BAB I PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morIologi, struktur dan siIat-siIat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentiIikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berIungsi untuk mengetahui siIat Iisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008). Berbagai macam tipe morIologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersiIat basoIilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersiIat alkalin (komponen kromoIoriknya bermuatan positiI). Faktor-Iaktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu Iiksasi, peluntur warna , substrat, intensiIikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994). Berdasarkan hal tersebut di atas, maka dilakukanlah praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pengecatan sederhana, pengecatan negatiI maupun pengecatan gram serta mengetahui morIologi mikroorganisme. I.2 Tujuan Percobaan Adapun tujuan dari percobaan ini adalah : 1. Untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme dengan cara pengecatan negatiI, pengecatan sederhana dan pengecatan gram. 2. Untuk mengetahui morIologi mikroorganisme I.3 Waktu dan Tempat Percobaan Praktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu, 25 Maret 2009, pukul 14.00- 17.30 WITA dan bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar. BAB II TINJAUAN PUSTAKA Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008). Macam-macam pewarnaan (Yulneriwanti, 2008) : 1. Pewarnaan negatiI - Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang - Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta 2. Pewarnaan sedehana - Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air Iukhsin) - Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel 3. Pewarnaan diIerensial - menggunakan lebih dari satu macam zat warna - Tujuan untuk membedakan antar bakteri - Contoh: Pw. Gram, Pw. Bakteri Tahan Asam 4. Pewarnaan khusus - Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri kapsul, spora, Ilagel dll Cara pewarnaan negatiI - Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop Untuk mempelajari morIologi, struktur, siIat-siIat bakteri dalam membantu mengidentiIikasinya, kuman perlu diwarnai. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positiI dan gram-negatiI, berdasarkan siIat kimia dan Iisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Iilzahazny, 2008). Bakteri Gram-negatiI adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positiI akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatiI tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatiI menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasiIikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Iilzahazny, 2008). SiIat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan siIat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan siIat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positiI dan bakteri Gram negatiI dapat dilihat pada table berikut ini (Iilzahazny, 2008) : Bakteri Gram PositiI Bakteri Gram NegatiI Dinding Sel: Lapisan petidoglikan Lebih tebal Lebih tipis Kadar lipid 1-4 11-22 Resistensi terhadap alkali (1 KOH) Lebih pekat Larut Kepekaan terhadap Yodium Lebih peka Kurang peka Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka SiIat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam Kepekaan terhadap penisilin Lebih peka Kurang peka Kepekaan terhadap streptomisin Tidak peka Peka Teknik pewarnaan Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersiIat basoIil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersiIat alkalin (komponen kromoIornya bersiIat positiI). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morIologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990). Pewarnaan negatiI, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morIologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo, 1990). Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas dibentuk oleh spesies ini disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. SiIat-siIat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang Membentuknya (Dwidjoseputro, 1989). Ciri-ciri bakteri gram negatiI yaitu (Hadiotomo, 1990) : - Struktur dinding selnya tipis, sekitar 1015 mm, berlapis tiga atau multilayer. - Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit I 10 dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. - Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. - Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. - Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatiI sederhana. - Tidak resisten terhadap gangguan Iisik. Ciri-ciri bakteri gram positiI yaitu (Hadiotomo, 1990) : - Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. - Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50 berat ringan. Mengandung asam tekoat. - BersiIat lebih rentan terhadap penisilin. - Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. - Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. - Lebih resisten terhadap gangguan Iisik. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu (Volk & Wesley, 1998): 1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. 2. PengintesiIan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. 3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. 4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna saIranin BAB III METODOLOGI III. 1 Alat Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah mikroskop, objek gelas, ose bulat, gegep kayu,lampu spritus , korek api,pipet tetes,wadah baskom, botol semprot , dan hand sprayer III.2 Bahan Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah Aquadest steri, lBiakan Eschericia coli, Biakan Bacillus cereus, Biakan Salmonella typii, Gram A (Kristal violet), Gram B (larutan lugol), Gram C (Alkohol asam), Gram D (SaIranin), Minyak imersi, Tissue roll, Alcohol 70 , Spirtus, Larutan nigrosin (tinta cina). III.3 Prosedur Kerja A. Pengecatan Sederhana 1. Membuat preparat olesan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella typii lalu Iiksasi dengan pembakar spirtus. 2. Meneteskan larutan Kristal violet diatas olesan preparat tersebut sebanyak 1-2 tetes dan membiarakan selama 1-2 menit. 3. Mencuci dengan air mengalir sampai sisa cat tercuci habis, kemudian mengeringkan dengan hati-hati mengunakan tissue roll. 4. Mengamati dibawah mikroskop dengan menggunakan pembesaran 100x dan minyak imersi. 5. Menggambar dan mencatat hasil yang diamati. B. Pengecatan NegatiI 1. Membersihkan gelas objek dengan alcohol 70 agar bebas lemak. 2. Mengambil 1 ose yang digunakan umntuk mengambil biakan, meletakkan biakan pada objek gelas kemudian mencampur dengan 1-2 tetes nigrosin. 3. Dengan menggunakan objek gelas lain menyentuhkan sisi objek gelas tersebut pada sampel tersebut sehingga membentuk sudut 300C, selanjutnya menarik objek gelas tersebut dengan arah yang berlawanan hingga membentuk Iilm tipis. 4. Membiarkan hingga mengering lalu mengamati diubawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan menggunakan minyak imersi. 5. Menggambar dan mencatat hasil pengamatan. C. Pengecatan Gram 1. Menyiapkan preparat olesan bakteri Bacillus cereus, Eshcericia coli dan Salmonella typii lalu Iiksasi pada pembakar spirtus. 2. Meneteskan larutan gram A sebanyak 2-3 tetes pada olesan bakteri, membiarkan selama 1 menit. 3. Mencuci dengan air mengalir dan mengeringkan dengan tissue roll dengan hati-hati. 4. Meneteskan larutan gram B, membiarkan selama 1 menit. 5. Mencuvi dengan air dan keringkan. 6. Meneteskan larutan gram C, membiarkan selama 30 detik. 7. Mencuci dengan air dan keringkan. 8. Menetesi dengan larutan gram D, membiarkan selama 30 detik, mencuci dengan air dan mengeringkan dengan tissue. 9. Mengamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan menggunakan minyak imersi BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN IV.1 Hasil IV.2 Pembahasan A. Pengecatan Sederhana Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya warna Kristal violet. Pada pengecatan sederhana digunakan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yang berarti bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga Nampak pada mikroskop. Zat warna yang umunya digunakan yakni yang bersiIat alkalin (kromatoIornya bermuatan ). B. Pengecatan NegatiI Pada pengecatan ini digunakan cat asam nirosin (tinta cina). Pengecatan ini dilakukan untuk mewarnai latar belakang preparat sedangkan bakteri sendiri tidak terwarnai serta untuk mengamati ukuran, bentuk, dan tata letak sel. Setelah pengamatan dibawah mikroskop diperoleh preparat mikroba berwarna hitam sedangkan bakteri sendiri tidak berwarna (berwarna putih) dan berbentuk basil (batang). C. Pengecatan