22

IV. Hasil dan Pembahasan

A. Sampling dan Isolasi Bakteri

Bakteri dalam penelitian ini diisolasi dari Acropora

nasuta (Gambar 2) hasil sampling di Taka Cemara,

Karimunjawa, Jepara yang secara geografis berada pada

0,5’ 49’ 33,6” lintang selatan dan 110’ 25’ 25,9” bujur

timur. Pigmen berwarna kuning dihasilkan setelah 24

jam masa inkubasi pada suhu 35°C di media Zobell

2216E Agar (Gambar 3).

Gambar 2. Acropora nasuta hasil sampling di Taka Cemara, Karimunjawa, Jepara.

23

A B

Gambar 3. Koloni bakteri hasil kultur pada Media Zobell 2216E Agar (a) dan Zobell 2216E cair (b).

Sedangkan hasil pengamatan menggunakan

mikroskop binokuler dengan perbesaran 1000×

ditunjukkan pada Gambar 4. Pengamatan mikroskopis

menunjukkan bahwa bakteri tersebut berbentuk coccus.

Setelah dilakukan pengecatan gram dengan metode

gram staining, terjadi perubahan warna koloni menjadi

merah, sehingga diketahui bahwa bakteri berjenis gram

negatif.

Gambar 4. Hasil pengamatan koloni bakteri

menggunakan mikroskop binokuler.

24

B. Polymerase Chain Reaction 16S rDNA

Hasil pengecekan terhadap PCR 16S rDNA

menunjukkan hasil positif dengan terdapatnya berkas

DNA isolat bakteri dengan panjang basa yang sesuai yaitu

sekitar 1.500 bp (Gambar 5).

Gambar 5. Elektroforesis PCR 16s rDNA. M: Marker ; (+): positif

kontrol; KJ5: Berkas DNA bakteri yang diisolasi dari Acropora

nasuta dengan panjang basa 1.500 bp.

C. Analisis Data BLAST Homologi

Dari analisis sekuensing didapatkan susunan basa

parsial 16S rDNA isolat bakteri dan kemudian

dibandingkan dengan sekuen DNA pada basis data (data

base) DNA (Altschul dkk., 1997). Hasil análisis BLAST

menunjukkan bahwa bakteri yang berasosiasi dengan

2.000

1.000

500

M (+) (KJ5)

2.000

1.000

500

25

Acropora nasuta memiliki homologi sebesar 96% dengan

Erythrobacter flavus

Tabel 1. Hasil penelusuran BLAST isolat bakteri KJ5

Kode

Bakteri Length Closest Relative Homology Accession

KJ5 1440 bp Erythrobacter

flavus 100 %

NR_02524

5.1

Erythrobacter flavus strain LAMA 944 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. Sequence ID: gb|KC583223.1|Length: 1338Number of Matches: 1

Score Expect Identities Gaps Strand

558 bits(302) 9e-156 314/326(96%) 0/326(0%) Plus/Plus

Query 2 GCCCTTAGGTTCGGAATAACTCAGAGAAATTTGAGCTAATACCGGATAATGTCTTCGGAC 61 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 46 GCCCTTAGGTTCGGAATAACTCAGAGAAATTTGAGCTAATACCGGATAATGTCTTCGGAC 105

Query 62 CAAAGATTTATCGCCTTTGGATGGGCCCGCGTAGGATTAGATAGTTGGTGGGGTAATGGC 121

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 106 CAAAGATTTATCGCCTTTGGATGGGCCCGCGTAGGATTAGATAGTTGGTGGGGTAATGGC 165

Query 122 CTACCAAGTCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGA 181

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 166 CTACCAAGTCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGA 225

Query 182 CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCT 241

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 226 CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCT 285

Query 242 GATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGNCTNANGGTTGTAAANNNCTTTTACCNNGG 301

|||||||||||||||||||||||||||||| || | ||||||||| |||||||| ||

Sbjct 286 GATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCAGGG 345

Query 302 ATGATANNGACAGTACNNGGAGAATA 327

|||||| |||||||| ||||||||

Sbjct 346 ATGATAATGACAGTACCTGGAGAATA 371

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/219857656?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=WFJGJN39015http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/219857656?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=WFJGJN39015http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/469615605?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=2&RID=UBHAMHRM01R

26

Gambar 6. Pohon filogenetik antara isolat KJ5 dengan bakteri laut lainnya.

Genus Erythrobacter ditemukan pertama oleh Shiba

& Simidu (1982) yang pada awal penulisannya terdapat 8

spesies : Erythrobacter longus (Shiba dan Simidu, 1982),

Erythrobacter litoralis (Yurkov dkk., 1994), Erythrobacter

citreus (Denner dkk., 2002), Erythrobacter flavus (dkk.,

2003), Erythrobacter aquimaris (Yoon dkk., 2004),

Erythrobacter seohaensis (Yoon dkk., 2005), Erythrobacter

gaetbuli (Yoon dkk., 2005) dan Erythrobacter vulgaris

(Ivanova dkk., 2005).

