การตรวจวิเคราะห์ยาในอาหารสัตว์afvc.dld.go.th/webnew/images/stories/Document/... · Staphylococcus aureus Escherichia coli

การตรวจวเคราะหยาในอาหารสตว

สทธพร พรยายนผเชยวชาญดานการวเคราะหคณภาพสนคาปศสตว

กลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตวส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว

โทร/โทรสาร 02-9679751, [email protected] หรอ [email protected]

28 พฤศจกายน 2561

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

Phiriyayon, 2018 2

91 หมท 4 ถนนตวานนท ต าบลบางกะด อ าเภอเมอง จงหวดปทมธาน 12000หมายเลขโทรศพท 02-9679700 หมายเลขโทรสาร 02-9679747

E-mail address: [email protected]://www.dld.go.th/qcontrol

ตดตอสงตวอยางและรบผลทดสอบเรงดวนโทร/โทรสาร 02-967-9753

http://www.dld.go.th/qcontrol

Phiriyayon, 2018 3

หองปฏบตการกลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตว

Phiriyayon, 2018 4

หองปฏบตการกลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตว

ชนดยาในอาหารสตว

•Chlortetracycline (CTC)

• Oxytetracycline (OTC)

• Nitrofurazone (NFZ)

• Nitrofurantoin (NFT)

• Furazolidone (FZD)

• Furaltadone (FZD)

• Nitrovin (NIV)

• Zoalene (ZOA)

• Roxarzone (ROX)

• Carbadox (CBX)

วเคราะหชนดวตามนและแรธาต

วเคราะหสวนประกอบ (Ingredients)

วเคราะหการปลอมปน (Adulteration) *

การวเคราะหตวอยางดานกายภาพ

5* หมายถง รายการทไดรบรองความสามารถหองปฏบตการทดสอบตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2005Phiriyayon, 2018

การวเคราะหตวอยางดานจลชววทยา

แบคทเรยกอโรคSalmonella spp.*

Campylobacter spp.

Listeria monocytogenes

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Enterobacter sakasakii

Coliform

การนบปรมาณจลนทรย

Total bacteria count*Enumeration of yeast&molds*

สารเสรมชวนะ (Probiotics)Bacillus spp.Lactobacillus spp.Saccharomyces spp.Bifidobacterium spp.Pediococcus spp.Lactic acid bacteriaEnterococcus faecium

Inhibitory microbiological assay

• Antibiotic microbiological assay*

DNA & GMOs

จลชววทยา 1 จลชววทยา 2 จลชววทยา 3

* หมายถง รายการทไดรบรองความสามารถหองปฏบตการทดสอบตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2005 6Phiriyayon, 2018

การวเคราะหตวอยางดานเคม

โปรตน*กาก*Pepsin digestibilityเถาทไมละลายในกรด ทราย แรธาต (Ca, P, Fe, Zn, Cu, Mg, Mn, Na)

ไขมนในอาหารสตวและวตถดบอาหารสตว*ไขมนในผลตภณฑนมและอาหาร เสรมไขมนในอาหารสตวเลยง (สนข, แมว)ความชน*เถา*เกลอ

โลหะหนก Cd*, Pb, As, Hgวตามน B2

ยเรยยรเอส แอคตวต

เคม 1คณคาทางโภชนาการ

เคม 2คณคาทางโภชนาการ

เคม 3โลหะหนก วตามน ยเรยและยรเอส แอคตวต

7

* หมายถง รายการทไดรบรองความสามารถหองปฏบตการทดสอบตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2005

Phiriyayon, 2018

การวเคราะหตวอยางดานพษวทยาและชวเคม

1. Banned substances

• Beta agonists*

• Chloramphenicol

• Carbadox*

• Nitroimidazoles*

• Nitrofurans

• Olaquindox*

• Diethylstilbestrol hormone

• Melamine & analogue

3. Anticoccidial substance

2. Antimicrobial drugs

• Sulfonamides

• -lactams

• Tetracyclines*

• Macrolides

• Tiamulin

• Lincomycin

• Fluoroquinolones

• Polymyxins (Colistin)

8. Mycotoxins

• Aflatoxins (total)*

• Aflatoxin (B1, B2, G1, G2)*

• Aflatoxin M1

• Ochratoxin A

• Zearalenone

• Fumonisins (FB1, FB2, FB3)

• T-2 + HT-2 Toxin

• Deoxynivalenol (DON)

9. Amino acid

6. Dyes

• Canthaxanthin

• Astaxanthin

4. Contaminants

• PCBs

• Dioxins

5. Pesticides

• OCPs 7. Hormones

• Diethylstilbestrol hormone

• Hexestrol hormone

* หมายถง รายการทไดรบรองความสามารถหองปฏบตการทดสอบตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:20058Phiriyayon, 2018

การตรวจวเคราะหยาในอาหารสตว

9Phiriyayon, 2018

การตรวจสอบชนดยาเบองตน (Screening test)

การทดสอบหาสารปฏชวนะโดยวธเบองตนทางจลชววทยา (Microassay)

การตรวจวเคราะหยาตกคางในอาหารสตวโดยใชเครองมอชนสง

Phiriyayon, 2018 10

วธวเคราะห

ดานกายภาพ ดานเคม ดานจลชววทยา ดานพษวทยาและชวเคม (สารตกคาง) ดานพษวทยาและชวเคม (สารพษเชอรา)

informationFQCLTestMethods2016update201059.pdf

11

1. รบตวอยางจากทองทและหนวยงานตางๆ ดวยรหสตวอยางจากทองทพรอมใบสงตวอยางอาหารสตวส าหรบทดสอบและเอกสารรายละเอยดตวอยางอาหารสตว2. ก าหนดรหส Lab code3. สงตรวจหาชนดยาเบองตนตามตนเรองและ พรบ.4. สงยนยนหาชนดและปรมาณดวยเครองมอชนสง5. สงเอกสารผลวเคราะหกลบไปยงหนวยงานตนเรองและจดท าเอกสารแจงเตอนความไมปลอดภย (Rapid Alert System for Feed Safety) 6. หนวยงานตนเรองแปลงรหสกนเปนรหสตวอยางและทมาของตวอยาง7. พจารณาด าเนนการควบคมตามหลกฐานทม8. หากผลวเคราะหไมตรงกบบรษทหรอการตรวจท Lab อน ควรสงตวอยางทเกบไว มาตรวจสอบหรอสอบสวนหาสาเหตเกบซ า โดยตองประสานกบผจดการวชาการกลมเพอรวมกนหาสาเหต9. รบรองผลวเคราะหเฉพาะตวอยางทมาถงหองปฏบตการและมหลกฐานรายละเอยดเทานนขอ 1-9 ด าเนนงานวเคราะหและควบคมผลทดสอบปฏบตตามระบบประกนคณภาพหองปฏบตการISO/IEC 17025:2005 และตาม directive EU เรองการทดสอบความใชไดของวธ และ Good Laboratory Practice (GLP)

การตรวจควบคมคณภาพอาหารสตว

Phiriyayon, 2018

ขนตอนการตรวจสอบคณภาพอาหารสตว

4 5 6

12Phiriyayon, 2018

1 2 3 4

5 6 7 8

13Phiriyayon, 2018

ขนตอนการบดตวอยางเพอเตรยมวเคราะหคณภาพอาหารสตว

Phiriyayon, 2018 14

Color test

Microbiological assay

ELISA

Strip test

CHARM II

FEED SAMPLE

Pesticide & Environmental Substances

GC, GC-MS

DRUGs

Screening Test

HPLC, LC-MS/MS ,

LC-HRMS/MS

Drug residue analysis

15

SulfonamidesBeta-agonists

Carbadox

Chloramphenicol

Nitrofurans

Tetracyclines

Olaquindox

Macrolides

Nitroimidazoles

Fluoroquinolones

DRUGS


Coccidiostat

Phiriyayon, 2018

Polymyxins (Colistin)Beta-lactams

Phiriyayon, 2018 16

SulfonamidesBeta-agonists

Carbadox

Chloramphenicol

Nitrofurans

Tetracyclines

Olaquindox

MacrolidesNitroimidazoles

Coccidiostat

LC-MSMS

Triple quadrupole


Polymyxins (Colistin)Beta-lactams

Phiriyayon, 2018 17

Fluoroquinolones

Diethylstilbestrol

LC-HRMS/MS


Phiriyayon, 2018 18

การวเคราะหยาและสารตองหามดวยวธเบองตน (Screening test)

ล าดบท สารตองหาม รายการ วธวเคราะห ยหอ

1 Beta agonists

SalbutamolLC-MS/MS Triple Quadrupole

Mass SpectrometryShimadzuClenbuterol

Ractopamine

2 Carbadox CarbadoxLC-MS/MS Triple Quadrupole

Mass SpectrometryShimadzu

3 Chloramphenical ChloramphenicalLC-MS/MS Triple Quadrupole


4 Diethylstilbestrol Diethylstilbestrol LC-HRMS/MSThermo scientific

Phiriyayon, 2018 19

การวเคราะหยาและสารตองหามดวยเครองมอชนสง (Confirmation)

