JTsarsrnnTuTaddlnrtnr nlsfidmlqfn5biotech.dld.go.th/webnew/Data/Document_Announces/... · 2.2 ต้นฉบับเป็นภาษาไทยหรือภาษาอังกฤษ

JTsarsrnnTuTaddlnrtnrnlsfidmlqfn5

ในปี 2558 อาเซียนจะรวมตัวเป็นประชาคมเศรษฐกิจอาเซียน มีเป้าหมายเพื่อส่งเสริมให้อาเซียนเป็นตลาดและฐานการผลิตร่วมกัน (Singlemarketandsingleproductionbase)มีการเคลื่อนย้ายสินค้าบริการ การลงทุน แรงงานมีฝีมืออย่างเสรี และเงินทุนอย่างเสรีมากขึ้น (freeflowsofgoods,services,investment,andskilledlabors,andfreerflowofcapital) ผลที่จะเกิดขึ้นหลังจากเป็นAECประกอบด้วยการยกเลิกภาษีศุลกากรสำหรับสินค้าการลดขั้นตอนพิธีการศุลกากรอนุญาตให้ผู้ส่งออกรับรองถิ่นกำเนิดสินค้าด้วยตนเอง(SelfCertification)ตลอดจน ลดเลิกข้อจำกัด / อุปสรรคในการให้บริการทุกรูปแบบ มีการเปิดเสรีการลงทุน คุ้มครองการลงทุน สง่เสรมิและอำนวยความสะดวกการลงทนุครอบคลมุธรุกจิ5ภาคไดแ้ก่เกษตรประมงปา่ไม้เหมอืงแร่และภาคการผลิตรวมถึงบริการที่เกี่ยวเนื่องนำไปสู่การเพิ่มขีดความสามารถในการแข่งขันของอาเซียน มีการพฒันาเศรษฐกจิระหวา่งประเทศสมาชกิที่เสมอภาคยิง่ขึน้ทำให้กำลงัซือ้ของประเทศเพือ่นบา้นดีขึน้ ขยายโอกาสการสง่ออกและการลงทนุของไทยและมีการเชือ่มโยงกบัประเทศภายนอกโดยเฉพาะประเทศคู่เจรจาของอาเซียน(+6)เป็นการเพิ่มโอกาสการค้าและการลงทุน

ในด้านปศุสัตว์ประเทศไทยมีข้อได้เปรียบประเทศในเขตอาเซียนทั้งด้านพันธุกรรมโคเนื้อคุณภาพและ เทคโนโลยีการผสมเทียม ซี่งเป็นสองปัจจัยหลักในการผลิต สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ จึงได้พัฒนาโครงการเพื่อเตรียมความพร้อมขยายการผลิตโคเนื้อคุณภาพ เพื่อรองรับการเปิดตลาดเนื้อโคคุณภาพในอาเซียน ประกอบด้วย “โครงการสร้างพันธุ์โคเนื้อคุณภาพไทย-แบล็ค” และ“โครงการเรง่รดัการผลติโคเนือ้คณุภาพสงูโดยวธิีการผสมเทยีม”ซึง่ทำให้สามารถจดัระเบยีบฟารม์ในประเทศไทยโดยจำแนกเป็น Breeding และ Fattening Farm ด้วยการสร้างระบบการผสมพันธุ์ที่ชัดเจนมีรูปแบบ เพื่อให้เกษตรกรสามารถบริหารจัดการฟาร์มได้อย่างเหมาะสมและมีประสิทธิภาพ นำไปสู่การเป็นศูนย์กลางผลิตพันธุ์โคเนื้อและผลิตภัณฑ์เนื้อโคคุณภาพในอาเซียนในอนาคตอันใกล้

ทั้งนี้สำนักฯ ยังมุ่งมั่นพัฒนางานเพื่อให้ไทยสามารถคงความเป็นผู้นำด้านปศุสัตว์ในอาเซียนด้วยการสง่เสรมิสรา้งสรรงานวจิยัและเผยแพร่ในวารสารเทคโนโลยีชวีภาพการผลติสตัวอ์ยา่งตอ่เนือ่งเปน็ประจำทุกปีเพื่อให้เกิดการแลกเปลี่ยนเรียนรู้นำไปสู่การพัฒนาต่อไป

(นายสัตวแพทย์จีระศักดิ์พิพัฒนพงษ์โสภณ)

ผู้อำนวยการสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์

สาสน์จากบรรณาธิการบริหาร

2

วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์

วัตถุประสงค์1. ส่งเสริมการศึกษาค้นคว้าและวิจัยด้านการผลิต

และขยายพันธุ์สัตว์

2. รวบรวมเผยแพร่ความรู้ด้านการผลิตและ

ขยายพันธุ์สัตว์โดยเทคโนโลยีชีวภาพ

3. ส่งเสริมความสัมพันธ์และความร่วมมือระหว่าง

นักวิชาการและสถาบันต่างๆ

เจ้าของสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์

สำนักงานสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์

ถ.ติวานนท์ต.บางกะดีอ.เมือง

จ.ปทุมธานี12000

โทร/โทรสาร0-2501-2116

กำหนดออกปีละ1ฉบับ

คณะที่ปรึกษาผชช.พรรณพิไลเสกสิทธิ์

ดร.ณชัยศราธพันธุ์

ดร.มาลีอภิเมธีธำรง

บรรณาธิการบริหารน.สพ.จีระศักดิ์พิพัฒนพงศ์โสภณ

บรรณาธิการสพญ.กัลยาเก่งวิกย์กรรม

ผู้ช่วยบรรณาธิการนสพ.วิษณุไพศาลรุ่งพนา

กองบรรณาธิการนสพ.ไกรวรรณหงษ์ยันตรชัย

นสพ.สาโรชงามขำ

สพญ.รพีพรรณเอื้อเวชนิชกุล

นสพ.รัตน์ฉายารัตนศิลป์

สพญ.นุสสราวัฒนกุล

นสพ.วิบูลย์เยี่ยงวิศวกูร

นางจุรีรัตน์แสนโภชน์

นายสายัณห์บัวบาน

ผู้จัดการวารสารนางจุรีรัตน์แสนโภชน์

นายวิบูลย์เยี่ยงวิศวกูร

นางสาวทัศนีย์พูนขำ

3

Journal of Biotechnology in Livestock Production


เป็นวารสารทางวิชาการของสำนักเทคโนโลยีชีวภาพ

การผลติปศสุตัว์กรมปศสุตัว์กำหนดออกปีละ1ฉบบั

คือเดือนกรกฎาคมวารสารนำลงบทความผลงาน

ค้นคว้าวิจัยด้านการผลิตปศุสัตว์ ทั้งด้านการพัฒนา

และปรับปรุงพันธุ์ การจัดการอาหาร สุขภาพ และ

ระบบสืบพันธุ์ ตลอดจนการขยายพันธุ์ และการใช้

เทคโนโลยีชีวภาพที่ก้าวหน้าในการปรับปรุงและเพิ่ม

ประสิทธิภาพการผลิตปศุสัตว์ด้านต่างๆ ที่กล่าวมา

ข้างต้น คณะผู้จัดทำวารสารเทคโนโลยีชีวภาพการ

ผลิตปศุสัตว์ ยินดีรับเรื่องจากทุกท่านที่ส่งมาเพื่อ

เผยแพร่ และเพื่อความสะดวกในการพิจารณา

ขอเสนอแนะดังนี้

1. เรื่อง ที่ จะ นำ ลง

1.1 งานทดลองวจิยัทางวชิาการ(Technical/

Researchpapers)หรือวิทยานิพนธ์เป็นการเสนอ

ผลการวิจัยที่ผู้เขียนได้ทำขึ้นเอง

1.2 บทความ (Articles) และย่อเอกสาร

(Literaturereviewed)ทางวชิาการที่รวบรวมขอ้มลู

ความคิดเห็นและประสบการณ์ของผู้เขียน

1.3 เรื่องอื่นๆ ที่คณะผู้จัดทำพิจารณาเห็น

สมควร

2. ต้นฉบับ

2.1 ต้นฉบับที่ส่งมาพิมพ์ ในวารสารเทคโนโลยี

ชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ ไม่ควรเป็นเรื่องที่เคยพิมพ์

หรือ กำลังอยู่ระหว่างการพิจารณาเพื่อลงพิมพ์

วารสารอื่น

ข้อแนะนำสำหรับผู้เขียน

2.2 ต้นฉบับเป็นภาษาไทยหรือภาษาอังกฤษ

พิมพ์บนกระดาษเอ4จำนวนไม่เกิน12หน้าโดย

จัดพิมพ์ด้วยMicrosoftWordforWindowsหรือ

ใช้ชนิดและขนาดตัวอักษรตามที่กำหนด

2.3 ไม่มีการส่งคืนต้นฉบับ

3. การ ลำดับ เรื่อง ใน ต้นฉบับ

เพือ่ให้ขบวนการการพจิารณาผลงานวชิาการและ

การดำเนนิการจดัพมิพ์วารสารเปน็ไปอยา่งเรยีบรอ้ย

รวดเร็วและถูกต้องจึงจำเป็นต้องให้ผู้เขียนผลงาน

วิชาการปฏิบัติตามข้อกำหนดอย่างเคร่งครัดดังนี้

3.1 ให้ส่งต้นฉบับผลงานวิชาการจำนวน 1ชุด

และยังไม่ต้องส่งแผ่นบันทึกข้อมูล(Diskette)

3.2 ต้นฉบับผลงานวิชาการที่ส่งมา ให้ตรวจ

ความถูกต้องของตัวสะกด รูปแบบการจัดพิมพ์ผล

งานวิชาการให้ถูกต้องตามที่กำหนด

3.3 ส่งแผ่นบันทึกข้อมูลมาให้ เมื่อผลงาน

วิชาการนั้นได้ผ่านการพิจารณาจากคณะกรรมการ

วิจัยสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ แล้ว

เท่านั้น โดยเลขาคณะกรรมการวิจัยฯ จะแจ้งกลับ

ไปยังเจ้าของผลงานวิชาการพร้อมส่งต้นฉบับเพื่อ

ให้แก้ ไขตามที่คณะกรรมการวิจัยสำนักเทคโนโลยี

ชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ ให้ข้อเสนอแนะ

บันทึกผลงานวิชาการที่แก้ ไข ถูกต้องแล้ว

ตามขอ้แนะนำของคณะกรรมการวจิยัสำนกัเทคโนโลยี

ชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ลงในDisketteขนาด3.5

นิ้วหรือCD-ROMใช้โปรแกรมMicrosoftWord

forWindowsโดยมีรายละเอยีดบนสติกเกอร์ตดิหนา้

DisketteหรือCD-ROMดังนี้

4


ชื่อผลงานวิชาการ..............................................

ชื่อเจ้าของผลงาน..............................................

ชื่อไฟล์..............................................................

ที่อยู่เบอร์ โทรศัพท์/E-Mail...............................

หรือส่งทางInternet

มายัง[email protected]

3.4 ต้นฉบับผลงานวิชาการที่ ส่งให้คณะ

กรรมการวิจัยสทป.พิจารณาจะเป็นบทความที่จัด

รูปแบบได้ถูกต้องตามที่กำหนดเท่านั้น หากผลงาน

วิชาการที่ส่งมาให้ไม่ถูกต้องตามข้อกำหนดจะจัดส่ง

คืนให้เจ้าของผลงานวิชาการกลับไปแก้ไขให้ถูกต้อง

3.5 ตน้ฉบบัที่จดัสง่มาตอ้งชดัเจนทัง้เนือ้หาและ

รูปภาพประกอบผลงานวิชาการโดยส่งมาที่

3.6 หรือติดต่อสอบถามได้ที่

นางจุรีรัตน์แสนโภชน์

สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์

ถ.ติวานนท์ต.บางกะดีอ.เมือง

จ.ปทุมธานี12000

โทรศัพท์02-967-9791หรือ02-967-9792

โทรสาร.02-5011386

ดูขอ้มลูรายละเอยีดเกี่ยวกบัขอ้แนะนำสำหรับผู้เขียน

ผลงานที่ ได้http://www.dld.go.th/biotech

4. การ ลำดับ เรื่อง

4.1 ชื่อเรื่อง (Title) ควรต้องชื่อให้สั้นและสื่อ

ความหมายให้ดี และพิมพ์ โดยใช้ขนาดตัวอักษร 18

และตัวหนา

4.2 ชื่อผู้เขียนและผู้ร่วมงาน(Authorandco

- workers) เขียนชื่อนามสกุลเต็มทั้งภาษาไทยและ

ภาษาอังกฤษวางกึ่งกลางใต้ชื่อเรื่องพร้อมทั้งสถาน

ที่ทำงานที่ติดต่อได้สะดวกพิมพ์ไว้ ใต้ชื่อคณะผู้วิจัย

โดยใช้ขนาดตัวอักษร16และตัวปกติ

4.3 บทคดัยอ่(Abstract)เขยีนสัน้ๆได้เนือ้ความ

คลุมวัตถุประสงค์วิธีการและผลการทดลองความ

ยาวไม่ควรเกิน3%ของตัวเรื่องบทคัดย่อต้องมีทั้ง

ภาษาไทยและภาษาอังกฤษ แยกหน้าต่างหากจาก

กันส่ง บรรณาธิการวารสารเทคโนโลยีชีวภาพการ

ผลติปศสุตัว์สำนกัเทคโนโลยีชวีภาพการผลติปศสุตัว์

ถ.ติวานนท์ต.บางกะดีอ.เมืองจ.ปทุมธานี12000

4.4 คำสำคัญ (Key words) เป็นคำหรือข้อ

ความสั้นๆ ที่มีความหมายแสดงถึงความเป็นไปของ

การทดลองนั้นๆ รวมกันแล้วไม่เกิน 5 คำ หากไม่

สามารถแปลเปน็ภาษาไทยได้ ให้ ใช้ภาษาองักฤษแทน

โดยการพิมพ์อยู่ใต้บทคัดย่อ(ขึ้นบรรทัดใหม่)

4.5 เนื้อหา (Text) สำหรับงานวิจัยประกอบ

ด้วย

4.5.1 บทนำ(Introduction) อธิบายถึง

ปัญหาและวัตถุประสงค์และควรมีการตรวจเอกสาร

(literaturereview)

4.5.2 อุปกรณ์และวิธีการ (Materials

and Methods) อธิบายเครื่องมือ อุปกรณ์ที่ ใช้ ใน

การทดลองวธิีการที่ ใช้ถา้คดิคน้ขึน้ควรอธบิายอยา่ง

ละเอียด แต่ถ้าเป็นที่ทราบกันโดยทั่วไปให้เขียนใน

ลักษณะอ้างอิงถึง ถ้าเป็นเครื่องหมายตราหรือชื่อ

การคา้ควรทำเปน็footnoteไว้ที่ดา้นลา่งของหนา้นัน้

4.5.3 ผล (Results) รายงานผลการ

ทดลองเปน็คำบรรยายให้ละเอยีดและเขา้ใจงา่ยโดย

แบ่งเป็นหลายๆ ย่อหน้า และจัดข้อความที่มีเนื้อหา

เดียวกันไว้ด้วยกัน หากเป็นไปได้ควรเสนอในรูปของ

ตารางหรือรูปภาพ หรือกราฟพร้อมทั้งบรรยาย

ประกอบ ทั้งนี้ตาราง รูป หรือกราฟ ไม่ควรแสดง

ผลที่เหมือนกัน

-ตาราง(Tables)ควรพมิพ์ให้ชดัเจนเหมาะ

กับหน้าต้องมีความหมายในตัวเองและมีคำอธิบาย

ตารางอยู่เหนือตารางนั้นๆ

5


-รปูภาพ(Figures)ควรเปน็ภาพขาว–ดำ

ภาพสีหากจำเปน็ผู้เขยีนตอ้งเสยีคา่ใช้จา่ยเองอธบิาย

รายละเอียดไว้ ใต้รูปนั้นๆ

4.5.4 วิจารณ์ (Discussion) เป็นการ

วิจารณ์ผลการทดลอง โดยมีจุดมุ่งหมาย เพื่อให้

ผู้อื่นเห็นคล้อยถึงหลักการที่แสดงออกมาจากผลการ

ทดลอง หรือเพื่อสนับสนุน หรือคัดค้านทฤษฏีที่มี

ผู้เสนอมากอ่นหรอืเพือ่เปรยีบเทยีบกบัผลการทดลอง

และการตีความหมายของผู้อื่น ผู้เขียนควรพยายาม

เน้นถึงปัญหาหรือข้อโต้แย้งในสาระสำคัญของเรื่อง

ที่กำลงักลา่วถงึตลอดจนขอ้เสนอแนะเพือ่การวจิยัใน

อนาคตและลู่ทางที่จะนำผลไปใช้เป็นประโยชน์

4.5.5 สรปุ(Conclusion)เขยีนใจความที่

สำคัญและคุณค่าของงานเพื่อให้ผู้อ่านเข้าใจง่ายขึ้น

4.5.6 กิตติกรรมประกาศ (Acknowl-

edgement)ควรมีในกรณีที่ ได้รบความชว่ยเหลอืหรอื

ความร่วมมือที่สนับสนุนงานค้นคว้าวิจัยนั้นๆ

4.5.7 เอกสารอ้างอิง(References)

ก. กรณีที่อ้างอิงในเนื้อเรื่อง ควรอ้างอิง

ดังนี้คือ

1. กรณีที่อ้างจากการตรวจเอกสาร โดย

ผู้อื่นๆให้ ใช้คำว่าอ้างถึงโดย(citedby)

2.กรณีผู้รายงานเอกสารเป็นคนไทยเมื่อ

เป็นประธานของประโยค ใช้ “วิบูรณ์ และ จุรรัตน์

(2549),เลศิชยัและคณะ(2549)กลา่ววา่.......”หรอื

เมื่อรายงานอยู่กลางหรือท้ายประโยคใช้ (วิบูรณ์,

2549)หรือมีเอกสารอ้างอิงในเรื่องเดียวกันมากกว่า

1ฉบับให้ ใช้(ถาวรและคณะ,2547;นริศและสิน

สมุทร,2543.....)

3. กรณีผู้รายงานเอกสารเป็นชาวต่าง

ประเทศเมื่อเป็นประธานของประโยคใช้“Rudbeck

andDissing(1998),Kashietal.(1990)กล่าว

ว่า......... “ หรือเมื่อผู้รายงานอยู่ระหว่างกลางหรือ

ท้ายประโยค ใช้ (Rudbeck andDissing, 1998;

Kashietal.,1990.............)

4. กรณีอ้างถึงบุคคลหรือเรื่องที่ ไม่เคยลง

พิมพ์มาก่อน (personal communication) ให้อ้าง

เฉพาะในเนื้อเรื่องเท่านั้น ไม่ต้องนำไปลงในรายชื่อ

เอกสารอา้งองิเชน่....similarresults(Walker,J.M.,

unpublished data), .......for other protocols

(Walker,J.M.,personalcommunication)

ข.การเขียนเอกสารอ้างอิงท้ายเรื่องควร

ขึ้นต้นเอกสารอ้างอิงภาษาไทยก่อน เขียนเรียงตาม

ลำดับพยัญชนะของผู้เขียน ถ้าเป็นภาษาอังกฤษใช้

ชื่อสกุลตามด้วยชื่อย่อของผู้แต่งแล้วตามด้วยปีชื่อ

เรื่องชื่อหนังสือหรือชื่อย่อวารสารปีที่ฉบับที่และ

หน้าที่อ้างอิงดังตัวอย่าง

วิบูรณ์ตุลารักษาและจุรีรัตน์แสนโภชน์2549

การสกัดดีเอ็นเอเซลล์รากขนในโคนมไทยโฮลสไตน์

การประชุมวิชาการสัตวศาสตร์ ครั้งที่ 2 “ก้าวทัน

สมัยกับปศุสัตว์ไทย”วันที่24มกราคม2549โรง

แรมโซฟิเทลขอนแก่น.หน้า452-463

เลิศชัยจินตพิทักษ์สกุลรพีพรรณเอื้อเวชนิชกุล

และกัลยาเก่งวิกย์กรรม2549การประเมินวิธีสกัด

แยกดีเอ็นเอจากเลือด น้ำเชื้อ และเซลล์รากขนของ

พ่อพันธุ์ โค.สัตวแพทย์สาร56(3):68-79

Jason,R.H.andCallings,D.F.1971.Trans-

placental infection of pigletswith a porcine

parvovirus.Res.Vet.Sci.12:570-572.

กรณีอา้งองิจากตำราให้ระบุชือ่ผู้เขยีนปีที่ตีพมิพ์

ชือ่เรือ่งชือ่ตำรา(พมิพ์ครัง้ที่เทา่ใดและบรรณาธกิาร

หากมี) สำนักพิมพ์ เมืองที่พิมพ์ หน้าแรกและหน้า

สุดท้ายที่อ้างถึงดังตัวอย่าง

Allison,P.D.2005.Survivalanalysisusing

SAS: A practical guide 8 th edition. SAS

instituteInc.,Cary,NC,USA.292pp.

6


VanOirschot,J.T.1986.HogCholera.In:

DiseaseofSwine,6thed.Leman,A.D.ed.

LowastateuniversityPress.lowa.p.293-297.

กรณีอา้งองิจากเวบไซด์(Onlinereferences)ดงั

ตัวอย่าง

Weeden,N.F. 1993.ComparisonofDNA

extractionprotocols.[Online]http://home.twony.

rr.com/protocol.htmAccess29/10/2005.

จันทราแป้นตุ้มจุฑาพรศรีวิพัฒน์วรวิทย์แสง

สิงแก้ว และพึ่งพิศดุลยพัชร์. 2541. อาหารจาก

ข้าวโพด.คู่มือการส่งเสริมการเกษตรที่ 43. แหล่ง

ที่มา:http://www.ku.ac.th/agri/cornn/corn.htm.

27มีนาคม2541.

5. การ พิมพ์ ผล งาน ทาง วิชาการ

ตัวพิมพ์ให้พิมพ์ดีดหรือใช้เครื่องพิมพ์(Printer)

หมึกพิมพ์ต้องเป็นสีดำ คมชัด สะดวกแก่การอ่าน

และใช้ตัวพิมพ์แบบเดียวกันทั้งฉบับ กรณีใช้เครื่อง

คอมพิวเตอร์พิมพ์เนื้อความให้ ใช้ตัวอักษร Ang-

sanaUPC 16 ตัวปกติ เท่านั้น ยกเว้นหัวข้อใหญ่

เช่น ชื่อเรื่อง บทคัดย่อ บทนำ อุปกรณ์และวิธีการ

ผล วิจารณ์ สรุป กิตติกรรมประกาศและเอกสาร

อ้างอิงพิมพ์ โดยใช้ตัวอักษรแบบหนา(Bold)ขนาด

18ส่วนหัวข้อย่อยเช่นชื่อผู้วิจัยและคณะคำสำคัญ

ตารางรปูภาพเปน็ตน้พมิพ์ โดยใช้ตวัอกัษรแบบหนา

(Bold)ขนาด16กระดาษที่ ใช้พมิพ์ให้ ใช้กระดาษขาว

ไม่มีบรรทัดขนาดมาตรฐานA4(210X297มม.)

ใช้เพียงหน้าเดียว

การเว้นที่ว่างขอบกระดาษ

-ตั้งกั้นหน้าบนและซ้ายไว้ที่2.5เซนติเมตร

- ด้านขวาและด้านล่างไว้ที่ 2.0 เซนติเมตร

การเว้นระยะในการพิมพ์

- การเว้นระยะระหว่างบรรทัดและการย่อหน้า

ควรจัดตามความสวยงาม

- กรณีคำสุดท้ายไม่จบบรรทัดนั้นๆ ให้ยกคำนั้น

ทัง้คำไปพมิพ์ ในบรรทดัตอ่ไปไม่ควรตดัสว่ยทา้ยของ

คำไปพิมพ์ ในบรรทัดใหม่เช่นกระบือปลักไม่ให้แยก

เป็นกระบือ-ปลักเป็นต้นจุลชีพเช่นEscherichia

coliหรือพิมพ์ตัวเอนEscherichiacoli

-หลังเครื่องหมาย.และ,หรือ;เคาะ1เคาะ

พืช เช่น Oryza sativa หรือพิมพ์ตัวเอน Oryza

sativa

- ระหว่างคำสุดท้าย กับเครื่องหมาย . และ ,

ไม่เว้นช่องว่าง

สัตว์เช่นBostaurusหรือพิมพ์ด้วยตัวเอนBos

taurus

-ไม่ต้องเว้นช่องว่างระหว่างวงเล็บและคำข้าง

ในวงเล็บเช่น(รพีพรรณและคณะ)

การลำดับหน้า

-ลำดับหน้าโดยใช้หมายเลข1,2,3......ที่กึ่งกลาง

หน้ากระดาษ

ตารางรูปภาพแผนภูมิกราฟ

- ตารางประกอบด้วย เลขที่ของตาราง (table

number)ชือ่ของตาราง(tabletitle)หวัตาราง(table

heading)และที่มาของตาราง(ถ้ามี)โดยให้ทำเป็น

ภาษาองักฤษหรอืภาษาไทยทัง้ตารางพมิพ์อยู่ในหนา้

เดียวกันทั้งหมด

-กรณีตารางมีความยาวมาก ไม่สามารถสิ้นสุด

ในหน้าเดียวได้ ให้พิมพ์ส่วนที่เหลือในหน้าถัดไปโดย

พิมพ์เลขที่ตารางและตามด้วยคำว่า(ต่อ)

- กรณีรูปภาพแผนที่ แผนภูมิ กราฟควรเป็น

ภาพขาวดำและใช้แนวทางข้างต้น

การพิมพ์ชื่อวิทยาศาสตร์ของสิ่งมีชีวิตให้ ใช้ตาม

ประมวลนามศาสตร์สากล (International code of

nomenclature)คือขีดเส้นใต้หรือพิมพ์ด้วยตัวเอน

ชื่อวิทยาศาสตร์เป็นไปตามการตั้งชื่อ

7


สารบัญ

8

10

18

29

37

44

52

65

75

85

94

• โครงการเร่งรัดผลิตโคเนื้อคุณภาพสูงโดยวิธีการผสมเทียม

• การศึกษารูปแบบของยีนCD18ที่ก่อโรคBovineLeukocyteAdhesion

Deficiency(BLAD)ในโคไทยโฮลสไตน์ด้วยเทคนิคPCR

• ระดับแอนติบอดีของเชื้อโบวายน์ไวรัลไดอะเรียและอุบัติการณ์เกิดโรคในโค

ในพื้นที่ปศุสัตว์เขต123และ7ของประเทศไทย

• ผลของระดับฮอร์โมนเอฟเอสเอชต่อการเพิ่มการตกไข่ในโคพื้นเมืองสายอีสาน

• ผลความเข้มข้นของCysteineในน้ำยาเจือจางEggYolkTris

ต่อคุณภาพน้ำเชื้อโคนม

• ผลการเสริมกลูตามีนและไกลซีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อต่อคุณภาพน้ำเชื้อโคนม

ภายหลังการละลาย

• สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อลูกผสมบราห์มันในภาคใต้ของประเทศไทย

• อิทธิพลของพลังงานเชิงลบช่วงหลังคลอดต่อความสมบูรณ์พันธุ์ในแม่โคนม

ลูกผสมไทยโฮลสไตน์

• การพัฒนาชุดตรวจสอบความเป็นพ่อแม่ลูกโคด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอ

ชนิดไมโครแซทเทิลไลท์เพื่อเพิ่มความเชื่อมั่น

• ความสัมพันธ์ระหว่างสนิปของยีนเลปตินกับคุณภาพซากในโคเนื้อ

ลูกผสมแองกัสxพื้นเมือง50%

• อิทธิพลสนิปจีโนไทป์ของยีนคาลเปนและคาลปาสตาตินต่อลักษณะความนุ่ม

ของเนื้อในโคลูกผสมแองกัส50%(Thai-Black)

หน้า

8


การเลีย้งโคเนือ้เปน็อาชพีทางการเกษตรที่สำคญัและเกีย่วขอ้งกบัเกษตรกรไม่นอ้ยกวา่ลา้นครอบครวั

การเลี้ยงโคเนื้อของเกษตรกรไทย ที่เคยใช้ประโยชน์เป็นแรงงานทำการเกษตรเป็นหลักนั้น ปัจจุบันความ

เจริญเติบโตของประชากรในประเทศที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว การใช้ประโยชน์ ในที่ดินทำกินมีจำกัด ต้องใช้

เกิดประโยชน์คุ้มค่าพื้นที่สาธารณะประโยชน์ที่เคยมีพืชอาหารสัตว์กระจายอยู่ทั่วไปก็ลดลงอย่างเห็นได้ชัด

เกษตรกรจำนวนมากต้องเลิกเลี้ยงโคเนื้อแบบเลี้ยงปล่อยมีการสูญเสียแม่พันธุ์ โคไปเป็นจำนวนมากแนวโน้ม

การเลี้ยงโคเนื้อต้องเปลี่ยนเป็นการเลี้ยงเพื่อจำหน่าย และเพื่อผลิตเนื้อโค ทั้งนี้เพราะความต้องการบริโภค

เนื้อสัตว์เพิ่มขึ้นทั้งจากความต้องการของประชากรในประเทศเองและนักท่องเที่ยวจากต่างประเทศตลอด

จนความต้องการของตลาดต่างประเทศยิ่งไปกว่านั้นการรวมตัวของประเทศในอาเซียนเกิดเป็นประชาคม

เศรษฐกิจอาเซียน ซึ่งจะเริ่มทำการค้าเสรี ตั้งแต่ปี พ.ศ.2558 เป็นต้นไปนั้น การเลี้ยงโคเนื้อจำเป็นต้อง

เปลีย่นรูปแบบเป็นฟาร์มที่มีมาตรฐานการเลีย้งที่สากลยอมรับการผลิตเนือ้โคคุณภาพสูง(PremiumGrade)

ซึ่งประเทศไทยมีโอกาสและศักยภาพสูง เมื่อเปรียบเทียบกับประเทศต่างๆ ในเขตเอเชียตะวันออกเฉียงใต้

(ASAEN)มีความสามารถที่จะผลติโคเนือ้คณุภาพสงูเพือ่การบริโภคภายในประเทศและสง่ออกไปจำหนา่ย

ต่างประเทศได้ ซึ่งผลจากข้อตกลงเขตการค้าเสรีอาเซียน (AFTA)ซึ่งมีผลตั้งแต่วันที่ 1มกราคม2553

ประเทศไทยเริ่มส่งออกโคเนื้อไปต่างประเทศเพิ่มมากขึ้น

กรมปศุสัตว์ กระทรวงเกษตรและสหกรณ์ ได้จัดทำแผนยุทธศาสตร์ โคเนื้อ ดำเนินการระหว่างปี

พ.ศ.2555–2559เพื่อเป็นแผนแม่บทและใช้เป็นแนวทางในการกำหนดนโยบายของรัฐบาลในการผลิต

โคเนือ้ในประเทศโดยรฐับาลได้บรรจุ“โครงการ เรง่รดั การ ผลติ โค เนือ้ คณุภาพ”ไว้ ในแผนบรหิารราชการ

แผ่นดิน(4ปี)แล้วโดยหวังว่าจะให้การเลี้ยงโคเนื้อเป็นอาชีพที่ทำรายได้ ให้เกษตรกรอย่างสมํ่าเสมอ

โครงการเร่งรัดการผลิตโคเนื้อคุณภาพสูงโดยวิธีการผสมเทียมได้รับการจัดสรรงบประมาณดำเนิน

การระยะ4ปีระหว่างปีงบประมาณพ.ศ.2555-2558โดยสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์เป็น

ผูร้บัผดิชอบดำเนนิการผสมเทยีมแม่โคเนือ้พืน้ฐานในประเทศคอืพนัธุ์พืน้เมอืงพนัธุ์ลกูผสมบราห์มนัให้ได้ลกู

เกิดโคเนื้อคุณภาพสูงสายเลือด50%ของพันธุ์ชาร์ โรเลย์หรือพันธุ์แองกัสในเบื้องต้นโดยมีวัตถุประสงค์

เพื่อยกระดับคุณภาพการผลิตโคเนื้อคุณภาพและเพิ่มรายได้ ให้กับเกษตรกรรายย่อยผู้เลี้ยงโคเนื้อเพื่อสนอง

ตอบความต้องการของตลาดโคเนื้อคุณภาพที่ขยายตัวอย่างรวดเร็วและเพื่อปรับเปลี่ยนทัศนคติผู้บริโภคให้

นิยมบริโภคเนื้อคุณภาพเพิ่มขึ้นเป้าหมายผสมเทียมแม่โคเนื้อในประเทศจำนวน600,000ตัวผลิตลูกเกิด

โคเนื้อคุณภาพดีจำนวน180,000ตัว

โครงการเร่งรัดการผลิตโคเนื้อคุณภาพโดยวิธีการผสมเทียม

นายรัตน์ ฉายารัตนศิลป์

9


เกษตรกรเปา้หมายคอืเกษตรกรตน้นำ้ผลติโคเนือ้คณุภาพปอ้นสู่ตลาดเกษตรกรกลางนำ้คอืกลุม่

โคเตรยีมขนุและหรือเกษตรกรปลายนำ้กลุม่โคขนุและเชื่อมโยงกบัผู้ประกอบการเนื้อโคคณุภาพตอ่ไปโดย

คาดว่าเกษตรกรต้นน้ำจะสามารถผลิตลูกเกิดโคเนื้อคุณภาพตอบสนองความต้องการของตลาดในประเทศ

ได้จำนวน180,000ตัวในช่วงเวลา4ปี(ปี2556-59)และมีกำไรตอบแทนจากการผลิตลูกโคเนื้อคุณภาพ

ตัวละ5,500บาทตั้งแต่ปีที่2ของโครงการฯจากผลผลิตจำนวน60,000ตัวเป็นเงิน564ล้านบาท

กลไกการขบัเคลือ่นโครงการมีการจดัตัง้และขึน้ทะเบยีนกลุม่ผสมเทยีมโคเนือ้คณุภาพผา่นศนูยว์จิยั

การผสมเทยีมและเทคโนโลยีชวีภาพทัง้10ศนูย์การให้ผสมเทยีมแม่โคของกลุม่เกษตรกรฯการตดิตามตรวจ

ท้องติดตามลูกเกิดการบันทึกข้อมูลประวัติการผสมเทียมและการรับรองพันธุ์เพื่อการจำหน่ายโคหย่านม

ของกลุ่มเกษตรกรฯการปรับปรุงพันธุ์ โคเนื้อคุณภาพสูงใช้หลักการปรับพันธุ์แบบTerminalCrossBreed

ซึ่งช่วยให้เกิดHybridVigorที่ ได้ประโยชน์สูงโดยการผสมข้ามสายเลือดระหว่างโคสายเลือดBosIndicus

ได้แก่โคพันธุ์ลูกผสมพื้นเมืองโคพันธุ์ลูกผสมบราห์มันกับโคสายเลือดBosTaurusได้แก่โคพันธุ์ชาร์ โรเลย์

หรือแองกัสเป็นต้น

สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์กำหนดแผนภูมิภาพการปรับปรุงพันธุโดยวิธีการผสมเทียม

เพื่อมุ่งเน้นการผลิตลูกโคขุนคุณภาพในฟาร์มเกษตรกรรายย่อย (รุ่น F1) ที่เกิดจากแม่พันธุ์ โคพื้นเมือง

ผสมเทียมกับน้ำเชื้อโคพ่อพันธุ์ ชาร์ โรเลย์ หรือแองกัส ซึ่งตรงตามความต้องการของกลุ่มผู้ประกอบการ

โคขุน โดยเกษตรกรสามารขายลูกโค รุ่น F1 นี้ ได้ทั้งตัวผู้และตัวเมีย ในราคาที่ ใกล้เคียงกัน สำหรับ

ลูกโครุ่นF1เพศเมียที่เกษตรกรต้องการเลี้ยงไว้ทำพันธุ์ต่อไปนั้นสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์

ไม่แนะนำให้ผสมเทียมด้วยน้ำเชื้อโคพ่อพันธุ์ชาร์ โรเลย์อีก แต่สามารถผสมพันธุ์กับน้ำเชื้อพ่อโคพันธุ์ตากหรือ

พันธุ์กำแพงแสนจะได้ลูกเกิดรุ่นF2และรุ่นF3ที่สามารถขายให้กับผู้ประกอบการโคขุนได้แต่การเลี้ยง

การจัดการอาจยุ่งยากขึ้นไม่เหมาะสำหรับเกษตรกรรายย่อยทั่วไป

จากผลการดำเนินโครงการในปีแรกของปีงบประมาณ 2555 เกษตรกรทั่วไป ได้รับโอกาสในการ

เชิญชวนเข้าร่วมโครงการและผสมเทียมแม่โคไปแล้วจำนวน41,713ตัวคิดเป็นร้อยละ84ของเป้าหมาย

แม่โคและลูกโคที่เกิดจะได้รับการติดหมายเลขประจำตัว (NID= National livestock Identification and

Registrationsystem)และการรับรองพันธุ์เพื่อการซื้อขายที่ ได้มูลค่าที่สูงขึ้น

ปีงบประมาณ ผสมเทียมแม่โค ตรวจท้อง ลูกเกิด ลูกโคผู้ ลูกโคเมีย

2555 50,000 45,000 - - -

2556 100,000 90,000 30,000 15,000 15,000

2557 200,000 180,000 60,000 30,000 30,000

2558 250,000 225,000 120,000 60,000 60,000

2559 0 0 150,000 75,000 75,000

รวม 600,000 540,000 360,000 180,000 180,000

10


บทคัดย่อ โรคBovineLeukocyteAdhesionDeficiency (BLAD) เป็นโรคทางพันธุกรรมที่เกิดจากยีน

ด้อย CD18 ชนิดโฮโมไซกัส (homozygous) ทำให้เป็นโรคบกพร่องภูมิคุ้มกัน และขาดความสมบูรณ์พันธุ์

พบในโคนมสายพันธุ์ โฮลสไตน์ และมักจะตายตั้งแต่อายุน้อย 1-2 เดือน แต่โคนมที่มียีนด้อย แบบเฮเทอ

โรไซกัส (heterozygous) จะมีอาการปกติ และเป็นตัวที่แพร่ยีนด้อยนี้ ไปในฝูงโคนมที่มีสายเลือดโฮลสไตน์

มีการค้นพบครั้งแรกในสหรัฐอเมริกา ว่าโคนมพ่อพันธุ์ โฮลสไตน์ เป็นพาหะของ โรคนี้ (BLAD carrier)

และต่อมาพบพาหะโรคBLADเพิ่มขึ้นในประเทศบราซิลและประเทศญี่ปุ่นจากรายงานที่พบมากขึ้นผู้วิจัย

จึงเริ่มทำการศึกษาเรื่องนี้ในปีพ.ศ.2554ขึ้นเป็นครั้งแรกในประเทศไทยและได้นำเทคนิคPCR-RFLP

ซึง่ให้ผลการตรวจที่รวดเรว็มาใช้เพราะมีความเทีย่งตรงมากกวา่การตรวจนบัเมด็เลอืดขาวซึง่เปน็การตรวจ

แบบดัง้เดมิการศกึษารปูแบบยนีCD18ครัง้นี้ได้นำตวัอยา่งดเีอน็เอซึง่สกดัจากเลอืดของฝงูโคนมลกูผสมไทย

โฮลสไตน์จำนวน220ตัวของเกษตรกรที่เกิดมาจากน้ำเชื้อแช่แข็งพ่อพันธุ์ โคนมโฮลสไตน์ของอเมริกาและ

ตรวจเช็คความแม่นยำของชิ้นดีเอ็นเอที่ถูกตัดด้วยเอ็นไซมด้วยการวิเคราะห์ลำดับเบส (DNA sequencing)

ด้วยเครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติพบว่าในจำนวนโคทั้งหมด(220ตัวอย่าง)มีโคที่เป็นพาหะโรคนี้จำนวน1ตัว

และมีรูปแบบยีนCD18คือ156bp,201bpและ357bpแต่ตัวอย่างของยีนCD18ในโคนมอีกจำนวน199

ตัวที่ ไม่เป็นพาหะโรคนี้มีรูปแบบของยีนCD18คือ156bpและ201bpจากการศึกษาพบว่าprevalence

rateของการพบพาหะโรคนี้มีค่าเท่ากับ0.045%และมีความถี่ของยีนCD18เท่ากับ0.094แสดงว่าพาหะ

ของโรคนี้ยังมีจำนวนน้อยอยู่

คำสำคัญ:รูปแบบของยีนCD18,BovineLeukocyteAdhesionDeficiency(BLAD)โคไทยโฮลสไตน์

เทคนิคPCR

กัลยา เก่งวิกย์กรรม1, ณชัย ศราธพันธุ์1, ณัฐนันท์ ศิริรัตนธัญญะกุล1 และ สายใจ ชื่นสุข1 1สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์

การศึกษารูปแบบของยีน CD18 ที่ก่อโรค BovineLeukocyte Adhesion Deficiency (BLAD) ในโคไทยโฮลสไตน์ด้วยเทคนิคPCR

11


Abstract BLAD isaspecificHolsteinautosomal recessivegeneticdisordercharacterizedby

immuno-deficiency,recurrentinfectionsandinfertilityresultingindeathofhomozygousanimals

attheearlyage(1-2months).Heterozygouscowsandbullsareclinicallynormalbuttheyhave

achanceofproducinghomozygouscalvesaffectedbythedisease.Itwasfirstlyidentifiedin

HolsteinsiresofNorthAmerican,thenBrazilandJapan.Accordingtothosereportsoffinding

BLADcarriersfrommanycountriesusingdeepfrozensemenofAmericanBLADcarriersires,

in2011PCR-RFLPwaschosentoidentifygenotypesofgeneCD18forthefirsttimeinThai-

land.BloodsamplesofThaiHolsteincattlepopulation(n=220)tofindoutBLADcarriers.The

PCR–RFLPprocedureandDNAsequencingwereadjustedforoptimumconditions.Theresults

showedthatthegenotypeofBLADcarrierhasthreefragmentsof156bp,201bpand357bp

whereasunaffectedcattlehaveonlytwofragmentsof156bpand201bp.Allgenotypeswere

confirmedbyDNAsequencingmethod.TheprevalencerateoftheBLAD-carrierwere0.045%

andallelicfrequencyofCD18,wasonly0.094.ItwasconcludedthattheprevalentofCD18

genemutationinThaiHolsteincattlewasstillverylow.

