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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
JOSÉ LUCIANO PIMENTA COUTO
ESTUDO DE PARÂMETROS SALIVARES EM PORTADORES DE PICNODISOSTOSE
FORTALEZA
2010
JOSÉ LUCIANO PIMENTA COUTO
ESTUDO DE PARÂMETROS SALIVARES EM PORTADORES DE PICNODISOSTOSE
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de
Pós-graduação em Odontologia, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito para a obtenção
do Título de Mestre em Odontologia.
Área de concentração: Clínica odontológica
Orientadora: Profa. Dr
a. Cristiane Sá Roriz Fonteles
FORTALEZA
2010
C91e Couto, José Luciano Pimenta
Estudo de parâmetros salivares em portadores de picnodisostose/
José Luciano Pimenta Couto – Fortaleza, 2010.
92 f. : il.
Orientadora: Profa. Dr
a. Cristiane Sá Roriz Fonteles
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará.
Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Fortaleza, Ceará.
1. Picnodisostose 2. Proteínas e Peptídeos Salivares 3. Saliva I.
Fonteles, Cristiane Sá Roriz (orient.) I. Título.
CDD: 617.6
JOSÉ LUCIANO PIMENTA COUTO
ESTUDO DE PARÂMETROS SALIVARES EM PORTADORES DE PICNODISOSTOSE
Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem da
Universidade Federal do Ceará, como requisito para obtenção do Título de Mestre em
Odontologia.
Aprovado em:___/___/_____
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
Prof.ª Dr.ª Cristiane Sá Roriz Fonteles (orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC
_________________________________________
Prof. Dr. Eduardo Costa Studart Soares
Universidade Federal do Ceará – UFC
_________________________________________
Profa. Dr
a.Maria Izabel Florindo Guedes
Universidade Estadual do Ceará – UECE
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A Deus pelo dom da vida e constante proteção de Pai, sempre renovando minha esperança
e fé, assim como trazendo para meu convívio pessoas encantadoras que têm tornado minha
vida uma eterna felicidade!!!
À minha mãe Iêda Pimenta, minha base, meu alicerce! Pelo força e amor demonstrados a
cada obstáculo superado... pela coragem ao partir conosco em busca de uma formação
difícil de imaginar, porém que já fazia parte dos planos traçados por ela para o nosso
futuro! Será SEMPRE meu exemplo maior de superação e de humildade....
Aos meus irmãos Alfredo (Macatrão), Jeffresson (Ninja) e Tiaguinho (bola) pelos
exemplos, pelos papéis assumidos diante das adversidades da vida e pela fé e amor que nos
uniram e permitiram que superássemos todas as dificuldades juntos, buscando sempre essa
felicidade que hoje nos cerca!
Alfredo – exemplo de bondade, trabalho e superação.
Jeffresson – palavra que poderia facilmente significar cumplicidade e amizade.
Tiaguinho – benção Divina que nos dá, no convívio diário, exemplo de humildade, carinho
e companheirismo.
À minha noivinha, Alynne...verdadeira Benção Divina que chegou para demonstrar o
verdadeiro sentido do amor! Um exemplo, uma inspiração, uma amiga, uma mulher que
me encanta a cada olhar, cada sorriso e com a qual pretendo ter o prazer de dividir cada dia
da minha vida!
Ao Sr. Aldenir (sogrão), Dona Lúcia (sogrona), Alyanne, Alysson e demais membros da
família pelo carinho, respeito e pela acolhida que fazem com que me sinta cada vez mais
membro dessa família...nossa FAMÍLIA CORAÇAO!!!
Amo muito todos vocês!!!!
AGRADECIMENTOS
A Dra Cristiane Fonteles por acreditar em mim! Construímos uma relação há muitos anos
onde, muitas vezes, ela precisou fazer papel de mãe, amiga, conselheira, tendo realizado esse
papel sempre com a intenção de me tornar melhor...um melhor profissional, um melhor ser
humano, sempre vibrando muito à cada vitória e oferecendo todas as oportunidades que foram
possíveis.
Ao sócio-amigo-IRMÃO, Carlos Eduardo (Dudu) pela cumplicidade desde nossa clínica
integrada, passando pelo nosso PSF no interior, concurso para Fortaleza, Faculdade Católica e
nossas evoluções dos consultórios até hoje e, com perspectiva de se manter por muuuuiito
tempo! Você é um exemplo de humildade, luta e profissional! Estaremos sempre juntos!!!
Aos amigos e, também IRMÃOS Lucas (Lukinha) e George pelas demonstrações de
felicidade a cada conquista pessoal e profissional e por todos os obstáculos superados, todas a
noites mal dormidas,...Vocês fizeram e fazem parte de tudo isso!!
À Faculdade Católica Rainha do Sertão pelo acolhimento e confiança depositada em mim,
enquanto professor em início de carreira. Sem dúvida, amadureço bastante e a experiência
adquirida tem ajudado muito na minha caminhada.
Às amigas e colegas de disciplina Bia, Cris e Pati (eternamente) pelos conhecimentos
compartilhados e pelas demonstrações de como tornar repleta de alegria e momentos
inesquecíveis uma rotina tão puxada!! Que nosso trabalho frente às disciplinas continue sendo
respeitado e valorizado pelos alunos!!
Aos meus queridos alunos. Espero ter despertado em vocês a vontade de correr atrás do
conhecimento. Aprendo muito com todos vocês!
Aos meus amigos- PRIMOS que SEEEMPRE ACREDITARAM em meu potencial e
valorizaram cada segundo de nossa amizade!! Vocês fizeram e farão parte de todos os
momentos de minha vida!!
Aos amigos e garndes colabores do Laboratório de Bioquímica da UECE, muito bem
representado pela Profa. Dr
a.Maria Izabel Florindo Guedes, além de outros seres humanos
encantadores como Isac, Jarbas, Sílvio (mestre do Bradford), Naíla, Manu, Profa Lia, Prof
Sérgio e todos que através de seus conhecimentos, ou mesmo, através do ambiente
MARAVILHOSO alimentado por todos que conduzem aquele laboratório, tornaram possível
a finalização deste trabalho...MUITO OBRIGADO!
Aos profundos conhecedores de Focalização Isoelétrica e,mais do que isso, dos valores
verdadeiros de uma amizade, Prof Raimundo e Prof Michel (NUGEM) meus agradecimentos
pela disponibilidade e pelo sorriso no rosto SEMPRE durante os momentos que os procurei.
Aos meus colegas de turma de mestrado que, mesmo diante das minhas correrias, sempre
acreditaram no meu potencial e valorizaram minha amizade.
À Karlinha, a mestranda mais merecedora de um título de doutora que já conheci!! Pela
dedicação, horas dedicadas às contribuições com esta pesquisa, pelo ser humano sincero e
amigo que demonstrou ser ao longos desses anos de convivência! Papai do Céu estará sempre
cuidando de você e a preservando com todas essas suas características que encantam todos
que desfrutam o prazer de sua amizade!
RESUMO
A picnodisostose é uma displasia esquelética caracterizada por baixa estatura, osteoclerose,
acrosteólise, deformidades crânio-faciais e fragilidade óssea. Aproximadamente 200 casos
foram descritos em diferentes grupos étnicos, estimando-se uma incidência de 1,7: 1.000.0000
de nascidos. O uso da saliva como um método de diagnóstico avançou exponencialmente nos
últimos anos. Desequilíbrios na quantidade e composição da saliva podem gerar afecções
bucais tais como cáries e doença periodontal, além de ser indicativo de alteração sistêmica
importante. Esse trabalho objetivou estudar parâmetros de saliva total humana em pacientes
portadores de picnodisostose (PYCN). A amostra consistiu em 04 indivíduoscom PYCN
(grupo experimental) e 04 indivíduos não-sindrômicos (grupo controle), tendo sido avaliado
fluxo salivar, pH e perfil protéico. Saliva total não estimulada foi coletada e centrifugada; o
sobrenadante foi retido, liofilizado, armazenado a -20°C e analisado para contagem de
proteínas totais e eletroforese bidimensional. Foi possível detectar diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos (p<0,05) para os parâmetros salivares analisados. Quando
comparados com o grupo controle, portadores de PYCN apresentaram redução no fluxo
salivar; pH com valores aumentados; redução na concentração total de proteínas e bandas
protéicas com expressão diferenciadas. Os resultados desse estudo sugerem haver padrões
diferenciados na composição salivar entre os grupos avaliados.
Palavras-chave: Picnodisostose. Proteínas Salivares. Saliva.
ABSTRACT
Picnodysostosis (PKND) is a skeletal displasia characterized by short stature, osteosclerosis,
acrosteolisis, craniofacial deformities and bone fragility. Approximately 200 cases have been
described among different ethnic groups, with an estimated incidence of 1.7: 1.000.000 live
births. The use of saliva as a diagnostic tool has advanced exponentially within recent years.
Unbalance in the amount and composition of saliva may generate oral diseases such as dental
caries and periodontitis, and may also indicate important systemic alterations. This study has
aimed to investigate the parameters of human whole saliva in patients with PKND. Our study
sample consisted of 4 individuals with PKND (experimental group) and 4 healthy individuals
without PKND (control group). Salivary flow rate, pH and protein profile were evaluated in
this population. Non stimulated whole saliva was collected and centrifuged. The supernatant
was separated and lyophilized and stored at -20°C for posterior total protein and
bidimensional electroforetic analysis. Statistically significant differences were observed
between groups (p<0,05) for the analyzed salivary parameters. When compared to the control
group, individuals with PKND presented reduced salivary flow rate, lower pH values, reduced
total protein concentration, and protein bands with differentiated expression. The results of
this study suggest the existence of a differentiated pattern of salivary composition between
groups.
Keywords: Picnodysostosis. Salivary Proteins. Saliva.
LISTA DE FIGURAS
1A Aspecto frontal de paciente portador de picnodisostose
1B Aspecto e perfil de paciente portador de picnodisostose
2A Aspecto clínico evidenciando encurtamento dos dedos
2B Evidenciação da hipoplasia das unhas
3A Aspecto intra-oral frontal
3B Aspecto intra-oral lateral direito
3C Aspecto intra-oral lateral esquerdo
4 Aspecto intra oral oclusal superior
5 Aspecto intra oral oclusão inferior
6 Telerradiografia
7 Radiografia panorâmica
8 Radiografia de mão e punho
9 Aspecto de corpo inteiro de portador de acondroplasia
10 Aspecto lateral de corpo de portador de acondroplasia
11A Aspecto frontal de paciente com acondroplasia
11B Aspecto lateral de paciente portador de acondroplasia
12.A Aspecto frontal de portador da síndrome de Robinow
12.B Aspecto lateral de portador de síndrome de Robinow
13 Aspecto intra-oral de portador da síndrome de Robinow
14 Cânula corretora
15 Coleta de saliva não-estimulada
16 Tubos na centrífuga
17 Separação do sobrenadante após centrifugação
17
17
18
18
19
19
19
19
19
21
21
21
30
30
30
30
32
32
32
49
49
49
49
18 Tubos de ensaio com amostras em triplicata
19 A e B Eequipamento IPGphor da Amersham Biosciences
20 A e B Equilíbrio das Strips
21 Marcador
22 Aplicação do marcador
23 A e B Cuba e fonte eletroforética
24 Gel em solução corante
25 Gel em solução descorante
51
54
55
56
56
57
57
57
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 13
2 REVISÃO DE LITERATURA 15
2.1Picnodisostose 15
2.1.1 Características Gerais 15
2.1.2 Características Orofaciais 18
2.1.3 Características Radiográficas 20
2.1.4 Mecanismos Fisiopatológicos 22
2.2 Diagnósticos Diferenciais 23
2.2.1Osteopetrose 23
2.2.2 Osteogênese Imperfeita 25
2.2.3 Disostose Cleidocraniana 27
2.2.4 Acondroplasia 28
2.2.5- Síndrome de Robinow 31
2.2.6- Doença de Camurati–Elgemann 33
2.3 Diagnóstico por saliva 34
2.3.1 Secreção salivar 34
2.3.2 Constituintes do fluido salivar 37
2.3.3 Saliva como ferramenta de diagnóstico 41
2.3.4 Análise proteômica da saliva 43
3 PROPOSIÇÃO 47
4 MATERIAL E MÉTODOS 48
4.1 População 48
4.2 Coleta da Saliva 48
4.3 Protocolo Analítico 50
4.3.1 Mensuração do Fluxo Salivar 50
4.3.2 Ph 50
4.3.3 Análise proteômica da saliva 50
4.3.3.1 Determinação das Proteínas Totais 50
4.3.3.2 Eletroforese Bidimensional 52
4.3.3.2.1 Focalização Isoelétrica 53
4.3.3.2.2 Equilíbrio da Strip 55
4.3.3.2.3 SDS/PAGE 56
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA 57
5 RESULTADOS 59
6 DISCUSSÃO 69
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS 74
REFERÊNCIA 75
ANEXO 1 91
ANEXO 2 92
ANEXO 3 94
ANEXO 4 96
13
1 INTRODUÇÃO
A picnodisostose (PYND) é uma displasia esquelética rara, autossômica recessiva,
que atinge diferentes grupos étnicos e ambos os sexos, sendo relatada consangüinidade dos
pais em mais de 30% dos casos (ELMORE, 1967). Essa displasia decorre de um defeito no
gene codificador da enzima catepsina K, localizada no cromossomo 1q21, resultando em
deficiência na atividade dessa enzima (GELB, 1996). As manifestações clínicas mais comuns
incluem o aumento na densidade óssea, freqüentes fraturas, displasia clavicular, deformidades
nos ossos do crânio com dificuldade de fechamento das suturas, acrosteólise das falanges
distais, ossificação incompleta das fontanelas, unhas finas e hipoplásicas, proptose, esclerótica
azul, nariz adunco, além de bossa frontal e parietal (MAROTEAUX & LAMY, 1965).
A saliva é um líquido aquoso, produzido e secretado pelas glândulas salivares
maiores (parótidas, submandibulares e sublinguais) e menores,constituindo em conjunção ao
fluido crevicular gengival, o fluido oral ou saliva total humana (STH), responsável pela
manutenção da homeostase da cavidade bucal (EDGAR, 1990). Suas funções em relação ao
fluxo salivar e à composição molecular são bem específicas: capacidade tamponante, ação
mecânica de limpeza, caráter antibacteriano e ação mineralizadora (BANDERAS-TARABAY,
1997; LENANDER-LUMIKARI & LOIMARANTA, 2000). Um grande número de proteínas
encontra-se presente na composição da STH, participando da proteção dos tecidos orais,
incluindo proteínas ricas em prolina, amilases, albumina, imunoglobulinas, lisozimas,
lactoferrina, lactoperoxidase, histatinas (com propriedades antimicrobianas), estaterina (para
homeostase do cálcio), mucinas (para lubrificação) e cisteínas (YAO et al., 2003).
Proteínas e peptídeos presentes em STH são frutos de uma série de complexos
processos moleculares, determinantes de uma definição estrutural final destas moléculas. Esses
processos iniciam-se a um nível biosintético, intra-glandular, finalizando após secreção intra-
oral destas estruturas. Portanto, durante a vida útil de uma proteína salivar, quatro fases
principais podem ser observadas: a fase 1, consistindo no processo celular básico de
biosínteseprotéica, tendo por base sua definição genética; fase 2, caracterizada por
modificações pós-translacionais intracelulares, anteriores à secreção protéicapara o sistema
ductal; fase 3, consistindo em modificações que ocorrem durante o processo secretório, e
trânsito através do sistema ductal; finalizando com uma 4ª fase, representativa de modificações
14
extensas às proteínas salivares, após sua secreção no ambiente contaminado da cavidade oral
(HELMERHORST & OPPENHEIM, 2007).
Nos últimos 10 anos, o uso da saliva como meio diagnóstico tem avançado
exponencialmente, por tratar-se de um fluido que pode ser coletado de forma não invasiva e
usado para medir e monitorar o risco de cárie (STRECKFUS & BIGLER, 2002). A predição do
risco de novas cáries tem sido de grande interesse e é muito importante para o desenvolvimento
de uma nova estratégia preventiva para a cárie. Isso é especialmente significante para crianças
sadias e para crianças com necessidades especiais (TAO et al., 2005). Para o Brasil, um país
subdesenvolvido, é relevante o fato de que os procedimentos preventivos podem se concentrar
mais eficientemente nos grupos de alto risco e não serem aplicados desnecessariamente nos
grupos de baixo risco (vAN HOUTE, 1993). Na atualidade, há, todavia, a compreensão de que
quase tudo que se pode medir no sangue é mensurável em saliva (WONG, 2006). Tendo já sido
demonstrada a presença de um grande número de dados analíticos diagnósticos em saliva,
incluindo hormônios esteróides (FORDE et al., 2006), anticorpos anti-HIV, hepatites virais A,
B e C, além de seu uso para monitoramento dos níveis de uma variedade de drogas (MANDEL,
1993).
