Metodologías para la determinación estructural de fármacos y el estudio de fenómenos de

reconocimiento molecular

Programa de doctorado en Química Médica

1USP-CEU

RMN bidimensional. Conceptos básicos Correlación Homonuclear. COSY, TOCSY

Javier Pérez Castells

Introducción a la RMN 2D

2USP-CEU

Hasta ahora hemos visto muchos pulsos pero una sola dimensión aunque vimos como una secuencia de pulsos múltiple nos da distintos espectros en función de los periodos tD que usemos entre pulsos

Un experimento 2D básico seria repetir una secuencia depulsos 1D con una variación sistemática del periodo de tiempovariable t1, y luego representarlo (stacked plot). Durante el tiempo de evolución no se observa nada luego pueden evolucionar coherencias no observables (Multi cuanto)que durante el tiempo de mezcla se conviertan en observables.

Esto es el esqueleto de lo que va a ser la secuencia de pulsos COSY.

Se va a recoger una matriz de datos en la que las filas son cada uno de los espectros individuales a cada incremento de t1 y las columnas son el comportamiento a cada uno de esos incrementos de una frecuencia determinada.

Introducción a la RMN 2D

3USP-CEU

Lo analizamos para un singlete fuera de resonancia (ωo), y para t1’s diferentes. Empezando tras el primer pulso π / 2:

El segundo pulso π / 2 actúa solo sobre la componente de la magnetización que este en el eje y del plano <xy>.• La componente en el eje x no es afectada, pero su amplitudva a depender de la frecuencia del pico.

Introducción a la RMN 2D

4USP-CEU

Tenemos datos en frecuencia en un eje (f2, que viene del tiempo t2), y datos en función del tiempo en el otro (t1).• Como la variación de intensidad en t1 es también periódica, podemos hacer una seudo-FID mirando a los puntos para cada frecuencia de los picos en f2.• Una cosa que no estamos considerando durante todos estos pulsos, esperas, pulsos, etc., es que la señal también va a estar afectada por relajación T1 y T2.

Introducción a la RMN 2D

5USP-CEU

Ahora tenemos FIDs en t1, y podemos hacer una segunda transformada de Fourier en el dominio de t1

(la primera fue el dominio de t2), y obtenemos un espectro bi-dimensional:• Tenemos ‘picos de cruce’ donde las dos lineas se interceptan en el mapa 2D, en este caso en la diagonal.

Introducción a la RMN 2D

Matriz de datos raw

Funcion de ventana a t2 FIDs

Trasformada de Fourier respecto a t2

Se forman los interferogramas

Funcion de ventana a los interferogramas

6USP-CEU

Llenado de ceros

FT de la dimensión t1

Espectro 2D

Faseado f2 luego f1

Procesado ulterior sym, etc

COSY significa COrrelation SpectroscopY, en este caso, espectroscopia de correlacion homonuclear.• En la introducción anterior consideramos un espinaislado sin acoplamientos. Obviamente, esto no es muy útil.• El COSY es útil para averiguar que espin esta acoplado con otros espines. Los picos fuera de la diagonal indican esto, o sea, que los dos picos en la diagonal estan acoplados.• Con esta idea básica vamos a tratar de ver el efecto de la secuencia de pulsos COSY 90y - t1- 90y - t2en un par de espines acoplados.

COSY

7USP-CEU

•Si miramos al núcleo I y aplicamos los dos pulsos π / 2 (un seudo-pulso π), invertimos parte de la población de S, y esto tiene un efecto en I (transferencia de polarización).• Como la transferencia de polarización de I a S o de S a I es lo mismo, lo explicamos de I a S y asumimos que nos da lo mismo de S a I. Perturbamos I y vemos lo que pasa con S.

COSY

8USP-CEU

asumimos que nos da lo mismo de S a I. Perturbamos I y vemos lo que pasa con S.• Después del primer π / 2, tenemos dos vectores de I en el eje x, uno moviéndose a ωI + J / 2 y el otro a ωI - J / 2. El segundo pulso va a mezclar: parte de la magnetización de I se queda en I y parte pasa a S lo cual al final de las FT dará dos señales una en la diagonal otra, el pico de cruce.• El pico de cruce es una magnetización que ha precesionado a ωI durante t1 y a ωS durante t2, por eso sale fuera de la diagonal. Puesto que a S le pasa lo mismo que a I salen picos simétricos respecto a la diagonal. (el COSY es simétrico)

• La variación en la inversión de población de I depende del coseno de su frecuencia. Considerando que estamos en resonancia con una de las líneas y que t1 = 1/ 4 J. Cada vector transfiere magnetización durante el segundo pulso a las otras 3 transiciones del sistema generando la estructura fina del espectro.