Keywords:Genotyping,GeneCD18,BovineLeukocyteAdhesionDeficiency,BLAD,

ThaiHolsteincattle,PolymeraseChainReaction,PCR

Kalaya Kengvikkum1, Nachai Sarataphan1, Nattanant Sirivattanatanyakul1 and Saijai Cheunsuk1

1Bureau of Biotechnology in Livestock Production Department of Livestock Development

Genotyping of Gene CD18 Causing BovineLeukocyte Adhesion Deficiency (BLAD) inThai Holstein Cattle using Polymerase ChainReaction(PCR).

12


Introduction BLADisaspecificHolsteinautosomalrecessivegeneticdisorderandresultsindeathofhomozygousanimalsattheearlyage(1-2months).ItwasfirstlyidentifiedinNorthAmeri-canHolstein(Shusteretal1992).BLADcarrierswereamongthemostpopulartopbullsoftheHolsteinbreedsuchasOsborrndaleIvanhoe,PenstateIvanhoeStar,andCarlin-MIvanhoeBell(Shusteretal1992,Powelletal1996).WidespreaduseofArtificialinsemination(AI)andmultipleovulationembryotransfer(MOET)techniquescauseddemandingsemenfromthoseeliteHolsteinbulls.AffectedcattlewithBLADwerelinkedtocommontheancestorsiresthatwereprovedtobecarriers(Shusteretal1992,Jørgensenetal1993).ThaiHolsteincattleinheriteddisorderbyautosomalrecessivegeneandexpressedasadiseasedphenotypeifbothallelesarepresent(Homozygous).Homozygousindividualscanbeidentifiedbydifferentmethodssuchasclinicalexamination,analysisofenzymeactivityinbloodandgenomicanalysis.Withthemolecularbasis,thescreeningofcarriers(Heterozygous)ispossibleatthedirectgeneticde-tection.ThisstudyaimstodevelopthePCR-RFLPconditionsandestimatetheBLADallelein220ThaiHolsteincattle.

MaterialandMethods Bloodsampleswerecollectedfrom220cattleofThaiHolsteincattle’sjugularveinintoEDTAcontainingtubes.DNAwasisolatedusingAxyprepBloodGenomicDNAMiniprepKitandstoredat4°Cuntilanalysis.

GenotypingforBLADwascarriedoutusingPCR-RFLPmethods.PCRwasmadein20µlreactionmixturecontaining1µlGenomicDNA,1UTaqpolymerase,0.2mMdNTP,5µMofeachprimer(F:5’GAATAGGCATCCTGCATCATATCCACCA3’R:5’CTTGGGGTTTCAGGGGAAGATGGAGTAG3’)TheprimersweredesignedtoamplifyaDNAfragmentof357bp.(Meydan,etal.2010)ThecyclingreactionwereperformedinaPersonalThermalCycler(MJMini™)withaninitialdenaturationfor3minat96๐Cfollowedbythethermalcyclesasfollows:denaturationstepat94๐Cfor30s,annealingstepat66๐Cfor30s,andanelongationstepat72๐Cfor30s.Thereactionwascompletedwithafinalelongationstepat72๐Cfor5minPCRproductswereanalyzedwith2%agarosegel.The357bpDNAfragmentwasamplifiedbyPCR.Aliquotsof2µlofPCRproductweresubjectedtorestrictiondigestionwithTaqIina10µlreactionvolume.Using0.2µlTaqIrestrictionendonucleasewithBSAperonesample,themixturewasincubatedat65oCfor3hr.ThedigestedamplifiedPCRproducton2%agarosegelyieldedtwobandsof201and156bpfornormalanimalsandthreebandsof201,156and357bpforcarriers.TheamplifiedPCRproductof357bpwasfortheBLADlocus.

13


OneDNAofknowncarrierofBLADasacontrolwasobtainedfromDr.IstvanAnton,ResearchInstituteforAnimalBreedingandNutrition(ATK)Herceghalom,Hungary.Allgeno-typeswereconfirmedbyDNAsequencingtechnique.Aftergelelectrophoresis,theampliconswerepurifiedusingNucleoSpin®ExtractIIandsequencedbyBigDyeTerminatorchemistryonanABI3130AutomatedDNASequencing.

AllelicFrequencyestimate

ThegenefrequencyestimateoftheCD18wascalculatedbasedontheHardy-Weinberglawasfollow:p=2(AA) + (Aa) q=1-p(Crow,JF.1999). 2N

Wherep=normalallelefrequency,q=mutantallelefrequency,N=totalnumberofanimaltested,AA=numberofBLAD-freecattle,andAa=numberofBLADcarriers.

Results

TheprimermentionedabovesuccessfullyamplifiedtheDNAfragmentsof357bpforBLAD.Infigure1,therewerefiveBLADcarriers:anexamplefromHungaryasacontrolandfoursamplesinThaiHolsteinhavethreefragmentsof156bp,201bpand357bpwhereasunaffectedcattlehaveonlytwofragmentsof156bpand201bp.TheBLADpositiveandnega-tivesamplesweresequencedbyBigDyeTerminatorchemistryonanABI3130AutomatedDNAsequencing(AppliedBiosystems,USA).TheDNAsequenceswereanalyzedusingtheSequencingAnalysisSoftwareVersion3.3(AppliedBiosystems).Amongfivecarriers’allele,therewereonly twomutantalleles:acontrolsampleDNAfromHungaryandonesamplefromThaiHolsteinbull.Theotherthreealleles(Figure1:inthecolumn5,6,7)werefoundtobefalsepositivewhenconfirmedbyDNAsequencingmethod.ToimprovethatPCR-RFLPanalysisshouldbeastrongandreliablemethodforidentificationofBLAD.ManytrialshavebeendoneinbothPCRandofTaqIenzymeconditionsinordertofindtheoptimumprocedure.Finally,aproperconditionofTaqIenzymewasfoundbyaddingBSA1µl(0.1%)andreducingDDW(deionizeddistilwater)from6.8µlto5.8µlintotalsolution10µl.DNAsamplesfromThaiHolsteincattleincolumn5,6,and7inFigure1weretrulyfalsepositivewhencheckingsequences.(Figure2)

14


Figure1: VisualizationofrestrictionfragmentsproducedbyTaqIenzymeonthePCRproducts.ColumnM:100bpladder.

Column 1-2: Positive control DNA from Hungary cow and positive sample of Thai Holsteincattlerespectively.

Column 3-4:NegativeDNAsamples

ofThaiHolsteincattle

Column 5, 6, 7:(false)positiveDNAsamplesofThaiHolsteincattle

Figure 2: Visualization of restriction frag-mentsproducedbyTaqIenzymeonthePCRproducts.

Column M:100bpladder.

Column 1-2: Positive control DNA from Hungary cow and positive sample of ThaiHolsteincattle

Column 3, 4, 5, 6, 7:NegativeDNAsamplesofThaiHolsteincattle

Theresultsfrom220DNAsamplesshowedthattherewereonlytwogenotypes.Onetypewasofknowncarrier(heterozygous;Aa)andtheotherwasofnormalcow(homozygous;AA).ThehomozygousofrecessivegeneofCD18cannotbefound.Allgenotypeswereconfirmedbysequencingmethod.ThenucleotidesequencewasintheGenBankwithaccessionnumberFJ853493forBLAD.TheresultofsequencingforthemutantBLADallelewasconfirmedasinglepointmutationatthenucleotide383intheCD18geneastheotherreports(Figure3)(Kriegesmann,etal1997,Meydan,etal.2010).Inthispaper:theprevalenceofBLADcarriersinThaiHolsteincattlewasfound0.045%andthegenefrequencyofCD18,calculatedaccordingtotheHardy-WeinbergLawwasonly0.01inthe220samples.TheotherincidenceofBLADcarriersamongTopsireswasalsofoundtobe23%inU.S.A.(Shusteretal1992),10%inFrance(Tainturieretal1995),16%inJapan(Nagaharaetal1995),3.33%inIran(Norouzyetal2005)and4.76%(Pateletal2011)

15


Figure 3 AlignmentofBLADsequencesfromnormalThaiHolsteincow(greenpeakpointedby the arrow represented theA/A bp),mutant1 (positive controlDNA fromHungary; twopeakspointedbythearrowrepresentedtheA/Gbp)andmutant2fromnormalThaiHolstein (positiveBLAD-DNAfromaThaisample;twopeakspointedbythearrowrepresentedtheA/Gbp)onthesecondandthirdrowsrespectively.Themutationconsistsofasinglepointmutationofnucleotide383intheCD18gene.Theboxindicatesthesinglepointmutationsite(AtoG)

16


Discussion ThePCR-RFLPprocedurewasadjustedbyourteamtoeliminatethefalsepositive.Finally,therestrictionenzymeTaqIdigestedthePCRproductintotwofragmentsof156bpand201bp(Figure2,lane3,4,5,6and7)innormalhomozygote.Heterozygoteanimalsgavethreefragmentsof156bp,201bpand357bp(Figure2,lane1and2).ItwasthesameasotherexperimentsthatnormalunaffectedBLADcattlehavetwofragmentsofallelesandthecarriershadthreefragmentsinPCR-RFLPmethod.Ribeiro,etal(2000)surveyedBLADinHolsteinandGircattleinBrazilandusedtheenzymeTaqItodigestthePCRproduct.Innormalhomozygotethereweretwofragmentsof26and32bpandinBLADcarrierhadthreefragmentsof58,26and32bp.Meyden,etal(2010)usedPCR-RFLPmethodandDNAsequencingforscreeninggenotypingBLADof350HolsteincowsinSouthEastAnatoliainTurkeybetweentheyears2007-2009.ThenormalunaffectedBLADcattleallelesproducedtwofragmentsof156bpand201bp.BLADcarriersexhibitedthreefragmentsof156,201and357bp.

TheprevalenceofBLADinthispaperisstilllowat0.045%andallelicfrequencyofCD18,wasonly0.094.Itwasbecauseofsmallinvestigatednumberofsamplesandcouldbehigherinthecomingyears.AstheselectionwithinHolsteinbreed,its’crossesandAIprogramsareofmajor factors tospreadofundesirablegeneticdisorderofBLAD.RoutinecheckingofbullsanddamsbytheRealtimePCRisrequiredtoreducetherecessivelethalgeneinThaiHolsteincattlepopulation.

Acknowledgements TheauthorwishtothankDr.IstvanAnton,ResearchInstituteforAnimalBreedingandNutrition(ATK)Herceghalom,HungaryforgivingDNAofknowncarriesofBLAD.

References Crow,JamesF.(1999).“Hardy,Weinbergandlanguageimpediments”.Genetics152(3): 821–825.PMC1460671.PMID10388804.[Online]

http://www.genetics.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=10388804.Access10/1/2011.

Jørgensen,C.B.,AgerholmJ.S.,PedersenJ.andThomsen,P.D.1993.Bovineleukocyte adhesiondeficiency inDanishHolstein-Friesiancattle. I.PCRscreeningand allelefrequencyestimation.Acta.Vet.Scand.1993;34(3):231-6.

17


Meydan, H., Yildiz, A.M. and Agerholm, J. 2010. Screening for bovine leukocyte adhesiondeficiency,deficiencyofuridinemonophossynthase,complexvertebral malformation, bovine citrullinaemia, and factorXI deficiency inHolstein cows rearedinTurkey.Acta.VeterinariaScandinavica.52:56

Kriegesmann,B.,Jansen,s.,BaumgartnerB.G.andBrening,B.1997.Partialgenomic structureofthebovineCD18geneandtherefinementoftestforbovineleukocyte adhesiondeficiency.J.DairySci.80:2547-2549

Nagahara,H.,TamotoK.,Noda,H.andKociba,G.J. 1995.Expressionand roleof adhesionmoleculeCD18onbovineneutrophils.Can.J.Vet.Res.59:1-7

NorouzyA.,Nassiry,M.R.,Eftekharishahrody,F.,Javadmanesh,A.,MohammadAbadi, M.R.andSulimova,G.E.2005. Identificationofbovineleukocyteadhesion deficiency(BLAD)carriersinHolsteinBrownSwissAIbullsinIran.Russ.J.Gen. 41(12):1679-1701

Patel,M.,Patel,R.K,Sing,K.M.,Rank,D.N.,Thakur,M.C.andKhan,A.2011.Detection ofgeneticpolymorphisminCD18geneincattlebyPCR-RFLP.WayambaJournal ofAnimalScience.http://www.Wayambajournal.com

Powell,R.L.,Norman,H.D.andCowan,C.M.1996.Relationshipofbovineleukocyte adhesion deficiency with genetic merit for performance traits. J. Dairy Sci. 79:895-899.

Ribeiro,L.A.,Baron,E.E.,Martinez,M.L,andCoutinho,L.L.2000.PCRscreening andallele frequencyofbovine leukocyte inHolsteinandGircattle inBrazil. GeneticsandMolecularBiology,234,831-834

Shuster,D.E.,Kehrli,M.E.JR,Ackermann,M.R.andGilbert,R.O.1992.Identification andprevalenceofageneticdefectthatcausesleukocyteadhesiondeficiencyin Holsteincattle.Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9225-9229

Tainturier,D.,Grobet, L.,Brouwers,B.,Bruyas, J.F.,Fieni,F.,Battut, I., Lecoanet, J.,Douart,A.,Breton,I.andDuclos,P.1995.Observationsonthreecasesof bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD)Revue-deMedecineVeterinaire 146(3):189-195

18


บทคัดย่อ การศึกษาความชุกของโรคไวรัสโบวายน์ไวรัลไดอะเรีย (Bovine Viral Diarrhea: BVD)

ในเขตพื้นที่ปศุสัตว์เขต 1, 2, 3 และ 7 ของประเทศไทย โดยเก็บตัวอย่างเลือดจากฟาร์มโคนมลูกผสม

โฮลสไตน์-ฟรีเชี่ยน 108 ฟาร์ม จำนวน 3,380 ตัวอย่างและเจาะเก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อหูจาก 89 ฟาร์ม

จำนวน2,679ตัวอย่างตรวจแอนติบอดีโดยใช้PrioCHECK®BVDVAbและตรวจแอนติเจนจากเนื้อเยื่อ

หนังหูโดยใช้ PrioCHECK® BVDV AgPIfocus ซึ่งเป็นชุดตรวจอีไลซ่าสำเร็จรูป ของประเทศเนเธอร์แลนด์

ผลการตรวจแอนติบอดีพบว่าพื้นที่ปศุสัตว์เขต7มีจำนวนฟาร์มที่ตรวจพบแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัสบีวีดีสูงสุด

เป็นร้อยละ83.9ขณะที่พื้นที่เขต3,1และ2พบร้อยละ72.0,62.5และ53.6ตามลำดับและพบว่าโคใน

พื้นที่ปศุสัตว์เขต7มีจำนวนโคนมที่ตรวจพบแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัสบีวีดีสูงสุดเช่นกันคิดเป็นร้อยละ30.21

ขณะที่พื้นที่ปศุสัตว์เขต3,1,และ2พบร้อยละ20.05,14.97และ2.86ตามลำดับพบระดับแอนติบอดี

ในฟาร์มที่มี และไม่มีประวัติแท้งลูกหรือลูกตาย ทั้ง 4 เขต เป็นร้อยละ 71.43 และ 64.44 ตามลำดับ

และพบระดับแอนติบอดีในกลุ่มแม่โคโคสาวและลูกโคเป็นร้อยละ20.79, 10.88และ10.36ตามลำดับ

สำหรับผลการตรวจแอนติเจนเนื้อเยื่อหนังหู ในระดับฟาร์มพบในฟาร์มของพื้นที่ปศุสัตว์เขต 2, 3 และ 7

คิดเป็นร้อยละ4.5,5.6และ6.9ตามลำดับแต่ไม่พบในพื้นที่ปศุสัตว์เขต1อัตราการพบในโคเพศเมียของ

พื้นที่ปศุสัตว์เขต2,3,และ7เป็นร้อยละ0.2,0.2,และ0.2ตามลำดับไม่พบในโคของพื้นที่ปศุสัตว์เขต1

และตรวจพบแอนติเจนเฉพาะในฟาร์มที่มีประวัติแท้งลูกหรือลูกตาย เป็นร้อยละ6.45 โดยพบแอนติเจนใน

กลุ่มแม่โคโคสาวเป็นร้อยละ0.11,0.52ตามลำดับไม่พบในลูกโคผลจากการศึกษาครั้งนี้จะเป็นประโยชน์

ในการวางมาตรการควบคุมและกำจัดโรคบีวีดีไม่ให้แพร่กระจายต่อไป

คำสำคัญ:โบวายน์ไวรัลไดอะเรียไวรัสบีวีดีโคนมแอนติบอดีแอนติเจน

ไกรวรรณ หงษ์ยันตรชัย1 อรุณ จันทร์กระจ่าง1 พรรณพิไล เสกสิทธิ์2

1ศูนย์วิจัยการผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพสระบุรี จ. สระบุรี 2สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ จ. ปทุมธานี 12000

ระดับแอนติบอดีของเชื้อโบวายน์ไวรัลไดอะเรียและอุบัติการณ์เกิดโรคในโคในพื้นที่ปศุสัตว์เขต123และ7ของประเทศไทย

19


Abstract AprevalencestudyofBovineViralDiarrhea(BVD)bydetectingBVDVantibodiesand

antigensincattlewasconducted.Atotalof3,380bloodand2,679earnotchtissuesamples

werecollectedfromfemalecrossbredHolstein-Friesianof108farmsintheareasofLivestock

Region(LR)1,2,3and7ofThailand.Thebloodsampleswerescreenedforantibodiesagainst

BVDVusingELISAtestkit:PrioCHECK®BVDVAb,whileearnotchtissuesamplesweretested

forBVDVantigensusingPrioCHECK®BVDVAgPIfocus.ResultsofBVDVantibodyprevalence

showedthatthefarmsinLR7hadhighestseroprevalenceof83.9%followedbyLR3,1,2,

(72%,62.5%and53.6%,respectively).Thenumberofcattlewithseroprevalencewasalso

highestinLR7(30.21%)followedbythesamesequenceofLR3,1,2,(20.05%,14.97%and

2.86%,respectively).Inaddition,thefarmswithhistoryofabortionhadhigherseroprevalence

thanthosewithouthistoryones(71.43%and64.44%,respectively).Whilecowshadhigher

seroprevalencethanheifersandcalves(20.70%,10.88%and10.36%,respectively).Resultsof

BVDVantigensdetectionfrom89farms,therewerepositiveinLR2,3and7(4.5%,5.6%and

6.9%,respectively)butnotinLR1.Whilethenumberofpositiveantigendetectedfrom2,679

cattleinLR1,2,3and7were0%,0.2%,0.2%,and0.2%,respectively.Thepositiveantigen

wasdetectedonlyinthefarmswithabortionhistory(6.45%)butnot inthefarmswithout

abortion.Thepositiveantigensprevalenceincows,heifersandcalveswere0.11%,0.52%and

0%,respectively.Thisstudyprovidesbeneficialinformationfordairycattlereproductiveherd

healthmanagementplanningandBVDpreventionprogram.

Keywords:Bovineviraldiarrhea,BVDV,cattle,antibody,antigen

Kriwon Hongyuntarachai1 Arun Chungrachang1 Panpilai Sekasiddhi2

1Saraburi Artificial Insemination and Biotechnology Research Center, Saraburi 182602The Bureau of Biotechnology in Livestock Production,

Department of Livestock Development, Pathumthani.

SeroprevalenceagainstBovineViralDiarrheainCattlein4LivestockRegionsofThailand

20


Introduction InThailand,artificialinseminationactivitymainlysupportedbytheBureauofBiotechnology inLivestockProduction(BBLP)hastakenamajorroleinlivestockimprovementespeciallyindairycattle.Normally,dairyfarmersprefertogethighproductionbygainingacalf/yearandminimizingday-openperiod.Somecowsabortedatthefirst3monthsorthe3monthsof midtermoratthelate3monthsofgestationperiod.Theabortionsincludedearlyembryonicdeathandmummification.Anycowthathadanearlyembryonicdeathcouldbeonheatasusual.Asaresult,theownermightthinkaboutinfertilityproblemoranaccidentincaseofabortion.Somenewborncalvesdiedofweaknesswithunknowncause.Therefore,infectiousdiseasesthoseresultinabortion,forexample,bovineviraldiarrhea(BVD)shouldnotbeexcluded.

TheBVDV,distributedworldwide, isaheterogeneousgroupofvirusesbelongingtogenuspestivirus,familyflaviviridae(Becheretal.,2002).Itexistsasacytopathogenic(CP)andnoncytopathogenic(NCP)biotype,basedonthepresenceorabsenceofvisiblecytopathiceffectsinthecellculture(Dubovi,1990).Fetusesinfectedwithnon-cytopathogenicbiotypeofBVDVintheperiodofbetween30to120daysofgestationdevelopimmunetoleranceandwillbepersistentlyinfected(PI).ThesePIcalvesarehighlysusceptibletootherdiseases.AsthePIanimalshaveveryhighandpersistentviremia,consequently,theywereprimaryreservoirofBVDVandcandisseminateinfectionbysheddingthevirusthroughnasaldischarge,saliva,semen,urine,feces,tearandmilk(Brock,1995).

ThereisnoadequateinformationaboutprevalenceofBVDVpersistencyinThailand. Therefore, the present study was aimed to survey the prevalence of PI animals among HolsteindairycattleherdsintheLivestockRegion1st,2nd,3rdand7thofThailand.Thedesignof effectivecontrolanderadicationstrategydependsontheknowledgeofepidemiologicalparameters,includingtheprevalenceofPIanimalswhichreflectedfromtheantibodyandantigendetection.

MaterialandMethods Thestudycomprisedof22monthsperiodfromOctober2009–July2011.Atotalof3,380animalsfrom108farmsintheLivestockRegion1st,2nd,3rdand7thnon–vaccinatedwithanyBVDvirusvaccines,wererandomlypurposivesampling.Bothserumandearnotchbiopsysamplesweretakenfromeachanimalthathashistoryrecordsuchasabortion,bearing weakcalfandinadditionwithcompletehistory:age,breedoftheanimals,totalnumberofanimalsonafarm,pregnancystatus,andpreviousdiseases.Thebloodsampleswereanalyzed forthepresenceofBVDVantibodiesusinganELISAtestkit,PrioCHECK®BVDVAb,whileearnotchtissuesamplesweretestedforBVDVantigensusingPrioCHECK®BVDVAgPIfocusattheBBLPcentrallab,Pathumthaniprovince.Thekitdetectedthehighlystablevirusprotein,

21


whichwassecretedextracellularlyduringvirusreplication.Thesensitivity(Se)andspecificity (Sp) of the testswere 98% and 99% forBVDV antibodies, 100% and 99.4% forBVDV antigens,respectively,asindicatedbythemanufacturer.

Statisticanalysis.Alldatawerecalculatedinto4aspectsasfollows;

1. Theprevalence=numberofinfectedcattle

2. PercentageoffarmswithpositivetoBVDVantibodies

3. Percentageofheadsofcattlewithpositiveantibodies

4. PercentageoffarmsandheadsofcattlewithpositivetoBVDVantigen

Results Table 1 showed that a total of 3,380 cows within 108 dairy cattle herds in the LivestockRegion1st,2nd,3rdand7ththerewere108farms(68.5%)positivetoantibodyagainstBVDV.Amongthosefarmsintheregions,itwasfoundthatfarmsinLR7thhadthehighestantibodyprevalenceof83.9%,followedbythe,farmsintheLR3rd,1stand2nd(72%,62.5%and53.6%,respectively).Alsotheprevalenceofcattle(heads)inLR7thhavingtheantibodywashigher(30.21%)thanthatofcattleinLR1st(14.97%),2nd(2.86%)and3rd(20.05%).

Table2showedthatthecowshadthehigherprevalenceofserumantibody(20.79%)thanheifers(10.88%)andyoungcalves(10.36%)

Table3showedthedetectionofBVDVantigenfromearnotchbiopsysamplesof4LivestockRegions,byPrioCHECK®BVDVAgPIfocusELISAtestkit.Itwasfoundthattherewere4infectedfarmslocatedinLR2nd(1farms),LR3rd(1farms),andLR7th(2farms).ThefarmshavingprevalenceofabortionwerefoundBVDVantigenpositivetestat6.45%.WhiletherewerenoprevalenceBVDVantigenpositiveinthefarmswithoutprevalenceofabortion.

Table4showedthatoutof1,849cowsand389heifers,BVDVantigendetectionwaslowerincowsthanheifers(0.11%and0.52%,respectively).WhereastherewasnoBVDVantigenpositivein441samplesfromcalves.

Table 5 showed status of farms and cattle with positive antibody detected byPrioCHECK®BVDVAbandpositiveantigenbyPrioCHECK®BVDVAgPIfocus.Thereare4farmsand4cattlewithantigenpositive,2farmsinLR7,onefarmLR3andLR2.Farm1-3hadhighantibodyprevalence(83.9%,97.6%and97.1%,respectively)inallcattleand6-12monthscattle(100%,75%and100%, respectively),except for farm4 thathad lowantibodyandantigenprevalence(8.3%and0%,respectively).Mostofthecattlethatpositiveantigendetection(3/4),hadnegativeantibody.

numberofcattleexamined

22


DiscussionandConclusion ThedetectionofBVDVantigenandantibodyhadbeendoneinfarmlevelandcattlein4importantLivestockRegions.TheresultsshowedthatthefarmsintheLivestockRegion7th(LR7)hadhighestprevalenceofbothBVDVantibodyandantigen.PhysicallytheLR7oc-cupiedlargeareawiththemostcongestedfarmsandpopulationofdairycattle(DLD,2012).Aiumlamaietal.(1992)reported4.4%prevalenceofBVDVantibodyfrombulkmilktanksofdairyfarmsintheMuaglekarea,whileVirakuletal.(1997)reportedat15.8%,39.6%32.9%and11.2%inLR1,2,3,and7,comparedwiththisreport(Table1)at62.5%,53.6%,72.0%and83.9%respectively,inthesameregions.The2reportsshowedthatBVDVspreadedrapidlyinallstudiedregions.Everycattleinthisstudywerenon-vaccinatedherd.Therefore,theantibody,foundineverycattlewasactiveimmunity.Howevertheantibodyofcalvesmightbethepassiveimmunederivedfromtheirdamsorbetheimmunityproducingbythemselveswhentheywere125daysembryofacingtheBVDV(Kampa,2008).ItisdifficulttopreventandcontrolBVDdiseaseeffectively.ThereforetheoutbreakofBVDdiseasecanhappenrapidlyandwidely.

The antibody prevalence was not so different between farms with and without abortions (71.43% vs. 64.44%).So, BVDV antibodymight not influence on abortion. It is generallyconsideredthatserologicallypositive;nonviremiccattleare‘safe’,providingthattheyarenotpregnant(Drew,2008).

FromTable2,accordingtopositiveantibodyprevalenceofcows,heifersandyoungcalves(20.79%,10.88%and10.36%)comparedtothestudyofAjariyakhajornetal.(2000)inmilkingcows,drycows,heifersandcalves(66.1%,82.4%,54.2%and43.3%,respectively).Thepositiveantibodyprevalencewasthesamesequencebyadultcattlehadhighestantibodyprevalence,thenheifersandcalves.Transmissionismostefficientbydirectcontact.However,as infectionshavebeenobserved inclosed,non-pasturingherds,othertransmissionroutesseemlikelytohavesomepracticalimportance,DifferencesinBVDVprevalenceamongregionsorintroductionofvirusinherdspreviouslyfreeofBVDVareoftenassociatedwithparticularepidemiologicaldeterminantssuchascattlepopulationdensity,animaltradeandpasturingprac-tices(Houe,2003).

Inthisstudy,thetotalprevalenceofantigendetectionfiguresfromfarmsandcattlewere4.5%and0.1%respectively(Table3).Thestatusofantigenpositivecattlewasacute infectiousorPIcattle.PIcattlearethemainsourcefortransmissionofthevirus.However,acutelyinfectedcattleaswellasotherruminants,eitheracutelyorpersistentlyinfected,maytransmitthevirus(Houe,2003).Ingenerally,therewere1-2%PIcattlewithinthecattlepopulationandsuchanimalshadnoorlowantibodiestoBVDV(Drew,2008).Groom(2005)reportedthathighBVDVtiterinnon-vaccinatedcalves6-12monthofagehadbeenshowedtobeareliable

23


indicatorthatcattlepersistentlyinfectedwithBVDVwerepresentintheherd.SinceBVDVantigenwasfoundinonlyfarmsthathadabortion(6.45%)butnotinthefarmswithoutabortion.ItmightbeconcludedthatBVDVisoneofthecausesofabortionsonthosefarms.

Fromtable4,therewasnopositiveantigendetectioninyoungcalves, inconsistentwithpositiveantibodyintable2.Itmightbeduetothelastlongingofmaternalantibodyincolostrumswhichcouldbelastedfor13monthsforBVD(Virakuletal.,1997).Coriaand McClurkin(1978)studiedthedurationofactiveandcolostrum-derivedpassiveantibodiestobovineviraldiarrheavirusin14calves.FivecalvesbornwithactivelyinducedantibodiestoBVDVretainedhightitersduringtheyearofobservation.Colostrum-derivedantibodiestoBVDVinninecalvesdeclinedatanexpectedrateforthefirstfourtosixmonthsofage.However,titersofsixof thesecalves increasedatfive toeightmonthsofageandeither remained constantorincreasedthroughoneyearofage.

Fromtable5,mostofthefarms(3outof4)hadhighprevalenceofBVDVantibodies(83.9%,97.6%and97.1%),butonlyfarm4thatlocatedinLR2ndhadlowprevalence(8.3%).Itmightbeduetothefirstinfectioninthefarm,theimmunityinthecowcoulddevelopatthethirdweekafterinfection,stablein10th-13thweekthenalittledeclineandstillinlonglife(Kampa,2008).The12-yearoldcowwithpositiveantibodyandantigenandhistoryofrepeatbreedwasstillpregnancyat3.5months(Farm1),accordingtoDrew(2008)reportedthatthedamwouldoftenhavehighantibodytitres(›1/2000)toBVDV,whichwassuggestionoffetalinfectionandwasprobablyduetothefetusprovidingthedamanextendedchallengeofvirus.Theproblemmightoccurwhentheantigenpositivepregnantcowinfarm1mightserveasreservoiranimalthathadapotentialtotransferringBVDVtoherfetusorothercattleonfarm(MoenningandLiess,1995).Mostofthe6-12monthcattle(farm1,2and3)hadhighprevalenceofantibodyagainstBVDV(100%,75%and100%,respective).Thehighantibodyinnonvaccinatedyoungcalvesagedat6-12monthsindicatedviruspersistencyinherds(Groom,2005).

Basedontheresultsobtainedfromthisstudy,antibodiesprevalencecanbefoundincattle,etherinfarmswithorwithoutabortions.However,antigenprevalencewasneitherfoundinfarmswithoutabortionnorincalves.AccordingtothereportsofAiumlamaietal.(1992),Virakuletal.(1997),Kampaetal.(2004)antibodiesprevalencecanbefoundingenerallyandshouldbetestedforPIcattle.WhenBVDVstillcirculatesinthoseareas,itmaycauselossesinThaidairyproductioninthefuture(Kampaetal.,2011).

TogetridofPIbyapropercountry-controlplan,DepartmentofLivestockDevelopmentshouldeducatethedairyfarmers,dairycooperativesandthegovernmentofficersinordertocorporateandinvestigatetheinfectedfarmsandcattle.

24


References Aiumlamai,S.,Alenius,S.andNithichai,K.1992.Prevalenceofantibodiestovarious bovine viruses in bulk tank samples from dairy herds in theMuaglek area. ThaiJVetMed.22:113-120.

Ajariyakhajorn,K.,Boonserm,T.,Inchaisri,C.,Oraveerakul,K.andManeechaiwongse, K.2000.Epidemiologyofbovineviraldiarrheavirus(BVDV)infectioninbulktank milkantibodypositivedairyherds.pp.75-82I.Proceedingsofthe26thVeterinary Medicine and Livestock Development Annual Conference; Miracle Grand Convention,Bangkok,Thailand.

Becher,P.,Thiel,H.J.,Collins,M.,Browlie,J.andOrlich,M.2002.Cellularsequences pestivirusgenomesencodinggamma-aminobutyricacid(A)receptor-associated proteinandGolgi-assosiatedATPaseenhancerof16kilodaltons.J.Virol.76:13069- 13076.

Brock,K.V.1995.Diagnosisofbovineviraldiarrheainfections.Vet.Clin.NorthAm. 11:549-561.

Coria,M.F. and McClurkin,A.W. 1978.Duration of active and colostrum-derived passiveantibodiestobovineviraldiarrheavirusincalves.CanJCompMed. 42(2):239–243.

DepartmentofLivestockDevelopment(DLD),2012.Availablesource:http://dld.go.th/ ict/th/images/stories/stat_web/yearly/2554/gis54/dairy_den54.pdf. Access:September17,2012.

Drew,T.2008.Bovineviraldiarrhea.Availablesource:http://www.oie.int.Access: September17,2012.

Dubovi,E.J.1990.TheDiagnosisofbovineviraldiarrheainfection.Vet.Med.85:1133-1139. Grooms,D.L.2005.DiagnosisofBovineViralDiarrheaVirus:Akeycomponentofa comprehensive BVDV control program. Available source:http://ars.usda.gov/ SP2UserFiles/Place /36253000 /BVD2005/ Produce 2_Grooms_Hout.pdf. Access:September11,2012.

Houe,H.2003.Epidemiological featuresandeconomical importanceofbovinevirus diarrheavirus(BVDV)infections.Vet.Microbiol.93:275-276.

Kampa,J.2004.BVDVandBHV-1InfectionsinDairyHerdsinNorthernandNorth EasternThailand.Actavet.Scand.45:181-192.

Kampa,J.2008.BovineViralDiarrhoea.KKU.Vet.J.18(1):54-67.

25


Kampa,J.,Sigh-na,U.,Kanistanon,K.andAiumlamai,S.2011.Reproductivelossdue to Pestivirus infection in dairy cattle herds in Thailand. Thai J. Vet. Med. 41(4):409-415

Moennig,V.andLiess,B.1995.Pathogenesisofintrauterineinfectionwithbovine viraldiarrheavirus.VeterinaryClinicsofNorthAmerica:foodanimalpractice. 11:477-487.

Virakul,P.,Suadsong,S.,Suwimonteerabutr,J.andSinglor,J. 1997.Prevalenceof infectiousbovinerhinotracheitis(IBR),bovineviraldiarrhea(BVD),parainfluenza –3(PI3)andbovinerespiratorysyncytial(BRS)virusesinThaidairyfarms. ThaiJ.Vet.Med.27(3):295-313.

26


No.farms

BVDpositive(farms)

Prevalence(%)

No.cattle(heads)

BVDpositive(heads)

Prevalence(%)

No.farmsprevalenceofabortion

BVDpositiveinfarms(prevalenceofabortion).

Prevalence(%)infarms(prevalenceofabortion).

No.farmsnoprevalenceofabortion

BVDpositiveinfarms(noprevalenceofabortion).

Prevalence(%)infarm(noprevalenceofabortion).

cows heifers Youngcalves

LR No. positive prevalence No. positive prevalence No. positive prevalence

(head) (head) (%) (head) (head) (%) (head) (head) (%)

LR1st 453 88 19.4 110 10 9.1 132 6 4.5

LR2nd 652 19 1.4 113 4 3.5 109 2 1.8

LR3rd 495 121 24.4 140 13 9.3 163 26 16.0

LR7th 724 255 35.2 152 29 19.1 137 22 16.1

Total 2,324 483 20.79 515 56 10.88 541 56 10.36

theLivestockRegion(LR)

LR1st

24

15

62.5

695

104

14.97

10

6

60.0

14

9

64.29

LR2nd

28

15

53.6

874

25

2.86

15

8

53.33

13

7

53.85

LR3rd

25

18

72.0

798

160

20.05

13

10

76.92

12

8

66.67

LR7th

31

26

83.9

1,013

306

30.21

25

21

84.00

6

5

83.33

Total

108

74

68.5

3,380

595

17.60

63

45

71.43

45

29

64.44

Table 1 TheprevalenceofBVDVantibodydetectedbyandPrioCHECK®Abin3,380cattlefrom

108farmsselectedoutoftheLivestockRegion(LR)1st,2nd,3rdand7th

Table 2 TheprevalenceofAntibodyagainstBVDVinserumofcows,heifersandyoungcalves

selectedoutoftheLivestockRegion1st,2nd,3rdand7thdetectedbyELISAPrioCHECK®BVDV

Ab

27


No.farms

BVDpositive(farms)

Prevalence(%)

No.cattle(heads)

BVDpositive(heads)

Prevalence(%)

No.farmsprevalenceofabortion

BVDpositiveinfarms(prevalenceofabortion).

Prevalence(%)infarms(prevalenceofabortion).

No.farmsnoprevalenceofabortion

Prevalenceinfarms(noprevalenceofabortion).

