura 12- Perfil cromatográfico do extrato hidroalcoólico bruto de Hovenia dulcis
(EHD)..............................................................................................................................36
Figura 13-Espectro de absorção do padrão de dihidromiricetina...................................37
Figura 14- Espectro de absorção do pico destacado (figura 12) no extrato (EHD).......37
Figura 15- Atividade antioxidante in vitro.....................................................................38
Figura 16- Médias dos pesos dos animais ao longo do experimento (30 dias)..............39
Figura 17- Níveis séricos de colesterol total e LDL-c, entre os grupos.........................43
Figura 18- Níveis séricos de HDL-c e triglicérides , entre os grupos............................46
Figura 19- Níveis séricos de AST (U/L) , ALT (U/L) e FALC (U/L), entre os grupos.50
Figura 20- Fotomicrografias representativas de fígados dos animais............................53
Figura 21- A- infiltrados lobulares perivasculares no grupo controle (C); B- congestão
sinusoidal próximo à veia centro lobular no grupo controle (C).....................................55
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
ACAT Acil CoA colesterol aciltransferase
ADH Álcool desidrogenase
ALDH Aldeído desidrogenase
ALT Aspartato aminotransferase
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Apo B Apolipoproteína B
Apo E Apolipoproteína E
AST Alanina aminotransferase
BHA Butilhidroxianisol
CCl 4 Tetracloreto de carbono
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
COT Colesterol total
DAC Doença arterial coronariana
DCVs Doenças cardiovasculares
D-Gal N/LPS Galactosamina lipopolissacarídeo
DHM Dihidromiricetina
DNA Ácido desoxirribonucleico
DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EGCG Epigalocatequinagalato
EHD Extrato de Hovenia dulcis
ERNS Espécies reativas de nitrogênio
EROs Espécies reativas de oxigênio
FALC Fosfatase alcalina
GSH Glutationa redutase
H2O Água
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HDL High density lipoprotein
HMG-CoA 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coa
HNE 4-hidroxinonenal
IDL Intermediary density lipoprotein
L · Radical alquila
viii
LDL Low density lipoprotein
LDL-OX LDL-oxidada
MDA Malondialdeído
MMP Metaloproteinases da matriz celular
O2 Oxigênio molecular
O2 · Íon superóxido
OH · Radical hidroxila
ONOO¯ Peroxinitrito
RMN Ressonância magnética nuclear
RO · Radical alcoxila
ROO · Radical peroxila
t-BHP Ter-butil hidroperóxido
TG Triglicerídeos
TSH Hormônio estimulante da tiróide
UV Ultra violeta
VLDL Very low density lipoprotein
· NO Óxido nítrico
· NO2 Radical dióxido de nitrogênio
ix
RESUMO
Atividade farmacológica do extrato hidroalcoólico dos frutos de Hovenia dulcis
Thunberg e da dihidromiricetina na hipercolesterolemia induzida em ratos.
No Brasil, o acidente vascular cerebral e a doença arterial coronariana
constituem as principais causas de mortalidade cardiovascular. Estudos clínicos de
intervenção com hipolipemiantes mostraram que o controle do colesterol reduz a
incidência não só da doença arterial coronariana, mas também do acidente vascular
cerebral. Nesse contexto, extratos vegetais contendo antioxidantes ou substâncias
isoladas capazes de reverter o estresse oxidativo, presente na hipercolesterolemia,
podem ser promissores, reduzindo os riscos de doenças cardiovasculares.
O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial do extrato hidroalcoólico dos
frutos de Hovenia dulcis e do flavonóide dihidromiricetina na redução do colesterol em
ratos hipercolesterolêmicos.
Para o experimento in vivo, 48 ratos Wistar machos, foram distribuídas em 8
grupos de 6 animais, que receberam dieta suplementada com 1,0% de colesterol e 0,3%
de ácido cólico, a exceção do grupo controle que recebeu ração convencional. Os
animais foram então tratados com suspensões orais contendo: atorvastatina 1,0 mg/Kg;
extrato de H. dulcis (50,0 e 100,0 mg/kg); dihidromiricetina (25,0 e 50,0 mg/kg) e
veículo inerte (grupo controle). Foram avaliados os parâmetros bioquímicos colesterol
total, HDL-c, LDL-c, triglicérides, transaminases e fosfatase alcalina.
Os tratamentos com as duas doses do extrato de H. dulcis mostraram-se eficazes
como hipocolesterolemiantes, já que foram capazes de reduzir substancialmente os
níveis séricos de colesterol total e LDL-c (até 33,3 e 51,5%, respectivamente), sem
alterar significativamente os demais parâmetros bioquímicos. Já os grupos tratados
com a dihidromiricetina, apesar de apresentarem reduções significativas no colesterol
total e LDL-c, tiveram aumento nos parâmetros hepáticos e triglicérides, resultado
indesejável no âmbito das hipercolesterolemias.
Estudos farmacológicos com outras espécies animais devem ser realizados para
comprovar a eficácia do extrato de H. dulcis na hipercolesterolemia, a segurança na sua
utilização (estudos de toxicidade), as dosagens terapêuticas mais eficazes e os
mecanismos de ação.
Palavras-chave: Hovenia dulcis, dihidromiricetina, hipercolesterolemia
x
ABSTRACT
Pharmacological activity of the hydroalcoholic extract from Hovenia dulcis
Thunberg fruit and dihydromyricetin during hypercholesterolemia induced in rats
In Brazil, the principal causes of cardiovascular mortalities are strokes and
cerebrovascular accidents. Clinical studies of intervention with hypolipidemic agents show
that controlling cholesterol reduces not only the incidence of coronary artery disease, but
also that of stroke. In this context, plant extracts containing antioxidants, or isolated
substances capable of reverting oxidative stress under hypercholesterolemia, show promise
in reducing the risks of cardiovascular diseases.
The objective of this study was to evaluate the potential of the hydroalcoholic
extract of the fruit of H. dulcis and of dihydromyricetin in cholestrol reduction in
hypercholesterolemic rats.
Forty-two Wistar male rats were distributed into seven groups of six animals that
received diets supplemented with 1% cholesterol and 0.3% cholic acid, with the exception
of the control group which received conventional rations. Animals were treated with oral
suspensions containing: atorvastatin 1.0 mg/Kg; H. dulcis extract at 50.0 and 100.0 mg/kg
and dihydromyricetin at 25.0 and 50.0 mg/kg vehicle (control group). The following
biochemical parameters were evaluated; total cholesterol, HDL-c, LDL-c, trigycerides,
AST, ALT, and alkaline phosphatase.
The treatments with two doses of the extract proved to be promising
hypocholesterolemic agents, as they were able to substantially reduce total cholesterol and
LDL-c (up to 33.3 and 51.5%, respectively), without significantly altering the other
biochemical parameters. As for the groups treated with the flavonoid dihydromyricetin,
although they showed a significant reduction in total cholesterol and LDL-c, they showed
increases in triglycerides and hepatic parameters, which is undesirable within the context of
hypercholesterolemia.
Pharmacological studies with other animal species should be conducted to prove the
effectiveness of the extract of H. dulcis in hypercholesterolemia, safe use (toxicity studies),
the most effective therapeutic dosages and mechanisms of action.
Key-words: Hovenia dulcis, dihydromyricetin, hypercholesterolemia.
1
I. INTRODUÇÃO
De acordo com a IV Diretriz Brasileira sobre Dislipidemias e Prevenção da
Aterosclerose (2007), nos últimos 30 anos, houve um declínio da mortalidade por
causas cardiovasculares em países desenvolvidos. Porém, têm ocorrido elevações
relativamente rápidas e substanciais nos países em desenvolvimento, como o Brasil. O
risco relativo de eventos cardiovasculares aumenta de acordo com inúmeros fatores de
risco, dentre eles a hipercolesterolemia (níveis sangüíneos de colesterol total superiores
a 200mg/dL).
Estudos clínicos de intervenção com hipolipemiantes mostraram que o controle
do colesterol reduziu a incidência não só da doença arterial coronariana, mas também do
acidente vascular cerebral (HANKEY, 2002; LAROSA, HE & VUPPUTURI, 1999;
LOLIO, LOTUFO & LIRA, 1995).
Nas dislipidemias, a principal conduta terapêutica até então adotada por muitos
profissionais de saúde é o controle do LDL-c, composto conhecido popularmente como
o “colesterol ruim” por depositar o colesterol nas células (COSTA & SILVA, 2005).
Dados científicos indicam que a elevação deste componente é a maior causa de doença
arterial coronariana (DAC), pois quando oxidada, esta molécula atua no início e na
progressão da aterosclerose (ARAÚJO et al., 2005; MATSUURA et al., 2006;
NOVELLI e DINIZ, 2005).
Os efeitos dos antioxidantes sobre a hipercolesterolemia são atribuídos à
capacidade dos mesmos em aumentar a resistência da LDL-c à oxidação e, portanto,
reduzir o risco de doenças cardiovasculares. Estudos in vitro mostraram que a oxidação
de LDL somente se inicia após o estresse oxidativo haver depletado o conteúdo de
antioxidante celular (JESSUP et al., 1990).
Nesse contexto, extratos vegetais contendo antioxidantes, ou substâncias
isoladas capazes de reverter o estresse oxidativo, presente na hipercolesterolemia,
podem ser promissores como adjuvantes terapêuticos, reduzindo os riscos de doenças
cardiovasculares (YOKOZAWA, NAKAGAWA e KITANI, 2002).
A indução do quadro de hipercolesterolemia por dieta, em ratos, é vastamente
utilizada em estudos que avaliam o potencial de extratos vegetais e substâncias isoladas.
No estudo de Yokozawa et al. (2006) uma dieta suplementada com 1% de colesterol e
0,5% de ácido cólico possibilitou um aumento de 65,7% e 80% nos índices de colesterol
total e de LDL, respectivamente, em ratos. Já Machado et al. (2003) obtiveram uma
2
De acordo com a IV Diretriz Brasileira sobre Dislipidemias e Prevenção da
Aterosclerose (2007), nos últimos 30 anos, houve um declínio da mortalidade por
causas cardiovasculares em países desenvolvidos. Porém, têm ocorrido elevações
relativamente rápidas e substanciais nos países em desenvolvimento, como o Brasil. O
risco relativo de eventos cardiovasculares aumenta de acordo com inúmeros fatores de
risco, dentre eles a hipercolesterolemia (níveis sangüíneos de colesterol total superiores
a 200mg/dL).
Estudos clínicos de intervenção com hipolipemiantes mostraram que o controle
do colesterol reduziu a incidência não só da doença arterial coronariana, mas também do
acidente vascular cerebral (HANKEY, 2002; LAROSA, HE & VUPPUTURI, 1999;
LOLIO, LOTUFO & LIRA, 1995).
Nas dislipidemias, a principal conduta terapêutica até então adotada por muitos
profissionais de saúde é o controle do LDL-c, composto conhecido popularmente como
o “colesterol ruim” por depositar o colesterol nas células (COSTA & SILVA, 2005).
Dados científicos indicam que a elevação deste componente é a maior causa de doença
arterial coronariana (DAC), pois quando oxidada, esta molécula atua no início e na
progressão da aterosclerose (ARAÚJO et al., 2005; MATSUURA et al., 2006;
NOVELLI e DINIZ, 2005).
Os efeitos dos antioxidantes sobre a hipercolesterolemia são atribuídos à
capacidade dos mesmos em aumentar a resistência da LDL-c à oxidação e, portanto,
reduzir o risco de doenças cardiovasculares. Estudos in vitro mostraram que a oxidação
de LDL somente se inicia após o estresse oxidativo haver depletado o conteúdo de
antioxidante celular (JESSUP et al., 1990).
Nesse contexto, extratos vegetais contendo antioxidantes, ou substâncias
isoladas capazes de reverter o estresse oxidativo, presente na hipercolesterolemia,
podem ser promissores como adjuvantes terapêuticos, reduzindo os riscos de doenças
cardiovasculares (YOKOZAWA, NAKAGAWA e KITANI, 2002).
A indução do quadro de hipercolesterolemia por dieta, em ratos, é vastamente
utilizada em estudos que avaliam o potencial de extratos vegetais e substâncias isoladas.
No estudo de Yokozawa et al. (2006) uma dieta suplementada com 1% de colesterol e
0,5% de ácido cólico possibilitou um aumento de 65,7% e 80% nos índices de colesterol
total e de LDL, respectivamente, em ratos. Já Machado et al. (2003) obtiveram uma
hipercolesterolemia moderada (49%) utilizando ração suplementada com 1% de
colesterol e 0,1% de ácido cólico. Afonso (2010), utilizando uma dieta suplementada
3
com 0,5% de colesterol e 0,25% de ácido cólico alcançou um quadro extremo de
hipercolesterolemia, com 197% de aumento do colesterol total.
A Hovenia dulcis é conhecida popularmente no Brasil, principalmente, por uva-
do-japão, caju-japonês, chico-magro e pau-doce. Seu nome em inglês é Japonese
Raisintree, no Japão é conhecida por kenponashi e na China por chih-chü, kenan,
ZhiBeiZi (CARVALHO, 1994).
A maioria dos estudos sobre atividades farmacológicas da H. dulcis descrevem a
atividade hipoglicemiante e/ou diabetogênica (HIROTAKA et al., 2003; JEONG-
SANG et al., 2005; JI et al., 2002; LEE et al., 2005) e sua utilização como
hepatoprotetor e detoxificante alcoólico (CHEN et al., 2006; HASE et al., 1997; JI et
al., 2001; OKUMA et al., 1995; XU et al., 2003).
Em relação à dihidromiricetina, O Provital Group (2006) publicou artigo com
ensaios que comprovam a eficácia desse flavonóide como agente redutor de celulite
dérmica. Os ensaios in vitro detectaram ação na adipogênese, lipólise e lipogênese.