Segundo Fonteles et al. (2007) o exame intra-oral de pacientes com PYND
geralmente revela mordida cruzada posterior e aberta anterior, severo apinhamento dental,
pobre higiene oral, doença periodontal, dentes extremamente cariados, além de anomalias
esqueléticas gerando redução do espaço aéreo da faringe, desenvolvimento de osteomielite,
osteosclerose, fraturas e limitação de abertura bucal. As características da síndrome dificultam
a obtenção de acesso para um adequado tratamento cirúrgico e restaurador, tornando de
fundamental importância uma abordagem preventiva e precoce. Apesar da significância dos
achados intra-orais de pacientes portadores desta condição, nenhum estudo de avaliação de
parâmetros salivares foi previamente realizado em pacientes portadores de PYND, não
havendo portando, nenhum dado na literatura mundial que possa servir como base para
avaliação de uma possível correlação entre a disfunção enzimática pré-existente, elevada
incidência de cáries e doença periodontal nesses pacientes e a composição qualitativa e
quantitativa de sua saliva.
15
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Picnodisostose
Reconhecida como entidade distinta em 1962 por Maroteaux e Lamy, a
picnodisostose (PYCN) (do grego picno- denso; dis- defeituoso; ostose- osso) é uma displasia
esquelética caracterizada por baixa estatura, osteoclerose, acrosteólise, deformidades crânio-
faciais e fragilidade óssea por meio de aumento na densidade óssea em decorrência da
alteração no equilíbrio reabsorção/aposição (TANNER & WHITEHOUSE, 1976; BATHI &
MASUR, 2000; NORHOLT et al., 2004; KATO et al., 2005; MUTO et al., 2005; PEREIRA
et al., 2008; MUJAWAR et al., 2009). Em 1965, Maroteaux e Lamy concluíram ter sido esta
a misteriosa doença que vitimou o famoso pintor francês Henri de Toulose-Lautrec (1864-
1901). Desde então, aproximadamente 200 casos foram descritos em diferentes grupos étnicos
(ORNETTI et al., 2008), estimando-se uma incidência de 1,7: 1.000.0000 de nascidos
(ORNETTI et al., 2008; MUJAWAR et al., 2009; TESSIER et al., 2009;HERNANDEZ-
ALFARO et al., 2011). Esta patologia apresenta-se como uma herança autossômica recessiva,
podendo também haver mutação espontânea e até 30% dos casos. Ambos os sexos são
igualmente afetados, tendo sido relatada consanguinidade dos pais em aproximadamente 30 %
dos casos (GELB et al., 1996; O`CONNEL et al., 1998).
2.1.1 Características Gerais
A PYND é uma doença congênita, porém manifesta-se tardiamente, já que
normalmente há uma fase silenciosa até a constatação do nanismo da fácies típica. Logo, o
reconhecimento ocorre, principalmente, durante a segunda infância quando o quadro clínico
se torna mais definido (KHAWALI et al., 1998). O diagnóstico, algumas vezes, é
determinado tardiamente, através de episódios de fraturas e infecções nos ossos longos,
decorrentes do incremento na densidade óssea e da menor vascularização (SOLIMAN et al.,
1996;BATHI & MASUR, 2000; KATO et al., 2005; MUJAWAR et al., 2009; TEISSIER et
al., 2009).
16
Maroteaux & Lamy (1965) descreveram densidade óssea aumentada, volume
anormal do crânio, ausência de fechamento das suturas e fontanelas, fragilidade óssea, baixa
estatura, bossa frontal e occipital, má implantação dentária e múltiplas cáries.
Para Nielsen (1974) esta displasia esquelética caracteriza-se por baixa estatura,
importante osteoesclerose, hipoplasia mandibular, atraso no fechamento das fontanelas,
ângulo mandibular obtuso, suturas cranianas separadas, proptose, voz anasalada, alterações na
formação dentária, displasia das clavículas e aplasia das falanges terminais. As alterações
craniofaciais reduzem o espaço aéreo superior e podem aumentar o risco de insuficiência
respiratória. Tornam-se frequentes as infecções na árvore brônquica, com insuficiência
respiratória, além de vômitos e regurgitações.
Saito & Gonzales (1988) observaram nariz proeminente, exoftalmia bilateral,
discreta assimetria facial, palato em ogiva, alterações dentárias com defeitos de implantação,
constituição e oclusão, suturas abertas, fontanela bregmática palpável, falanges curtas, unhas
friáveis, calvário desproporcionalmente grande e com abaulamentos frontais e occipitais,
maxila hipoplásica, queixo com tamanho reduzido, ângulo mandibular obtuso, nariz adunco,
palato alto, profundo e, muitas vezes, sulcado; anodontia parcial, erupção prematura ou tardia
dos dentes, hipoplasia do esmalte e mau posicionamento dos dentes, podendo haver
persistência dos decíduos, tórax é estreito e pode haver pectus excavatum, as mamas são
pouco desenvolvidas nas mulheres, porção distal dos dedos e artelhos são reduzidas e
largadas, a pele é enrugada e as unhas podem ser finas e quebradiças (Figuras 1,2,3 e 4) .
Magalhães et al. (1998) em relato de 2 casos observaram desproporção
craniofacial, ausência de fechamento das fontanelas, alargamento e persistência das suturas
cranianas, bossa frontal e parietal, agenesia do ângulo mandibular, aumento da densidade
óssea principalmente nos ossos longos, associados a dedos curtos com polpas digitais mal
formadas e maior risco às fraturas. Os indivíduos afetados também podem apresentar esclera
azul, unhas anormais, bossa frontal, cifose e escoliose. Segundo esses autores, os pacientes
geralmente apresentam desenvolvimento mental e sexual normais e, caracteristicamente, não
apresentam anemia ou compressão de feixes nervosos.
Soliman et al. nos estudos realizados em 1996 e 2001 consideram que a hipoplasia
da glândula hipofisária pode ser um achado associado à síndrome. No primeiro deles, Soliman
et al. avaliaram oito casos de picnodisostose e verificaram que 50 % deles apresentaram
17
déficit do hormônio de crescimento (GH) associado à hipoplasia da hipófise anterior,
detectada através de imagem por ressonância magnética. Cinco anos depois, esses autores
postularam que o aumento do volume ósseo e a relativa rigidez da parede da sela túrcica
poderiam resultar em um aumento da pressão intra-selar e determinar o hipopituitarismo.
Nesse segundo estudo, os pacientes com picnodisostose foram submetidos ao teste da geração
de IGF-I, sendo verificada uma resposta significativa e, portanto, excluída resistência ao GH.
Já para, Quezado et al. (2003) numa avaliação de 2 casos através de exames de
imagem (RX de sela e TC de crânio) não existem evidências de alterações na região da
hipófise.
Em 2010, Bertola et al. avaliaram 6 pacientes portadores de picnodisostose e
identificaram desenvolvimento mental normal, baixa estatura, esclerose óssea, ângulo
mandibular obtuso, hipoplasia/ acrosteólise das falanges distais, múltiplas fraturas,
anormalidades no crânio, sutura lambidóide ampla e persistência da sutura coronal.
Essas características clínicas são ilustradas nas figuras 1 (A e B) e 2 (A e B) com
imagens dos participantes da pesquisa
convexo. Figura 1- A)Aspecto frontal evidenciando bossa frontal e parietal, nariz adunco, retrognatia,
proptose e escleróticas azuladas. B) Aspecto lateral evidenciando bossa frontal, nariz adunco, hipoplasia do
terço médio da face, retrognatia, proptose e perfil facial convexo.
18
Figura 2- A) Aspecto clínico evidenciando encurtamento dos dedos acometidos pela acrosteólise
das falanges distais. B) Imagem em maior aumento evidenciando a hipoplasia presente nas unhas.
2.1.2 Características Orofaciais
Essa síndrome apresenta deformidades craniofaciais típicas, como dolicocefalia
ou braquicefalia, com proeminência da testa, hipoplasia da maxila e micrognatia, hipoplasia
do terço médio da face com exoftalmia, hipopneumatização dos seios da face, nariz adunco,
palato ogival e com falsa fissura, mordida aberta anterior, língua fissurada e redução do
espaço aéreo da faringe (BATHI & MANSUR, 2000; MUTO ET AL., 2005; FONTELES ET
AL., 2007; MUJAWAR ET AL., 2009).
Durante o exame intra-oral normalmente evidencia-se mordida aberta anterior e
posterior, severo apinhamento dentário, pobre higiene oral, doença periodontal, palato ogival
com falsa fissura, língua geográfica, alterações de forma e tamanho dos dentes (JONES et al
AL., 1998; QUEZADO ET AL., 2003; OLIVEIRA ET AL., 2010).
Fonteles et al. (2007) relatou quatro casos através dos quais descreveu os
principais achados observados nos portadores de tal condição. Sendo eles a bossa frontal,
proptose, perfil convexo, micrognatia, mordida aberta, palato ogival, protrusão lingual,
mordida aberta posterior, retenção de dentes decíduos, anodontia parcial, alterações
morfológicas dentárias, pobre higiene oral, cáries dentárias e doença periodontal (Figuras 3
A,B e C, 4 e 5).
19
Figura 3- A, B e C Aspecto intra-oral evidenciando severo apinhamento, além de extenso
comprometimento por cárie e doença periodontal. Observar mordida cruzada anterior decorrente da
hipoplasia do terço médio da face.
A osteomielite é a mais séria complicação advinda dos problemas orais, comum
em adultos e incomuns em crianças (BERTOLA, 2010), uma vez que a vascularização óssea
comprometida aumenta a probabilidade de desenvolver osteomielite pós-extração (PEREIRA,
BERINI AYTE´S, GAY, 2008). O tratamento atual é principalmente direcionado aos
sintomas, com ênfase na prevenção de fraturas. Rigorosa higiene oral diária e profilaxia com
antibióticos em casos de extração dentária são procedimentos recomendados na prevenção da
osteomielite (BERTOLA, 2010).
Figura 4- Aspecto clínico oclusal
superior evidenciando atresia maxilar,
apinhamento dentário e presença de
falsa fissura característicos da
síndrome.
Figura 5- Aspecto clínico oclusal
inferior evidenciando apinhamento
dentário. Observar bom controle de
placa e ausência de cárie e/ou doença
periodontal.
A
B C
20
2.1.3 Características Radiográficas
Embora os conhecimentos genéticos e bioquímicos no campo das displasias
ósseas estejam progredindo, as características clínicas e principalmente as radiológicas ainda
são as bases diagnósticas da PYCD (BERTOLA, 2010).
Maroteaux e Lamy (1962) descreveram densidade óssea aumentada, suturas
amplas e permanecendo abertas, principalmente as parieto-occipitais, defeitos vertebrais,
alterações nas estrias transversais e longitudinais nos ossos longos e ausência de fechamento
dos forames. Fernandez Marino et al. (1981) relatou proeminência frontal e parietal, abertura
das fontanelas, hipoplasia dos maxilares superiores e seios paranasais, diminuição do ângulo
mandibular, densidade óssea aumentada, aumento da cortical e redução do canal medular e
osteólise das falanges distais. Já em 1988, Saito & Gonzales observaram aumento
generalizado da densidade, espessamento da base do crânio, suturas e fontanelas permanecem
muito abertas, padrão de ossos wormianos sobre os parietais, hipoplasia e falta de
pneumatização dos seios paranasais, ângulo obtuso ou retificado da mandíbula, extremidades
acromiais das clavículas saio displásicas, canais medulares podem ser visualizados, ausência
ou desenvolvimento precário das falanges distais.
Magalhães et al. (1998) observaram ausência de fechamento das fontanelas e
alargamento e persistência das suturas, agenesia dos ângulos mandibulares, corticais
espessadas dos ossos longos com diminuição do canal medular mas sem perda da relação
corticomedular e falanges distais de forma triangular. Em estudo de 6 pacientes portadores de
picnodisostose, Bertola et al. (2010) identificaram aumento na densidade óssea, micrognatia,
sutura lambidóide ampla, sinostose coronal, acrosteólise das falanges distais, ângulo
mandibular obtuso (Figuras 6, 7 e 8).
Diferentemente de outras condições que afetam o metabolismo ósseo, a
picnodisostose promove o aumento da densidade óssea sem, no entanto, promover redução
dos espaços medulares, fechamento de forames e alterações decorrentes de tecidos
hematopoiéticos, como anemia (ELMORE, 1967; EDELSON ET AL., 1992).
21
Alguns estudos têm relatados os achados clínicos e radiográficos relacionados à
síndrome (LANDA et al., 2000; SOLIMAN et al., 2001; ZENKE et al., 2002), entretanto,
poucos têm relacionados medidas cefalométricas a essas descrições (HUNT et al., 1998;
MUTO et al., 2005; FONTELES et al., 2007).Hunt et al. (1998) relataram 3 casos de PYCD,
onde foi mensurado o ângulo ANB, tendo sido encontrado valores negativos para um dos
casos descritos evidenciando a maloclusão. Fonteles et al. (2007) descreveram dados
Figura 8- Radiografia de mão e punho
evidenciando a acrosteólise da falange distal de 2
dedos. Achado típico de portadores de
picnodisostose.
Figura 6- Radiografia lateral de face
demonstrando hipoplasia maxilar,
osso mandibular estreito, ângulo
goníaco aberto, hipoplasia do
processo coronóide e mordida aberta
anterior.
Figura 7- Radiografia panorâmica evidenciando
mandíbula pequena, fratura decorrente de
exodontia, anodontia parcial e malformações
dentárias.
22
cefalométricos de 4 casos descritos, observando redução de medidas maxilares (hipoplasia
maxilar) evidenciada por Co-A, SNA e ANS-PNS e redução no tamanho do corpo mandibular
(medido através de Goc –Me). Esses achados associados à redução de SNA e SNB tornam
mais significativa a alteração no espaço aéreo faríngeo posterior. Todos os casos revelaram
predomínio de crescimento vertical com inclinação do plano mandibular, rotação horária
(SN.GoMe e MP.FH), com importante deficiência de crescimento do ramo mandibular (Goc-
Ar) evidenciada pela deficiência na altura facial posterior (S-Goc) comprometendo o espaço
aéreo da faringe.
Como consequência dessas severas alterações craniofaciais, a apnéia obstrutiva do
sono tem sido descrita em pacientes portadores de picnodisostose, aumentando, assim, os
riscos de insuficiência respiratória (MUTO et al., 2005).
2.1.4 Mecanismos Fisiopatológicos
Na década de 1990, o gene defeituoso responsável pela síndrome foi localizado no
cromossomo 1 q 21, responsável pela produção da catepsina K (CK), proporcionando um
diagnóstico mais preciso e um conhecimento mais profundo de tal condição (GELB et al.,
1996; FONTELES et al., 2007; MUJAWAR et al., 2009).
A CK é uma protease lisossômica com importante papel na reabsorção da matriz
óssea, e se expressa abundantemente nos osteoclastos, sendo secretada no espaço sub-
osteoclástico onde a matriz é degradada. Estudos in vitro revelam que a CK mutante da
PYCD não degrada o colágeno tipo I, de que se constituem 95% da matriz orgânica óssea.
Assim, a contínua formação óssea e a incapacidade de reabsorção levam a uma remodelação
óssea alterada, resultando em um aumento generalizado da densidade e do volume do osso,
esclerose, fragilidade óssea e, consequente, maior predisposição às fraturas ósseas
(ELMORE, 1967; PEREIRA et al., 2008).
Tal comprometimento no equilíbrio reabsorção-aposição pôde ser constatado
também através dos estudos de Nishi et al. (1999), onde foi demonstrado níveis normais de
marcadores de formação óssea (pro-peptídeo carboxiterminal do colágeno I e osteocalcina), e
níveis baixos de marcadores de reabsorção óssea (telopeptídeos do colágeno tipo I - NTX e
CTX), em 7 pacientes com PYCD. Assim, a contínua formação óssea e a incapacidade de
reabsorção, desequilibram o metabolismo ósseo, resultando em um aumento generalizado da
23
densidade e do volume dos ossos, esclerose, fragilidade e, consequentemente, maior
predisposição a fraturas ósseas.
2.2 Diagnósticos diferenciais
O diagnóstico diferencial da PYCD compreende outras doenças esqueléticas que
afetam crânio, mandíbula e falanges distais, tais como a osteopetrose, a osteogênese
imperfeita a disostosecleido-cranial, a acondroplasia, a síndrome de Robinow e a doença de
Camurati-Engelmann ( LAZNER et al., 1999; SOLIMAN et al., 2001).