Gram Pengecatan gram termasuk pengecatan diIerensial yang digunakan untuk membedakan bakteri gram negative dan bakteri gram positiI. Pada pengecatn ini digunakan 3 jenis bakteri yaitu Bacillus cereus, Salmonella typii dan Eshericia coli.. Pengecatan ini menggunakan 4 jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai cat utama, larutan iodine sebagai pengintensiIan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan saIranin sebagai cat penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh Bacillus cereus dan Salmonella typii bersiIat gram positiI yang berarti bakteri dapat mengikat dengan kuat cat utama cristal violet berwarna ungu, pada saat bakteri Gram positiI ditambahkan dengan kristal violet maka gram positiI akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel, dengan pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Sedangkan bakteri Eschericia coli bersiIat gram negative karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna saIranin. Perbedaan gram () dan gram (-) SiIat Gram () Gram (-) Komposisi Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitiI Lebih tahan Penghambatan warna Lebih dihambat Kurang dihambat Ketahanan terhadap Iisik Lebih tahan Kurang tahan Kebutuhan Nutrien Kompleks RelatiI BAB V PENUTUP V.1 Kesimpulan Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa : - Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan pengecatan gram, pengecatan sederhana dan pengecatan negative. - Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti saIranin atau kristal violet, pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram () dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna sedangkan pewarnaan negative berguna untuk mewarnai latar belakang preparat dan bakteri sendiri tidak terwarnai. - Bakteri gram negatiI pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positiI akan menghasilkan warna ungu. V.2 Saran Saran untuk laboratorium agar percobaan berikutnya keanekaragaman bakteri yang digunakan dapat bertambah lagi sehingga hasil yang diperoleh dapat bervariasi. DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan. Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia. Jimmo., 2008, http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA BLoG KiTa.mht,. diakses pada tanggal 14 April 2009, Makassar. Fauziah., 2008, www.Ikugm2008.com/wp-content/uploads/HSC/1- 2x/6/Praktikum6.pdI. diakses pada tangan 04 April 2009, Makassar. Filzahazny., 2008, , http:/wordpress.com/Penganta-tentang-bakteri.htm.di akses pada tanggal 08 maret 2009, Makassar. Rizki., 2008, http ://ngecat bakterimakul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi- kuliah.html. diakses pada tanggal 04 April 2009, Makassar. Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga. MACAM-MACAM TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI

MikroorganismeyangadadialaminimempunyaimorIologi,strukturdansiIat-siIatyang khas,begitupuladenganbakteri.Bakteriyanghiduphampirtidakberwarnadankontras denganair,dimanasel-selbakteritersebutdisuspensikan.Salahsatucarauntukmengamati bentuk sel bakteri sehinggamudah untuk diidentiIikasi ialah denganmetodepengecatan atau pewarnaan.HaltersebutjugaberIungsiuntukmengetahuisiIatIisiologisnyayaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008). BerbagaimacamtipemorIologibakteri(kokus,basil,spirilum,dansebagainya)dapat dibedakandenganmenggunakanpewarnasederhana.Istilahpewarnasederhanadapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990).Kebanyakanbakterimudahbereaksidenganpewarna-pewarnasederhanakarena sitoplasmanyabersiIatbasoIilik(sukaakanbasa)sedangkanzat-zatwarnayangdigunakan untukpewarnaan sederhanaumumnyabersiIatalkalin (komponenkromoIoriknyabermuatan positiI). Faktor-IaktoryangmempengaruhipewarnaanbakteriyaituIiksasi, pelunturwarna , substrat,intensiIikasipewarnaandanpenggunaanzatwarnapenutup.Suatupreparatyang sudahmeresapsuatuzatwarna,kemudian dicucidenganasamencermakasemuazatwarna terhapus.sebaliknyaterdapatjugapreparatyangtahanterhadapasamencer.Bakteri-bakteri sepertiinidinamakanbakteritahanasam,danhalinimerupakanciriyangkhasbagisuatu spesies (Dwidjoseputro, 1994). Teknikpewarnaanwarnapadabakteridapatdibedakanmenjadiempatmacamyaitu pengecatansederhana,pengecatannegatiI, pengecatandiIerensialdanpengecatanstruktural. Pemberianwarnapadabakteriataujasad-jasadreniklaindenganmenggunakanlarutan tunggalsuatupewarnapadalapisantipis,atauolesan,yangsudahdiIiksasi,dinamakan pewarnaansederhana.Prosedurpewarnaanyangmenampilkanperbedaandiantarasel-sel microbeataubagian-bagianselmicrobedisebutteknikpewarnaandiIerensial.Sedangkan pengecatanstrukturalhanyamewarnaisatubagiandariselsehinggadapatmembedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, Ilagella dan pengecatan kapsul.