Zang et al. (2003) demonstraram que a dihidromiricetina possui elevada
atividade sequestrante do radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) e inibitória da
peroxidação lipídica.
Fang et al. (2007) encontraram altas taxas de compostos fenólicos no extrato
alcoólico dos frutos de H. dulcis. Verificaram também elevada atividade antioxidante
utilizando o método do DPPH e a relacionaram aos compostos fenólicos presentes no
extrato, principalmente aos flavonóides.
Nenhum trabalho foi encontrado referindo-se à atividade hipocolesterolemiante
da planta ou do flavonóide dihidromiricetina. No entanto, em trabalho do nosso grupo
de pesquisa (ALVARENGA, 2008), que avaliou extrato da planta e o flavonóide em
modelo de diabetes, foi observada redução de colesterol total e LDL-c e aumento de
HDL-c, sugerindo a necessidade de estudarmos o extrato de H. dulcis e a
dihidromiricetina em um modelo específico de hipercolesterolemia.
II. OBJETIVOS
II.1- GERAL
Avaliar o potencial hipocolesterolemiante do extrato hidroalcoólico dos frutos de
Hovenia dulcis e do flavonóide dihidromiricetina em ratos Wistar
hipercolesterolêmicos, bem como identificar constituintes químicos do extrato e avaliar
a atividade antioxidante in vitro das substâncias teste.
4
II.2- ESPECÍFICOS
1- Avaliar a atividade antioxidante in vitro do extrato hidroalcoólico bruto de H.
dulcis e do flavonóide dihidromiricetina.
2- Identificar constituintes químicos do extrato de H. dulcis através de métodos
químicos e cromatográficos.
3- Estudar o potencial farmacológico do extrato bruto e flavonóide
dihidromiricetina em modelo de hipercolesterolemia induzida por dieta em ratos
Wistar.
III. REVISÃO DE LITERATURA
III.1 – Hovenia dulcis
Rhamnaceae é uma família botânica de plantas angiospérmicas. Embora sua
distribuição seja cosmopolita, elas são comumente encontradas em zonas tropicais e
subtropicais. Possui 58 gêneros e aproximadamente 900 espécies (LIMA, 2006). Muitas
dessas espécies são utilizadas como plantas medicinais de uso popular.
Bao-jun et al. (2004), em artigo de revisão das bioatividades de Hovenia dulcis,
consideram que o gênero Hovenia, possui três espécies: Hovenia dulcis, Hovenia
acerba e Hovenia trichocarpa. e duas variações para a espécie Hovenia dulcis: Hovenia
dulcis var. tomentella Makino e Hovenia dulcis var. koreana Nakai.
Porém de acordo com o banco de dados TRÓPICOS (2010), o gênero Hovenia
da família Rhamnaceae possui, até o presente, nove espécies diferentes catalogadas. A
espécie Hovenia dulcis fica assim dividida:
H. dulcis Thunberg (sinônimos: H. dulcis var. glabra Makino e H.
dulcis var. latifolia Nakai).
H. dulcis var. tomentella Makino
Sendo as outras oito espécies de Hovenia:
H. acerba Lindl.
H. inaequalis (sinônimos: H. acerbavar.acerba, H. dulcis var. acerba, H.
parviflora, Ziziphus esquitolii);
H. trichocarpa
H. fulvotomentosa (sinônimos: H. trichocarpavar.fulvotomentosa, H.
trichocarpa var. trichocarpa)
5
H. tomentosa
H. robusta (sinônimos: H. trichocarpavar.robusta);
H. merrilliana;
H. kiukiangensis (sinônimos: H. acerbavar.kiukiangensis).
Originária do leste da Ásia, com distribuição principalmente na China, Japão,
Coréia e áreas do Himalaia, a Hovenia dulcis Thunberg foi introduzida no Brasil
possivelmente em 1987, quando o Centro Nacional de Pesquisa de Florestas da Empresa
Brasileira de Pesquisa em Agropecuária (CNPFlorestas/EMBRAPA) recebeu, da
Academia Chinesa de Florestas, sementes de Hovenia dulcis de duas localidades da
República Popular da China para fins ornamentais e de reflorestamento (CARVALHO,
1994). São comuns, atualmente, pequenos plantios de H. dulcis em propriedades
agrícolas no sul do país e nas outras regiões ocorre em terrenos baldios e nas
proximidades das habitações, de forma isolada ou em pequenos agrupamentos, devido à
dispersão de origem zoocórica de suas sementes (CARVALHO, 1994; RIGATTO et al.,
2001).
Figura 1- A: Árvore adulta de Hovenia dulcis; B: Frutos de H. dulcis
Popularmente, suas partes vêm sendo utilizadas como diurético, antipirético e
para doenças do fígado, asma, bronquite e diarréia. (CASTRO et al., 2002). Seus frutos
e pedúnculos frutíferos são considerados anti-eméticos, antipiréticos, laxativos,
diuréticos e calmantes estomáquicos (SUTTISRI et al., 1995; LI et al., 2005; REN-BO
A B
6
et al., 2007; YOSHIKAWA et al., 1997). A casca da árvore é utilizada para tratar
doenças do reto, constipação, convulsão infantil, antispasmódico, febrífugo. (KOLLER
et al., 1979).
As outras espécies de Hovenia não são encontradas espontaneamente no Brasil e
suas bibliografias são bastante escassas. Hovenia trichocarpa, encontrada no Japão, tem
suas cascas e as folhas utilizadas popularmente para combater sintomas do excesso
alcoólico. Da H. trichocarpa foram isolados e elucidados estruturalmente, através de
métodos químicos e espectroscópicos, oito glicosídeos fenólicos denominados
hovetrichosideos A-H, um novo triterpeno Lupano, ácido hovênico e um glicosídeo
Abeolupano, dentre outros compostos fenólicos (YOSHIKAWA et al., 1998a; 1998b;
1998c).
Figura 2- Estruras químicas de (1) hovetrichoside A: 1R, 2S; (2) hovetrichoside B: 1S,
2R; (3) ácido hovênico
Estudos fitoquímicos e farmacológicos têm revelado promissor potencial
bioativo para a espécie Hovenia dulcis Thunberg. Pesquisadores chineses concluíram
em experimento com ratos diabéticos aloxano induzidos, que o tratamento, por sete
dias, com extrato de Hovenia dulcis reduziu, significativamente, os níveis de glicose e
aumentou a formação de glicogênio hepático, quando comparados ao grupo controle
diabético (JI et al., 2002).
Hirotaka et al. (2003) registraram a patente de um suplemento alimentar que
possui atividade hipoglicemiante. O composto possui, dentre outros, o extrato das
sementes de Hovenia dulcis.
Outro estudo comprovou atividade de H. dulcis na patologia da diabetes.
Camundongos hiperglicêmicos, induzidos com estreptozocina e tratados, por seis
(3)
7
semanas, com 10mg/kg e 40mg/kg do extrato de H. dulcis, apresentaram redução
glicêmica e maior tolerância à glicose. A análise histopatológica do pâncreas mostrou
que as Ilhotas de Langerhans foram parcialmente regeneradas quando comparadas ao
grupo doente não tratado. Os resultados sugerem que o tratamento auxilia na
recuperação de danos causados ao pâncreas pela estreptozocina (JEONG-SANG et al.,
2005).
O extrato metanólico dos frutos de Hovenia dulcis var. koreana Nakai, e suas
partições, apresentaram atividade antioxidante considerável, em estudo que utilizou a
metodologia da atividade sequestrante de radicais livres DPPH e ânion superóxido. A
fração acetato de etila obtida do extrato, por ter apresentado maior atividade
antioxidante, foi utilizado, no mesmo trabalho, para tratar ratos diabéticos induzidos por
estreptozocina. Os níveis de glicose plasmática, triglicérides, colesterol total e peróxido
lipídico foram diminuídos nos ratos tratados nas duas doses, 20 e 50mg/kg, durante 24
dias, enquanto que o colesterol HDL e a glutationa foram aumentados, comprovando
que o tratamento diminuiu o desequilíbrio entre radicais livres e antioxidantes, causado
pela indução com estreptozocina e pelas complicações da diabetes (LEE et al., 2005).
Há vários estudos que comprovam atividade de Hovenia dulcis na intoxicação
alcoólica. Okuma et al. (1995) trabalhou com frações do extrato de H. dulcis e
encontraram que, uma das frações denominada Fr G, na dose de 0,5 g/kg, quando
administrada cinco minutos antes da ingestão alcoólica em ratos, promoveu decréscimo
de 40 e 37% nos níveis plasmáticos de álcool e acetaldeído, respectivamente. O extrato
seco etanólico, na dose de 0,125g/kg de peso corporal, administrado em homens adultos
vinte minutos antes da ingestão alcoólica, diminuiu a concentração alcoólica e
acetaldeídica presente na saliva e a concentração alcoólica expiratória foi reduzida em
cinco dos oito homens do estudo.
Quatro flavonóides foram isolados das folhas de H. dulcis por Ding et al. (1997)
e suas estruturas foram identificadas como dihidrocamferol (isolado no gênero pela
primeira vez), quercetina, (+)-3,3',5',5,7-pentahidroflavanona (um novo flavonóide) e
(+)-dihidromiricetina (isolada pela primeira vez no gênero).
Yoshikawa et al. (1997) encontraram atividade inibitória do efeito relaxante
muscular induzido por álcool e atividade protetora de lesões hepáticas induzidas por D-
galN/LPS (galactosamina/lipopolissacarídeo) ou CCl4 (tetracloreto de carbono), em
ratos, na fração metanólica de Hoveniae Semen Seu Fructus, produto comercial chinês e
japonês à base de frutos com sementes e folhas de Hovenia dulcis.
8
Do produto também isolaram e determinaram a estrutura de três novos
flavonóides, denominados hovenitinas I, II e III e quatro já conhecidos, os isômeros
miricetina e dihidromiricetina (Figura 3), laricetrina e (+)-gallocatequina. Hovenitina I e
dihidromiricetina, principais componentes, demonstraram atividade inibitória do efeito
relaxante muscular induzido por álcool. Somente hovenitina I demonstrou atividade
protetora de lesões hepáticas induzidas.
Figura 3- Estruturas químicas dos isômeros: (1) miricetina; (2) dihidromiricetina
Um flavonóide ativo, denominado hovenodulinol (Figura 4), extraído da fração
butanólica do extrato hidroalcoólico dos frutos de H. dulcis, foi patenteado. O processo
de obtenção desse composto, sua utilização no alívio dos sintomas do excesso alcoólico
e como agente detoxificante alcoólico também foram registrados pela comprovação da
atividade através de experimentos com ratos e humanos (LEE et al., 2002).
Figura 4- Estrutura química do Hovenodulinol
Chen et al. (2006), encontraram redução significativa da concentração alcoólica
plasmática nas primeiras três horas após tratamento com o extrato aquoso de H. dulcis
em camundongos. Resultado que corrobora os de OKUMA et al.(1995) e JI et
al.(2001). Além disso, acrescentam que o tratamento aumentou a atividade da enzima
álcool desidrogenase (ADH) no fígado, concluindo que o tratamento estimula o
metabolismo alcoólico. JI et al. (2001) que utilizaram os frutos de H. dulcis também
detectaram encurtamento no tempo de sono dos ratos no experimento.
(1) (2)
9
Na et al. (2003) patenteou uma composição farmacêutica (alimento funcional)
contendo a fração insolúvel do extrato alcoólico dos frutos de Hovenia dulcis e um
polissacarídeo isolado da fração como um potente hepatoprotetor e ativo contra os
sintomas do excesso alcoólico. Kim (2005) patenteou uma composição contendo extrato
de Hovenia dulcis, extrato de Lindera obtusiloba ou contendo o extrato de mistura das
duas plantas como ingredientes ativos contra hepatotoxicidade e para melhoramento da
função hepática e renal.
Xu et al. (2003) comparou a atividade das enzimas álcool desidrogenase (ADH)
e aldeído desidrogenase (ALDH) de frações dos extratos de várias partes da H. dulcis.
Os resultados indicaram que a fração butanólica dos frutos, acetato de etila do caule e o
extrato aquoso das folhas obtidos do extrato hidroalcoólico de cada parte apresentaram
elevação na atividade de ADH. Enquanto o extrato butanólico e aquoso dos frutos,
aquoso do caule e butanólico e aquoso das folhas elevaram a atividade de ALDH.
Shen et al. (2012) encontraram efeitos antialcoólicos para dihidromiricetina,
isolada de Hovenia dulcis, em modelos animais e determinaram um importante alvo
molecular e mecanismo celular contra intoxicação e dependência alcoólica. O estudo
mostra que a administração oral de 1,0 mg/kg de dihidromiricetina com álcool ou até 30
minutos antes da ingestão de álcool reduziu significativamente o efeito do álcool nos
ratos. A dihidromiricetina bloqueou a ligação de neurotransmissores nos receptores
GABA.
Embora a H. dulcis seja muito utilizada na medicina popular chinesa e tenha
vários estudos comprovando sua ação como detoxificante alcoólico, os constituintes
ativos, as frações ativas dos extratos e os mecanismos de ação ainda são pouco
conhecidos.
Fang et al. (2007) comprovaram a atividade protetora do extrato alcoólico dos
frutos de H. dulcis contra hepatite crônica, induzida por CCl4. O extrato foi
administrado em camundongos oralmente, na doses de 0,5 e 1mg/kg. O extrato
promoveu redução de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotranferase
(ALT), atenuou a formação de metaloproteinases da matriz celular-I (MMP-I) e a
expressão do RNAm de MMP-III, inibiu a peroxidação lipídica, diminuindo os níveis
de malondialdeído e hidroxiprolina em respectivamente 80% e 73%, para a dose de
0,5g/kg e 78% e 74%, para a dose de 1,0g/kg, respectivamente. O tratamento diminuiu
também a formação de fibrose hepática, verificada por análise histológica do fígado dos
camundongos. Foram encontradas, no mesmo estudo, altas taxas de compostos
10
fenólicos. Verificaram também elevada atividade antioxidante utilizando o método do
DPPH e a relacionaram aos compostos fenólicos presentes no extrato, principalmente
aos flavonóides.