2.2.1 Osteopetrose
Embora os conhecimentos genéticos e bioquímicos no campo das displasias
ósseas estejam progredindo, as características clínicas e radiológicas ainda são as bases
diagnósticas da osteopetrose e da picnodisostose. É importante realizar o diagnóstico o mais
precoce possível, a fim de planejar a conduta terapêutica e o aconselhamento mais
apropriados, evitando assim as complicações decorrentes da evolução da doença
(WEINSTEIN & BUCKWALTER, 2000). A osteopetrose, também conhecida como doença
de Albers- Schonberg ou doença Marmórea ou osteosclerosis fragilis generalisata, é uma
displasia esquelética hereditária rara, em que 20% dos casos derivam de casamentos
consanguíneos, atinge ambos os sexos e raças, predominando na raça branca e no sexo
masculino, podendo se manifestar de várias formas e em qualquer idade (CRUZ et al., 2002).
Classificada clinicamente em dois grupos: congênita (maligna) de transmissão
autossômica recessiva e tardia (benigna) de transmissão autossômica dominante. A forma
congênita ou maligna é mais prevalente e ocorre numa incidência de 1/500.000 habitantes,
nos Estados Unidos, e de 1/200.000, no Brasil (ARYANPUR et al., 1990). A forma maligna,
autossômica recessiva, de pior prognóstico, que acomete mais crianças, caracterizada por
obliteração da medula óssea por tecido ósseo anormal (MYAMOTO et al.,1980; MILROY &
MICHAELIS, 1990) com anemia e neutropenia (estas as maiores causas de morte nestas
crianças), hematopoese extramedular, aumento do fígado e baço, atrofia óptica por
compressão direta do nervo ou decorrente de alteração vascular (HAMERSMA, 1970)
24
paralisia facial, disacusia severa neurossensorial, retardo mental, hidrocefalia, múltiplas
fraturas e hipocalcemia. Notou-se, nos estudos histopatológicos, deiscência do nervo facial
com herniação para o nicho da janela oval e ausência de alteração da orelha interna
(YARINGTON & SPRINKLE, 1967). Esta forma é fatal até aproximadamente a 2a década de
vida.
A forma benigna é autossômica dominante (doença de Albers-Schöenberg), de
melhor prognóstico, acomete adolescentes e adultos, pode ser assintomática ou caracterizada
por macrocefalia, alargamento da mandíbula, proptose (devido ao acometimento dos ossos
orbitais), hipoacusia condutiva (envolvimento de estruturas da orelha média), pode haver
disacusianeurossensorial por constricção óssea do nervo coclear no meato acústico interno
(SUGA & LINDSAY, 1976), inteligência normal, raro envolvimento do nervo óptico.
Sindactilia ou alterações das unhas podem ajudar no diagnóstico. Há supercrescimento ósseo,
com disfunção medular, fraturas espontâneas, anemia, plaquetopenia, hepatoesplenomegalia
(hematopoieseextramedular), enfartamento ganglionar e aumento do timo. As infecções são
comuns, pois os neutrófilos apresentam resposta quimiotática diminuída e baixa capacidade
de fagocitose bacteriana. Em estágios mais avançados, pode ocorrer paralisia dos nervos
óptico, oculomotor e facial, pela compressão resultante do crescimento ósseo, sendo os nervos
óptico e o facial os mais afetados.
O crânio costuma ser afetado em grau menor. Pode haver também aumento na
densidade óssea dos platôs vertebrais, dando o aspecto de ―vértebras em sanduíche‖.
Espondilolistese pode ocorrer. Os ossos ilíacos podem ser afetados precocemente; alterações
nos ossos longos podem aparecer apenas tardiamente. Envolvimento mandibular é raro.
Linhas transversas metafisárias alternando bandas densas e radioluscentes são observadas
com frequência. A maturação esquelética é normal. Fraturas de ossos longos são comuns e
observa-se com certa frequência varismo resultante de fraturas femorais proximais (MYERS
& STOOL, 1969).
O tratamento visa diminuir ou cessar a hiperostose progressiva, corrigir a anemia
e trombocitopenia, tratar as infecções, correção da compressão nervosa, correção de fraturas,
transfusão sanguínea, esplenectomia. O transplante de medula óssea HLA idêntico representa
a melhor opção de tratamento e deve ser realizado o mais precoce possível (MILROY &
MICHAELIS, 1990).
25
2.2.2 Osteogênese Imperfeita
A osteogênese imperfeita é uma doença determinada geneticamente, na qual está
afetada a estrutura e a função do colágeno do tipo I, que representa mais de 90% do colágeno
tecidual total, sendo responsável por 70% a 80% do peso seco dos tecidos fibrosos densos que
formam o sistema músculo-esquelético. O padrão de herança mais comum é o autossômico
dominante, podendo ser, com menor freqüência, recessivo. A alteração é determinada por
mutações nos cromossomos 7 e 17, mais especificamente nos loci COL1A1 e COL1A2, onde
ocorre com maior frequência a substituição da glicina por um outro aminoácido; mutações
localizadas nestes loci determinam principalmente a OI, mas podem também causar, dentre
outras doenças, a síndrome de Ehlers-Danlos dos tipos VIIA ou VIIB (PAULI et al., 1995;
RIMOIN, 1995).
A classificação mais utilizada divide a osteogênese imperfeita em quatro tipos
diferentes (ROUGHLEY et al., 2003; PLOTKIN, 2004). Entretanto, novas formas estão sendo
descobertas (WHYTE, 1999). O tipo I apresenta transmissão autossômica dominante, esclera
azulada, osteopenia relativamente leve, o que determina a pouca freqüência de fraturas, e
surdez em torno de 30% dos casos. É a forma mais branda da doença e a mais freqüente,
atingindo cerca de 80% dos casos, não havendo comprometimento da estatura final do
indivíduo. É subclassificado em I-A ou I-B na presença ou ausência, respectivamente, de
dentinogênese imperfeita (STREUBEL et al.,2005).
O tipo II é a forma mais grave da doença e usualmente é autossômica recessiva,
apresentando-se com fraturas e deformidades ósseas intra-uterinas. O recém-nascido, no geral,
é prematuro ou pequeno para idade gestacional e o indivíduo afetado, na maioria das vezes,
evolui para o óbito dos primeiros dias a semanas de vida, por complicações respiratórias. Com
um estudo radiográfico cuidadoso podem-se distinguir 3 subtipos, sendo o II-a letal antes do
nascimento ou no período neonatal (ROUGHLEY et al., 2003; STREUBEL et al.,2005).
O tipo III é compatível com a vida, apresentando-se como doença autossômica
recessiva. Fraturas recorrentes levam a deformidades ósseas, determinando baixa estatura,
além de apresentar-se com dentiogênese imperfeita. Apesar de ocorrer deformidade dos ossos
longos, articulações frouxas e escoliose, a deambulação é possível. Os tipos II e III podem
ocorrer como novas mutações dominantes (WHYTE ,1999; ROUGHLEY et al. 2003).
26
O tipo IV é, também, compatível com a vida, com características clínicas
semelhantes às do tipo I, porém com esclera normal. Está associado com interação gênica
tanto dominante como recessiva. Pode-se dividir em pelo menos cinco subtipos, conforme a
utilização de critérios clínicos e histomorfométricos (RAUCH & GLORIEUX, 2004).
Atualmente, acrescenta-se o tipo V, como sendo uma forma com calosidade
hipertrófica e ossificação da membrana interóssea do antebraço, podendo ser levantado como
diagnóstico diferencial de processos neoplásicos10, e os tipos VI e VII. Todos os três não
estão associados a defeitos no colágeno tipo I (WHYTE, 1999).
Os pacientes afetados pela osteogênese imperfeita apresentam expressão clínica
variada dependendo do tipo da doença (STREUBEL & LUSTIG, 2005). Entretanto, existem
algumas características clínicas mais comuns, como: fragilidade óssea, a qual determina
arqueamento, fratura e o calibre aumentado, devido às fraturas consolidadas e escleras
azuladas, devido a camada de colágeno encontrar-se mais fina, permitindo a visibilidade do
pigmento intraocular. A surdez pode ocorrer em aproximadamente 42 a 58% dos casos e é
devida ao colabamento do conduto auditivo, que causa pressão no nervo auditivo quando ele
emerge do crânio (PLOTKIN, 2004). A pele fina está associada à facilidade de apresentar
equimoses ou hematomas. Ocorre dentinogênese imperfeita e os dentes quebram-se
facilmente, são propensos a cáries, as restaurações não se fixam bem e é comum a coloração
marrom-amarelada ou azul translucente, decorrente da deficiência da dentina. A baixa estatura
é devida às deformidades, principalmente dos membros inferiores. O crânio é, aparentemente,
maior em relação ao corpo, mas não em relação à idade. As anormalidades ósseas incluem
deformidade da coluna vertebral, decorrente da osteoporose, compressão das vértebras por
fraturas e hiperfrouxidão ligamentar; rosto com formato triangular, devido ao calvário
protuberante, o que causa desproporção craniofacial; hipermobilidade articular, devido à
frouxidão ligamentar; dor, aguda ou crônica, pode ser associada às múltiplas fraturas,
colapsos vertebrais, osteoartrites, contraturas, deformidade ou mau alinhamento dos membros
(STREUBEL & LUSTIG, 2005).
27
2.2.3 Disostose Cleidocraniana
A displasia cleidocraniana é uma doença rara, que atinge diversos ossos e
articulações do corpo. Caracteriza-se por causar alterações de desenvolvimento nas clavículas,
nos ossos do crânio, da face, nos dentes e em outros ossos, envolvendo praticamente todo o
esqueleto. A ausência das clavículas, que ocorre em 10% dos casos, ou a sua formação parcial
permite aos seus portadores movimentar os ombros para frente, até a linha média do corpo,
sem nenhum desconforto (KELLY & NAKAMOTO, 1974; CRESPI, 1991).
A síndrome de disostose cleidocraniana exibe manifestação fenotípica em graus
variados e, por esse motivo, pode ser confundida com outras afecções ósseas ou ser sub-
diagnosticada na prática clínica (FORLAN, 1962; SHAFER, 1985). Esta condição é
caracterizada por malformações cranianas (como fontanelas amplas e ossos wormianos),
anormalidades das clavículas (hipoplasia ou ausência) e alterações da dentição (atraso na
esfoliação dos dentes decíduos, dentes permanentes inclusos ou retardo em sua erupção e
dentes supranumerários) (KIRSON et al., 1982). As alterações claviculares são as
características principais dessa síndrome, levando à hipermobilidade dos ombros, com
tendência a aproximação destes, anteriormente. A estatura final pode ou não ser afetada
(SHAFER, 1985).
Os sinais clínicos da doença permitem o seu diagnóstico. Além da ausência ou
hipoplasia das clavículas, ocorre retardo na ossificação das suturas cranianas e manutenção
das fontanelas abertas por longos períodos de tempo, algumas vezes até a idade adulta
(CRESPI, 1991).
A sutura sagital é deprimida, dando ao crânio o aspecto achatado (FORLAN,
1962), com as bossas frontal, parietal e occipital proeminentes. Os ossos cranianos são largos
(SHAFER, 1985). A face é curta, em consequência do pouco desenvolvimento vertical de
seus ossos, os seios paranasais são pequenos ou ausentes e não há células pneumáticas nas
apófises mastóides (CRESPI, 1991). Geralmente, o paciente apresenta aspecto de prognata
devido ao crescimento deficiente da maxila (KALLIALLA & TASKINEN, 1962).
A coluna vertebral pode apresentar, nas regiões torácica e lombar, escoliose e
lordose severa. Os ossos da pelve comumente apresentam deformidades, levando a um
estreitamento da mesma. As articulações sacroilíacas estão alargadas. Ocorrem coxa vara ou
28
valga e genovalgo, bem como alterações nas articulações do quadril. Além dessas alterações
ósseas, o crescimento, também, está alterado. Ocorre uma diminuição da estatura e casos de
nanismo são frequentes (KALLIALLA & TASKINEN, 1962). Devido às alterações
comentadas os portadores da displasia cleidocraniana são pequenos, com membros gordos,
tronco delgado, apresentando mãos e dedos curtos e largos, ombros estreitos e caídos,
bochechas gordas e mento pouco desenvolvido (SILVA & SILVA, 1994).
Os dentes temporários erupcionam normalmente. Entretanto, apesar da presença
dos germes dos dentes permanentes, eles se mantêm nas arcadas dentárias por longos períodos
de tempo (algumas vezes até a idade adulta), se não forem removidos ou perdidos devido à
doença cárie dental ou doença periodontal (SHAFER, 1985). Além da retenção dos dentes
temporários, há uma grande quantidade de dentes supranumerários, principalmente na
mandíbula, na região dos pré-molares. Os molares permanentes que não têm antecessores
decíduos, geralmente erupcionam em suas posições normais embora esta erupção seja
retardada (CRESPI, 1991). A extração dos dentes decíduos não estimula a erupção dos dentes
permanentes (SHAFER, 1985).
2.2.4Acondroplasia
A acondroplasia é a mais frequente displasia esquelética de membros curtos,
resulta de uma mutação gênica do receptor do fator de crescimento do fibroblasto tipo três
(FGFR3), que está localizado no braço curto do cromossomo quatro. Isto causa uma mudança
individual no aminoácido na transmembrana desse receptor (FRANCOMANO et al., 1994).
Esta mutação gênica é produzida por um gene autossômico dominante de penetrância
completa, na qual todos os portadores do gene apresentam a doença (OTTO, OTTO &
PESSOA, 1998).
Parece paradoxal que o distúrbio raro seja dominante, porém, no caso da
acondroplasia, as pessoas com estatura normal possuem um genótipo recessivo e as
acometidas um genótipo autossômico. Geralmente, o genótipo dos acometidos pela doença é
heterozigótico, pois, acredita-se que o efeito produzido por um genótipo homozigótico seria
bastante grave e até letal (GRIFFITHS et al., 2001).
29
Em concordância, Otto, Otto& Pessoa (1998) afirmam que são conhecidos alguns
poucos casos homozigóticos gravemente afetados que são resultantes da união de
heterozigotos e que foram a óbito precocemente.
O processo básico é uma inabilidade da placa epifisária no sentido de produzir
cartilagem colunar, o que resulta um crescimento insuficiente dos ossos de formação
endocondral, tornando a linha de ossificação irregular. Em alguns casos, há uma linha
transversal de tecido conjuntivo, interpondo-se entre a epífise e a diáfise, o que compromete
mais ainda o crescimento longitudinal do osso. O crescimento transversal está conservado, de
modo que o aspecto final dos ossos longos é curto e largo (DICHETCHEKE et al., 1987).
A incidência foi estimada, nos Estados Unidos, em 15 casos:1.000.000 de
nascidos vivos; contudo, alguns autores admitem que outras condições semelhantes à
acondroplasia possam ter influenciado no cálculo referido. Estima-se que a incidência deva
estar entre um caso/8.000 a 10.000 nascidos vivos (LIMA et al., 2008).
A acondroplasia é bastante uniforme quanto à expressão clínica, mas pode haver
variações em relação à severidade de cada deformidade (FRANCOMANO et al., 1994).
Quando transmitida por herança, as mesmas características clínicas do progenitor tendem a se
fazer presentes no filho. Embora seja geralmente considerada uma doença associada à
longevidade normal, e, portanto, compatível com uma vida íntegra e produtiva, muitos autores
têm documentado que as várias complicações clínicas e sociais podem comprometer esse
panorama. Diante disso, eventualmente, muitos acondroplásicos poderão apresentar distúrbios
psicológicos decorrentes do seu complexo de inferioridade e insatisfação com a aparência
física (DICHETCHEKE et al., 1987).
Não há prejuízo do desenvolvimento mental, mesmo nos casos que apresentam a
referida hidrocefalia, que pode estar presente na infância. Esta se caracteriza por não ser
obstrutiva por reabsorção do líquido cefalorraquidiano (FANO & LEJARRAGA, 2000) ou em
virtude de possíveis alterações na base do crânio (KOPITS, 1976). A inteligência não é
negativamente afetada e, muitos acondroplásicos, são na verdade dotados de inteligência
acima da média (HECHT et al., 1987).
O fenótipo dos acondroplásicos se caracteriza por baixa estatura, membros curtos
com predomínio do segmento proximal e do comprometimento dos ossos longos, por meio do
30
qual o nanismo resultante é dito rizomélico (ARYANPUR et al., 1990). A doença pode,
eventualmente, passar despercebida no período neonatal uma vez que o recém nascido já
apresenta os membros curtos, o que mascara a desproporção tronco/membros. Por outro lado,
o tronco compensa a diminuição do tamanho das pernas, e o comprimento total do recém
nascido pode apresentar um valor que não chama a atenção dos pediatras e familiares (FANO
et al., 2000).