(waluyo,2010) Mikrobasulitdilihatdengancahayakarenatidakmengadsorbsiataumembiaskancahaya. Alasan inilah yangmenyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warnamemungkinkan pengamatan strukur seperti spora, Ilagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula IosIat (Entjang, 2003) Melihatdanmengamatibakteridalamkeadaanhidupsangatsulit,kerenaselainbakteriitu tidakberwarnajugatransparandansangatkecil.Untukmengatasihaltersebutmaka dikembangkansuatuteknikpewarnaanselbekteri,sehinggaseldapatterlihatjelasdan mudahdiamati.Olekkarenaituteknikpewarnaanselbakteriinimerupakansalahsatucara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008). 2.1 Macam-macam pewarnaan 2.1.1Pewarnaan Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk : 1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun Iungi. 2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad 3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad. 4. Melihat reaksijasad terhadappewarnayangdiberikansehinggasiIat-siIatIisikdankimia dapat diketahui. Langkah-langkah utama teknik pewarnaan 1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis 2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, Iormalin, Ienol. 3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna Teknikpewarnaandikelompokkanmenjadibeberapatipe,berdasarkan responselbakteri terhadapzatpewarnadansistempewarnaanyangdigunakanuntukpemisahankelompok bakteridigunakanpewarnaanGram,danpewarnaan 'acid-fast(tahanasam)untuk genusMycobacterium. UntukmelihatstrukturdigunakanpewarnaanIlagela,pewarnaankapsul,pewarnaanspora, danpewarnaannukleus.PewarnaanNeisseratauAlbertdigunakanuntukmelihatgranula metakromatik (volutinbodies) pada Corynebacteriumdiphtheriae. Untuksemuaprosedur pewarnaanmikrobiologidibutuhkanpembuatanapusanlebihdahulusebelummelaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesiIik (Pelezar,2008). 2.1.2 Macam-Macam Pewarnaan Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut : 1. Pewarnaan sederhana Menggunakansatumacamzatwarna(birumetilen/airIukhsin)tujuanhanyauntukmelihat bentuksel.Pewarnaansederhana,merupakanpewarnayangpalingumumdigunakan. BerbagaimacamtipemorIologibakteri(kokus,basil,spirilum,dansebagainya)dapat dibedakandenganmenggunakanpewarnasederhana,yaitumewarnaisel-selbakterihanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarnasederhanakarenasitoplasmanyabersiIatbasoIilik(sukaakanbasa)sedangkanzat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersiIat alkalin (komponen kromoIoriknya bermuatan positiI). Zatwarnayangdipakaihanyaterdiridarisatuzatyangdilarutkandalambahanpelarut. PewarnaanSederhanamerupakansatucarayangcepatuntukmelihatmorIologibakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan Iukhsin-karbol (5 detik).

2. Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam Pewarnaan differensial Pewarnaan bakteri yangmenggunakan lebih dari satu zat warna sepertipewarnaan gramdan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut: Pewarnaan Cram Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadiduakelompokbesar,yaknigram-positiIdangram-negatiI,berdasarkansiIatkimia danIisikdindingselmereka.Metodeinidiberinamaberdasarkanpenemunya,ilmuwan DenmarkHansChristianGram(18531938)yangmengembangkanteknikinipadatahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. DenganmetodepewarnaanGram,bakteridapatdikelompokkanmenjadidua,yaitubakteri GrampositiIdanGramnegatiIberdasarkanreaksiatausiIatbakteriterhadapcattersebut. Reaksi atau siIat bakteri tersebutditentukanolehkomposisidindingselnya. Olehkarena itu, pengecatanGram tidakbisadilakukanpadamikroorganismeyang tidakmempunyaidinding selsepertiMycoplasmaspContohbakteriyangtergolongbakteritahanasam,yaitudari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genusNocardia. Bakteribakteri dari keduagenusinidiketahuimemilikisejumlahbesar zatlipodial(berlemak)didalamdinding