BVDpositive(%)infarm(noprevalenceofabortion).

cows heifers Youngcalves

LR No. positive prevalence No. positive prevalence No. positive prevalence

(head) (head) (%) (head) (head) (%) (head) (head) (%)

LR1st 379 0 0 82 0 0 120 0 0

LR2nd 429 1 0.2 82 0 0 86 0 0

LR3rd 378 0 0 96 1 1 115 0 0

LR7th 663 1 129 1 0.8 120 0 0

Total 1,849 2 0.11 389 2 0.52 441 0 0

theLivestockRegion(LR)

LR1st

20

0

0

581

0

0

10

0

0

10

0

0

LR2nd

22

1

4.5

597

1

0.2

15

1

6.67

7

0

0

LR3rd

18

1

5.6

589

1

0.2

13

1

8.33

5

0

0

LR7th

29

2

6.9

912

2

0.2

25

0

8.00

4

0

0

Total

89

4

4.5

2,679

4

0.1

6326

6.45

26

0

0

Table 3 TheprevalenceofBVDVantigendetectedbyPrioCHECK®AgPIfocus fromearnotch

samplesselectedoutoftheLivestockRegion(LR)1st,2nd,3rdand7th

Table 4 The prelalence of BVDV antigen from ear notch samples of cows, heifers and

youngcalvesselectedout of theLivestockRegion 1st, 2nd, 3rd and7th detectedbyELISA

PrioCHECK®AgPIfocus

28


Table 5 StatusoffarmsandcattlewithpositiveantibodydetectedbyPrioCHECK®BVDVAb

andpositiveantigenbyPrioCHECK®BVDVAgPIfocus

Farm1inLR7

Farm2inLR7

Farm3inLR3

Farm4inLR2

Farm

47/56(83.9%)*

40/41(97.6%)*

34/35(97.1%)*

3/36(8.3%)*

Positiveantibody

prevalenceinadult

cattle

11 112yearsoldcowwith3.5

monthpregnancy,repeat

breederandpositiveantibody

detection

12 22.5years,positiveantigen

butnegativeantibodyheifer.

13 33years,positiveantigen

butnegativeantibodyheifer.

14 48yearsoldscow,repeat

breeder,postantigenbut

negativeantibody.

Nopositive

antigencattle

1/1(100%)*

3/4(75%)*

5/5(100%)*

0/0(0%)

Positiveantibody

prevalencein

6-12mo.cattle

*No.ofpositive/Totalno.inthefarm(%)

29


บทคัดย่อ วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้เพื่อเปรียบเทียบขนาดฮอร์ โมน เอฟ เอส เอช (FSH; Follicle

stimulatinghormone)2ระดับคือ150และ200มิลลิกรัมในการกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ในโคพื้นเมือง

อสีานโคให้ตวัออ่นเปน็โคพืน้เมอืงอสีานที่มีสขุภาพแขง็แรงสมบรูณ์และมีวงจรการเปน็สดัปกติอายุประมาณ

3-5 ปี นํ้าหนักระหว่าง 250-350 กิโลกรัม ทำการเหนี่ยวนำการเป็นสัดด้วยฮอร์ โมนโปรเจสเตอร์ โรน

ชนิดสอดในช่องคลอด (CIDR-B®) และกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ โดยใช้ฮอร์ โมน FSH (Folltropin-V®,

Australia) แบ่งกลุ่มแม่โคแบบสุ่มเป็น2กลุ่มๆละ5ตัว วางแผนการทดลองแบบcrossover design

ทำซ้ำ 4 ครั้ง โคกลุ่มที่หนึ่ง ใช้ฮอร์ โมน FSH ขนาด 150 มิลลิกรัม ต่อตัว และกลุ่มที่สอง ใช้ฮอร์ โมน

FSHขนาด200มิลลิกรัมต่อตัวโดยฉีดเข้ากล้ามเนื้อเช้า-เย็นห่างกัน12ชั่วโมงและฉีดติดต่อกันแบบ

ลดขนาดลงทุกวันเป็นเวลา3วันร่วมกับการฉีดพรอสต้าแกรนดิน (Estrumate,NewZealand)ขนาด

500 ไมโครกรัม เข้ากล้ามเนื้อบันทึกเวลาและอาการเป็นสัดหลังจากนั้นผสมเทียมในแม่โคตัวให้พร้อมกับ

ฉีดฮอร์ โมน gonadotrophic releasing hormone (Receptal®, Germany) ขนาด 100 ไมโครกรัม

เข้ากล้ามเนื้อผลการทดลองในกลุ่มที่ 1ได้อัตราการเก็บตัวอ่อนได้80%(76/95)เป็นตัวอ่อนที่มีคุณภาพ

ย้ายฝากได้(เกรดA,B,C)จำนวน35ตัวอ่อนเฉลี่ย(mean±SE)2.00±1.6ตัวอ่อน/ตัวแม่โคในกลุ่ม

ที่2ได้ตัวอ่อนที่มีคุณภาพย้ายฝากได้(เกรดA,B,C)จำนวน26ตัวอ่อนเฉลี่ย1.53±1.48ตัวอ่อน/ตัว

อัตราการเก็บตัวอ่อนได้66.31%(63/95)ขนาดฮอร์ โมนFSH150และ200มิลลิกรัมให้จำนวนCL

เฉลี่ย(mean±SE)ต่อตัว(5.94±2.14และ5.6±1.00)และจำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้ไม่แตกต่างกันอย่าง

มีนัยสำคัญทางสถิติ (P>0.05) จำนวนตัวอ่อนเกรด A, B, C และ D+UFO ไม่มีความแตกต่างอย่างมี

นัยสำคัญระหว่างกลุ่มที่ 1 และ2คือ เกรดA= 1.29±1.08และ 1.0±0.47, เกรดB=0.53±0.44

และ0.13±0.07,เกรดC=0.24±0.22และ0.18±0.16,D+UFO=1.88±1.25และ1.76±1.57ตามลำดับ

(P>0.05)ผลการศึกษานี้แสดงว่าขนาดฮอร์ โมนFSH150มิลลิกรัมหรือ200มิลลิกรัมให้ผลไม่แตกต่าง

กันอย่างมีนัยสำคัญต่อการตอบสนองต่อฮอร์ โมนสำหรับกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ในโคพื้นเมืองสายอีสาน

คำสำคัญ:โคพื้นเมืองอีสานฮอร์ โมนเอฟเอสเอชการกระตุ้นเพิ่มการตกไข่

ณรงค์กร เกษมสุข1 อนนท์ เทืองสันเทียะ2 ณรงค์ เลี้ยงเจริญ2 บรรลือ กล่ำพูล2 และมาลี อภิเมธีธำรง3

1 ศูนย์วิจัยการผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพอุบลราชธานี2 ศูนย์พัฒนาเทคโนโลยีการย้ายฝากตัวอ่อน จ.นครราชสีมา

3 สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์กรมปศุสัตว์

ผลของระดับฮอร์โมนเอฟเอสเอชต่อการเพิ่มการตกไข่ในโคพื้นเมืองสายอีสาน

30


Abstract Theobjectiveofthisstudywastocomparetheefficacyofdifferentfolliclestimulating

hormone (FSH)doses;150and200mg.onsuperovulatory response innorth-easternThai

native cattle (Bos indicus). Cyclic donor cows (n = 10) were assigned randomly into 2

treatmentgroups(n=5ineachgroup)withacrossoverdesign,4replications.Theywere3-5

yearsofageandliveweight250-350kg.Estroussynchronizationwasdoneinalldonorswith

CIDR-B®andProstaglandinF2α.ThentheywereinjectedwithFolltropin®-V(FSH)twicedaily

for3daysindecreasingdosesaccordingtoitsdoseassignment,150(Group1)or200mg.

(Group2).OnthelastdayofFSHinjection,PGF2αwasgivenandCIDR-B®wasremoved.

Onstandingheat,cowswereartificialinseminated(AI)withsamefrozensemenbatchofa

north-easternThainativebullandinjectedi.m.with100µggonadotrophicreleasinghormone

(Receptal®, Germany). Numbers of corpora lutea were determined by rectal palpation and

embryoswerecollectedonday7afterAI.DatawereanalyzedbyStudent,sttest.InGroup1,

atotalof35transferableembryos(A,B,Cgrades=2.00±1.6,mean±SE)werecollected,

forarecoveryrateof80%(76/95).InGroup2,atotalof26transferableembryos(1.53±1.48,

mean±SE)werecollected,forarecoveryrateof66.31%(63/95).Nosignificantdifferencein

thenumbersofCLandtransferableembryos(mean±SE)werefoundbetweenGroup1and

Group2(5.94±2.14and5.6±1.0;2.00±1.6and1.53±1.48,respectively,P>0.05).Therewere

alsonosignificantdifferencesinthenumbersofembryogradeA,B,C,andD+UFObetween

twotreatmentgroups(Agrade=1.29±1.08and1.0±0.47,Bgrade=0.53±0.44and0.13±0.07,

Cgrade=0.24±0.22and0.18±0.16,andD+UFO=1.88±1.25and1.76±1.57,forGroup1and

2,respectively,P>0.05).Thisstudydemonstratedthat150or200mgofFSHdidnotgive

differentresultsonsuperovulatoryresponseinnorth-easternThainativecattle.

Keywords:north-easternThainativecows,FSH,superovulation

Effect of FSH Dosages on SuperovulatoryResponseinNorth-EasternThaiNativeCows

Narongkorn Kasemsuk1 Anone Thuangsanthia2 Narong Liengchareon2 Bunleu Glamphu2 and Malee Apimeteetumrong3

1Ubonratchathani Artificial Insemination and Biotechnology Research Center2Embryo Transfer Technology Research Center

3Bureau of biotechnology in Livestock Production

31


บทนำ โคพื้นเมืองของเมืองไทย จัดเป็นโคกลุ่ม Bos indicus เป็นโคที่เลี้ยงง่าย ใช้งานได้ดี ทนต่อโรค

แมลง อากาศร้อน มีความสมบูรณ์พันธุ์สูง เป็นสัดเร็ว ผสมติดง่าย และให้ลูกอย่างสม่ำเสมอตลอดทั้งปี

ทั้งที่ ไม่ได้รับอาหารที่สมบูรณ์นัก ปัญหาและอุปสรรคในการเลี้ยงโคพื้นเมือง ได้แก่ มีพื้นที่เลี้ยงน้อยลง

ขาดการปรับปรุงพันธุ์ จำนวนประชากรโคลดลง มีการเลี้ยงตัวผู้และตัวเมียรวมกัน ความหลากหลาย

สายพันธุ์ลดลง ทำให้เกิดสายเลือดชิด ลูกเกิดมาแคระแกรนไม่แข็งแรง อีกทั้งผู้เลี้ยงไม่ค่อยเลี้ยงดูและ

เอาใจใส่เกี่ยวกับสุขภาพเท่าที่ควร นอกจากนี้ โคพื้นเมืองมักถูกนำไปผสมกับโคสายพันธุ์ต่างประเทศอื่นๆ

ทั้งพันธุ์เนื้อและนม เพื่อใช้ ในการปรับปรุงพันธุ์ โดยอาศัยข้อดีของโคพื้นเมือง ทำให้โคพื้นเมืองสายพันธุ์

ไทยแท้ๆกลายเป็นโคลูกผสมไปเป็นจำนวนมากและเมื่อผสมกับโคสายพันธุ์อื่นไปหลายๆรุ่นผลที่ตามมาคือ

ระดบัสายเลอืดของโคพืน้เมอืงไทยจะลดนอ้ยลงเรือ่ยๆและในอนาคตอาจหาโคพืน้เมอืงพนัธุ์แท้ของไทยไม่ได้

หากไม่มีการดำเนินงานด้านการอนุรักษ์สายพันธุ์อย่างจริงจังการพัฒนาโคพันธุ์ ใหม่ที่ต้องอาศัยพันธุ์พื้นฐาน

จากพันธุ์พื้นเมืองก็จะกระทำได้อย่างลำบาก

การอนุรักษ์พันธุกรรมสัตว์ สามารถดำเนินการได้สองแนวทางคือ การอนุรักษ์ ในสภาพธรรมชาติ

และนอกสภาพธรรมชาติการอนุรักษ์ ในสภาพธรรมชาติหมายถึงการเลี้ยงดูที่มีการจัดการฝูงการจัดแผน

ผสมพันธุ์เพื่อให้ดำรงสายพันธุ์และรักษาระยะห่างทางพันธุกรรม ซึ่งมีหน่วยงานของกรมปศุสัตว์ดำเนินการ

อยู่ส่วนการอนุรักษ์นอกสภาพธรรมชาติหมายถึงการเลี้ยงดูในสวนสัตว์การเก็บรักษาพันธุกรรมในรูปของ

เซลล์สืบพันธุ์และตัวอ่อนโดยเก็บในสภาพแช่แข็งสามารถนำไปผสมเทียมหรือฝากตัวอ่อนเพื่อให้มีลูกเกิดได้

ในอนาคตทั้งนี้พบว่าอัตราการตั้งท้องจากการผสมเทียมและย้ายฝากตัวอ่อนไม่แตกต่างกันเมื่อตรวจณวัน

ที่28หลังการเป็นสัด(Demetrio,2007)ปกติโคพื้นเมืองของไทยจะถูกเลี้ยงอยู่กระจายทั่วประเทศมีหลาย

ชื่อเรียกมักเรียกชื่อตามถิ่นที่อยู่เช่นโคขาวลำพูนโคพื้นเมืองสายอีสานโคพื้นเมืองภาคใต้โดยจะมีลักษณะ

ปรากฏตา่งกนักรมปศสุตัว์โดยสำนกัเทคโนโลยีชวีภาพการผลติปศสุตัว์ได้เริม่ศกึษาการอนรุกัษ์ โคพืน้เมอืง

ภาคใต้และโคขาวลำพนูโดยเทคโนโลยีการยา้ยฝากตวัออ่น(อนนท์และคณะ,2547;ณรงค์และคณะ,2550)

พบว่าโคทั้งสองสายพันธุ์มีการตอบสนองต่อฮอร์ โมนกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ไม่เท่ากันแม้ว่าจะใช้ขนาดฮอร์ โมน

เท่ากัน(150-200มิลลิกรัมFolltropin-V®,BionicheAnimalHealth(A/Asia)Pty.Ltd.,Australia)

การใช้ขนาดฮอร์ โมนสูงเกินไป (260 มิลลิกรัม) ทำให้เกิดการตอบสนองมากเกินไป (overstimulation)

มีไข่ไม่ได้รับการผสมจำนวนมากและได้ตัวอ่อนน้อยมีรายงานว่าBosindicusมีการตอบสนองต่อฮอร์ โมน

FSH มากกว่า Bos Taurus และสามารถใช้ฮอร์ โมนในขนาดที่น้อยกว่าที่ ใช้ ใน Bos Taurus 25-30%

(Lewis,1992)วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้เพื่อเปรียบเทียบขนาดของฮอร์ โมนFSH2ระดับคือ

200และ150มิลลิกรัมในการกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ในโคพื้นเมืองอีสาน

32


อุปกรณ์และวิธีการ 1. คดัเลอืกแม่โคพืน้เมอืงอสีานที่เปน็ตวัให้ตวัออ่น(Donor)จำนวน10ตวัมีสขุภาพแขง็แรงสมบรูณ์

และมีวงจรการเป็นสัดปกติอายุประมาณ3–5ปีมีน้ำหนักระหว่าง250–350กิโลกรัม

2.แม่โคพื้นเมืองสายอีสานทุกตัว จะได้รับการเหนี่ยวนำการเป็นสัดด้วยฮอร์ โมนโปรเจสเตอร์

โรนชนิดสอดในช่องคลอด (CIDR-B®, InterAg,NewZealand) และกระตุ้นเพิ่มการตกไข่โดยใช้ฮอร์ โมน

FSH (Folltropin-V®,BionicheAnimal Health (A/Asia) Pty. Ltd.,Australia) โดยแบ่งกลุ่มแม่โค

พืน้เมอืงภาคตะวนัออกเฉยีงเหนอืแบบสุม่เปน็2กลุม่ๆละ5ตวัวางแผนการทดลองแบบcrossoverdesign

ทำซ้ำ4ครั้งกลุ่มที่หนึ่งใช้ฮอร์ โมนFSHขนาด150มิลลิกรัมต่อตัวและอีกกลุ่มหนึ่งใช้ฮอร์ โมนFSH

ขนาด200มิลลิกรัมต่อตัวซึ่งจะเริ่มฉีดในวันที่9หลังใส่ฮอร์ โมนโปรเจสเตอร์ โรนชนิดสอดในช่องคลอด

โดยฉีดเข้ากล้ามเนื้อเช้า-เย็นห่างกัน12ชั่วโมงและฉีดติดต่อกันแบบลดขนาดลงทุกวันเป็นเวลา3วัน

3.ในวันที่ 3 ของการฉีดฮอร์ โมนกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ ฉีดสารพรอสต้าแกรนดิน (Estrumate®,

Cloprostenol,Schering-PloughAnimalHealth,NSW,Australia) ขนาด2ml. (500 ไมโครกรัม)

เข้ากล้ามเนื้อเช้า-เย็นร่วมกับการถอดฮอร์ โมนโปรเจสเตอร์ โรน

4.บันทึกเวลาและอาการเป็นสัด หลังจากนั้นผสมเทียมในแม่โคตัวให้ จำนวน 4 ครั้ง ห่างกัน

12ชั่วโมงโดยใช้น้ำเชื้อแช่แข็งของพ่อพันธุ์ โคพื้นเมืองที่ผ่านการทดสอบคุณภาพหลังการละลายแล้วพร้อม

กับฉีดฮอร์ โมนgonadotrophicreleasinghormone(Receptal®,IntervetInternationalB.V.,Holland)

ขนาด100ไมโครกรัมเข้ากล้ามเนื้อให้กับแม่โคตัวให้หลังจากผสมเทียมครั้งแรก

5.ในวนัที่7หลงัอาการสดัลว้งตรวจและบนัทกึการตอบสนองตอ่การกระตุ้นการตกไข่โดยการนบั

จำนวนคอร์ปัสลูเทียม (Corpus lutium : CL) บนรังไข่ทั้ง 2 ข้าง จากนั้นทำการเก็บตัวอ่อนจากแม่โค

ตัวให้ โดยใช้น้ำยาชะล้างตัวอ่อน (Emcare®, Har-vet, New Zealand) ชะล้างตัวอ่อนออกจากปีกมดลูก

ทั้ง 2 ข้าง ด้วยน้ำยาข้างละ 500 ml. โดยใช้ชุดสายยางสำหรับชะล้างตัวอ่อน (flushing set) ต่อกับ

ท่อสวนตามวิธีของSaito(1994)และปล่อยน้ำยาไหลผ่านถ้วยกรองตัวอ่อน

6.นำถ้วยกรองตัวอ่อนไปตรวจหาตัวอ่อน และประเมินคุณภาพตัวอ่อนภายใต้กล้องจุลทรรศน์

สเตอริโอ บันทึกจำนวน และคุณภาพตัวอ่อนที่เก็บได้ โดยการประเมินคุณภาพตัวอ่อนที่เก็บได้ ตามวิธีของ

LinderและWright(1983)ตามรายละเอียดดังนี้

เกรด A ตัวอ่อนคุณภาพดีมาก มีพัฒนาการปกติ ลักษณะของเซลล์ตัวอ่อนหรือบลาสโตเมียร์

ต้องเป็นทรงกลมเกาะกันแน่นไม่มีเซลล์แตก

เกรด B ตัวอ่อนคุณภาพดี มีพัฒนาการปกติ ลักษณะของตัวอ่อนเป็นทรงกลม มีบางเซลล์

แยกออกจากเซลล์กลุ่มใหญ่10-20%ของเซลล์ทั้งหมด

เกรด C เป็นตัวอ่อนคุณภาพพอใช้ตัวอ่อนอาจมีรูปร่างเป็นทรงกลม มีการเสื่อมของเซลล์ประมาณ

30-40%

33


เกรดDเป็นตัวอ่อนที่มีการเสื่อมสลายของเซลล์มากมีเซลล์ที่ยังเกาะแน่นต่ำกว่า40%หรือ

เป็นตัวอ่อนที่มีพัฒนาการช้ากว่าปกติและหยุดเจริญหรือไข่ที่ยังไม่ได้รับการผสม(UFO;unfertilizedova)

ตัวอ่อนเกรด A, B และ C เป็นตัวอ่อนคุณภาพที่สามารถนำไปฝากให้ตัวรับได้ (Transferable

embryo)และตัวอ่อนเกรดAและBเป็นตัวอ่อนที่นำไปแช่แข็งได้

7. รวบรวมผลการดำเนินการและนำข้อมูลไปวิเคราะห์ผลโดยใช้Student’sttest

ผลการทดลอง ตารางที่ 1 (Table 1) แสดงจำนวนCLที่ตรวจพบบนรังไข่ จำนวนตัวอ่อนคุณภาพดีย้ายฝากได้

จำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้ทั้งหมดตารางที่2เปรียบเทียบจำนวนCLที่ตรวจพบจำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้เกรด

ต่างๆกันจำนวนตัวอ่อนคุณภาพดีที่ย้ายฝากได้ต่อตัว/ครั้ง

a = ตัวเลขที่มีตัวอักษรกำกับเหมือนกันในคอลัมน์เดียวกันคือไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่

ระดับความเชื่อมั่น95%

Dataareshownasmean±SE.

UFO:unfertilizedova

Transferableembryos:ตัวอ่อนเกรดA,BและC

ผลการทดลอง ไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (P>0.05) ของ จำนวน CL ที่ตรวจพบ

จำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้จำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้เกรดA,B,C,D-UFOและตัวอ่อนที่คุณภาพที่ย้ายฝากได้

(Transferableembryos,A+B+Cgrades)

FSHLevel No. No. No.recoveredova/embryo %Recoveryrate

session (range) (range)

150mg 16 95(3-17) 76(0-11) 80.0%(76/95)

200mg 17 95(3-17) 63(0-13) 66.3%(63/95)

FSHmg CL A B C D+UFO transferable

(n) embryos

150(n=16) 5.94±2.14a 1.29±1.08a 0.53±0.44a 0.24±0.22a 1.88±1.25a 2.00±1.6a

200(n=17) 5.6±1.00a 1.0±0.74a 0.13±0.07a 0.18±0.16a 1.76±1.57a 1.53±1.48a

Table 1 EffectsofFSHonCLandembryonumbers

Table 2 Effects of FSH on CL number and embryo quality

34


วิจารณ์ จากการศึกษาครั้งนี้ พบว่าจำนวน CL ที่ตรวจพบไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ (P>0.05)

ในโคพื้นเมืองอีสานที่ ได้รับฮอร์ โมน FSH ขนาด 150 หรือ 200 มิลลิกรัม ตัวอ่อนคุณภาพที่ย้ายฝากได้

(Transferableembryos,จำนวนรวมตัวอ่อนเกรดA,BและC)จากทั้ง2กลุ่ม (Table2)ก็ให้ผลไม่

แตกต่างกันทางสถิติ(เฉลี่ย2.00±1.60และ1.53±1.48ตัวอ่อน)ที่ระดับความเชื่อมั่น95%(P<0.05)

อยา่งไรกต็ามมีแนวโนม้ที่การใช้FSHขนาด150มลิลกิรมัจะได้จำนวนตวัออ่นคณุภาพที่ยา้ยฝากได้มากกวา่

การใช้FSH200มลิลกิรมัซึง่อาจเกดิจากการที่ โคพืน้เมอืงอสีานมีนำ้หนกัตวันอ้ยการใช้FSHปรมิาณเทา่กบั

โคสายพันธุ์อื่นอาจจะกระตุ้นรังไข่มากเกินไป เช่นเดียวกับรายงานของ Barati et al. (2006) รายงานว่า

FSHขนาด250มิลลิกรัมทำให้รังไข่ได้รับการกระตุ้นมากเกินไปและมีจำนวนฟอลลิเคิลที่ ไม่มีการตกไข่

จำนวนมากและรายงานของBarrosetal.(2003)ที่พบว่าขนาดฮอร์ โมนFSH200มิลลิกรัมมีแนวโน้ม

ให้ผลจำนวนตัวอ่อนคุณภาพดีมากกว่าขนาด 120 มิลลิกรัม แต่เมื่อทดลองใช้ขนาด 250 มิลลิกรัม

พบว่าทำให้มีการตอบสนองมากเกินไป (overstimulation) จากจำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้ซึ่งแยกตามคุณภาพ

ของตัวอ่อนคือเกรดA,B,C,D+UFOและTransferableแสดงในตารางที่2ซึ่งจะเห็นว่าจำนวนตัว

อ่อนในกลุ่มคุณภาพA,B,CและD+UFOไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มที่1และ2

คือเกรดA=1.29±1.08และ1.0±0.47,เกรดB=0.53±0.44และ0.13±0.07,เกรดC=0.24±0.22

และ0.18±0.16,D+UFO=1.88±1.25และ1.76±1.57ตามลำดับ(P>0.05)

พบว่าจำนวนCLที่ตรวจพบทั้งจากการใช้FSHขนาด150และ200มิลลิกรัม(5.94±2.14

และ5.6±1.00)ต่ำกว่าในรายงานของโคขาวลำพูน(ณรงค์และคณะ,2549)และแตกต่างกันกับรายงาน

การใช้ ในโคพืน้เมอืงภาคใต้(ชาญยทุธและคณะ,2551)โดยใช้ขนาดฮอร์ โมนเทา่กนัจงึเปน็ไปได้วา่รงัไข่ของ

โคพื้นเมืองอีสานอาจจะมีการตอบสนองต่อฮอร์ โมน FSH ต่างจากโคขาวลำพูนและโคพื้นเมืองภาคใต้หรือ

อาจมาจากปัจจัยด้านอื่นเช่นน้ำหนักตัวหรือสภาพแวดล้อม และเมื่อเปรียบเทียบกับโคสายพันธุ์ยุโรปตาม

รายงานของ Hasler (1992) ที่ว่าโคในกลุ่ม Bos indicus ให้การตอบสนองมากกว่า Bos taurus เมื่อ

เหนี่ยวนำการตกไข่โดยใช้FSHในปริมาณเท่ากันทั้งได้ด้านปริมาณตัวอ่อนและคุณภาพตัวอ่อน

พิจารณาจากอัตราการเก็บตัวอ่อนได้(Recoveryrate,Table1)ทั้งสองกลุ่มคือFSH150และ

200มิลลิกรัมคือ80%(76/95)และ66.3%(63/95)ใกล้เคียงกับรายงานในโคพื้นเมืองSistanicattle

(Bosindicus)ของอิหร่าน(Baratietal.,2006)ที่ ได้อัตราการเก็บเฉลี่ย61-84%เมื่อให้ฮอร์ โมนFSH

ขนาด160-200มิลลิกรัมในขณะที่มีตัวอ่อนคุณภาพที่นำไปย้ายฝากได้(รวมเกรดA,B,C)จำนวน35

และ26ตัวอ่อน(Table1)นับว่าได้น้อยกว่า50%เมื่อเทียบกับจำนวนไข่และตัวอ่อนที่เก็บได้ทั้งหมดคือ76

และ63ใบ/ตัวอ่อน(FSH150มิลลิกรัมได้46.1%,35/76และFSH200มิลลิกรัมได้41.3%,26/63)

ทั้งนี้อาจมีสาเหตุจากคุณภาพของน้ำเชื้อแช่แข็งมีความแปรปรวนมาก การทดลองครั้งนี้ ใช้น้ำเชื้อโคพื้นเมือง

อสีาน100%ซึง่รดีเกบ็มาแลว้นานกวา่สบิปีและมีประวตักิารเปลีย่นสถานที่จดัเกบ็บอ่ยครัง้จากการสุม่ตรวจ

พบอัตราการเคลื่อนที่(motility)15-35%ในชุดการผลิตเดียวกันเพื่อป้องกันความผิดพลาดจากคุณภาพ

35


น้ำเชื้อจึงได้ทำการผสมเทียมให้กับแม่โค 4 ครั้งๆ ละ 2 โด๊ส พร้อมกับสุ่มตรวจคุณภาพน้ำเชื้อก่อนการ

ผสมเทยีมดว้ยในปจัจบุนัมีนำ้เชือ้โคพืน้เมอืงอสีานเหลอือยู่นอ้ยแลว้ดงันัน้หากจะมีการดำเนนิงานยา้ยฝากตวั

อ่อนในโคพื้นเมืองอีสานต่อไปในอนาคต ควรมีการรีดเก็บน้ำเชื้อจากโคพื้นเมืองอีสานเพิ่มเติม เพื่อให้การใช้

ประโยชน์เทคโนโลยีการย้ายฝากตัวอ่อนมีประสิทธิภาพสูงสุด

จากการศึกษาครั้งนี้พบว่าขนาดฮอร์ โมนFSH150มิลลิกรัมให้ผลเทียบเท่าและมีแนวโน้มให้ผล

สูงกว่าขนาด 200 มิลลิกรัม แสดงให้เห็นว่า ปริมาณฮอร์ โมนมาก ก็ไม่ได้ส่งผลดีเสมอไป ซึ่งนับว่ามีข้อดี

เนื่องจากสามารถใช้ฮอร์ โมนในขนาดที่น้อยลงแต่ได้ผลเท่าเทียมกันหรือดีกว่าทำให้ประหยัดค่าใช้จ่ายจาก

การใช้ฮอร์ โมนเหนี่ยวนำการตกไข่เป็นผลดีต่องานอนุรักษ์ โคพื้นเมืองอีสานต่อไป

กิตติกรรมประกาศ คณะผู้วิจัยขอขอบคุณ นายสัตวแพทย์อยุทธ์ หรินทรานนท์ ผู้อำนวยการสำนักเทคโนโลยีชีวภาพ

การผลิตปศุสัตว์ที่สนับสนุนการดำเนินงานนายสัตวแพทย์กมลชนกสร้อยเพชรนายสัตวแพทย์ระดับ

ชำนาญการที่ชว่ยวเิคราะห์ขอ้มลูขา้ราชการและพนกังานราชการของศนูยว์จิยัการผสมเทยีมและเทคโนโลยี

ชีวภาพอุบลราชธานี และศูนย์วิจัยเทคโนโลยีย้ายฝากตัวอ่อน ที่ช่วยให้การศึกษาครั้งนี้สำเร็จได้ด้วยดี

งานวิจัยนี้ ได้รับการสนับสนุนจากสำนักงานคณะกรรมการวิจัยแห่งชาติ(วช.)

เอกสารอ้างอิง ณรงค์เลี้ยงเจริญอนนท์เทืองสันเทียะวิบูลย์เยี่ยงวิศวกูรและมาลีอภิเมธีธำรง2549ผลของ

ขนาดฮอร์ โมนเอฟเอสเอชต่อการเพิ่มการตกไข่และจำนวนตัวอ่อนในโคขาวลำพูนการประชุม

สัมมนา Enhancement Of Reproductive Efficiency and Production of Livestock in

Thailandในโอกาสครบรอบ50ปีงานผสมเทียมในประเทศไทยวันที่14-16ธันวาคม2549

โรงแรมเชียงใหม่ฮิลล์จ.เชียงใหม่

ชาญยุทธกาพลอนนท์เทืองสันเทียะณรงค์เลี้ยงเจริญและมาลีอภิเมธีธำรง2551ผลของ

ขนาดฮอร์ โมนเอฟเอสเอชต่อการเพิ่มการตกไข่และจำนวนตัวอ่อนในโคพื้นเมืองภาคใต้

อนนท์เทืองสันเทียะวิบูลย์เย่ียงวิศวกูรณรงค์เล้ียงเจริญกีรติธิแจ้บุญชูศรีสุขและจุรีย์รัตน์

สำเร็จประสงค์2547การตอบสนองของโคพันธุ์ขาวลำพูนต่อการกระตุ้นการตกไข่การประชุม

วิชาการสัตวแพทย์และการเลี้ยงสัตว์ ครั้งที่ 30 วันที่ 10-12 พฤศจิกายน 2547

กรุงเทพมหานคร

Barros, C.M., Porto, L.P.C., and Noguera, M.F.G. 2003. Dose-response trial in

BostaurusvsBosindicuscowssuperovulatedwithFSH,assiatedwithcontrolled

LHsurgeandfixedtimeartificialinsemination.Theriogenology59:524(abstr.).

36


Barati,F.,Niasari_Naslaji,A.,Bolourchi,M.,Sarhaddi,F.,Razavi,K.,Naghzali,E.and

Thatcher,W.W.2006.SuperovulatoryresponseofSistanicattletothreedifferent

dosesofFSHduringwinterandsummer.Theriogenology.66:1149-1155.

Demetrio,D.G.B.,Santos,R.M.Santos,R.M.,Santos,R.M.,Demetrio,C.G.B.and

Vasconcelos,J.L.M.2007.Factorsaffectingconception rates followingartificial

inseminationorembryotransferinlactatingHolsteincows.J.DairySci.90(11):

5073-5082.

Hasler,J.F. 1992.Currentstatusandpotential of embryo transferand reproductive

technologyindairycattle.J.DairySci.75(10):2857-2879.

Lewis,I.1992.Programmingdonorsandrecipients.In:Embryotransferandpregnancy

diagnosis. NSW: Post Graduate Committee in Veterinary Science, University of

Sydney.pp.69-88.

Linder, G.M. and Wright, R.W. 1983. Bovine embryo morphology and evaluation.

Theriogenology.20:407-416.

Saito, N. 1994. Manual of embryo transfer and in vitro fertilization in cattle.

NationalLivestockBreedingCenter,MAFF,Japan,September.pp.132.

37


บทคัดย่อ การเปรียบเทียบผลของการเสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนที่ระดับความเข้มข้น 5 10 และ15 มิลลิโมล

ในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อโคนม Egg Yolk Tris ต่อคุณภาพของอะโครโซม เยื่อหุ้มตัวอสุจิ และอัตราการมี

ชีวิตของตัวอสุจิภายหลังการแช่แข็งด้วยเครื่องflowcytometerและCASA(computerizedautomatic

semen analyzer) วางแผนการทดลองแบบ RCBD โดยรีดเก็บน้ำเชื้อจากโคนมทรอปิคอลโฮลสไตน์

จำนวน 5 ตัวด้วย Artificial vagina สัปดาห์ละครั้งต่อเนื่องกัน 5 สัปดาห์ ในแต่ละสัปดาห์น้ำเชื้อของ

พ่อพันธุ์ โคนมถูกแบ่งออกเป็น 4 ส่วนตามทรีตเมนต์ที่วางแผนทดลอง ได้แก่ กลุ่มควบคุม เสริมซิสเตอีน

ที่ระดับ 5, 10 และ15 มิลลิโมล ผลการศึกษาคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งด้วยเครื่อง CASA พบว่าน้ำเชื้อที่

เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนทั้ง สามระดับมีอัตราการเคลื่อนที่ของตัวอสุจิร้อยละ 51.62±2.03, 49.12±1.83

และ 47.52±2.43 ตามลำดับ สูงกว่ากลุ่มที่ ไม่เสริมซิสเตอีนอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P<0.05) ซึ่ง

มีอัตราการเคลื่อนที่ร้อยละ 40.03±1.78 ลักษณะการเคลื่อนที่ของอสุจิพบว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริม

กรดอะมิโนซิสเตอีนคือลักษณะ Beat frequency (BCF), Linearity (LIN) และStraightness (STR)

สูงกว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางที่เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P<0.01) ลักษณะ

ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์และโครโซมของอสุจิภายหลังการแช่แข็งพบว่าแตกต่างกันอย่างไม่มีนัยสำคัญ

ทางสถิติ (P<0.05) ผลจากการศึกษาแสดงว่าการเสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ

Egg Yolk Tris สามารถเพิ่มคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งโคนม ซึ่งการเสริมกรดอะมิโนซิสเตอีน 5 มิลลิโมล

มีอัตราการเคลื่อนที่สูงที่สุด ส่วนการเสริมกรดอะมิโนซิสเตอีน 10 มิลลิโมลมีลักษณะความสมบูรณ์ของ

เยื่อหุ้มเซลล์และโครโซมสูงที่สุด

คำสำคัญ:พ่อโคนม,EggYolkTris,ซิสเตอีน

สุดา จันทาสี1 และ จตุพร พงษ์เพ็ง1 1 ศูนย์ผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งพ่อพันธุ์ผสมเทียมลำพญากลาง

ผลความเข้มข้นของ Cysteine ในน้ำยาเจือจาง EggYolkTrisต่อคุณภาพน้ำเชื้อโคนม

38


Abstract ThisstudywasperformedtoevaluatetheeffectofcysteineconcentrationinEggYolk

Trisondairycattlesemenquality.SemenfromfiveTropical–Holsteinbullswerecollectedand

frozenonceaweekforfiveconsecutiveweeks.EachBull´ssemensamplewasaccessed

weeklyfor4treatedgroups:non-cysteinetreated(control)andsupplementtreatedwith5,10

and15mMofcysteine.Percentageofmotilityoffrozen-thawedsemenextenderwithcysteine

treated groups showed highly significant (P<0.05) compared to control group (51.62±2.03,

49.12±1.83,47.52±2.43and40.03±1.78respectively).ForKineticmovementofspermatozoa:

BCFLINandSTR,allcysteinetreatedgroupsshowedhighlysignificant(P<0.01).However

percent of spem membrane and acrosome integrity was not significant different (P>0.05).

TheresultsfromthisstudyindicatedthatcysteinetreatedinEggYolkTrisimprovedafterthaw

motilityofbullspermatozoawhich5mMofcysteineshowedthehighestresponsewhereas

10mMofcysteineshowedthehighestliveacrosomeintact(LAI).