Erythrobacter flavus merupakan bakteri gram

negatif dengan koloni berwarna kuning, motil, halus,

mengkilap, bulat, tidak berspora dan berbentuk cembung

dengan diameter 10-15 mm setelah 3 hari kultivasi pada

KB5 Isolate

Erythrobacter flavus strain SW-46 16S ribosomal RNA, partial sequence

Alpha proteobacterium B36 gene for 16S rRNA, partial sequence

Sphingomonas phyllosphaerae strain FA2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

Erythrobacter sp. MBIC4118 gene for 16S rRNA, partial sequence

Erythrobacter flavus strain 2PR56-3 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

Erythrobacter citreus strain RKHC-1 16S ribosomal RNA gene, complete sequence

Erythrobacter gaetbuli partial 16S rRNA gene, isolate AMV17

KJ5

http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-17http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-17http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-17http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-24http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-4http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-21http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-21http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-22http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-23http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-23http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-7

27

suhu 30°C. Bakteri ini tumbuh optimal pada suhu 30–

37°C dengan pH optimal 6-7 (Yoon dkk., 2003)

Hampir semua spesies yang termasuk ke dalam

genus Erythrobacter mampu memproduksi pigmen dan

beberapa diantaranya mampu memproduksi

bakterioklorofil (BChl) a. Erb. longus dan Erb. litoralis

dilaporkan mengandung bakterioklorofil (BChl) a dan

karotenoid (Shiba dan Simidu, 1982; Yurkov dkk., 1994),

namun pada spesies Erythrobacter lain tidak ditemukan

BChl a (Denner dkk., 2002; Yoon dkk., 2003, 2004, 2005;

Ivanova dkk., 2005). Spesies Erythrobacter mensintesis

pigmen fotosintetik dalam kondisi aerob, namun mereka

tidak mampu tumbuh anaerob meskipun dengan kondisi

pencahayaan yang sama dengan bakteri fotosintesik

lainnya (Shiba dan Simidu 1982).

D. Isolasi β-karoten bakteri dengan ekstraksi

Ekstraksi β-karoten bakteri dilakukan

menggunakan pelarut aseton murni (Khalil dan

Varananis, 1996). Ekstraksi bakteri dilakukan dengan

menumbuhkan sampel bakteri ke dalam media padat

Zobell sebanyak 10 petri. Dari hasil ektraksi pigmen

bakteri dengan aseton diperoleh pigmen berwarna kuning

dengan serapan ekstrak kasarnya pada gelombang 300-

500 nm (Gambar 7). Berat basah sampel β-karoten

http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-17http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-24http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-4http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-21http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-22http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-23http://ijs.sgmjournals.org/content/60/9/2215.full#ref-7

28

350 400 450 500 550

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Ab

so

rba

ns

i (m

AU

)

Panjang gelombang (nm)

448

476

diperoleh 0,42 gram dengan kadar air 47,10%.

Selanjutnya dilakukan identifikasi pigmen bakteri dan

analisis kandungan pigmen dengan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi.

Gambar 7. Pigmen bakteri berwarna kuning hasil ekstraksi dengan aseton (A) ; Spektrum serapan ekstrak kasar pigmen

dalam pelarut aseton (B).

E. Analisis β Karoten dengan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT) dan Photo Diode Array

(PDA)

Analisis ekstrak aseton Erb. flavus dengan KCKT

berhasil mengidentifikasi beberapa pita yang diketahui

tergolong ke dalam pigmen fotosintetik dominan. Diantara

beberapa puncak yang muncul tersebut terdapat 1

puncak yang muncul pada menit-menit terakhir (60,24

A B

29

0 20 40 60 80

0

20000

40000

60000

80000

100000

Ab

so

rba

ns

i (m

AU

)

Waktu Tambat (menit)

350 400 450 500 550

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Ab

so

rban

si

(mA

U)

Panjang Gelombang (nm)

448

472

menit) yang diidentifikasi sebagai β-karoten dengan

puncak serapan (427),449,477 nm.

Gambar 8. Kromatogram KCKT ekstrak pigmen Erb. flavus yang dideteksi pada panjang gelombang 450 nm (A);

Gambar 2 dimensi ekstrak pigmen Erb. flavus (B); Spektrum serapan dari puncak pada waktu tambat 60,24

min (C).