A acondroplasia se caracteriza por macrocefalia devida, em parte, à megaencefalia
e também devido à hidrocefalia; hipoplasia facial e comumente a fronte é proeminente
(FANO et al., 2000). Em virtude de uma desproporção entre o crescimento dos ossos da
calota craniana (normal) e dos ossos da base (moderadamente insuficiente), o paciente
apresenta uma fisionomia característica com o nariz chato e depressão da ponte nasal. A
mandíbula é ressaltada e grande em relação aos ossos da face. Os dentes são mal alinhados
gerando uma má oclusão devido a uma quantidade excessiva de dentes podendo gerar com
isso uma estrutura dentária problemática (SCOTT et al., 1998) As mãos são pequenas, largas
e os dedos curtos com separação entre a terceira e quarta falanges (mão em tridente)
(ARYANPUR et al., 1990). As características descritas podem ser observadas nas figuras 9,
10 e 11(A e B).
Warkany (1971) relatou dimensões longitudinais normais embora em algumas
ocasiões ocorra diminuição do diâmetro anteroposterior podendo provocar dificuldades
Figura 9- Aspecto
frontal evidenciando
as alterações de
crescimento.
Figura 10- Aspecto
lateral de corpo de portador de
acondroplasia
Figura 11 A e B- Aspecto frontal e perfil
evidenciando macrocefalia e aspecto
característico do nariz achatado
A B
31
respiratórias e circulatórias. A diminuição da caixa torácica; estenose do forame magno;
hipertrofia das adenoides (a qual resulta em obstrução das vias aéreas superiores) entre outros
fatores, contribuem para a ocorrência de inúmeras complicações respiratórias tais como
apnéia do sono, insuficiência respiratória, asma brônquica, pneumonias recorrentes (TASKER
et al., 1998).
2.2.5- Síndrome de Robinow
A síndrome de Robinow descrita em 1969 por Meinhard Robinow é uma
desordem genética rara, caracterizada por baixa estatura e anomalias na cabeça, face e
genitália externa associada com defeitos de segmentação vertebral (ROBINOW, 1993).
Aproximandamente 100 casos foram relatados na literatura. Ambos os modos de herança,
autossômica dominante ou recessiva são conhecidos, com a forma recessiva sendo
responsável por sintomatologia mais grave. Esta síndrome é também conhecida como
síndrome da "fácies fetal" em decorrência da semelhança observada entre os portadores dessa
síndrome e um feto de oito semanas de idade (PATTON & AFZAL, 2002). A incidência
relatada é de 1: 500.000 nascidos vivos, com igual freqüência em homens e mulheres. A
prevalência é baixa, devido à morte de 5-10% das crianças na infância por problemas
cardíacos de correntes da forma autossômica recessiva (VAN BOKHOVEN et al., 2000;
BALCI et al., 1993).
O diagnóstico depende do quadro clínico, mas os clínicos devem conhecer os
aspectos radiográficos, os quais costumam estar presentes nos casos moderados a graves desta
condição. Todos os pacientes da forma recessiva sofrem de anormalidades segmentação
vertebral, resultando em deformidades (ROBINOW, 1993). Mazzeu et al. (2007) observaram
que hemivertebras e escoliose esteve presente em mais de 75% dos casos com a forma
recessiva, mas em menos de 25% com a forma dominante.O gene causador é ROR2 na 9 ª
posição do braço longo do cromossomo. Este gene é responsável por osso e cartilagem de
crescimento. O diagnóstico pré-natal é possível a partir da 19ª semana da gestação por ultra-
sonografia fetal. Avaliação do comprimento dos ossos longo tem sido utilizada no diagnóstico
pré-natal (GUVEN et al., 2006).
B B
32
Clinicamente, os portades de síndrome de Robinow apresentam características
marcantes, como hipertelorismo, hipoplasia do terço médio da face, nariz pequeno e
arrebitado, testa larga e proeminente, orelhas com implantação baixa e com pavilhão auricular
apresentando deformidade, lábio superior com aparência de ―v‖ invertido expondo os
incisivos e a gengiva do rebordo superior, hiperplasia gengival, além de dentes apinhados
(ROBINOW, 1993). As características clínicas podem ser evidenciadas nas figuras 12 (A e B)
e 13.
De acordo com Soliman et al. (1998) há encurtamento mesomélico das
extremidades, com luxação da cabeça do rádio e limitação de rotação do antebraço. Observa-
se também encurtamento das falanges distais, sendo os membros inferiores, geralmente,
menos afetados. Esta condição deve ser diferenciada de outras causas de má segmentação
vertebral, hipoplasia das costelas e displasia dos antebraços, devendo para isso, serem
avaliadas as mudanças faciais características e a hipoplasia genital (ROBINOW, 1993).
O prognóstico da síndrome de Robinow é geralmente bom, com mais de 80% dos
pacientes apresenta desenvolvimento mental normal. Terapias com hormônio do crescimento
têm sido descritas em pacientes que apresentam deficiência nos índices do mesmo
(HOSALKAR & SHAW, 2002), além do uso da gonadotrofina coriônica para aumentar o
comprimento do pênis e o volume dos testículos (GUVEN et al., 2006).
Figura 12 A e B- hipertelorismo, hipoplasia do terço
médio da face, nariz pequeno e arrebitado, testa
larga e proeminente, orelhas com implantação baixa
e com pavilhão auricular apresentando deformidade.
Figura 13- Aspecto intra-oral
evidenciando severo apinhamento
dentário decorrente da atresia do terço
médio da face.
33
2.2.6- Doença de Camurati - Elgemann
A Doença de Camurati-Engelmann ou Displasia Diafisária Progressiva foi
descrita pela primeira vez em 1922 por Camurati e em 1929 por Engelmann. É uma doença de
transmissão autossómica dominante, de penetrância variável, com uma prevalência de
1/1.000.000 e predomínio no sexo masculino. Resulta de mutações do gene codificador do
fator transformador do crescimento b1 (TGFb1), localizado no braço longo do cromossoma
19, causando uma expressão inadequada desta molécula (GARCIA et al., 2007).
Verifica-se, principalmente, uma redução da atividade osteoclástica, mas também
um aumento da atividade osteoblástica, favorecendo a deposição óssea, simétrica, a nível do
endósteo e periósteo das diáfises dos ossos longos. Ainda que seja uma doença de atingimento
predominantemente diafisário, estão descritos alguns casos de envolvimento das metáfises e
epífises dos ossos longos, como no presente caso. Raramente pode existir envolvimento dos
ossos do crânio, com risco de compressão dos nervos óptico e vestíbulo-coclear (JANSSENS
et al, 2006).
A doença pode manifestar-se entre os 3 meses e os 50 anos, mais frequentemente
por dor nos membros (68%), marcha bamboleante (48%), fadiga (44%) e fraqueza muscular
(39%). Quando existe envolvimento dos ossos do crânio pode ocorrer exoftalmia, paralisia
facial, perda de visão ou hipoacúsia. O estudo analítico é frequentemente normal, podendo
surgir anemia normocrómicanormocítica, elevação da velocidade de sedimentação, da
fosfatase alcalina e da hidroxiprolinúria (GARCIA et al., 2007).
Radiologicamente observa-se espessamento simétrico da cortical dos ossos
longos, sobretudo no nível das diáfises, perda da diferenciação corticomedular, podendo
ocorrer estenose do canal medular. O cintigrama ósseo pode revelar hipercaptação difusa dos
ossos envolvidos. O diagnóstico fundamenta-se na clínica e na imagiologia, confirmando-se
através do estudo genético. A terapêutica é sintomática, podendo ser necessário recorrer à
corticoterapia em situações refratárias (VANHOENACKER et al., 2003).
34
2.3 Diagnóstico por saliva
2.3.1 Secreção salivar
Saliva é um fluido oral que apresenta diversas funções relacionadas a saúde oral e
homeostase, tendo um papel protetor ativo na manutenção da saúde oral (CHIAPPIN et al.
2007). É um dos mais complexos, versáteis e importantes fluidos do corpo, suprindo um largo
espectro de necessidades fisiológicas.
O fluido salivar é uma secreção exócrina produzida principalmente pelas
glândulas salivares maiores (parótida e submandibular), havendo uma modesta contribuição
das glândulas salivares menores (KAUFMAN & LAMSTER, 2002). As glândulas maiores
incluem as glândulas parótidas localizadas na região dos primeiros molares superiores e as
glândulas submandibulares e sublinguais, que estão localizadas no assoalho bucal. As
glândulas menores que produzem saliva são encontradas no lábio inferior, língua, palato,
bochecha e orofaringe (HUMPHREY & WILLIAMSON, 2001).
Os termos maiores e menores se referem ao tamanho anatômico da glândula.
Edgar (1990) leva a crer que as glândulas menores são as mais importantes devido aos seus
componentes protetores. As glândulas maiores produzem mais saliva, no entanto a qualidade
do conteúdo e o tipo de produção são variáveis. Ainda segundo esse autor, a porcentagem de
contribuição das diferentes glândulas salivares varia de acordo com a presença de estimulo,
sendo o fluxo de saliva não estimulada maior para as glândulas submandibular (65%). A
glândula parótida contribui com cerca de 20%, as sublinguais de 7% a 8%, e menos de 10% é
produzida pelas glândulas menores. Quando há a presença de um estímulo, ocorre uma
mudança drástica na porcentagem de contribuição de cada glândula, com a parótida
contribuindo com mais de 50% do total da secreção salivar.
Além do fluido de origem glandular, a saliva total humana (STH) apresenta
componentes que tem uma origem não glandular - fluido gengival, detritos celulares,
secreções das vias áreas superiores e microrganismos da cavidade bucal (NAGLER et al.,
2002; APS & MARTENS, 2005). Douglas (1998) descreve STH como uma combinação dos
produtos aquosos de secreção das glândulas salivares maiores e menores, compostos
orgânicos (proteínas e enzimas) e inorgânicos (íons e sais minerais), restos alimentares,
microorganismos, produtos do metabolismo bacteriano, células que descamam do epitélio
35
bucal, muco da cavidade nasal, faringe e fluido transudato da mucosa e exsudato dos sulcos
gengivais.
As glândulas diferem no tipo de secreção que elas produzem, o que se deve a
proporção de células glandulares serosas ou mucosas. As glândulas parótidas são inteiramente
glândulas serosas, que secretam um fluido aquoso essencialmente sem mucina, enquanto que
as glândulas submandibulares e sublinguais são mistas (sero-mucosa), produzindo uma
secreção rica em mucina, sendo esta mais viscosa (CARRANZA et al, 2005; SCHIPPER et
al., 2007), enquanto as glândulas salivares menores são essencialmente mucosas (PUY, 2006).
O fluxo salivar é denominado não-estimulado quando nenhum estímulo externo
ou famacológico é utilizado; já o fluxo estimulado necessita de estímulos mecânicos,
gustatórios ou agentes farmacológicos (Nauntofte et al., 2005). Cerca de 60% da saliva total é
produzida em condições de repouso e reflete a velocidade do fluxo basal, ou seja, é a mistura
de secreções que entram na boca na ausência de estímulos exógenos. Está presente na
cavidade oral cerca de 14 horas por dia e é a secreção que recobre os tecidos orais, fornecendo
muito da sua proteção. A saliva estimulada, que também exerce ação de proteção, está
presente em nossas bocas cerca de duas horas do dia e associa-se com a função da saliva sobre
os alimentos. Cerca de 70% da saliva total em repouso é derivada das glândulas
submandibular e sublingual, 15%–20% da parótida e 5%–8% das glândulas salivares
menores. Na condição de estímulo, cerca de 45%–50% da saliva total resulta das glândulas
parótida, submandibular, sublingual e menor quantidade das glândulas salivares menores
(SREEBNY, 2000).
Em 2006, Lewis reporta que para a análise dos componentes bioquímicos da
saliva o ideal é utilizar saliva total não-estimulada.
Segundo Jenkins, 1970, a composição salivar sofre variações em função do fluxo
salivar, e está intimamente relacionada ao tipo, intensidade e duração do estímulo utilizado na
obtenção da amostra, podendo ocorrer alterações significativas na composição salivar em
diferentes indivíduos e no mesmo indivíduo sob diferentes circunstâncias. O autor ainda relata
que existe diferença na composição salivar das diversas glândulas. A glândula parótida
contribui com cerca de 10% do volume salivar quando em saliva total não estimulada, no
entanto produz parte significante da saliva estimulada. Dessa forma, a saliva estimulada é
quase que totalmente representativa do tipo de secreção produzido pelas glândulas parótidas.
Medidas de variação no fluxo das diferentes glândulas mostram que a submandibular produz
36
o maior fluxo em condição de repouso, porém quando o fluxo é estimulado a parótida é mais
responsiva que a submandibular.
As medidas precisas do fluxo salivar são requeridas para uma variedade de
protocolos clínicos e experimentais, a importância da medida do fluxo salivar está no fato de
que ela pode nos dar uma idéia da qualidade da saúde, não só oral, mas também sistêmica
(LEITE et al., 2002). É possível determinar o valor do fluxo salivar, medindo tanto o volume
quanto o peso da saliva coletada. Edgar & O'mullane, em 1996, relatam que a quantidade e a
composição da saliva não são constantes e estão relacionadas ao ritmo biológico circadiano. O
fluxo salivar atinge seu pico no final da tarde e é praticamente nulo durante o sono. Os autores
enfatizam ainda que ciclo circadiano é um fator importante a ser considerado quando se
pretende realizar estudos com a saliva. A secreção salivar é menor à noite em relação à
secreção diurna. Todavia, a concentração de proteínas é maior à tarde, enquanto que as
concentrações de eletrólitos, tais como sódio e cloretos são nitidamente maiores pela manhã,
enquanto que o potássio é excretado pela saliva no crepúsculo. Os teores de cálcio e fosfato
salivares são maiores à noite (DOUGLAS, 1998).
Segundo Humphrey & Williamson (2001) existe uma grande variabilidade nas
taxas do fluxo salivar. Os valores aceitos como normais para a taxa de fluxo de saliva não-
estimulada deve ser acima de 0,1 ml/min. Para a saliva estimulada, um volume de 0,2 ml/min
é considerado normal. Dawes (2004) reportou como normal, um valor médio ao redor de 0,3
mL/min, sendo que valores entre 0,1–0,2 mL/min são considerados baixo fluxo salivar
(hipossalivação) e abaixo de 0,1 mL/min xerostomia.
Para Puy (2006), a taxa de secreção diária varia entre 500 e 700ml e a média de
volume na boca é de 1,1ml. Em repouso, há uma variação de 0,25 a 0,35 mL/min e a glândula
submandibular e sublingual são as principais produtoras. Estímulos sensório, elétrico e
mecânico podem aumentar a saliva para um fluxo de 1,5 mL/min. O maior volume da saliva é
produzido antes, durante e depois das refeições, alcançando seu máximo por volta de meio
dia, e diminuindo consideravelmente a noite, durante o sono.
Sem adequada função das glândulas salivares, um indivíduo pode experimentar
severa debilidade na saúde oral que resulta em aumento dramático do número de cáries novas
ou recorrentes, infecção microbiana, acúmulo de biofilme dental, perda da estrutura dos
dentes por erosão química, alterações na membrana da mucosa, perda da acuidade gustativa,
dificuldade para falar, mastigar, deglutir e problemas de digestão e absorção de alimentos
37
(DAWES, 2004). A hipofunção das glândulas salivares é causada por múltiplos fatores,
incluindo distúrbios e doenças orais e sistêmicas, desordens imunológicas, desidratação,
medicações prescritas ou não, quimioterapia e radioterapia da cabeça e pescoço, fatores
psicogênicos e diminuição da mastigação que podem causar danos permanentes ou
temporários nas glândulas salivares (GHEZZI & LANGE, 2000). Segundo Fejerskov & Kidd
(2005), algumas doenças sistêmicas associadas à medicação causam notável declínio na
secreção salivar, como, por exemplo, a Síndrome de Sjögren, Diabetes Mellitos (tipo I) e a
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA).
A composição da saliva sofre ainda alterações devido a vários fatores fisiológicos
e não-fisiológicos, como: ritmo circadiano, natureza e duração do estímulo, condições da
higiene bucal, tipo de dieta alimentar, uso de medicamentos, etc. Além disso, os componentes
orgânicos são muito suscetíveis ao catabolismo (DAWES, 1993).
2.3.2 Constituintes do fluido salivar
A saliva é um fluido aquoso e transparente (JENKINS, 1970; DAWES, 1993)
composto principalmente de água (99,5%), proteínas (0,3%) e de substâncias inorgânicas
(0,2%) (HUMPHREY & WILLIAMSON, 2001). Esses componentes interagem entre si e
relacionam-se com as funções da secreção salivar, como: preparação do bolo alimentar,
umedecimento das mucosas bucais, ação solvente e de limpeza, excretora, digestiva,
controladora do balanço hidro-eletrolítico, proteção e remineralizante nos dentes
(DOUGLAS, 1998).