Hase et al. (1997) encontrou atividade hepatoprotetora dos frutos de H. dulcis,
sendo que o extrato metanólico mostrou significativa atividade hepatoprotetora contra
toxicidade induzida por CCl4 em ratos, chamada indução química, e por D-GalN/LPS
em camundongos, chamada indução imunológica. Os animais foram tratados com
100mg/kg do extrato, duas vezes na semana, por uma semana antes da indução de
toxicidade hepática. A dihidromiricetina foi isolada do extrato metanólico, sendo a
atividade atribuída ao flavonóide encontrado.
Ren-bo et al. (2007) descreveram o isolamento e elucidação de componentes
presentes nas frações, a partir do extrato etanólico, de Hoveniae lignum (caule de
Hovenia dulcis) e verificaram o efeito citoprotetor contra toxidade induzida por tacrina
em células derivadas de fígado humano (Hep G2) e contra toxicidade induzida por ter-
butil hidroperóxido (t-BHP) em hepatócitos primários de ratos. Isolaram os compostos
fenólicos: floretina, 5-(4-dihidroxifenil)-γ- valerolactona, (-)-epiafzelechina e
maesopsina. A Floretina foi hepatoprotetora contra toxidade induzida por tacrina em
células derivadas de fígado humano (Hep G2) e também reduziu a citotoxicidade
induzida por t-BHP em hepatócitos primários de ratos, reduzindo os níveis de lactato
desidrogenase e aspartato aminotransferase.
Sobre a dihidromiricetina, o PROVITAL GROUP (2006) publicou artigo com
ensaios in vitro e in vivo que comprovam a eficácia desse flavonóide como agente
redutor de celulite dérmica. Os ensaios in vitro detectaram ação na adipogênese, lipólise
e lipogênese. Esta ação se deve à inibição seletiva da atividade da tirosina quinase por
ligação à subunidade β dos receptores de membrana nos adipócitos. Esta união
desencadeia uma série de reações bioquímicas, que aumentam o transporte da glicose
através da membrana e ativam ou inativam enzimas, podendo causar mudanças nos
níveis de expressão de vários genes.
O ensaio determinou a expressão do transportador de glicose GLUT-4 e sugeriu
que a dihidromiricetina inibe em 40% a indução de GLUT-4 e a capacidade da célula
adiposa de promover adipogênese. A atividade de tirosina quinase nas subunidades β
dos receptores de membrana é fundamental para o bloqueio da lipólise nos adipócitos.
Os resultados demonstram que a molécula de dihidromiricetina bloqueia
seletivamente a atividade de tirosina quinase na subunidade β dos receptores de
11
membrana e de outras proteínas da cascata de reações, causando conseqüente ativação
da lipólise, aumentando a degradação de triacilgliceróis em 11,7 vezes, formando ácidos
graxos e glicerol. A inibição da proteína quinase e de GLUT 4 provoca diminuição da
captação de glicose pelos adipócitos, inibindo a lipogênese. (PROVITAL GROUP,
2006).
O PROVITAL GROUP (2006) sugere que a dihidromiricetina atua no
metabolismo dos adipócitos diretamente, por catabolismo, estimulando a degradação de
lipídeos. Em longo prazo, ela age por bloqueio dos processos anabólicos: bloqueio da
lipogênese e inibição da adipogênese. A empresa também realizou estudos in vivo de
avaliação da densidade dérmica, por aferição dos infiltrados no tecido adiposo da derme
de voluntários. Concluíram que, após 28 dias de tratamento, um produto dermatológico
formulado à base de dihidromiricetina, causava uma variação da densidade da derme de
11,4% com relação ao grupo placebo. Estudos do perfil toxicológico foram realizados
por técnicas de citotoxicidade, irritação dérmica, sensibilização dérmica, irritação ocular
e mutagenicidade, sendo que os resultados não revelaram alterações estatisticamente
significativas.
Zhang et al. (2003) demonstraram que a dihidromiricetina possui elevada
atividade sequestrante do radical 1,1-diphenil-2-picrilhidrazil (DPPH) e inibitória da
peroxidação lipídica. Eles propõem que o mecanismo de ação antioxidante seja quelante
de Fe2+
, atuando no sistema de peroxidação lipídica dependente de Fe2+
. HE et al.
(2003) corroborou estes resultados testando a inibição da peroxidação lipídica, pela
dihidromiricetina, no coração, fígado, homogenato de tecido do cérebro e em
mitocôndrias. O flavonóide inibiu peroxidação lipídica no homogenato e nas
mitocôndrias de maneira dose dependente.
Em relação à segurança no uso da H. dulcis, Keyler et al. (2002) determinaram o
potencial de toxicidade, em ratos, de um fitopreparado (NPI-028) contendo plantas da
medicina tradicional chinesa, historicamente utilizadas no tratamento da intoxicação
alcoólica. O fitopreparado é composto por Pueraria lobata e Citrus reticulata, e
suplementado com outras cinco plantas, Panax ginseng, Glycyrrhizauralensis, Hovenia
dulcis, Silybum marianum, e Stevia rebandiana. O estudo teve duração de treze
semanas.
Os parâmetros avaliados foram anormalidades físicas e comportamentais,
parâmetros sanguíneos (sódio, potássio, cloreto, cálcio, fósforo, dióxido de carbono,
ânion gap, glicose, colesterol, triglicerídeos, ferro, tiroxina, hormônio estimulante da
12
tiróide (TSH), uréia, creatinina, ácido úrico, proteínas totais, albumina, globulina,
bilirrubina total, direta e indireta, AST, ALT e fosfatase alcalina e hematologia) e
análise histológica dos órgãos (cérebro, coração, pulmão, fígado, rim, baço, gordura
retroperitonial e a musculatura do quadríceps).
Nenhuma anormalidade física ou comportamental foi observada nos ratos
durante o experimento. Os parâmetros hematológicos não apresentaram nenhuma
alteração significativa. Na análise histológica os órgãos não apresentaram nenhuma
alteração com relação ao grupo controle. Lesões no pulmão e rins foram mais comuns,
porém encontradas tanto nos grupos tratados quanto no grupo controle.
Na análise bioquímica dos parâmetros TSH, triglicerídeos, fosfatase alcalina,
uréia, creatinina, proteínas totais e globulina, pequenas variações foram encontradas,
porém foram distribuídas entre os grupos, tratados e não tratado, não refletindo
correlação com o tratamento. Os autores consideraram o fitopreparado seguro no
tratamento dos ratos durante três meses (KEYLER et al., 2002).
Ainda em relação à toxicidade, Alvarenga (2012) concluiu que o fitopreparado a
base do extrato hidroalcoólico dos frutos de Hovenia dulcis, o mesmo extrato utilizado
no presente trabalho, não apresentou evidências de toxicidade aguda (experimento de
dose única) ou crônica (experimento de doses repetidas) de acordo com os parâmetros
propostos na RE no 90 da ANVISA (BRASIL, 2004) em níveis comportamentais,
ponderais, hematológicos, bioquímicos sorológicos e histológicos, em ratos Wistar para
um período de três meses. Adicionalmente apresentou evidências, que corroboram a
literatura, sobre efeitos benéficos em nível sanguíneo dos parâmetros hepáticos e renais.
BAMPI et al. (2010) pesquisaram a composição centesimal do fruto da H.
dulcis. Os açúcares totais somaram 19,46% da composição do fruto, sendo 12,57% de
açúcares redutores (glicose e frutose) e 6,89% de açúcares não redutores (sacarose).
Outros estudos também revelam a presença de açúcares redutores e de açúcares não
absorvíveis com propriedades adoçantes dietéticas (HUSSAIN et al., 1990;
YOSHIKAWA et al., 1992, 1993; SUTTISRI et al., 1995; KENNED et al., 1988).
Ainda no estudo de BAMPI et al. (2010) foi determinado o percentual de
proteína bruta (3,74%), de lipídeos totais (1,42%) e o teor de fibra alimentar total
(12,56%) . Uma vez que o fruto apresentou um teor de fibra alimentar superior a 3,0 %,
pode ser classificado como “fonte de fibras”, de acordo com o estabelecido pela
legislação brasileira (BRASIL, 1998).
13
Estudos brasileiros com a espécie H. dulcis são escassos, possivelmente por não
se tratar de uma planta nativa, e que não possui vasta utilização popular no país. No
entanto, estudos internacionais, principalmente chineses, já demonstraram o potencial
promissor dessa espécie em patologias importantes, incentivando a realização de mais
estudos com a planta.
III. 2 - HIPERCOLESTEROLEMIA
III.2.1 ASPECTOS GERAIS
Nas últimas décadas as doenças cardiovasculares (DCVs) passaram a ser a
principal causa de morbimortalidade nos países desenvolvidos e também em proporções
cada vez maiores nos países em desenvolvimento (FALUDI e BERTOLAMI, 2005;
REHRAH et al., 2007).
No panorama nacional Martinez e colaboradores (2003) determinaram os níveis
de colesterol em 81.262 indivíduos com mais de 18 anos em 13 cidades brasileiras e
observaram que a prevalência dos níveis de colesterol acima de 200 e 240 mg/dL foram
de 40% e 13%, respectivamente. Além disso, os mesmos observaram que quanto maior
a quantidade de fatores de risco associados, maiores os níveis de colesterol (p < 0,0001)
e a proporção de indivíduos com colesterol total > 200 mg/dL (p = 0,032).
Em estudo transversal realizado na cidade de São Paulo com pessoas de 15 a 59
anos de idade, Marcopito et al. (2005) constataram prevalência de 8,1% de indivíduos
com colesterol total >240 mg/dL; 27,1% com HDL-colesterol <40 mg/dL; 14,4% com
triacilgliceróis>200 mg/dL.
Nas dislipidemias, a principal conduta terapêutica até então adotada é o controle
do LDL-c, composto conhecido popularmente como o “colesterol ruim” por depositar o
colesterol nas células (COSTA e SILVA, 2005). Já é bem estabelecido que a elevação
deste parâmetro é a maior causa de doença arterial coronariana (DAC), pois quando
oxidada, esta molécula atua no início e na progressão da aterosclerose (ARAÚJO et al.,
2005; MATSUURA et al.,2006).
A IV Diretriz Brasileira Sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose
divide o tratamento da hipercolesterolemia em medicamentoso e não medicamentoso,
conforme esquematizado na figura 5.
Figura 5- Tratamento da hipercolesterolemia.
14
Adaptado da IV Diretriz Brasileira Sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose, 2007
As três classes de medicamentos que atuam predominantemente sobre a
colesterolemia, relatadas nessa diretriz, são as estatinas, ezetimiba e resinas de troca
(representada pela colestiramina).
As estatinas são inibidores da HMG-CoA redutase, uma das enzimas chave na
síntese intracelular do colesterol. Sua inibição reduz o conteúdo intracelular de
colesterol e, como conseqüência, há aumento do número de receptores de LDL nos
hepatócitos que então removem mais VLDL, IDL e LDL da circulação para repor o
colesterol intracelular. Estes medicamentos reduzem o LDL-C de 20% a 55%
(MAHLEY e BERSOT, 2003).
A ezetimiba é um inibidor de absorção do colesterol que atua na borda em
escova das células intestinais inibindo a ação da proteína transportadora do colesterol.
Usada isoladamente, reduz cerca de 20 % o LDL-C. Entretanto, variações de resposta
podem ocorrer em indivíduos com absorção intestinal de colesterol acima ou abaixo da
média populacional. Já as resinas de troca, são fármacos que reduzem a reabsorção
intestinal de sais biliares e, conseqüentemente, de colesterol (Diretriz Brasileira Sobre
Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose, 2007).
15
A ação hipocolesterolemiante de alguns ácidos graxos poliinsaturados tem sido
intensamente demonstrada. Os mecanismos de ação incluem a inibição da síntese
endógena e da esterificação do colesterol, o aumento da excreção de colesterol na bile e
o aumento da síntese de sais biliares (ALVAREZ-LEITE; ROSA, 2008).
A presença de fibra na dieta resulta em alta viscosidade do líquido intraluminal,
e o maior volume do conteúdo intestinal pela retenção de água leva ao “sequestro” de
ácidos biliares secretados pelo fígado. O mecanismo pelo qual a fibra sequestra os
ácidos biliares não está bem entendido, mas pode estar relacionado com interações
hidrofóbicas (grupos fenólicos das fibras) e iônicas (ácidos urônicos das fibras), que
levam ao aumento da excreção fecal desses ácidos, impondo ao fígado uma maior
conversão de colesterol em ácidos biliares para recuperar os níveis dos mesmos. Além
disso, a indisponibilidade dos ácidos biliares no intestino para a formação de micelas
inibe a absorção de lipídios e colesterol (ALVAREZ-LEITE; ROSA,2008).
A presença dos fitosteróis nos alimentos, em função da sua estrutura molecular,
pode colaborar de forma efetiva com a diminuição da absorção do colesterol
(SCALBERT et al., 2005). Foi observado que o colesterol, devido à baixa solubilidade,
quando na presença dos fitosteróis, se precipita, não sendo dessa forma absorvido pelo
intestino (AMSTRONG; CAREY, 1987).
Reconhecidamente, a dieta rica em colesterol (hipercolesterolêmica) e ácidos
graxos saturados também é um dos fatores de risco para o desencadeamento das
doenças cardiovasculares ateroscleróticas (PRAÇA, THOMAZ e CARAMELLI, 2004).