ล าดบท สารตองหาม รายการ วธวเคราะห ยหอ

5 Nitrofurans

NitrofurazoneLC-MS/MS Triple Quadrupole


NitrofurantoinFurazolidoneFuraltadone

6 NitroimidazolesDimetridazole

LC-MS/MS Triple QuadrupoleMass Spectrometry

ShimadzuRonidazoleMetronidazole

7Malamine and

analogues

Melamine

GC-MS/MS AgilentAmmelide

CyromazineCyanuric acide

8 Olaquindox OlaquindoxLC-MS/MS Triple Quadrupole


Phiriyayon, 2018 20


ล าดบท ยา/กลมยา รายการ วธวเคราะห ยหอ

1 Beta-lactamsAmoxicillin LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass

SpectrometryShimadzuPenicillin G

Ceftiofur

2 Fluoroquinolones

Ciprofloxacin

LC-HRMS/MSThermo scientific

CinoxacinDanofloxacin

DifloxacinEnoxacin

EnrofloxacinFlumequine

MarbofloxacinNorfloxacin

Nalidixic acidOrbifloxacinOxolinic acidSarafloxacinMaloxacinOfloxacin

Phiriyayon, 2018 21



3 Lincomycin LincomycinLC-MS/MS Triple Quadrupole


4 MacrolidesTylosin


ShimadzuTilmicosinErythromycin

5 Polymyxins ColistinLC-MS/MS Triple Quadrupole


6 SulfonamidesSulfamethazine LC-MS/MS Triple Quadrupole


Sulfadimethoxine

7 TetracyclineChlortetracycline

HPLC WaterOxytetracyclineDoxycycline

Phiriyayon, 2018 22



8 Tiamulin TiamulinLC-MS/MS Triple Quadrupole


9Anticoccidial

substance

Decoquinate


Shimadzu

DiclazurilHalofuginone

LasalocidMaduramicin

MonensinNarasin

NicarbazinNigericin

RobinidineSalinomycinToltrazuril

23

รายชอยาและสารมาตรฐานทใชกลมยา รายการ ความบรสทธ ยหอ

Polymyxin Colistin sulfate - EDQM

Penicillin G Amoxicillin trihydrate 99.4 Dr.EhrenstorferCephalosporins Ceftriaxone Sodium Hemiheptahydrate 99.5 LGC

Cefotaxime sodium 98 TRCCeftiofur 99.0 Dr.Ehrenstorfer

Cefquinome sulfate 96.3 Dr.Ehrenstorfer

Fluoroquinolones Cirofloxacin 99.1 Fluka

Enrofloxacin 98.5 Dr.Ehrenstorfer

Norfloxacin 99.8 Sigma

Enoxacin 99.0 Dr.EhrenstorferCiprofloxacin Hydrochloride 94.0 Dr.EhrenstorferDanofloxacin 99.6 FlukaSarafloxacin 97.0 Dr.EhrenstorferEnrofloxacin 99.2 USPEnoxacin 99.0 Dr.EhrenstorferMarbofloxacin 99.0 Dr.EhrenstorferNorfloxacin 99.0 Dr.Ehrenstorfer

Phiriyayon, 2018

Phiriyayon, 2018 24

กลมยา รายการ ความบรสทธ ยหอMacrolides Tilmicosin - USP

Tiamulin 99.0 Dr.EhrenstorferNitroimidazoles Dimetridazole 99.0 Dr.Ehrenstorfer

Metronidazole 99.5 Dr.EhrenstorferMetronidazole 99.9 FlukaDimetridazole 99.9 FlukaRonidazole 97 FlukaRonidazole 99.0 Dr.EhrenstorferRonidazole 97.0 Dr.EhrenstorferRonidazole >99 Fluka

Olaquindox Olaquindox 99.0 Dr.EhrenstorferOlaquindox 95.7 Fluka

รายชอยาและสารมาตรฐานทใช

Phiriyayon, 2018 25

กลมยา รายการ ความบรสทธ ยหอBeta agonists Salbutamol 99.5 Dr.Ehrenstorfer

Clenbuterol Hydrochloride 98.5 Dr.EhrenstorferRactopamine Hydrochloride 97.0 Dr.EhrenstorferClenbuterol Hydrochloride (reference standard) - EDQMRactopamine Hydrochloride (reference standard) 99.0 USPSalbutamol CRS (reference standard) - EDQMSalbutamol (reference standard) - EDQMSalbutamol 99 Dr.EhrenstorferRactopamine Hydrochloride 98.0 Dr.EhrenstorferRactopamine Hydrochloride 95.5 Sigma-AldrichSalbutamol 99.0 Dr.EhrenstorferSalbutamol 99.5 Sigma-AldrichClenbuterol Hydrochloride 99.0 Dr.EhrenstorferClenbuterol Hydrochloride 98.1 Sigma


กลมยา รายการ ความบรสทธ ยหอTetracycline Chlortetracycline(1/2) 87 Sigma

Doxycycline 98.0 SigmaDoxycycline 98.7 SigmaTetracycline Hydrochloride (Reference STD) 97.6 USPOxytetracycline (Reference STD) 90.0 USPChlortetracycline Hydrochloride (Reference STD) 92.40 EDQMTetracycline 92.4 SigmaOxytetracycline (Reference STD) 90.0 USPChlortetracycline Hydrochloride (Reference STD) 92.40 EDQMChlortetracycline Hydrochloride 90.0 SigmaDoxycycline Hyclate 100.0 SigmaOxytetracycline 95.9 SigmaDoxycycline Hyclate 99.1 Sigma -AldrichOxytetracycline Hydrochloride 100 USPChlortetracycline Hydrochloride 92.4 EDQMChlortetracycline Hydrochloride 93.3 SigmaDoxycycline Hyclate 98.7 Dr.EhrenstorferTetracycline Hydrochloride 97.7 Dr.EhrenstorferTetracycline Hydrochloride 98.0 Sigma -Aldrich


กลมยา รายการ ความบรสทธ ยหอNitrofurans Furazolidone 99.9 Sigma /Fluka

Nitrofurantion 99.9 Sigma /FlukaNitrofurantion 99.4 FlukaFuraltadone Hydrochloride 96.9 CarbosynthFuraltadone Hydrochloride 99.0 Dr.EhrenstorferFurazolidone 99.0 Dr.EhrenstorferNitrofurazone 99.0 Dr.EhrenstorferNitrofurantion 99.0 Dr.Ehrenstorfer


กลมยา รายการ ความบรสทธ ยหอDiethylstilbestrol Diethylstilbestrol 99.5 Dr.Ehrenstorfer

Diethylstilbestrol 99.9 SigmaHexestrol 99.8 Dr.Ehrenstorfer

Sulfanamides Sulfamethoxypyridazine 99.0 Dr.EhrenstorferSulfadimethoxine 99.0 Dr.Ehrenstorfer

Chloramphenicol Chloramphenicol 99.9 Dr.EhrenstorferCoccidiostats Monensin sodium salt hydrate 86.3 Sigma-Aldrich

Diclazuril 99.0 Dr.EhrenstorferRobenidine Hydrochloride 96.8 Sigma-AldrichLasalocid A sodium salt 99.0 Dr.EhrenstorferSalinomycin Sodium Salt >12 TRC


29

ชอยามาตรฐาน ความบรสทธ ยหอColistin sulfate (salt) Purity 86.1% USPTilmicosin - USPTiamulin Purity 99.0% USPLincomycin hydrochloride Purity 93%

Potency 835 units/mgSigma

Bacitracin zinc salt Assay 71.4 units/mg SigmaVirginiamycin M1 Purity 98% SigmaTylosin tartrate Potency 929 units/mg SigmaMonensin sodium salt Purity 91% SigmaOxytetracycline dihydrate Purity >99% SigmaChlortetracycline hydrochloride Purity 77% Sigma

สารมาตรฐานเมอละลายเปน working standard สามารถเกบไดนาน 1 วน ดงนนหลงการเตรยมสารมาตรฐานควรใชทดสอบทนท


Phiriyayon, 2018

Phiriyayon, 2018 30

การทดสอบการกระจายตวอยางสม าเสมอเปนเนอเดยวกน การทดสอบการปนเปอนขาม และการทดสอบการคงสภาพ

1. การทดสอบการกระจายตวอยางสม าเสมอเปนเนอเดยวกน (Homogeneity) ใชอยางนอย 10 ตวอยาง ตองพบยาในชวง 80-120 % และมคา coefficient of variation ไมเกน 10 %2. การทดสอบการปนเปอนขาม (Carryover) สมตวอยางจาก 2 ชดการผลต carryover ไดไมเกน 5 % ส าหรบชดแรก และ 1 % ส าหรบชดทสอง(อางองตาม (ราง) ประกาศกรมปศสตว เรอง ก าหนดหลกเกณฑ วธการในการทดสอบการกระจายอยางสม าเสมอเปนเนอเดยวกนและการทดสอบการปนเปอนขามของยาในการผลตอาหารสตวทผสมยา กรณผรบใบอนญาตผลตอาหารสตวควบคมเฉพาะเพอขาย พ.ศ. ....)

3. การทดสอบการคงสภาพ (Stability test) (Health Canada, 2010)

ใชอยางนอย 2 batches เกบนาน 3 เดอน (Long-term conditions)

ทอณหภม 25°C ± 2°C / 60% ± 5% relative humidity (RH)

ทอณหภม 40°C ± 2°C / 75% ± 5% RH.