selnyasehinggamenyebabkandindingseltersebutrelatiItidakpermeabelterhadapzat-zat warnayangumumsehinggaselbakteritersebuttidakterwarnaiolehmetodepewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : O Zat warna utama (violet kristal) O Mordan(larutanIodin)yaitusenyawayangdigunakanuntukmengintensiIkanwarna utama. O Pencuci/pelunturzatwarna(alcohol/aseton)yaitusolvenorganicyangdigunakan uantuk melunturkan zat warna utama. O Zatwarnakedua/catpenutup(saIranin)digunakanuntukmewarnaikembalisel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol. BakteriGram-negatiIadalahbakteriyang tidakmempertahankanzatwarnametilungupada metodepewarnaanGram.Bakterigram-positiIakanmempertahankanzatwarnametilungu gelapsetelahdicucidenganalkohol,sementarabakterigram-negatiItidak.Padauji pewarnaanGram,suatupewarnapenimbal(counterstain)ditambahkansetelahmetilungu, yangmembuatsemuabakterigram-negatiImenjadiberwarnamerahataumerahmuda. Pengujian ini berguna untuk mengklasiIikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu 1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. 2. PengintesiIan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. 3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. 4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna saIranin PerbedaandasarantarabakterigrampositiIdannegatiIadalahpadakomponendinding selnya.Komplekszatiodinterperangkapantaradindingsel danmembransitoplasma organismegrampositiI,sedangkanpenyingkiranzatlipidadaridindingselorganismegram negatiIdenganpencucianalcoholmemungkinkanhilangdarisel.BakterigrampositiI memilikimembrantunggalyangdilapisipeptidohlikanyangtebal(25-50nm)sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). SiIat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan siIat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan siIat yangdapat dijumpai antara bakteri Gram positiIdan bakteri Gram negatiI yaitu: Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu. O Struktur dinding selnya tipis, sekitar 1015 mm, berlapis tiga atau multilayer. O Dindingselnyamengandunglemaklebihbanyak(11-22),peptidoglikanterdapat didalam O lapisankaku,sebelahdalamdenganjumlahsedikit10dariberatkering,tidak mengandung asam tekoat. O Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. O Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. O Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatiI sederhana. O Tidak resisten terhadap gangguan Iisik. O Resistensi terhadap alkali (1 KOH) lebih pekat O Peka terhadap streptomisin O Toksin yang dibentuk Endotoksin Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu. O Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. O Dindingselnyamengandunglipidyanglebihnormal(1-4),peptidoglikanadayang sebagailapisantunggal.Komponenutamamerupakanlebihdari50beratringan. Mengandung asam tekoat. O BersiIat lebih rentan terhadap penisilin. O Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. O Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. O Lebih resisten terhadap gangguan Iisik. O Resistensi terhadap alkali (1 KOH) larut O Tidak peka terhadap streptomisin O Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin Contoh bakteri gram posittiIcontoh bakteri gram negatiI

Sumber: 'http.//id.wikipedia.org/wiki/PewarnaanGram Pewarnaan 1ahan Asam Pewarnaaniniditujukan terhadapbakteriyangmengandunglemakdalamkonsentrasi tinggi sehinggasukarmenyerapzatwarna,namunjikabakteridiberizatwarnakhususmisalnya karbolIukhsinmelaluiprosespemanasan,makaakanmenyerapzatwarnadanakantahan diikattanpamampudilunturkanolehpelunturyangkuatsekalipunsepertiasam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Teknikpewarnaaninidapatdigunakanuntukmendiagnosakeberadaanbakteripenyebab tuberkulosisyaitu Mycobacteriumtuberculosis .Adabeberapacarapewarnaantahanasam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)

Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru) Sumber: www.google.com 3.Pewarnaankhususuntukmelihatstrukturtertentu:pewarnaanflagel,pewarnaan spora, pewarnaan kapsul. Pewarnaan Spora Sporabakteri(endospora)tidakdapatdiwarnaidenganpewarnaanbiasa,diperlukanteknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasansupayacatmalachitehijau bisamasukkedalamspora,sepertihalnyapada pewarnaan BasilTahanAsamdimanacat carbolIuschsin harusdipanaskanuntukbisa menembuslapisan lilin asam mycolicdari Mycobacterium . Skema prosedur pengecatan Spora SchaeIIer Fulton