III.2.2 - HIPERCOLESTEROLEMIA E ESTRESSE OXIDATIVO
Os efeitos tóxicos do oxigênio sobre componentes biológicos têm-se tornado
objeto de intensa investigação científica nos últimos anos. Estes efeitos são resultantes
da oxidação de componentes celulares como tióis, cofatores enzimáticos, proteínas,
nucleotídeos e lipídios (principalmente ácidos graxos poliinsaturados), mediada por
espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs),
conhecidas genericamente como radicais livres (GILLER e SIGLER, 1995; ROMERO
et al., 1998).
O oxigênio é considerado o principal fornecedor de espécies reativas. Durante o
metabolismo aeróbio mais de 95% do oxigênio consumido decorre da produção de
energia nas mitocôndrias celulares; o restante, quando não é totalmente reduzido à água,
16
pode sofrer redução por um número menor de elétrons, ao longo da cadeia respiratória,
produzindo espécies reativas de oxigênio numa sequência de reações de oxi-redução
(LEITE e SARNI, 2003; URSO e CLARKSON, 2003).
Radical livre é qualquer espécie com existência independente que contenha um
ou mais elétrons não pareados ocupando orbitais externos, sendo que um elétron não
pareado é aquele que ocupa um orbital atômico ou molecular isoladamente (STOKER e
KEANEY, 2004). Assim, os radicais livres são moléculas altamente instáveis, com
meia-vida muito curta e quimicamente muito reativas (SOARES, 2002).
A formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) é uma consequência natural
do metabolismo aeróbico e é importante para manter a homeostase de oxigênio nos
tecidos (SEIFRIED et al., 2007). Entretanto, o excesso de colesterol nos eritrócitos,
leucócitos, plaquetas e células endoteliais estimula a produção de espécies reativas,
contribuindo para a disfunção endotelial e a modificação da LDL (FORSTERMANN,
2008).
As EROs incluem todos os radicais do oxigênio, como íon superóxido
(O2•),radical hidroxila (OH•), radical alquila (L•), alcoxila (RO•) e peroxila (ROO•).
Nas ERNs estão incluídos além do peroxinitrito (ONOO-), o óxido nítrico (•NO) e o
radical dióxido de nitrogênio (•NO2) (MANCINI-FILHO, 2006).
O desequilíbrio entre moléculas oxidantes e antioxidantes, que resulta na
indução de danos celulares pelos radicais livres, tem sido chamado de estresse oxidativo
(STOKER e KEANEY, 2004).
II.2.2.1- PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
A reação de EROs com ácidos graxos poli-insaturados presentes em membranas
celulares e nas lipoproteínas dão início a um processo em cadeia chamado peroxidação
lipídica ou lipoperoxidação, que pode ser utilizado como um indicador do estresse
oxidativo celular (LIMA e ABDALLA, 2001).
Segundo Benzie (1996), a peroxidação lipídica pode ser definida como uma
sequência de reações bioquímicas resultantes da ação dos radicais livres sobre os
lipídios insaturados das membranas celulares, gerando principalmente radical alquila,
alcoxila e peroxila. As alterações então provocadas nas membranas levam a mudanças
na permeabilidade, o que gera por sua vez diversos prejuízos, como a perda da
seletividade para entrada e/ou saída de nutrientes e substâncias tóxicas à célula,
17
alterações do DNA, e oxidação do LDL-colesterol (BABER e HARRIS, 1994; VACA,
WILHEM e HARMS-RINGDAHL, 1988). A figura 6 esquematiza as etapas de um
processo de peroxidação lipídica.
Figura 6 – Mecanismo de peroxidação lipídica.
Fonte: FONSECA, 2007
O processo da peroxidação lipídica inicia-se quando espécies reativas removem
um átomo de hidrogênio do grupo metileno da cadeia de ácidos graxos poliinsaturados
(LH) das membranas ou de partículas de lipoproteínas formando um radical lipídico
(L•). Este por sua vez, para se estabilizar, sofre um rearranjo molecular formando um
dieno conjugado que reage com o oxigênio produzindo radical peroxil (LOO•), o qual
na presença de outro lipídio (LH) ou outro doador de elétron forma um hidroperóxido
lipídico (LOOH) e um outro radical lipídico (L•) (BLOKHINA, VIROLAINEN e
FAGERSTEDT, 2003; SJÖDIN, WESTING e APPLE, 1990; STOKER e KEANEY,
2004).
O radical lipídico (L•) é reativo e inicia a formação de novos radicais livres,
dando continuidade ao processo de reação em cadeia. O hidroperóxido lipídico sofre
degradação catalisada por metais de transição, e produzir outros radicais reativos, como
18
o radical peroxil (LOO•) ou o radical alcoxil (LO•), os quais continuam as reações em
cadeia e produzem compostos como o malondialdeído (MDA) (BLOKHINA,
VIROLAINEN e FAGERSTEDT, 2003; SJODIN,WESTING e APPLE, 1990;
STOKER e KEANEY, 2004).
O malondialdeído, assim como outros aldeídos insaturados, são capazes de se
ligar covalentemente a grupos nucleofílicos presentes em DNA, peptídeos e proteínas,
provocando alterações nas funções dessas moléculas, fato que vem relacionando esses
compostos a processos degenerativos (HALLIWELL e CHIRICO, 1993).
Os compostos aldeídicos formados durante o processo de oxidação de ácidos
graxos insaturados presentes nas membranas lipoprotéicas, em especial o
malondialdeído (MDA), 4-hidroxinonenal (HNE) e o hexanal, reagem com a porção
amino dos aminoácidos lisina da apolipoproteína B-100 da LDL (LECOMTE et al.,
1993; STOCKER e KEANEY, 2004). Este fato diminui o reconhecimento pelo receptor
celular clássico da lipoproteína de baixa densidade. Assim, as formas modificadas da
LDL são captadas através de mecanismos de reconhecimento pelo receptor scavenger
(presente em macrófagos) resultando em um substancial acúmulo de colesterol e
subsequente formação de células espumosas nos vasos sanguíneos (CARMENA,
DURIEZ e FRUCHART, 2004; GOTTO, 2003).
III.2.2.2- MODIFICAÇÃO OXIDATIVA DA LDL E A ATEROSCLEROSE
As doenças cardiovasculares vêm representando uma das causas mais
importantes de morbidade e mortalidade em todo o mundo. De acordo com a
Organização Mundial da Saúde, estima-se que até 2015 vinte milhões de pessoas
morrerão de doenças cardiovasculares, principalmente a partir de infarto do miocárdio e
acidentes vasculares cerebrais (WHO, 2009).
A aterosclerose é uma doença multifatorial que consiste em uma complexa e
crônica inflamação que ocorre nas artérias de médio e grande calibre como as artérias
coronárias (VANDERLAAN, REARDON e GETS, 2004).
Postula-se que a modificação oxidativa da LDL seja importante e,
possivelmente, obrigatória na patogênese da doença (STEINBERG E WITZTUM,
1990; WITZTUM, 1994).
A sequência de eventos da modificação oxidativa da LDL está esquematizada na
Figura 7.
19
Figura 7- Esquema da modificação oxidativa da LDL
A LDL oxidada estimula a quimiotaxia de monócitos (A),o que leva à fagocitose das LDL-ox
econsequente formação das células espumosas. Impede ainda o egresso desses monócitos (B).
Paralelamente, as lipoproteínas oxidadas geram disfunção e injúria endotelial (C) e favorecem a necrose
das células espumosas (D). Adaptado de Stocker e Keaney, 2004.
As LDL-oxidadas, além de transformarem macrófagos em células espumosas,
aumentam a adesão, ativação e migração dos monócitos (ROSS, 1993; CUSHING et al.,
1990). LDL altamente oxidadas podem também inibir a migração de células endoteliais
e comprometer a reparação de placas ulceradas em lesões ateroscleróticas avançadas
(MURUGESAN, CHISOLM e FOX, 1993)
LDL-OX são também imunogênicas; anticorpos a determinados epítopos
(determinantes antigênicos) de LDL-OX são encontrados no plasma e em lesões
associadas a imuno-complexos. Há, portanto, uma resposta humoral e uma resposta
imunológica, mediada por células, típica de lesão inflamatória (WITZTUM, 1994).
Os efeitos da LDL oxidada sobre a parede vascular também incluem danos ao
DNA e consequente apoptose de células endoteliais, macrófagos e células musculares
lisas, o que pode favorecer a ativação de genes pró inflamatórios e de fatores de
crescimento bem como o aumento dos fosfolípides oxidados capazes de induzir a
interação monócito-endotélio (GIOVANNINI et al., 2007; TIROSH e ARONIS, 2008).
20
Certos produtos das LDL oxidadas, como oxiteróis, são altamente tóxicos para
as células endoteliais e podem comprometer a integridade endotelial. Outros produtos
podem estimular a liberação do fator tissular e iniciar o processo de coagulação.
Finalmente, como as bordas das lesões ateroscleróticas, onde a ruptura da placa
habitualmente ocorre, são ricas em células espumosas, contendo LDL-OX, essas
partículas provavelmente participam também desse estágio tardio da aterosclerose, ou
seja, ruptura da placa e trombose (WITZTUM, 1994; STEINBERG, 1995).
III.2.3- MECANISMOS ANTIOXIDANTES E A HIPERCOLESTEROLEMIA
Com base no exposto no item anterior, entende-se a hipótese de que os
antioxidantes possam, ao menos parcialmente, prevenir riscos cardiovasculares
normalmente causados pelo excesso de radicais livres (FKI, SAHNOUN e SAYADI,
2007).
Os antioxidantes são compostos que previnem a formação ou sequestram os
radicais livres e interrompem a cadeia de reações de propagação, pois reagem com os
radicais livres nas etapas iniciais da oxidação formando produtos intermediários estáveis
(VALENZUELA; NIETO; UAUY, 1993).
Tais antioxidantes, que protegem as células contra os efeitos dos radicais livres,
podem ser classificadas como antioxidantes enzimáticos (endógenos) ou não-
enzimáticos (exógenos) (SIES,1993).
III.2.3.1 - MECANISMOS ENDÓGENOS
Nos seres humanos, a proteção contra o estresse oxidativo é realizada por uma
variedade de mecanismos fisiológicos de defesa, que ajudam a eliminar as espécies
reativase incluem enzimas como catalase, glutationaperoxidase e superóxido dismutase
(SOD) (CHOI e HWANG, 2005; TOUSOULIS et al., 2008), além de glutationa
redutase (GSH) nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato (NADPH), coenzima Q
(JACOB, 1994); proteínas ligantes de metais como a albumina, metalotioneína,
ceruloplasmina e transferrina (SOARES, 2002).
Estudos conduzidos com ratos da linhagem Wistar com hipercolesterolemia
induzida pela dieta mostraram um aumento da atividade da superóxido dismutase em
tecidos e plasma após tratamento com antioxidantes naturais Piper cubeba,
21
Physalisangulata e Rosahybrida (CHOI e HWANG, 2005) e Ajugaiva
(BOUDERBALA et al., 2008). Esta enzima tem a capacidade de dismutar o ânion
superóxido a peróxido de hidrogênio e oxigênio molecular (WASSMANN,
WASSMANN e NICKENIG, 2004).
Em animais com hipercolesterolemia induzida por dieta, Anila e Vijayalakshmi
(2003) observaram aumento na atividade da catalase após o tratamento com manga
(Mangifera indica L.) e emblica (Emblica officinalis L.) na dose de 10 mg/Kg. De
acordo com Forstermann (2008), a expressão aumentada desta enzima possibilita a
inibição da hipertrofia da parede aórtica induzida pela angiotensina II e a redução no
desenvolvimento da aterosclerose, exercendo, portanto, efeitos protetores no sistema
cardiovascular. A principal função da catalase é promover a decomposição do peróxido
de hidrogênio (H2O2) em água (H2O) e oxigênio (O2), protegendo as células do estresse
oxidativo (ANDERSON et al., 2009).
III.2.3.2- ANTIOXIDANTES EXÓGENOS
Em adição aos efeitos protetores dos antioxidantes endógenos, a inclusão de
antioxidantes exógenos auxilia na prevenção do risco de doenças associadas ao excesso
de radicais livres no organismo. Por exemplo, o efeito protetor atribuído às frutas deve-
se à variedade de constituintes com atividade antioxidante presentes nas mesmas, como
vitaminas e numerosos metabólitos secundários, incluindo flavonóides e outros
polifenóis (HAVSTEEN, 2002; PIETTA, 2000).
Os antioxidantes naturais são compostos de baixo peso molecular capazes de
sequestrar diretamente as espécies reativas e compreendem os tocoferóis, ascorbato,
carotenoides, tióis e polifenóis (SIES, STAHL e SEVANIAN, 2005).
O desempenho dos antioxidantes in vivo depende principalmente de fatores
como: tipos de radicais livres formados, onde e como são gerados os mesmos e doses
ideais para a proteção. Assim, é possível que um antioxidante atue como protetor em
determinado sistema, mas não proteja ou mesmo aumente as lesões induzidas em outros
sistemas ou tecidos (HALLIWELL et al., 1995). A vitamina C, por exemplo, atua na
fase aquosa como um excelente antioxidante sobre os radicais livres, mas não é capaz
de agir nos compartimentos lipofílicos para inibir a peroxidação dos lipídeos. Por outro
lado, estudos in vitro mostram que essa vitamina na presença de metais de transição,
22
como o ferro, pode atuar como uma molécula pró-oxidante gerando os radicais H2O2 e
OH· (ODIN, 1997).
Os compostos fenólicos, em especial os flavonóides, sequestram os radicais
livres bloqueando as reações radicalares em cadeia através da doação de átomos de
hidrogênio, podendo aturar em ambos os compartimentos celulares lipofílico e
hidrofílico (DECKER, 1997). Segundo Halliwell et al. (1995), esses compostos de
considerável importância na dieta podem inibir o processo de peroxidação lipídica e
com isso ajudar na prevenção de doenças oriundas desse tipo de processo.