A fração inorgânica da saliva contem os usuais eletrólitos dos fluidos corporais
(sódio, potássio, cálcio, magnésio, fosfato e bicarbonato), mas com diferentes concentrações o
que tornando a saliva um fluido hipotônico. O bicarbonato exerce um efeito tampão, enquanto
o cálcio e o fosfato permitem a manutenção da integridade mineral do dente. Trabalhos
pioneiros como o de DAWES (1969) relacionam o fluxo salivar com a composição dos
eletrólitos. Além disso, o pH e a composição iônica também influenciam na atividade dos
componentes orgânicos da saliva (DODSA et al., 2004). Para Humphrey & Williamson
(2001), bicarbonato, fosfato e uréia agem como moduladores do pH e são responsáveis pela
capacidade tampão da saliva. Os íons cálcio e fosfato, juntamente com as proteínas trabalham
38
em conjunto no processo dinâmico de desmineralização e remineralização que ocorre entre os
dentes e a saliva.
A porção orgânica salivar contém uma grande variedade de proteínas, únicas ao
fluido salivar,com funções biológicas de particular interesse à saúde oral. As proteínas na
saliva são principalmente constituídas por glicoproteínas (ex. mucinas), enzimas (ex. α-
amilase, anidrase carbônica), imunoglobulinas e uma grande variedade de peptídeos com
atividades antimicrobianas (cisteína, estaterina, histatina e proteinas ricas em prolina-PRP)
(HUMPHREY & WILLIAMSON, 2001).
A saliva auxilia na formação do bolo alimentar, protege a mucosa oral contra
danos e desempenha um papel importante no processo digestivo devido a presença de
enzimas, como por exemplo a α-amilase (AMERONGEN & VEERMAN, 2002).
O poder lubrificante e a capacidade de manter a superfície da mucosa úmida estão
relacionadas a presença de mucinas. Além disso, elas mediam a adesão de bactérias
específicas à superfície dos dentes, e ajudam a proteger a mucosa de infecções (VAN NIEUW
AMERONGEN & VEERMAN, 2002; SHIP, 2002). Assim sendo, redução na quantidade de
mucina pode gerar inúmeros efeitos na saúde oral e sistêmica, bem como na qualidade de vida
do paciente (DODDS et al., 2005). Constituem importante classe de glicoproteínas, sintetizadas
pelas células acinares mucosas das glândulas salivares, que na saliva total não estimulada
representam cerca de 25 – 30% da concentração protéica total ( BOLSCHER et al., 2002).
A fração protéica também apresenta um papel na manutenção da mineralização do
esmalte: proteínas como as proteínas ricas em prolina (PRP) e estaterina, permitem que a
saturação de cálcio no meio seja mantida (VAN NIEUW AMERONGEN & VEERMAN,
2002). As PRPs constituem uma significante fração da proteína total salivar e têm importantes
atividades biológicas. Em decorrência da concentração relativamente alta de radicais ácidos,
especialmente grupos fosfatos, essas proteínas apresentam grande afinidade pela
hidroxiapatita, sendo um dos principais constituintes da película adquirida, filme orgânico que
recobre a superfície dos dentes, e também foram observadas no biofilme dental. São
inibidoras do crescimento cristalino do fosfato de cálcio, controlando a precipitação desse sal
pela saliva supersaturada em íons cálcio e fosfato, além de prevenirem a cristalização no
interior da glândula salivar e a formação de tártaro sobre a superfície dos dentes (DODDS et
al., 2005).Outra proteína que está relacionada à homeostase do cálcio no meio bucal é a
estaterina, que promove uma regulação do meio iônico. É uma fosfoproteína rica em tirosina,
39
que inibe a precipitação espontânea de soluções supersaturadas de sais de cálcio e fosfato
(JENSEN et al., 1991).
A fosfatase alcalina (FA) é uma proteína com atividade enzimática envolvida na
hidrólise de ligações ésteres-fosfato de inúmeras moléculas fosforiladas, cujos grupos fosfatos
são liberados na sua forma livre. A liberação dessa proteína intracelular no fluido gengival é
usualmente indicativa de inflamação e/ou destruição tecidual. Estes trabalhos têm mostrado
que o nível de FA no fluido gengival e STH estão positivamente correlacionam-se
positivamente com a gravidade da doença periodontal (CHAPPLE et al., 1994). Existem
relatos de que a atividade da FA na saliva e biofilme dental pode estar positivamente
correlacionada com a susceptibilidade à cárie. Rudenko (1991) observaram níveis elevados de
FA na saliva de crianças com diferentes formas de cárie. Gandhy e Damle (2003) registraram
aumento na atividade da FA em indivíduos com cárie rampante em relação a indivíduos livres
de cárie. N’dobo-Epoy et al., 2001 concluíram que a FA é um marcador de cárie
estatisticamente significante e sugeriram o seu uso como método biológico de detecção de
cárie.
Dibdin e Dawes (1998) estudaram o efeito da concentração de uréia da saliva no
pH do biofilme dental, e concluíram que níveis normais de uréia salivar são suficientes para
aumentar significativamente o pH, e reduzir a profundidade e extensão da curva de Stephan
após a exposição de carboidratos fermentáveis. Os mesmos autores também verificaram que a
exposição do biofilme dental à quantidade adicional de uréia através da mastigação de gomas
contendo uréia causa elevação do pH da mesma.
A amônia do biofilme dental, resultante do metabolismo da uréia e de
aminoácidos, pode inibir a progressão de cárie dental através da neutralização dos ácidos
gerados pela glicólise bacteriana. Além disso, as condições menos ácidas resultante desses
processos fornecem um meio mais favorável para o crescimento de espécies bacterianas
menos cariogênicas. Assim, a ureólise pode ter um grande impacto na ecologia do biofilme
oral (CLANCY et al., 2000).
As pesquisas com saliva têm permitido a identificação de um completo arsenal
de proteínas com atividade antimicrobiana, cuja função é manter um balanço ecológico das
bactérias que afetam as saúdes geral e oral. Além de uma série de mucinas de alto e baixo
peso molecular, glicoproteínas que atuam como agentes aglutinantes promovendo a
aglomeração ―clearance‖ bacteriano e redução da colonização bacteriana inicial na
40
cavidade oral, outras proteínas tais como a lisozima, lactoferrina, peroxidases, histatinas,
imunoglobulinas e defensinas exercem atividade antibacteriana, antiviral e antifúngica
(LAWRENCE, 2002; VAN NIEW AMERONGEN & VEERMAN, 2002; VAN NIEW
AMERONGEN et al., 2004).
As glândulas salivares são consideradas um reservatório protéico natural de
muitos fatores de crescimento. Em humanos, a família do fator de crescimento epidérmico
(FCE), de fibroblastos (FCF), hepatócito (FCH), semelhante à insulina (FCI) e fator de
crescimento endotelial vascular (FCEV) têm sido detectadas nas glândulas, bem como na
saliva, mas as funções fisiológicas destas substâncias na cavidade oral não estão totalmente
esclarecidas (CONSTIGAN et al., 1988). Existem evidências de que estas substâncias
exerçam papel fundamental no reparo de tecidos moles atuando na cicatrização de
ulcerações.
A saliva desempenha papel importante na acuidade gustativa através da
solubilização dos componentes dos alimentos e como meio de interação com os receptores
das células gustativas. Nesse aspecto, alguns trabalhos da literatura têm descrito a presença
de uma proteína específica da parótida humana denominada gustina, normalmente
associada ao zinco, como sendo a responsável pela sensação do paladar (SHATZMAN &
HENKIN, 1981). Para Nauntofte et al. (2005) um desequilíbrio na quantidade e na
constituição dessas proteínas na saliva pode gerar afecções bucais tais como cárie e
doenças periodontais, podendo também ser um indicativo de alguma alteração sistêmica
importante.
A quantidade e a composição da saliva secretada depende de vários fatores,
como o fluxo salivar, ritmo circadiano, o tipo e o tamanho da glândula salivar, a duração e
o tipo de estímulo, dieta, drogas, idade, gênero, tipo sanguíneo e fator psicológico
(HUMPHREY & WILLIAMSON, 2001).O fluxo da saliva total é um índice da umidade
oral e indicativo da atividade metabólica das glândulas salivares. A medida do fluxo salivar
é básica para o entendimento do processo de secreção e para avaliação das condições e
doenças orais e sistêmicas que levam à hipofunção salivar (SREEBNY, 2000).
Para Benedetto (2002) as análises da função salivar em relação ao fluxo e
capacidade tampão são de extrema importância, pois, com freqüência apresentam correlação
com atividade de cárie. Além disso, o fluxo salivar é importante pois promove a limpeza da
cavidade bucal, regula a capacidade tampão, além de gerar atividades antimicrobianas.
41
2.3.3 Saliva como ferramenta de diagnóstico
O uso da saliva como um método de diagnóstico avançou exponencialmente nos
últimos anos. Esse fato pode ser relacionado com o fato da saliva poder ser facilmente
coletada quando comparada à coleta de sangue, o que desperta especial interesse nos
pesquisadores (DAWES, 1993; MOURA et al., 2007). Os procedimentos laboratoriais mais
utilizados com fins diagnósticos envolvem a análise dos constituintes químicos e celulares do
sangue. Além disso, outros constituintes biológicos também são utilizados com esses fins,
como a urina, o líquor e as fezes. Uma diversidade de pesquisas tem avaliado o potencial da
saliva como fluido biológico útil nos exames para diagnóstico de doenças sistêmicas ou
localizadas na boca (MOURA et al., 2007).
Para Giannobile (2000) a saliva é uma fonte valiosa de informações clinicamente
relevantes, uma vez que seus múltiplos componentes não apenas protegem a integridade dos
tecido bucais, mas também funcionam como biomarcadores de doenças e condições
sistêmicas do individuo. Mudanças qualitativas na composição desses biomarcadores têm sido
utilizados na identificação de pacientes com maior suscetibilidade a certas doenças, na
identificação de locais com doença ativa, na predição de locais que tem maior atividade da
doença no futuro e/ou servindo como ferramenta de monitoração da efetividade de terapias.
Para Lawrence (2000), os testes com saliva são bem mais seguros que testes com
sangue, que tem mais chances de expor os profissionais da saúde e cientistas, ao vírus HIV ou
hepatite. Para o paciente, as técnicas de coleta não-invasiva para a saliva podem reduzir
drasticamente a ansiedade e o desconforto, além de simplificar a coleta de amostras para
monitorar a saúde geral.
Os avanços tecnológicos têm propiciado o uso da saliva como um fluido
diagnóstico. Por meio do exame salivar é possível: detectar microorganismos bucais,
substâncias químicas presentes no organismo dos indivíduos e marcadores imunológicos
(STREKFUS E BIGLER, 2002).
Com o aumento do reconhecimento da relação entre saúde bucal e geral, as
atenções foram voltadas para a saliva como um fluido diagnóstico para uma diversidade de
doenças. Profissionais de saúde bucal vêm avaliando o risco de pacientes para cárie
dentária durante décadas, medindo a capacidade de tamponamento e o conteúdo bacteriano
da saliva (LAWRENCE, 2000). Atualmente, avanços em bioquímica, microbiologia e
42
imunologia deram origem a novas ferramentas para diagnosticar doenças sistêmicas que
são refletidas na composição da saliva.
A determinação das características funcionais da saliva é objeto de estudo de
um número significativo da pesquisas na atualidade. Apesar da utilização de secreções
salivares puras, devemos considerar que as propriedades biológicas da saliva estão na
verdade relacionadas à mistura de fluidos orais e seus conteúdos, motivo pelo qual se tem
incrementado o uso da saliva total nas pesquisas. Os estudos demonstram que o
polimorfismo genético na saliva, fatores variáveis como a nutrição, bem como
características fisiológicas específicas, podem promover modificações no conteúdo e na
função da saliva (AZEN, 1993; AGUIRRE et al., 1993).
Chiappin et al. (2007) reforçam a utilidade da análise salivar como meio de
diagnóstico, justificando a escolha pelo fato do método de coleta ser simples e não-
invasivo. O fluido oral é considerado seguro para o paciente e para o operador, sendo fácil
e barato o seu armazenamento. Essas características tornam possível a avaliação de
biomarcadores em recém-nascidos, crianças, idosos e indivíduos não-colaboradores, e em
várias circunstâncias nas quais o sangue e a urina não estão disponíveis. Outra razão que
justifica o aumento no interesse dos propósitos diagnósticos da saliva é a ligação com
parâmetros bioquímicos tradicionais que aparecem na circulação em várias formas,
existindo assim uma inter-relação entre o soro sangüíneo e as concentrações dos
componentes salivares. Contudo, o autor relata algumas dificuldades na utilização da saliva
como substituta do sangue, como por exemplo, a detecção de algumas proteínas salivares,
devido a sua baixa concentração nesse fluido em relação ao encontrado no sangue. Além
disso, a metodologia da coleta deve ser bem padronizada, pois vários fatores externos e
ambientais podem interferir no fluxo e na composição salivar.
Dawes (1993) relata que uma variedade de fatores pode influenciar o fluxo e as
características fisiológicas da saliva, incluindo o ritmo circadiano e atividades físicas, e esses
fatores devem ser considerados quando a saliva é usada como um fluido diagnóstico. Para
Falcão (2005) faz-se necessário tomar algumas medidas cautelares no que diz respeito a
realização da coleta, tais como: a amostra deve ser sempre colhida entre 9:00 e 10:00 da
manhã, para reduzir a interferência do ciclo circadiano em cada participante; sempre que
possível utilizar pacientes do mesmo sexo, para que não haja interferência por causa do sexo;
os pacientes devem ser avisados para que não comam, bebam, masquem chiclete, façam
exercícios, fumem ou escovem os dentes por até 2 horas antes da coleta; além disso, durante a
43
coleta, o ambiente deve estar bem ventilado e os indivíduos sentados de forma ereta e
relaxados por 5 minutos.
Andrade et al. (2007) descreveram os métodos atuais para a coleta e a obtenção da
amostra de saliva, reportando uma grande variedade de métodos para coleta deste fluido oral,
desde os mais simples, como por exemplo uma simples expectoração por parte do próprio
indivíduo, o método da drenagem, sucção aberta, sucção fechada, do esfregaço entre outros
até a utilização de dispositivos mais sofisticados para coleta como o método salivette,
eyespears e o UltrafiltrationProbe. Para Shipper et al. (2007) o importante é que a coleta da
saliva usada como material de pesquisas ocorra de forma padronizada, uma vez que a
composição da saliva varia consideravelmente tanto intra como inter- indivíduos. Métodos
não padronizados têm parcialmente contribuído para a alta variabilidade das informações
disponíveis sobre os parâmetros salivares, tais como, composição, viscosidade e propriedades
lubrificadoras. Segundo esses autores, várias razões tornam complicada a análise da saliva
total: 1) é quase sempre difícil determinar qual componente representa os verdadeiros
constituintes da saliva e quais tem origem celular ou bacteriano; 2) como resultado do
metabolismo bacteriano, a composição da saliva pode mudar com o tempo; 3) a presença de
restos celulares e então a observação de um liquido turvo, pode interferir com muitas das
técnicas analíticas. Um dos métodos para resolver esses problemas é a centrifugação da
amostra o que permite a remoção das bactérias e os restos celulares.
2.3.4 Análise proteômica da saliva
O proteoma reflete o estado atual de funcionamento do sistema em condições
fisiológicas específicas, ou seja, a expressão funcional do genoma. Esta característica faz com
que o estudo do proteoma se torne um grande desafio, pois a expressão gênica de uma célula é
bastante dinâmica, dependendo do estado de desenvolvimento, da presença de ativadores ou
inibidores e também das condições do meio ambiente. Apesar disso, a proteômica é a
ferramenta mais apropriada para se entender o funcionamento dos genes, porque analisa o
produto final do genoma (Pandey e Mann, 2000). Embora a identificação de todas as
proteínas codificadas no genoma de um organismo pareça uma tarefa bastante difícil de
realizar, mesmo em organismos mais simples, são cada vez mais completas as informações
obtidas através de estudos proteômicos (Suresh et al., 2005). Esses novos conhecimentos
estão relacionados às vias de sinalização celular, conjuntos de proteínas reguladoras,
44
modificações pós-traducionais, bem como outras informações cruciais sobre os estados
fisiológicos e fisiopatológicos de células e organismos.
Schipper et al. (2007) retratam que embora a saliva contenha proteínas e peptídeos
com importantes funções biológicas já reveladas por métodos bioquímicos convencionais, as
funções da maioria delas ainda está probremente defenida. Uma nova e promissora
abordagem no estudo da saliva, é a análise global das proteínas salivares usando as técnicas
de análise proteômica. Tal avaliação proteômica da saliva irá tanto melhorar o conhecimento
sobre a fisiologia oral, como também permitirá a identificação de novas proteínas e a
identificação de mudanças nos níveis protéicos frente a diferentes condições fisiológicas ou
estados patológicos.