C

A

B

30

250 300 350 400 450 500

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

379

Panjang Gelombang (nm)

Ab

so

rba

ns

i (m

AU

)

375

409

413

Untuk memperkuat hasil analisa, pigmen pada

waktu tambat 60,24 yang diduga sebagai pigmen β

karoten ditampung dan dikeringkan kemudian diukur

spektrum serapannya menggunakan spektrofotometer

UV-Tampak pada panjang gelombang 300-500 nm dengan

beberapa pelarut yang berbeda (Gambar 9).

Gambar 9. Pola spektra β-karoten pada panjang gelombang

300-500 nm dengan pelarut aseton (..); etanol (--) dan heksana (-).

Dari hasil analisa UV-Tampak dengan 4 jenis pelarut

yang berbeda, terlihat bahwa pola serapan dan puncak

maksimum spektra yang muncul hampir sama. Pola

serapan dan puncak I, II, III, pigmen murni tersebut

merupakan pola serapan β-karoten (Britton dkk., 1995;

Hegazi dkk., 1998; Jeffrey dkk., 1997).

31

Tabel 2. Perbandingan panjang gelombang maksimum β-

karoten pada beberapa pelarut

Hingga saat ini belum ditemukan penelitian yang

berhasil mengidentifikasi β-karoten pada Erb. flavus,

namun Koblizek dkk. (2003) telah berhasil

mengidentifikasi β-karoten dari genus Erythrobacter yaitu

Erb.longus yang diisolasi dari Samudera Atlantik,

Samudera Pasifik, Laut Mediterania dan Samudera

Hindia. Kurang lebih 18 jenis pigmen berhasil

diidentifikasi dari Erb. longus pada beberapa kondisi

kultur yang berbeda. Karotenoid tersebut memiliki 3

struktur yang sangat berbeda, yaitu bisiklik, monosiklik

dan asiklik, dimana karotenoid golongan polar merupakan

karotenoid dominan pada spesies tersebut (70% dari total

karotenoidnya). Dibandingkan dengan bakteri fotosintetik

lainnya, Erb. longus memiliki jumlah karotenoid yang

Pelarut Aseton Etanol n-Heksana Eluent

Britton dkk.,

(1995)

- 425,450, 478 - -

Jeffrey dkk.,

(1997)

426,453,480

(III/II=21%)

427,449, 475 422,450,477

(III/II=36%)

425, 453, 476

(III/II=22%)

Hegazi dkk.,

(1998)

- - 425,449, 477 428,452, 476

Hasil

pengukuran

429,451,480

(III/II=20%)

429,454,479

(III/II=11%)

426,450,476

(III/II=33%)

427,449, 477

(III/II=13%)

32

lebih variatif (Takaichi dkk., 1990). Erb. longus memiliki

Reaction Centers (RCs) dan B865 complexes (dimana tidak

ada komplek pemanen cahaya lain pada spesies ini)

(Shimada dkk., 1985). Oleh karenanya Erb. longus

memiliki komposisi pigmen yang spesifik, yang tidak

ditemukan pada bakteri fotosintetik lainnya. Total

karotenoidnya jauh lebih banyak daripada

bakterioklorofilnya, berbeda dengan bakteri fotosintetik

lainnya yang perbandingan karotenoid dan

bakterioklorofilnya sebanding (Takaichi dkk, 1990). β-

karoten dan turunannya merupakan komponen

karotenoid dominan pada mikroorganisme ini. Jenis

pigmen tersebut sangat jarang ditemukan pada bakteri

fotosintetik lainnya kecuali pada Rhodomicrobium vannielii

dalam jumlah yang relatif sedikit (Ryvarden dan Liaaen-

Jensen, 1964).

Selain Erb. longus, Baskar dkk. (2010) juga berhasil

mengidentifikasi β-karoten dari Streptomyces sp. yang

diisolasi dari sponge. Kruqel dkk, (1999) juga melaporkan

bahwa karotenoid golongan aromatik telah berhasil

ditemukan pada spesies Streptomyces sp. yang lain. Pada

Streptomyces sp. produksi karotenoid terjadi secara

konstitutif dan tergantung pada cahaya (Koyama dkk.,

1976).

33

Informasi mengenai jalur sintesis maupun beberapa

gen yang terlibat dalam proses sintesis β-karoten pada

genus Erythrobacter dapat kita temukan dalam genome

database. Diantaranya adalah β carotene ketolase dan β

carotene hydroxylase yang telah berhasil disekuen Oh

dkk. (2009) dari spesies Erythrobacter litoralis HTCC2594.

F. Kuantifikasi Kandungan β-Karoten

Untuk menghitung kandungan pigmen β-karoten

pada bakteri Erb. flavus, fokus area yang diambil yaitu

pada tR 59,73 – 60,65 sesuai hasil analisa KCKT

sebelumnya (Indrawati dkk., 2013).