Phiriyayon, 2018 31

การตรวจสอบชนดยาเบองตนในอาหารสตว

การตรวจสอบชนดยาเบองตนในอาหารสตว โดยใชชดตรวจสอบชนดยาในอาหารสตว (Testing kits for Drugs in Feed )

พฒนามาจากวธการทใชในหองปฏบตการดวยวธ Colorimetric method

ตรวจผลโดยใชกลองจลทรรศนชนดสเตอรโอ

32Phiriyayon, 2018

หลกการเกดส

ใชทฤษฎการเกดสของสารประกอบทมโมเลกลของสารกลม Chromophoreท าปฏกรยาทางเคมกบน ายาทดสอบโดยเขาไปแทนทตรง Benzene ring ท าใหเกดสารสขน ซงสารประกอบแตละชนดจะเกดปฏกรยาทางเคมทมความจ าเพาะกบน ายาทดสอบแตละชนดและใหสารสทแตกตางกน

การตรวจสอบชนดยาเบองตนในอาหารสตว (Screening test)

ชดตรวจสอบชนดยาเบองตนในอาหารสตว สามารถตรวจชนดยา 9 ชนด ดงนสารเภสชเคมภณฑ :กลมไนโตรฟแรนส 5 ชนด คอ Furazolidone (FZD) Furaltadone (FTD) Nitrofurazone (NFZ) Nitrofurantoin (NFT) Nitrovin (Niv)

สารปฏชวนะ : Chlortetracycline (CTC) Oxytetracycline (OTC)

สารเภสชเคมภณฑชนดอน ๆ 2 ชนด คอRoxarsone (Rox)Zoalene (Zoa)

33Phiriyayon, 2018

34

วธการตรวจสอบชนดยาเบองตนในอาหารสตว (Screening test)

2

หยดน ายาทดสอบ Nitro1= 9 หยด, Nitro 2= 1 หยดหรอ Tetra = หยดประมาณ 2/3 ของถาดหลม

3

โรยตวอยางพอประมาณลงในน ายาทดสอบ

4

ตรวจผลโดยใชกลองจลทรรศนชนดสเตอรโอ

5

สมวงน าเงน (FZD) ภายใตกลองจลทรรศน

เรยงตวอยางอาหารสตว

1

Phiriyayon, 2018

Phiriyayon, 2018 35

น ายาทดสอบ

ชดตรวจสอบยาในอาหารสตว:Screen EZ Nitro test ประกอบดวย

• Nitro-1• Nitro-2

Screen EZ Tetra test ประกอบดวย• Tetra

บ. สยามอนเตอรควอลต จ ากดโทร: 02-8864701-2 โทรสาร: 02-8864703

ผลการตรวจสอบชนดยาเบองตนในอาหารสตว (Screening test)

Chlortetracycline (CTC) จดสมวง Oxytetracycline (OTC) จดสแดงเขม

36Phiriyayon, 2018

น ายาทดสอบ Screen EZ Tetra test :Tetra หยดประมาณ 2/3 ของถาดหลม


Furazolidone จดสมวง - น าเงน Furaltadone จดสน าเงน คราม Nitrofurazone จดสแดงบานเยน

Nitrofurantoin จดสเหลองและจะเปลยนเปนสมวง Nitrovin จดสฟาสด

37

น ายาทดสอบ Screen EZ Nitro test: Nitro-1= 9 หยด, Nitro-2 = 1 หยดPhiriyayon, 2018


Roxarsone จดสเหลองเขมลกษณะเปนเยอ

Zoalene จดสเขยวใบไมเขม กระจายหายเรว

38Phiriyayon, 2018

น ายาทดสอบ Screen EZ Nitro test: Nitro-1= 9 หยด, Nitro-2 = 1 หยด

Phiriyayon, 2018 39

การทดสอบหาสารปฏชวนะโดยวธเบองตนทางจลชววทยา

(Microassay)

Phiriyayon, 2018 40

การทดสอบหาสารปฏชวนะในอาหารสตวโดยวธเบองตนทางจลชววทยา

Roux flask ปนเหวยงทความเรว 3000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท

ท าการเจอจางตามล าดบเพอตรวจนบปรมาณเชอจลนทรยมาตรฐาน

เชอทใชในการทดสอบ

ขนตอนการเตรยมเพลท ขนาด Inhibition zoneขนตอนการวางตวอยาง


41Phiriyayon, 2018

เตมเชอ(1x105cfu/ml)

B.CereusATCC 11778

(WDCM 00001) เตมลงใน อาหาร AM8

K. rhizophila ATCC 9341

เตมลงในอาหาร AM11

ดดอาหารเลยงเชอแตละชนดปรมาตร 10 มล. ลงในจานเพาะเชอ

วธทดสอบ

B.subtilisATCC 6633

(WDCM 00003) เตมลงในอาหาร AM5

G. stearothermophilus ATCC 7953

เตมลงในอาหาร KD

B. bronchiseptica ATCC 4617

เตมลงในอาหาร AM10


42Phiriyayon, 2018

B.subtilisบมท 30±1oC

B.cereusบมท 30±1oC

K. rhizophila บมท 37±1oC oC

G. stearothermophilusบมท 62±1oC oC

18-24 ชวโมง

วด Inhibition Zone ขนาดมากกวา 2 มลลเมตร

วางตวอยางประมาณ 0.1 กรมลงบนอาหารเลยงเชอแตละชนด

วธทดสอบ

B. bronchiseptica บมท 35±1oC

ตวอยาง

โซนใส

Phiriyayon, 2018 43

วธหาปรมาณยา Colistin โดยวธทางจลชววทยา

• การเตรยมสารละลายมาตรฐาน Colistin

ชง Colistin standard 5,000 mcg

ใช purified water 5 ml ละลาย โดยใชเปน Stock (ซงสารนสามารถเกบไวในตเยนเปนเวลา 2 สปดาห)

น าไปท าใหมความเขมขนของสารดงน 0.64, 0.80, 1.00, 1.25, 1.56 mcg/mlดวยสารละลาย 10 % buffer solution pH 6.0

Phiriyayon, 2018 44

• การเตรยมตวอยาง

ชงตวอยาง 1.88 กรม (มความเขมขนของ Colistin 25,000 mcg) เตม purified water 100 ml ละลายใหเขากน

ปเปต 0.20 ml เตม สารละลาย 10 % buffer solution pH 6.0

ปเปต 1.0 ml เตม สารละลาย 10 % buffer solution pH 6.0


Phiriyayon, 2018 45

• วธปฏบตงาน

วาง cylinder 6 อนบน seed layer หางกน 2.5 cm./ 60 องศา โดยต าแหนง 1,2,3 เปนStandard 1.0 mcg/ml และต าแหนง4,5,6 เปนตวอยางทดสอบทความเขมขน 0.64, 0.80,1.25,1.56 mcg/ml

1 5

3

42

6

บมท 36.0 - 37.5 ˚C / 16-18 hrs. เมอครบเวลาน ามาวดขนาดเสนผานศนยกลางของ Inhibitor zone

จดท ากราฟจากผลทได โดยใหแกน X แสดงขนาดของโซนใสทวดได (mm.)และแกน Y แสดงคาความเขมขนของ Standard (mcg/ml)

วดขนาดโซนใสหาคา L และ Hโดย L = 3a + 2b+ c – e

H = 3e + 2d + c - e

5

5

อานคาความเขมขนเฉลยของตวอยางจาก standard curve (mcg/ml)


Phiriyayon, 2018 46

วธการวเคราะห ZINC BACITRACINชงตวอยาง 10 กรม + METHANOL / น า / HCL 25 มล.

เขยา 10 นาท

เตม PHOSPHATE BUFFER PH 6.5 25 มล.

เขยา 15 นาท

CENTRIFUGE เอาสวนใสมา 20 มล.

ปรบ PH ใหได 6.5

ใช 1 N. NaOH ( BROMOCRESOL PURPLE เปน INDICATOR )

EVAPORATE ใหได 4 มล. ท 35 oC

เจอจางดวยน า

U8 0.42 I.U. / มล.

ขนตอนการเตรยมการสกด

Phiriyayon, 2018 47

• วธปฏบตงาน

วาง cylinder 8 อนบน seed layer หางกน พอประมาณ และเตมสารปฏชวนะประมาณ 0.10 – 0.15 มล. *

*

บมท 30.0 ˚C / 16 – 18 hrs. เมอครบเวลาน ามาวดขนาดเสนผานศนยกลางของ Inhibitor zone

บนทกคาวดไดแตละความเขมขนบนกราฟ SEMI – LOGARITHM ซงเปนคาความเขมขน LOG ในความสมพนธของ INHIBITION ZONE

*

*

* *

*

*

การวเคราะหเสนทเหมาะสมส าหรบสารละลายต าสด ใชสตร( A ) SL = 7S1 + 4S2 + S4 – 2S8

การวเคราะหเสนทเหมาะสมส าหรบสารละลายมาตรฐานสงสด ใชสตร( B ) SH = 7S8 + 4S4 + S2 – 2S1

10

วธการวเคราะห ZINC BACITRACIN

ผลการทดสอบหาสารปฏชวนะในอาหารสตวโดยวธเบองตนทางจลชววทยา

48Phiriyayon, 2018

• Bacillus subtilis ATCC 6633 (WDCM 00003) มความไวตอยา LincomycinNitrofurantoin Erythromycin และ Tetracycline

• Bacillus cereus ATCC 11778 (WDCM 00001) มความไวตอยา Nitrofurantoin Erythromycin Tetracycline และ Monensin

• Kocuria rhizophila ATCC 9341 มความไวตอยา Lincomycin Erythromycin Tetracycline Monensin และ Bacitracin zinc salt

• Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 มความไวตอยา LincomycinNitrofurantoin Erythromycin Tetracycline Monensin และ Bacitracin zinc salt

• Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 มความไวตอยา Colistin


49Phiriyayon, 2018

Positive Control ใช Antimicrobial Susceptibility test discs วางบนเพลทอาหารเลยงเชอทดสอบ ดงน

Test PlateAntimicrobial

Susceptibility test discsTarget

Zone SizeMaximumZone Size

Bacillus subtilisATCC 6633

(WDCM 00003)

Lincomycin 10 g 20 mm 28 mmNitrofurantoin 30 g 22 mm 30 mmErythromycin 10 g 21 mm 28 mmTetracycline 10 g 20 mm 28 mm

Bacillus cereusATCC 11778

(WDCM 00001)

Nitrofurantoin 30 g 21 mm 29 mmErythromycin 10 g 20 mm 28 mmTetracycline 10 g 20 mm 28 mm

Monensin 10 g 20 mm 27 mm

50

Test Plate Antimicrobial Susceptibility test discs

Target Zone Size

MaximumZone Size

Kocuria rhizophilaATCC 9341

Lincomycin 10 g 23 mm 30 mmErythromycin 10 g 20 mm 27 mmTetracycline 10 g 22 mm 29 mm