O potencial antioxidante das antocianinas é regulado por diferenças na sua
estrutura química. Variando-se a posição e os grupamentos químicos nos anéis
aromáticos das mesmas, a capacidade de reagir com radicais livres também varia
(GALVANO et al., 2004). Seu potencial antioxidante também é dependente do número
e da posição dos grupos hidroxilas e sua conjugação na estrutura. Assim, os flavonóides
com um maior número de grupos hidroxila têm maior atividade antioxidante
(KUSKOSKI et al., 2004).
Os efeitos dos antioxidantes sobre a hipercolesterolemia são atribuídos à
capacidade dos mesmos em aumentar a resistência da LDL-c à oxidação e, portanto,
reduzir o risco de doenças cardiovasculares. Em modelos animais, observou-se que a
vitamina E e o probucol preveniram a oxidação de LDL e retardaram o
desenvolvimento de placas ateroscleróticas (YOKOZAWA, NAKAGAWA e KITANI,
2002). A oxidação da LDL também foi reduzida de modo dose dependente em humanos
após a suplementação com vitamina E e carotenóides (UPRITCHARD et al., 2003).
O estudo realizado por Galvano et al. (2004) com cianidina-3-glicosilrutinosídeo
e cianidina-3-rutinosídeo, de cerejas, relatou que para ambas a atividade antioxidante foi
superior a vitamina E.
Em relação aos mecanismos de ação dos compostos fenólicos sobre a
hipercolesterolemia, um dos mais importantes é a redução na absorção intestinal de
colesterol e na atividade da lipase pancreática conforme comprovado por Rehrah et al.
(2007), utilizando o chá verde. Neste estudo houve um aumento da excreção de lipídeos
totais, colesterol (60%) e ácidos biliares (50%) nas fezes e redução do armazenamento
excessivo de lipídeos no tecido hepático em ratos com hipercolesterolemia induzida
pela dieta.
Kumar, Sudhahar e Varalakshmi (2005) também discutem a ação
hipocolesterolemiante dos polifenóis em decorrência da redução na secreção da apoB e
23
aumento da atividade da lipase de lipoproteínas, o que favorece o aumento da excreção
de sais biliares e estimula a enzima hepática 7-α-hidroxilase (MICELI et al., 2007),
indicando maior degradação de colesterol.
Raederstorff et al. (2003) observaram em um modelo de micela biliar in vitro
que a epigalocatequinagalato (EGCG), composto presente no chá verde, altera o
tamanho da micela e diminui a solubilidade do colesterol, reduzindo por sua vez a
absorção de colesterol.
Em ratos alimentados com uma dieta suplementada com 1,0 % de colesterol e
0,5 % de extrato da casca de tangerina ou uma mistura 0,5 % de naringina e hesperidina
tiveram a excreção de esteróides fecais neutros e a atividade das enzimas 3-hidroxi-3-
metil-glutaril-CoA (HMG-CoA) redutase e acil CoA: colesterol aciltransferase (ACAT)
diminuídas quando comparados ao grupo controle, indicando um aumento na
degradação do colesterol (BOK et al., 1999).
Outro possível mecanismo é o acúmulo de compostos fenólicos em macrófagos
presentes nas lesões ateroscleróticas, tal como comprovado por Aviram (2004) em
camundongos deficientes na apolipoproteína E (apo E) tratados com 20 mg de
glabridina por dia. Esta conduta afetou os processos de sinalização celular, o que
possibilitou uma inibição da oxidação da LDL mediada por células em até 80% com
concomitante diminuição da lesão aterosclerótica (50%).
Utilizando um anticorpo monoclonal para localizar os órgãos alvos do principal
metabólito secundário da quercetina no plasma humano, a quercetina-3-glicuronídeo,
Kawai et al. (2008) constataram que o macrófago ativado pode ser um alvo potencial de
flavonóides dietéticos na aorta, uma vez que o estudo imuno-histoquímico demonstrou
coloração positiva acumulada especificamente nas lesões ateroscleróticas e não em
aortas normais.
Além disso, os polifenóis podem aumentar a atividade e expressão dos
receptores de LDL hepáticos proporcionando uma diminuição das concentrações
plasmáticas de LDL colesterol (LECUMBERRI et al., 2007).
Em experimentos utilizando ratos com hipercolesterolemia induzida pela dieta,
os polifenóis presentes no chá verde (Camellia sinensis L.), demonstraram reduzir os
níveis de colesterol e LDL séricos (YOKOZAWA, NAKAGAWA e KITANI, 2002).
Os mesmos resultados foram relatados por Koshy (2001) utilizando garcínia
(GarciniacambogiaL.) e por El-Beshbishy (2006) testandoamoreira branca (Morus alba
L.), respectivamente.
24
IV. MATERIAIS E MÉTODOS
IV.1- OBTENÇÃO DO EXTRATO
Frutos da planta H. dulcis foram coletados de árvore adulta, localizada no
município de Perdões, em Minas Gerais, sob as coordenadas 21o05´38.51´´S e
45o05´24.75´´, em janeiro de 2009. Exsicata foi depositada no Herbário José Badini-
UFOP (OUPR 21003). Os frutos foram secos em estufa com ventilação forçada de ar à
40 ºC, até peso constante, posteriormente moídos e remacerados em etanol/água 1:1
(SONAGLIO et al., 2004). A cada sete dias o líquido extrator foi filtrado e novo líquido
extrator (dois litros) foi adicionado, processo este realizado até exaustão de cada
material. O extrato obtido foi seco em evaporador rotatório à pressão reduzida e
posteriormente liofilizado, sendo desde então armazenado em ultrafreezer (-80 ºC). O
material liofilizado foi denominado extrato hidroalcoólico seco dos frutos de Hovenia
dulcis (EHD).
IV.2- DETERMINAÇÃO DO TEOR RESIDUAL DE UMIDADE
O teor de umidade do EHD foi determinado conforme normas oficiais da
Farmacopéia Brasileira 5ª edição, pelo método gravimétrico de determinação da perda
de umidade por dessecação. Foram pesadas três amostras do extrato bruto liofilizado em
pesa-filtros e colocadas em estufa de ventilação forçada à temperatura controlada de 105
0C. As amostras foram pesadas até estabilização do peso (diferença menor que 0,5
mg/g) e o percentual de umidade determinada pela fórmula: (Pu-Ps)/Pa x 100, sendo Pa
= peso da amostra, Pu = peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação, Ps
= peso do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação (BRASIL, 2010).
IV.3- TRIAGEM FITOQUÍMICA DO EXTRATO DE H. dulcis
Para a realização da prospecção fitoquímica, foram utilizadas 30 g dos frutos
secos, segundo metodologia descrita por Matos (1997).
Foram realizados os testes para fenóis, taninos, antocianinas, antocianidinas,
flavonóides, catequinas e confirmação de catequinas, xantonas, triterpenóides,
saponinas e confirmatório para saponinas, alcalóides, bases quaternárias, quinonas,
25
antranóis e cumarinas. Os testes determinam presença de compostos por meio de
reações com aparecimento de cor e/ou precipitado e formação de espuma (saponinas).
IV.4- ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
IV.4.1- IDENTIFICAÇÃO DO FLAVONÓIDE DIHIDROMIRICETINA NO
EXTRATO HIDROALCOÓLICO BRUTO DE Hovenia dulcis.
A identificação foi realizada através de cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), de acordo com a metodologia adaptada de Yoo et al., 2005. Utilizou-se
cromatógrafo líquido Waters Alliance 2695, com detector Waters UV/vis 2996, coluna
de fase reversa C 18 Waters Symmetry (150 mm x 4,6 mm x 5 μm) e pré-coluna
Bondpack C 18 Waters (10 x 3,9-4 μm). Foi utilizada eluição por gradiente
água:acetonitrila de 90:10 v/v a 30:70 v/v, com vazão de 1,0 mL/mim. O volume de
injeção foi de 50 μL, e o efluente foi monitorado utilizando detector UV (190-600 nm).
A eluição foi controlada por software Waters. Todos os solventes utilizados foram de
alta pureza e filtrados (0,22 μm de poro, 47 mm de diâmetro, Millipore®) e desaerados
em banho de ultra-som (Tecnal®).
O extrato hidroalcoólico bruto de Hovenia dulcis (EHD) e o padrão do flavonóide
dihidromiricetina (Provital group®, lote 501435) foram solubilizados em mistura de
água: metanol (7:3) gerando amostras em concentrações de 50,0 e 1,0 mg/mL,
respectivamente. As amostras foram filtradas em filtros RC 0,45 μm (Sartórious®), e
injetadas no cromatógrafo.
IV.4.2- QUANTIFICAÇÃO DE DIHIDROMIRICETINA NO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO BRUTO DE Hovenia dulcis.
Realizou-se a quantificação através de cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), utilizando-se o mesmo sistema cromatográfico e condições já descritas.
Obtenção da curva-padrão de dihidromiricetina
Preparou-se solução estoque de dihidromiricetina padrão em água: metanol (7:3)
na concentração 50 μg/mL, a partir da qual, diluindo-se à metade, obteve-se a
26
concentração de 25,0 μg/mL e assim sucessivamente, até obtenção das outras cinco
concentrações (12,5; 6,25; 3,125; 1,5625; 0,78125 μg/mL), em triplicata. Em seguida,
as amostras foram filtradas em filtros RC 0,45 μm (Sartórious®) e submetidos à análise
cromatográfica. A curva analítica foi obtida por regressão linear (área do pico versus
concentração do padrão), utilizando-se os seis pontos da solução padrão.
Posteriormente, preparou-se solução do extrato hidroalcoólico bruto de Hovenia
dulcis (EHD) em água: metanol (7:3) na concentração 50,0 mg/mL, em triplicada e
procedeu-se a análise cromatográfica, nas mesmas condições já descritas. As áreas
obtidas foram substituídas na equação da curva-padrão (Figura 8), gerando a
concentração do flavonóide no extrato bruto.
Figura 8 – Curva de calibração da dihidromiricetina
IV.5- ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
A determinação da atividade antioxidante pelo método do DPPH (radical 1,1-
diphenil-2-picrilhidrazil), foi realizada de acordo com SINGH, CHIDAMBARA
MURTHY & JAYAPRAKASHA, 2002.
Diferentes concentrações de amostra (200 e 400 ppm), solubilizadas em
metanol, foram misturadas a 5,0 mL de solução metanólica de DPPH 0,1 mM. O
butilhidroxianisol (BHA) foi utilizado para comparação da atividade antioxidante. Para
isso, BHA nas concentrações de 25 e 50 ppm foi misturado a 5,0 mL de solução
metanólica de DPPH 0,1 mM. Os tubos foram agitados e a leitura foi realizada nos
tempo 0 e 30 minutos.
y = 4E+08x - 117007 R² = 0,9996
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
10000000
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03
Are
a
Concentração mg/mL
27
O controle foi preparado utilizando-se apenas a solução metanólica de DPPH 0,1
mM. O metanol foi utilizado como branco. As leituras foram realizadas em
espectrofotômetro Femto® no comprimento de onda de 517 nm, em triplicata. A
porcentagem da atividade antioxidante foi calculada pela fórmula: % AAT = [(Abs
controle – Abs amostra) / Abs controle)] x 100.
IV.6- FORMULAÇÃO DAS SUSPENSÕES COM SUBSTÂNCIAS TESTE
As formulações farmacêuticas utilizadas no experimento in vivo foram:
• Suspensão de Atorvastatina, correspondente a dose 1,0 mg/Kg de peso corporal.
• Suspensão do flavonóide dihidromiricetina (DHM), correspondente a dose 25,0
mg/Kg de peso corporal.
• Suspensão do flavonóide dihidromiricetina (DHM), correspondente a dose 50,0
mg/Kg de peso corporal.
• Suspensão do extrato EHD, correspondente a dose 50,0 mg/Kg de peso corporal.
• Suspensão do extrato EHD, correspondente a dose 100,0 mg/Kg de peso
corporal.
• Suspensão inerte (veículo).
Suspensão inerte (veículo) foi adquirida em Farmácia de Manipulação (Botica
Fontenele) na cidade de Viçosa-MG, com a seguinte composição (Tabela 1):
Tabela 1- Composição do veículo utilizado para manipulação das substâncias teste
VEÍCULO
Componente Percentual
Propilenoglicol 20%
Suspender 1,5%
Nipagim 0,1%
Nipasol 0,05%
Água destilada q.s.p. 100%
A partir da suspensão inerte, todos os princípios ativos (atorvastatina*,
dihidromiricetina** e extrato hidroalcoólico liofilizado de H. dulcis), nas suas
respectivas dosagens, foram incorporados através da levigação em gral de porcelana
28
com a própria suspensão placebo. Completou-se o volume com essa mesma suspensão,
aferindo-se em balão volumétrico de 250,0 mL, para todas formulações.
*Atorvastatina (Galena, lote AT110703)
**Dihidromiricetina (Provital group, lote 501435). Nome comercial: Myriceline SPE 90®: código do
laudo 7531000G; 92,2% de pureza; extraída e concentrada de Myricacerifera L.
IV.7- PROCESSAMENTO DA RAÇÃO
As rações hipercolesterolêmica e não-hipercolesterolêmica (controle) foram
processadas na Unidade Processadora de Ração do LabNUT (Laboratório de nutrição de
peixes) do Departamento de Zootecnia da UFV.
Ração comercial para roedores da marca Presence® foi moída em moinho tipo
martelo, a 3200 RPM, peneira de 0,25 mm (Inbramaq). Uma porção da ração comercial
pulverizada foi reservada, para produção da ração controle.
Paralelamente, foram pesados o colesterol (Vetec®, lote 1101904) e o ácido
cólico (Sigma-Aldrich®, lote 031M1781V) em quantidades suficientes para produto
final contendo 1,0 % de colesterol e 0,3% de ácido cólico. Os princípios ativos foram
misturados manualmente à ração pulverizada, por diluição geométrica. Posteriormente,
a mistura foi colocada em misturador por 15 minutos, para completa homogeneização.