Keywords:dairybull,DFS,EggYolk,Cysteine

Suda Chuntasee1 and Jatuporn Pongpeng1

1 Lamphayaklang Livestock Semen Production Center, Lamsonthi, Lopburi, 15190, Thailand

EffectofCysteineConcentrationsinEggYolkTrisonDairyCattleSemenQuality

39


บทนำ การผสมเทยีมให้เกดิความสำเรจ็นัน้ตอ้งอาศยัปจัจยัหลายประการเชน่การจบัสดัการผสมเทยีมในชว่งเวลาที่เหมาะสมเและคณุภาพนำ้เชือ้แช่แขง็ที่ ใช้ผสมเทยีมเปน็ตน้คณุภาพนำ้เชือ้แช่แขง็มีความสำคญัเนื่องจากมีกระบวนการและขั้นตอนในการผลิตที่ต้องอาศัยเทคนิควิชาการและความชำนาญในการผลิตและควบคุมคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งตั้งแต่ขั้นตอนการรีดเก็บน้ำเชื้อสดจากพ่อโคการตรวจประเมินคุณภาพน้ำเชื้อเบือ้งตน้การควบคมุอณุหภมูิและลดอณุหภมูินำ้เชือ้การเจอืจางนำ้เชือ้การบรรจุในหลอดนำ้เชือ้การแช่แขง็น้ำเชื้อและการตรวจคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็ง(ปริฉัตร,2544)เพื่อให้ได้น้ำเชื้อแช่แข็งที่มีคุณภาพดีมีศักยภาพในการผสมติดดีที่สุด

ในการผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งต้องใช้สารcryoprotectantซึ่งทำหน้าที่ช่วยป้องกันและลดความเสียหายที่เกิดกับอสุจิจากการลดอุณหภูมิในขณะทำการแช่แข็ง (Foote, 1970) สารที่กล่าวถึงนี้ ได้แก่ กลีเซลรอลเป็นต้น ปัจจุบันมีการศึกษาผลของการใช้กรดอะมิโนเพื่อช่วยลดความเสียหายจากกระบวน การแช่แข็งน้ำเชื้อพ่อพันธุ์ ในสัตว์หลายชนิด เช่น น้ำเชื้อกระบือ El-Sheshtawy at el. (2008) ได้ทำการศึกษาพบว่า การเติม glutamine glycine alanine และ cystein ในน้ำยาเจือจางทำให้คุณภาพน้ำเชื้อภายหลังการแช่แข็งดีขึ้น โดยการเติม cysteine ความเข้มข้น 5 mM สามารถรักษาความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มอสุจิ (Membrane Integrity) ได้ดีที่สุดคือ 53.90% น้ำยาเจือจางปกติที่ ไม่ได้เติมคือ 41.10% ส่วนในแกะ Uysaletal. (2007)รายงานว่าการเติมcysteineความเข้มข้น10mMช่วยเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่ และอัตราการมีชีวิตสูงสุดของตัวอสุจิในขณะที่อัตราความผิดปกติของตัวอสุจิต่ำกว่าการไม่เสริมcysteineคือ9.8%เปรียบเทียบกับ30.1%

ดังนั้น การศึกษาเปรียบเทียบคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งโค โดยใช้น้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ egg yolk tris ที่เติมcysteieปริมาณ0mM,5mM,10mMและ15mMเพื่อทำหน้าที่เป็นสารเสริมจะช่วยให้คุณภาพน้ำเชื้อภายหลังขบวนการแช่แข็งมีชีวิตรอดมากขึ้นและมีประสิทธิภาพมากขึ้น

อุปกรณ์และวิธีการการทดลอง

1. รีดน้ำเชื้อพ่อพันธุ์ โคนมทรอปิคอลโฮลสไตน์อายุประมาณ5-6ปีจำนวน5ตัวที่น้ำเชื้อมี ความเข้มข้นของตัวอสุจิไม่น้อย กว่า 500 ล้านตัว/มล. ตัวอสุจิมีชีวิตไม่น้อยกว่า 70% ตัวอสุจิมีความ ผิดปกติส่วนหัว และส่วนหางไม่เกิน 10% และ 5% ตามลำดับ สัปดาห์ละ 1 ครั้ง 5 สัปดาห์ติดต่อกัน โดยใช้โยนีเทียม(ArtificialVagina:AV)

2.ตรวจคุณภาพน้ำเชื้อเบื้องต้นดังนี้ ปริมาตร สี ความหนืด การเคลื่อนไหวหมู่ และตรวจนับ ความเข้มข้นของน้ำเชื้อโดยใช้spectrophotometer(Model:REFZ160,Minitube,Germany)

3.นำน้ำเชื้อมาแบ่งเป็น 4 ส่วนเท่าๆ กัน เจือจางน้ำเชื้อด้วยน้ำยาเจือจาง ให้มีจำนวนตัวอสุจิ 96ล้านตัว/มล.ด้วยน้ำยาเจือจางดังนี้

40


1. น้ำยาเจือจางeggyolktris

2. น้ำยาเจือจางeggyolktrisเสริมcysteine5mM



4.นำน้ำเชื้อที่เจือจางแล้วไปทำการบรรจุและพิมพ์หลอดที่อุณหภูมิ25oCแล้วนำไปลดอุณหภูมิที่4°Cนาน4ชั่วโมง

5.แช่แข็งน้ำเชื้อด้วยเครื่องแช่แข็งน้ำเชื้ออัตโนมัติ(Digitcool5300ZH350&UE350with900 HP programmer French) โดยเรียงน้ำเชื้อบนแท่นเรียงน้ำเชื้อแล้วนำไปวางเรียงในเครื่องแช่แข็ง น้ำเชื้ออัตโนมัติอุณหภูมิ-140°Cนาน6นาทีจากนั้นนำหลอดน้ำเชื้อแช่ในไนโตรเจนเหลวทันทีเมื่อครบ24ชั่วโมงนำมาตรวจคุณภาพน้ำเชื้อดังนี้

ตรวจร้อยละตัวอสุจิมีชีวิต(%livingsperm)อัตราการเคลื่อนที่(%motilityและอัตราการเคลื่อนที่ไปข้างหน้า(%progressivemotility)ในน้ำเชื้อแช่แข็งโดยใช้เครื่องCASA(computerassistedsemenanalyzer)(HamiltonThornMotilityAnalyzer,IVOS12.3)โดยตั้งค่าเพื่อการตรวจดังนี้FramesPerSec.50Hz,No.ofFrames30,minimumcontrast60,minimumcellsize5pix,Pathvelocity,VAP55ul/s,STR50%,cellIntensity55,VAPcutoff21.9u/s,VSLcutoff6u/s

ตรวจร้อยละความสมบูรณ์ของผนังเซลล์และอะโครโซมของตัวอสุจิในน้ำเชื้อแช่แข็ง ตรวจคุณภาพ น้ำเชื้อหลังจากแช่แข็งอย่างน้อย 24 ชั่วโมง โดยตรวจร้อยละของความผิดปกติของเยื่อหุ้มตัวอสุจิและ อะโครโซมในน้ำเชื้อแช่แข็งโดยใช้เครื่องFlowCytometer

การวิเคราะห์และประมวลผลวางแผนการทดลองแบบRCBDเปรียบเทียบร้อยละความผิดปกติของอะโครโซมและเยือ่หุม้ตวัอสจุิในนำ้เชือ้แช่แขง็และเปรยีบเทยีบรอ้ยละอสจุิมชีวีติในนำ้ยาเจอืจางนำ้เชือ้ทัง้4ชนิดวิเคราะห์ความแปรปรวนโดยวิธีANOVAเปรียบเทียบความแตกต่างของtreatmentsโดยDMRT(Duncan’sMultipleRangetest)

ผลการทดลอง ผลการศกึษาคณุภาพนำ้เชือ้แช่แขง็พอ่พนัธุ์ โคนมที่เจอืจางดว้ยนำ้ยาเจอืจางนำ้เชือ้EggYolkTrisที่เสริมด้วยกรดอะมิโนซิสเตอีน515และ15มิลลิโมลภายหลังการแช่แข็งน้ำเชื้อและนำน้ำเชื้อที่แช่แข็งมาละลายด้วยน้ำอุณที่อุณหภูมิ37องศาเซลเซียลเป็นเวลา30วินาทีพบว่าอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิที่เสริมน้ำยาเจือจางEggYolkTrisด้วยกรดอะมิโนซิสเตอีนมีอัตราการเคลื่อนที่สูงกว่าอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิที่ ไม่เสริมน้ำยาเจือจางEggYolkTrisด้วยกรดอะมิโนซิสเตอีน(51.62±2.03,49.12±1.83,47.52±2.43,40.03±1.78)อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(P<0.05)ส่วนลักษณะการเคลื่อนที่ของอสุจิพบว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนมีลักษณะBeatfrequency(BCF)Linearity;(LIN)และStraightness(STR)สงูกวา่อสจุิในนำ้ยาเจอืจางที่เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนอยา่งมีนยัสำคญัทางสถติ(ิP<0.01)แต่ความเรว็ในการเคลื่อนที่เป็นเส้นตรงStraight-linevelocity(VSL)พบว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนสูงกว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางที่เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนคือ71.10±1.63µm/s,66.34±1.02µm/s,66.34±1.02µm/sและ66.96±1.08µm/sตามลำดับ(ตารางที่1)

41


1/:a,b:อักษรที่เหมือนกันในแถวเดียวกันไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(p>0.05)

เมื่อศึกษาความสมบูรณ์ของอะโครโซมและเยื่อหุ้มตัวอสุจิในน้ำเชื้อแช่แข็งโคนมที่ผลิตโดยใช้น้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ Egg Yolk Tris เสริมด้วยกรดอะมิโนซิสเตอีน 5 15 และ 15 มิลลิโมล ด้วย เครื่องflowcytometerแสดงในตารางที่2โดยพบว่าไม่แตกต่างกันทางสถิติ(p<0.05)แต่น้ำเชื้อที่เจือจางด้วยน้ำยาเจือจางEggYolkTrisเสริมด้วยกรดอะมิโนซิสเตอีน10มิลลิโมลมีเยื่อหุ้มเซลล์และอะโครโซม สมบูรณ์สูงที่สุดคือร้อยละ 44.65±6.39 เมื่อเทียบกับไม่เสริมกรดอะมิโน และการเสริมcysteine 5 และ 15มิลลิโมล(40.07±2.25,42.00±3.57และ38.66±4.30ตามลำดับ)

Motility(%)

Progressivemotility(%)

ความเร็วในการเคลื่อนที่(µm/s)

Curvilinearvelocity;VCL(µm/s)

Straight-linevelocity;VSL(µm/s)

Averagepathvelocity;VAP(µm/s)

Amplitudeoflateralheaddisplacement;

ALH(µm/s)

ลักษณะการเคลื่อนที่

Beatfrequency;BCF(Hz)

Linearity;LIN(%)

Straightness;STR(%)

40.03b±1.78

26.58±1.24

151.06b±3.65

71.10a±1.63

88.43±1.94

6.89b±0.16

26.58a±0.62

48.12a±0.80

79.18a±0.89

0mM

49.12a±1.83

26.20±1.20

166.53a±4.19

67.83b±1.14

92.10±1.99

8.13a±0.15

21.80b±0.41

43.17b±1.00

73.20b±0.64

10mM

51.62a±2.03

26.05±1.19

163.22a±3.55

66.34b±1.02

90.82±1.69

7.81a±0.09

22.98b±0.43

42.22b±0.64

72.54b±0.79

5mM

น้ำยาเจือจางEggYolkTrisที่มีความเข้มข้นCysteineลักษณะการเคลื่อนที่

47.52a±2.43

24.82±1.31

164.57a±2.65

66.96b±1.08

89.42±1.25

8.01a±0.13

22.42b±0.41

41.58b±0.64

73.05b±0.78

15mM

ตารางที่ 1 แสดงค่าเฉลี่ย±SEของร้อยละของตัวอสุจิมีชีวิตและการเคลื่อนที่ทางkineticของตัวอสุจิ

ภายหลังการแช่แข็งในน้ำเชื้อโคนมที่มีน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อEggYolkTris

42


Dead-acrosomeintact(%)

Dead-acrosomedamage(%)

Live-acrosomeintact(%)

Live-acrosomedamage(%)

32.39±2.82

28.39±2.34

40.07±2.25

0.03±0.01

0mM

30.67±2.94

25.13±2.14

44.65±6.39

0.03±0.01

10mM

31.72±3.09

25.20±2.41

42.00±3.57

0.007±0007

5mM

น้ำยาเจือจางEggYolkTrisที่มีความเข้มข้นCysteineลักษณะของอะโครโซมของอสุจิ

34.70±3.17

26.25±2.49

38.66±4.30

0.02±0.01

15mM

ตารางที่ 2 ร้อยละของความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มตัวอสุจิและอะโครโซมภายหลังการแช่แข็งของอสุจิใน

น้ำเชื้อแช่แข็งโคนมในน้ำยาเจือจางEggYolkTrisเสริมด้วยกรดอะมิโนcysteine510และ15มิลลิโมล

เมื่อตรวจด้วยเครื่องFlowCytometer(ค่าเฉลี่ย±SE)

1/:a,b:อักษรที่เหมือนกันในแถวเดียวกันไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(p>0.05)

วิจารณ์ ผลการศึกษาคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งโคนมที่ ใช้น้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ Egg Yolk Tris เสริมด้วย กรดอะมิโน cysteine 5 10 และ 15 มิลลิโมล พบว่าอัตราการเคลื่อนที่ของกลุ่มที่เสริมด้วยกรดอะมิโนcysteine สูงกว่ากลุ่มที่ ไม่เสริมโดยน้ำยาเจือจางที่เสริมกรดอะมิโน cysteine 5 มิลลิโมล สูงที่สุด แต่ ความสมบูรณ์ของอะโครโซมและเยื่อหุ้มตัวอสุจิพบว่าทั้งสองกลุ่มไม่พบความแตกต่าง เนื่องจาก cysteine เป็นกรดอะมิโนที่เป็นองค์ประกอบของ glutatthione และ glutathione สามารถป้องกัน reduction of fertilitypotentialหลังการแช่แข็ง(Kaeoketatal.,2008)นอกจากนี้cysteineยังป้องกันสารออกซิเจนที่เป็นพิษต่อตัวอสุจิจากขบวนการเมตาบอลิซึม (toxicoxygenmetabolites)ซึ่งเป็นสาเหตุทำให้plasmamembranes ของตัวอสุจุเสียหาย (Meister and tate, 1976)ซึ่งแตกต่างกับการทดลอง Tuncer และ คณะ(2010)พบว่าการเสริมcysteine5มิลลโมลในน้ำยาเจือจางLaiciphose®ไม่ทำให้อัตราการเคลื่อนที่ของตัวอสุจิโคนมเพิ่มขึ้นแต่สามารถลดความเสียหายของ DNA ได้นอกจากนี้ยังมีรายงานการทดลองใน สัตว์หลายชนิดที่ ให้ผลใกล้เคียงกัน เช่นAndreeaและคณะ (2010)พบว่าการเสริมcysteineที่ระดับ10 มิลลิโมล ในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อแพะเพิ่มอัตราการการเคลื่อนที่ อสุจิมีชีวิต และความสมบูรณ์ของ เยื่อหุ้มเซลล์ที่ดีที่สุด รายงานในหมูพบว่าการเสริม cysteine ที่ระดับ 5 มิลลิโมลสามารถเพิ่มอัตรา การเคลื่อนที่ดีที่สุด(ChanapiwatP.atal,2008)

จากผลการศึกษาแสดงว่าการเสริมซิสเตอีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ Egg Yolk Tris ที่ระดับ ความเข้มข้น 5 มิลลิโมลให้อัตราการเคลื่อนที่ดีที่สุด ทำให้มีประโยชน์ที่จะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของน้ำเชื้อดียิ่งขึ้น

43


กิตติกรรมประกาศ คณะผู้วิจัยขอขอบคุณนายสัตวแพทย์ภาณุพันธ์ พงษ์เพ็ง ที่ ให้การสนับสนุนงานวิจัย ดร.จำเนียรสายขุน และอาจารย์กรชัย กรแก้วรัตน์ ที่ ให้ความอนุเคราะห์เครื่องมือและช่วยเหลือการตรวจคุณภาพ น้ำเชื้อนายนรินทร์จารีนางสายแก้วแก้วเกิดและเจ้าหน้าที่ของศูนย์ผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งพ่อพันธุ์ผสมเทียมที่ ให้ความช่วยเหลือการศึกษาครั้งนี้

เอกสารอ้างอิง ปริฉัตรสุขโต.2544.เทคโนโลยีชีวภาพทางวิทยาการสืบพันธ์เพื่อการผลิตปศุสัตว์.71-77.

Andreea,A.,StelaZ.,Coprean,D.andDorina,M.2010.Theeffectsofantioxidantson thecytologicalparametersofcryopeservedbucksemen.RomanianBiotechnological Letters.15:26-32.

Chanapiwat, P., Kaeoket, K. and Tummaruk, P. 2008. L-cysteine supplementation improved qualities of cryopreserved boar semen.Proceedings the 15th of FAVA. p.165-167.

El-Sheshtawy,R.I.,El-Sisy,G.A.andEl-Nattat,W.S.2008.Useofselectedamino acids to improve buffalo bull semen cryopreservation. Global Veterinaria. 2(4): 146-150.

Foot,R.H. 1970. Fertility of bull semenat highextension rates in tris–buffered extender.J.DairySci.53:1475-1477.

Kaeoket,K.,Tantiparinyakul,K.,Kladkaew,W.,Chanapiwat,P.andTechakumphu.M. 2008.Effectofdifferentantioxidantsonqualityofcryopreservedboarsemenin breeds.ThaiJournalofAgriculturalSci.41:1-9.

Meister,S.,andTate,S.S.1976.Glutathioneandrelatedgamma-glutamylcompounds, Biosyntehesisandutilization.Annu.Rev.Biochem.45:559-604.

UsalBucak,M.N.2007,Effectofoxidixedglutathione,bovineserumalbumin,cysteine and lycopene on the quality of frozen thawed ram semen,Acta Vet. Brno. 76: 383-390.

44


บทคัดย่อ การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อเปรียบเทียบการเสริมกรดอะมิโนสองชนิดคือ กลูตามีน

และไกลซีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ Egg Yolk Tris (EYT) ต่อคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งโคนม วางแผนการ

ทดลองแบบบล็อกสมบูรณ์(randomizedcompleteblockdesign:RCBD)ใช้พ่อโคนมทรอปิคอลโฮลไสตน์

จำนวน5ตัว(บล็อก)ทำการรีดน้ำเชื้อสัปดาห์ละ1วันเป็นเวลา5สัปดาห์(ซ้ำ)ในแต่ละสัปดาห์น้ำเชื้อ

ถูกแบ่งออกเป็น4ส่วนสำหรับการทดลอง4กลุ่มคือกลุ่มที่1เจือจางด้วยน้ำยาเจือจางEYTที่ ไม่เสริม

กรดอะมิโน,กลุ่มที่2เสริมกลูตามีน50mM,กลุ่มที่3เสริมไกลซีน50mMและกลุ่มที่4เสริมกลูตา

มีน25mMร่วมกับไกลซีน25mMผลการศึกษาพบว่าอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิในกลุ่มที่เจือจางด้วย

น้ำยาเจือจางน้ำเชื้อEYTไม่แตกต่างกับกลุ่มที่เสริมกลูตามีนหรือไกลซีนและกลุ่มที่เสริมกลูตามีนร่วมกับ

ไกลซีน (P>0.05) แต่ความเร็วในการเคลื่อนที่ของอสุจิพบว่าอสุจิในน้ำยาเจือจาง EYT ที่เสริม กลูตามีน

ร่วมกับไกลซีนมีความเร็วที่ ใช้ ในการเคลื่อนที่วิถีตรง(straight-linevelocity:VSL)ต่ำที่สุดคือ64.07±2.19

µm/s (P<0.05) ในขณะที่ลักษณะการเคลื่อนที่ของอสุจิในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อที่ ไม่เสริมกรดอะมิโน

มีความกว้างในการส่ายหัวมากที่สุด(amplitudeoflaterealheaddisplacement:ALH)คือ6.80±0.11µm

เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่เสริมกรดอะมิโน กลูตามีน หรือไกลซีน และกลูตามีนร่วมกับไกลซีน โดยมี

ค่า 6.56±0.11, 6.66±0.08 และ 6.40±0.12 µmตามลำดับ (P<0.05) ส่วนลักษณะความสมบูรณ์ของ

เยื่อหุ้มอสุจิและอะโครโซมภายหลังการแช่แข็ง พบว่าเมื่อเจือจางน้ำเชื้อด้วยน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ EYT

ที่เสริมกลูตามีนอสุจิมีเยื่อหุ้มเซลล์และชอะโครโซมสมบูรณ์สูงกว่ากลุ่มไม่เสริมกรดอะมิโน (P<0.05)

แต่ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับอสุจิในน้ำยาเจือจางที่เสริมไกลซีน หรือเสริมกลูตามีน

ร่วมกับไกลซีน คือมีค่าร้อยละ 52.90±2.45, 42.72±3.30, 48.66±3.53 และ 44.17±2.80 ตามลำดับ

จากการศึกษาแสดงว่าการเสริมกลูตามีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ EYT สามารถช่วยเพิ่มคุณภาพของน้ำเชื้อ

โคนมภายหลังการแช่แข็งโดยทำให้อสุจิมีความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มอสุจิและอะโครโซมสูงสุด

คำสำคัญ:กลูตามีนไกลซีนน้ำเชื้อโคนมม

เลขทะเบียนผลงานวิจัย:54(1)-0408-032

ภาณุพันธ์ พงษ์เพ็ง1 สุดา จันทาสี1 กุลณสรรค์ สายขุน2 จตุพร พงษ์เพ็ง1

1ศูนย์ผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งพ่อพันธุ์ผสมเทียมลำพญากลาง อ.ลำสนธิ จ.ลพบุรี 151902สถาบันวิจัยและพัฒนาวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล อ.ศาลายา จ.นครปฐม 73170

ผลการเสริมกลูตามีนและไกลซีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อต่อคุณภาพน้ำเชื้อโคนมภายหลังการละลาย

45


Abstract Thisstudywasperformedtoevaluatetheeffectsofglutamine,glycineandglutamine+glycine

addedinEggYolkTris(EYT)extenderoncryopreservationofdairybullsemen.Semenwas

collectedatfiveweeklyintervalsfromfivematurecrossbreedHolstein-Friesianbulls.Eachbull

semensample(n=4)wasaccessedweeklyfortreatedgroups:non-aminoacidtreated(control)

andsupplementedwith50mMofglutamine,glycineand25mMglutamine+25mMglycine.

Aminoacidtreatedgroupsshowednosignificantdifferent(P>0.05)post-thawingsperm

motilitycomparedtothecontrolgroup.However,forthespermvelocity,theglutamine+glycine

addedgrouphadtheloweststraight-linevelocity(VSL)(P<0.05).Forthekineticmovement,

the control group had the highest amplitude of lateral head displacement (ALH) compared

withtheaminoacidtreatedgroups(P<0.05).Additionally,thestatisticallysignificant(P<0.05)

spermmembraneandacrosomeintegrityaslive-acrosomeintact(LAI)wasobservedonlyin

the glutamine added group as52.90±2.45%vs42.72±3.30, 48.66±3.53 and44.17±2.80%

forthecontrol,theglutamineandtheglutamine+glycineaddedgrouprespectively.

TheresultsfromthisstudyindicatedthatadditionofglutamineinEYTextenderenhanced

post-thawedsemenquality,intermsofimprovedmembraneandacrosomeintegrityofdairybull

frozensemen.

Keywords:Glutamine,Glycine,Semenquality,Dairybulls

Researchprojectno.:54(1)-0408-032

Panupan Pongpeng1 Suda Janthasi1 Kunasan Saykhun2 Jatuporn Pongpeng1

1Lamphayaklang Livestock Semen Production Center, Lamsonthi, Lopburi 151902Institute of Science and Technology for Research and Development, Mahidol University,

Salaya, Nakhornpathom 73170.

EffectofGlutamineandGlycineSupplementsinExtendersonPost-ThawSemenQualityofDairyBulls.

46


บทนำ ในการผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งอาจมีความเสียหายเกิดขึ้นกับตัวอสุจิจากปัจจัยหลายอย่าง เนื่องจากอสุจิ

มีความไวต่อการเปลี่ยนแปลงของสารเคมี การลดอุณหภูมิขณะทำการแช่แข็ง ในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อมีสาร

ที่สำคัญคือสาร cryoprotectants ที่ช่วยป้องกันอสุจิเสียหายหรือตายระหว่างการลดอุณหภูมิขณะแช่แข็ง

(McLaughlinetal.,1992)โดยช่วยป้องกันการเกิดเกล็ดน้ำแข็งในเซลล์(Curry,2000)ลดความเสียหาย

ของผนังอสุจิ(PetersandBall,1995)ซึ่งถ้าผนังเซลล์อสุจิเสียหายจะส่งผลให้เกิดความเสียหายต่อเยื่อหุ้ม

อสุจิและอะโครโซมซึง่เปน็สว่นสำคญัที่อสจุิใช้เจาะผา่นผนงัเซลล์ไข่ถา้หากอะโครโซมเสยีหายหรอืไม่สมบรูณ์

ถึงแม้ว่าอสุจิไม่ตายแต่ก็ไม่สามารถปฏิสนธิกับไข่ได้(Januskauskasetal.,2003)

เมือ่อณุหภมูิเยน็จดัสตัว์และพชืหลายชนดิจะมีการสะสมกรดอะมิโนไว้ ในเซลล์รวมทัง้ในนำ้เชือ้ดว้ย

เชื่อว่าสามารถช่วยป้องกันอันตรายให้กับเซลล์ได้(El-Sheshtawyetal.,2008)และกรดอะมิโนกลูตามีน

ก็เป็นกรดอะมิโนที่พบมากที่สุดประมาณร้อยละ 90 ของกรดอะมิโนทั้งหมด รองลงมาได้แก่ ไกลซีนและ

อะลานนีในนำ้เชือ้พอ่พนัธุ์ โคยงัพบกรดอะมิโนในรปูแบบของสารประกอบไนโตรเจนอืน่ๆดว้ยซึง่สารประกอบ

เหล่านี้ทำหน้าที่เป็นสารเสริมช่วยป้องกันความเสียหายให้แก่ตัวอสุจิในกระบวนการแช่แข็ง (Brown and

White, 1974) และยังมีส่วนเกี่ยวข้องในกระบวนการเปลี่ยนน้ำตาลโมเลกุลเดี่ยวให้เป็นพลังงานเพื่อใช้ ใน

กิจกรรมของเซลล์และการเคลื่อนที่ของอสุจิอีกด้วย (Bhargava et al., 1959) อย่างไรก็ตามกลไกทาง

สรีรวิทยาของกรดอะมิโนเหล่านี้ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด (El-Sheshtawy et al., 2008) แต่มีการศึกษา

ชนิดของกรดอะมิโนที่นิยมใช้เสริมในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อในการผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งของสัตว์ชนิดต่างๆ ได้แก่

การเสริมกลูตามีนไกลซีนและโปรลีน 100-150 mM สามารถเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิภายหลังการ

แช่แข็งน้ำเชื้อ หรือการเสริมกลูตามีน 80 mM สามารถเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิมนุษย์และอสุจิม้า

ภายหลังการแช่แข็ง(Renardetal,1996;Scanchez-Partidataetal,1992)ส่วนEl-Sheshtawyet

al. (2008) ทำการศึกษาในน้ำเชื้อกระบือพบว่าการเสริมกลูตามีน ไกลซีน อะลานีนและซีสเตอีนในน้ำยา

เจือจางน้ำเชื้อมีผลทำให้คุณภาพน้ำเชื้อภายหลังการแช่แข็งแตกต่างกัน และอธิบายว่าการเสริมไกลซีนที่

ความเข้มข้น 25 mM สามารถรักษาความสมบูรณ์ของอะโครโซมได้ดีที่สุดคือ 61.30% เปรียบเทียบกับ

น้ำยาเจือจางปกติที่ ไม่ได้เสริมซึ่งมีความสมบูรณ์ของอะโครโซม 50.30% ในขณะที่การเสริม กลูตามีนที่

ระดับ 25 mM สามารถเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิเป็น 42.50% เมื่อเปรียบเทียบกับน้ำยาเจือจางที่

ไม่เสริมมีอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิ32.50%และAmirat-Briandetal. (2009)ก็ทำการศึกษาเสริม

กลูตามีนขนาด10mMในน้ำยาเจือจางEYTที่ ใช้lowdensitylipoproteins(LDL)แทนไข่แดงพบว่า

สามารถเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิโคให้สูงขึ้นเมื่อเปรียบเทียบน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริมกลูตามีน

ดังนั้นจึงทำการศึกษาการเสริมกรดอะมิโน 2 ชนิด คือกลูตามีนไกลซีนและกลูตามีนร่วมกับ

ไกลซีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อโคนมเพื่อเพิ่มคุณภาพน้ำเชื้อภายหลังการแช่แข็ง

47


อุปกรณ์และวิธีการ วางแผนการทดลองแบบบล็อกสมบูรณ์(randomized complete block design:RCBD) กำหนด

ให้น้ำเชื้อพ่อพันธุ์ โคทรอปิคอลโฮลสไตน์ อายุประมาณ 3-5 ปีจำนวน 5 ตัวเป็นบล็อก รีดเก็บน้ำเชื้อด้วย

artificialvaginaสัปดาห์ละ1ครั้ง โดยกำหนดให้น้ำเชื้อต้องมีอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิไม่ต่ำกว่า70%

รีดเก็บติดต่อกัน5สัปดาห์ โดยแบ่งน้ำเชื้อออกเป็น4ส่วนเท่าๆกันทำการเจือจางน้ำเชื้อด้วยน้ำยาเจือจาง

ในแต่ละกลุ่มทดลองดังนี้กลุ่มที่1เจือจางด้วยน้ำยาเจือจางEYT(tris30.28g,citricacid17g,fructose

12.5g,deminralisedwater920.0ml.,glycerol80ml.,eggyolk250ml.,penicillinGsodium

1,000,000 IU และstreptomycinsulfate 1 g) ที่ ไม่เสริมกรดอะมิโน กลุ่มที่2 น้ำยาเจือจาง EYT

เสริมกลูตามีน50mMกลุ่มที่3น้ำยาเจือจางEYTเสริมไกลซีน50mMและกลุ่มที่4น้ำยาเจือจางEYT

เสริมกลูตามีน25mMร่วมกับไกลซีน25mMโดยคำนวณให้มีจำนวนอสุจิ96ล้านตัว/ml

การบรรจุและการแช่แข็งบรรจุน้ำเชื้อใน French ministraw 0.25ml ด้วยเครื่องบรรจุน้ำเชื้อ

(Typemachine MRS3,CodeYC250, IMV,France)นำไปบ่มไว้ที่อุณหภูมิ 4oC เป็นเวลา4ชั่วโมง

จากนั้นทำการแช่แข็งน้ำเชื้อด้วยเครื่องแช่แข็งน้ำเชื้ออัตโนมัติ (Digitcool 5300, ZH 350 & UE 350

with900HPprogram3TSoftware,IMV,France)และเก็บไว้ ใต้ระดับไนโตรเจนเหลวในถังเก็บน้ำเชื้อ

การตรวจวิเคราะห์คุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็ง ทำการละลายน้ำเชื้อแช่แข็งด้วยน้ำอุ่น 37oC เป็นเวลา

30วินาทีเช็ดให้แห้งตัดปลายหลอดให้น้ำเชื้อหยดลงในหลอดแก้วเล็กทำการตรวจคุณภาพน้ำเชื้อทันที

การตรวจวิเคราะห์ด้วยเครื่องCASA(computerassistedsemenanalysis)โปรแกรมIVOS

motilityanalyzerversion12.0(Hamilton-Thorne,Biosciences,MA,USA.)ทำการตรวจวิเคราะห์

ดังนี้

- การเคลื่อนที่(motility)และการเคลื่อนที่ ไปข้างหน้า(progressivemotility)

- ความเร็วในการเคลื่อนที่ ได้แก่ pathvelocity (VAP), straight-line velocity (VSL)

และcurvilinearvelocity(VCL)

- ลักษณะการเคลื่อนที่ ได้แก่ amplitude of lateral headdis placement (ALH),

beatcrosfrequency(BCF),straightness(STR)และlinearity(LIN)

การตรวจความผิดปกติของอะโครโซม (acrosome integrity) โดยย้อมสี FITC-PNA

(fluorescein isothiocyanate-conjugated peanut agglutinin) และตรวจความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์

(plasmamembraneintegrity)โดยย้อมด้วยสีPI(propridiumiodide)วิธีการคือทำการละลายน้ำเชื้อแช่

แข็งที่37oCนาน30วินาทีเจือจางด้วยHepes-bufferedmodifiedTyrodemedium(CaCl22.0mM,

KCl3.1mM,MgCl20.4mM,NaCl 100mM,NaHCO325mM,NaH2PO40.3mM,sodium

pyruvate 1.0mM,sodium lactate21.6mM,Hepes 10.0mMและBSA6.0mg/ml)ปริมาตร

10เท่าของน้ำเชื้อที่อุณหภูมิ37oCกรองผ่านnylonmeshขนาด41µm(Spectrum,LosAngeles,CA,

USA)จากนั้นย้อมด้วยสีFITC-PNAโดยใช้น้ำเชื้อ440µlผสมกับสีFITC-PNA50µl (10mg/ml)

48


นำไปไว้ที่อุณหภูมิ37oCนาน30นาทีจากนั้นย้อมด้วยสีPIก่อนนำไปตรวจด้วยเครื่องflowcytometer

รุ่นFACScaliber(BectonDickinson,NJ,USA.)

การวิเคราะห์และแปลผล วิเคราะห์ค่าตัวชี้วัดต่างๆ ด้วยAnalysis of Variance และวิเคราะห์

ความแตกต่างของค่าเฉลี่ยด้วยวิธีDuncan’sMultipleRangeTest

ผลการทดลองและวิจารณ์ การศึกษาเปรียบเทียบคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งพ่อพันธุ์ โคนมที่เจือจางด้วยน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ

EggYolkTrisที่เสริมกรดอะมิโนต่างๆได้แก่กลูตามีนไกลซีนและกลูตามีนร่วมกับไกลซีนพบว่าอัตรา

การเคลื่อนที่ (motility) และอัตราการเคลื่อนที่ ไปข้างหน้า (progressive motility) ของอสุจิในกลุ่มที่

เจอืจางดว้ยนำ้ยาเจอืจางนำ้เชือ้EYTไม่แตกตา่งกบักลุม่ที่เสริมกลตูามนีไกลซนีและกลูตามนีรว่มกบัไกลซนี

(P>0.05)ซึ่งแตกต่างกับน้ำเชื้อกระบือที่การเสริมกลูตามีนในน้ำยาเจือจางสามารถเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่

ของอสุจิให้สูงขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริมกรดอะมิโนแต่เมื่อเพิ่มถึงระดับ100mMกลับ

ทำให้อัตราการเคลื่อนที่ลดลง (El-Sheshtawy et al., 2008) แสดงว่าการเสริมกรดอะมิโนสามารถเพิ่ม

คุณภาพน้ำเชื้อสัตว์หลังการแช่แข็งได้หลายชนิดแต่การเสริมอาจมีระดับที่จำกัดแตกต่างกันในสัตว์แต่ละชนิด

ส่วนความเร็วในการเคลื่อนที่ของอสุจิ (velocity) ซึ่งเป็นตัวชี้วัดที่ ให้ทราบถึงความสามารถในการ

เคลื่อนที่ของอสุจิในช่วงเวลาหนึ่งได้แก่VAPเป็นความเร็วในการเคลื่อนที่จริงในหนึ่งวินาทีส่วนVCL(การ

เคลื่อนที่วิถีโค้ง)เป็นการคำนวณแนวโน้มของการเคลื่อนที่เฉลี่ยใน1วินาทีและVSL(การเคลื่อนที่วิถีตรง)

เปน็การคำนวณจากจดุหนึง่ไปยงัอกีจดุหนึง่ในแนวเสน้ตรงในชว่งระยะเวลา1วนิาทีซึง่ความเรว็ในการเคลือ่นที่

ของอสจุิที่มีคา่มากแสดงวา่อสจุินา่จะมีความสามารถในการเคลือ่นที่ ได้ดีซึง่มีความสมัพนัธ์กบัความสามารถ

ในการผสมติด(กิตติศักดิ์และคณะ2551)จากการทดลองพบว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางEYTที่เสริมกลูตามีน

ร่วมกับไกลซีนมีความเร็วที่ ใช้ ในการเคลื่อนที่วิถีตรง(VSL)ต่ำที่สุดคือ64.07±2.19µm/sเทียบกับกลุ่มที่

ไม่เสริมกลุ่มที่เสริมกลูตามีนและกลุ่มที่เสริมไกลซีนเพียงอย่างเดียว(P<0.05)ซึ่งมีค่าเท่ากับ72.15±1.23,

69.55±1.13และ68.82±1.39µm/sตามลำดับในทำนองเดียวกับความเร็วในการเคลื่อนที่วิถีโค้ง(VCL)

อสุจิในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อที่เสริมกลูตามีนร่วมกับไกลซีนให้ค่าต่ำที่สุดเมื่อเทียบกับไม่เสริมอะมิโนหรือเสริ

มกลูตามีนหรือเสริมไกลซีนเพียงอย่างเดียว(P<0.05)ซึ่งมีค่าVCLเท่ากับ139.45±2.45,150.42±2.51,

145.57±2.57และ142.46±2.84µm/sตามลำดับ

สว่นลกัษณะการเคลือ่นที่(kineticmovement)เปน็ตวัชี้วดัที่บอกให้ทราบวา่ในการเคลือ่นที่ของอสจุิ

มีลักษณะการส่ายของหัวมากน้อย ซึ่งลักษณะการเคลื่อนที่ของอสุจิควรมีการส่ายน้อยๆหรือมีการเคลื่อนที่

ได้ตรงที่สุดซึ่งมีความเกี่ยวข้องกับคุณสมบัติของผนังเซลล์และการควบคุมการผ่านเข้าออกของสารและองค์

ประกอบของผนังเซลล์ (Shannon and Vishwanath, 1995) และผลกระทบจากการเปลี่ยนสถานะของ

สารละลายอันเนื่องมาจากการแช่แข็ง(HoltandNorth,1994)เมื่อเจือจางน้ำเชื้อด้วยน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ

ที่ ไม่เสริมกรดอะมิโนพบว่าอสุจิมีช่วงกว้างขณะส่ายหัว(ALH)มากที่สุดคือ6.80±0.11µmเมื่อเปรียบ

เทียบกับกลุ่มที่เสริมกรดอะมิโนกลูตามีนไกลซีนและกลูตามีนร่วมกับไกลซีน(P<0.05)โดยมีค่า6.56±0.11,

6.66±0.08 และ 6.40±0.12 µmตามลำดับ (Table 1) แสดงว่าน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อที่เสริมกรดอะมิโนมี

ส่วนช่วยลดผลกระทบจากการแช่แข็งได้ดีกว่า

49


ลักษณะความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์และอะโครโซมภายหลังการแช่แข็ง พบว่าเมื่อเจือจางน้ำเชื้อ

ด้วยน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ EYT ที่เสริมกลูตามีน มีผลทำให้อสุจิที่มีชีวิตมีความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มอสุจิและ

อะโครโซมสูงกว่า อสุจิในน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริมกรดอะมิโน (P<0.05) แต่ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ

เมื่อเปรียบเทียบกับอสุจิในน้ำยาเจือจางที่เสริมไกลซีน หรือที่เสริมกลูตามีนร่วมกับไกลซีน คือมีค่าร้อยละ

52.90±2.45,42.72±3.30,48.66±3.53และ44.17±2.80ตามลำดับ(Table2)ซึ่งมีผลการทดลองเป็น

ไปในทำนองเดียวกับEl-Sheshtawyetal.(2008)พบว่าการเสริมไกลซีนในน้ำยาเจือจางสามารถรักษา

ความสมบูรณ์ของอะโครโซมได้ดีกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับน้ำยาเจือจางที่ ไม่ได้เสริมกรดอะมิโน

Motility(%)

Progressivemotility(%)

Velocity

Averagepathvelocity:VAP(µm/s)

Straight-linevelocity:VSL(µm/s)

Curvilinearvelocity:VCL(µm/s)

Kineticmovement

Amplitudeoflateralhead:ALH(µm)

Beatcrossfrequency:BCF(HZ)

Straightness:STR(%)

Linearity:LIN(%)

Dead-acrosomeintact(DAI)

Dead-acrosomedamage(DAD)

Live-acrosomeintact(LAI)

Live-acrosomedamage(LAD)

50.85±1.17

32.45±0.95

113.56±24.58

72.15a±1.23

150.42a±2.51

6.80a±0.11

27.07±0.53

79.29±0.62

48.49±0.59

29.13bc±1.86

28.12±2.97

42.72a±3.30

0.05±0.01

Control

Control

51.00±2.17

30.68±1.46

85.07±1.55

68.82a±1.39

142.46b±2.84

6.66ab±0.08

26.61±0.45

79.77±0.65

49.69±0.72

26.16ab±1.19

25.18±3.46

48.66ab±3.53

0.03±0.01

Glycine

Glycine

52.58±2.41

32.67±1.55

86.36±1.36

69.55a±1.13

145.57ab±2.57

6.56ab±0.11

27.18±0.56

79.40±0.72

49.14±0.68

24.70a±1.50

23.14±2.72

52.90b±2.45

0.06±0.02

Glutamine

Glutamine

Post-thawingsemeninEYTsupplements

Post-thawingsemeninEYTsupplements

Spermqualityparameters

Spermqualityparameters(%)

49.59±2.14

30.69±1.45

82.46±1.48

64.07b±2.19

139.45b±2.45

6.40b±0.12

26.77±0.61

78.77±0.74

48.46±0.72

31.00c±1.77

24.76±2.99

44.17ab±2.80

0.04±0.01

Glutamine+Glycine

Glutamine+Glycine

Table 1 Post-thawingspermqualityparameterswereexaminedbyCASA

Table 2 Post-thawingspermqualityparametersexaminedbyFlowCytometer

abตัวอักษรที่แตกต่างกันอยู่ในแถวเดียวกันมีความแตกต่างกันทางสถิติ(P<0.05)

abตัวอักษรที่แตกต่างกันอยู่ในแถวเดียวกันมีความแตกต่างกันทางสถิติ(P<0.05)

50


สรุปผลการทดลอง ผลจากการศึกษาสามารถสรุปได้ว่าการเสริมกรดอะมิโนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ สามารถช่วยเพิ่มคุณภาพน้ำเชื้อภายหลังการแช่แข็งได้ โดยสามารถช่วยลดผลกระทบจากการแช่แข็ง และช่วยเพิ่มความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์และอะโครโซมให้สูงขึ้นแต่ไม่ทำให้อัตราการเคลื่อนที่และความเร็วในการเคลื่อนที่แตกตา่งกบัการเจอืจางดว้ยนำ้ยาเจอืจางนำ้เชือ้EYTที่ ไม่เสริมกรดอะมิโนและจากผลการทดลองการเสริม กลูตามีน50mMในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อEYTสามารถช่วยเพิ่มคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งได้อสุจิมีความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มอสุจิและอะโครโซมสูงขึ้น

เอกสารอ้างอิง กิตติศักดิ์แสงสกุลสราวุธฉายประสาทเลิศชัยจินตพิทักษ์สกุลและมุขดารัตนภาสกร.2551. ความสัมพันธ์ระหว่างอัตราการตกลูกและลักษณะการเคลื่อนที่ของตัวอสุจิของน้ำเชื้อแช่แข็งโค. วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์.ปีที่3ฉบับที่1มิถุนายน2551.