Monensin 10 g 21 mm 30 mmBacitracin zinc salt 10 g 21 mm 28 mm

Geobacillusstearothermophilus

ATCC 7953

Lincomycin 10 g 22 mm 30 mmNitrofurantoin 30 g 21 mm 30 mmErythromycin 10 g 21 mm 28 mmTetracycline 10 g 22 mm 29 mm

Monensin 10 g 20 mm 30 mmBacitracin zinc salt 10 g 22 mm 30 mm


Positive Control ใช Antimicrobial Susceptibility test discs วางบนเพลทอาหารเลยงเชอทดสอบ ดงน

Phiriyayon, 2018

Phiriyayon, 2018 51

ผลการศกษาความเขมขนสารละลายยามาตรฐาน

ชนดยา

ขนาด Inhibitione zone (mm.)B.subtilis B.cereus K.rhizophila G.stearothermophilus S.aureus B.bronchiseptica

เจาะหลม

cup swabเจาะหลม





cup swab

Tiamulin - - - - - - 3.12 6.25 1.56 50 50 25 6.25 6.25 6.25 - - -Amoxicillin 12.5 12.5 12.5 6.2 6.2 6.2 3.12 3.12 3.12 0.78 0.78 0.78 6.2 6.2 6.2 - - -Colistin - - - - - - 6.25 6.25 6.25 - - - - - - 1.56 1.56 0.78Tylosin 3.12 3.12 1.56 100 100 100 0.78 0.78 0.78 3.12 3.12 3.12 1.56 1.56 1.56 - - -Tilmicosin 3.12 3.12 3.12 100 100 100 0.78 0.78 0.78 3.12 3.12 3.12 0.78 0.78 0.78 - - -Robenidine 25 25 25 - - - 0.78 0.78 0.78 - - - 50 50 50 - - -Nicarbazin 50 50 50 25 25 25 25 25 25 50 50 50 100 100 100 - - -Nigericin 6.25 6.25 6.25 1.57 1.57 1.57 12.5 12.5 12.5 0.78 0.78 0.78 12.5 12.5 12.5 - - -Maduramicin - - - 25 25 25 - - - 12.5 12.5 12.5 - - - - - -Monensin 50 50 50 1.57 1.57 1.57 - - - 6.25 6.25 6.25 - - - - - -Diclazuril 50 50 50 50 50 50 25 25 25 100 100 100 100 100 100 100 100 100Salinomycin 50 50 50 0.78 0.78 0.78 - - - 0.78 0.78 0.78 50 50 50 - - -Halofuginone - - - - - - 100 100 100 - - - 0.78 0.78 0.78 50 50 50

Phiriyayon, 2018 52

ผลการศกษาความเขมขนสารละลายยามาตรฐาน (ตอ)

ชนดยา

ขนาด Inhibitione zone (mm.)

B.subtilis B.cereus K.rhizophilaG.stearothermophilu

sS.aureus B.bronchiseptica

เจาะหลม






cup swab

Narasin 25 25 25 3.12 3.12 3.12 25 25 25 0.78 0.78 0.78 50 50 50 - - -Lincomycin 25 100 12.5 50 - 12.5 0.78 1.57 0.78 3.12 6.25 3.12 6.25 6.25 6.25 - - -Spiramycin 3.12 6.25 12.5 6.25 6.25 12.5 0.78 0.78 0.78 25 50 25 0.78 0.78 0.78 - - -Tetracycline 1.57 3.12 3.12 0.78 1.57 0.78 50 50 50 0.78 0.78 3.12 50 50 50 - - -Chlortetracycline 0.78 0.78 6.25 0.78 0.78 0.78 3.12 6.25 25 0.78 0.78 0.78 3.12 6.25 25 - - -Oxytetracycline 0.78 6.25 6.25 1.57 3.12 1.57 3.12 25 12.5 0.78 0.78 1.57 3.12 25 12.5 - - -

ใช Methanol ในการละลายตวอยางยามาตรฐาน ความเขมขน 100 ppm - 0.78 ppm

ชนดของยา เชอมาตรฐานทใช และชนดอาหารเลยงเชอทเหมาะสมในการทดสอบ ทางจลชววทยากบวธวเคราะหบนวนแบบวาง Cylinder cup และวธวดความขนของเชอ

Antibiotic Cylinder test Turbidmetric test

Test strain Culture medium Test strain Culture mediumSeed Culture Base layer Seed layer

Amphomycin Micrococcus luteus ATCC 14452 MediumNo.1

MediumNo.7

MediumNo.1

- -

Amphotericin B Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 MediumNo.13

MediumNo.12

MediumNo.12

- -

Ampicillin Micrococcus luteus ATCC 9341(Kocuria rhizophila ATCC 9341)

MediumNo.1

MediumNo.11

MediumNo.11

- -

Bacitracin Micrococcus luteus ATCC 10240 or Micrococcus luteus ATCC 7468 D

MediumNo.1

MediumNo.2

MediumNo.1

S. aureusATCC 10537

MediumNo.3

Carbomycin Micrococcus luteus ATCC 9341(Kocuria rhizophila ATCC 9341)

MediumNo.3

MediumNo.11

MediumNo.11

- -

Chloramphenicol Micrococcus luteus ATCC 9341(Kocuria rhizophila ATCC 9341)

MediumNo.3

MediumNo.1

MediumNo.1

- -

Cephalothin Saccharomyces cerevisiae ATCC 6538 P MediumNo.1

MediumNo.2

MediumNo.1

- -

Colistin Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 MediumNo.9

MediumNo.9

MediumNo.10

- -




Erythromycin Micrococcus luteus ATCC 9341(Kocuria rhizophila ATCC 9341)

MediumNo.3

MediumNo.11

MediumNo.11

- -

Gentamicin(Refobacin®Merck)

B. subtilis ATCC 6633 MediumNo.1

MediumNo.5

MediumNo.5

- -

Kanamycin S. aureus ATCC 6538 P MediumNo.1

MediumNo.11

MediumNo.11

S. aureusATCC 10537

MediumNo.3

Neomycin S. aureus ATCC 6538 P MediumNo.1

MediumNo.11

MediumNo.11

- -

Novobiocin S. epidermidis ATCC 12228 MediumNo.1

MediumNo.2

MediumNo.1

- -

Oleandomycin S. epidermidis ATCC 12228 MediumNo.1

MediumNo.11

MediumNo.11

- -

Paromomycin S. epidermidis ATCC 12228 MediumNo.1

MediumNo.11

MediumNo.11

KlebsiellapneumoniaeATCC 10031

MediumNo.3

Polymyxin B Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 MediumNo.9

MediumNo.9

MediumNo.10

- -




Penicillin, oxacillin, Methicillin, nafcillin

S. aureus ATCC 6538 P MediumNo.3

MediumNo.2

MediumNo.11

- -

Streptomycin, Dihydro-streptomycin

B. subtilis ATCC 6633 MediumNo.1

MediumNo.5

MediumNo.5

KlebsiellapneumoniaeATCC 10031

MediumNo.3

Tetracycline, Oxytetracycline

B. cereus ATCC 11778 MediumNo.1

MediumNo.8

MediumNo.8

S. aureusATCC 6538 P

MediumNo.3

Viomycin B. subtilis ATCC 6633 MediumNo.1

MediumNo.5

MediumNo.5

- -

Phiriyayon (2018) 56

สารมาตรฐานแบบ Sensitivity ทระดบความเขมขนต าสดทเกดโซนใส

B. smithiiIsolate 285/1

G. stearothermophilusATCC 7953

B. subtilisATCC 6633

B. cereusATCC 11778

K. rhizophilaATCC 9341

B. bronchisepticaATCC 4617

ยาปฏชวนะ Tetracycline ++++ ++++ ++++ ++++ ++ -Chlortetracycline ++++ ++++ ++++ ++++ ++ -

Oxytetracycline ++++ ++++ ++ ++++ ++ -

Tylosin ++++ ++++ +++ + +++ -

Spiramycin +++ +++ ++ ++ ++ -

Erythromycin +++ ++ + + ++ -

Tiamulin + + - - +++ -

Tilmicosin + +++ + + +++ -

Lincomycin +++ ++ ++ ++ +++ -

Colistin + - - - +++ +++

Amoxicillin +++ +++ + + + -

Bacitracin + + ++ ++ ++ -

Cefquinome sulfate + + - - + -

แบบการเกดโซนใส และการแปลผลชนดยาปฏชวนะทพบมความไว (Sensitivity) กบเชอทแยกไดกบเชอมาตรฐาน ทใชทดสอบ


สารมาตรฐาน

แบบ Sensitivity ทระดบความเขมขนต าสดทเกดโซนใส




B. cereusATCC 11778



Ceftriaxone sodium + + - - + -Ceftiofur + + - - - -

Cefotaxime sodium + + - - - -Nitrofurantoin ++++ ++++ ++++ +++ + -

Nitrofurazone ++++ +++ +++ ++ ++ -

Furaltadone ++++ ++++ ++++ ++ +++ -

Furazolidone ++++ +++ ++ ++ ++ -

ยากนบด Nigericin +++ +++ ++ +++ +++ -

Salinomycin +++ ++ ++++ + + -

Maduramicin ++ ++ - + - -

Monensin ++ ++ + + ++ -

Lasalocid + + - - - -

Diclazuril + + - - - -

แบบการเกดโซนใส และการแปลผลชนดยาปฏชวนะทพบมความไว (Sensitivity) กบเชอทแยกไดกบเชอมาตรฐาน ทใชทดสอบ (ตอ)