Tabel 3. Luas puncak, yield dan berat kering kandungan β-

karoten

Luas puncak rata-rata Y (µg/mL) C (µg/g berat kering)

1166,17 12.64 56.74

Dengan persamaan,

Y = 0.0108X + 12.677

Dimana :

X = Luas puncak serapan

Y = Konsentrasi (mikrogram/ml)

Maka, Y = (0,0108 x 1166,1688) + 12,677

Y = 12,59 + 12,64

Y = 25,27 µg/0,5 mL

Y = 12,64 µg/mL (2x pengenceran)

Berat sampel basah adalah 0,421 gr,

34

Jadi, Yield = 12,64 µg/0,42 gr atau 30,01 g/g

Jika kadar air sampel 47,10% maka :

Yield = 30,01 µg/0,53 g berat kering

= 56,74 µg/1 g berat kering

Jadi berat kering β-karoten Erb. flavus adalah 56,74 µg/

g berat kering

Jumlah kandungan β-karoten yang dihasilkan Erb.

flavus ini masih dibawah kandungan β-karoten yang

mampu diproduksi oleh Dunaliella salina yang berkisar

10% dari berat keringnya (Prieto dkk., 2011). Selain dari

golongan mikroalga, fungi dari jenis wild type Phycomyces

blakesleeanus juga dilaporkan mampu mensintesis β-

karoten sekitar 0.05 mg/g berat kering dalam kondisi

normal, dan bahkan mencapai 10 mg untuk tipe mutant-

nya (Murillo dkk., 1978). Sedangkan untuk fungi jenis

Blakeslea trispora, dengan stimulasi seksual pada jalur

biosintesis karotenoidnya, mampu meningkatkan

produksi β-karoten hingga 35 mg/g (Mehta dkk., 1997).

Namun demikian, kandungan karotenoid pada Erb. flavus

ini masih lebih tinggi jika dibandingkan dengan

Streptomyces sp. yang hanya mampu memproduksi β-

karoten 4,88 µg per 100 gram (Baskar dkk., 2010).

Meskipun jumlah kandungan β-karoten yang

dihasilkan Erb. flavus masih relatif sedikit, bakteri

tersebut sangat berpotensi dalam menghasilkan β-

35

karoten. Optimasi pada kondisi kultur dan lingkungannya

bisa dilakukan untuk mengoptimalisasi produksi β-

karoten pada Erb. flavus. Choudhari dan Singhal (2008)

berhasil mengoptimalisasi produksi β-karoten pada

Blakeslea trispora hingga 1,209 μg/mL dengan

menambahkan laktosa sebagai sumber karbon. Laktosa

dapat dengan mudah diasimilasi pada jalur metabolis β-

karoten, begitupula dengan glukosa. Beberapa teknologi

juga telah digunakan untuk kultivasi Dunaliella sp. secara

komersial (Ben-Amotz, 1993). Ketika Dunaliella sp

ditumbuhkan pada kondisi terbatas, β-karoten dalam

jumlah besar berhasil disintesis dan diakumulasi

(Borowitzka dkk., 1984). Muthukannan dkk. (2010) juga

berhasil mengoptimalisasi produksi β-karoten Dunaliella

sp dengan mengoptimasi parameter kondisi kulturnya

seperti pH dan intensitas cahaya. Parameter tersebut

sangat bermanfaat untuk megetahui kadar nutrisi yang

digunakan pada medium pertumbuhannya (De walne’s

medium) (Oreset dan Young, 1999).

Selain itu, dengan rekayasa genetika, Sacharomyces

cerevisiae juga dilaporkan mampu meningkatkan

produksi β-karotennya hingga 200% dengan optimasi

spesifik gen crtI dan crtY (Li dkk., 2013). Misawa dkk.

(1991) juga berhasil menyisipkan gen crtB, crtE, crtI, crtY

dari Erwinia uredovora yang mengkode sitesis β-karoten

36

ke dalam Zymomonas mobilis dan Agrobacterium

tumefaciens. Dari penelitian tersebut diperoleh bahwa

Z.mobilis dan A.tumefaciens memiliki koloni berwarna

kuning dan mampu memproduksi β-karoten hingga 220

µg untuk Z. mobilis mutan dan 350 µg untuk mutan

A. tumefaciens per gram berat kering pada fase stationer di

medium cair.

Dengan menambahkan mineral atau sumber

karbon lain pada medium kultivasi, mengoptimasi

parameter pertumbuhan seperti pH, intensitas cahaya

dan suhu optimal pertumbuhan kultur maupun

melakukan rekayasa genetika pada jalur biosintesis β-

karoten diharapkan bisa menjadi solusi untuk

meningkatkan produksi β-karoten pada Erb. flavus.