Amirat-Briand, L., Bencharif, D., Vera-Munoz, O., Bel Hadj Ali, H., Destrumelle, S.,Desherces,S.,Schmidt,E.,Anton,M.,andTainturier,D.2009.Effectofglutamine onpost-thawmotilityofbullspermatozoaafterassociationwithLDL(lowdensity lipoproteins)extender:Preliminaryresults.Theriogenology.71(8):1209-1214.

Bhargava,P.M.,Bishop,W.H.andWork,T.S.1959.Thechemicalcompositionofbull semenwithspecialreferencetonucleicacids,freenucleotidesandfreeaminoacids. BiochemicalJournal.73(2):242-247.

Brown-Woodman,P.D.andWhite,I.G.1974.Aminoacidscompositionofsemenand the secretions of the male reproductive tract. Australian Journal of Biological Sciences.27(4):415-422.

Curry,M.R. 2000. Cryopreservation of sperm from domestic livestock. Reviews of Reproduction.5:46-52.

El-Sheahtawy,R.I.,El-Sisy,G.A.andEl-Nattat,W.S.2008.UseofSelectedamino acidstoimprovebuffalobullsemencryopreservation.GlobalVeterinaria.2(4):146-150. Holt,W.V. and Nort, R.D. 1994. Effects of temperature and restoration of osmotic equilibrium during thawing on the induction of plasma membrane damage in cryopreservedramspermatozoa.BiologicalReproduction.51:414-424.

Januskauskas,A.,Johannisson,A.andRodriguez-Martinez,H.2003.Subtlemembrane changes in cryopreserved bull semen in relation with sperm viability, chromatinstructure,andfieldfertility.Theriogenology.60:743-758.

51


Khlifaoui, M., Battut, I., Bruyas, J. F., Chatagnon, G., Trimeche, A. and Tainturier, D. 2005.Effect of glutamine on post-thaw motility of stallionspermatozoa: an approach of the mechanism of action at spermatozoa level. Theriogenology. 63(1):138-149.

McLaughlin,E.A.,Ford,W.C.andHull,M.G.1992.Thecontributionofthetoxicityof aglycerol-eggyolk-citratecryopreservativetothedeclineinhumanspermmotility duringcryopreservation.JournalofReproductionandFertility.95:749-754.

Peters,A.R.andBall,P.J.H.1995.ReproductioninCattle.2ndEd.BlackwellScience Ltd.P.82-84.

Phetudomsinsuk,K.,Sirinarumitr,K.,Choothesa,A.,Suthanmapinunt,P.,Kornkaewrat, K.,Laikul,A.,Amornsak,S.andPinyopummin,A.2009.ThaiJournalVeterinarian Medicine.39(2):105-114.

Renard,P.,Grizard,G.,Griveau,J.F.,Sion,B.,Boucher,D.andLeLannou,D.1996. Improvement of motility and fertility potential of post-thaw human sperm using aminoacids.Cryobiology.33:311-319.

Scanchez-Partidata, L.G., Maxwell, W.M.C., Paleg, L.G. and Setchell, B.P. 1992. Proline and glycine brtaine in cryoprotective diluent for ram spermatozoa. ReproductionandfertilityDevelopment.4:113-118.

Shannon, P. and Vishwanath, R. 1995. The effect of optimal and suboptimal concentration of sperm on the fertility of fresh and frozen bovine semen and atheoreticalmodeltoexplainthefertilitydifferences.AnimalReproductiveScience. 39:1-10.

52


บทคัดย่อ ศึกษาสมรรถนะทางการสืบพันธุ์ โคเนื้อลูกผสมภายใต้สภาพการจัดการของเกษตรกรรายย่อย

ทางภาคใต้ของประเทศไทย ใช้ข้อมูลผสมเทียมรายตัวของโคที่รวบรวมไว้ ในระบบฐานข้อมูลของศูนย์วิจัย

การผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพสุราษฎร์ธานีกรมปศุสัตว์ในช่วงปีพ.ศ.2548-2553จำนวน8,095

บันทึก มีการตรวจสอบความถูกต้องจากบัตรบันทึกผสมเทียม (ผท.2) ประจำหน่วยผสมเทียม แบ่งกลุ่ม

พันธุ์ โคออกเป็น 5 กลุ่ม คือ AB75%xNA25%, AB50%xNA50%, AB50% xCHA50%, AB25%

xCHA50%xNA25%และNA100%และแม่โคแบ่งออกเป็น2กลุ่มคือโคสาว(Heifer)และแม่โค

(PrimiparousและMultiparous)สมรรถภาพการสืบพันธุ์ที่วิเคราะห์ได้ดังนี้อายุเมื่อให้ลูกตัวแรก(AFC)

จำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด (SPC) และระยะอุ้มท้อง (GL) ในโคสาว มีค่าเท่ากับ 38.84+0.29

เดือน 1.56+0.08 ครั้งและ 282.02+0.02 วัน ตามลำดับ ส่วนระยะเวลาจากคลอดถึงผสมครั้งแรก

(PTF) จำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด (SPC) ระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึงผสมติด (DO) ระยะอุ้มท้อง

(GL) และช่วงห่างการคลอดลูก (CI) ของในกลุ่มแม่โค มีค่าเท่ากับ 148.59+4.02 วัน 1.43+0.03ครั้ง

174.82+5.76 วัน 282.25+0.10 วัน และ 465.56+4.43 วัน ตามลำดับ กลุ่มโคที่มีระดับสายเลือด

บราห์มันจะให้ผลการวิเคราะห์ตัวชี้วัดของ AFC, PTF, SPC, DO และ CI สูงกว่ากลุ่มแม่โคพื้นเมือง

ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญยิ่ง (p<0.01) โดยเฉพาะกลุ่ม AB75%xNA25% จะให้ค่าเฉลี่ยของ

ตัวชี้วัดเหล่านี้สูงสุด แม่โคในกลุ่ม Primiparous ทุกระดับสายเลือดมีประสิทธิภาพการสืบพันธุ์ โดยเฉลี่ย

ต่ำกว่ากลุ่ม Multiparous มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญยิ่ง (p<0.01) ยกเว้น SPC และ GL เมื่อมี

การเลี้ยงดูภายใต้สภาพการจัดการของเกษตรกรรายย่อยทางภาคใต้ของประเทศไทย

คำสำคัญ:โคเนื้อลูกผสมบราห์มันสมรรถภาพทางการสืบพันธุ์

จิตศักดิ์ เมืองเขียว1 และ ธวัชชัย โพธิ์คำ1

1 ศูนย์วิจัยการผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพสุราษฎร์ธานี อ.พุนพิน จ.สุราษฎร์ธานี

สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อลูกผสมบราห์มันในภาคใต้ของประเทศไทย

53


Abstract Themainobjectiveofthisstudywastodeterminereproductiveperformancesofmixed

breedbeefcattleundersmallfarmholdermanagementinSouthernThailand.Between2005

to2010,8,095AIrecords(AI2form)fromAIunitsofSurathaniArtificialInseminationand

Research Center, Department of Livestock Development. were checked and analyzed. The

beefcattleontheAIrecordsweredividedaccordingtotheirbreedpercentageinto5groups

asfollows;AB75%xNA25%,AB50%xNA50%,AB50%xCHA50%,AB25%xCHA50%

xNA25% andNA100%. These female beef cattlewere also divided into heifer and cow

groups.ThecowgroupwasthensubdividedintoPrimiparousandMultiparous.Reproductive

performancesstudiedinheifergroupwereAgeatFirstCalving(AFC),ServiceperConception

(SPC)andGestationLength(GL)whichtheresultsshowed38.84±0.29months,1.56±0.08

servicesand282.02±0.02days,respectively.WhereasresultsofDayfromparturitiontofirst

service(PTF),ServiceperConception(SPC),DaysOpen(DO),GestationLength(GL)and

CalvingInterval(CI)inthecowgroupwere148.59±4.02days,1.43±0.03services,174.82±5.76

days,282.25±0.10daysand465.56±4.43days,respectively.StudyinmixedBrahmancattle

grouprevealedsignificantsuperiorperformancesintermofAFC,PTF,SPD,DOandCIto

Nativecattle(p<0.01)whichthebestperformanceindexwasfromAB75%xNA25%group.

Cowsinprimiparousgroupofanybreedpercentageshowedsignificantlyinferiorintermofall

reproductiveperformanceindexestothemultiparousgroupexceptSPCandGL(p<0.01).

Keywords:Brahmancrossbred,reproductiveperformance

Jitthasak Maungkhiow1 and Tawutchai Pothkom1

1 Suratthani Artificial Insemination and Biotechnology research Centre, Punpin District, Suratthani

ReproductivePerformancesofBrahmanCrossbredsinSouthernThailand

54


บทนำ การเลีย้งโคเนือ้ในพืน้ที่ภาคใต้สว่นใหญ่เปน็เกษตรกรรายยอ่ยใช้หญา้ตามธรรมชาติและผลพลอยได้

ทางการเกษตรเป็นแหล่งอาหารหยาบ อาจมีการสร้างแปลงพืชอาหารสัตว์ขนาดเล็กและมีการเสริมวัตถุดิบ

อาหารสัตว์บ้างในบางราย โดยมีวัตถุประสงค์ของการเลี้ยงเพื่อขายลูกโคและนำเนื้อมาบริโภค นอกจากนี้

มูลโคยังเป็นผลพลอยได้ที่สำคัญใช้เป็นปุ๋ยบำรุงดินให้กับพืชเศรษฐกิจหลัก ทั้งยางพาราและปาล์มน้ำมัน

ทั้งนี้ยังรวมถึงโคพื้นเมืองภาคใต้ที่ผ่านการคัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์ โดยภูมิปัญญาในท้องถิ่นมายาวนาน

จนเกดิ “กฬีา ชน โค”ซึง่แสดงความเปน็เอกลกัษณ์ของโคทางภาคใต้สิง่เหลา่นี้แสดงให้เหน็วา่การเลีย้งโคเนือ้

มีบทบาทต่อวิถีชีวิตสังคมและวัฒนธรรมของคนทางภาคใต้เป็นอย่างมาก

จากรายงานของกรมปศสุตัว์ระยะเวลา10ปีที่ผา่นมาปรมิาณโคเนือ้ในพืน้ที่ภาคใต้มีทศิทางที่เพิม่ขึน้

โดยในปี2542มีจำนวนโคเนื้อเท่ากับ685,669ตัว(กองแผนงาน,2542)และในปีพ.ศ.2552มีจำนวน

โคเนื้อเท่ากับ 776,019 ตัว (ศูนย์สารสนเทศ, 2553) ส่วนใหญ่เป็นโคลูกผสมที่เกิดจากการใช้โคพื้นเมือง

เป็นแม่โคพื้นฐานผสมเทียมด้วยน้ำเชื้อโคพันธุ์แท้จากต่างประเทศ โดยเฉพาะน้ำเชื้อจากโคพันธุ์บราห์มัน

และโคพันธุ์ชาร์ โรเลส์สำหรับผลิตโคเนื้อคุณภาพ โคเพศผู้จะนำไปเลี้ยงเป็นโคขุนหรือเลี้ยงเป็นโคเนื้อส่ง

โรงฆ่าส่วนโคเพศเมียจะเลี้ยงไว้เป็นแม่โคเพื่อผลิตลูกในรุ่นต่อๆไป

สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ เช่น อายุเมื่อให้ลูกตัวแรก (Age at first calving) ระยะเวลา

อุ้มท้อง (Gestation length) ช่วงห่างของการคลอดลูก (Calving interval) ระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึง

ผสมครั้งแรก(Calvingtofirstserviceinterval)ระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึงผสมติด(Daysopen)อัตรา

การผสมติดครั้งแรก (First service conception rate) จำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด (Service per

conception)เป็นต้นเป็นตัวชี้วัดประสิทธิภาพการผลิตโคที่สำคัญโดยทั่วไปแม่โคที่มีประสิทธิภาพการผลิต

ที่ดีควรจะให้ลูกปีละตัวคือแม่โคต้องได้รับการผสมพันธุ์และผสมติดภายใน60-90วัน(สุณีรัตน์,2550)

แต่ข้อมูลทางด้านสมรรถนะทางการสืบพันธุ์ ของแม่โคเนื้อลูกผสมภายใต้สภาพการเลี้ยงของเกษตรกร

รายยอ่ยและสภาพแวดลอ้มทางภาคใต้ของประเทศไทยมีผู้ศกึษานอ้ยและไม่ครอบคลมุทัว่ทกุจงัหวดัในพืน้ที่

จึงมีความจำเป็นที่จะต้องศึกษาทางด้านนี้เพื่อเป็นข้อมูลพื้นฐานในการจัดการเลี้ยงดู วางแผนปรับปรุงพันธุ์

และวางแผนส่งเสริมในการผลิตต่อไป

ในการศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อลูกผสมบราห์มันใน

ภาคใต้ของประเทศไทยภายใต้สภาพการจัดการของเกษตรกรรายย่อย

55


อุปกรณ์และวิธีการ 1. ข้อมูลและการจัดการข้อมูล

เป็นการศึกษาข้อมูลสมรรถนะการสืบพันธุ์จากฐานข้อมูลผสมเทียมรายตัวโคเนื้อของศูนย์วิจัยการ

ผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพสุราษฎร์ธานีกรมปศุสัตว์ในช่วงปีพ.ศ.2548-2553โดยมีการตรวจสอบ

ความถูกต้องจากบัตรผสมเทียม(ผท.2)ประจำหน่วยผสมเทียมจำนวน8,095บันทึก

โคเนื้อในฟาร์มของเกษตรกรรายย่อยทางภาคใต้ของประเทศไทย ที่มีการเลี้ยงดูโดยใช้พืชอาหาร

สัตว์จากแปลงขนาดเล็กที่ปลูกเองและหญ้าตามธรรมชาติรวมทั้งผลพลอยได้จากพืชผลทางการเกษตร

เป็นแหล่งอาหารหยาบ

สมรรถนะภาพทางการสืบพันธุ์ที่ ใช้เป็นตัวชี้วัดในโคสาวประกอบด้วย อายุเมื่อให้ลูกตัวแรก

(Ageatfirstcalving,AFC)จำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด(Serviceperconception,SPC)และ

ระยะอุ้มท้อง(Gestationlength,GL)

ในแม่ โคประกอบด้วยระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึงผสมติด (Days open, DO) ระยะอุ้มท้อง

(Gestation length, GL) และช่วงห่างการคลอดลูก (Calving interval, CI) ระยะเวลาจากคลอดถึง

ผสมครั้งแรก (Day from parturition to first service, PTF) และจำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด

(Serviceperconception,SPC)

การจัดการข้อมูลการผสมเทียมเบื้องต้นจะประยุกต์ตามวิธีการของ Kadarmideen and Coffey

(2001)ที่กำหนดให้ระยะเวลาการตั้งท้องอยู่ในช่วง268-296วันส่วนข้อจำกัดและเกณฑ์ในการตรวจสอบ

ความถูกต้องและความน่าเชื่อถือของข้อมูลการผสมเทียมเพิ่มเติมได้มีข้อกำหนดดังนี้

-อายุเมื่อคลอดลูกตัวแรกอยู่ในช่วง18-52เดือน

-ช่วงห่างจากคลอดถึงการผสมเทียมครั้งแรกจะต้องอยู่ในช่วง20-240วัน

-จำนวนครั้งการผสมเทียมต่อการผสมติดจะต้องบันทึกอยู่ในช่วง20-340วันหลังคลอด

-ค่าเฉลี่ยจำนวนครั้งการผสมเทียมต่อการผสมติดของฝูงจะต้องอยู่ในช่วง1.5-3.5ครั้ง

-ช่วงห่างการคลอดลูกจะต้องอยู่ในช่วง290-630วัน

จำแนกปัจจัยหลักที่เป็นกลุ่มได้คือ

กลุ่มพันธุ์จำแนกออกเป็น5กลุ่มคือAB75%xNA25%,AB50%xNA50%,AB50%xCHA50%,

AB25%xCHA50%xNA25%และNA100%

กลุ่มแม่โคแบ่งออกเป็น2กลุ่มคือโคสาว(Heifer)และแม่โคแบ่งเป็น2กลุ่มย่อยคือแม่โคมีลูก

แล้ว1ตัว(Primiparous)และแม่โคมีลูกมากกว่า1ตัว(Multiparous)

เดอืนที่ผสมเทยีมและเดอืนที่คลอดในแตล่ะปีแบง่เปน็2ฤดูคอืฤดูรอ้นตัง้แต่ธนัวาคมถงึพฤษภาคม

และฤดูฝนตั้งแต่มิถุนายนถึงพฤศจิกายน(จิตศักดิ์,2550)

ปีของการผสมเทียมและการคลอดจำนวน5ปีคือปีพ.ศ.2548-2553

56


2.การวิเคราะห์ข้อมูล

วิเคราะห์ข้อมูลด้วยGLMprocedureที่มีตัวแบบดังต่อไปนี้

Y=µ+bAgeBi+Hr

j+Yb

k+Db

1+BG

m+e(โคสาว)

Y=µ+bAgeCi+Hr

j+Yc

k+Dc

1+BG

m+CG

n+(BGxCG)o+e(แม่โค)

เมื่อ: Y = ค่าสังเกตจากโคสาวหรือแม่โคสำหรับลักษณะข้อมูลต่อเนื่อง

µ = ค่าเฉลี่ย

bAgeBi = สัมประสิทธิ์การถดถอยเชิงเส้นตรงของอายุของโคสาวเมื่อผสม

เทียมครั้งแรก

bAgeCi = สัมประสิทธิ์การถดถอยเชิงเส้นตรงของอายุของแม่โคเมื่อคลอดลูก

Hrj = ปัจจัยคงที่ของฝูง

Ybk = ปัจจัยคงที่ของปีเกิด

Db1 = ปัจจัยคงที่ของฤดูกาลที่เกิด

Yck = ปัจจัยคงที่ของปีที่คลอดลูก

Dc1 = ปัจจัยคงที่ของฤดูกาลที่คลอดลูก

BGm = ปัจจัยคงที่ของระดับสายเลือดโค

CGn = ปัจจัยคงที่ของกลุ่มแม่โค

(BGxCG)o = ปัจจัยคงที่ของการปฏิสัมพันธ์ระหว่างระดับสายเลือดกับกลุ่มแม่โค

e = ค่าความคลาดเคลื่อน

ผลการศึกษา ค่าสมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อ

จากผลการวิเคราะห์ค่าเฉลี่ย สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อลูกผสมภายใต้สภาพการจัดการ

ของเกษตรกรรายย่อยทางภาคใต้ของประเทศไทย อายุเมื่อให้ลูกตัวแรก (AFC) จำนวนครั้งที่ผสมต่อการ

ผสมติด(SPC)และระยะอุ้มท้อง(GL)ในโคสาว5กลุ่มมีค่าเท่ากับ38.84+0.29เดือน1.56+0.08ครั้ง

และ 282.02+0.02 วัน ตามลำดับ ส่วนระยะเวลาจากคลอดถึงผสมครั้งแรก (PTF) จำนวนครั้งที่ผสม

ต่อการผสมติด (SPC) ระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึงผสมติด (DO) ระยะอุ้มท้อง (GL) และช่วงห่างการ

คลอดลูก (CI) ของในแม่โค 5 กลุ่มมีค่าเท่ากับ 148.59+4.02 วัน 1.43+0.03 ครั้ง 174.82+5.76 วัน

282.25+0.10วันและ465.56+4.43วันตามลำดับ(ตารางที่1-6)

อิทธิพลของระดับสายเลือดในโคสาว

จากการวเิคราะห์อทิธพิลของระดบัสายเลอืดในโคสาวตอ่สมรรถนะทางการสบืพนัธุ์พบวา่คา่AFC

มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญยิ่ง (P<0.01) ส่วนค่า SPC และ GL ไม่มีความแตกต่างทางสถิติ

(P>0.05)ดังที่แสดงไว้ ในตารางที่1

57


AB75%xNA25%

AB50%xNA50%

AB50%xCHA50%

AB25%xCHA50%xNA25%

NA100%

Overallmeans

AB75%xNA25%

AB50%xNA50%

AB50%xCHA50%

AB25%xCHA50%xNA25%

NA100%

Cowgroupmeans

41.88±0.83a

40.82±0.41a

40.88±0.93a

39.20±0.41b

38.21±0.54b

38.84±0.29

186.02±15.15aA

182.55±4.53aA

171.68±12.17abA

184.40±8.90aA

142.96±3.37bA

173.52±4.60A

AFC(month)

Primiparous

282.97±0.58

282.01±0.29

282.71±0.64

282.55±0.37

281.93±0.29

282.02±0.11

176.41±9.07a

169.47±2.61a

161.81±7.47b

169.34±5.50a

135.60±1.85c

148.59±4.02*

GL(day)

1.54±0.11

1.52±0.05

1.51±0.12

143±0.07

1.41±0.54

1.56±0.83

166.80±9.89aA

156.38±2.40aB

151.95±8.43aA

154.30±6.19aB

128.25±1.40bB

151.53±3.00B

SPC(service)

Multiparous

Leastsquaremeans+SE

Cowgroups

Breedgroups

Breedgroups Breedgroupmeans

Table 1 LeastsquaremeansandstandarderrorforAFCSPCandGLofheiferindifferent

breedgroups.

Table 2 LeastsquaremeansandstandarderrorforPTFindifferentbreedgroupsandcow

groups.

abLeastsquaremeanswithdifferentletterswithinthecolumnarehighsignificantlydifference. (P<0.01)

abcLeastsquaremeanswithdifferentletterswithinthecolumnarehighsignificantlydifferent.(P<0.01)ab Leastsquaremeanswithdifferentletterswithintherowarehighsignificantlydifferent.(P<0.01)*Overallmeans

อิทธิพลของระดับสายเลือดกลุ่มแม่โคและปฏิสัมพันธ์ระหว่างระดับสายเลือดกับกลุ่มแม่โค

จากการวเิคราะห์ปจัจยัที่มีผลกระทบตอ่สมรรถภาพทางการสบืพนัธุ์ ในกลุม่แม่โคและการปฏสิมัพนัธ์

ระหว่างระดับสายเลือดกับกลุ่มแม่โคพบว่าทุกปัจจัยมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญยิ่งต่อPTF,SPC,DO,

GLและCI(P<0.01)(ตารางที่2-6)

58


AB75%xNA25%

AB50%xNA50%

AB50%xCHA50%

AB25%xCHA50%xNA25%

NA100%

Cowgroupmeans

AB75%xNA25%

AB50%xNA50%

AB50%xCHA50%

AB25%xCHA50%xNA25%

NA100%

Cowgroupmeans

1.42±0.15

1.38±0.05

1.61±0.12

1.50±0.08

1.39±0.03

1.46±0.04

242.31±17.62aA

204.82±5.27aA

212.06±14.16aA

218.90±10.35aA

162.73±3.91bA

208.16±5.34A

Primiparous

Primiparous

1.54±0.09

1.40±0.03

1.52±0.08

1.48±0.05

1.37±0.01

1.43±0.03*

223.75±10.54a

192.95±3.03b

191.72±8.68b

201.49±6.39b

155.53±2.15c

174.82±5.76*

1.66±0.10ab

1.41±0.02ab

1.42±0.08ab

1.45±0.06ab

1.36±0.14b

1.46±0.03

205.20±11.50aA

181.09±2.80aB

171.39±9.81abB

184.08±7.20aB

148.33±1.63bB

178.02±3.48B

Multiparous

Multiparous

Cowgroups

Cowgroups

Breedgroups

Breedgroups

Breedgroupmeans

Breedgroupmeans

Table 3 LeastsquaremeansandstandarderrorforSPCindifferentbreedgroupsandcow

groups.

Table 4 LeastsquaremeansandstandarderrorforDOindifferentbreedgroupsandcow

groups

ab Leastsquaremeanswithdifferentletterswithinthecolumnarehighsignificantlydifferent. (P<0.01)* Overallmeans

abc Leastsquaremeanswithdifferentletterswithinthecolumnarehighsignificantlydifferent. (P<0.01)AB Leastsquaremeanswithdifferentletterswithintherowarehighsignificantlydifferent. (P<0.01)* Overallmeans

59


AB75%xNA25%

AB50%xNA50%

AB50%xCHA50%

AB25%xCHA50%xNA25%

NA100%

Cowgroupmeans

AB75%xNA25%

AB50%xNA50%

AB50%xCHA50%

AB25%xCHA50%xNA25%

NA100%

Cowgroupmeans

280.54±0.86abA

282.37±0.25abA

283.15±0.69abA

283.77±0.52aA

281.61±0.19bA

282.29±0.86A

522.84±17.65aA

487.83±5.28aA

495.21±14.18aA

502.67±10.36aA

444.34±3.92bA

490.45±5.36A

Primiparous

Primiparous

281.59±0.52b

282.42±0.14a

282.70±0.43ab

282.87±0.32a

281.74±0.10b

282.25±0.10*

505.34±10.54a

475.38±3.04a

474.42±8.70a

484.36±6.41a

437.27±2.15b

465.56±4.43*

282.53±0.57abA

282.46±0.13aA

282.25±0.48abA

281.97±0.35abB

281.85±0.08bA

282.23±0.57A

487.83±11.52aA

463.56±2.80aB

453.64±9.83aA

466.05±7.21aB

430.19±1.63aB

460.25±3.50B

Multiparous

Multiparous

Cowgroups

Cowgroups

Breedgroups

Breedgroups

Breedgroupmeans

Breedgroupmeans

Table 5 Leastsquaremeansandstandarderror forGLindifferentbreedgroupsandcow

groups.

Table 6 Leastsquaremeansandstandarderror forCI indifferentbreedgroupsandcow

groups

abc Leastsquaremeanswithdifferent letterswithin thecolumnaresignificantlydifferent (P<0.01)AB Least square means with different letters within the row are significantly different (P<0.01)* Overallmeans

abc Leastsquaremeanswithdifferentletterswithinthecolumnarehighsignificantlydifferent (P<0.01)AB Leastsquaremeanswithdifferentletterswithintherowarehighsignificantlydifferent (P<0.01)* Overallmeans

60


วิจารณ์ ผลการวิเคราะห์สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อลูกผสมภายใต้สภาพการจัดการของเกษตรกร

รายย่อยในภาคใต้ของประเทศไทย พบว่าโคลูกผสมบราห์มันมีค่าเฉลี่ยของตัวชี้วัดสูงกว่าโคพื้นเมือง

โดยเฉพาะโค AB75%xNA25% จะมีค่าเฉลี่ยของตัวชี้วัดสูงสุดแสดงว่ามีประสิทธิภาพทางการสืบพันธุ์

ต่ำกว่า สอดคล้องกับ Tamwasorn et al. (1982) ที่ศึกษาในฟาร์มทดลองโคเนื้อกำแพงแสนพบว่าโคพื้น

เมืองมีประสิทธิภาพทางการสืบพันธุ์ดีกว่า โคลูกผสมบราห์มันxพื้นเมืองและโคลูกผสมชาโรเลส์xพื้นเมือง

นอกจากนี้ผลการวเิคราะห์พบวา่แม่โคกลุม่Primiparousมีคา่เฉลีย่ของตวัชี้วดัสงูกวา่แม่โคกลุม่Multiparous

สอดคล้องกับการศึกษาในโคนมของ ชาลีและคณะ (2549) และรายงานในต่างประเทศก็พบว่าแม่โคกลุ่ม

Primiparous มีประสิทธิภาพการสืบพันธุ์ต่ำกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับแม่โคกลุ่ม Multiparous (Kinsel and

Etherington,1998)เนื่องจากสารอาหารที่แม่โคกลุ่มPrimiparousได้รับเข้าไปร่างกายจำเป็นต้องมีการ

แบ่งส่วนสารอาหาร (partition) ไปเพื่อการเจริญเติบโตในสัดส่วนที่สูงเมื่อเทียบกับแม่โคกลุ่มMultiparous

(BellowsandShort,1978)ดงันัน้แม่โคกลุม่Multiparousแบง่สว่นสารอาหารเพือ่การสบืพนัธุ์จงึมีสดัสว่น

สงูกวา่แม่โคกลุม่Primiparousนอกจากนี้อาจเปน็ไปไดท้ี่วา่เกษตรกรได้ทยอยขายแม่โคที่มีความสมบรูณ์พนัธุ์

ต่ำออกไปทำให้เหลือแม่โคกลุ่มที่มีความสมบูรณ์พันธุ์สูงในฝูง

เมื่อพิจารณาแยกตามตัวชี้วัดที่ทำการศึกษาปรากฏดังนี้

อายุเมือ่ให้ลกูตวัแรก(AFC)พบวา่โคลกูผสมที่มีระดบัสายเลอืดอเมรกินับราห์มนัตัง้แต่50%ขึน้ไป

มีอายุเมื่อให้ลูกตัวแรกสูงกว่าโคที่มีระดับสายเลือดอเมริกันบราห์มันต่ำกว่า50%และโคพื้นเมืองสอดคล้อง

กับTamwasornetal.(1982)และรายงานในเม็กซิโก(MaganaandSegura,1997)แต่ต่ำกว่าโคบราห์มัน

พันธุ์แท้ (AB100%) ที่เลี้ยงในศูนย์ฯ / สถานี ซึ่งมีค่าเท่ากับ 3.91 ปี หรือประมาณ 46.92 เดือน

(กองบำรงุพนัธุ์สตัว,์2545)ทัง้นี้เปน็ผลมาจากโคพนัธุ์บราห์มนัมอีายุการเปน็หนุม่สาวชา้ประกอบกบัอายุการเปน็

หนุ่มสาวของโคพันธุ์บราห์มันมีค่าอัตราพันธุกรรมสูง ทำให้โคลูกผสมที่มีระดับสายเลือดบราห์มันสูงมีอายุ

เมื่อให้ลูกตัวแรกช้าตามไปด้วย(Nogueira,2004)

ระยะเวลาจากคลอดถึงผสมครั้งแรก (PTF) พบว่าแม่โคที่มีสายเลือดอเมริกันบราห์มันจะมีค่า

PTF ยาวนานกว่าแม่โคพื้นเมืองเนืองจากลูกผสมบราห์มันมีโครงสร้างของรูปร่างใหญ่กว่าโคพื้นเมืองจึงมี

ความตอ้งการอาหารเพือ่การดำรงชพีและสบืพนัธุ์สงูกวา่HentgesandHowes(1963)รายงานวา่ในสภาพ

การเลีย้งของเกษตรกรรายยอ่ยใช้หญา้ตามธรรมชาติและผลพลอยได้ทางการเกษตรเปน็แหลง่อาหารหยาบ

จึงมีแนวโน้มให้โคลูกผสมบราห์มันได้รับอาหารไม่เพียงพอทำให้กลับมาเป็นสัดช้ากว่าโคพื้นเมือง

แม่โคกลุ่มPrimiparousมีค่าPTFยาวนานกว่ากลุ่มMultiparousวันสอดคล้องกับNaharet

al.(1992)ที่ทำการศึกษาสมรรถนะแม่โคสายพันธุ์ซีบู(Zebutype)พบว่าช่วงระยะเวลาจากคลอดถึงผสม

ครั้งแรกของกลุ่มแม่โคลำดับท้องที่2(151.97+14.44วัน)ยาวนานกว่ากลุ่มแม่โคลำดับท้องที่3(127+

10.22 วัน) อย่างไรก็ดีจากการศึกษาในครั้งนี้พบว่าช่วงระยะเวลาจากคลอดถึงผสมครั้งแรกของโคลูกผสม

บราห์มันและโคพื้นเมืองสูงกว่าค่าทางอุดมคติที่ว่าแม่โคต้องได้รับการผสมพันธุ์และผสมติดภาย90-100

วันหลังคลอดทั้งนี้เนื่องมาจากการเลี้ยงโคเนื้อในภาคใต้เป็นเกษตรกรรายย่อยและเลี้ยงโคเป็นอาชีพเสริม

ทั้งขาดแคลนอาหารหยาบคุณภาพดีและขาดการจัดการฟาร์มที่ดี โดยเฉพาะไม่มีการจัดการหย่านมลูกโค

61


มีผลทำให้แม่โคไม่กลับสัดหลังคลอดนานประมาณ7-8 เดือน (Morrowetal, 1969)ซึ่งSpicerand

Echternkamp (1986) รายงานว่าแม่โคที่ลูกดูดนมต่อเนื่องและยาวนาน จะมีผลไปยับยั้งการเจริญของ

กระเปาะไข่และกระบวนการตกไข่นา่จะเปน็เหตผุลสำคญัประการหนึง่ที่ทำให้การกลบัสดัในแม่โคหลงัคลอด

ยาวนานออกไป

จำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด (SPC) พบว่าระดับสายเลือดลูกผสมอเมริกันบราห์มัน รวมทั้ง

ลำดับการให้ลูกไม่มีผลต่อSPCแต่ในกลุ่มMultiparousพบว่าแม่โคพื้นเมืองมีค่าSPCเท่ากับ1.36ต่ำ

ที่สุดสอดคล้องกับการศึกษาของTamwasornetal.(1982)และณัฐพรและคณะ(2549)ซึ่งค่าSPCที่

วัดได้จากการศึกษาในครั้งนี้อยู่ในเกณฑ์ดีมากซึ่งกรมปศุสัตว์(2545)แนะนำไว้คือ1.5ครั้ง

ระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึงผสมติด(DO)พบว่าค่าDOจะผันแปรโดยตรงกับระดับสายเลือดอเมริกัน

บราห์มันของแม่โค แสดงว่าแม่โคที่มีระดับสายเลือดอเมริกันบราห์มันสูงจะมีค่า DO มากกว่า สอดคล้อง

กับที่Roberts(1986)สำหรับลำดับการตั้งท้องพบว่าแม่โคกลุ่มPrimiparousมีค่าDOมากกว่าแม่โค

กลุ่ม Multiparous สอดคล้องกับพิพัฒน์และคณะ (2541) ที่ศึกษาในโคออสเตรเลี่ยนบราห์มันรายงานว่า

ค่าเฉลี่ยระยะเวลาท้องว่างของแม่โคให้ลูกระหว่างตัวที่ 1 - 2 (247.89+8.71วัน) นานกว่าระยะเวลา

ท้องว่างของแม่โคให้ลูกระหว่างตัวที่2–3(148.91+13.98วัน)

เป็นที่น่าสังเกตว่าจากค่าดัชนีชี้วัดPTFและSPCที่ปรากฏจะเห็นว่าการที่แม่โคมีระยะเวลาท้อง

วา่งหรอืระยะเวลาตัง้แต่คลอดถงึผสมตดิยาวมิได้มีสาเหตุมาจากการที่แม่โคผสมตดิยากหากเปน็ผลจากคา่

PTFที่นานมากกว่านั้นคือการที่แม่โคมีระยะการกลับสัดหลังคลอดหรือการกลับมามีวงรอบการทำงานของ

รังไข่อีกครั้งหลังคลอดยาวนาน

ระยะอุ้มท้อง(GL)พบว่าโคสาวมีระยะอุ้มท้องเฉลี่ย282.02+0.11วันและระดับสายเลือดของแม่

โคลูกผสมมีผลต่อระยะเวลาการตั้งท้องโดยพบว่าโคทีมีสายเลือดชาร์ โรเลย์มีแนวโน้มมีค่าGLนานกว่าสาย

เลือดลูกผสมอเมริกันบราห์มันและพันธุ์พื้นเมืองโดยลำดับการตั้งท้องมีค่าGLไม่แตกต่างกัน

ช่วงห่างการคลอดลูก (CI) พบว่าระดับสายเลือดลูกผสมอเมริกันบราห์มันไม่มีผลต่อระยะห่างการ

คลอดลูกแต่มีค่ามากกว่าของแม่โคพันธุ์พื้นเมืองซึ่งสอดคล้องกับ Tamwasorn et al. (1982) และจิตศักดิ์

และคณะ(2550)

อย่างไรก็ตามช่วงห่างการคลอดลูกของแม่โคเป็นตัวชี้วัดประสิทธิภาพทางการสืบพันธุ์ที่ดีที่สุดที่บ่ง

ชี้ถึงประสิทธิภาพการผลิตของสัตว์ทั้งหมดของฝูง(Mukasa-Mugerwa,1989)จากการศึกษาในครั้งนี้พบ

ว่าสูงกว่าค่าที่ยอมรับได้ ในโคเนื้อเขตร้อนที่ 410 - 440 วัน ทั้งนี้เพราะมีหลายปัจจัยมากระทบทั้ง สภาพ

แวดล้อมการจัดการและพันธุกรรม(Lôboetal.,1988)

สรุปผล สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคลูกผสมบราห์มันและชาร์ โรเล่ย์มีประสิทธิภาพทางการสืบพันธุ์ต่ำ

กว่าโคพื้นเมืองและแม่โคกลุ่มPrimiparousมีประสิทธิภาพทางการสืบพันธุ์ต่ำกว่ากลุ่มแม่โคMultiparous

นอกจากนี้ยงัพบวา่ชว่งระยะเวลาจากคลอดถงึผสมครัง้แรกของโคลกูผสมบราห์มนัและโคพืน้เมอืงสงูกวา่คา่

ทางอดุมคติที่วา่แม่โคตอ้งได้รบัการผสมพนัธุ์และผสมตดิภาย90-100วนัหลงัคลอดมีผลทำให้แม่โคในภาค

ใต้มีช่วงห่างการคลอดลูกของแม่โคยาวส่งผลถึงประสิทธิภาพการผลิตโคเนื้อโดยรวมของเกษตรกรรายย่อย

62


ข้อเสนอแนะ ระยะเวลาจากคลอดถงึผสมครัง้แรกเปน็ชว่งสำคญัทีส่ดุแม่โคตอ้งการอาหารคณุภาพดีโดยเฉพาะ

โคลกูผสมบราห์มนัที่มีโครงสรา้งใหญ่และการหยา่นมลกูโคจะเปน็ประโยชน์อยา่งยิง่กบัแม่โคในชว่งที่อาหาร

สัตว์ไม่สมบูรณ์โดยสามารถหย่านมได้ตั้งแต่ลูกโคอายุ6–7เดือนหรือใช้การหย่านมแบบชั่วคราวคือ

การแยกแม่โคกับลูกเป็นชั่วเวลาสั้นๆ เพื่อไม่ให้ลูกโคดูดนมต่อเนื่องนานเกินไป จะช่วยแม่โคกลับมาเป็น

สัดหลังคลอดเร็วขึ้นทั้งนี้ควรพิจารณาสุขภาพของลูกโคประกอบการหย่านม

กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุณนายสัตวแพทย์ชาญยุทธ กาพล ผู้อำนวยการศูนย์วิจัยการผสมเทียมและเทคโนโลยี

สุราษฎร์ธานี เจ้าหน้าที่ผสมเทียมประจำหน่วย เจ้าหน้าที่ของศูนย์ฯ ผสมเทียมสุราษฎร์ธานีทุกท่านที่ช่วย

ตรวจสอบความถูกต้องของข้อมูล คุณจุรีรัตน์ แสนโภชน์ และคุณสายัณห์ บัวบาน นักวิชาการสัตวบาล

ชำนาญการพเิศษสำนกัเทคโลยีชวีภาพการผลติปศสุตัว์กรมปศสุตัว์ที่ ให้คำแนะนำในการวเิคราะห์ขอ้มลูและ

ตรวจแก้ไขต้นฉบับ

เอกสารอ้างอิง กรมปศุสัตว์2545คู่มือสำหรับเจ้าหน้าที่ผสมเทียมเล่ม5กรุงเทพ:กระทรวงเกษตรและสหกรณ์

กองบำรุงพันธุ์สัตว์2545คู่มือการปฏิบัติงานผลิตและวิจัยโคเนื้อในศูนย์วิจัยฯ/สถานีบำรุงพันธุ์สัตว์

กองบำรุงพันธุ์สัตว์กรมปศุสัตว์กรุงเทพฯ290หน้า

กองแผนงาน ข้อมูลจำนวนปศุสัตว์ ในประเทศไทย ปี 2542 กรมปศุสัตว์ กระทรวงเกษตร

และสหกรณ์-กรุงเทพฯ376หน้า

จิตศักดิ์ เมืองเขียว และ ชาญยุทธ กาพล 2550 ปัจจัยที่มีผลกระทบต่อช่วงห่างการให้ลูกของ

โคพืน้เมอืงและลกูผสมชาร์ โรเลส์วารสารเทคโนโลยีชวีภาพสรุาษฎรธ์านีปีที่2ฉบบัที่1สงิหาคม

2550

ชาลีลีละสิริสายัณห์บัวบานและจุรีรัตน์แสนโภชน์2549สมรรถภาพการสืบพันธุ์ โคนมลูกผสม

ระดับสายเลือดต่างๆของเกษตรกรรายย่อยในประเทศไทยวารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิต

ปศุสัตว์ปีที่1ฉบับที่1สิงหาคม2549

ณัฐพร จุ้ยจุลเจิม สมพงษ์ เทศประสิทธ์ และศิริชัย ศรีพงศ์พันธุ์ 2549 สมรรถภาพทางการ

สบืพนัธุ์บางประการของโคพืน้เมอืงเพศเมยีในจงัหวดัชมุพรและระนองรายงานการประชมุวชิาการ

สัตวศาสตร์ ภาคใต้ ครั้งที่ 4ณมหาวิทยาลัยสงขลานครรินทร์ วิทยาเขตหาดใหญ่ จังหวัด

สงขลาระหว่าง15–16สิงหาคม2549หน้า354-363

ณัฐพร จุ้ยจุลเจิม 2550 สมรรถภาพทางการสืบพันธุ์บางประการของโคพื้นเมืองเพศเมียทาง

ภาคใต้ตอนบนของไทยจากฐานข้อมูลซึ่งบันทึกโดยเจ้าหน้าที่ผสมเทียมของรัฐวิทยานิพนธ์วิทยา

ศาสตรมหาบัณฑิตมหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์95หน้า

63


พิชิตชูเสนสมมาตรสุวรรณมาโจและสุวิชบุญโปร่ง2548ความสมบูรณ์พันธุ์บางประการของ

โคพนัธุ์บราห์มนัที่เลีย้งในศนูยว์จิยัและบำรงุพนัธุ์สตัว์ทบักวาง.[online]http://www.dld.go.th/

research-AHD/research/Webpage/Research_2548_1.html

พพิฒัน์สมภารกญัจนะมากวิจติร์ศรเทพธมัวาสรบณัฑติธานนิทร์ธราธารและนนัทาวาณชิยเศรษฐกลุ

2541 การปรับปรุงความสมบูรณ์พันธุ์ภายหลังคลอดของแม่โคพันธุ์ออสเตรเลียนบราห์มันใน

สภาพการเลี้ยงระดับหมู่บ้านในจังหวัดอ่างทองและอุทัยธานี ประชุมทางวิชาการ ครั้งที่ 36:

บทคัดย่อ3-5กุมภาพันธ์2541มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์297หน้า

ศูนย์สารสนเทศ 2553 ข้อมูลสถิติปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์ กระทรวงเกษตรและสหกรณ์ [Online]

http://www.dld.go.th/ict/stat_web/yearly/yearly52/stock52/region/table2.pdf

สุณีรัตน์ เอี่ยมละมัย 2550 การจัดการและการดูแลสุขภาพโคเนื้อเบื้องต้น วารสารศูนย์บริการ

วิชาการมหาวิทยาลัยขอนแก่น15(3):41-45

สมบัติ ศรีจันทร์ 2542 อิทธิพลของฤดูกาลต่อการผลิตของลูกโคพันธุ์ออสเตรเลียนบราห์มันและ

โคพันธุ์ลูกผสม บราห์มัน เอกสารการประชุมสัมมนาทางวิชาการ สถาบันเทคโนโลยีราชมงคล

ครั้งที่16:เล่ม2สาขาเกษตรศาสตร์หน้า251-285

Bellows,R.A.andShort,R.E.1978.Effectsofprecalvingfeedlevelonbirthweight,

calvingdifficultyandsubsequentfertility.J.Anim.Sci.46:1522-1528.