สารมาตรฐาน

แบบ Sensitivity ทระดบความเขมขนต าสดทเกดโซนใส




B. cereusATCC 11778



Halofuginone + + - - - -

Robenidine + - + - +++ -

Nicarbazin + + + + + -

หมายเหต + หมายถง ระดบความเขมขนทเกดโซนใส 100.0 mg/l++ หมายถง ระดบความเขมขนทเกดโซนใส 10.0 mg/l+++ หมายถง ระดบความเขมขนทเกดโซนใส 5.0 mg/l++++ หมายถง ระดบความเขมขนทเกดโซนใส 1.0 mg/l- หมายถง ไมเกดโซนใส (Inhibition zone)

แบบการเกดโซนใส และการแปลผลชนดยาปฏชวนะทพบมความไว (Sensitivity) กบเชอทแยกไดกบเชอมาตรฐาน ทใชทดสอบ (ตอ)

การตรวจวเคราะหยาและสารตองหามในอาหารสตวโดยใชเครองมอชนสง

59

ยากลม Tetracycline สารตองหามกลม Nitrofurans ยากลม Macrolides ยากลม Sulfonamides ยากลม Fluoroquinolones ยากนบด (Anticoccidial drugs) สารตองหาม Chloramphenicol Colistin ยากลม Beta lactams เชน Amoxicillin,

Penicillin G, Ceftiofur

ยาทอยระหวางการพฒนาวธ Beta lactam เพมเตม

กลม Penicilllins เชน Ampicillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Nafcillin, Oxacillin เปนตน

Phiriyayon, 2018

เครองมอชนสงทใชในการตรวจวเคราะหยาและสารตองหามในอาหารสตว

60Phiriyayon, 2018

LC-HRMS/MSLC-MS/MS

HPLCGC-MS/MS

61

ยากลม Tetracyclines• Chlortetracycline• Oxytetracycline• Doxycycline

สารตองหามกลมNitrofurans• Nitrofurazone• Furazolidone• Furaltadone• Nitrofurantoin

ยากลม Macrolides• Tylosin• Tilmicosin• Erythromycin

ยากลม Sulfonamides• Sulfamethazine• Sulfadimethoxine

ยากลม Fluoroquinolones• Ciprofloxacin • Cinoxacin• Danofloxacin• Difloxacin• Enoxacin• Enrofloxacin• Flumequine• Marbofloxacin• Norfloxacin• Nalidixic acid• Orbifloxacin• Oxolinic acid• Sarafloxacin• Maloxacin• Ofloxacin

ยากนบด• Decoquinate• Diclazuril• Halofuginone• Lasalocid• Maduramicin• Monensin• Narasin• Nicarbazin• Nigericin• Robinidine• Salinomycin• Toltrazuril

Phiriyayon, 2018

ยากลม Polymycins• Colistin

ยากลม Beta-lactams• Amoxicillin• Penicillin G• Ceftiofur

Antibiotic

Chlortetracycline, Oxytetracycline, Doxycycline

Screening method>>> Colorimetric method

Determination and Confirmation method>>> HPLC

การวเคราะหยากลม Tetracyclines ในอาหารสตว

62Phiriyayon, 2018

63

Sample 10 g

Extraction 0.1 M HCL in MeOH 50 ml, Shake 30 min,Centrifuge 5 min, 3,500 rpm, Dilute with H2O (1:1)

Clean up with SPE (SCX) (Condition with MeOH and H2O,Wash with 0.05 M HCl in MeOH , Elute with 0.4 M HCl in MeOH)

Adjust volume, Inject 30 µl to HPLC(C8, 4.6×250 mm, 5 µm, 0.5 ml/min, 30 min, UV 365 nm)

Reference: In house method base on Journal of Chromatography A Vol.1088, (2005) P169-174

วธวเคราะหยากลม Tetracyclines ในอาหารสตว (Carry over)

Phiriyayon, 2018

64

Sample 2 g

Extraction 0.1 M HCL in MeOH 100 ml, Shake 30 min,Centrifuge 5 min, 3,500 rpm, Dilute with H2O (1:1)

Clean up with SPE (SCX) (Condition with MeOH and H2O,Wash with 0.05 M HCl in MeOH , Elute with 0.4 M HCl in MeOH)

Adjust volume, Inject 30 µl to HPLC(C8, 4.6×250 mm, 5 µm, 0.5 ml/min, 30 min, UV 365 nm)

Reference: In house method base on Journal of Chromatography A Vol.1088, (2005) P169-174

วธวเคราะหยากลม Tetracyclines ในอาหารสตว (Medicated feed)

Phiriyayon, 2018

Reference: modify from ISO 14797-19991(F)P1-13

วธวเคราะหสารตองหามกลม Nitrofurans ในอาหารสตว

65

Sample 10 g

Extraction with H2O : ACN , Shake 30 min, Centrifuge 5 min at 3,500 rpm

Clean up with SPE (Alumina column), Evaporate (remain approx. 5 ml )

Liquid-Liquid Extraction (LLE) with Hexane discard fat layer, LLE with Ethyl acetate collect clear layer

Evaporate (dry), Add 0.1 % Formic acid , inject 20 µL to LC- MS/MS(Inertsil C18, 5 µm, 2.1×150 mm, 0.2 ml/min, 16 min, solventA=0.1% Formic aid, solvent B Acetonitrile)

Phiriyayon, 2018

Reference: modify from ISO 14797-19991(F)P1-13

วธวเคราะหสารตองหาม Chloramphenicol ในอาหารสตว

66

Sample 10 g

Extraction with H2O : ACN , Shake 30 min, Centrifuge 5 min, 3,500 rpm

Clean up with SPE (Alumina column), Evaporate (remain approx. 5 ml )

Evaporate (dry), Add 0.01 M Ammonium acetate, inject 20 µl to LC- MS/MS (C18, 0.2 ml/min, 15 min)

LLE with Hexane discard fat layer, LLE with Ethyl acetate collect clear layer

Phiriyayon, 2018

ล าดบ รายการ ขอบขาย วธวเคราะห ระยะเวลาทใช(วน)

จ านวน ต.ย./ครง

LOD/LOQ

1 Screening test ชนดยา-Nitrofurazone-Nitrofurantoin-Furazolidone-Furaltadone-Nitrovin-Zoalene-Roxarzone-Chlortetracycline-Oxytetracycline-Carbadox

อาหารสตวอาหารเสรมสารผสมลวงหนานมและผลตภณฑนม ส าหรบสตว In house method

Based on AOAC (1980)

In house method based on Feed Additive Compendium, 1985

1 15010/- (mg/kg)

------

10/- (mg/kg)--

2 หาสารปฏชวนะโดยวธเบองตนทางจลชววทยา(Inhibitory microbiological assay)

วตถดบอาหารสตวอาหารสตวผสมส าเรจรป- อาหารสตวผสมส าเรจรป- ไกฟารมมาตรฐาน (a)- อาหารสตวผสมส าเรจรปอนๆ

In house method based on Microbiological assay technique

2 35 -

ประสทธภาพการตรวจวเคราะหยาและสารตองหามในอาหารสตว ป 2562



LOD/LOQ

3 Beta-agonists- Salbutamol- Clenbuterol- Ractopamine

อาหารสตว

อาหารสตว- อาหารสกร (a)- อาหารสตว อนๆ

- ELISA (Sal, Clen, Rac):Document of ELISA test kit- LC-MS/MS (Sal,Clen,Rac):In house method - based on Anal Chemica Acta 483(2003) p.137-145

2

3-5

30

10

ELISA Salbutamol =3/10 (µg/kg)Clenbuterol =3/10 (µg/kg)Ractopamine =4/10 (µg/kg)LC-MS/MSSalbutamol =0.02/0.05 (mg/kg)Clenbuterol =0.02/0.05 (mg/kg)Ractopamine =0.02/0.05 (mg/kg)

4 Nitrofurans- Nitrofurazone- Furazolidone- Furaltadone- Nitrofurantoin

อาหารสตว -LC-MS/MS : In house method based on Journal of Chromatography A, 1997, Vol.771, p.349-354)

3-5 10Nitrofurazone =50/100 (µg/kg)Furazolidone =50/100 (µg/kg)Furaltadone =30/50 (µg/kg)Nitrofurantoin =50/100 (µg/kg)

5 Chloramphenicol อาหารสตว - CHARM II :Document of CHARM II test kit- LC-MS/MS : In house method base on Anal.Chim.acta 483, 2003, p.125-135

2

3-5

10

10

CHARM II =5/16 (µg/kg)

LC-MS/MS =0.02/0.06 (mg/kg)




LOD/LOQ(mg/kg)

6 Nitroimidazoles- Dimetridazole- Ronidazole- Metronidazole

อาหารสตว- อาหารสกร (a)- อาหารสตวอน ๆ

-LC-MSMS : In house method based on CHEMIJA Vol.18 (2007) p.30-34 and Journal of Chromatography A Vol.882 (2000) p.89-98

3-5 10 0.02/0.05

7 Macrolides- Tylosin- Tilmicosin- Erythromycin

อาหารสตว - CHARM II : Document of CHARM II test kit- LC-MS/MS : In house method based on Anal.Chim.acta 492, 2003, p.187-197

2

3-5

10

10

CHARM II =2/7 LC-MS/MS =0.02/0.05

8 Tiamulin อาหารสตว - LC-MS/MS : In house method based on Anal.Chim.acta 492, 2003, p.187-197

3-5 10 0.02/0.05

9 Lincomycin อาหารสตว - LC-MS/MS : In house method based on Anal.Chim.acta 492, 2003, p.187-197

3-5 10 0.02/0.05

10 Olaquindox อาหารสตว- อาหารสกร (a)- อาหารสตวอน ๆ

-LC-MS/MS : In house method based on CHEMIJA Vol.18 (2007) p.30-34 and Journal of Chromatography A Vol.882 (2000) p.89-98