Ghafouri et al. (2003) enfatiza a utilização da eletroforese bi-dimensional para
separar os componentes protéicos e, em seguida, utiliza a espectrometria para identificar os
peptídeos de interesse. A conjunção desses métodos tem permitido a identificação de
componentes protéicos de baixo peso molecular, muitos dos quais tem importantes funções
biológicas, como a histatina, cisteína, estaterina, proteínas rica em prolina.
Durante muito tempo a saliva foi usada como meio de monitorar o risco de cárie
sendo utilizada como meio biológico útil da medida da capacidade tampão e avaliação
microbiológica. Agora, a saliva é objeto de estudos mais detalhados para o diagnóstico de
doenças sistêmicas que afetam a função das glândulas salivares e a composição da saliva,
como por exemplo, na síndrome de Sjögren, cirrose alcoólica, fibrose cística, sarcoidose,
diabete mellitos e doenças do córtex adrenal (Lawrance et al. 2002). Moura et al. (2007)
relatam que a microbiota oral desempenha um papel importante na saúde humana e está
diretamente ligada a doenças como cárie e a doença periodontal, que são as alterações
crônicas mais comuns em humanos.Para Bretas et al., 2008, devido à importância da saliva
em relação à prevenção da doença cárie, os testes salivares (mensuração da capacidade
tampão, do fluxo salivar) deveriam ser incluídos nos exames de rotina para avaliação de
pacientes quanto ao risco de desenvolvimento da doença.
Tang et al. (2003) com o objetivo de determinar o padrão de expressão das
proteínas salivares em indivíduos adultos com periodontite, propuseram-se a analisar a
composição de proteínas salivares através do método de eletroforese em gel de
poliacrilamidaduodecil sulfato de sódio em amostras de saliva total não estimulada obtidas
antes e após tratamento básico. Os resultados demonstraram que bandas de proteínas com 18
45
kD, 15 kD e 13 kD podem estar estreitamente relacionadas com a ocorrência e recorrência de
periodontites.
Para Taba et al. (2005) existem algumas perguntas chaves relacionadas com a
decisão clínica a ser tomada: Como os clínicos acessarão o risco de doença periodontal?
Quais são os métodos clínicos e laboratoriais úteis para acessar o risco periodontal? E o que
pode ser alcançado com o controle da doença periodontal usando um perfil de risco? Essas 3
perguntas incluem a questão do fator de risco que é considerado um modificador da atividade
da doença. Quando associados com a suscetibilidade do hospedeiro e uma variedade de
condições sistêmicas e locais, os fatores de risco influenciam no início e na progressão da
periodontite e nas mudanças nos biomarcadores.
Sousa e Taba (2004) discorreram sobre a necessidade de desenvolvimento de novos
testes diagnósticos que permitam a detecção de doença ativa, avaliem a progressão de doenças
futuras, e a resposta a terapia periodontal, melhorando assim, o quadro clínico de pacientes
com problemas periodontal. O diagnóstico da fase ativa da doença periodontal e a
identificação de pacientes de risco representa um desafio para a prática e a investigação
clínica.
Nesse sentido, Kaufman & Lamster (2000) realizaram uma revisão da literatura na
qual analisaram a saliva como um método de diagnóstico em potencial para a doença
periodontal. Para esses autores, a saliva é um fluido facilmente disponível e que contem
biomarcadors como: proteínas (ex. enzimas, imunoglobulinas), células do hospedeiro,
hormônios (cortisol), bactérias e produtos bacterianos, bem como marcadores sistêmicos que
podem ser usados como método diagnóstico da doença periodontal. Os autores concluíram
que a análise da saliva pode oferecer uma avaliação que agregue custo-efetividade no
diagnóstico da doença periodontal.
Segundo Koss et al. (2009) a detecção de mudanças na composição química da saliva
pode ser usada para refletir alterações gengivais e periodontais. Os autores tiveram como
objetivo identificar parâmetros salivares que poderiam identificar diferentes estágios da
doença periodontal. A saliva total foi analisada de acordo com suas propriedades químicas e
físicas. Fluxo salivar, pH, capacidade tampão mostraram valores similares em todos os
grupos. A eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilssulfato de sódio
(SDS-PAGE) permitiu a observação de mais proteínas em pacientes com periodontite severa.
46
A presença de imunoglobulina A foi significativamente menor em todos os grupos de doença
periodontal. Um aumento na peroxidase foi detectada nos casos de periodontite moderada e
severa. Foi possível concluir que mudanças quantitativas na composição química da saliva de
pacientes com doença periodontal pode ser significante no diagnóstico e na progressão da
doença periodontal.
Wu et al. (2009) tiveram como objetivo comparar o perfil proteômico da saliva total
não-estimulada de indivíduos com periodontite agressiva generalizada com voluntários
saudáveis. Para tanto, foi coletada saliva não-estimulada de 5 pacientes com periodontite
agressiva e 5 saudáveis e as proteínas foram separadas através da eletroforese bidimensional.
Foram identificadas onze proteínas com diferentes níveis entre o grupo teste e o controle, o
que pode ser útil na compreensão da etiologia da periodontite agressiva.
Embora existam evidências de mudanças na composição protéica da saliva total em
pacientes com periodontite crônica, Gonçalves et al. (2010) se propuseram a comparar o perfil
protéico da saliva total não-estimulada de pacientes com periodontite crônica e saudáveis,
utilizando 2 abordagens complementares ( eletroforese bidimensional e cromatografia
liquida). As análises revelaram que pacientes com doença periodontal tiveram maior
quantidade de proteínas do sangue (albumina e hemoglobina) e imunoglobulina e menor
quantidade de cistatina quando comparados com o grupo controle. Um maior número de spots
de proteína foi observado no grupo com periodontite, das quais a maioria foi identificada
como alfa-amilase, o que pode ser causada pela hidrólise pela cisteína sob tais condições
inflamatórias.
47
3 PROPOSIÇÃO
3.1 Objetivo Geral
Estudar os parâmetros de saliva total humana (STH) de pacientes portadores de PYND.
3.2 Objetivos Específicos
Analisar pH, fluxo salivar e concentração total de proteínas em pacientes com
PYND;
Identificar padrões do perfil proteico de STH em pacientes portadores da
síndrome;
Comparar pH, fluxo salivar e perfil proteico presentes em STH entre pacientes
portadores de PYND e pacientes sadios não-sindrômicos;
48
4 MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho trata-se de um estudo caso-controle, transversal e analítico
realizado após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (COMEPE) da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Cearácom o protocolo no143/08 (Anexo 1).
4.1 População
Para a realização desse estudo foi selecionada uma amostra de conveniência (grupo
teste) composta por 04 (quatro) indivíduos, do sexo feminino, com idade variando de 19 a 22
anos,portadores de picnodisostose. Esses indivíduos foram previamente diagnosticadoscomo
portadores de tal síndrome pelos Serviços de Pediatria e Endocrinologia do Hospital
Universitário Walter Cantídio, da Universidade Federal do Ceará, e cadastrados no Projeto
SEMENTE do Curso de Odontologia da referida Universidade. Como grupo controle,
utilizou-se 04 indivíduos sadios, não-sindrômicos, também do gênero feminino ecom idade
semelhante aos participantes do grupo teste.
Foi quesito básico para a participação no estudo que os indivíduos tanto do grupo teste
como do grupo controle não estivessem utilizando nenhum medicamento até no máximo 15
dias antes da coleta da saliva, além de não possuírem nenhuma outra alteração sistêmica
associada à síndrome.
Após a devida assinatura do termo de consentimento informado (ANEXO 1), pelos
voluntários,foi preenchida uma ficha clínica com base na anamnese e exame clínico
realizados (ANEXO 2).
4.2 Coleta da saliva
As amostras de saliva foram coletadas por um único examinador, pela manhã (entre 9
e 10 horas), para evitar variações induzidas pelo ritmo circadiano. Os indivíduos foram
orientados a realizar higiene oral 2 horas antes da coleta e não ingerir nenhum alimento por
um período mínimo de 2 horas antes do procedimento. No período que antecedeu a coleta das
amostras, pacientes foram orientados a permanecer sentados confortavelmente durante 10
49
minutos para relaxar. Os participantes foram esclarecidos que, durante a coleta da saliva,
evitassem realizar movimentos com a língua, bochecha ou lábios. Após esse período, toda a
saliva produzida era eliminada (expelida ou deglutida) a fim de desprezar os resíduos iniciais.
A partir desse momento, a coleta da saliva não- estimulada foi iniciada no ponto zero, por
exatamente 10 minutos (figuras 14 e 15). Foram feitos ciclos de 2 minutos, nos quais os
participantes mantinham a saliva na cavidade bucal. As amostras de saliva foram coletadas
com micropipeta manual e aliquotadas em tubos tipo Eppendorfsgraduado, com capacidade
para 1,5 mL devidamente identificados. Uma vez coletada, as amostras foram conservadas em
gelo (por um período máximo de 2 horas) e transportadas ao laboratório, onde foram
centrifugadas (centrifuga JANETZKI®) a 7500rpm durante 7 minutos a 32° C.Tal
procedimento visou a separação de partículas contaminantes da saliva, tais como células
epiteliais descamadas, bactérias, células sanguíneas e qualquer resíduo alimentar. Após esse
processo, foi retirado um volume de 200μL do sobrenadante de cada tubo e congelado a -
20°C para posterior liofilização (Figuras 16
e17).
Figura 15- Coleta da saliva não estimulada
realizada após período de repouso
Figura 14- Cânula coletora e tubo do tipo
eppendorf®
Figura 16- Tubos contendo saliva coletada
prontos para iniciar processo de
centrifugação.
Figura 17- Centrifugação
50
4.3 Protocolo Analítico
4.3.1 Mensuração do Fluxo Salivar
O fluxo salivar foi determinado pela relação entre o volume coletado pelo tempo de
dez minutos. A velocidade de secreção salivar foi demonstrada em mililitros por minuto
(ml/min). O valor foi determinado individualmente para todos os participantes de cada grupo.
4.3.2 pH
O pH salivar foi mensurado utilizando o pHmetro portátil digital (DIGIMED DU-
02)no local da coleta da saliva. Antes de iniciar as medições de pH, o pHmetro foi calibrado
com soluções padrões (quais foram as soluções?) de pH nos valores de 6,86 e 4,0.O valor do
pH foi determinado individualmente para todos os participantes de cada grupo.
4.3.3 Análise proteômica da saliva
\4.3.3.1 Determinação das Proteínas Totais
A concentração total de proteínas foi determinada pelo método Bradford (1976), tendo
como reagente o Coomassieblue G250 e a proteína, sero-albumina bovina (BSA )como
padrão para aplotagem dos resultados obtidos com análise das amostras. Todas as amostras
foram submetidas à análise em duplicata.
As amostras para a curva padrão foram constituídas por5μL de albumina diluída em
diferentes concentrações (quais foram as concentrações) + 1,0 mL de solução de Bradford.
Tendo-se aguardado 10 minutos para o início das leituras, que foram feitas em
espectofotômetroUltraspec 1100 (Pharmacia, England).a 595 nmemespectofotômetro. Os
resultados foram expressos em miligrama de proteína por mililitro de saliva (mgP/mL),
calculados com base na curva-padrão com BSA.
Ressuspensão das Amostras
Preparo das Amostras
51
As amostras (1, 2, 3 e 4) liofilizadas foi ressuspendida em 100 μL de água mili-Q e
agitado para homogeneizar as amostras. Após a completa ressuspensão da saliva, o conteúdo
dos eppendorfs®
de todas as amostras dos pacientes portadores de picnodisostose foi
misturado em um único tubo de hemólise (pooldas amostras do grupo correspondente aos
casos). O mesmo procedimento foi realizado para o grupo controle (pool do grupo controle).
Foram misturados: 50 μL do pool das amostras ressuspendida com
250 μL de água mili-Q. Após a mistura, obteve-se 300μL, os quais foram igualmente
distribuídos em 3 tubos de hemólise (cada tubo com 100 μL). Cada tubo de hemólise
contendo o branco (controle da espectofotometria) e com as amostras recebeu 2500μL do
reagente de Bradford. Após 10 minutos deu-se início à leitura no espectofotômetro com grau
de absorbância a 595nm (Figura 18).
Volume: 100μL da amostra + 2500μL do reagente
Branco: 100μL de água mili-Q + 2500μL do reagente
Após o preenchimento das cubetas do espectofotômetro com as amostras, deu-se início
às leituras, conforme descrito abaixo:
Leituras para o grupo controle
AMOSTRAS LEITURAS
"Pool" das amostras 1; 2; 3 e 4
0,497
0,605
0,571
Branco
Figura 18. Amostras ressuspendidas em triplicata + branco
52
As leituras foram realizadas em triplicata de forma a minimizar erros na dosagem total
de proteínas em cada grupo, permitindo uma definição mais segura da quantidade de amostra
necessária a ser usada por grupo.
Diante das leituras, estimou-se 1mL da amostra para obtenção de 400 μg de proteína.
Leituras para o grupo PYCN
AMOSTRAS síndrome LEITURAS
"Pool" das amostras 1; 2; 3 e 4
0,678
0,635
0,662
As leituras também foram realizadas em triplicata de forma a minimizar erros na
dosagem total de proteínas em cada grupo, permitindo uma definição mais segura da
quantidade de amostra necessária a ser usada em cada grupo. Logo, deve-se usar 1mL da
amostra para provável obtenção de 400 μg de proteína no poço.
4.3.3.2 Eletroforese Bidimensional
Análise de eletroforese em gel de poliacrilamida SDS_PAGE
1) Preparo da amostra
Para a análise em gel SDS-PAGE, as amostras liofilizadas foram ressuspensas em 50
µL da solução de solubilização (Tabela 1).
Tabela 1. Componentes da solução de solubilização utilizada para ressuspensão daamostra.
Componentes Quantidade
Uréia7 M 2,104 g
53
Após a ressuspensão, adicionou-se aos 50 µL da solução, 200 µL de solução de re-
hidratação (Tabela 2).
Tabela 2. Componentes da solução de rehidratação
Componentes Quantidade
Uréia8 M 2,402 g
CHAPS 2% 0,1 g
IPG Buffer 3-10 2% 100µL
Azul de Bromofenol 1% 0,05 g
Água mili-Q 5mL
4.3.3.2.1 Focalização Isoelétrica
A Focalização Isoelétrica (IEF), segunda etapa da 2DPAGE,é o procedimento
empregado para determinar o ponto isoelétrico (pI) de uma determinada proteína. Um
gradiente de pH é estabelecido em um gel através da distribuição de uma mistura de
moléculas orgânicas anfóteras (ácidos e bases) de baixo peso molecular, sob ação de um
campo elétrico. Quando uma mistura protéica é aplicada a esse gel, cada proteína migra até
atingir o pH que coincide com o seu pI. Proteínas com diferentes pIssão, portanto, distribuídas
diferentemente através do gel (Alfenas, 1998). Desta forma, as proteínas migram em direção à
sua carga até atingir uma posição neutra, denominada de repouso. A combinação da
Tiouréia2 M 0,7612 g
CHAPS 2% 0,1 g
IPG Buffer 3-10 2% 100µL
DTT 0,3 % 0,015 g
Água mili-Q 5mL
54
Focalização Isoelétrica (IF) com a SDS PAGE em um gel bidimensional, resulta num método
eficiente para a separação de uma mistura complexa de proteínas. Este método analítico
combinado é muito mais sensível que qualquer um dos dois (IEF e SDS-PAGE) empregados
isoladamente. A eletroforese bidimensional separa proteínas de idênticos pesos moleculares,
porém com distintos pontos isoelétricos (pIs), ou então, proteínas de mesmo pI, mas com
pesos moleculares diferentes (Alfenas, 1998).
A isoeletrofocalização das proteínas foi realizada em equipamento
IPGphordaAmershamBiosciences (Figura 18). A IF foi conduzida em tiras (strip) IPG, com
gradiente imobilizado de pH em gel de poliacrilamida fixado em plástico. As faixas de pH
utilizadas foram 3 – 7 NL em STRIP de 7 cm.