A mistura foi então encaminhada à extrusora/peletizadora MX-40 da Imbramaq, com as
seguintes configurações: velocidade de abastecimento 20kg/h; umidade 10ccH2O/cm3;
frequência de corte de 32,5 Hz; Matriz de 5 mm de diametro, temperatura de 50ºC para
confecção dos pellets.
Em seguida, os pellets foram secos em secadora horizontal Inbramaq com
capacidade de secagem de 150 kg/h, à temperatura de 50oC e após resfriamento,
embalados em sacos plásticos impermeáveis.
A ração controle pulverizada foi processada pelos mesmos procedimentos de
peletização e secagem já descritos, para que apresentasse as mesmas características
físico-químicas e de digestibilidade que a ração hipercolesterolêmica (Figura 9).
29
Figura 9- Equipamentos utilizados no processamento da ração
hipercolesterolêmica. A- Moinho tipo martelo; B- Máquina extrusora/peletizadora; C-
Secadora horizontal; e da D-Ração hipercolesterolêmica (produto final).
IV.8- ENSAIO BIOLÓGICO
IV.8.1- ATIVIDADE FARMACOLÓGICA IN VIVO DO EXTRATO DE H.
dulcis.
A avaliação da atividade farmacológica in vivo, baseou-se nos estudos de
Machado et al, 2003 e Afonso (2010), com adaptações. O estudo utilizando animais de
laboratório foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal
(Protocolo 0017/2012-1, anexo I) da Faculdade UNIVIÇOSA.
Quarenta e oito (48) ratos (Rattus novergicus, var.albinus) da linhagem Wistar
machos, com aproximadamente 8 semanas, pesando em média 138,7 ± 11,85 gramas
foram adquiridos do Biotério de Experimentação Animal do Departamento de
Veterinária da Universidade Federal de Viçosa. e distribuídos aleatoriamente em 8
grupos de 6 animais, acomodados em gaiolas com sistema de exaustão de ar,
temperatura de (22 ±5ºC) e umidade relativa (55 ±10%) e ciclo claro/escuro de 12
horas.
A B
C D
30
Os animais foram pesados nos tempos 0, 7, 15, 23 e 30 dias, para monitoramento
da evolução ponderal. A água e a ração (controle ou hipercolesterolêmica) foram
ofertadas ad libidum. O consumo alimentar foi diariamente monitorado.
Após período de adaptação de 5 dias, ingerindo ração controle (não-
hipercolesterolêmica), passaram a receber, durante 10 dias, a ração
hipercolesterolêmica, com exceção do grupo 1 que permaneceu ingerindo ração
controle. A partir do 11º dia foi iniciado o tratamento com as substâncias teste,
mantendo-se a mesma dieta, até o 30º dia. O grupo 8 foi eutanasiado no 10º dia para
monitoramento da indução da hipercolesterolemia, não recebendo nenhuma substância
teste (Tabela 2).
Tabela 2- Grupos experimentais
GRUPOS CÓDIGO TRATAMENTO
Grupo 1 C Ração controle, tratado com veículo
Grupo 2 HC Ração hipercolesterolêmica, tratado com veículo
Grupo 3 ATOR Ração hipercolesterolêmica, tratado com
atorvastatina 1,0 mg/kg
Grupo 4 DHM 1 Ração hipercolesterolêmica, tratado com
dihidromiricetina 25,0 mg/kg
Grupo 5 DHM 2 Ração hipercolesterolêmica, tratado com
dihidromiricetina 50,0 mg/kg
Grupo 6 EHD 1 Ração hipercolesterolêmica, tratado com extrato
de H. dulcis 50,0 mg/kg
Grupo 7 EHD 2 Ração hipercolesterolêmica, tratado com extrato
de H. dulcis 100,0 mg/kg
Grupo 8 SAT Ração hipercolesterolêmica, eutanasiado no 10º
dia, não tratado
IV.8.2- EUTANÁSIA
Os animais foram eutanasiados em câmara contendo mistura de dióxido de
carbono (40% em ar atmosférico, com administração lenta). Procedeu-se imediatamente
a perfusão cardíaca para coleta do sangue. Em seguida, coletou-se porção do lobo
esquerdo do fígado, que foi lavada em solução fisiológica (cloreto de sódio 0,9%) e
31
armazenada em frasco com formaldeído a 10% para confecção de lâminas para análise
histológica.
IV.8.3- DOSAGENS BIOQUÍMICAS
Realizaram-se as dosagens bioquímicas em aparelho Cobas Mira Plus (Roche®),
a partir do soro dos ratos, centrifugado em centrífuga CELM LS-3 Plus.
A concentração de colesterol total (COT), triglicérides (TG) e lipoproteína de
alta densidade (HDL-c) sérica foi determinada por método enzimático colorimétrico. A
lipoproteína de baixa densidade (LDL-c) foi calculada de acordo com a fórmula LDL=
COT - HDL - (TG/5), descrita por Friedwald, Levy e Fradrickson (1972). As
concentrações de alanina aminotranferase (ALT) e aspartatoaminotranferase (AST) e
fosfatase alcalina (FALC) séricas foram determinadas por método cinético (Tabela 3).
Tabela 3- Reagentes utilizados nas análises bioquímicas
PARÂMETRO
BIOQUÍMICO
MARCA/REFERÊNCIA
DO KIT
TIPO DE
REAÇÃO
Colesterol total Labtest/ 76-2/250 Enzimático
HDL Labtest/13-50 Enzimático
Triglicérides Bioclin/ K055-2 Enzimático
AST Bioclin/ K048 Cinético
ALT Bioclin/ K049 Cinético
Fosfatase alcalina Bioclin/ K021 Cinético
IV.8.4- ESTATÍSTICA
Utilizou-se a análise de variância (ANOVA), seguida do teste Dunnett, adotando
um nível de significância de p<0,05, utilizando o grupo HC como grupo referência. O
teste de Tukey foi utilizado para comparação dos tratamentos (p<0,1), ambos através do
programa SAEG 9.1.
IV.8.5- HISTOPATOLOGIA DO FÍGADO
Fragmentos do fígado foram coletados dos seis animais de cada grupo
experimental, fixados em solução de formaldeído tamponado a 10% por um período
mínimo de 24 horas. Porteriormente os fragmentos foram transferidos para solução de
32
álcool 70% e preservados até processamento. Em seguida, os fragmentos foram
transferidos para solução de álcool 95% por quatro horas, após o que foram imersos em
solução de álcool 95% e resina glicolmetacrilato (Leica, Historesin®) na proporção de
1:1 por 12 horas, seguida de resina pura por 24 horas, e posterior inclusão. Foram
obtidos cortes histológicos semisseriados com 3 μm de espessura em micrótomo semi-
automático (Leica®), utilizando-se navalha de vidro. Os cortes foram submetidos à
coloração com hematoxilina e eosina.
A análise histopatológica das lâminas de fígado foi realizada de forma
qualitativa, com observação completa dos fragmentos de fígado nas lâminas e a
fotodocumentação em software de captura de imagem (Leica DM5000®), usando
ocular de 10x e objetiva de 40x (0,5mm diâmetro do campo explorado pela objetiva)
associado ao software de análise de imagens Image Pro-plus 4.5 (Media Cybernetcs®),
devidamente calibrado (área da fotomicrografia: 11,7 x103µm
2). Foram capturadas
imagens aleatórias de cada fragmento de órgão para representação do grupo.
As principais finalidades da análise histopatológica foram avaliar a intensidade
da vacuolização citoplasmática que caracteriza a degeneração gordurosa (esteatose) e
avaliar a integridade tecidual dos órgãos extirpados. Dentre os principais parâmetros
investigados estão lesões celulares reversíveis (degenerações) e irreversíveis (necrose e
apoptose), infiltração de leucócitos, hiperemia, congestão, hemorragia, edema e fibrose
(CUNHA et al, 2009).
33
V. RESULTADOS E DISCUSSÃO
V.1- DETERMINAÇÃO DO TEOR RESIDUAL DE UMIDADE
O teor de umidade do extrato bruto liofilizado de H. dulcis foi de 21,4%. O
extrato liofilizado obtido no processo de extração foi considerado finalizado, uma vez
que não houve possibilidade de retirar mais água do extrato sem alterar suas
características químicas, o que ocorre com a utilização altas temperaturas.
BAMPI et al. (2010) também avaliaram o teor de umidade de extrato dos frutos
de H. dulcis pelo método da secagem em estufa (105°C ± 5°C), de acordo com
metodologia da AOAC (2007), obtendo-se o teor de umidade de 54,08 %, sendo que
esse último não foi um extrato liofilizado.
Torna-se importante produzir extratos com menor teor de umidade possível, já
que o processo de secagem proporciona a concentração das substâncias, redução de
posologias, aumento do prazo de validade e conservação do material vegetal
(MARQUES, 2005).
Considerando que não há monografias oficiais para padronização do extrato de
Hovenia dulcis, a determinação do teor de umidade realizada contribui para o
estabelecimento de um padrão de comparação para outros trabalhos com a espécie
vegetal.
V.2- TRIAGEM FITOQUÍMICA DO EXTRATO DE H. dulcis
Os resultados da triagem fitoquímica realizada segundo o roteiro de Matos
(1997) estão dispostos na tabela 4 e os tubos das reações de identificação de taninos e
saponinas estão ilustrados na figura 10.
Tabela 4- Prospecção fitoquímica do extrato hidroalcoólico dos frutos de H.
dulcis
Classe Resultado
Alcalóides o
Antocianidina/antocianina o
Antranóis o
34
Fortemente positivo (++); Positivo (+) e Negativo/não-detectado (o).
Figura 10- Tubos de reações de identificação fitoquímica no extrato de H. dulcis. (a)-
formação de precipitado escuro, caracterizado pela presença de taninos; (a’) tubo
controle ; (b)- formação de espuma, causada por saponinas
Catequinas +
Cumarinas o
Fenóis simples ++
Flavonóides +
Quinonas +
Saponinas ++
Taninos ++
Triterpenóides o
Xantonas +
a’ a b
35
Através da triagem fitoquímica foi revelada forte presença de fenóis simples,
taninos e saponinas. Em estudo de isolamento e identificação de compostos,
HOGIHARA et al. (1976) apud INOUE et al. (1978) isolaram saponinas do extrato
metanólico das cascas de Hovenia dulcis, que foram denominadas hovenosídeos C, D,
G, G’ e H. HOGIHARA et al. (1987) isolaram sapogeninas e jujubogeninas obtidas da
saponina D das folhas de H. dulcis.
As saponinas formam complexos insolúveis com β-hidroxiesteróides, diminuindo a
absorção intestinal de colesterol e aumentando a excreção fecal de esteróis. A adsorção
de ácidos biliares à fibra alimentar é aumentada na presença de saponinas, formando
micelas de grande peso molecular que impedem a reabsorção dos ácidos biliares,
aumentando a conversão hepática de colesterol para ácidos biliares (MILGATE;
ROBERTS, 1995).
Postula-se que também há ação benéfica dos taninos nas dislipidemias. Moreno
et al. (2003) estudaram a atividade inibidora destes compostos sobre a lipase e Tebib et
al. (1994) estudaram seu efeito hipocolesterolêmico em ratos. Ravichandiran et al.
(2012) também verificaram efeito benéfico de taninos na glicemia, perfil lipídico e
atenuação do estresse oxidativo em ratos com hipercolesterolemia associada ao
diabetes.
Os compostos fenólicos são os antioxidantes mais ativos e freqüentemente
encontrados nos vegetais, dentre os quais estão os flavonóides. Os flavonóides atuam
como antioxidantes na inativação dos radicais livres, em ambos os compartimentos
celulares lipofílico e hidrofílico. Esses compostos têm a capacidade de doar átomos de
hidrogênio e portanto, inibir as reações em cadeia provocadas pelos radicais livres
(HARTMAN & SHANKEL, 1990; ARORA et al., 1998). O flavonóide miricetina, por
exemplo, foi mais efetivo do que a vitamina C na inibição dos danos oxidativos
induzidos pelo H2O2 no DNA de linfócitos humanos (NOROOZI et al., 1998).
V.3- ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
V.3.1- IDENTIFICAÇÃO DO FLAVONÓIDE DIHIDROMIRICETINA
NO EXTRATO HIDROALCOÓLICO BRUTO DE HOVENIA DULCIS.
O pico da Figura 11 é equivalente à dihidromiricetina e a Figura 10 representa o
perfil cromatográfico do extrato hidroalcoólico de H. dulcis. Sugere-se que o pico
36
assinalado na figura 12 seja a dihidromiricetina, devido à proximidade dos tempos de
retenção e dos espectros de absorção (Figuras 13 e 14).
Figura 11- Perfil cromatográfico do padrão de dihidromiricetina
Figura 12- Perfil cromatográfico do extrato hidroalcoólico bruto de Hovenia dulcis
(EHD).
Figura 13- Espectro de absorção do padrão de dihidromiricetina
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
7,567 Peak 1
213,3
292,2
AU
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
nm
250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00
37
Figura 14- Espectro de absorção do pico destacado (figura 12) no extrato (EHD)
Estes resultados corroboram os apresentados por DING et al (1997) e por
YOSHIKAWA et al (1997), que encontraram o flavonóide dihidromiricetina, dentre
outros, nos frutos e folhas de Hovenia dulcis. ALVARENGA (2008) demonstrou a
presença da dihidromiricetina na fração acetato de etila da casca do tronco de H. dulcis.
V.3.2- QUANTIFICAÇÃO DE DIHIDROMIRICETINA NO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO BRUTO DE HOVENIA DULCIS.