3-5 100.02/0.05

11 Sulfonamides- Sulfamethazine

-Sulfadimethoxine

อาหารสตว -LC-MS/MS : In house method base on J.AOAC,Vol 85, No.1, 2002, p.20-24

3-5 10 CHARM II = 0.2/0.6 LC-MS/MS =0.009/0.03




LOD/LOQ(mg/kg)

12 Carbadox อาหารสตว- อาหารสกร (a)- อาหารสตวอน ๆ

-LC-MS/MS : In house method based on Animal feeding stuffs, ISO 14939-2001, p.1-15

3-5 10 0.012/0.040

13 Fluoroquinolones-Ciprofloxacin -Cinoxacin-Danofloxacin-Difloxacin- Enoxacin-Enrofloxacin-Flumequine-Marbofloxacin-Norfloxacin-Nalidixic acid-Orbifloxacin-Oxolinic acid-Sarafloxacin-Maloxacin-Ofloxacin

อาหารสตว -LC-MS/MS : In house method based on Anal Chim.acta483(2003) p.81-89

3-5 10 0.015/0.05




LOD/LOQ(mg/kg)

14 Tetracyclines- Chlortetracycline- Oxytetracycline- Doxycycline

อาหารสตว (a) -HPLC: In house method based on Journal of Chromatography A, Volume1088, Issue 1-2, 2005 p.169-174

3-5 100.3/1.00.5/1.0 0.5/1.0

15 Anticoccidial substance-Decoquinate-Diclazuril-Halofuginone-Lasalocid-Maduramicin-Monensin-Narasin-Nicarbazin-Nigericin-Robinidine-Salinomycin-Toltrazuril

อาหารสตววตถดบอาหารสตว

-LC-MS/MS : In house method - based on Journal of Chromatography B 813,2004 p.181-189

3-7 10-/--/--/--/-

0.03/0.05-/--/-

0.01/0.020.03/0.05

-/-0.03/0.05

-/-




LOD/LOQ(mg/kg)

16 Polymyxins-Colistin


- ELISA : Document of ELISA test kit- LC-MS/MS :In house method - based on Journal of Chromatography B 878 (2010) p.2831-2838)

2

3-5

30

10

0.05/-

-/-

17 Beta-lactams-Amoxicillin-Penicillin G-Ceftiofur


- CHARM II : Document of CHARM II test kit)- LC-MS/MS : In house method – base on Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 85, 2013, p.169-178

2

3-5

12

10

0.50/-

0.05/0.08


73Phiriyayon, 2018

การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบ

รายการ ชนดวตถดบ

Method validation Uncertainty

Linearity range ของ

Calibration curve

Working/Linearity

range ของวธทดสอบ

LOD LOQ Accuracy%Recovery

Precision (Repeatability)

%RSD

Precision (reproducibility)

%RSD

OTC อาหารไก

R2 = 0.9999(0.1 – 40 µg/ml)

R2 = 0.9981(1 – 300 mg/kg

0.3 mg/kg

1 mg/kg

82.45-102.83%

(1 - 300 mg/kg)

1.33 - 4.59%(1 - 300 mg/kg)

1.93-11.55 %(1 - 300 mg/kg)

1.05 ± 0.39 mg/kg

ทระดบความเชอมน 95%

CTC R2 = 0.9999(0.1 – 40 µg/ml)

R2 = 0.9997(1 – 300 mg/kg)

0.5 mg/kg

1 mg/kg

82.08 -102.91%

(1 - 300 mg/kg)

1.64 - 3.76 %(1 - 300 mg/kg)

2.07-12.50%(1 - 300 mg/kg)

DXC R2 = 0.9994(0.1 – 40 µg/ml)

R2 = 0.9985(1 – 300 mg/kg)

0.5 mg/kg

1 mg/kg

83.39-103.61%

(1 - 300 mg/kg)

1.67- 5.31%(1 - 300 mg/kg)

1.74-12.04%(1 - 300 mg/kg)

การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบ สารกลม Tetracycline ในอาหารไกโดยวธ HPLC

74Phiriyayon, 2018


การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบ สารกลม Tetracyclines ในอาหารสกรโดยวธ HPLC




Calibration curve

Working/Linearity




%RSD

Precision (Reproducibility)

%RSD

OTC อาหารสกร

R2 = 1(0.1 – 40 µg/ml)

R2 = 0.9986(1 – 300 mg/kg)

0.3 mg/kg

1 mg/kg

86.23-96.81 % (1 - 300 mg/kg)

1.26-3.92 %(1 - 300 mg/kg)

2.69-6.76%(1 - 300 mg/kg)

1.05 ± 0.39 mg/kg

ทระดบความเชอมน 95% CTC R2 = 0.9995

(0.1 – 40 µg/ml)

R2 = 0.9998(1 – 300 mg/kg)

0.5 mg/kg

1 mg/kg

100.15-107.97%

(1 - 300 mg/kg)

1.07-3.16 %(1 - 300 mg/kg)

3.22-8.67 %(1 - 300 mg/kg)

DXC R2 = 0.9998(0.1 – 40 µg/ml)

R2 = 0.9994(1 – 300 mg/kg)

0.5 mg/kg

1 mg/kg

95.68-103.78 %(1 - 300 mg/kg)

1.87-4.36 %(1 - 300 mg/kg)

3.27-7.72%(1 - 300 mg/kg)

75Phiriyayon, 2018


การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบ สารกลม Beta agonists ในอาหารสตวโดยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry


Method validation


Calibration curve

Working/Linearity range ของวธทดสอบ



%RSD


%RSD

Uncertainty

Salbutamol อาหารสตว - R2 = 0.9976(0.05-1.00 mg

/kg)

0.02 mg/k

g

0.05 mg/kg

95.33-101.86 %

0.87-2.83 % 0.52-4.21 % 0.73 ± 0.11 mg/kg ทระดบความเชอมน

95 %

Clenbuterol - R2 = 9994(0.05-1.00 mg

/kg)

0.02 mg/k

g

0.05 mg/kg

96.48-103.44 %

0.84-1.74 % 0.79-3.93 % 0.77 ± 0.10mg/kg ทระดบความเชอมน 95 %

Ractopamine - R2 = 0.9983 (0.05-1.00 mg

/kg)

0.02 mg/k

g

0.05 mg/kg

94.11-104.28 %

0.55-2.08 % 1.05-2.21% 0.72 ± 0.10mg/kg ทระดบความเชอมน 95 %

76Phiriyayon, 2018


การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบสาร Carbadox ในอาหารสตวโดยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometryรายการ ชนด

วตถดบMethod validation Uncertainty


Calibration curve

Working/Linearity




%RSD

Precision (Reproducibilit

y)%RSD

Carbadox อาหารสตว - R2 = 0.9980 (40-1,000 µg

/kg)

12 µg/kg

40 µg/kg

81.19 - 94.78 % 2.24 - 6.40 % 3.88 - 8.16 % 0.49 ± 0.13mg/kg ทระดบความเชอมน95 %

77Phiriyayon, 2018





Calibration curve

Working/Linearity




%RSD


%RSD

Dimetridazole


- R2 = 0.9980(0.05-1.00

mg/ml)

0.020 mg/kg

0.050 mg/kg

72-101% 3.33-9.01% 5.73-13.18 % 1.87 ± 0.41 mg/kg


Metronidazole

- R2 = 0.9966(0.05-1.00

mg/ml)

0.020 mg/kg

0.050 mg/kg

72-103% 2.29-9.87% 2.66-7.51% 1.86 ± 0.34 mg/kg


Ronidazole

- R2 = 0.9979(0.05-1.00

mg/ml)

0.020 mg/kg

0.050 mg/kg

78-101 % 3.10-9.65% 3.54-11.21% 1.97 ± 0.42 mg/kg


การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบ สารกลม Nitroimidazoles และ Olaquindox ในอาหารสตว โดยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry

78Phiriyayon, 2018





Calibration curve

Working/Linearity




%RSD


%RSD

Olaquindox


- R2 = 0.9995(0.05-1.00

mg/ml)

0.020 mg/kg

0.050 mg/kg

76-108% 2.20-11.52% 3.49-12.00 % 2.00 ± 0.35 mg/kg


การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบ Olaquindox ในอาหารสตว โดยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry

Phiriyayon, 2018 79

การควบคมคณภาพภายในผลการทดสอบรายการทดสอบ รายการควบคมคณภาพภายใน ความถ

Beta Agonists - Salbutamol- Clenbuterol- Ractopaminein Feed (swine)

1. ทดสอบ Positive control (Spike sample ท 0.10 mg/kg)1.1 %Recovery เกณฑการยอมรบ : อยในชวง 80-110%1.2 %RPD เกณฑการยอมรบ : ไมเกน 15%

2. ทดสอบ Negative Control2.1 Reagent Blank เกณฑการยอมรบ : ไมพบ2.2 Sample Blank เกณฑการยอมรบ : ไมพบ หรอพบนอยกวา LOD

3. ท า Duplicate3.1 กรณตวอยางทดสอบไมผานการทดสอบดวยวธคดกรองมากอน3.2 กรณตวอยางทดสอบผานการทดสอบดวยวธคดกรองมากอน 3.3 %RPD เมอตวอยางมความเขมขนอยในชวง 0.05 ถง 0.10 mg/kg

เกณฑการยอมรบ : ไมเกน 30%3.4 %RPD เมอตวอยางมความเขมขนอยในชวง 0.10 ถง 2.00mg/kg

เกณฑการยอมรบ : ไมเกน 20%4. ท า Control Chart เกณฑการยอมรบ : อยในชวง LCL ถง UCL

- 2 ตวอยาง/ชดการทดสอบ

- 1 ตวอยาง/ชดการทดสอบ- 1 ตวอยาง/ชดการทดสอบ

- ทกๆ 10 ตวอยาง- ทกตวอยาง

- ทกชดการทดสอบ- ทกครงกอนการทดสอบ

Phiriyayon, 2018 80

การควบคมคณภาพภายในผลการทดสอบ

รายการทดสอบ รายการควบคมคณภาพภายใน ความถ

Beta Agonists - Salbutamol- Clenbuterol- Ractopaminein Feed (swine)