Para el caso general llegaríamos a esta relación para el cambio de la intensidad de la señal de S (depues del pulso π / 2) en función de la frecuencia del espin I y de JIS

Dos problemas:Multipletes con diferente fase en los picos de

COSY

9USP-CEU

Multipletes con diferente fase en los picos de cruce y en fase en la diagonal. Si se ajusta la fase de los de cruce los de la diagonal se ven dispersivos.Solución: ciclado de fases o presentación en magnitud

Esta es la ‘huella’ tipica de un doblete en un COSY Sensible a la fase (phase-sensitive COSY). Los senos hacen que las señales sean dispersivas en f1 y f2 y también en la diagonal

Correlación del sistema A2X3 del etilbenceno en antifase

10USP-CEU

Para evitar los antifases y sobretodo las señales dispersivas en la diagonal cuyas colas pueden ocultar señales próximas se pueden procesar los COSYs en magnitude calculation, lo cual implica una combinación matemática de partes real e imaginaria que sale con peor resolucion peo que se mejora con una fuerte función de ventana (sinebell cuadrática). Aun así, la función disminuye la intensidad de algunos picos por lo que se llega a un compromiso y queda menos resuelto. Se usa solo para rutina.

M = (real2 + imaginaria2)1/2

Problemas adicionales:Picos axiales (se eliminan con el ciclado TPPI, Time proportional phase incrementation)Artefactos (se eliminan con la simetrización)

El COSY (o experimento de Jenner) fue uno de los primeros 2D (1971), y es una de las secuencias de pulso 2D mas útiles para elucidación estructural. Tiene milesde variaciones y mejoras (DQF-COSY, E-COSY, etc.).

COSY

11USP-CEU

COSY largo

Puesto que muchas presentaciones sensibles a la fase requieren un ciclado de fases pueden necesitar mucho tiempo de adquisición. El tiempo de adquisición se limita mucho con el gCOSY (COSY con gradientes), que destruye la magnetización z no deseada y por tanto sus correspondientes señales. Se pueden lograr así espectros de alta calidad en tan solo 5 min.

La bobina de gradientes desfasa las coherencias a lo largo del eje z con un pulso que no es cuadrado y luego de un período en el que sucede otra cosa, generalmente

gCOSY

12USP-CEU

de un período en el que sucede otra cosa, generalmente un pulso, las refasea con otro pulso igual.Por ejemplo: en el COSY tras el 2º pulso en el cual se hacen detectables magnetizaciones que estaban en el eje z el segundo pulso de gradientes las desfasa y las hace indetectables.Sustituye así al tedioso ciclado de fases y permite aumentar mucho la ganancia del receptor reduciendo el num de scansLos gradientes permiten:•Seleccionar caminos de coherencia•Suprimir señales de disolvente•Eliminar magnetización no deseada procedente de ruido o de inhomogeneidad.

DQF-COSYSe basa en añadir un tercer pulso al final que convierte en detectables las coherencias de doble cuanto que se generan tras el segundo pulso. Los gradientes o un ciclado de fases adecuado hacen indetectables las coherencias de un cuanto que había antes del 3er

13USP-CEU

Recordemos que los multipletes se ven en antifase en el COSY y en la diagonal dispersivos. Esa dispersión se evita con el filtradoComo solo se ven las coherencias de doble cuanto desaparecen los singletes que son los que mas ruido aportan y más colas y eso puede incluir al disolvente

que había antes del 3er pulso

DQF-COSY

14USP-CEU

Zona aromáticas de un 2D COSY del 12,14-ditbutilbenzo[g]criseno

1

2

34

5

6

7

8

9

1011

13

DQF-COSY

15USP-CEU

TOCSY

• Aunque alargando el tiempo de mezcla en el COSY(delayed y relayed COSY) o simplemente disminuyendo el plano de corte se pueden ver acoplamientos a 4 y 5 enlaces se pierde la señal y es bueno disponer de un método de ver todas las correlaciones escalares de un sistema de espines.

• Es el Total correlation spectroscopy (TOCSY) experiment. Es muy útil en análisis de moleculas con sistemas de spin independientes.

16USP-CEU

• Se basa en una secuencia de bloqueo de spin (en el plano transversal) que se logra con un tren de pulsos (MLEV-17 etc) que coloca al sistema en condiciones de mezcla isotrópica (todos los spines experimentan el mismo campo efectivo).

• Entonces se cumple la condición de Hartmann-Hahn y la magnetización se trasfiere entre núcleos acoplados.

• En definitiva, pueden aparecer señales de cruce entre todos los spines del sistema y además salen en fase, con lo que es muy ventajoso respecto al COSY.

• La aparición y la intensidad de las señales depende del tiempo de mezcla que escojamos.

