Imobilizacija lipaze na maghemitne nanodelce, modificirane

Matej Žarn

Imobilizacija lipaze na maghemitne nanodelce,

modificirane z aminosilanom

Diplomsko delo

Maribor, december 2014

Imobilizacija lipaze na maghemitne nanodelce, modificirane z aminosilanom

Imobilizacija lipaze na maghemitne nanodelce,

modificirane z aminosilanom

Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa

Študent: Matej Žarn

Študijski program: univerzitetni študijski program Kemijska tehnologija

Smer: Biokemijska tehnika

Mentor: red. prof. dr. Maja Leitgeb

Komentor: doc. dr. Mateja Primožič

Maribor, december 2014



I

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal sam, prispevki drugih so posebej označeni.

Maribor, december 2014 Matej Žarn


II

ZAHVALA

Zahvaljujem se mentorici red. prof. dr. Maji

Leitgeb in somentorici doc. dr. Mateji Primožič za

pomoč, vodenje in svetovanje pri opravljanju

diplomskega dela. Zahvala gre tudi Katji Heržič za

koristne nasvete in pomoč pri opravljanju

laboratorijskega dela ter ostalim strokovnim

sodelavcem Laboratorija za separacijske procese

in produktno tehniko.

Posebna zahvala gre tudi moji družini in punci za

vso podporo, vzpodbude besede, pomoč in

zaupanje vame.


III


Povzetek

Namen diplomske naloge je sinteza maghemitnih nanodelcev, prevlečenih z aminosilanom, ter

imobilizacija encima lipaze na pripravljen nosilec. Maghemitne nanodelce smo pripravili z obarjalno

reakcijo ali koprecipitacijo železovih II in železovih III ionov s 25 % amonijakom in jih prevlekli s

funkcionalno plastjo silike, nato pa še s plastjo aminosilana. Optimirali smo pogoje za dosego najvišje

učinkovitosti imobilizacije ter preostale aktivnosti imobiliziranega encima, kot so: koncentracija

encima, vrsta mrežnega povezovalca, čas imobilizacije ter koncentracija mrežnega povezovalca

glutaraldehida. Proučevali smo stabilnost imobiliziranega encima, vpliv časa in temperature

izpostavitve na ohranitev aktivnosti imobiliziranega ter prostega encima.

Najvišjo učinkovitost imobilizacije smo dosegli po aktivaciji magnetnih nanodelcev z 1 %

glutaraldehidom (GA), s koncentracijo encima 7,5 µL/mL ter časom imobilizacije 24 ur pri hitrosti

stresanja 410 rpm. Kljub visoki učinkovitosti imobilizacije smo v večini primerov dobili zelo nizke

ohranjene aktivnosti imobiliziranega encima, imobiliziran encim pa je pokazal boljšo stabilnost pri

povišani temperaturi v primerjavi s prostim encimom.

Ključne besede: nanotehnologija, imobilizacija encima, lipaza, aminosilanski maghemitni nanodelci,

aktivnost encima, učinkovitost imobilizacije.

UDK: 579.66(043.2)


IV

Immobilization of lipase onto maghemite nanoparticles, modified with

aminosilane

Abstract

The purpose of the diploma thesis is the synthesis of magnetic maghemite nanoparticles coated with

aminosilane and immobilization of lipase on a ready carrier. Maghemite nanoparticles were

synthesized by the coprecipitation technique of ferrous II and ferric III ions with 25 % ammonia and

coated with silica and afterwards with aminosilane. Process conditions for achieving the maximum

efficiency and the residual activity of the immobilized enzyme were optimized, by changing the

concentration of the enzyme, the type of a cross-linker, the time of immobilization and the

concentration of a cross-linker glutaraldehyde. Our subject of interest was also the stability of the

enzyme and how the remaining activity of the immobilized enzyme was affected by exposed time and

temperature.

Maximum efficiency was achieved after activating maghemite nanoparticles with 1 % glutaraldehyde

(GA), with the enzyme concentration of 7,5 µL/mL after 24 hours at 410 rpm. Despite a good binding

efficiency of the immobilization, very low residual activity was obtained in most cases. However, the

immobilized enzyme showed a better stability at increased temperatures as compared to the wild

enzyme.

Key words: nanotechnology, enzyme immobilization, lipase, aminosilane-coated maghemite

nanoparticles, enzyme activity, binding efficiency.