O teor médio da dihidromiricetina, calculado a partir da curva-padrão (4E+08x –
117007, com R² = 0,9996), foi de 470,0 ± 12,14 μg por grama de extrato (EHD). YOO
et al. (2005) desenvolveram um método de pré-purificação de alta pureza e rendimento
para a produção industrial de dihidromiricetina extraída do extrato aquoso dos frutos de
H. dulcis. Os autores obtiveram, no melhor resultado, 84µg de dihidromiricetina por
grama de biomassa (fruto, in natura, liofilizado e moído). Como esse teor foi calculado
a partir do fruto, e não do extrato como no presente trabalho, justifica-se que o teor
encontrado para o flavonóide tenha sido menor, uma vez que no processo de extração
ocorre a progressiva concentração dos constituintes químicos da planta.
V.4- ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
São apresentados na Tabela 5 as porcentagens de atividade antioxidante para as
diferentes concentrações de extrato e do flavonóide isolado.
6,717 Peak 1
292,2
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
nm
250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00
38
Tabela 5- Atividade antioxidante in vitro do extrato hidroalcoólico de H. dulcis (EHD),
flavonóide dihidromiricetina (DHM) e padrão butilhidroxianisol (BHA)
AMOSTRAS (ppm) MÉDIA (%) ± DESVIO PADRÃO
EHD (200)
EHD (400)
16,65 ± 1,94
23,82 ± 1,60
DHM (200)
DHM (400)
51,31 ± 0,72
82,53 ± 0,68
BHA (25)
BHA (50)
40,27 ± 1,59
76,97 ± 0,96
São mostrados na Figura 15 os tubos controle (b), contendo apenas solução
metanólica de DPPH e tubo teste (a) contendo solução do flavonóide dihidromiricetina
(400 ppm) e solução metanólica de DPPH, após a reação de neutralização dos radicais
livres.
Figura 15- Atividade antioxidante in vitro. (a) tubo teste; (b) tubo controle.
A B
39
O percentual de atividade antioxidante da Dihidromiricetina 400 ppm foi
semelhante ao encontrado no estudo de ZHANG et al. (2003), que foi de 91,5% para a
mesma concentração de dihidromiricetina (400 ppm ou 0,04%).
ZHANG et al. (2003) demonstraram também que a dihidromiricetina possui
elevada atividade inibitória da peroxidação lipídica. Eles propõem que o mecanismo de
ação antioxidante seja quelante de Fe2+,
atuando no sistema de peroxidação lipídica
dependente de Fe2+.
No contexto da hipercolesterolemia, sabe-se que o conteúdo de antioxidantes da
partícula de LDL é crucial para sua proteção (ESTERBAUER et al., 1992) Estudos in
vitro mostraram que a oxidação de LDL somente se inicia após o estresse oxidativo
haver depletado o conteúdo de antioxidante celular (JESSUP et al., 1990). In vivo, é
provável que a magnitude do processo oxidativo dependa do balanço entre a intensidade
da agressão oxidativa e a capacidade das defesas antioxidantes (WITZTUM, 1994).
V.5- ATIVIDADE FARMACOLÓGICA IN VIVO DO EXTRATO DE H. dulcis
V.5.1- EVOLUÇÃO PONDERAL
De acordo com a análise de variância (ANOVA) não houve diferenças
estatisticamente significativas no ganho de peso ou consumo alimentar entre os grupos.
Os pesos dos animais foram monitorados nos tempos 0, 7, 15, 23 e 30 dias. (figura 16)
Figuras 16- Médias dos pesos dos animais ao longo do experimento (30 dias)
40
Grupos: (C) controle; (HC) Hipercolesterolêmico; (ATOR) Hipercolesterolêmico tratado com tratado
com atorvastatina 1,0 mg/kg; (DHM 1) Hipercolesterolêmico tratado com dihidromiricetina 25,0 mg/kg;
(DHM 2) Hipercolesterolêmico tratado com dihidromiricetina 50,0 mg/kg; (EHD 1) Hipercolesterolêmico
tratado com extrato de H. dulcis 50,0 mg/kg; (EHD2) Hipercolesterolêmico tratado com extrato de H.
dulcis 100,0 mg/kg.
No trabalho desenvolvido por Ramos et al. (2008), os animais que consumiram
uma dieta suplementada com 1,0 % de colesterol e 0,5 % de ácido cólico tiveram um
ganho de peso e consumo alimentar maiores do que o grupo controle, os quais foram
explicados pelo maior conteúdo de lipídeos na dieta hipercolesterolêmica.
Ainda existem muitas controvérsias com relação ao comportamento dos animais
frente a diferentes concentrações de colesterol e ácido cólico dietéticos. No trabalho de
Bocanegra et al. (2008), ratos hipercolesterolêmicos (ração padrão suplementada com
2% de colesterol e 0,4% ácido cólico) tratados com algas apresentaram consumo
alimentar significativamente maior do que o grupo controle. Já no estudo de Afonso
(2010) e de Brai, Odetola e Agomo (2007), o ganho de peso global dos ratos
hipercolesterolêmicos em comparação com o controle normal não foi significativamente
diferente.
IV.5.2- INDUÇÃO DA HIPERCOLESTEROLEMIA
O grupo hipercolesterolêmico satélite (SAT) foi eutanasiado no 10º dia para
monitoramento da indução da hipercolesterolemia. O perfil lipídico desse grupo foi
comparado aos do grupo hipercolesterolêmico (HC) e controle (C), ambos eutanasiados
no 30º dia (Tabela 6).
Tabela 6- Comparação dos perfis lipídicos dos grupos controle (C);
Hipercolesterolêmico (HC) e grupo satélite (SAT).
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
GRUPOS
COT (mg/dL) TG (mg/dL) LDL-c (mg/dL) HDL-c (mg/dL)
Média ± DP Média ± DP Média ± DP Média ± DP
C 82,66 ±10,11 42,33 ± 7,22 30,53± 8,95 43,66±2,16
HC 175,83±16,24 * 75,83±43,77 125,16± 24,19* 35,5± 8,21
SAT 194,0 ± 30,4 * 89,1 ± 17,0 127,0 ± 25,9* 49,2 ± 17,8
DP desvio padrão
Médias com (*) na coluna, diferem do grupo C, ao nível de significância 95% (p<0,05), teste Dunnett.
41
Os valores do Colesterol total (COT) e colesterol LDL do grupo SAT foram
significativamente elevados, se comparados ao controle (C), pelo teste de dunnett
(p<0,05), o que permite garantir que, no 10º dia, o quadro de hipercolesterolemia já
havia sido atingido, antes que os respectivos tratamentos fossem iniciados (11º dia).
Observa-se também que não houve diferenças significativas entres os grupos HC
e SAT (dunnett, p<0,05), ou seja, os parâmetros do perfil lipídico mantiveram-se
estatisticamente equivalentes entre o 10º e o 30º dia.
Resultados superiores foram encontrados por Afonso (2010), empregando-se
uma dieta suplementada com 0,5% de colesterol e 0,25% de ácido cólico, por período
de 30 dias. Por outro lado, no estudo de Yokozawa et al. (2006) uma dieta
suplementada com 1,0 % de colesterol e 0,5% de ácido cólico possibilitou um aumento
de apenas 65,7% do colesterol total, enquanto no presente estudo observou-se uma
elevação de 112,7 % no mesmo parâmetro.
42
V.5.3- PERFIL LIPÍDICO
Os valores médios dos parâmetros bioquímicos avaliados, no 30º dia, para os grupos experimentais, com suas respectivas
significâncias estatísticas estão apresentados na Tabela 7.
Tabela 7- Perfil lipídico: colesterol total (COT), trigricérides (TG), colesterol HDL (HDL-c), colesterol LDL (LDL-c) e as respectivas
correlações (Corr.) entre os grupos
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
GRUPOS COT
(mg/dL)
TG
(mg/dL)
HDL-c
(mg/dL)
LDL-c
(mg/dL)
Média ± desvio
padrão
Corr. Média ± desvio
padrão
Corr. Média ± desvio
padrão
Corr. Média ± desvio
padrão
Corr.
C 82,66 ±10,11 * d 42,33 ± 7,22 c 43,66±2,16 b 30,53± 8,95* a
HC 175,83±16,24 a 75,83±43,77 abc 35,5± 8,21 ab 125,16± 24,19 b
ATOR 104,83±15,14 * cd 48,66± 12,94 bc 56,66± 21,13 * bc 39,80±18,78* a
DHM 1 141,66±22,79* b 128,00± 50,39 * c 48,17± 11,03 bc 67,90± 13,96* ab
DHM 2 145,00±28,44* ab 105,00± 34,97 ab 45,5± 2,07 b 78,50± 28,32* ab
EHD 1 136,16±21,46* bc 96,16± 50,75 ab 42,83± 7,16 b 74,10± 33,23* ab
EHD 2 117,16±24,33* bc 74,16±20,09 abc 41,66± 7,44 b 60,66±29,88* ab
Médias com (*) na coluna, diferem do grupo HC, ao nível de significância 95% (p<0,05), teste Dunnett.
Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si, pelo teste Tukey (p<0,1).
Grupos: (C) controle; (HC) Hipercolesterolêmico; (ATOR) Hipercolesterolêmico tratado com tratado com atorvastatina 1,0 mg/kg; (DHM 1) Hipercolesterolêmico
tratado com dihidromiricetina 25,0 mg/kg; (DHM 2) Hipercolesterolêmico tratado com dihidromiricetina 50,0 mg/kg; (EHD 1) Hipercolesterolêmico tratado com
extrato de H. dulcis 50,0 mg/kg; (EHD2) Hipercolesterolêmico tratado com extrato de H. dulcis 100,0 mg/kg.
43
V.5.3.1-COLESTEROL TOTAL e LDL-c
Figura 17- Níveis séricos de colesterol total e LDL-c, entre os grupos
Médias com (*) diferem do grupo HC, ao nível de significância 95% (p<0,05), teste Dunnett.
Valores entre parênteses representam o percentual de variação do parâmetro em relação ao grupo HC
Grupos: (C) controle; (HC) Hipercolesterolêmico; (ATOR) Hipercolesterolêmico tratado com tratado com atorvastatina 1,0 mg/kg; (DHM 1) Hipercolesterolêmico
tratado com dihidromiricetina 25,0 mg/kg; (DHM 2) Hipercolesterolêmico tratado com dihidromiricetina 50,0 mg/kg; (EHD 1) Hipercolesterolêmico tratado com
extrato de H. dulcis 50,0 mg/kg; (EHD2) Hipercolesterolêmico tratado com extrato de H. dulcis 100,0 mg/kg.
44
De acordo com a análise estatística, todos os tratamentos reduziram
significativamente os níveis de colesterol total (Dunnett, p<0,05), quando comparados
ao grupo doente (HC), sendo a maior redução do grupo tratado com atorvastatina 1,0
mg/Kg, de 40,3%, seguida pelo grupo tratado com extrato de H. dulcis na maior dose
(EHD 2), que apresentou redução de 33,3% do colesterol total. Já os gupos tratados com
a dihidromiricetina (DHM 1 e DHM 2) tiveram reduções menores, de 19,4 e 17,5 %,
respectivamente (Figura 17).
Ressalta-se, no entanto, que as doses de extrato e flavonóide utilizadas foram
superiores à dose do medicamento referência atorvastatina, sendo inquestionável a
superioridade dessa substância frente às demais, no que se refere à redução do colesterol
total. Pode-se dizer que os tratamentos com atorvastatina e extrato de H. dulcis (EHD 2)
apresentaram eficácias semelhantes, já que as respostas terapêuticas foram próximas
(percentual de redução do colesterol total), porém a potência da atorvastatina é superior,
uma vez que a dose necessária para obtenção do efeito foi menor.
No estudo de Alvarenga (2008) o extrato hidroalcoólico de H. dulcis na dose
200 mg/kg reduziu o colesterol total em 68% aos 28 dias, em coelhos diabéticos.
É possível inferir que o flavonóide dihidromiricetina possui ação
hipocolesterolemiante, mas não é o único ou principal princípio ativo presente no
extrato, uma vez que a administração do extrato na dose de 50,0 mg/kg apresentou
maior redução do colesterol total que a administração do flavonóide isolado, nessa
mesma dose, indicando assim que há outras moléculas no extrato, atuando na redução
desse parâmetro, seja isoladamente ou em sinergismo com a dihidromiricetina.
Vale ressaltar a forte presença de saponinas reveladas na triagem fitoquímica do
extrato de H. dulcis. Sabe-se que as saponinas formam complexos insolúveis com β-
hidroxiesteróides, diminuindo a absorção intestinal de colesterol e aumentando a
excreção fecal de esteróis. A adsorção de ácidos biliares à fibra alimentar é aumentada
na presença de saponinas, formando micelas de grande peso molecular que impedem a
reabsorção dos ácidos biliares, aumentando a conversão hepática de colesterol para
ácidos biliares. A interação de saponinas com as células da mucosa intestinal conduz a
um aumento na permeabilidade e subsequente perda nas funções celulares normais,
incrementando a esfoliação e promovendo a proliferação. A perda aumentada das
células intestinais contribui para um aumento adicional na excreção fecal de colesterol
(MILGATE; ROBERTS, 1995).
45
Em relação aos flavonóides, segundo Martinello (2006), o mecanismo
hipocolesterolêmico pode decorrer da ação sobre a absorção intestinal de colesterol, ou
por efeitos sobre enzimas como a colesterol esterase (responsável pela hidrólise de
ésteres de colesterol no lúmen intestinal), colesterol-7-alfa-hidroxilase (responsável pela
degradação do colesterol e síntese de ácidos biliares), AcetilCoA-colesterol-
aciltransferase, responsável pela esterificação e armazenamento intracelular do
colesterol) e HMGCoA redutase (enzima limitante da síntese endógena de colesterol).