Hentges,J.F.Jr.andHowes,J.R.,1963.Milkproduction.In:T.J.Cunha,M.Koger

andA.C.Warnick(Ed.)CrossbreedingBeefCattle.Univ.ofFloridaPress,Gainesville.

p.93-97.

Kadarmideen,H.N.andCoffey,M.2001.Qualityandvalidationofinseminationdatafor

nationalgeneticevaluationsfordairycowfertilityintheUnitedKingdom.Interbull

Bulletin27.Proceedingsofthe2001InterbullMeetinginBudapest,Hungary,August

30-31,2001.

Kinsel,M.L.andEtherington,W.G.1998.Factorsaffectingreproductiveperformancein

Ontariodairyherds.Theriogenology.50:1221-1238.

Lôbo,R.B.,Reis,J.C.,Duarte,F.A.M.andWilcox,C.J.1988.Reproductiveperformance

ofPitangueirascattleinBrazil.BrazilJournalGenetics.11:51-61.

Magaña,J.G.andSegura,J.1997.Heritabilityandfactorsaffectinggrowthtraitsand

ageatfirstcalvingofzebuheifersinsouth-easternMexico.TropicalAnimalHealth

andProduction.29:185-192.

Morrow,D.A.,Roberts,S.J.andMcEntee,K.1969.Postpartumovarianactivityand

involutionoftheuterusandcervixindairycattleovarianactivity.CornellVeterinarian.

59:173-199.

Mukasa-Mugerwa,E.1989.AreviewofreproductiveperformanceoffemaleBosindicus

64


(zebu)cattle.ILCAmonographno.6.InternationalLivestockCentreforAfrica(ILCA).

AddisAbaba,ET.134p.

Nahar,T.N.,Islam,M.andHasnath,M.A.1992.Acomparativestudyontheperformance

of F1 crossbred cows, under rural conditions in and around the BAU campus,

Asian-AustralasianJournalofAnimalScience.5:35-438.

Nebel, R.L. and Jobst,S.M. 1998. Evaluation of systematic breeding programs for

lactatingdairycows.J.DairySci.81:1169–1174.

Nogueira,G.P.2004.Puberty inSouthAmericanBos indicus (Zebu)cattle.Animal

ReproductionScience.82–83:361–372.

Plasse,D.,Warnick,A.C.,Reese,R.E.andKoger,M.1968.Reproductivebehaviorof

Bosindicusfemalesinsubtropicalenvironment.II.GestationlengthinBrahmancattle.

J.Anim.Sci.27:101-104.

Roberts, S. J. 1986. Veterinary Obstetrics and Genital Diseases, 2nd ed. CBS

Publishers,NewDelhi,Lucknow.p.230-232

Sacco, R.E., Baker, J.F., Cartwright, T.C., Long, C.R. and Sanders, J.O. 1990.

Measurements at calving for straightbred and crossbred cowsof diverse types.

JournalofAnimalScience.68:3103-3108.

Spicer,L.J.andEchternkamp,S.E.1986.Ovarianfolliculargrowth,functionandturnover

incattle:Areview.JournalofAnimalScience.62:428-451

Tamwasorn,S.,Prucsasri,P.,Markvichitr,B.,Rengsirikul,P.andChantalakhana,C.1982.

ComparativeperformanceofThaiindigenousnative,BrahmanhalfbredandCharolais

halfbredcattleatKamphaengsaenanimalresearchstation.Proceedingoftheanimal

scienceresearch.The20thannualconference.KasetsartUniversity1–5February

1982.p.363-376.

65


บทคัดย่อ การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินค่าพลังงานเชิงลบคือระดับความเข้มข้นของค่า

non – esterified fatty acid (NEFAs) และกลูโคสในซีรั่ม ที่มีผลต่อค่าสมรรถนะการสืบพันธุ์ คือ

ระยะคลอดถึงผสมครั้งแรก (days to first service) ระยะคลอดถึงผสมติด (days open) จำนวนครั้ง

ที่ผสมเทียมต่อการผสมติด (service per conception) อัตราการผสมติดจากการผสมเทียมครั้งแรก

(first service conception rate) รวมถึงความสัมพันธ์ระหว่างค่า NEFAs และกลูโคสกับค่าสมรรถนะ

การสืบพันธุ์ ในโคนมลูกผสมไทยโฮลสไตน์ช่วงก่อนและหลังคลอดจำนวน 69 ตัว ในอำเภอ ชัยบาดาล

และท่าหลวง จังหวัดลพบุรี โดยเก็บตัวอย่างเลือดที่ 2 สัปดาห์ก่อนคลอดและ หลังคลอด ผลปรากฏว่า

ระดับกลูโคสก่อนคลอดมีค่าเท่ากับ 34.90±1.65 mg/dL และหลังคลอดมีค่าเท่ากับ 26.17±1.47 mg/

dL ส่วนระดับ NEFAs ก่อนคลอดมีค่าเท่ากับ 0.398±0.035 mEq/L และหลังคลอด 0.475±0.049

mEq/Lและค่าสมรรถนะระบบสืบพันธุ์ได้แก่จำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอด(Daystofirstservice)

มีค่าเท่ากับ83.86±4.11วันจำนวนวันคลอดจนถึงผสมติด(Daysopen)มีค่าเท่ากับ106.76±5.66วัน

จำนวนครัง้ที่ผสมตดิ(Serviceperconception)มีคา่เทา่กบั1.65±0.14ครัง้และอตัราการผสมตดิครัง้แรก

(Firstserviceconceptionrate)ร้อยละ47.62ซึ่งจะพบว่าแม่โคในฟาร์มดังกล่าวมีระดับของการเกิด

พลังงานเชิงลบโดยสังเกตจากระดับของกลูโคสที่ลดต่ำลงและระดับ NEFAs มีค่าสูงขึ้นในช่วงหลังคลอด

ซึ่งการเกิดสภาวะพลังงานเชิงลบดังกล่าวส่งผลกระทบต่อความสมบูรณ์พันธุ์ทำให้จำนวนวันผสมครั้งแรก

หลังคลอดยาวนานขึ้น

คำสำคัญ:กรดไขมันอิสระกลูโคสความสมบูรณ์พันธุ์พลังงานเชิงลบแม่โคนม

เลขทะเบียนผลงานวิจัย54(1)-0108–031

อรุณ จันทร์กระจ่าง1 ไกรวรรณ หงษ์ยันตรชัย1

1ศูนย์วิจัยการผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพสระบุรี จ. สระบุรี 18260

อิทธิพลของพลังงานเชิงลบช่วงหลังคลอดต่อความสมบูรณ์พันธุ์ในแม่โคนมลูกผสมไทยโฮลสไตน์

66


Abstract The aim of this studywas to evaluate the effects of the negative energy balance

such as the concentration of non – esterified fatty acid (NEFAs) and serum glucose on

reproductiveperformanceincludingdaystofirstservice,daysopen,servicesperconception,

firstserviceconceptionrateaswellastherelationshipbetweenNEFAsandserumglucoseand

reproductiveperformance.Thestudywasperformedin69ThaiHolsteinCrossbreddairycows

atChaibadarnandThaluangdistrictinLopburiprovince.Bloodsampleswerecollectedtwo

timesattwoweeksprepartumandtwoweekspostpartum.Meansandstandarddeviationsof

glucosepreandpostpartumwere34.90±1.65mg/dLand26.17±1.47mg/dLwhereasNEFAs

preandpostpartumwere0.398±0.035mEq/Land0.475±0.049mEq/L.Meansandstandard

deviationsofdaystofirstservice,daysopen,servicesperconception,firstserviceconception

rate were 83.86±4.11 days, 106.76±5.66 days, 1.65±0.14 times and 47.62% respectively.

TheresultsshowedthatatpostpartumNEFAsincreasedsignificantly(p<0.05)whileglucose

decreased significantly (p< 0.05) compared to those of prepartum. It was concluded that

negativeenergybalancehadeffectonprolongingdaystofirstservice.

Keywords:Non–esterifiedfattyacid,Glucose,Fertility,NegativeEnergyBalance,Cows

Researchprojectno.54(1)-0108-031

Arun Chankrachang1 Kriwan Hongyantrachai1

1Saraburi Artificial Insemination and Biotechnology Research Center, Saraburi 18260

InfluenceofNegativeEnergyBalanceduringPostpartumonFertilityinThai-HolstienCows

67


บทนำ ความไม่สมบูรณ์พันธุ์ ในแม่โคนม เกิดจากปัจจัยหลายสาเหตุซึ่งเป็นปัญหาที่ก่อให้เกิดความสูญเสีย

ทางด้านเศรษฐกิจอย่างมากต่อเกษตรกรผู้เลี้ยงโคนม สาเหตุที่สำคัญประการหนึ่งคือ พลังงานเชิงลบ

(Negativeenergybalance,NEB)ในชว่งหลงัคลอดพลงังานเชงิลบหมายถงึภาวะที่รา่งกายได้รบัสารให้

พลงังานไม่เพยีงพอกบัที่รา่งกายตอ้งการใช้ซึง่เกดิจากความตอ้งการพลงังานเพิม่ขึน้รวมถงึการเปลีย่นแปลง

ทางสรีระและระดับฮอร์ โมนช่วงก่อนและหลังคลอดเป็นสาเหตุให้ร่างกายแม่โคนำไปสู่สภาวะที่มีพลังงาน

เชงิลบ(Harrisonetal.,1990)ระยะนี้แม่โคมีความอยากอาหารลดลงทำให้กนิได้นอ้ยจงึสญูเสยีนำ้หนกัตวั

และแสดงอาการตอบสนองต่อพลังงานเชิงลบโดยดึงพลังงานที่ร่างกายเก็บสำรองไว้มาใช้ได้แก่ไกลโคเจน

ไขมันและโปรตีนเพื่อชดเชยพลังงานที่ต้องการ(Rakkwamsuketal.,2006)การสลายไขมันที่สะสมใน

เนื้อเยื่อของไขมันทำให้ระดับnon–esterifiedfattyacid(NEFAs)ในเลือดสูงขึ้นส่งผลให้แม่โคมีปัญหา

การสะสมของไขมันในตับและรบกวนการทำงานของตับนำไปสู่ภาวะketosisและfattyliverรวมทั้งเป็นพิษ

ต่อรังไข่และฟอลลิเคิลและพลังงานเชิงลบจะทำให้ลดการหลั่งGnRHและLHส่งผลต่อวงรอบการเป็นสัด

(Butler and Canfield, 1989) ทำให้การตกไข่ครั้งแรกหลังคลอดล่าช้าออกไป (Staples et al., 1990)

และอัตราการผสมติดลดลง(Wathesetal.2003and2007)

ค่าที่บ่งชี้ถึงสภาวะพลังงานเชิงลบมี2ชนิด ได้แก่กลูโคสซึ่งเป็นแหล่งพลังงานหลักสำหรับรังไข่

และ NEFAs ในกระแสเลือด (Rabiee et al., 1999) ที่สะท้อนถึงสภาพการจัดการด้านโภชนาการใน

แม่โคนมทั้งก่อนและหลังคลอดของเกษตรกร ซึ่งสภาวะพลังงานเชิงลบในช่วงหลังคลอด จะเกิดขึ้นโดยปกติ

อยู่แล้ว(Butler,2006)ถ้าแม่โคที่มีร่างกายแข็งแรงและมีความสมบูรณ์ดีจะแก้ไขสภาพพลังงานเชิงลบและ

สามารถฟืน้ตวัได้เรว็โดยแม่โคสว่นใหญ่จะปรบัตวัจนเขา้สู่สภาวะสมดลุของพลงังานที่ประมาณ6-8สปัดาห์

หลังคลอด(Blocketal.,2001;Heueretal.,2001)โดยแม่โคที่ร่างกายไม่สมบูรณ์ต้องใช้ระยะเวลานาน

ในการปรบัตวัเขา้สู่สภาวะสมดลุของพลงังานการทดลองครัง้นี้เพือ่ศกึษาขอ้มลูของระดบักลโูคสและNEFAs

ในกระแสเลอืดที่ทำให้เกดิปญัหาพลงังานเชงิลบในแม่โคนมที่เลีย้งในฟารม์เกษตรกรรายยอ่ยจงัหวดัลพบรุี

และใช้เป็นแนวทางในการเฝ้าระวังป้องกันไม่ให้แม่โคเกิดปัญหาพลังงานเชิงลบภายหลังคลอด อันจะส่งผล

ให้แม่โคไม่กลับเป็นสัดตามปกติ มีปัญหาผสมติดล่าช้า มีจำนวนวันท้องว่างยาวนาน และลดผลกระทบต่อ

ประสิทธิภาพการผลิตจนเกษตรกรเกิดความสูญเสียทางด้านเศรษฐกิจ

68


อุปกรณ์และวิธีการ สัตว์ทดลอง

โคลูกผสมไทยโฮลสไตน์มีระดับสายเลือดตั้งแต่87.5–93.75เปอร์เซ็นต์แม่โคทั้งหมดมีสุขภาพ

สมบูรณ์อายุในช่วง3-7ปีเลี้ยงในฟาร์มโคนมของเกษตรกรรายย่อยในจังหวัดลพบุรีโดยแม่โคทั้งหมด

ได้รับการเลี้ยงดูและการจัดการที่คล้ายคลึงกันคืออยู่ในโรงเรือนแบบปล่อยตลอดเวลารีดนมวันละ2ครั้ง

พร้อมสังเกตการเป็นสัดคือช่วงเช้า06.00–07.00น.ในช่วงบ่าย14.00–15.00น.การให้อาหารข้น

โปรตีน16%วันละ2ครั้งโดยให้เป็นสัดส่วนคือให้อาหารข้น1กิโลกรัมต่อปริมาณน้ำนม2กิโลกรัม

ที่แม่โคผลิตได้ สำหรับอาหารหยาบช่วงเดือน มิถุนายน – ธันวาคมให้หญ้าสดเช่น หญ้าขน หญ้ารูซี่

หญ้าเนเปียร์ กินเต็มที่ สลับกับฟางวันละ 2 มื้อ ส่วนช่วงเดือนมกราคม-พฤษภาคมให้ฟางหรือฟางหมัก

วันละ2มื้อ

การเก็บตัวอย่าง

สุ่มตัวอย่างโคนมตั้งท้องจำนวน 69 ตัว จดบันทึกประวัติ และเก็บตัวอย่างเลือดตัวละจำนวน

10 ซีซี. ก่อนและหลังคลอด 2 สัปดาห์ ปั่นแยกซีรั่ม แช่แข็งไว้ส่งห้องปฏิบัติการเพื่อตรวจระดับ กลูโคส

และNEFAsสังเกตอาการเป็นสัดของแม่โคนมหลังคลอดและผสมเทียมโดยน้ำเชื้อจากพ่อพันธุ์และชุดการ

ผลิตเดียวกันของกรมปศุสัตว์ โดยเจ้าหน้าที่ผสมเทียมที่มีความชำนาญเพียงคนเดียวจนกว่าจะผสมติดถ้า

แม่โคไม่กลับแสดงอาการเป็นสัดหลังการผสมเทียม 60 วัน จะตรวจการตั้งท้อง ติดตามและบันทึกข้อมูล

สมรรถนะทางการสบืพนัธุ์ไดแ้ก่ระยะคลอดถงึผสมครัง้แรก(daystofirstservice)ระยะคลอดถงึผสมตดิ

(days open) จำนวนครั้งที่ผสมเทียมต่อการผสมติด (service per conception) และอัตราการผสมติด

จากการผสมเทียมครั้งแรก(firstserviceconceptionrate)

การวิเคราะห์ข้อมูล

วิเคราะห์สถิติโดยใช้RegressionanalysisโดยมีIndependentvariableคือระดับกลูโคสกับ

NEFAsและDependentvariableคือ1.ระยะคลอดถึงผสมครั้งแรก2.ระยะคลอดถึงผสมติด3.จำนวน

ครั้งที่ผสมเทียมต่อการผสมติด4.อัตราการผสมติดจากการผสมเทียมครั้งแรกโดยแยกวิเคราะห์เฉพาะผล

ของกลูโคสกับNEFAsที่มีต่อค่าสมรรถนะทางการสืบพันธุ์ทั้ง4ค่าและวิเคราะห์Multipleregression

ของผลร่วมของกลูโคสกับNEFAsกับทั้ง4ตัวเพื่อดูความสัมพันธ์ระหว่างกลูโคสกับNEFAsว่าจะมี

Interactionกันหรือไม่

ผลการทดลองและวิจารณ์ ระดับกลูโคสในซีรั่มของแม่โคนมก่อนและหลังคลอดมีค่าดังนี้คือก่อนคลอด2สัปดาห์มีค่าเท่ากับ

34.90±1.65mg/dLและหลังคลอด2สัปดาห์มีค่าเท่ากับ26.17±1.47mg/dLซึ่งลดลงอย่างมีนัยสำคัญ

(P<0.05)ส่วนระดับNEFAsในช่วงก่อนคลอด2สัปดาห์มีค่าเท่ากับ0.398±0.035mEq/Lและหลัง

คลอด2สัปดาห์มีค่าเท่ากับ0.475±0.049mEq/Lซึ่งเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ(P<0.05)ดังตารางที่1

69


และขอ้มลูสมรรถนะระบบสบืพนัธุ์ของแม่โคนมไดแ้ก่จำนวนวนัผสมครัง้แรกหลงัคลอด(Daystofirstservice)

มีค่าเท่ากับ83.86±4.11วันจำนวนวันคลอดจนถึงผสมติด(Daysopen)มีค่าเท่ากับ106.76±5.66วัน

จำนวนครั้งที่ผสมติด(Serviceperconception)มีค่าเท่ากับ1.65±0.14ครั้งอัตราการผสมติดครั้ง

แรก(Firstserviceconceptionrate)มีค่าเท่ากับร้อยละ47.62ดังตารางที่2และจากผลการวิเคราะห์

ความสัมพันธ์ของค่ากลูโคสและ NEFAsพบว่าไม่มีความสัมพันธ์ ในทางสถิติกับค่าสมรรถนะระบบสืบพันธุ์

(P>0.05)

NEFAs(mEq/L)

Glucose(mg/dL)

0.398a±0.035

34.90a±1.65

means±SD

0.475b±0.049

26.17b±1.47

means±SD

0.122-1.588

13.40-61.28

range

ก่อนคลอด หลังคลอด

0.096-2.371

7.505-51.812

range

ตาราง ที่ 1 แสดงระดับNEFAs (mEq/L) และGlucose (mg/dL) ในซีรั่มของแม่โคนมจำนวน69ตัว

ตรวจวัดระดับที่ก่อนคลอด2สัปดาห์(prepartum)และหลังคลอด2สัปดาห์(postpartum)

ตาราง ที่ 2 แสดงค่าสมรรถนะระบบสืบพันธุ์ของแม่โคนมที่ศึกษา

abc แสดงค่าเฉลี่ยของระดับ NEFAs และ Glucose ระหว่างก่อนและหลังคลอดที่ความแตกต่างอย่าง มีนัยสำคัญ(P<0.05)

* ค่าที่เหมาะสมของค่าสมรรถนะระบบสืบพันธุ์ โคนม(Hermanetal.,1994และDahletal.,1991)

จำนวนโค(ตัว)

จำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอด(วัน)

จำนวนวันคลอดจนถึงผสมติด(วัน)

จำนวนครั้งที่ผสมติด(ครั้ง)

อัตราการผสมติดครั้งแรก(ร้อยละ)

69

83.86±4.11

106±5.66

1.65±0.14

47.62

means±SD

52-142

56-215

1-4

60

<100

<2.0

70

range ค่าที่เหมาะสม*ค่าสมรรถนะระบบสืบพันธุ์

ชว่งระหวา่งการคลอดคา่ชวีเคมีของเลอืดที่บง่ชี้ถงึสภาวะพลงังานเชงิลบถกูประเมนิโดยระดบักลโูคส

และNEFAsในกระแสเลอืด(Jimspain,2005)การศกึษานี้ระดบักลโูคสในซีรัม่ของแม่โคนมที่2สปัดาห์

หลังคลอด ลดลงจากที่ 2 สัปดาห์ก่อนคลอด อย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05) สอดคล้องกับ Rukkwamsuk

(2010)ซึ่งชี้ ให้เห็นว่าแม่โคนมเข้าสู่ช่วงพลังงานเชิงลบหลังคลอดโดยเฉพาะช่วง2สัปดาห์ของการให้นม

การลดลงของระดับกลูโคสในกระแสเลือดจากผลของการเกิดพลังงานเชิงลบในช่วงหลังคลอดนี้

จะทำให้แม่โคนมมีการเพิ่มการเคลื่อนย้ายของพลังงานสำรองโดยการเพิ่มขบวนการสลายไขมันจากเนื้อเยื่อ

ไขมัน (MacNamara, 1986 ; Rukkwamsuk et al., 1999) ส่งผลให้มีระดับ NEFAsในกระแสเลือด

มากขึ้นซึ่งNEFAsเป็นตัวบ่งชี้ถึงระดับของการเคลื่อนย้ายไขมันและสภาวะพลังงานเชิงลบ

70


ในช่วงการเจริญเติบโตของโอโอไซต์(oocyte)ระยะแรกกลูโคสและNEFAsสามารถผ่านเข้าไป

ในของเหลวในฟอลลิเคิล(follicularfluid)ได้ง่ายและมีผลต่อโอโอไซต์โดยตรง(Fernandezetat.,2006)

โดยระดับความเข้มข้นของกลูโคสในกระแสเลือดในช่วงสภาวะ NEB จะมีค่าลดลงอย่างมีนัยสำคัญและ

มีผลโดยตรงต่อระดับความเข้มข้นของกลูโคสในของเหลวในฟอลลิเคิล(Lopezetal.,2003;Martinet

al., 2008) มีผลทำให้ยับยั้งการเจริญเติบโตของ โอโอไซต์ เนื่องจากขาดกลูโคสซึ่งใช้เป็นแหล่งพลังงาน

ส่วน NEFAs ในกระแสเลือดจะเป็นพิษโดยตรงต่อฟอลลิเคิล ซึ่งจะชักนำให้ Cumulus cells ตาย และ

ฟอลลิเคิลหยุดการเจริญเติบโต(Jorritsmaetal.,2004;Friggens,2003;Bossaertetal.,2008)

การขาดพลงังานหลงัคลอดทำให้ไม่เกดิการตกไข่ซึง่ตอ่มาจะพฒันากลายเปน็ถงุนำ้ในรงัไข่(Boland

etal.,2001;Vanholderetal.,2006)และมีผลกระทบต่อการทำงานของคลอปัสลูเทียมและส่งผลถึง

การผลิตโปรเจสเตอโรน(VanKnegseletat.,2007;Vanholderetal.,2006)ซึ่งสภาวะเหล่านี้ทำให้

เยื่อบุมดลูกไม่มีการเปลี่ยนแปลงทั้งรูปร่างและการทำงานในช่วงการผสมครั้งแรกหลังคลอดและมีผลที่ ไม่ดี

ต่อสภาพแวดล้อมภายในมดลูกซึ่งจำเป็นต่อการฝังตัวของตัวอ่อน ทำให้การเข้าอู่ของมดลูกล่าช้าหลังคลอด

(30-40 วัน) และเป็นสาเหตุหลักของการเกิดมดลูกอักเสบในฝูง (Rossi et al., 2008; Huzzey et al.,

2007)เช่นเดียวกับJacksonetal.(2011)และLeBlancetal.(2010)รายงานว่าNEBก่อนคลอดมี

ความสมัพนัธ์กบัการเกดิendometritisและNEBหลงัคลอดสมัพนัธ์กบัการเกดิถงุนำ้ในรงัไข่และการทำงาน

ของคลอปัสลูเทียมที่ล่าช้า

ในชว่งกอ่นและหลงัคลอดเปน็จดุวกิฤติที่สำคญัตอ่สขุภาพและความสมบรูณ์พนัธุ์แม่โคสว่นใหญ่จะเกดิ

พลงังานเชงิลบสง่ผลถงึวงรอบการเปน็สดัปกติและอตัราการผสมตดิ(Wathesetal.,2009)ภาวะพลงังาน

เชิงลบ จะเริ่มเกิดประมาณ 1 สัปดาห์ก่อนคลอด เนื่องจากการกินได้ลดลงและยังคงดำเนินต่อไปมากกว่า

2-3สัปดาห์และถึงจุดสูงสุดที่ประมาณ2สัปดาห์หลังคลอด(Butler,2006)โคส่วนใหญ่จะปรับตัวจนเข้า

สู่ภาวะสมดุลของพลังงานที่ประมาณ6-8สัปดาห์หลังคลอด(Blocketal.,2001;Heueretal.,2001)

หรือ อาจเป็นระยะเวลานานหลายสัปดาห์ก่อนที่จะกลับเข้าสู่สภาวะปกติ (Wathes, 2008) ซึ่งระยะนี้อาจ

ยาวนานถ้าโคไม่ได้รับพลังงานจากสารอาหารเพียงพอ(Grummeretal.,2004)ความรุนแรงและระยะ

เวลาของการขาดพลังงาน มีผลต่อระบบสืบพันธุ์และความสมบูรณ์พันธุ์ (Pryce et at., 2001;Wathes,

2008)โดยปกติแล้วแม่โคควรได้รับการผสมครั้งแรกไม่เกิน60วันหลังคลอด(Dahletal.,1991)แต่จาก

การศึกษาครั้งนี้จำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอดมีค่าเท่ากับ83.86±4.11วันซึ่งมีค่ามากกว่าปกติแสดงให้

เห็นว่าภาวะดังกล่าวส่งผลกระทบต่อจำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอด ซึ่งมีค่าใกล้เคียงกับ Rukkwamsuk

(2010) รายงานว่า จำนวนวันคลอดถึงเป็นสัดครั้งแรกมีค่าเท่ากับ 72±65 วันซึ่งมีค่ามากกว่าปกติ

และสอดคล้องกับGeorge ที่รายงานว่าการเพิ่มภาวะพลังงานเชิงลบ อาจทำให้การตกไข่ครั้งแรกล่าช้า

ที่60-75วันหรือยาวนานกว่านั้น

จำนวนวันคลอดจนถึงผสมติดมีค่าเท่ากับ106.76±5.66วันซึ่งมีค่ามากกว่าปกติส่วนจำนวนครั้ง

ที่ผสมติดมีค่าเท่ากับ 1.65±0.14 ครั้งอาจเนื่องจากแม่โคสามรถกลับเข้าสู่สภาวะสมดุลของพลังงานและ

สภาพแวดล้อมภายในมดลูกพร้อมรับการผสมทำให้จำนวนครั้งที่ผสมติดมีค่าน้อยและอัตราการผสมติดครั้ง

แรกมีค่าเท่ากับร้อยละ 47.62 ซึ่งมีค่าน้อยกว่าปกติ ในขณะที่ Rukkwamsuk (2010) รายงานอัตราการ

71


ตัง้ทอ้งจากการผสมเทยีมครัง้แรกเทา่กบัรอ้ยละ28.6ซึง่การศกึษานี้แสดงให้เหน็วา่แม่โคนมในฟารม์ที่ศกึษา

มีระดบัการเกดิพลงังานเชงิลบแต่ไม่รนุแรงและเปน็ระยะเวลานานในการกลบัสู่สภาวะพลงังานสมดลุซึง่ภาวะ

ดังกล่าวทำให้ส่งผลกระทบต่อจำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอดยาวนานขึ้น

แม่โคใกล้คลอดการกินได้จะลดลง25-40เปอร์เซ็นต์(Grummeretal.,2004)ซึ่งการลดการกิน

ได้ส่งผลกับการเกิดสภาวะNEB (Huzzey et al., 2007) ทำให้แม่โคสูญเสียคะแนนร่างกาย โดยสภาวะ

NEBสามารถสงัเกตจากการเปลีย่นแปลงคะแนนรา่งกายของแม่โคซึง่เปน็วธิีการที่ ใช้มากทีส่ดุเพือ่ใช้ประเมนิ

ค่าสมดุลของพลังงาน (Pryceetal.,2001)และสามารถใช้ ในการประเมินสภาวะการสลายไขมันที่สะสม

ในเนื้อเยื่อไขมันได้(Rukkwamsuketal.,2006)ถ้าคะแนนร่างกายลดลง0.5หน่วยระหว่างช่วงแห้งนม

และสัปดาห์แรกของการให้นมอัตราการผสมติดจะลดลง10เปอร์เซ็นต์(Butler,2003)และอัตราการผสม

ติดลดลงน้อยกว่าร้อยละ30เมื่อคะแนนร่างกายลดน้อยลงกว่า1หน่วย(Formigonietal.,2003)ดังนั้น

แม่โคควรจะสูญเสียคะแนนร่างกายประมาณ1หน่วยในช่วง4สัปดาห์หลังคลอดถ้าสูญเสียมากกว่านั้นจะ

ส่งผลต่ออัตราการผสมติดครั้งแรกลดต่ำลง

สรุปผลการทดลอง จากผลการทดลองนี้ชี้ ให้เห็นว่าแม่โคนมในฟาร์มเกษตรกรมีการเกิดสภาวะพลังงานเชิงลบที่ส่ง

ผลกระทบต่อความสมบูรณ์พันธุ์ทำให้จำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอดยาวนานขึ้น ทำให้เราต้องใส่ใจใน

การป้องกันโดยเฉพาะการจัดการด้านโภชนาการและการกินได้ ในช่วงก่อนและหลังคลอด โดยการเพิ่ม

เข้มข้นของโภชนะในสูตรอาหารและความถี่ของการให้อาหารต่อวันให้มากขึ้นให้อาหารสดใหม่และเพียงพอ

กับระดับของพลังงานที่ โคต้องการ ทั้งนี้เกษตรกรผู้เลี้ยงโคนมควรหมั่นสังเกตคะแนนร่างกายของแม่โคนม

อย่างสม่ำเสมอเพ่ือใช้เป็นการเฝ้าระวังการเกิดปัญหาภาวะพลังงานเชิงลบท่ีจะส่งผลกระทบต่อความสมบูรณ์พันธ์ุ

นอกจากนี้ควรทำการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับการกลับเข้าสู่ภาวะพลังงานสมดุลของแม่โคนมหลังคลอดเพื่อ

นำไปใช้ประโยชน์ ในการวางแผนการจัดการเพิ่มประสิทธิภาพระบบสืบพันธุ์ต่อไป

กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุณ รศ.ดร.น.สพ.ธีระ รักความสุข คณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

วิทยาเขตกำแพงแสน ที่ ให้ความอนุเคราะห์ ในการตรวจวิเคราะห์ค่ากลูโคสและNEFAs พร้อมทั้ง

สพ,ญ.กลัยาเกง่วกิย์กรรมและคณุสายณัห์บวับานสำนกัเทคโนโลยีชวีภาพการผลติปศสุตัว์ที่ ให้คำแนะนำ

ตลอดการทดลองนี้จนสำเร็จลุล่วงด้วยดี

72


เอกสารอ้างอิง Block,S.S.,Butler,W.R.,Ehrhardt,R.A.,Bell,A.W.,VanAmburgh,M.E.andBoisclair, Y.R.2001.Decreasedconcentrationofplasmaleptininperiparturientdairycowsis causedbynegativeenergybalance.J.Endocrinol.171(2):339-48.

Boland,M.P.,Lonegan,P.andO’Callaghan,D.2001.Effectofnutritionandandocrine parameters,ovarianphysiologyandoocyteandembryodevelopment.Theriogenology 55:1323-1340.

Bossaert,P.,Leroy,J.,DeVliegher,S.andOpsomer,G.2008.Interrelationsbetween glucoseinducedinsulinresponse,metabolicindicatorsandtimeoffirstovulationin high-yieldingdairycows.JournalofDairyScience91:3363-3371.

Butler,W.R.andCanfieldR.W.1989.Interrelationshipsbetweenenergybalanceand

postpartumreproduction.InProc.CornellNutritionConferenceforFeedManufacturers, October24-26,1989,CornellUniversity,Ithaca.

Butler,W.R.2003.Energybalancerelationshipswithfolliculardevelopment,ovulation andfertilityinpostpartumdairycows.LivestockProductionScience83:211-218.

Butler,W.R.2006.RelationshipsofNegativeEnergyBalancewithFertility.(Online)

http://WWW.altagenetics.com/English/Whatsnew/20060110NegativeEnergy. htm.5/1/2012

Dahl, J.C., Ryder, J.K., Holmes, B.J. andWollenzien,A.C.1991.An integrated and multidisciplinaryapproachtoimprovingadairy’sproduction.VetMed.86(2)

Fernandez, R., Martini, A.C, Navarro, V.M., Castellano, J.M., Dieguez, C., Aguilar, E.,Pinilla,L.andTena–Sempere,M.2006.Novelsignalsfortheintegration ofenergybalanceandreproduction.MolecularandCellularEndocrinology254–255: 127-132.

Formigoni, A. and Trevisi, E. 2003. Transition Cow : Interaction with Fertility. VeterinaryResearchCommunications.Volume27:143-152.

Friggens,N.C.2003.Bodylipidreservesandthereproductivecycle:towardsabetter understanding.LivestockProductionScience83:219-236.

George,J.NegativeEnergyBalanceandConceptionRates.(Online)http://www.uky.edu/ Ag/AnimalSciences/dairy/dairyrepro/rep024.pdf5/1/2012

Grummer, R.R., Mashek, D.G. and Hayirli, A. 2004. Dry matter intake and energy balanceinthetransitionperiod.VeterinaryClinics:FoodAnimalPractice20:447-470. Harrison, R.O., Ford, S.P., Young, J.W., Conley, A.J. and Freeman, A.E. 1990. Increasedmilkproductionversusreproductiveandenergystatusofhighproducing dairycows.J.DairySci.73:2749–2758.

73


Herman, H.A., Mitchell, J.R. and Doak, G.A. 1994.The Artificail Insemination and Embryo transfer. A handbook of laboratory manual, Interstate Publishers, INC. p.198.

Heuer,C.,VanStraalen,W.M.,Schukken,Y.H.,Dirkzwager,A.andNoordhuizen,T.M. 2001. Prediction of energy balance in high yielding dairy cows with test-day information.JournalofDairyScience84(2):471-81.

Huzzey,J.M.,Veira,D.M.,Weary,D.M.andVonKeyserlingk,M.A.2007.Prepartum behavioranddrymatterintakeidentifydairycowsatriskformetritis.Journalof DairyScience90:3220-3233.

Jackson,R.A.,Wills,J.R.,Kendall,N.R.,Green,M.J.,Murray,R.D.andDobson,H.2011. Energy metabolites in pre – and postpartum dairy cattle as predictors of reproductivedisorders.VeterinaryRecord2011:168,562.