A solução foi aplicada no sarcófago (tipo de suporte da IF) e em seguida foi removida a
fita plástica protetora,posicionadas com o gel voltado para baixo no STRIP Holdere recoberto
com 2 mL de óleo mineral (―DryStrip Cover Fluid”). A re-hidratação foi feita no
equipamento IPGphordurante 12 horas. A isoeletrofocalização foi iniciada logo após o
término da rehidratação e ocorreu em 3 etapas (fase 1: 300 V, 2mA, 5W, 0:01h; fase 2:
3500V, 2mA, 5W, 1:30h; fase 3: 300V, 2mA, 5W, 5:00h) Após a IEF, a stripfoi armazenada
em tubo de vidro e congelada a –80 ºC para posterior aplicação no gel de eletroforese (Figura
19 A e B).
Figura 19 A e B- Equipamento IPGphorda Amersham Biosciences
A B
55
4.3.3.2.2 Equilíbrio da Strip
Após a isoeletrofocalização a stripfoi equilibrada em 5mL de solução tampão ou
solução de equilíbrio base (Tabela 3), mantida em repouso por 15 minutos, sendo a mesma em
seguidadescartada. O segundo passo consistiu na imersãodastrip numa solução composta por
5mL da solução de equilíbrio + 0,05 g de DTT, onde a strip permaneceu por mais 15 minutos
e em seguida, colocou-se a strip numa solução composta por 5 mL da solução de equilíbrio +
0,125 g de iodoacetamida, durante 15 minutos (Figura 20 A e B).
Tabela 3. Componentes da solução de equilíbrio usadas para equilibrar a strip.
Componentes Quantidade
Tris_HCl 1,5 M pH 8,8 50mM 3,4 mL
Uréia6 M 36,04 g
Glicerol (87%) 34,5 mL
SDS 2 g
Azul de Bromofenol 1% 200 µL
Água mili-Q 100 mL
Figura 20 A e B- Equilíbrio das strips.
A B
56
Ao término do período de incubação em solução de equilíbrio, a stripfoi retirada e
aplicada imediatamente no gel de poliacrilamida na presença de SDS para a eletroforese de
segunda dimensão.
4.3.3.2.3 SDS/PAGE (2ª Dimensão)
A separação das proteínas através dos pesos moleculares foi conduzida segundo
Laemmli (1970). Em gel de poliacrilamida, em um sistema descontínuo, usando gel de
concentração a 5% e gel de separação a 12,5%. As amostras liofilizadas foramreconstituídas
com água mili-Q (10 g/1) sob condições desnaturantes (tampão da amostra contendo SDS e-
mercaptoetanol). Após o término da corrida, o gel foifixado por 30 minutos na solução
fixadora (Ácido Tricloroacético 10%). Em seguida, o gel foi corado com Coomassieblue por
1 hora. Sendo a amostra então descorada pela solução descorante (ácido acético5%, 150 ml;
metanol 10%, 300 ml; H2O 2550 ml) durante a noite. O gel descorado foisecado por 24 horas
com a solução de secagem (metanol 50%, 100 ml; glicerol 6%, 6 ml; H2O bidestilada para
completar 200 ml).
Figura 22- Aplicação do marcador Figura 21- Marcador protéico
57
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram tabulados no programa Excel (Windows 2010) e submetidos a
analise descritiva e aos seguintes testes estatísticos: teste de normalidade de Kolmanov-
Smirnov, teste t de Student e teste de Mann-Whitney pelo programa Bioestat for WindowsTM
versão 5.0.
O teste de normalidade de Kolmogov-Smirnov foi realizadopara verificar a
normalidade (homogeneidade) das amostras, acusando normalidade dos dados entre os grupos
experimental e controle em função das variáveis: velocidade do fluxo de saliva total
estimulada, pH e concentração de proteínas totais (p>0,05), e uma distribuição assimétrica
Figura 23 – Gel em solução corante
Figura 24- Gel em solução descorante
Figura 23 A e B- Cuba e fonte eletroforética.
Figura 25- Gel em solução corante
58
quando se considerou os dados obtidos pela análise bidimensional dos géis. Para as variáveis
paramétricas (velocidade do fluxo de saliva total estimulada, pH e concentração de proteínas
totais) o teste realizado foi o t de Student, considerando-se um nível de significância de 95%
(p <0,05). Para a comparação da massa molecular obtida na eletroforese (variável não-
paramétrica) realizou-se o teste de Mann-Whitney, também a um nível de probabilidade de
p<0,05.
59
5 RESULTADOS
Nesse estudo foram coletadas e avaliadas as amostras de saliva total não-estimulada de
4 pacientes portadores de Picnodisostose e 4 paciente sadios (grupo controle), pareados em
sexo e idade para se ter uma amostra dependente, a fim de reduzir a variabilidade entre os
grupos e aumentar o intervalo de confiança (Tabela 4).
Tabela 4- Estatística descritiva da idade e sexo, segundo os grupos experimental e controle.
GRUPO N Sexo Idade
Experimental
(PYCN)
4 Feminino
19
19
20
22
Controle 4 Feminino
19
19
20
22
Fonte: dados da pesquisa
Os valores médios e desvios-padrão dos parâmetros bioquímicos da saliva: fluxo
salivar não estimulado, pH e concentração de proteína total, tanto no grupo controle
(indivíduos saudáveis) como no grupo teste (indivíduos portadores de picnodisostose) são
mostrados na Tabela 5. Após a aplicação do teste t de Student foi possível observar diferença
estatisticamente significativa entre os grupos para as acima mencionadas variáveis (p<0,05).
60
Tabela 5 – Parâmetros salivares distribuídos conforme os grupos. Os valores expressam a média ±
desvio padrão.
Parâmetros
salivares Grupos
Teste (PYCN) Controle
pH 7.06 (± 0,07) a 7.21 (0,02) b
Fluxo salivar 0.345 mL/min (±0,05) a 0.215 mL/min (± 0,04) b
Proteína Total 0.658 mg/mL (±0,02) a 0.558 mg/mL (± 0,06) b
Valores médios seguidos por letras distintas (sentido horizontal) diferem
estatisticamente entre si (p<0,05)
As variáveis dos parâmetros: pH, fluxo salivar e concentração total de proteínas são
mostradas isoladamente nos Gráficos 1, 2 e 3.
Ao analisar o pH foi possível observar uma variação de 7.01 a 7.16 para o grupo
experimental e de 7.19 a 7.24 para o grupo controle, observando valores de pH
estatisticamente inferiores para o grupo experimental (p<0,05) (Gráfico 1).
Gráfico 1: Valores médios do pH da saliva
Em relação ao fluxo salivar não-estimulado, o grupo experimental apresentou maior
média que o grupo controle, sendo essa diferença estatisticamente significante (p <0,05). A
variação do fluxo salivar no grupo experimental foi de 0.18 a 0.27 mL/min (média = 0.215),
enquanto que no grupo controle foi de 0.29 a 0.39 mL/min (média= 0.345) (Gráfico 2).
6,95
7
7,05
7,1
7,15
7,2
7,25
Grupo experimental (PYCN) Grupo controle
pH
61
Gráfico 2: Média do fluxo salivar não-estimulado
A concentração total de proteínas foi dosada em triplicata, considerando-se nesse
momento o pool das amostras e não mais as amostras individuais (Tabela 6). O pool do grupo
experimental apresentou maior concentração de proteínas que o grupo controle (Gráfico 3),
diferença esta, considerada estatisticamente significativa (p< 0,05).
Tabela 6. Concentração total de proteínas obtida em triplicata para cada pool.
Concentração total de proteínas
Pool - Grupo experimental
(PYCN) Pool - Grupo controle
Leitura1 0.678 mg/mL 0.497 mg/mL
Leitura2 0.635 mg/mL 0.605 mg/mL
Leitura 3 0.662 mg/mL 0.571 mg/mL
Gráfico 3. Média da concentração total de proteínas em ambos os grupos
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
Pool - Grupo experimental (PYCN) Pool - Grupo controle
Concentração total de proteínas
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Grupo experimental (PYCN) Grupo controle
Fluxo salivar não-estimulado
62
A análise dos géis de eletroforese bidimensionais permite a contagem do número de spots
coma caracterização automática dos valores de pI e massa molecular como mostrado na tabela
7 (Grupo controle) e 8 (grupo experimental).
Tabela 7. Determinação do Ponto Isoelétrico (PI) e Massa Molecular (MM), expressa em kDa,
para cada spot identificado no gel do grupo controle
Grupo controle
SpotID PI
MM
(KDa) SpotID PI
MM
(KDa)
3105 4,312 212 3165 4,405 46
3106 9,907 203 3167 3,592 45
3119 5,101 104 3173 5,995 37
3123 3,615 99 3176 3,522 35
3124 3,940 98 3180 5,647 25
3128 6,065 92 3181 4,370 25
3131 4,753 90 3184 5,461 25
3133 3,952 90 3185 3,952 25
3137 6,146 81 3186 3,615 25
3145 9,385 68 3188 6,111 25
3148 7,400 62 3190 7,226 25
3152 9,373 51 3192 8,433 24
3158 7,307 46 3194 8,027 24
3159 6,100 46 3197 7,446 22
3161 6,784 46 3200 9,466 18
3163 5,217 46 3201 3,430 18
3164 5,461 46 3219 5,658 14
63
Tabela 8. Determinação do Ponto Isoelétrico (PI) e Massa Molecular (MM), expressa em kDa,
para cada spot identificado no gel do grupo experimental
Grupo experimental
SpotID PI
MM
(KDa) SpotID PI
MM
(KDa) SpotID PI
MM
(KDa) SpotID PI
MM
(KDa)
301 7,844 265 608 8,053 44 763 3,966 29 893 4,907 14
320 7,707 128 613 6,025 43 766 7,474 30 894 8,689 15
334 8,093 142 616 6,685 43 770 7,956 30 900 6,098 14
350 5,052 123 625 8,375 42 775 6,452 29 901 6,162 14
358 5,245 112 630 5,631 42 776 7,095 29 905 9,389 14
369 5,864 108 632 8,721 41 777 9,010 29 906 8,664 14
372 6,267 104 635 5,679 41 779 5,510 28 908 8,246 14
387 3,426 95 643 8,141 39 789 7,015 27 909 6,331 14
416 4,279 85 644 8,077 39 793 9,397 27 910 9,389 14
417 8,157 86 649 4,078 38 796 7,152 26 912 5,438 14
422 7,618 86 650 7,876 38 797 7,361 26 913 6,822 14
433 7,079 85 661 7,120 38 811 5,575 25 915 4,859 13
437 5,213 83 666 7,876 37 812 2,823 25 916 4,561 13
461 6,234 82 673 5,969 37 813 5,454 25 921 9,002 13
494 5,261 68 674 7,892 37 814 5,003 24 923 9,356 13
523 5,591 60 677 8,375 37 826 5,623 22 924 9,187 13
525 8,005 62 679 7,538 37 833 3,756 21 927 7,393 13
526 8,149 61 683 6,725 36 835 3,845 20 928 8,520 13
527 8,737 61 684 4,883 36 836 8,520 20 929 9,324 12
531 7,634 65 691 6,725 35 839 5,277 19 931 7,111 12
550 8,109 56 700 7,715 35 840 8,672 19 933 7,514 12
554 7,626 52 706 3,233 34 841 8,302 19 936 7,401 12
557 4,529 53 708 9,509 34 845 7,940 18 939 7,506 12
559 8,141 51 709 7,168 34 846 6,082 18 944 6,967 12
564 4,086 52 710 9,260 34 852 5,993 17 957 5,414 11
571 7,932 51 714 5,100 33 857 7,240 17 958 8,962 11
573 8,037 50 717 8,415 33 859 3,515 16 963 6,355 11
579 7,884 50 731 7,256 31 860 7,401 16 965 5,454 11
588 8,664 47 737 6,210 31 869 5,341 16 971 5,398 10
591 5,366 46 742 5,277 30 871 4,617 16 972 5,478 10
593 8,013 46 743 6,436 30 878 5,317 15 973 9,461 10
595 3,249 46 744 3,531 30 879 9,332 15 975 5,414 10
598 3,901 46 747 7,095 30 883 2,582 15 1157 9,107 87
599 4,287 45 753 7,063 29 884 4,480 15 1158 9,751 79
602 7,643 45 757 5,728 29 889 9,389 15 1159 8,616 86
604 6,259 44 761 2,871 29 890 7,691 15 1161 8,045 39
64
O número de spots identificados foi em média 34 spots no grupo controle,enquanto que no
grupo de portadores de picnodisostose, 144 spots foram evidenciados (Gráfico 4).
Gráfico 4. Quantidade de spots evidenciados em ambos os grupos.
Através da comparação dos géis bidimensionais foi possível observar variações
estatisticamente significativa (p< 0,05) entre os grupos na faixa de pH de 3 a 10. Pela curva
de relação entre os grupos notamos que o grupo controle apresenta maior média de massa
molecular das proteínas do que o grupo experimental (Gráfico 5).
Gráfico 5: Médias e erro padrão da massa molecular (kDa) entre ambos os grupos.
CONTROLE SINDROMICO
MM
( k
Da)
0
20
40
60
80
100
*
*Teste de Mann-Whitney: diferença estatística em relação ao grupo controle (p<0,05)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Grupo experimental (PYCN) Grupo controle
Quantidade de spots
65
Dentre os 34 spots identificados no grupo controle, observou-se uma variação entre 14
a 212 KDa da massa molecular, com 64,7% apresentando valores menor que 50 KDa (Gráfico
6).
Gráfico 6: Histograma de distribuição de spots do grupo controle de acordo com sua massa molecular
(MM) e o número de spots.
MM( kDa)
0 50 100 150 200
Qu
anti
dad
e d
e sp
ots
0
2
4
6
8
10
12
14
Já no grupo de pacientes portadores de picnodisostose, os spots apresentaram-se com
massa molecular variando de 10 a 265 KDa, com 79,16% apresentando massa molecular
menor que 50 KDa, observando-se um diminuição acentuada do número de spots com maior
massa molecular (Gráfico 7).
Gráfico 7: Histograma de distribuição de spots do grupo sindrômico de acordo com sua massa
molecular (MM) e o número de spots.
MM (kDa)
0 50 100 150 200 250
Qua
ntid
ade
de s
pots
0
10
20
30
40
50
60
sindromico
66
A distribuição dos spots também pode ser observada no Gráfico 8, o qual permite uma
comparação entre o perfil protéico dos grupos, confirmando a predominância de spots com
menor massa molecular em ambos os grupos, sendo essa ainda mais acentuada no grupo
sindrômico.
Gráfico 8: Distribuição das massas moleculares (KDa) nos grupos controle e sindrômico.
MM
CONT
MM
SIN
D
0
100
200
300
MM
( kD
a)
Em relação aos pontos isoelétricos observa-se um aumento no pH no grupo sindrômico,
o que significa que este grupo,em média, apresenta proteínas com pH mais ácido do que o
controle (Gráfico 9).
Gráfico 9: Médias dos pontos isoelétricos (pH) com erro padrão entre os grupos controle e sindrômico.
CONTROLE SINDROMICO
pH
4-1
0
4
5
6
7
8
9
10
*
**Teste de Mann-Whitney: diferença estatística entre os grupos (p<0,05)
69
6 DISCUSSÃO
A Picnodisostose é uma displasia esquelética de etiologia genética, rara com
aproximadamente 200 casos descritos na literatura mundial, estimando-se uma incidência de
1,7: 1.000.0000 de nascidos (KATO et al., 2005). Estudos demonstraram ser essa displasia
decorrente de defeitos no gene codificador da catepsina K, localizado no cromossomo 1q21,
resultando em deficiência na atividade dessa enzima, que faz parte da família de proteases de
cisteína (GELB et al., 1996).
A catepsina K se expressa nos osteoclastos e media o papel destes na reabsorção da
matriz de colágeno tipo I, alterando todo o processo de remodelação óssea, o que resulta em
um aumento generalizado da densidade e do volume dos ossos, esclerose, fragilidade e,
conseqüente maior predisposição a fraturas ósseas conforme descrito em estudos de
O’Connel, Brennan & Francomano (1998). Essa condição foi também verificada por Schilling
et al. (2007) por meio de um estudo caso-controle, evidenciando o aumento da densidade
volumétrico dos ossos no grupo sindrômico (686 mg/cm) quando comparados com um grupo
controle (290 mg/cm).Em decorrência desse aumento na densidade óssea, observa-se também
uma redução no padrão de vascularização dos ossos, o que parece justificar a maior
predisposição a quadros de osteomielite. As características clinicas observadas em pacientes
com picnodisostose tem sido relatada por inúmeros autores como por exemplo, Fonteles et al.
(2007) que relataram 4 casos, descrevendo como principais achados orais, condições como:
mordida aberta, palato ogival, protrusão lingual, retenção de dentes decíduos, anodontia
parcial, alterações morfológicas dentárias, pobre higiene oral, cáries dentárias e doença
periodontal.
Com o aumento do reconhecimento da relação entre saúde oral e geral, as atenções
foram voltadas para a saliva como um fluido diagnóstico para uma diversidade de doenças. A
utilização da saliva no lugar de sangue ou urina para exames diagnósticos apresenta uma série
de benefícios. representados por uma coleta fácil, indolor, não invasiva, que causa menos
ansiedade ao paciente, pelo baixo custo para armazenar e transportar bem como pelo fato de
oferecer menor risco de contaminação para o operador quando do manuseio da mesma
(DOUGLAS et al., 1998).