Sobre o parâmetro LDL-c, o mesmo perfil de redução foi observado. De acordo
com a análise estatística, todos os tratamentos reduziram significativamente os níveis de
LDL-c (Dunnett, p<0,05), quando comparados ao grupo doente (HC), sendo a maior
redução do grupo tratado com atorvastatina 1,0 mg/Kg, de 68,2%. Os grupos EHD 1 e
EHD 2 tiveram reduções de 40,8 e 51,5 %, respectivamente. Já os grupos DHM 1 e
DHM 2 tiveram reduções de 45,7 e 37,3 %, respectivamente.
Flavonóides podem inibir a enzima acilCoA colesterol aciltransferase,
responsável por converter o colesterol em éster de colesterila, substância presente no
LDL (LEHNINGER et al., 2007). Flavonóides que inibem esta enzima impedem a
formação de maior quantidade de LDL (CARVALHO et al., 2005).
Quesada et al. (2009) relataram que proantocianidinas de sementes de uva
reprimem genes que controlam a lipogênese e síntese de VLDL no fígado de ratos
alimentados com dieta rica em gordura. Outro mecanismo que envolve a regulação da
transcrição gênica foi descrito por Goldwasser et al. (2010), que estudou os benefícios
do flavonóide naringenina sobre o metabolismo lipídico hepático em ratos.
Flavonóides do suco de bergamota (Brutieridina e Melitidina) são análogos
estruturais de estatinas e foram capazes de inibir a HMG-CoA redutase, enzima passo
limitante da velocidade na via de síntese do colesterol (LEOPOLDINI et al. , 2010).
A redução dos níveis de LDL-colesterol é extremamente importante em
indivíduos hipercolesterolêmicos, sendo os altos níveis de LDL-c considerado
importante fator de risco para doença arterial coronariana, em diferentes populações
(KHOO et al., 2013; TONELLI et al., 2013; SCHAEFER et al., 2013).
46
V.5.3.2-HDL-c e TRIGLICÉRIDES
Figura 18- Níveis séricos de HDL-c e triglicérides , entre os grupos.
Média com (*) difere do grupo HC, ao nível de significância 95% (p<0,05), teste Dunnett.
Valores entre parênteses representam o percentual de variação do parâmetro em relação ao grupo HC
Grupos: (C) controle; (HC) Hipercolesterolêmico; (ATOR) Hipercolesterolêmico tratado com tratado com atorvastatina 1,0 mg/kg; (DHM 1) Hipercolesterolêmico tratado
com dihidromiricetina 25,0 mg/kg; (DHM 2) Hipercolesterolêmico tratado com dihidromiricetina 50,0 mg/kg; (EHD 1) Hipercolesterolêmico tratado com extrato de H. dulcis
50,0 mg/kg; (EHD2) Hipercolesterolêmico tratado com extrato de H. dulcis 100,0 mg/kg.
47
Observa-se a partir da Figura 18, que apenas o grupo ATOR teve um aumento
estatisticamente significativo (Dunnett, p<0,05) para o parâmetro HDL-c, em
comparação ao grupo HC.
Níveis elevados de colesterol-HDL estão associados com a diminuição de risco
da cardiopatia coronariana; seu efeito é oposto ao colesterol-LDL, uma vez que esse
transporta o colesterol para os tecidos, enquanto o HDL atua no transporte do colesterol
em excesso para o fígado. O quociente colesterol LDL/colesterol- HDL é um indicativo
confiável de risco aterogênico (FEINLEB, 1984).
Apesar de os tratamentos DHM 1, DHM 2, EHD 1 e EHD 2 não apresentarem
efeito significativamente positivo sobre o colesterol HDL, vale ressaltar que a redução
nos níveis de colesterol total e LDL colesterol na circulação também representam um
passo essencial na prevenção da doença cardiovascular (LECUMBERRI et al., 2007).
Auger et al. (2002) também verificaram resultado parecido ao avaliarem o efeito
dos compostos fenólicos presentes no vinho tinto sob os lipídios plasmáticos de
hamsters hipercolesterolêmicos. Não foi encontrada diferença significativa nos níveis de
HDL-c entre os animais tratados e controle. O mesmo aconteceu com Hirunpanich et al.
(2006) trabalhando com hibisco e Soares et al. (2005) com gengibre, amoreira branca e
alecrim, em ratos hipercolesterolêmicos.
Em relação aos triglicérides, apenas o grupo DHM 1 se diferiu estatisticamente
do grupo HC, apresentando valor significativamente elevado para esse parâmetro
(Dunnett p<0,05).
Segundo a IV Diretriz Sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose, o
acúmulo de quilomícrons e/ou de VLDL no compartimento plasmático resulta em
hipertrigliceridemia e decorre da diminuição da hidrólise dos triglicérides destas
lipoproteínas pela lipase lipoprotéica ou do aumento da síntese de VLDL.
Diante do exposto, postula-se que o tratamento com DHM 1 (dose de 25,0
mg/Kg) gerou um resultado negativo no âmbito das hipercolesterolemias, uma vez que,
apesar de reduzir significativamente o colesterol total e LDL-c, promoveu um aumento
significativo de triglicérides.
No estudo de Afonso (2010), o extrato aquoso de alecrim na concentração 70
mg/Kg foi capaz de reduzir de modo significativo os níveis de colesterol total (39,8%) e
LDL-c (45,6%),contudo não foram observados efeitos positivos sobre triglicérides e
HDL-c.
48
Cherem et al. (2007), em um estudo realizado com cobaias submetidas à dieta
hiperlipídica com e sem a adição de casca da berinjela, verificaram redução nos níveis
de colesterol total e LDL-colesterol, em torno de 45 e 54%, respectivamente, mas não
observaram efeito positivo sobre os níveis de triglicerídeos.
49
V.5.4- TRANSAMINASES (AST e ALT) e FOSFATASE ALCALINA
Tabela 8- Parâmetros bioquímicos: aspartato aminotranferase (AST), alanina aminotranferase (ALT), fosfatase alcalina (FALC), e suas
respectivas correlações (Corr.).
As médias com (*) na coluna, diferem do grupo HC, ao nível de significância 95% (p<0,05), pelo teste de Dunnett.
Médias seguidas por letras iguais (Corr.) não diferem entre si, pelo teste Tukey (p<0,1).
Grupos: (C) controle; (HC) Hipercolesterolêmico; (ATOR) Hipercolesterolêmico tratado com tratado com atorvastatina 1,0 mg/kg; (DHM 1) Hipercolesterolêmico
tratado com dihidromiricetina 25,0 mg/kg; (DHM 2) Hipercolesterolêmico tratado com dihidromiricetina 50,0 mg/kg; (EHD 1) Hipercolesterolêmico tratado com
extrato de H. dulcis 50,0 mg/kg; (EHD2) Hipercolesterolêmico tratado com extrato de H. dulcis 100,0 mg/kg.
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
AST (U/L) ALT (U/L) FALC (U/L)
GRUPOS Média± desvio
padrão
Correlação Média± desvio
padrão
Correlação Média± desvio
padrão
Correlação
C 170,8±23,8 a 47,2±5,1 b 158,0±20,4 d
HC 151,5±41,7 ab 45,7±3,9 b 216,8±30,1 bcd
ATOR 130,3±19,8 b 41,2±8,9 b 192,2±21,2 cd
DHM 1 156,0±11,1 ab 71,8±28,4 * a 259,2±63,1 bc
DHM 2 121,0±20,3 b 48,2±8,1 b 341,8±70,7 * a
EHD 1 122,0±15,2 b 56,2±13,8 ab 268,3±28,3 b
EHD 2 131,8±14,2 b 53,0±9,9 ab 245,5±40,2 bc
50
Figura 19- Níveis séricos de AST (U/L) , ALT (U/L) e FALC (U/L), entre os grupos
Média com (*) difere do grupo HC, ao nível de significância 95% (p<0,05), teste Dunnett.
Valores entre parênteses representam o percentual de variação do parâmetro em relação ao grupo HC.
Grupos: (C) controle; (HC) Hipercolesterolêmico;
(ATOR) Hipercolesterolêmico tratado com tratado com
atorvastatina 1,0 mg/kg; (DHM 1) Hipercolesterolêmico
tratado com dihidromiricetina 25,0 mg/kg; (DHM 2)
Hipercolesterolêmico tratado com dihidromiricetina 50,0
mg/kg; (EHD 1) Hipercolesterolêmico tratado com extrato
de H. dulcis 50,0 mg/kg; (EHD2) Hipercolesterolêmico
tratado com extrato de H. dulcis 100,0 mg/kg
51
Os resultados mostram que houve aumento significativo na ALT apenas para o grupo
tratado com dihidromiricetina na dose 25,0 mg/kg. Ainda assim, observa-se que o grupo
tratado com maior dose de dihidromiricetina (50,0 mg/kg) não apresentou esse perfil,
acreditando-se não se tratar de dano hepático devido à administração do flavonóide. Além
disso, o parâmetro triglicérides, foi significativamente aumentado nesse grupo (DHM 1), o
que pode ter gerado dano hepático e alteração da transaminase.
Atividades elevadas de ALT ocorrem em doenças hepatobiliares. Em dano
hepatocelular leve há também aumento dessa enzima. (LIMA, 1985).
Em relação à fosfatase alcalina, apenas o grupo DHM 2 apresentou valor de
significativamente superior ao HC (Dunnett, p<0,05). Não houve alteração significativa nos
valores dessa enzima comparando grupo doente e controle.
A hiperfosfatasemia alcalina ocorre na obstrução intra-hepática, em carcinomas
hepatocelulares, hepatites, cirroses, por efeito de diversos fármacos (antifúngicos,
benzodiazepínicos, anabolizantes, antihipertensivos e antiinflamatórios não esteroidais). Pode
ocorrer uma elevação de duas a três vezes em sua atividade na obstrução intra-hepática
(MOTTA, 2003). Geralmente qualquer hepatopatia ativa pode aumentar os valores de FALC,
mas as maiores elevações nos níveis da enzima ocorrem nos casos de obstrução do trato biliar.
Nos casos de drogas hepatotóxicas, as elevações da enzima são menores (VASCONCELOS et
al., 2007).
Para verificar se as alterações nos parâmetros sanguíneos ALT e FALC refletem a
ocorrência de hepatotoxicidade, e que essa seja atribuída ao uso da dihidromiricetina, é
necessária realização de estudos de toxicidade específicos, administrando-se a substância em
animais sadios.
Os grupos tratados com o extrato de H. dulcis não apresentaram alterações
significativas nos parâmetros AST, ALT e FALC. O efeito hepatoprotetor de Hovenia dulcis
vem sendo alvo de pesquisas (Fang et al., 2007; Hase et al., 1997; Ren-bo et al., 2007).
V.5.5- HISTOPATOLOGIA DO FÍGADO
De maneira geral, todos os grupos apresentaram hepatócitos bem delimitados, núcleo
com cromatina visível, ductulos biliares e veias centro lobulares características, e ausência de
fibrose.
52
Quanto à degeneração gordurosa, encontrada em todos os grupos colesterol induzidos,
foi verificado que o HC (controle induzido não tratado) apresentou acentuada vacuolização
citoplasmática com alguns núcleos de hepatócitos ligeiramente ou completamente deslocados
para a periferia. O grupo C (controle não induzido) não apresentou degeneração gordurosa,
caracterizado pela ausência de vacuolização citoplasmática. Foi possível a visualização de
poucas e pequenas microvesículas gordurosas aleatórias e difusas, consideradas normais.
No entanto, para verificação da relevância estatística desses achados será necessária
análise histológica quantitativa das microvesículas gordurosas, em todos os grupos, a ser
realizada em etapa posterior, utilizando-se quantificação computacional.
53
Figura 20: Fotomicrografias representativas de fígados dos animais. Setas indicando microvesículas gordurosas. Coloração HE,
barra = 100μm
Grupos: (C) controle; (HC) Hipercolesterolêmico;
54
Apareceram, ocasionalmente e distribuídos em todos os grupos, incluindo no
grupo controle (C), pequenos infiltrados lobulares perivasculares e congestão sinusoidal
leve próximo a veia centro lobular. (Figura 26).
Figura 21: A- infiltrados lobulares perivasculares no grupo controle (C); B- congestão
sinusoidal próximo à veia centro lobular no grupo controle (C). Coloração HE, Barra
100 µm
55
VI- CONCLUSÕES
1- O extrato hidroalcoólico de H. dulcis possui taninos, saponinas e fénois simples
em sua composição. A partir da análise cromatográfica, foi possível identificar o
flavonóide dihidromiricetina, presente na concentração de 470 µg por grama de extrato.
2- Tanto o extrato de H. dulcis quanto o flavonóide dihidromiricetina apresentaram
atividade antioxidante in vitro, pela metodologia do DPPH, sendo que o flavonóide na
concentração de 400 ppm teve melhor desempenho (82,5 %).
3- Os tratamentos com o extrato de H. dulcis mostraram-se promissores como
agentes hipocolesterolemiantes, especialmente na maior dose (100,0 mg/Kg),
apresentando redução substancial do colesterol total e LDL-c (33,3 e 51,5 %,
respectivamente). Já o grupo tratado com a dihidromiricetina (25,0 mg/kg) apresentou
elevação significativa nos triglicérides, resultado não desejável no âmbito das
dislipidemias.
4- Foram observadas elevações na transaminase ALT e fosfatase alcalina para os
grupos tratados com dihidromiricetina, sem relação dose-dependência. Os grupos
tratados com extrato de H. dulcis não apresentaram alterações nesse sentido.
5- A análise histopatológica qualitativa preliminar do fígado revelou a presença de
degeneração gordurosa nos grupos hipercolesterolêmicos induzidos, ao contrário do
grupo controle, no qual foram ausentes ou escassas, sendo ainda necessária a
quantificação das microvesículas gorduras.
6- Sugere-se a realização de mais estudos farmacológicos para comprovar a eficácia
do extrato de H. dulcis na hipercolesterolemia, a segurança na sua utilização (estudos de
toxicidade), as dosagens terapêuticas mais eficazes e os mecanismos de ação.
56
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