5. ตรวจสอบประสทธภาพเครอง LC-MS/MS กอนการใชงาน (System Suitability)

5.1 %RPD of peak area เกณฑการยอมรบ : นอยกวา 2.55.2 %RPD of RT เกณฑการยอมรบ : นอยกวา 1

6. ทดสอบ Peak area drift ของสารละลายมาตรฐาน เกณฑการยอมรบ : ไมเกน ±30%

7. Standard calibration curve เกณฑการยอมรบ : R2 ไมนอยกวา 0.9958. เฝาระวงทระดบคา LOD และ LOQ

8.1 LOQ พจารณาคา % Recovery และ % RSDเกณฑการยอมรบ : % Recovery = 70-125 และ % RSD ไมเกน 15%8.2 LOD พจารณา คา S/N และ %lon ratioเกณฑการยอมรบ : ไมนอยกวา 3 และ %lon ratio พจารณาตามเกณฑ (European commission decision 2002/657/EC)

- ทกชดการทดสอบ- ทกชดการทดสอบ- ทก 6 เดอน

Phiriyayon, 2018 81


Tetracycline - Chlortetracycline- Oxytetracycline- Doxycyclinein Feed

1. ทดสอบ Positive control (Spike sample ท 1.00 mg/kg)1.1 %Recovery เกณฑการยอมรบ : อยในชวง 80-110%1.2 %RPD เกณฑการยอมรบ : ไมเกน 11%


3. ท า Duplicate เกณฑการยอมรบ : %RPD ไมเกน 20%4. ท า Control Chart เกณฑการยอมรบ : อยในชวง LCL ถง UCL5. ตรวจสอบประสทธภาพเครอง LC-MS/MS กอนการใชงาน(System Suitability)


6. ทดสอบ Peak area drift ของสารละลายมาตรฐาน เกณฑการยอมรบ : ไมเกน ±10%7. Standard calibration curve เกณฑการยอมรบ : R2 ไมนอยกวา 0.9958. เฝาระวงทระดบคา LOD พจารณา คา S/N เกณฑการยอมรบ : ไมนอยกวา 3


- 1 ตวอยาง/ชดการทดสอบ- 1 ตวอยาง/ชดการทดสอบ- ทกตวอยาง- ทกชดการทดสอบ- ทกครงกอนการทดสอบ

- ทกชดการทดสอบ

- ทกชดการทดสอบ- ทก 6 เดอน


Phiriyayon, 2018 82


Carbadox(swine feed)

1. ทดสอบ Positive control (Spike sample ทระดบ LOQ)1.1 %Recovery เกณฑการยอมรบ : อยในชวง 60-115%1.2 %RPD เกณฑการยอมรบ : ไมเกน 15%


3. ท า Duplicate 3.1 %RPD เมอตวอยางมความเขมขนอยในชวง 0.04 ถง 0.10 mg/kg

เกณฑการยอมรบ : %RPD ไมเกน 30%3.2 %RPD เมอตวอยางมความเขมขนอยในชวง >0.10 ถง 20.00 mg/kg

เกณฑการยอมรบ : %RPD ไมเกน 20%4. ท า Control Chart เกณฑการยอมรบ : อยในชวง LCL ถง UCL5. ตรวจสอบประสทธภาพเครอง LC-MS/MS กอนการใชงาน(System Suitability)


6. ทดสอบ Peak area drift ของสารละลายมาตรฐาน เกณฑการยอมรบ : ไมเกน ±30%7. Standard calibration curve เกณฑการยอมรบ : R2 ไมนอยกวา 0.9958. เฝาระวงทระดบคา LOD พจารณา คา S/N เกณฑการยอมรบ : ไมนอยกวา 3 และ %lon ratio พจารณาตามเกณฑ (European commission decision 2002/657/EC)


- 1 ตวอยาง/ชดการทดสอบ- 1 ตวอยาง/ชดการทดสอบ- ทก 10 ตวอยาง




Phiriyayon, 2018 83


Nitroimidazoles(swine feed)-Dimetridazole-Metronidazole-RonidazoleOlaquindox(swine feed)

1.ทดสอบ Positive control (Spike sample ทระดบ LOQ)1.1 %Recovery เกณฑการยอมรบ : อยในชวง 60-115%1.2 %RPD เกณฑการยอมรบ : ไมเกน 15%

2.ทดสอบ Negative Control2.1 Reagent Blank เกณฑการยอมรบ : ไมพบ2.2 Sample Blank เกณฑการยอมรบ : ไมพบ หรอ พบนอยกวา LOD

3.ท า Duplicate 3.1 %RPD เมอตวอยางมความเขมขนอยในชวง 0.05 ถง 0.10 mg/kg

เกณฑการยอมรบ : %RPD ไมเกน 30%3.2 %RPD เมอตวอยางมความเขมขนอยในชวง >0.10 ถง 2.00 mg/kg

เกณฑการยอมรบ : %RPD ไมเกน 20%4.ท า Control Chart เกณฑการยอมรบ : อยในชวง LCL ถง UCL5. ตรวจสอบประสทธภาพเครอง LC-MS/MS กอนการใชงาน(System Suitability)


6.ทดสอบ Peak area drift ของสารละลายมาตรฐาน เกณฑการยอมรบ : ไมเกน ±30%7.Standard calibration curve เกณฑการยอมรบ : R2 ไมนอยกวา 0.9958.เฝาระวงทระดบคา LOD พจารณา คา S/N เกณฑการยอมรบ : ไมนอยกวา 3 และ %lonratio พจารณาตามเกณฑ (European commission decision 2002/657/EC)


- 1 ตวอยาง/ชดการทดสอบ- 1 ตวอยาง/ชดการทดสอบ- ทก 10 ตวอยาง




หองปฏบตการทดสอบและสอบเทยบตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2017

ขอก าหนดทวไปวาดวยความสามารถของหองปฏบตการทดสอบ

และหองปฏบตการสอบเทยบ ISO/IEC17025:2017

1. Scope

2. Normative references

3. Terms and definitions

4. General requirement

5. Structural requirements

6. Resource requirements

7. Process requirements

8. Management system requirements

Phiriyayon, 2018

ISO 17025:2017 ISO 17025:2005

5. Structural requirements (ขอก าหนดดานโครงสราง)

5.1 Legal, responsible (หองปฏบตการตองเปนนตบคคลหรอเปนสวนหนงทระบไวของนตบคคลทรบผดชอบกจกรรมหองปฏบตการของตน)

4.1.1

5.2 Management responsibility (หองปฏบตการตองก าหนดผบรหารทรบผดชอบโดยรวมของหองปฏบตการ)

4.1.5(h)

5.3 Range of activities (หองปฏบตการตองก าหนดและท าเอกสารชวงของกจกรรมตางๆของหองปฏบตการทตองสอดคลองกบเอกสาร ISO ฉบบน)

4.2.1, et al

5.4 Lab activities meet the requirements of the standard & stakeholders and applied at all work location (กจกรรมตางๆของหองปฏบตการตองด าเนนการเพอใหเปนไปตามขอก าหนดของเอกสาร ISO ฉบบน ลกคาหองปฏบตการ หนวยงานก ากบดแลและองคกรทใหการยอมรบ รวมถงกจกรรมตางๆของหองปฏบตการทท าในสงอ านวยความสะดวกแบบถาวรทงหมด (ในสถานทตง) ในทหางไกลจากสถานทตง ในสถานทชวคราวหรอเคลอนท หรอทสถานทของลกคา)

4.1.2, 4.1.3

ตารางเปรยบเทยบขอก าหนด ISO17025:2017 และ 2005

Dusadee, 2018Phiriyayon, 2018


ISO 17025:2017 ISO 17025:2005

5. Structural requirements (ขอก าหนดดานโครงสราง)

5.5 Define structure: specify responsibilities and authorities; document procedures for consistency (ก าหนดโครงสรางองคกรและการจดการหองปฏบตการ ระบความรบผดชอบ และจดท าเอกสารขนตอนตางๆในขอบเขตทจ าเปน)

4.1.5(e)(f), 4.2.1

5.6 Personnel follow PDCA to carry out duties 4.1.5(a)(l), 4.2.2(e), 4.2.3

5.7 Integrity & communication of MS (มการสอสารเกยวกบประสทธผลของระบบการบรหารงานและสอสารเกยวกบความส าคญของการตอบสนองความตองการของลกคาและความตองการตางๆ ทนอกเหนอจากความตองการของลกคา)

4.2.7, 4.1.6, 4.2.4

Phiriyayon, 2018

ISO 17025:2017 ISO 17025:2005

6. Resource requirements (ขอก าหนดดานทรพยากร)

6.1 General (ทวไป)

6.2 Personnel (บคลากร) 4.1.5(d)(g)(k), 4.2.1, 4.2.4, 4.3.1, 5.2, 5.4.3, 5.5.2

6.3 Facilities and environmental conditions(สถานทและสภาพแวดลอม)

4.1.3, 5.3.1, 5.3.2, 5.3.4, 5.4.7.2 (c)

6.4 Equipment (อปกรณ) 5.4.1, 5.4.7.2(a), 5.5, 5.6.1, 5.6.2.2.1, 5.6.3

6.5 Metrological traceability (การตรวจสอบยอนกลบทางมาตรวทยา)

(5.6)

6.6 Externally provided products and services(ผลตภณฑและบรการจากภายนอก)

(4.6)