Ao se estudar saliva como meio de diagnóstico, considera-se necessário distinguir seu
uso para o diagnóstico da doença, verificar suscetibilidade à doença, identificar componentes
normais à saliva em concentrações anormais e detectar constituintes não usuais (DAWES,
1993). Na odontologia, a monitorização salivar tem sido principalmente usada para verificar
70
atividade de cáries, doença periodontal, xerostomia, doenças inflamatórias e tumorais das
glândulas salivares (KAUFMAN & LAMSTER, 2000). Moura et al. (2007) citam que dentre
as diversas possibilidades de uso da saliva como meio de diagnóstico, a sua utilização nas
medidas de risco de cárie utilizando parâmetros como mensuração do fluxo salivar,
capacidade tampão, potencial hidrogeniônico (pH) e contagem de microorganismos. Porém,
os avanços nos métodos de análise já tomam outras proporções de modo a propiciar uma
extensão na aplicabilidade de outros métodos de análises salivares ampliando as
possibilidades de diagnósticos.
Para Schipper et al. (2007) uma nova e promissora abordagem no estudo da saliva, é a
análise global das proteínas salivares usando as técnicas de análise proteômica, como nos
estudos realizados por Wu et al. (2009) e Gonçalves et al. (2010) que tiveram como variável
pacientes com doença periodontal. Tal avaliação do perfil protéico da saliva irá tanto
melhorar o conhecimento sobre a fisiologia oral, como também permitirá a identificação de
novas proteínas e a identificação de mudanças nos níveis protéicos frente a diferentes
condições fisiológicas ou estados patológicos.
No presente estudo, nos propusemos a analisar alguns parâmetros salivares orgânicos
de indivíduos portadores de picnodisostose (grupo experimental), comparando-os com
indivíduos não-sindrômicos, a fim de entender possíveis diferenças causadas pela falha
genética o qual resulta nesta síndrome. Para a análise do fluxo salivar, uma variedade de
protocolos clínicos e experimentais são requeridas, e a sua importância está no fato de que ela
pode nos dar uma idéia da qualidade da saúde, não só oral, mas também sistêmica (LEITE;
MAMEDE & LEITE, 2002). Sabe-se ainda que a composição da saliva sofre muitas
alterações devido a vários fatores fisiológicos e não-fisiológicos, como: ritmo circadiano,
natureza e duração do estímulo, condições da higiene bucal, tipo de dieta alimentar, uso de
medicamentos, etc. (DAWES, 1993). Daí a necessidade de tomar medidas cautelares no que
diz respeito a realização da coleta, tais como as seguidas nesse estudo: amostra sempre
colhida entre 8 e 10 horas da manhã para reduzir a interferência do ciclo circadiano em cada
participante; indivíduos de ambos grupos, do mesmo gênero e idade, foram alertados para não
comer, beber, mascar chiclete, fazer exercícios, fumar ou escovar os dentes por 2 horas antes
da coleta, estando os mesmos sentados de forma ereta e relaxada.
O presente trabalho encontrou diferença estatisticamente significativa entre o fluxo
salivar de pacientes portadores de picnodisostose (0,215 mL/ min) em relação ao grupo
controle (0,345 mL/ min). De acordo com os critérios estabelecidos por Dawes (2004), o
grupo experimental apresentou baixo fluxo salivar (hipossalivação) enquanto que o grupo
71
controle apresentou um fluxo considerado normal. O fluxo salivar diminuído no grupo de
pacientes portadores de picnodisostose pode, segundo Daniels e Fox (1992), estar relacionado
com o maior índice de cáries nesse grupo. Os resultados corroboram parcialmente com
Siqueira Jr (2004) que analisou parâmetros salivares de indivíduos portadores de síndrome de
Down concluindo que o fluxo salivar apresentou-se reduzido nesses indivíduos. Apesar da
velocidade do fluxo salivar estar reduzida nos indivíduos portadores de picnodisostose,
nenhum paciente examinado relatou sensação de boca seca diariamente, nem mesmo
disgeusia, disfonia, ingestão freqüente de líquidos ou sede excessiva.
As opiniões dos pesquisadores são ligeiramente divergentes quanto ao pH de repouso
da saliva. Em 1944, Loesche verificou que os indivíduos, cujo pH de repouso da saliva era
igual ou maior que 7,0, apresentavam-se livres da cárie, enquanto na saliva dos pacientes com
atividade positiva de cárie o valor do pH era menor que 7,0. Para Edgar (1996), o pH de
repouso da saliva em humanos deve manter-se entre 5,0 e 8,0. A amostra dos 2 grupos aqui
estudados consistiram em indivíduos adultos jovens (19 a 22 anos), tendo sido encontrado um
pH médio do grupo controle de 7,21 e 7,06 no grupo experimental, o que se assemelha com os
resultados de Magalhães et al (2001), que verificou os níveis de pH salivar em pacientes
adultos jovens constatando uma variação entre 5,6 e 7,6, (média de 6,9). Não foi encontrado
na literatura estudos com um padrão de normalidade para o pH em pacientes com
picnodisostose, o que dificulta a comparação dos dados com os de outros trabalhos, assim,
embora tenha sido observada uma diferença estatística entre as amostras, acredita-se que esta
não seja clinicamente relevante, uma vez que a média do pH de repouso de ambos os grupos
se encontrava dentro dos parâmetros de normalidade citados na literatura.
Em relação a concentração total de proteínas, o grupo com picnodisostose apresentou
menor concentração (0.558 mg/mL) em relação ao grupo controle (0.658 mg/mL), sendo essa
diferença estatisticamente significativa (p<0,05). Da mesma forma dos outros parâmetros
avaliados, a comparação com os dados da literatura é dificultado pela ausência de estudos cuja
população se trata de pacientes com picnodisostose. Siqueira (2004) realizou um estudo
avaliando fluxo salivar, pH, capacidade tampão e concentração de proteína total dentre outros
fatores em saliva total de indivíduos com síndrome de Down com idades variando de 1 a 25
anos. Os pacientes foram divididos em 5 grupos (1 a 5; 6 a 10; 11 a 15; 16 a 20 e 21 a 25
anos). Os resultados obtidos revelaram uma redução no fluxo salivar, pH e capacidade tampão
e um aumento na concentração de proteína total, sendo tais diferenças mantidas mesmo com a
aumento da idade. De acordo com tal estudo, a maior concentração de proteína pode estar
72
relacionada com o menor fluxo salivar no grupo sindrômico, sendo, neste caso, o grupo
sindrômico referente à Síndrome de Down.
Para Perinpanayagam et al., (1995) peptídeos de baixo peso molecular encontrados na
saliva são formados a partir da atividade proteolítica ocorrida nesse meio. Siqueira Jr (2006)
ao avaliar os parâmetros salivares em pacientes portadores de doença periodontal relatou que
o grupo com periodontite crônica apresentou menor concentração (p<0,05) em relação ao
grupo controle, o que conforme o autor pode estar ligado à atividade proteolítica acentuada
que ocorre em condições patológicas periodontais, o que vem a corroborar com os resultados
encontrados, visto que pacientes com picnodisostose têm sido constantemente caracterizados
por apresentarem doença periodontal (FONTELES et al., 2007; SHILLING et al., 2007).
A comparação do perfil protéico salivar é difícil de ser realizada em virtude das
diferenças existentes na origem da saliva estudada, faixa etária dos grupos estudados, métodos
de análises, variáveis analisadas, etc. Para analisar com mais fidelidade os componentes
protéicos salivares, Ghafouri et al. (2003) enfatiza a utilização da eletroforese bi-dimensional
para separar os componentes protéicos, sendo em seguida, quando possível, realizada a
espectrometria para identificar os peptídeos de interesse. Nesse estudo realizou-se a
eletroforese bidimensional, onde foi possível observar diferentes padrões de peptídeos nos 2
grupos avaliados (p<0,05). No grupo controle foram observados 34 spots protéicoscom massa
molecular variando de 14 a 212 kDa, enquanto que no grupo experimental foram
evidenciados 144 spots com variação da massa entre 10 e 265 kDa. Embora uma maior
quantidade de spots observados no grupo experimental, a média da massa molecular no grupo
controle foi maior.
Comparando os grupos entre si foi possível observar que 73,52% das bandas protéicas
evidenciadas no grupo controle também foram evidenciadas no grupo experimental. No
entanto, ao considerar as bandas protéicas com massa molecular menor que 68 kDa foi
possível verificar grandes faixas de bandas com massa molecular exclusivas do grupo
experimental (por ex. S706 [MM=35kDa] ao S797 [MM=26kDa]). Acima de 68 kDa, o grupo
controle apresentou 9 bandas protéicas e o grupo experimental 17, presentes exclusivamente
em cada grupo.A banda protéica mais freqüentemente observada no grupo controle
apresentou massa molecular igual a 25 kDa, enquanto que no grupo experimental a massa
molecular mais prevalente correspondeu a 14 kDa, seguido pela banda protéica com 13 kDa,
15 kDa e 29 kDa, não estando estas últimas presentes no grupo controle. Para Tang et al
(2003) bandas de proteínas com 18 kDa, 15 kDa e 13 kDa podem estar estreitamente
relacionadas com a ocorrência e recorrência de periodontites.
73
Os resultados aqui mostrados permitem inferir que a saliva é um fluido capaz de
demonstrar alterações sistêmicas, como evidenciado entre pacientes com picnodisostose e
indivíduos saudáveis. Alem disso, é relevante mencionar a facilidade da coleta deste fluido,
sem injúrias ao paciente. No entanto, a escassez de estudos na literatura dificultaram a
discussão dos resultados obtidos, o que mostra a necessidade da realização de mais pesquisas
usando a saliva como meio diagnóstico, além de estudos mais aprofundados, que permitam a
identificação dos peptídeos e sua correlação com a saúde oral.
74
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O grupo PYCN apresentou baixo fluxo salivar
Ambos os grupos apresentaram média de pH de repouso dentro dos parâmetros de
normalidade
O grupo PYCN apresentou menores valores de pH e fluxo salivar em relação aos
pacientes sadios não-sindrômicos;
O grupo PYCN apresentou valores aumentados de concentração total de proteínas
em relação ao grupo de pacientes sadios não-sindrômicos;
O grupo PYCN apresentou um padrão diferenciado no que se refere a quantidade de
spots, além de variação e distribuição da massa molecular dos mesmos em relação
ao grupo de pacientes sadios não-sindrômicos;
75
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91
ANEXO 1
92
ANEXO 2
FICHA DE ANAMNESE
DADOS PESSOAIS
NOME _________________________________________________________________________
IDADE _______ DATA DE NASCIMENTO _______________________________________
NOME DO PAI
__________________________________________________________________
NOME DA MÃE
_________________________________________________________________
RESPONSÁVEL LEGAL
__________________________________________________________
ENDEREÇO _____________________________________________________________________
TELEFONE PARA CONTATO
_____________________________________________________
NOME DA ESCOLA
______________________________________________________________
ENDEREÇO DA ESCOLA
_________________________________________________________
93
ESTADO DE SAÚDE GERAL DA CRIANÇA
FAVOR LER E RESPONDER COM ATENÇÃO.
1) O seu filho ou filha se encontra sob tratamento médico? SIM NÃO
Para que? Caso a sua resposta tenha sido SIM.______________________________
2) O seu filho ou filha tem alguma doença crônica? SIM NÃO
Qual? Caso a sua resposta tenha sido SIM. _________________________________
3) O seu filho ou filha está tomando algum remédio? SIM NÃO
Quais? Caso a sua resposta tenha sido SIM. ________________________________
4) O seu filho ou filha tem algum tipo de alergia? SIM NÃO
A que? Caso a sua resposta tenha sido SIM. ________________________________
5) O seu filho ou filha esteve recentemente hospitalizado? SIM NÃO
Para que? Caso a sua resposta tenha sido SIM. ______________________________
Afirmo que as informações acima são verdadeiras.
Data:__________________
Assinatura:____________________________________________
94
ANEXO 3
FICHA DE EXAME DENTÁRIO
NOME DA CRIANÇA ___________________________________________________
IDADE _______ DATA DE NASCIMENTO ________________________
DATA _____________________
EXAME EXTRA-ORAL
LINFADENOPATIA: PRESENTE AUSENTE
ASSIMETRIA FACIAL POR INFECÇÃO: PRESENTE AUSENTE
EXAME INTRA-ORAL
TECIDOS MOLES: NORMAIS PATOLÓGICOS
EXAME DENTÁRIO
55 54 53 52 51 61 62 63 64 65
95
85 84 83 82 81 71 72 73 74 75
Cor vermelha – corresponde a superfícies cariadas
Cor azul – corresponde a superfícies restauradas
X – corresponde a superfícies ausentes devido à cárie
COMENTÁRIOS: __________________________________________________________
96
ANEXO 4
TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO
―ESTUDO DE PARAMETROS SALIVARES EM PACIENTES PORTADORES DE
PICNODISOSTOSE”
Você ou seu filho (a) está sendo convidado a participar de um projeto de pesquisa. Sua
participação é importante, porém, não deve haver participação contra vontade própria. Leia
com atenção as informações abaixo, sentindo-se livre para fazer qualquer pergunta que
desejar, para que não haja dúvida alguma sobre os procedimentos a serem realizados.
Ao assinar este termo que consta de seu nome (ou responsável), você estará
declarando que por meio de livre e espontânea vontade sua, estará participando como
voluntário do projeto de pesquisa citado acima, de responsabilidade do Cirurgião-Dentista
Jose Luciano Pimenta Couto da Faculdade de Odontologia, da Universidade Federal do
Ceará. O abaixo-assinado estará ciente que:
a) O objetivo da pesquisa é verificar se existe alguma diferença entre a saliva de um
paciente portador de picnodisostose, quando comparado com um paciente que não seja
portador dessa síndrome.
b) Durante o estudo você deverá fornecer informação sobre o seu (ou do paciente)
estado geral de saúde. A participação neste estudo consistirá de um momento onde será feito
um exame dentário e coletada a amostra da saliva utilizada para analise.
c) Essa coleta de saliva não ocasionará DOR. Duas amostras de saliva serão colhidas
conforme segue:
A primeira consistirá apenas da coleta da saliva já presente na sua boca (ou do
paciente) com o uso de uma pequena cânula (semelhante a um pequeno pedaço de borracha),
enquanto o paciente se encontra em repouso. Para que seja feita a coleta é preciso que o
paciente esteja em jejum por no mínimo 3 horas, e que tenha escovado os dentes uma hora
antes da consulta.
Na segunda coleta, o paciente terá sua saliva coletada durante 10 (dez)
minutos, devendo ser esse volume analisado posteriormente.
d) O paciente NÃO RECEBERÁ INJEÇÃO de anestésico local.
97
e) Essa saliva após recolhida será analisada para que se possa verificar as suas
características, alem do tipo de proteínas e peptídeos encontrados.
f) Você tem a liberdade de desistir ou interromper a sua participação (do seu filho
ou filha) neste estudo no momento que desejar, sem necessidade de qualquer explicação.
g) A participação neste estudo lhe dá o direito (do seu filho ou filha) ter, sem
custos, tratamento dentário, profilaxia (limpeza dos dentes) e aplicação tópica de flúor para a
prevenção, evitando novas cáries.
h) Os resultados obtidos durante este estudo serão mantidos em sigilo. O Curso de
Odontologia da UFC não identificará você (ou seu filho (a)) por ocasião da exposição e/ou
publicação dos resultados desta pesquisa.
i) É condição indispensável para participação no estudo que o paciente (seu filho
ou filha) não tenha nenhuma doença crônica (não associada à síndrome) e, portanto, não
esteja no momento sob tratamento médico ou fazendo uso crônico de drogas ou medicações.
j) O surgimento de resfriados ou viroses, com conseqüente uso de medicações
por período de tempo limitado, não exclui o paciente (seu filho ou filha) do estudo.
k) Caso venham a surgir dúvidas ou perguntas, sinta-se livre para contatar o
Cirurgião-Dentista. Jose Luciano Pimenta Couto (responsável pelo projeto) na Faculdade de
Odontologia (sala 1), rua Monsenhor Furtado, s/n, Rodolfo Teófilo ou no telefone 3366
8408. Pode-se ainda contatar o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do
Ceará no telefone 3366 8338.
Fortaleza, _________________________________________
Nome Completo: ___________________________________
Assinatura Voluntário ou Responsável:____________________________________________
Testumunha 1:____________________________________________
Testemunha 2:____________________________________________
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Jose Luciano Pimenta Couto
Responsável pela Pesquisa