JimSpain.2005.ImplementingaNutritionalManagementStrategytoEnhanceFertility. AdvanceinDairyTechnology17:171.

Jorritsma,R.,Cesar,M.L.,Hermans,J.T.,Kruitwagen,C.L.J.J.,Vos,P.L.A.M.and Kruip,T.A.M.2004.Effectsofnon–esterifiedfattyacidsonbovinegranulosecellsand developmental potential of oocytes in vitro. Animal Reproduction Science 81: 225–235.

LeBlanc,S.J.,Dubuc,I.,Duffield,T.F.,Leslie,K.E.andWalton,J.S.2010.Riskfactors, impactandtreatmentofpostpartumuterinediseasesindairycows.Proceedingof the26thWorldBuiatricsCongress.Santiago,ChileNovember14to18,2010.

LopezGautius,F.,Yaniz ,J.andMadriles–Helm,D.2003.Effectofbodycondition score and score change on the reproductive performance of dairy cows: a meta–analysis.Theriogenology59:801–812.

Martin,B.,Golden,E.,Carlson,O.D.,Egan,J.M.,Mattson,M.P.andMaudsley,S.2008. Caloricrestriction:Impactuponpituitaryfunctionandreproduction.AgeingResearch Reviews7:209–224.

MacNamara, I.P. andHillers, J.K. 1986.Adaptations in Lipidmetabolism of bovine adiposetissueinlactogenesisandlactation.JournalofLipidResearch27:150-157. Patton, J., Kenny, D.A., McNamara, S., Mee, J.F., O’Mara, F.P., Diskin, M.G. and Murphy,J.J.2007.RelationshipsAmongMilkProduction,EnergyBalance,Plasma Analyses,andReproductioninHolstein–FriesianCows.JournalofDairyScience 90:649-658.

Pryce,J.E.,Coffey,M.P.andSim,G.2001.Therelationshipbetweenbodycondition scoreandreproductionperformance.JournalofDairyScience84:1508-1515.

Rabiee, A.R., Lean, I.J., Gooden, J.M. andMiller, B.G. 1999. Relationships among metabolitesinfluencingovarianfunctioninthedairycow.JournalofDairyScience 82:39-44.

74


Rossi,F.,Righi,F.,Romanelli,S.andQuarantelli,A.2008.Reproductiveefficiencyof dairycowsundernegativeenergybalanceconditions.Ann.Fac.MedicVet.DiParma 28:173-180

Rukkwamsuk,T.,Kruip,T.A.M.andWensing,T.1999.Relationshipbetweenoverfeeding andoverconditioninginthedryperiodandtheproblemsofhighproducingdairycow duringtheperiparturientperiod.Veterinary.Quart21:71-77.

Rukkwamsuk,T.,Homwong,N.,Bunkhuntod,W.,Rohitakanee,P.andSukcharoen,R.2006. NegativeBalance inPeriparturientDairyCowsRaised inSmall-HolderFarms in Kamphaengsaen District , Nakhon Pathom Province. Kasetsart J. Nat.Sci. 40: 1000–1004.

Rukkwamsuk.2010.Afieldstudyonnegativeenergybalanceinperiparturientdairy cowskeptinsmall-holderFarms:Effectonmilkproductionandreproduction.African JournalofAgriculturalResearch5(23):3157–3163.

Spicer,L.J.,Francisci,C.C.,Jones,D.andWaldner,D.N.2002.Changesin Insulin andGlucoseConcentrationsDuringEarlyLactation inHolstein. http://wwwansi. okstate.edu/research/2002rr/33/index.htm5/1/2012

Staples,C.R.,Tucker,W.B.andAdams,G.D.1990.Relationshipbetweenovarianactivity andenergystatusduringtheearlypostpartumperiodofthehighproducingdairy cow.JournalofDairyScience73:938.

Vanholder,T.,Opsomer,G.,andDeKruie,A.2006.Aetiologyandpathogenesisofcystic ovarian follicles in dairy cattle: a review. Reproduction Nutrition, Development 46:105-119.

VanKnegsel,A.T.M.,VanDenBramd,H.,Dijkstra,J.andKemp,B.2007.Effectsof dietaryenergysourceonenergybalance,metabolitesandreproductionvariablesin dairycowsinearlylactation.Theriogenology685:274-280.

Wathes,D.C.,Taylor,V.J.,Cheng,Z.andMann,G.E.2003.Folliclegrowth,corpus luteumfunctionand theireffectsonembryodevelopment in thepostpartumcow. ReproductionSupplement61:219–237.

Wathes,D.C.,Fenwick,M.,Cheng,Z.,Bourne,N.,Llewellyn,S.,Morris,D.G.,Kenny, D.,Murphy,J.andFitzpatrick,R.2007. Influenceofnegativeenergybalanceon cyclicity and fertility in the high producing dairy cow. Theriogenology 68: S232–S241.

Wathes, D.C. 2008. Metabolic effects on the reproductive tract environment and conceptionratesinthedairycow.HavemeyerFoundMonogrSer21:15-19.

Wathes,D.C.,Fenwick,M.,Cheng,Z.Bourne,N.,Llewellyn,S.,Morris,D.G.,Kenny, D.,Murphy,J.andFitzpatrick,R.2009. Influenceofnegativeenergybalanceon cyclicityandfertilityinhighproducingdairycow.Theriogenology68:232-241.

75


บทคัดย่อ งานวิจัยนี้เพื่อพัฒนาชุดเครื่องหมายดีเอ็นเอชนิดไมโครแซทเทิลไลท์ (ไพรเมอร์ 11 คู่)

สำหรับตรวจสอบความเป็นพ่อแม่ลูก (parentage test) และเอกลักษณ์ (identification) ในโค เพื่อเพิ่ม

ความเชื่อมั่น จำนวน 11 ตำแหน่งในโครโมโซมคือ HEL1, HEL5, ILSTS005, INRA063, INRA005,

HEL13, BM1818, MM12, CSRM60, HEL9 และ ETH185 โดยเก็บตัวอย่างเลือดโคนมลูกผสม

ไทยโฮลสไตน์ จำนวนทั้งสิ้น 234 ตัว นำไปทดสอบด้วยชุดตรวจสอบที่พัฒนาขึ้นใหม่ พบว่าสามารถ

เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ สำหรับการตรวจสอบเอกลักษณ์ได้ ในตัวอย่างทั้งหมด 234 ตัว และสามารถตรวจ

สอบพ่อแม่ลูกได้ เครื่องหมายดีเอ็นเอชนิดไมโครแซทเทิลไลท์ ทุกตำแหน่งแสดงรูปแบบความหลากหลาย

ของอัลลีล อยู่ระหว่าง 6 - 23 อัลลีล โดยมีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 12.09 อัลลีล ค่าเฮเทอโรไซโกซิตี้

(Heterozygosity)มีค่าเฉลี่ยของHo=0.6788(พิสัย0.444-0.902),ค่าเฉลี่ยของHeเท่ากับ0.7508

(พิสัย0.610 - 0.924) และค่าเฉลี่ยของโพลีมอร์ฟิก อินฟอร์เมชั่นคอนเทน (Polymorphic Information

Content;PIC)คือ0.7122(พิสัย0.535-0.924)และตำแหน่งที่ ใช้ตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่ ให้ผลแม่นยำสูง

คือHEL9(23alleles,Ho=0.902,He=0.924,PIC=0.917),BM1818(15alleles,Ho=0.762,

He=0.805,PIC=0.781)และETH185(14alleles,Ho=0.816,He=0.836,PIC=0.815)และCSRM60

(13alleles,Ho=0.833,He=0.801,PIC=0.776)ตามลำดบัผลการวเิคราะห์พบวา่ขอ้มลูทางพนัธกุรรม

หลายตำแหน่งร่วมกัน(CombinedExclusionProbability;CEP)ของ11markerkitที่พัฒนาเป็น2ชุด

multiplex PCR ใหม่ มีค่าความถูกต้องในการตรวจสอบสูงสุดที่ 0.999999 ให้ค่าความเชื่อมั่นสูงถึง

99.99% และพบค่า exclusion probability (PE) มีค่าอยู่ระหว่าง 8.86x10-12 จะเพิ่มความแม่นยำ

และความเชื่อมั่นสูงขึ้นในการตรวจพิสูจน์พ่อแม่ลูกโคและน้ำเชื้อปลอม

คำสำคัญ:ชุดตรวจสอบความเป็นพ่อแม่ลูกโคเครื่องหมายดีเอ็นเอชนิดไมโครแซทเทิลไลท์

กัลยา เก่งวิกย์กรรม1 ณัฐนันท์ ศิริรัตนธัญญะกุล1 และ บุหงา จินดาวานิชสกุล1

1 สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์

การพัฒนาชุดตรวจสอบความเป็นพ่อแม่ลูกโคด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอชนิดไมโครแซทเทิลไลท์เพื่อเพิ่มความเชื่อมั่น

76


Abstract The objective of thisstudy is to develop newsets of bovine elevenmicrosatellite

markers; HEL1, HEL5, ILSTS005, INRA063, INRA005, HEL13, BM1818, MM12, CSRM60,

HEL9andETH185forevaluatingparentageverificationandidentitytest.Thebloodsamples

from234Holsteincrossbredcattle(Holstein–Thainativecattle)populationinThailandwere

extractedforgenotypingbyfourcapillaryelectrophoresisinjections.Allmarkerswerehighly

polymorphicwithameannumberof12.09allelesper locuswithrangeof6-23alleles.At

the11testedloci,atotalof133allelesweredetected.Anaverageobservedandexpected

heterozygositywas0.6788(withrange0.444-0.9020)and0.7508(withrange0.610-0.924)

respectively.AnaveragePolymorphicInformationContent(PIC)was0.7122andvaluesranged

0.535–0.917.ThehighpolymorphicmarkerswereHEL9(23alleles,Ho=0.902,He=0.924,

PIC=0.917),BM1818(15alleles,Ho=0.762,He=0.805,PIC=0.781)ETH185(14alleles,

Ho=0.816,He=0.836,PIC=0.815)andCSRM60(13alleles,Ho=0.833,He=0.801,PIC=

0.776)respectively.TheresultsofCombinedExclusionProbability;CEPforparentagetesting

washighat0.999999(99.99%)andtherangeofexclusionprobability(PE)was8.86x10-12.

Thepresentstudyconfirmsthatthenewtwosetsofmultiplexfor11microsatellitemarkersare

suitableforparentagetestingandidentificationinThaiHolsteinCrossbredcattle.

Keywords:Bovine,Parentagetestkit,MicrosatelliteDNAmarkers

Kalaya Kengvikkum1 Nattanant Sirivattanatanyakul1 and Buh-nga Chindawanichsakul1

1 Bureau of Biotechnology in Livestock Production Department of Livestock Development

DevelopmentofBovineParentageTestKitusingMicrosatelliteDNAMarkers

77


Introduction Correctpedigreeinformationandidentificationareessentialforsuccessfulimprovement

ofproductivityandcattlebreedingprogram.Misidentificationcan lead to inaccurategenetic

evaluationandthestructureofselectionindexes(Rehoutetal.,2006).Cattleparentageanalysis,

using blood type showed a high frequency of incorrect paternity in Germany (4-23%)

(Geldermannetal.,1986)AdvancemoleculartechnologysuchasPolymeraseChainReaction

(PCR)developmentandthediscoveryofmanynewDNAmarkersforexampleMicrosatellite

havebeenusedtosolvethislimitation.Manymicrosatellitesmarkersareusefulinparentage

analysisbecauseitisduetotheirhighlypolymorphisms,simplenucleotiderepeatsknownas

ShortTandemRepeat(STR)(Divineetal.,2010,LewisJr.,2010)anddistributedthroughout

genome. In 2008, The International Society for Animal Genetics (ISAG) recommended 11

microsatelliteloci(TGLA227,Bm2113,ETH10,SPS115,TGLA126,TGLA122,INRA023,ETH225,

BM1824,ETH3,andTGLA53)astheInternationalPanelofMicrosatellitesforCattleParentage

Testing(ISAGPanel).Othercountriesdevelopedmoremicrosatellitemarkersfor theircattle

populations. (Carolino et al., 2009,Ozkanet al., 2009) To increaseefficacy in parentage

testingandidentification,additional11markers(HEL1,HEL5,ILSTS005,INRA063,INRA005,

HEL13,BM1818,MM12,CSRM60,HEL9และETH185)fromISAGpanelusingtwomultiplex

PCRwereevaluated.

MaterialsandMethods SamplecollectionandDNAextraction

GenomicDNAfrombloodsamplesof234ThaiHolsteincattlefromprivatefarmslocated

invariousregionsofThailandwereisolatedwithAxyPrepBloodGenomicDNAMiniprepKit

andkeptat4oC.DNAyieldwascheckedwithAgaroseGelElectrophoresis.

MultiplexPCRandGenotypedetermination.

ElevenmicrosatellitesusedinthisstudyasrecommendedbytheInternationalSociety

forAnimalGenetics(ISAGConference,2008)forcattlepaternitytestingweredividedinto2

sets.Thefirstmultiplexsethas6primersandanotherhas5primers.Allprimerswerelabeled

withfluorescencedye(Table1).DNAsampleswereamplifiedusing1XPCRbuffer,3mMMgCl,

200µMdNTP,0.1µMprimersand1UPlatinumTaq(InvitrogenTM)Thecyclingreactionswere

performedinaprogrammableMJMiniPersonalThermalcyclerwithaninitialdenaturationfor10

minat950Cfollowedbythethermalcyclesasfollows:denaturationstepat950Cfor45s,

annealingstep: thefirstmultiplexgroupat570Cand thesecondmultiplexgroupat620C

78


for45s,andanelongationstepat720Cfor1min.Thereactionwascompletedwithafinal

elongationstepat720Cfor60min.PCRproductswerecheckedwithGelElectrophoresis

(2%agarosegel),andstainedwithethidiumbromideandtookapicturewithUVlightofGel

Documentation.ThefluorescentlabeledPCRproductsweresubmittedtofragmentsanalysisby

fourcapillaryelectrophoresis,withanautomatedsequencer(3130GeneticAnalyzer:Applied

Biosystem)usingtheGeneScanTM-500ROXTMSizeStandard(AppliedBiosystem),according

to the manufacturer specifications. Results were read and interpreted using GeneScan®

andGeneMappersoftwarerespectively.

1

2

HEL1

(FAM)

HEL13

(FAM)

HEL5

(VIC)

MM12

(VIC)

INRA063

(PET)

INRA005

(FAM)

CSRM60

(PET)

HEL9

(NED)

ILSTS005

(NED)

BM1818

(FAM)

ETH185

(FAM)

98–118

177–197

151–181

107–133

175–188

137–143

93–111

143–171

181–193

252–272

220-238

F-CAACAGCTATTTAACAAGGA

R-AGGCTACAGTCCATGGGATT

F-TAAGGACTTGAGATAAGGAG

R-CCATCTACCTCCATCTTAAC

F-GCAGGATCACTTGTTAGGGA

R-AGACGTTAGTGTACATTAAC

F-CAAGAGAGGTGTTTCAATCT

R-ATCGACTCTGGGGATGATGT

F-ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC

R-AAACCACAGAAATGCTTGGAAG

F-CAATCTGCATGAAGTATAAATAT

R-CTTCGAGCATACCCTACACC

F-AAGATGTGATCCAAGAGAGAGGCA

R-AGGACCAGATCGTGAAAGGCATAG

F-CCCATTCAGTCTTCAGAGGT

R-CACATCCATGTTCTCACCAC

F-GGAAGCAATGAAATCTATAGCC

R-TGTTCTGTGAGTTTCTAAGC

F-AGCTGGGAATATAACCAAAGG

R-AGTGCTTTCAAGGTCCATGC

F-TGCATGGACAGAGCAGCCTGGC

R-GCACCCCAACGAAAGCTCCCAG

KaukinenandVarvio1993

(15)


(11)


(21)

MommensandCoppieters1994(9)

Vaimanet al.1994

(18)

Vaimanet al.1992

(12)

Mooreet al.1994

(10)


(8)

Brezinskyet al.1993

(10)

Bishopet al. 1994

(23)

Steffen,P.et al.1993(17)

MultiplexLocus(Dye)

Allelicrange(bp)

PrimerSequence(5’-3’)

Reference(chromosome)

Table 1 Compositionoftwomultiplexesforthenewbovinemicrosatellitelociexamined

79



(15)


(11)


(21)

MommensandCoppieters1994(9)

Vaimanet al.1994

(18)

Vaimanet al.1992

(12)

Mooreet al.1994

(10)


(8)

Brezinskyet al.1993

(10)

Bishopet al. 1994

(23)

Steffen,P.et al.1993(17)

Dataanalysis Standardstatisticalprocedureswereusedtoassesstheinformativenessofselected

microsatellite markers. The number of alleles (N), Heterozygosity (Ho, He), Polymorphism

InformationContent(PIC)accordingtoHardyWeinbergequilibrium,(Bosteinetal.,1980).The

CombinedExclusionProbability(CEP)andtheProbabilityofExclusion(PE)wasdefinedfor

twocases(JamisonandTaylor,1997)andtheprobabilityofIdentity(PI)wascalculatedforeach

microsatellitemarker.AllweredeterminedbytheCERVUS3.0software(Kalinowskietal.,

2007)

Results FromTable1,accordingtoABIPRISMGeneticAnalyzer3130(AppliedBiosystems),

genotypingdatawereanalyzedwithGeneMapper®version3.0software(AppliedBiosystems),

andweresizedduetoGeneScan™500ROX™SizeStandard,aninternallanesizestandard

developedfortheusewiththeAppliedBiosystemsfluorescence-basedDNA.Elevennew11

microsatellitemarkerswereevaluatedfortheiruseinparentageanalysis.

The results are presented in Table 2. Among the 11 microsatellite sequences, an

amplificationproductwasobtainedfor11loci.Allareeffectiveinparentagetestingandpedigree

verification depending on polymorphism (number of alleles), and their relative population

frequencies(Taylor,1997).Inthestudiedgroupof234cattle(N),theallelesperlocus(K)ranged

from6to23.ThemeanKperlocuswas12.09andthetotalnumberofalleleswas133.The

allelefrequencyperlocuswasshown.Hohadanaveragevalueat0.6788withrangefrom

0.444to0.902andHehadvaluesanaveragevalueat0.7508withrangefrom0.610to0.924.

PICvaluesrangedfrom0.535to0.917withthemeanvalueof0.712(Table2).

80


Table 1 Compositionoftwomultiplexesforthenewbovinemicrosatellitelociexamined

HEL1(D15S10)**

INRA005(D9S1)***

HEL13(D11S15)

ETH185(D17S1)

BM1818(D23S21)

MM12(D9S20)*

HEL5(D21S15)

HEL9(D8S4)

ILSTS005(D10S25)***

CSRM60(D10S5)

INRA063(D18S5)***

Mean

12

6

8

14

15

11

13

23

9

13

9

12.09

234

234

234

234

231

234

234

234

124

233

232

0.662

0.641

0.637

0.816

0.762

0.564

0.611

0.902

0.444

0.833

0.595

0.6788

0.742

0.737

0.610

0.836

0.805

0.653

0.693

0.924

0.711

0.801

0.748

0.7508

0.704

0.689

0.535

0.815

0.781

0.594

0.645

0.917

0.670

0.776

0.707

0.712

(0.006-0.386)

(0.002-0.352)

(0.004-0.376)

(0.002-0.284)

(0.002-0.342)

(0.002-0.342)

(0.002-0.451)

(0.002-0.147)

(0.009-0.459)

(0.004-0.347)

(0.002-0.375)

K N Ho He PICAlleleFreqMarker/(Locus)/HWE

K Allelesperlocus,N-numberofindividuals,AlleleFreq–Allelefrequency, Ho-observedHeterozygosity,H

eExpectedHeterozygosityPIC–PolymorphismInformationContent.

*,**,***wereresultsofchisquaretest.

Highnumberofalleles,HeterozygosityandPICvalueswereobservedforHEL9,ETH185,

CSRM60, BM1818 and HEL1. In addition, those are the most informative markers among

testedlociinthisstudy.Theresultsofthechisquaretestofgoodness-of-fitrevealedthatthe

populationwasinHardy-WeinbergEquilibrium(HWE)proportionsforsixmicrosatelliteloci

(HEL13,ETH185,BM1818,HEL5,HEL9andCSRM60).TheremainingfiveLoci(HEL1,INRA005,

MM12, ILSTS005 and INRA063) showed significant from HWE. It might be attributed to

selection,mutation,geneticdriftandnullallele(notamplifyingalleles).

81


PE1 Probabilityofexclusion(bothparentsknown),PE2-Probabilityofexclusion(onlyone parentknown),PI Averageprobabilityoftwoindividualshaveidenticalgenotype,PI-Sib=Averageprobability oftwofullsiblingshasidenticalgenotypes.

The two sets of 11 markers in this study had similar exclusion probabilities and

probabilityofIdentity(PI)tothecommerciallyavailableStockMarks®kit.(AppliedBiosystems)

(ShowedinTable3)Bycomparingwiththeresultsusingother11microsatelliteloci:TGLA227,

Bm2113,ETH10,SPS115,TGLA126,TGLA122,INRA023,ETH225,BM1824,ETH3,andTGLA53

(the“StockMarksforCattle®BovineGenotypingKit”(AppliedBiosystemsInc.,FosterCity,

CA)(inFigure1)

11marker

(StockMarks®kit)

11newmarkerkit

0.9999999

0.999999

PE1

2.14x10-11

8.86x10-12

0.999821

0.97900

PE2

Combinedprobability

probabilityPI PI-Sib

exclusion

7.72x10-6

5.418x10-5

Table 3 Thecombinedexclusionprobabilityandmultilocusprobabilityofidentityestimationof

twomarkersets(commercialanddevelopedmarkerset)

Figure 1 Parentagetestingusingfragmentsanalysisby4capillaryelectrophoresis,withan

automatedsequencer(3130GeneticAnalyzer:AppliedBiosystems)usingtheGeneScanTM-500

ROXTMSizeStandard(AppliedBiosystem)

82


Discussion Thecommercial“StockMarksforCattle®BovineGenotypingKit”has11microsatellite

loci:TGLA227, Bm2113, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, INRA023, ETH225, BM1824,

ETH3,andTGLA53 thathasbeenalreadyapprovedfor theiraccuracy.Thisstudytriedto

developmoremarkersetsofmicrosatellitelociandhadspenttimefindingoptimalconditions

inmultiplexPCRusingtheother11newmicrosatellitesmarkersalsorecommendedbyISAG.

TwosetsofmultiplexPCRhavetheoptimalconditionsasmentionabove.Every11microsatel-

litesHEL1, HEL5, ILSTS005, INRA063, INRA005, HEL13, BM1818, MM12, CSRM60, HEL9

and ETH185canamplifyDNAfragmentat11lociandshowedsimilarPEandPIinparentage

testingasusingthe“StockMarksforCattle®BovineGenotypingKit”(Figure3andTable3).

Theoretically,thePICvaluesshouldbehigherthan0.5.Inthisstudy,themeanPICvalueforall

lociwasfoundtobe0.712andrangedfrom0.535(HEL13)to0.917(HEL9)similartoZhang,

etal.,(2010),Rehout,etal.,(2006)andOzken,etal.,(2009).

Thehighgeneticvariabilityofmarkersindicatedtheirhigheffectivenessforparentage

testing.Thecombinedexclusionprobability(CEP)isameasureofabilityofmarkerstoidentify

geneticpaternityandexcludeallsuspectedcandidates.Theprobabilityofexclusionsisshown

inTable3.PE1estimatedtheprobabilityofexclusionofaparentwhengenotypesoftheoffspring

and two parents are known. PE2 estimated the probability of exclusion of parentage test

whengenotypesofoffspringandonlyoneparentwasknown,PI–Averageprobabilityoftwo

individualshaveidenticalgenotype,PI-Sib=Averageprobabilityoftwofullsiblingshasidentical

genotypes.InthisstudyPE1were0.999999forboththecommercialkitandnewtwosets

of11microsatellitekits.PE2ofthecommercialkitvalued0.999821andwas0.97900fornew

twosetsof11microsatellitekits.PIandPI-sibestimationswerehigh(2.14x10-11,7.72x10-6

and8.86x10-12,5.48x10-5respectively)inbothcommercialStockMarksandnew11markerkits.

PIindicatedhigheffectivenessinparentageanalysis.AllPE1PE

2,PIandPI-sibweresimilar

toZhang,et.Al.,(2010).

Inconclusion,thisstudydevelopedanewconvenientandefficienttwosetmultiplex

PCR(6and5microsatellitemarkers)forroutineidentificationandparentagetestingincattle

population.ByusingbothcommercialStockMarksandnewsetkitof11microsatellitemarkers

canbeusefulandincreasetheaccuracyinpedigreeandparentageanalysis.

83


Acknowledgement TheauthorwouldliketoconveythankstotheDepartmentofLivestockDevelopment

forprovidingfinancialmeans.

References Bishop,M.D.andKappes,S.M.1994.Ageneticlinkagemapforcattle.Genetic.136

(5):619–639.

Botstein,D.,White,R.L.,Skolnick,M.andDavis,R.W.1980.Constructionofagenetic

linkagemapinmanusingrestrictionfragmentlengthpolymorphism.Am.J.Hum.

Genet.32(3):314-331.

Brezinsky L.S., Kemp, J. and Teale, A.J. 1993. ILSTS005: a polymorphic bovine

microsatellite.AnimalGenetics24:73.(2)

Carolino I., Sousa C.O., Ferreira S., Carolino N., Silva F. S., Gama L.T. 2009.

ImplementationofaparentagecontrolsysteminPortuguesebeef-cattlewitha

panelofmicrosatellitemarkers.GeneticsandMolecularBiology.32:306–311.

Divine, A.M, Edlund, H. andAllen,M. 2010. Forensic analysis of autosomalSTR

markersusingpyrosequencing.ForensicSci.Int-Gen.4:122-129.

Geldermann,H.,Pieper,U.andWeber,W.E.1986.Effectofmisidentificationonthe

estimationofbreedingvalueandheritabilityincattle.JournalofAnimalScience.

63(6):1759-1768.

ISAGConference.2008.Amsterdam,theNetherlands.CattleMolecularMarkersand

ParentageTestingWorkshop.[Online]http://www.isag.org.uk/ISAG/all/ISAG2008_

CattleParentage.pdf

Jakabova, D., Trandzik, J., Chrastina, J., Hudecova, L., Zetochova, E., Bulla, J.,

Bugarsky, A., Jakab, F. and Kozlik, P. 2002. Effectiveness of six highly

polymorphicmicrosatellitemarkersinresolvingpaternitycasesinThoroughbred

horsesinSlovakia.CzechJ.Anim.Sci.47:497-501.

Jamieson,A.andTaylor,S.C.S.1997.Comparisonsofthreeprobabilityformulaefor

parentageexclusion.Anim.Genet.28(6):397-400.

Kalinowski,S.T.,Taper,M.L.andMarshall,T.C.2007.Revisinghowthecomputer

programCERVUSaccommodatesgenotypingerrorincreasessuccessinpaternity

assignment.Mol.Ecol.16(5):1099-1006.

84


Kaukinen,J.andVarvio,S.L.1993.Eightpolymorphicbovinemicrosatellites.Animal

Genetic.24(1):148.

Lewis,C,M,Jr.2010.Hierarchicalmodelingofgenome-wideshorttandemrepeat(STR)

markersinfersnativeAmericanprehistory.Am.J.Phys.Anthropol.141:281-289.

Mommens,G.W.andCoppieters,A.1994.Dinucleotiderepeatspolymorphismatthe

bovineMM12E6andMM8D3loci.AnimalGenetics25(6):368.

Moore. S.S., Byrne. K. 1994. Characterization of 65 bovine microsatellites.

MammalianGenome5(7):84–90.

Ozkan,E.,Soysal,M.I.,Ozder,M.,Koban,E.,Sahi,nO.andTogan,I.2009.Evaluation

of parentage testing in the Turkish Holstein population based on 12

microsatelliteloci.LivestockScience.124:101–106.

Rehout,V.,Hradecká,E.andCítek,J.2006.Evaluationofparentage testing in the

CzechpopulationofHolsteincattle.Czech.J.Anim.Sci.51(12):503-509.

Steffen,P.,Eggen,A.,Stranzinger,G.,Fries,R.,Dietz,A.B.andWomack,J.E.1993.

Isolationandmappingofpolymorphicmicrosatellitesincattle.AnimalGenetics.

24(2):121–124.

Taylor,G.R.1997.Laboratorymethodsforthedetectionofmutationsandpolymorphisms

inDNA.CRCPressInc.,BocaRaton,USA,333p.

Vaiman,D.,Merier,D.1994.Asetof99cattlemicrosatellites:characterization,synteny

mapping,andpolymorphism.MammalianGenome.5(3):288–297.

Vaiman,D.andOsta,D.1992.Characterizationoffivenewbovinemicrosatelliterepeats.

AnimalGenetics23(4):537.

Zhang,Y.,Wang,Y.,Sun,D.,Yu,Y.andZhang,Y.2010.Validationof17Microsatellite

MarkersforParentageVerificationandIdentityTestinChineseHolsteinCattle.

Asian-Aust.J.Anim.Sci.23(4):425–429.

85


บทคัดย่อ วัตถุประสงค์ ในการศึกษาครั้งนี้ เพื่อตรวจหาความถี่ของการเปลี่ยนแปลงของนิวคลีโอไทด์หนึ่ง

ตำแหน่ง(สนิป)ในส่วนโปรโมเตอร์ของยีนเลปติน(leptin5)และเพื่อหาหาความสัมพันธ์กับคุณภาพของซาก

รวมทั้งผลจากอัลตราซาวน์ตัวอย่างดีเอ็นเอจำนวน66ตัวอย่างของโคลูกผสมแองกัสxพื้นเมืองไทย50%

ถูกนำมาเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมด้วยวิธี TaqMan probe real-time PCR และนำผลมาวิเคราะห์หาค

วามถี่ของอัลลิลและสนิปจี โนไทป์ของยีนเลปตินส่วนโปรโมเตอร์ที่ตำแหน่งนิวคลีโอไทด์ 528 หมายเลข

ธนาคารยีน AB070368 ซึ่งมีการเปลี่ยนแปลงจากเบส C เป็น T ผลการวิเคราะห์พบว่า ความถี่ของ

อัลลิลC ในโคเพศผู้และเมีย เท่ากับ 0.79และ0.69ส่วนอัลลิล T เท่ากับ 0.21 และ0.31ตามลำดับ

สนิปจีโนไทป์CC,CTและTT ในโคเพศผู้เท่ากับ0.63,0.33และ0.04ส่วนในเพศเมียเท่ากับ0.47,

0.43 และ 0.10 ตามลำดับ ซึ่งพบว่าความถี่สนิปจี โนไทป์ของโคเพศผู้มีการกระจายอยู่ ในสัดส่วนของ

Hardy-Weinberg equilibrium คุณภาพซากจากผลอัลตราซาวน์พบว่าโคเพศเมียมีความหนาไขมันที่สะโพก

(RF) เท่ากับ 7.54±1.16 มม มากกว่าในเพศผู้ (3.91±1.53 มม) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05)

ในทางตรงกันข้าม ในโคเพศผู้มีเปอร์เซ็นต์ไขมันแทรกเนื้อ (IMF) เท่ากับ 3.56±0.24% มากกว่าในโคเพศ

เมีย(2.29±0.01%)อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(p<0.05)ค่าเฉลี่ย(LSmean)ของคุณภาพซากของโคเพศ

ผู้และเพศเมียได้แก่พื้นที่หน้าตัดกล้ามเนื้อสันนอกส่วนริบอาย(REA)คะแนนไขมันแทรกเนื้อ(BMS)และ

ค่าแรงตัดผ่านเนื้อ(WBSF)เท่ากับ62.24ซม2,7.28มมและ14.63กกตามลำดับผลการวิเคราะห์

พบว่าเพศไม่มีอิทธิพลต่อREA(R2=0.25,p=0.827)และWBSF(R2=0.675,p=0.145)แต่มี

อิทธิพลต่อBF(R2=0.92,p=0.021)และBMS(R2=0.92,p=0.012)อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ

(p<0.05)นอกจากนี้พบว่าBMSได้รับอิทธิพลจากระยะเวลาการขุน(p<0.05)น้ำหนักสุดท้าย(p<0.05)

และยีน leptin5 (p<0.01) การศึกษานี้ ได้ผลที่น่าสนใจคือค่าBMSและWBSFมีความสัมพันธ์อย่าง

มีนัยสำคัญ(p=0.035)กับสนิปจีโนไทป์ของยีน leptin5โคที่มีสนิปจีโนไทป์CTมีค่าเฉลี่ยของBMS

สูงกว่า (3.42±0.47; 1.14±0.43)และมีค่าเฉลี่ยของWBSFต่ำกว่า (2.97±4.42; 14.86±1.91) โคที่มี

สนิปจีโนไทป์ CC อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) ผลการศึกษานี้สรุปได้ว่า สนิปจีโนไทป์ของยีน

leptin5มีความสัมพันธ์กับคะแนนไขมันแทรกเนื้อและความนุ่มของเนื้อ

คำสำคัญ:โคลูกผสมแองกัสxพื้นเมืองไทย50%คุณภาพซากสนิปจีโนไทป์เลปติน

ณชัย ศราธพันธุ์1 ณัฐนันท์ ศิริรัตนธัญญะกุล1 สายใจชื่นสุข1 และ กัลยา เก่งวิกย์กรรม1

1 สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์

ความสัมพันธ์ระหว่างสนิปของยีนเลปติน กับคุณภาพซากในโคเนื้อลูกผสมแองกัสxพื้นเมือง50%

86


Abstract The objective of this study was to determine frequency of a single nucleotide polymorphism (SNP) in the leptin promoter region (leptin5) and examine associations of ultrasoundandcarcassqualitytraits.Sixty-sixDNAsamplesfrom50%AngusxThai-nativecrossbredbeefwereanalyzedalleleandgenotypefrequencyofaSNPofleptingeneatthepromoterregion(g528C>T,AB070368)byTaqManprobereal-timePCR.FrequencyofalleleCwas0.79and0.69aswellasalleleTwas0.21and0.31inthemaleandfemaleanimals,respectively.ThegenotypefrequencyofCC,CTandTTwas0.63,0.33and0.04,aswellas0.47,0.43and0.10inmaleandfemaleanimals,respectively.Thegenotypefrequencyoftheleptin5SNPweredistributedaccordingtoHardy-Weinbergequilibriumproportionsinthemaleanimals.Thecarcassqualitytraitsofrumpfat(RF)fromultrasoundmeasurementwassignificantly higher in female (7.54±1.16 mm) than male (3.91±1.53 mm) animals (p<0.05).Incontrast, intramuscularfat(IMF) inmaleanimals(3.56±0.24%)wassignificantlyhigherthanfemale(2.29±0.01%)animals(p<0.01).Theleastsquaremeanofdependentvariableof carcassqualitytraitsincludedribeyearea(REA),backfat(BF),beefmarblingstandardscore(BMS;0-9)andWarner-BratzlerShearForce(WBSF)was62.24cm2,7.08(mm),2.28and14.63kgrespectively.TheresultshowedthatnoeffectofsexonREA(R2=0.25,p=0.827)andWBSF(R2=0.675,p=0.145)butithadsignificantlyeffectonBF(R2=0.92,p=0.021)andBMS(R2=0.92,p=0.012).TheBMSofthecarcasseswassignificantlyeffectedondurationoffattening(p<0.05),finalweight(p<0.05)andleptin5genotype(p<0.01).Interestingly,theWBSFofribeyesteakmusclewassignificantlyeffectedonleptin5genotype(p=0.035).Theeffectsofleptin5 genotypewereonlyfoundsignificantlyonBMSandWBSF.TheanimalscarriedCTgenotypehadsignificantlyhigherBMS(3.42±0.47;1.14±0.43)andlowerWBSF(2.97±4.42;14.86±1.91)thananimalscarriedCC leptin5genotype,respectively(p<0.05).TheresultsconcludedthattheSNPinbovine leptin5genehadhighlysignificantassociationwithbeefmarblingstandardscoreandalsoassociationwithmeattenderness.

Keywords:AngusxThai-native50%,Beef,Carcassqualitytraits,Genotype,Leptin,SNP

Nachai Sarataphan1 Saijai Cheunsuk1 Nattanant Sirivattanatanyakul1 and Kalaya Kengvikkum1

1 Bureau of Biotechnology in Livestock Production, Tiwanon Rd., Bangkadee, Muang, Pathumthani

AssociationofSNPintheBovineLeptinGenewithCarcassQualityTraitof50%AngusxThai–NativeCrossbredBeefCattle

87


Introduction Leptinisa16-kDaproteinthatissynthesizedbyadiposetissueandisinvolvedin

regulationoffeedintake,energybalance,fertility,andimmunefunctions(Fruhbecketal.,1998).

Leptin binds to a receptormainly localized on neuropeptideY-neurons,which results in a

reductionoffeedintakeandanincreaseofenergyexpenditure.NeuropeptideYisalsoinvolved

inthecontrolofreproductivefunction(Magnietal.,2000).Althoughpoly-morphismsinthebovine

leptingenehavebeendescribed(Pompetal.,1997;Haegemanetal.,2000)andanassociation

withfatdepositioninbeefcattlewasreported(Fitzsimmonsetal.,1998).Thesephysiological

propertiessupportleptinasastrongcandidategeneforevaluationofgeneticpolymorphisms

thatcouldaffectcarcassfatcontentincattle.

PolymorphismsinthebovineleptinpromoterhadbeenreportedbyNkrumahetal.(2005).

ThestudyindicatedthatBos taurus x Bos tauruscrossbredcattlewiththeTTgenotypeat

nucleotideposition528accordingtoGenBankaccessionNo.AB070368show48and39%

increaseshighlysignificant inserumleptinconcentration,39and31%increasesinbackfat

thicknessand13and9% increasesignificant inmarblingscore,comparedwithCCorCT

genotypes,respectively.AssociationstudiesofSNPinthebovineleptinpromoterwithcarcass

qualitytraitshavenotbeenreportedyetinAngusxThai–native50%crossbredbeefcattle.

Theobjectiveofthisstudywastodeterminefrequencyofasinglenucleotidepolymorphism

(SNP) in the leptin promoter region (leptin5) and examine associations of ultrasound and

carcassqualitytraitsinAngusxThai–native50%crossbredbeefcattle.

MaterialandMethods Experimentalanimals

Sixty-six50%AngusxThainativecrossbredbeeffromtheprojectofahighquality

Thai-BlackbeefproductionundertheBureauofBiotechnologyinLivestockProduction(BBLP),

DepartmentofLivestockDevelopment(DLD)wereusedinthisstudy.Elevencastratedmale

ataverage1.71±0.08yrofagewith294.36±11.32kgand10femaleataverage1.66±0.07yrof

agewith295.10±15.37kgwereusedinexperimentofcarcassqualitytraits.Themalewere

fedwithstemsandsweetcornpulpsby-productofsweetcorncan.Fourteenpercentprotein

ofcommercialconcentratedfeedwereaddeddailyat4kgperanimal.Thefemaleanimalswere

fedwith14%proteinoftotalmixration(TMR)includingconcentratedanddryPangolahays.

88


DNAsamples

Bloodsamplesofeachanimalwerecollectedfromthejugularveininto6mlofEDTA

tube.Thebloodsampleswerekeptiniceboxandsubmittedtoourlaboratory.Twohundredml

ofeachbloodsamplewasextractedgenomicDNAbycommercialkit(AxyPrepBloodGenomic

DNAMiniprepkit:AxygenBioscience;USA).FrozensemensamplesofAngusbullwere

extractedDNAby thestandardphenol:chloroformmethod (Sambrooketal. 1989).Twenty

nanogramoftheDNAsampleswerepreparedfordetectingasinglenucleotidepolymorphism

(SNP)inthepromoterregionofbovineleptin(leptin5)gene.