Sumber http://images.suite101.com/400620comendosporestainprocpscanite.jpg Protokol pewarnaan diIerensial endospores dan sel vegetatiI adalah sebagai berikut:

Sumber: Prinsip kerja: Sporakumanmempunyaidindingyangtebalsehinggadiperlukanpemanasanagarpori-pori membesarzatwarnaIuchsindapatmasuk,denganpencucianpori-porikembalimengecil menyebabkanzatwarnaIuchsintidakdapatdilepaswalaupundilunturkandenganasam alkohol, sedangkanpadabadanbakteriwarnaIuchsindilepaskandanmengambilwarna biru dari methylen blue. Cara Kerja : Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol Iuchsin sama banyak. Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit. Dibuat sediaan dan dikeringkan. Dimasukkan kedalam H2SO4 1 selama 2 detik Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir. Sediaan dicuci dengan air. Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan. Diperiksa dibawah mikroskop. Pewarnaan flagel PewarnaanIlageldenganmemberisuspensekoloidgaramasamtanatyangtidakstabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan Ilagel. Pewarnaan kapsul Pewarnaan inimenggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulIat sebagai pembilasanmenghasilkanwarnabirupucatpadakapsul,karenajikapembilasandenganair dapatmelarutkankapsul.Garamtembagajugamemberiwarnapadalatarbelakang.Yang berwana biru gelap. 4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri : O pewarnaan Neisser (granula volutin), O pewarnaan yodium (granula glikogen). 5. Pewarnaan negatif Tujuan Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatiI untuk mengamati morIologi organisme yangsukardiwarnaiolehpewarnasederhana.Bakteritidakdiwarnai,tapimewarnailatar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta Cara pewarnaan negatif - Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop PewarnaannegatiI,metodeinibukanuntukmewarnaibakteritetapimewarnailatar belakangnyamenjadihitamgelap. Padapewarnaaninimikroorganismekelihatantransparan (tembuspandang).TeknikinibergunauntukmenentukanmorIologidanukuransel.Pada pewarnaaniniolesan tidakmengalamipemanasan atauperlakuanyangkerasdenganbahan-bahankimia,makaterjadinyapenyusutandansalahsatubentukagarkurangsehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode inimenggunakan cat nigrosin atau tinta cina. PewarnaannegatiImemerlukanpewarnaasamsepertieosinataunegrosin.pewarnaasam memilikinegatiIchargekromogen,tidakakanmenembusatauberpenetrasikedalamsel karenanegativechargepadapermukaanbakteri.olehkarenaitu,seltidakberwarnamudah dilihat dengan latar belakang berwarna. Kajian religi 1. Al-Furqon: 2 2.Yangkepunyaan-Nya-lahkerajaanlangitdanbumi,danDiatidakmempunyaianak,dan tidakadasekutubaginyadalamkekuasaan(Nya),danDia telahmenciptakansegalasesuatu, dan Dia menetapkan ukuran-ukurannya dengan serapi-rapinya|1053|. |1053|Maksudnya:segalasesuatuyangdijadikanTuhandiberi-Nyaperlengkapan-perlengkapandanpersiapan-persiapan,sesuaidengannaluri,siIat-siIatdanIungsinya masing-masing dalam hidup. 2. An nahl: 12 12.DanDiamenundukkanmalamdansiang,mataharidanbulanuntukmu.danbintang-bintang itu ditundukkan (untukmu) dengan perintah-Nya. Sesungguhnya pada yang demikian itu benar-benar ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum yang memahami (Nya), 1. Al-Baqarah : 164 164.Sesungguhnyadalampenciptaanlangitdanbumi,silihbergantinyamalamdansiang, bahtera yang berlayar di lautmembawa apa yang berguna bagimanusia, dan apa yang Allah turunkan dari langit berupa air, lalu dengan air itu Dia hidupkan bumi sesudah mati (kering)-nyadanDiasebarkandibumiitusegalajenishewan,danpengisaranangindanawanyang dikendalikan antara langit dan bumi; sungguh (terdapat) tanda-tanda (keesaan dan kebesaran Allah) bagi kaum yang memikirkan DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro. 2005. asar-asar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta Pelezar,chan. 2008. asar-asar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta Waluyo,lud. 2010. Buku Petunfuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM. Malang Widjoseputro, D., 1989. asar-asar Mikrobiologi. Malang : Djambatan Jimmo.,2008,http://PembuatanPReParATdanPengeCaTAnnyABLoGKiTa.mht,. diakses pada tanggal 14 April 2009, Makassar. Fauziah.,2008,www.Ikugm2008.com/wp-content/uploads/HSC/1-2x/6/Praktikum6.pdI. diakses pada tangan 04 April 2009, Makassar.