Phiriyayon, 2018

ISO 17025:2017 ISO 17025:2005

7. Process requirements (ขอก าหนดดานกระบวนการ)

7.1 Review of requests, tenders and contracts (การทบทวนค าขอ การประมลและขอสญญา)

4.4, 4.5.2, 5.4.2

7.2 Selection, verification and validation of methods (การคดเลอก การทวนสอบและการตรวจสอบความถกตองของวธ)

5.4

7.3 Sampling (การชกตวอยาง) 5.7

7.4 Handling of test or calibration items (การจดการตวอยางทดสอบหรอสอบเทยบ)

5.8

7.5 Technical records (บนทกทางดานวชาการ) 4.13

7.6 Evaluation of measurement uncertainty (การประเมนความไมแนนอนของการวด)

5.4.6

7.7 Ensuring the validity of results (ความมนใจในความถกตองของผลตางๆ) 5.9, 5.6.3

7.8 Reporting of results (การรายงานผล) 5.10, 5.4.7.1, 5.6.2.1.1, 4.13



ISO 17025:2017 ISO 17025:2005

7.9 Complaints (ขอรองเรยน) 4.8

7.10 Nonconforming work (งานทไมเปนไปตามขอก าหนด) 4.9

7.11 Control of data and information management (การควบคมขอมลและการจดการขอมล)

4.13, 5.4.7



ISO 17025:2017 ISO 17025:2005

8. Management system requirements (ขอก าหนดของระบบการจดการ)

8.1 Options (ขอเสนอทางเลอก)

8.1.1 General (ทวไป)8.1.2 Option A (ทางเลอก ก) ระบบการบรหารงานของหองปฏบตการตองมการระบถงสงตอไปน- เอกสารระบบการบรหารงาน- การควบคมเอกสารระบบการบรหารงาน- การควบคมบนทก- การปฏบตการในการระบความเสยงและโอกาส- การปรบปรง- การปฏบตการแกไข- การตรวจตดตามคณภาพภายใน- การทบทวนการบรหารงาน

8.1.3 Option B (ทางเลอก ข)หองปฏบตการทมการจดท าและรกษาระบบการบรหารงานตามขอก าหนดของ ISO 9001 และมความสามารถในการสนบสนนและแสดงใหเหนถงการปฏบตตามขอก าหนดขอ 4 ถงขอ 7 อยางสม าเสมอ จะถอวามความครบถวนนอยทสดของขอก าหนดระบบการบรหารงานตามทระบไวในขอ 8.2 ถง 8.9

New

New

8.2 Management system documentation (Option A) (เอกสารขอมลระบบการจดการ(ทางเลอก ก))

4.2




ISO 17025:2017 ISO 17025:2005

8. Management system requirements (ขอก าหนดของระบบการจดการ)

8.3 Control of management system documents (Option A) (การควบคมเอกสารระบบการจดการ (ทางเลอก ก))

4.3

8.4 Control of records (Option A) (การควบคมบนทก (ทางเลอก ก)) 4.13

8.5 Actions to address risks and opportunities (Option A) (การปฏบตในการจดการความเสยงและโอกาส (ทางเลอก ก))

New

8.6 Improvement (Option A) (การปรบปรง (ทางเลอก ก)) 4.10

8.7 Corrective action (Option A) (การปฏบตการแกไข (ทางเลอก ก)) 4.11

8.8 Internal audits (Option A) (การตรวจตดตามคณภาพภายใน (ทางเลอก ก)) 4.14

8.9 Management reviews (Option A) (การทบทวนการบรหารงาน (ทางเลอก ก)) 4.15

Phiriyayon, 2018

Phiriyayon, 2018 92

สงทส าคญกบการทดสอบ

บคลากร

วธทดสอบ สอบเทยบฯ

สถานทและสภาวะแวดลอม

เครองมอความสอบกลบไดของการวด

การประกนคณภาพฯ

Phiriyayon, 2018 93

การประกนคณภาพการทดสอบ (Quality assurance)

Laboratory

Instrument (calibration)

Instrument (maintenance)

Audit & Review

Persons (training)

Phiriyayon, 2018 94

การควบคมคณภาพการทดสอบ

Internal Quality Control

• ตรวจสอบประสทธภาพของเครองมอ

• ทดสอบตวอยางควบคม (Quality Control sample, QC sample)

External Quality Control

• การทดสอบความช านาญ (Proficiency Testing, PT)

• การเปรยบเทยบผลวเคราะหระหวางหองปฏบตการ (Inter-laboratory comparison)

Quality Control

Internal Quality Control

External Quality Control

Phiriyayon, 2018 95

เพมความเชอมนในผลวเคราะห ทดสอบ

ชใหเหนถงปญหา น ามาซงการปรบปรงและแกไข

เปนไปตามขอก าหนดของมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2005

ความส าคญของการควบคมคณภาพการทดสอบ

96Phiriyayon, 2018

Acceptable Recovery Limits

Concentration Recovery Limits (%)100% 98-10110% 95-1021% 92-1050.1% 90-1080.01% 85-11010 µg/g (ppm) 80-1151 µg/g (ppm) 75-12010 µg/kg (ppb) 70-125

ทมา: AOAC “International Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods”

97Phiriyayon, 2018

Analytical Variations (AV) in [%]; x= analyte concentration

Analyte AV%Moisture (Dry Mass) 12Protein 20/x+2Fat 10Crude Fibre 30/x+6Ash 45/x+3Total sugars as invert 12Calcium 10Phosphorus 3/x+8Salt 7/x+5Vitamin A 30ทมา: Association of American Control Officials 2011, Official Publication 2011, page 298-299.

Phiriyayon, 2018 98

ปจจยทมผลตอการวเคราะหยา1. ตวอยางตองมความเปนเนอเดยวกน2. การเกบตวอยางตองไมกอใหเกดการปนเปอนขามกน3. ตวอยางตองเกบไวทอณหภมเหมาะสม ไมถกแสงและไมอบชน 4. ประวตตวอยางทผสมยาควรมการระบใหชดเจน หากเปน medicated feeds และควรมใบสงแพทยก ากบมาพรอมใบสงตวอยาง หากเปนไปได5. ระมดระวงเรองการสลบตวอยาง

รายการวเคราะห วธการเกบตวอยาง1. ดานจลชววทยา เชน เชอซลโมเนลลา ปรมาณแบคทเรยและปรมาณเชอรา

ตวอยางตองเกบแบบเทคนคปลอดเชอ แลวหอดวยถงกระดาษทบแสงอก 1 ชน ใชถงพลาสตกใหมและตองฆาเชอทภาชนะและมอของผปฏบตงานดวย Alcohol 70% และภาชนะตองไมมรอยทะลใหอากาศภายนอกเขาสมผสได หากเปนไปไดควรเกบแยกถงเพมขนอก 1 ตวอยาง หากตองวเคราะหรวมกบรายการอน

2. วตามน ยา ตองท าการเกบตวอยางโดยระมดระวงการปนเปอนขามระหวางตวอยาง และตองใชถงพลาสตกใหม และหอดวยถงกระดาษทบแสง อก1 ชน เพอปองกนแสงทท าใหยาและวตามนเสอมคณภาพได

3. สารพษจากเชอรา การเกบตวอยางเขาหองปฏบตการตองไมนอยกวา 500 กรม โดยตองสมตวอยาง ใหกระจายเปนตวแทนอยางทวถง และน ามาคลกเคลาใหเขากนด แบงเปน 3 สวน เพอจะไดผลวเคราะหทเปนตวแทนตวอยางทงหมด หากตวอยางนอยกวา 500 กรม จะไมเพยงพอในการวเคราะหและการตรวจจนไดคาปรมาณหากเกดตรวจพบ เพราะตองท าการตรวจเบองตนและหาปรมาณดวยเครอง HPLC

4. รายการวเคราะหในกจกรรมรองเรยน ด าเนนคด ยด อายด ยนยนผลดานปรมาณ หรอทดสอบประสทธภาพการวเคราะหทกรายการ

ใหแยกเรองแยกกจกรรมและเขยนในหนงสอตนเรองใหชดเจนวาตองการใหวเคราะหในรายการอะไร และไมควรรวมไวกบเรองการเกบตวอยางสมตรวจตามปกต เพราะจะท าใหเรองมจ านวนตวอยางมากและวเคราะหหลายรายการท าใหการตอบผลตองรอกน ท าใหลาชาได

หมายเหต ตวอยางอาหารสตวทกชนดตองเกบในทมด หามถกแสงและความรอนและความชน เพราะจะท าใหคาปรมาณสารเปลยนแปลงและเสอมลงไดหากมตเยนควรเกบทอณหภม 4 oC จะเกบไดนานขน ยกเวน ตวอยาง Aflatoxin ควรเกบทอณหภม -20 oC

มาตรฐานการเกบตวอยางอาหารสตวดวยเทคนคพเศษส าหรบสงตรวจรายการวเคราะหทจ าเพาะ

99Phiriyayon, 2018

1. การไดรบการรบรองความสามารถหองปฏบตการทดสอบและ

หองปฏบตการสอบเทยบตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025

2. การทดสอบความช านาญ (Proficiency testing, PT) ทงภายใน/ตางประเทศ

3. การทดสอบ Ring test

4. การเปรยบเทยบผลทดสอบระหวาง 2 หองปฏบตการหรอมากกวา

5. การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบหรอการทวนสอบความใชไดของ

วธมาตรฐาน และคาความไมแนนอนของการวดในกรณรายงานคาเปนปรมาณ

สรปการเลอกใชหองปฏบตการทดสอบ ตามล าดบ

Phiriyayon, 2018 100

Thank Youขอบคณคะ สวสด

Feed Quality Control Laboratory Division

Documents

การตรวจวิเคราะห์ยาในอาหารสัตว์afvc.dld.go.th/webnew/images/stories/Document/... · Staphylococcus aureus Escherichia coli