Trabajo a campos bajos - Spin-locking• Una primera idea sobre el TOCSY es que es como hacer el mezclado a un campo mas ‘bajo.’• La tecnica que usamos para lograr esto se llama spinlocking. La idea es sacar la magnetización fuera de los efectos de Bo ‘enganchandolo los espines’ a un campo magnetico distinto. O sea, los hacemos precesionar alrededor de un campo B que no esta alineado con el eje z.• Para tener spin-lock de la magnetizacion lo primero es sacarla del eje z (lejos de Bo). Por tanto primero hacemos un pulso π / 2.• Una vez que M está en el plano <xy>, hay que mantenerla alli haciéndola precesionar alrededor de un nuevo campo magnético alineado con el eje x o y.• Esto lo hacemos con un campo de banda continua (BC) o con un campo generado por pulsos compuestos (‘tren’ de pulsos) que tiene el mismo efecto que la irradiacion de BC: Cuando logramos esta condición (llamada la condición de Hartmann-Hahn), las frecuencias de todas las

TOCSY

17USP-CEU

logramos esta condición (llamada la condición de Hartmann-Hahn), las frecuencias de todas las transiciones del sistema son proporcionales a BSL (al TOCSY se le llamaba HOHAHA(HOmonuclear HArtmann-HAhn experiment)

•BSL es un campo magnético variable aplicado aprox a la resonancia de los espines de nuestra muestra. Es estático en el sistema rotatorio y por eso estos experimentos seconocen como experimentos de sistema rotatorio.• Habría distintas formas de generar el BSL. Una es basicamente usar un campo de BC que actuaria todo el tiempo de mezcla, pero eso implica un ancho espectral muy bajo y entonces solo los espines con ωo similar a ωSL van a estar bien ‘enganchados.’

Podemos usar pulsos de RF cortos y obtener los mismos resultados. Los llamamos pulsos compuestos, ya que son una colección de pulsos cortos (µs) esparcidos por todo el periodo de mezcla (o todo el periodo del spin-lock) y tienen el mismo efecto que irradiación de BC.

TOCSY

18USP-CEU

mezcla (o todo el periodo del spin-lock) y tienen el mismo efecto que irradiación de BC.• El mas comun es llamado MLEV, o ciclo de desacoplamiento de Malcom LEVitt. Una variación es llamada DIPSI (Decoupling In the Presence of Scalar Interactions).• Un PC es basicmente un monton de pulsos juntos que usamos repetidas veces. PC’s tipicos son R = (π/2)x(π)y(π/2)x o R = (π/2)x(3π/2)y(π/2)x. •Lo que hacen, basicamente, es mantener a la magnetización en el plano <xy>. Si ponemos muchos en sucesión podemos mantener el spin-lock por el tiempo que queramos. Normalmente las fases de los distintos PC’s del spin-lock se alternan (R):

• En un sistema bajo spin lock el efecto del desplazamiento químico desaparece, es como si todos los espines tuvieran el mismo offset. • Sin embargo los acoplamientos siguen funcionando, es decir se trasfiere magnetización entre los espines del mismo sistema.

•En suma logramos que la magnetización no decaiga y damos tiempo a trasferir coherencia. Un espin se correlaciona con todos los demás del sistema:

TOCSY

19USP-CEU

•La mayor transferencia entre dos espines con un acoplamiento de J Hz es óptima cuando el periodo del spin-lock, tm, es 1 / 2J. • El TOCSY-1D necesita un pulso π / 2 selectivo para afectar solo al espin que queremos ‘enganchar’Los dos pulsos antes y despues del mezclado son llamados pulsos de recorte (trimming pulses), y son necesarion para que el spin-lock funcione cuando usamos PC’s con pulsos duros como el MLEV o el DISPI…

• Durante tm tenemos mezclado de todos los espines que pertenezcan al mismo sistema en la molecula, osea que surgen cross-peaks de un espin a todos los demas. En t2 (f2) tambien detectamos δ y J, osea que el 2D es simetrico.

CT-COSY TOCSY

TOCSY

20USP-CEU

12

3

4

5

32

54

1

6 6

Picos TOCSY HN-Hββββs

TOCSY

21USP-CEU

Picos COSY HN-Hαααα

TIEMPO DE MEZCLA, POTENCIA

TOCSY

22USP-CEU

TOCSY

Gramicidina-S

23USP-CEU

2D 13C-13C INADEQUATE (Incredible Natural Abundance DoublE QUAntum Transfer Experiment) sería una especie de COSY de 13C utilísimo en teoría. Pero la probabilidad de que dos 13C queden juntos es solo del 0.01%. Por eso es poco utilizado a no ser que se disponga de muestras enriquecidas a un 10% en 13C y por ello la abundancia natural de los pares contiguos de 13C sea similar a la de un espectro normal de 13C y se pueden usar concentraciones normales porque si no, hacen falta entre 100 y 500 mg de muestra. Un 2D

INADEQUATE

24USP-CEU

hacen falta entre 100 y 500 mg de muestra. Un 2D INADEQUATE no tiene el mismo aspecto que un COSY porque el eje f2 es el espectro de carbono normal y el eje f1 es la frecuencia del doble cuanto es decir la suma de las frecuencias que correlacionan. No hay diagonal y cuando las señales que correlacionan están próximas se pierde sensibilidad debido a que los acoplamientos no son de primer orden. Aparecen a ambos lados de una seudo-diagonal de pendiente 2.

INADEQUATE

25USP-CEU

Mentol

CH3

OH

CH3 CH3

CH3

OH

CH3 CH3

INADEQUATE

26USP-CEU

INADEQUATESimetrizado

3 3