SNPdetectionandgenotyping

ASNPof leptin5geneat thebovine leptinpromoteraccordingtoGenBankacces-

sionAB070368(g528C>T)wasamplifiedbyprimerandspecificprobes.Theforwardprimer:

5’-aggtgcccagggactca-3’,thereverseprimer:5’-caacaaaggccgtgtgaca-3’andtwoABITaqMan

fluorogenicprobes:Probe1,5’-caagctctagagcctGtgt-3’andProbe2,5’-aagctctagagcctAtgt-3’were

designedaccordingtoNkrumahetal.(2005).Theprobe1and2weretaggedwithVICand

FAMfluorescentdyeswhichshowedgreenandbluecolorofamplificationcurveinaresultof

analysisbyStepOnePlussoftware(StepOnePlus,ABI,USA).Aspecificmatchoftheprobe

sequencetothetargetsequencewillresultinamplification,duringwhichcleavageandrelease

ofthereporterdyeoccurs.Fluorescentsignalforoneortwodyesindicatedhomozygosityor

heterozygosityforaparticularalleleoftheSNP.

Ultrasoundforcarcassqualitytraits

At terminationof theexperiment, theanimal’sweightwere recorded.Mean±SE (n)

valuesofmaleandfemaleanimalswereaverage2.5±0.1and2.1±1.3yrofagewithliveweight

of425.4±17.7and400.9±22.1kg.Economicimportanttraitsforcarcassqualityincluding,rib

eyearea(REA)ofLongissimusdorsimuscle(cm2),backfat(BF)thickness(mm),lumpfat

(LF)thickness(mm)andpercentageofintramuscularfat(%IMF)weremeasuredatthe12th

and13thribinterface.Theultrasoundmeasurementwasdonebeforesubmittingtoslaughterby

real-timeultrasound(Aloka,Japan)witha17cm,3.5MHzlineararraytransducer.Thedata

wereanalyzedbyImageAnalysisSoftware(DesignerGenesTechnologies,Inc.,USA).

Carcassexamination

Ineachcarcass,ribeyeareamusclebetweenthe10thto13thribwerecutandsubmitted

toourlaboratoryfor14dofageing.OnehalfoftheREAmusclesampleswerecutinto250-300

gofribeyesteakforREA,backfatthicknessandbeefmarblingscore(BMS)measurement

(0-9)usingAustralian’scorecard.Theotherhalfofthecarcassesweredebonedandcut3x

2x5cmoflongitudinalLongissimusdorsimuscleforsubmittingtomeasureWarner-Bratzler

89


ShearForce(WBSF)usingthemachineofInstronModel1011(InstronCorporation,USA)at

theChiangMai’smeatlaboratoryundertheDLD.

Statisticalanalyses

Thegenotypeandallelefrequenciesofeachpolymorphismwereexaminedfordevia-

tionsfromHardy-Weinbergequilibrium(HWE)withinbothAngusxThainative50%crossbred

andAngus bull byX2 testwith statistic on 1 df. The carcass quality traits between the

experimentalmaleandfemaleanimalsaswellasgenotypesofleptin5genewerecompared

byPROCMEANS(leastsquaresmeans±standarderror).Co-variabledataeg.finalweight,

durationoffatteningwerealsocalculatedusingtheGLMprocedureofSASmanual.

ResultsandDiscussion SNPgenotypeandallelefrequencies

Expectedgenotypeandallelefrequenciesofleptin5geneinmaleandfemaleAngusx

Thai-native50%crossbredbeefwasshowninTable1.TheresultsoftheX2testofgoodness-

of-fit revealed that themaleanimalswas inHardy-Weinbergequilibrium(HWE)proportions

(p=0.784).ButthefemaleanimalsshowedsignificantdeparturefromHWEproportions(p=0.048)

whichmightbetosystemicselectionforceinthepopulation.However,inbreedingcoefficient

(F)werenegativeFvalues(F<0)inbothmaleandfemaleanimalsindicatingtheabsenceof

inbreedingatthisgene.Incontrast,theresultofX2testofgoodness-offitinAngus100%

bullwasinHWEproportions(p=0.166)andFvaluewasbelowzeroindicatingoutbreedingin

thesebulls.ThefrequencyoftheTalleleofleptin5genewas0.21and0.31inmaleandfemale

AngusxThainative50%crossbredbeef,respectively.ThefrequencyoftheTallelewas0.40

inAngus100%bullwhichwashigherthantheAngusxThainative50%crossbredcattle.

ThefrequencyoftheTalleleofleptin5geneoftheanimalsinthisstudywasnearlysimilar

toexperimentalanimalsinastudyofNkrumahetal.(2005).TheTallelefrequency(0.11-0.26)

wassignificantdifferentamongcrossbredlinesusingAngus,HerfordandCharolaissires.

TheoverallaverageandstandarderrorsforthetraitstestedareinTable2.Ultrasound

rumpfatshowedsignificantdifferent(p=0.028)amongthemaleandfemaleanimals.Ultrasound

intramuscularfat(IMF,%)washighlysignificantdifferent(p=0.001)amongthemale(3.56±0.24)

and female (2.29±0.01) animals. Carcass back fat thickness was significant (p=0.021)

different among the male (3.83±2.01) and the female (13.58±2.06) animals. Carcass beef

marblingscore(BMS0-9)wasalsosignificant(p=0.012)differentamongthemale(2.74±0.18)

andthefemale(0.84±0.21)animals.Inaddition,durationoffatteningandfinalweightofthe

animalswassignificantly(p=0.010andp=0.023)associatedwithBMSasshownintable3.

90


SNPgenotypeeffects

Theleptin5genotypewashighlysignificant(p=0.005)associatedwithBMSandwas

significantly(p=0.035)associatedwithWBSFaspresentedinTable3.Theeffectsofleptin5

genotypeonthecarcassqualitytraitsanalyzedareshowninTable4.Theleptin5genotype

wasnotassociatedwithultrasoundandcarcassREA,BF,RFandIMF.TheBMSdiffered

(p<0.05)amonggenotypesandwashigherforanimalswithgenotypeCT(3.42±0.47)thanfor

animalswithgenotypeCC(1.14±0.43).ThesamplesizeofanimalwithgenotypeTTwastoo

smallforstatisticcomparisoninthisstudy.However,animalsinheritingwithgenotypeTThad

highlysignificantlyhigherultrasoundBFandBMS(p=0.01)comparedwithgenotypeCTorCC

(Nkrumahetal.,2005).Interestingly,animalswithCTgenotype(2.97±4.42kg)hadsignificant

(p<0.05) lowerWBSF compared with genotype CC (14.86±1.91 kg). The sample size of

animalwithgenotypeTTwastoosmallforstatisticcomparisoninthisstudy.Inpresentstudy

indicatedthatSNPgenotypiceffectofleptin5genewasindirectlyinfluencedonWBSFdueto

effectofleptin5genotypeonBMS.Inaddition,themeanvalueofBMSwasslightlyassociated

(r=-0.32)withWBSFvalue,thoseweresimilarlytothestudyof(Bertrandetal.,2001).It

indicatedthatgreatermarblingisslightlyassociatedwithgreatermeattenderness.Theresults

representtheinitialassociationsofleptin5genotypeswithcarcassqualitytraitsandfurther

effortsarerequiredtovalidatethesefindingsinotheranimalpopulationsbeforetheirapplication

inmarker-assistedselection.

References Bertrand,J.K.,Green,R.D.,Herring,W.O.andMoser,D.W.2001.Geneticevaluation

ofbeefcarcasstraits.J.Anim.Sci.79(SupplE):190–200.

Buchanan,F.C.,Fitzsimmons,C.J.,VanKessel,A.G.,Thue,T.D.,Winkelman–Sim,

C.andSchmutz,S.M.2002.Associationofamissensemutationinthebovine

leptingenewithcarcassfatcontentandleptinmRNAlevels.Genet.Sel.Evol.

34:105-116.

Fitzsimmons,C. J.,Schmutz,S.M.,Bergen,R.D. andMcKinnon, J. J. 1998.A

potentialassociationbetweentheBM1500microsatelliteandfatdepositionin

beefcattle.Mamm.Genome9:432–434.

Fruhbeck, G., Jebb, S. A. and Prentice, A. M. 1998. Leptin: Physiology and

pathophysiology.Clin.Physiol.18:399–419.

91


Haegeman,A.,VanZeveren,A.andPeelman,L.J.2000.Newmutationinexon2of

thebovineleptingene.Anim.Genet.31:79.

Magni,P.,Motta,M.andMartini,L.2000.Leptin:Apossiblelinkbetweenfoodintake,

energyexpenditure,andreproductivefunction.Regul.Pept.92:51–56.

Nkrumah, J.D., Li, C., Yu, J., Hansen, C., Keisler, D.H. and Moore, S.S. 2005.

Polymorphisms in the bovine leptin promoter associated with serum leptin

concentration,growth,feedintake,feedingbehavior,andmeasuresofcarcass

merit.J.Anim.Sci.83:20-28.

Pomp,D.,Zou,T.,Clutter,A.C.andBarendse,W.1997.Rapidcommunication:mapping

ofleptintochromosome4bylinkageanalysisofaPCR-basedpolymorphism.

J.Anim.Sci.75:1427.

Table 1 ExpectedgenotypeandallelefrequencyoftheSNPleptin5genederivedfromHardy-

Weinbergequilibriumcalculationin50%AngusxThainative(TN)crossbredbeefandBlack

Angusbull

AngusxTN50%

-Male 29 0.63 0.33 0.04 0.79 0.21 0.07 0.784 -0.050

-Female 37 0.47 0.43 0.10 0.69 0.31 3.90* 0.048* -0.324

Angus100% 10 0.36 0.48 0.16 0.60 0.40 0.28 0.166 0.166

n CC CT TT C T x2 P F

Exp.GenotypeAllele

FrequencyofBreed

TestsfordeviationfromHardy-Weinbergequilibrium

X2 chi-square,P=Pearson’sgoodnessoffitchi-square,F=Inbreedingcoefficient,*p<0.05

92


Ultrasound(n=30) 8 22

Ribeyeare(cm2) 79.15±6.4 73.59±4.87 0.388

Ribeyearea(cm2/100kgBW) 19.09±1.81 18.36±1.37 0.682

Backfat(mm) 3.17±1.21 5.35±1.21 0.085

Rumpfat(mm) 3.91±1.53 7.54±1.16 0.028*

Intramuscularfat(IMF,%) 3.56±0.24 2.29±0.01 0.001**

Carcass(n=26) 8 18

Ribeyearea(cm2) 67.28±12.81 70.54±9.83 0.818

Ribeyearea(cm2/100kgBW) 16.40±3.27 17.32±2.51 0.767

Backfat(mm) 3.83±2.01 13.58±2.06 0.021*

Beefmarblingstandardscore(0-9) 2.74±0.18 0.84±0.21 0.012*

Male Female

Mean±SECarcassqualitytraits

P

Table 2 Leastsquaresmeans±SEshowingtheeffectofsexonmusclequalitytraitsofmale

andfemale50%AngusxThainativecrossbredbeef

Table 3 Probabilityofdependentvariableofcarcassqualitytraitsassociatedwithco-variable

datain50%Angusxnativecrossbredbeef

*p<0.05,**p<0.01

*p<0.05,**p<0.01

Dependentvariableofcarcassqualitytraits

REA REA/100 Backfat BMS WBSF

Mean 62.24 15.26 7.08 2.28 14.63

R2 0.254 0.287 0.922 0.732 0.675

Probability(P)

Sex 0.827 0.767 0.021* 0.012* 0.145

Durationoffattening 0.287 0.322 0.062 0.010* 0.453

Finalweight 0.927 0.214 0.817 0.023* 0.089

Leptin5genotype 0.904 0.904 0.859 0.005** 0.035*

93


Ultrasound(n=30) 14 15 1

Ribeyearea(cm2) 71.57±4.29 75.85±5.01 81.69±9.88

Ribeyearea(cm2/100kgBW) 18.74±2.73 18.42±1.01 19.02±2.07

Backfatthickness(mm) 5.20±0.85 4.59±0.94 2.97±1.86

Rumpfat(mm) 5.66±1.08 6.72±1.19 4.80±2.35

Intramuscularfat(%) 2.93±0.23 2.94±0.26 2.91±0.49

Carcass(n) 10 15 1

Ribeyearea(cm2) 69.59±9.91 64.92±10.85 72.23±17.62

Ribeyearea(cm2/100kgBW) 16.99±2.53 15.68±2.77 17.58±4.49

Backfatthickness(mm) 8.22±1.34 9.44±2.15 8.54±2.64

Beefmarblingscore(0-9) 1.14±0.43a 3.42±0.47b 0.81±0.77a

Warner-BratzlerShearForce(kg) 14.86±1.91* 2.97±4.42* nd

CC CT

Leptin5 genotypeCarcassqualitytraits

TT

Table 4 Mean±SEvaluesofcarcassqualitytraitsoftheanimalscarriedCC,CTandTTgeno-

typeoftheleptin5gene

a,b Withinthecarcassqualitytraitsinacolumn,genotypeswithoutacommonsuperscript letterdiffer(p<0.05),*p<0.05,nd=notdone

94


บทคัดย่อ วัตถุประสงค์ของการศึกษาในครั้งนี้ เพื่อหาความถี่อัลลิลและสนิปจีโนไทป์ ในยีนคาลเปนและ

ยีนคาปาส ตาติน และหาความสัมพันธ์กับความนุ่มของเนื้อของโคลูกผสมแองกัสxพื้นเมือง 50%

ตัวอย่างดีเอ็นเอจำนวน66ตัวอย่างได้นำมาวิเคราะห์ด้วยเครื่องหมายสนิปCAPN14751และCAST-

T1โดยเทคนิคTaqManProbereal-timePCRผลการศึกษาพบว่าตัวอย่างโคมีความถี่อัลลิลCและT

ของยีนคาลเปนเท่ากับ0.55และ0.45ในโคเพศผู้ส่วนในโคเพศเมียมีความถี่อัลลิลเท่ากับ0.42และ0.58

ตามลำดับความถี่สนิปจีโนไทป์CC,CTและTTเท่ากับ0.30,0.49และ0.21ในโคเพศผู้และเท่ากับ

0.17,0.49และ0.34ในเพศเมียตามลำดับส่วนยีนคาลปาสตาตินมีความถี่อัลลิลGและAเท่ากับ0.28

และ0.72ในโคเพศผู้และเท่ากับ0.20และ0.80ในโคเพศเมียตามลำดับความถี่สนิปจีโนไทป์GG,

AGและAAเท่ากับ0.07,0.36และ0.56ในโคเพศผู้และเท่ากับ0.04,0.30and0.66ในโคเพศเมีย

ตามลำดับ การกระจายของความถี่สนิปจี โนไทป์ของยีนคาลเปนและคาลปาสตาติน พบว่าอยู่ ในภาวะ

ไม่สมดลุย์และสมดลุย์ของHardy-Weinbergequilibriumตามลำดบัความนุม่ของเนือ้สนันอกสว่นรบิอายของ

โคลูกผสมแองกัสxพื้นเมือง50%จำนวน20ตัวได้จากการวัดค่าแรงตัดผ่านเนื้อหลังจากบ่มซาก14วัน

โคตัวผู้มีค่าแรงตัดผ่านเนื้อเท่ากับ 5.96±3.36 กก. ส่วนในตัวเมียมีค่าเท่ากับ 11.87±2.83 กก. แสดงว่า

โคตัวผู้มีค่าแรงตัดผ่านเนื้อต่ำกว่าในตัวเมียอย่างไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (p>0.05) ในโคที่มีสนิปจีโนไทป์

ของยีนคาลเปนเป็นCTและTTมีค่าแรงตัดผ่านเนื้อเท่ากับ11.53±1.95และ6.31±4.17กก.ตามลำดับ

ซึ่งมีค่าเฉลี่ยไม่แตกต่างกันทางสถิติ (p=0.241) ส่วนในโคที่มีสนิปจีโนไทป์ของยีนคาลปาสตาตินเป็น AA,

AGและGGมีค่าแรงตัดผ่านเนื้อเท่ากับ9.5±3.41,8.15±3.97และ9.05±3.51กก.ตามลำดับซึ่งมี

คา่เฉลีย่ไม่แตกตา่งกนัทางสถติิ(p=0.751-0.922)การทดลองในครัง้นี้สรปุได้วา่สนปิจีโนไทป์ของยนีคาลเปน

และคาลปาสตาตินมีอิทธิพลต่อความนุ่มของเนื้ออย่างไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ(p>0.05)

คำสำคัญ:โคลูกผสมแองกัสxพื้นเมืองไทย50%คาลเปนคาลปาสตาตินความนุ่มของเนื้อสนิปจีโนไทป์

ณชัย ศราธพันธุ์1 สายใจ ชื่นสุข1 ณัฐนันท์ ศิริรัตนธัญญะกุล1

เลิศชัย จินตพิทักษ์สกุล2 และ กัลยา เก่งวิกย์กรรม1

1 สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์ 2 สถาบันสุขภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศุสัตว์

อิทธิพลสนิปจีโนไทป์ของยีนคาลเปนและคาลปาสตาตินต่อลักษณะความนุ่มของเนื้อในโคลูกผสมแองกัส50%(Thai-Black)

95


Abstract TheobjectiveofthisstudywastodeterminefrequencyandassociationofSNPgenotype

in calpain (CAPN1) and calpastatin (CAST) gene with meat tenderness. Sixty-six DNA

samplesfrom50%AngusxThai-Nativecrossbredbeefwereanalyzedtwosinglenucleotide

polymorphisms(SNPs)andSNPgenotypefrequencyofCAPN1and CASTgenebyCAPN1

4751andCAST-T1markersviaTaqManprobereal-timePCR.FrequencyofalleleCandTin

CAPN1 genewas0.55and0.45aswellas0.42and0.58inmale(n=29)andfemale(n=37)

animals,respectively.TheSNPgenotypefrequenciesofCC,CTandTTinCAPN1genewas

0.30,0.49and0.21,aswellas0.17,0.49and0.34inmaleandinfemaleanimals,respectively.

AllelefrequencyofGandAinCASTgenewas0.28and0.72aswellas0.20and0.80in

maleandfemaleanimals,respectively.TheSNPgenotypefrequencyofCASTgene,including

GG,AGandAAwas0.07,0.37and0.56inmale,aswellas0.04,0.30and0.66infemale

animals,respectively.TheSNPgenotypefrequencyoftheCAPN1andCASTgeneswerenot

andweredistributedaccordingtoHardy-Weinbergequilibriumproportions,respectively.Meat

tendernessofrib-eyesteakmuscleswasmeasuredbyWarner-BratzlerShearForce(WBSF)

at14dpostmortemageingfrom11maleand9femaleof50%AngusxThai-Nativecrossbred

beef.TheWBSFvalueswere5.96±3.36and11.87±2.83kginmaleandfemaleanimals,

respectively. It revealed that the rib eyesteakmuscleofmaleanimal hadnosignificantly

(p>0.05)moretenderthanthoseoffemaleanimals.Moreover,theWBSFvalueswere11.53±1.95

and6.31±4.17inanimalscarriedCTandTTgenotypeofCAPN1gene(p=0.241).Inaddition,

theWBSFvalueswere9.5±3.41,8.15±3.97and9.05±3.51inanimalscarriedAA,AGandGG

genotypeof CASTgene(p=0.751-0.922).Itwasconcludedthattherewasnosignificanteffect

oftheSNPgenotypeofCAPN1 and CASTgenesonmeattendernessinthisstudy.

Keywords:AngusxThai-native50%,Beef,µ-Calpain,Calpastatin,Gene,Meattenderness

Nachai Sarataphan1 Saijai Cheunsuk1 Nattanant Sirivattanatanyakul1 Lerdchai Chintapitasakul2 and Kalaya Kengvikkum1

1 Bureau of Biotechnology in Livestock Production, Pathumthani 1 National Institute of Animal Health, Bangkok, 10900

SNPGenotypicEffectofµ-CalpainandCalpastatin GenesonTendernessTraitin50%AngusCrossbred(Thai-Black)

96


Introduction Meat tenderness is a critical trait in determining consumer satisfaction, and there

hasbeensignificantinterestingeneticselectiontodecreaseproblemswithmeattenderness

variation.However,theproblemofvariabilityinmeattendernesshasnotdiminished,inpart

becauseofaninabilitytoaccuratelyselectforincreasedtenderness.Identificationofgenetic

markersformeattendernessvariationwouldprovidesomeselectioncriteriatofacilitatege-

neticimprovementinthistrait.PreviousstudyidentifiedaQTLinfluencingmeattendernesson

chromosome29(Casasetal.,2000).Subsequently,thebovinecalcium-activatedneutralprotease

(CAPN1)gene,encodingtheprotease-calpain,wasmappedtotheQTLinterval(Smithetal.,

2000).Thisproteaseseemstobetheprimaryenzymeinpostmortemtenderization(Koohmaraie,

1996),suggesting frombothpositionalandfunctionalstandpoints thatvariation in thegene

sequencemightbeassociatedwithmeattendernessincattle.SequencingthebovineCAPN1

geneinamultibreedpanelofcattleidentified>150sequencevariationsspreadalong>11,000

bp.Twosingle-nucleotidepolymorphisms(SNP)predictvariationintheproteinsequenceofthe

protease(Pageetal.,2002).

Thephysiologicalchangeinmusclestructureduringthepostmortemperiodiscomplex

(Koohmaraie, 1994). The calpain/calpastatin system is an endogenous, calcium-dependent

proteinase system, theorized tomediate the proteolysis of keymyofibrillar proteins during

postmortemstorageofcarcassandcutsofmeatatrefrigeratedtemperatures(Koohmaraieet

al.,1995b).Calpainisresponsibleforthebreakdownofmyofibrillarproteins,whichareclosely

relatedtomeattenderness(WheelerandKoohmaraie,1994).Calpastatin(CAST)inhibitscalpain

activityand,therefore,regulatespostmortemproteolysis.IncreasedpostmortemCASTactivity

hasbeencorrelatedwithreducedmeattenderness(e.g.,Koohmaraieetal.,1995a;Pringleet

al.,1997).TheCASTgene,mappedtoBTA7(Bishopetal.,1993),isconsideredacandidate

gene forbeef tenderness.More recently,genetic tests formeat tenderness inbeef,which

utilizegeneticpolymorphismsintheCAPN1and/orCASTgenes,havebeenmadeavailable

byprivatecompanies.ExamplesaretheIGENITYTenderGENEtest(MerialLtd.,Atlanta,GA)

andtheGene-STARTenderness2test(GeneticSolutionsPty.Ltd.,Albion,Australia).The

objectiveofthisstudywastoassesstheassociationoftwoSNPsintheCAPN1andCAST

genewithmeattendernessinAngusxThai-native50%crossbredbeefcattle.

97


MaterialsandMethods Experimentalanimals

Sixty-six50%AngusxThainativecrossbredbeeffromtheprojectofahighquality

Thai-BlackbeefproductionundertheBureauofBiotechnologyinLivestockProduction(BBLP),

DepartmentofLivestockDevelopment(DLD)wereusedinthisstudy.Elevencastratedmale

ataverage1.71±0.08yrofagewith294.36±11.32kgand10femaleataverage1.66±0.07yrof

agewith295.10±15.37kgwereusedinexperimentofcarcassqualitytraits.Themalewere

fedwithstemsandsweetcornpulpsby-productofsweetcorncan.Fourteenpercentprotein

ofcommercialconcentratedfeedwereaddeddailyat4kgperanimal.Thefemaleanimalswere

fedwith14%proteinoftotalmixration(TMR)includingconcentratedanddryPangolahays.

DNAsamples

Bloodsamplesofeachanimalwerecollectedfromthejugularveininto6mlofEDTA

tube.Thebloodsampleswerekeptiniceboxandsubmittedtoourlaboratory.Twohundredml

ofeachbloodsamplewasextractedgenomicDNAbycommercialkit(AxyPrepBloodGe-

nomicDNAMiniprepkit:AxygenBioscience;USA).FrozensemensamplesofAngusbull

wereextractedDNAbyphenol:chloroformmethod(Sambrooketal.1989).Twentynanogram

oftheDNAsampleswerepreparedfordetectingtwoSNPsintheCAPN1andCASTgene.

SNPdetectionandgenotyping

ASNPofCAPN1gene,namelyCAPN14751,atthenucleotide6545accordingtoGenBank

accessionAF248054(g6545C>T)wasamplifiedbyprimerandspecificprobes.Theforward

primer:5’-tggcatcctccccttgact-3’,thereverseprimer:5’-cccccgtcacttgacaca-3’andtwoABITaq-

Manfluorogenicprobes:Probe1,5’-cgcctcGgttttc-3’andProbe2,5’-cgcctcAgttttc-3’weredesigned

accordingtoWhiteetal.(2005).ASNPofCASTgene,namelyCAST-T1,atthenucleotide

2959accordingtoGenBankaccessionAF159246(g2959A>G)wasalsoamplifiedbyprimer

andspecificprobes.Theforwardprimer:5’-ctcacgtgttcttcagtgttctg-3’,thereverseprimer:5’-caac-

ccaaagaaacatcaaacacagt-3’andtwoABITaqManfluorogenicprobes:Probe1,5’-cctttcctcttA-

gacttgt-3’,Probe2:5’-ctttcctcttGgacttgt-3weredesignaccordingtoBarendse(2002).

Real-timepolymerasechain reaction (PCR)mixture contained20ng (1 µl) ofDNA

sampletemplate,5µlofTaqManGenotypingMasterMix(2x),0.5µlofTaqMangenotyping

assaymix(20x)and3.5µlofDNase-free,RNAsefreewater.Real-timePCRwasperformed

inthethermalcyclermachine(StepOnePlus,ABI,USA).PCRreactionwasactivatedAmpliTaq

Goldenzymeat95oCfor10min,thenthermalcycleof40cyclesincludeddenaturationat

95oCfor15sandannealingat60oCfor1min.Theprobe1and2weretaggedwithVICand

98


FAMfluorescentdyeswhichshowedgreenandbluecolorofamplificationcurveinaresultof

analysisbyStepOnePlussoftware(StepOnePlus,ABI,USA).Aspecificmatchoftheprobe

sequencetothetargetsequencewillresultinamplification,duringwhichcleavageandrelease

ofthereporterdyeoccurs.Fluorescentsignalforoneortwodyesindicatedhomozygosityor

heterozygosityforaparticularalleleoftheSNP.

Carcassexamination

Ineachcarcass,ribeyearea(REA)musclebetweenthe10thto13thribwerecutand

submittedtoourlaboratoryfor14dofageing.OnehalfoftheREAmusclesampleswerecut

into250-300gofribeyesteakforREA,backfatthicknessandbeefmarblingscore(BMS)

measurement(0-9)usingAustralian’scorecard.Theotherhalfofthecarcassesweredeboned

andcutinto3x2x5cmoflongitudinalLongissimusdorsimuscleforsubmittingtomeasure

Warner-BratzlerShearForce(WBSF)usingthemachineofInstronModel1011(InstronCor-

poration,USA)attheChiangMai’smeatlaboratoryundertheDLD.

Statisticalanalyses

Gene-marker frequenciesforAngusxThainative50%crossbredbeefwithCAPN1

andCASTgenemarkerwereestimatedusingthegenotypedata.TestofdeviationfromHardy-

Weinbergequilibrium(HWE)wasperformedandtestedagainsttheirexpectationsusingthe

chi-squaredtestwithstatisticon1df.Allanalysesofcarcassqualitytraitswereperformed

usingtheGLMprocedureofSASmanual.Thecarcassqualitytraitsbetweentheexperimental

maleandfemaleanimalsaswellasgenotypesofCAPN1andCASTgeneswerecompared

byPROCMEANS.

ResultsandDiscussion ExpectedgenotypeandallelefrequenciesofCAPN1geneinmaleandfemaleAngusx

Thai-nativecrossbredbeefwasshowninTable1.TheresultsoftheX2testofgoodness-of-fit

revealedthatthemaleandfemaleshowedsignificantdeparturefromHWEwhichmightbeto

systemicselectionforceinthepopulation.However,inbreedingcoefficient(F)werenegative

Fvalues(F<0)indicatingtheabsenceofinbreedingatthisgene.Incontrast,thisstudythe

resultofX2testofgoodness-offitinAngus100%bullwasinHWEandFvaluewasbelow

zeroindicatingoutbreedinginthesebulls.FavorablealleleCfrequencyofCAPN1gene(0.47)

hadbeenreportedinredAngus(VanEenennaametal.2007)whichsimilarlyvalue(0.42-0.55)

inthemaleandfemaleanimalsandlowervalue(0.60)thanBlackAngusinthisstudy.

99


ExpectedgenotypeandallelefrequenciesofCASTgeneinmaleandfemaleAngusxThai-nativecrossbredbeefwasshowninTable1.TheresultsoftheX2testofgoodness-of-fitrevealedthatthemaleandfemalewasinHWEandFvalueswerenegative(F<0)indicatingtheabsenceofinbreedingatthisgenesimilartoAngus100%bull.FavorablealleleAfrequencyofCASTgene(0.89)hadbeenreportedinAngus(VanEenennaametal.2007)whichwashighervalue(0.72-0.80)thaninthemaleandfemaleanimalsandlowervalue(0.95)thanBlackAngusinthisstudy.

TheWBSFvalueswere5.96±3.36and11.87±2.83kg(p=0.145)inmaleandfemaleanimals,respectivelyasshowninTable2.Itrevealedthattheribeyesteakmuscleofmaleanimalhadnosignificantly(p >0.05)moretenderthanthoseoffemaleanimals.Moreover,theWBSFwasalsonotassociatedwithperiodoffattening(p=0.453)andfinalliveweight(p=0.089)oftheanimalsinthisstudy(Table3).Theresultindicatedthattherewasnosignificanteffectofsex,periodoffatteningandfinalliveweightontendernesstrait.Interestingly,leptin5geneshowedasignificanteffect(p =0.035)ontendernessinAngusxThai-native50%crossbredbeef.Inaddition,leptin5 geneshowedahighlysignificanteffect(p=0.005)onbeefmarblingscore.Itwaspossiblethatphenotypicandgeneticrelationshipsbetweenmarblingandtender-nessarenotespeciallyhighbutshowafavorabledirection.Itindicatedthatgreatermarblingisslightlyassociatedwithgreatertenderness(Bertrandetal.,2001).

Intable3,thestudywasnotdetectsignificantassociationofCAPN1(p=0.241)andCAST (p=0.940)polymorphismswithmeat tenderness. In table4, theWBSFvalueswere11.53±1.95and6.31±4.17inanimalscarriedCTandTTgenotypeofCAPN1gene(p=0.241).Inaddition,theWBSFvalueswere9.5±3.41,8.15±3.97and9.05±3.51inanimalscarriedAA,AGandGGgenotypeofCASTgene(p=0.751-0.922).ItwasconcludedthattherewasnosignificanteffectoftheSNPgenotypeofCAPN1andCASTgenesonmeattendernessinthisstudy. InthisstudywassimilartobothstudiesofLonerganetal.(1995)andChungetal.(1999)thatassociationofCASTpolymorphismwerenotdetectedsignificantlywithmeattenderness.Itwaspossiblethatthesamplesizesweresmall,whichmayhavecontributedtothefailuretoidentifysignificantassociationbetweenthe CASTgenepolymorphismsandmeattenderness.However,thestudyofCasasetal.(2006)usingalargesamplesizesofcrossbredEuropeanbeef(n>500)andpurebreedBrahman(n=444)wasperformedtodetecttheCAPN1andCAST polymorphismsbythesameourmarkers.TheresultsshowedthatanimalsinheritingtheCCgenotypeofCAPN1genehadmeatthatwasmoretenderthanthoseinheritingtheTTgenotype.Inaddition,animalsinheritingtheAAgenotypeofCASTgenehadmoremeattendernessthanthoseinheritingtheGGgenotype.ItconcludedthattheCAPN14751andCAST-T1markersaresuitableforuseinidentifyingBos taurus x Bos taurus, Bos taurus x Bos indicuscrossbredandpurebreedBrahmanbeefwiththegeneticpotentialtoproducemeatthatismoretender.

100


References Barendse, W.G. 2002. DNA markers for meat tenderness. International patent

applicationNo.PCT/AU02/00122.WorldIntellectualPropertyOrg.Int.Publication

No.WO02/064820A1.

Bertrand,J.K.,Green,R.D.,Herring,W.O.andMoser,D.W.2001.Geneticevaluationof

beefcarcasstraits.J.Anim.Sci.79(SupplE):190–200.

Bishop,M.D.,Koohmaraie,M.,Killefer,J.andKappes,S.1993.Rapidcommunication:

Restriction fragment length polymorphisms in the bovine calpastatin gene.

J.Anim.Sci.71:2277.

Casas,E.,Shackelford,S.D.,Keele,J.W.,Stone,R.T.,Kappes,S.M.andKoohmaraie,

M.2000.Quantitativetraitlociaffectinggrowthandcarcasscompositionofcattle

segregatingalternateformsofmyostatin.J.Anim.Sci.78:560–569.

Casas,E.,White,S.N.,Wheeler,T.L.,Shackelford,S.D.,Koohmaraie,M.,Riley,D.G.,

Chase,C.C.,Johnson,Jr.,D.D.andSmith,T.P.L.2006.Effectsofcalpastatin

and{micro}-calpainmarkersinbeefcattleontendernesstraits.J.Anim.Sci.

84:520–525.

Chung,H.Y.,Davis,M.E.,Hines,H.C. andWulf,D.M. 1999.Relationship of a

PCR-SSCPatthebovinecalpastatinlocuswithcalpastatinactivityandmeat

tenderness.J.Anim.Sci.77(Suppl1):31.(Abstr.)

Koohmaraie, M. 1994. Muscle proteinases and meat aging. Meat Sci. 36:93–104.

Koohmaraie, M. 1996. Biochemical factors regulating the toughening and

tenderizationprocessofmeat.MeatSci.43:S193–S201.

Koohmaraie, M., Killefer, J., Bishop, M. D., Shackelford, S. D.,Wheeler, T. L. and

Arbona,J.R.1995a.Calpastatin-basedmethodsforpredictingmeattenderness.

Pages395–412inExpressionofMuscleProteinasesandRegulationofProtein

DegradationasRelatedtoMeatQuality.A.Ouali,D.Demeyer,andF.Smulders,

ed.AudetTijdschrifrenb.v.,Nijmegen,TheNetherlands.

Koohmaraie, M., Wheeler, T. L. and Shackelford, S. D. 1995b. Beef tenderness:

Regulationandprediction.Pages1–10inProc.Meat’95:CSIROMeatIndustry

Res.Conf.,Session4A.CSIROAustralia,Brisbane,Australia.

101


Page,B.T.,Casas,E.,Heaton,M.P.,Cullen,N.G.,Hyndman,D.L.,Morris,C.A.,

Crawford,A.M.,Wheeler,T.L.,Koohmaraie,M.,Keele,J.W.andSmith,T.P.

L.2002.EvaluationofsinglenucleotidepolymorphismsinCAPN1forassociation

withmeattendernessincattle.J.Anim.Sci.80:3077–3085.

Pringle,T.D.,Williams,S.E.,Lamb,B.S.,Johnson,D.D.andWest,R.L.1997.

Carcasscharacteristics,theCalpainproteinasesystem,andagedtendernessof

AngusandBrahmancrossbredsteers.J.Anim.Sci.75:2955–2961.

Lonergan,S.M.,Ernst,C.W.,Bishop,M.D.,Calkins,C.R.andKoohmaraie,M.1995.

Relationshipofrestrictionfragmentlengthpolymorphisms(RFLP)atthebovine

calpastatin locus to calpastatin activity andmeat tenderness. J.Anim.Sci.

73:3608–3612.

Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.1989.MolecularCloning:ALaboratory

Manual.2nded.ColdSpringHarborLab.Press,NewYork,NY.

Wheeler,T.L.,andKoohmaraie,M.1994.Prerigorandpostrigorchangesintenderness

ofovinelongissimusmuscle.J.Anim.Sci.72:1232–1238.

White,S.N.,Casas,E.,Wheeler,T.L.,Shackelford,S.D.,Koohmaraie,M.,Riley,D.G.,

ChaseC.C.Jr.,Johnson,D.D.,Keele,J.W.andSmith,T.P.L.2005.Anew

single nucleotide polymorphism in CAPN1 extends the current tenderness

markertesttoincludecattleofBosindicus,Bostaurus,andcrossbreddescent.

J.Anim.Sci.83:2001–2008.

VanEenennaam,A.L.,Li,J.,Thallman,R.M.,Quaas,R.L.,Dikeman,M.E.,Gill,C.

A.,Franke,D.E.andThomas.M.G.2007.ValidationofcommercialDNAtests

forquantitativebeefqualitytraits.J.Anim.Sci.85:891–900.

102


Table 1 AlleleandgenotypefrequencyofCAPN1andCASTgenederivedfromHardy-Weinberg

EquilibriumcalculationinAngus100%andAngusxThainative(AngusxTN)50%crossbred

beef

AngusxTN50%

-Male 29 0.30 0.49 0.21 0.55 0.45 13.14 2.8e-4** -0.673

-Female 37 0.17 0.49 0.34 0.42 0.58 13.76 2.07e-4** -0.609

Angus100% 10 0.36 0.48 0.16 0.60 0.40 3.40 0.065 0.583

AngusxTN50%

-Male 29 0.07 0.37 0.56 0.28 0.72 1.26 0.261 -0.208

-Female 37 0.04 0.30 0.66 0.20 0.80 2.39 0.121 -0.254

Angus100% 10 0.01 0.09 0.90 0.05 0.95 0.03 0.867 -0.053

CC CT TT C T x2 P F

Breed/ n

CAPN1gene:

Frequencyof

TestsfordeviationfromHardy-Weinbergequilibrium

X2 chi-square,P=Pearson’sgoodnessoffitchi-square,F=Inbreedingcoefficient,** p<0.05

Frequencyof

Breed/ n

CASTgene: CC CT TT C T x2 P F

2.50±0.15

2.10±0.13

Male(n=11)

Female(n=10)

Age(yr)Sex

5.96±3.36

11.87±2.83

425.36±17.75

400.90±22.14

LiveWeight(kg) WBSF(kg)

Cowgroups

Table 2 Mean±SEvaluesofageatslaughter,liveweightandWarner-BratzlerShearForce

(WBSF)ofmaleandfemale50%Angusxnativecrossbredbeef

abc Leastsquaremeanswithdifferent letterswithin thecolumnaresignificantlydifferent (P<0.01)AB Least square means with different letters within the row are significantly different (P<0.01)* Overallmeans

103


Table 3 Probabilityofdependentvariableofcarcassquality traits in50%Angusxnative

crossbredbeef

* p<0.05

Dependentvariableofcarcassqualitytraits

REA REA/100 Backfat BMS WBSF

Mean 62.24 15.26 7.08 2.28 14.63

R2 0.254 0.287 0.922 0.732 0.675

Probability(P)

Sex 0.827 0.767 0.021* 0.012* 0.145

Durationoffattening 0.287 0.322 0.062 0.010* 0.453

Finalweight 0.927 0.214 0.817 0.023* 0.089

Leptin5genotype 0.904 0.904- 0.859 0.005** 0.035*

CAPN1genotype 0.696 0.745 0.965 0.162 0.162

CASTgenotype 0.9990.9930.213 0.369 0.369

CAPN1 CC CT TT

nd 11.53±1.95ns 6.31±4.17ns

CAST AA AG GG

9.56±3.41ns 8.15±3.97ns 9.05±3.51ns

Warner-BratzlerShearForce(kg)

Mean±SE

GenotypeGene

Table 4 Independent genotypic effect of calpain (CAPN1) and calpastatin (CAST) gene on

Warner-BratzlerShearForceof22ribeyesteakmuscles

nd nodata,ns nonsignificance(p>0.05)

104


Documents

JTsarsrnnTuTaddlnrtnr nlsfidmlqfn5biotech.dld.go.th/webnew/Data/Document_Announces/... · 2.2 ต้นฉบับเป็นภาษาไทยหรือภาษาอังกฤษ