UDK: 579.66(043.2)


V

Kazalo vsebine

1 Uvod ..................................................................................................................................................... 1

2 Teoretični del ........................................................................................................................................ 2

2.1 Encimi ............................................................................................................................................ 2

2.1.1 Lipaze ...................................................................................................................................... 5

2.2. Imobilizacija biokatalizatorja ........................................................................................................ 6

2.2.1 Vezava encima na nosilec ....................................................................................................... 6

2.2.1.1 Kovalentna vezava encima na nosilec ............................................................................. 7

2.2.1.2 Zamreženi encimski skupki (CLEA) .................................................................................. 7

2.2.2 Tehnika zamreženja v polimerih ............................................................................................. 8

2.2.3 Mikroinkapsulacija .................................................................................................................. 8

2.3 Nanotehnologija ............................................................................................................................ 9

2.4 Nanodelci kot nosilci za imobilizacijo encimov ........................................................................... 10

2.4.1 Magnetni nanodelci .............................................................................................................. 11

2.4.2 Magnetne tekočine .............................................................................................................. 13

2.4.3 Priprava magnetnih delcev ................................................................................................... 14

2.4.4 Površinska modifikacija magnetnih nanodelcev .................................................................. 15

2.4.5 Aktivacija magnetnih nanodelcev z mrežnimi povezovalci .................................................. 16

2.4.5.1 Glutaraldehid (GA) ......................................................................................................... 16

2.4.5.2 Pentaetilenheksamin (PEHA) ......................................................................................... 17

3 Eksperimentalni del ............................................................................................................................ 18

3.1 Materiali in reagenti .................................................................................................................... 18

3.2 Laboratorijska oprema in aparature ........................................................................................... 19

3.3 Eksperimentalne metode ............................................................................................................ 20

3.3.1 Priprava magnetnih nanodelcev maghemita ....................................................................... 21

3.3.2 Priprava magnetne tekočine ................................................................................................ 22


VI

3.3.3 Priprava aminosilanskih maghemitnih nanodelcev .............................................................. 23

3.3.3.1 Nanos silike (SiO2) .......................................................................................................... 23

3.3.3.2 Nanos aminosilana na maghemitne nanodelce, prevlečene s siliko (γ-Fe2O3/SiO2) ..... 26

3.4 Imobilizacija lipaze na magnetne nanodelce............................................................................... 30

3.4.1 Določanje učinkovitosti imobilizacije ................................................................................... 31

3.4.1.1 Priprava Bradfordovega reagenta ................................................................................. 32

3.4.1.2 Priprava umeritvene krivulje ......................................................................................... 32

3.4.2 Izračun učinkovitosti imobilizacije ........................................................................................ 33

3.4.3 Merjenje preostale aktivnosti imobiliziranega encima ........................................................ 33

3.4.3.1 Aktivnostni test.............................................................................................................. 33

3.4.3.2 Izračun aktivnosti encima .............................................................................................. 34

3.4.4 Proučevanje stabilnosti encima ............................................................................................ 35

4 Rezultati in diskusija ........................................................................................................................... 36

4.1 Vpliv koncentracije encima na učinkovitost imobilizacije ........................................................... 36

4.2 Vpliv koncentracije glutaraldehida na učinkovitost imobilizacije .............................................. 37

4.3 Vpliv mrežnega povezovalca PEHA na učinkovitost imobilizacije in na ohranjeno aktivnost

encima ............................................................................................................................................... 38

4.4 Vpliv časa imobilizacije na učinkovitost vezave in ohranjeno aktivnost encima ......................... 40

4.5 Vpliv temperature na stabilnost imobilizirane lipaze .................................................................. 42

4.6 Vpliv kombinacije različnih mrežnih povezovalcev na učinkovitost imobilizacije in ohranjeno

aktivnost imobiliziranega encima ...................................................................................................... 44

5 Zaključek ............................................................................................................................................. 46

6 Viri ...................................................................................................................................................... 47

7 Priloge ................................................................................................................................................. 49

7.1 Umeritvena krivulja za določevanje koncentracije proteinov po Bradfordu .............................. 49

7.2 Tabele z rezultati ......................................................................................................................... 50

8 Življenjepis .......................................................................................................................................... 52


VII

Kazalo slik

Slika 2-1: Model delovanja encima ....................................................................................................... 2

Slika 2-2: Struktura lipaze ....................................................................................................................... 5

Slika 2-3: Vezava encima na trdni nosilec .............................................................................................. 6

Slika 2-4: Tehnike imobilizacije encimov: a) vezava encima na nosilec, b) kovalentna vezava na

nosilec, c) zamreženje (npr. zamreženi encimski skupki) , e) mikroinkapsulacija................................ 8

Slika 2-5: Shematski prikaz kubične strukture maghemita. ................................................................ 12

Slika 2-6: Nanodelci železovega oksida maghemita ............................................................................ 12

Slika 2-7: Magnetna tekočina .............................................................................................................. 13

Slika 2-8: Struktura glutaraldehida ...................................................................................................... 16

Slika 2-9: Struktura pentaetilenheksamina ......................................................................................... 17

Slika 3-10: Vorteks Micro+Polo ............................................................................................................ 19

Slika 3-11: Stresalnik (Heidolph Unimax 1010) .................................................................................... 20

Slika 3-12: UV-VIS spektrofotometer (Varian Cary 50 Probe) ............................................................. 20

Slika 3-13: Obarjanje z dodatkom raztopine amonijaka (sprememba barve) .................................... 21

Slika 3-14: Magnetna tekočina ............................................................................................................. 22

Slika 3-15: Priprava aminosilanskih delcev .......................................................................................... 23

Slika 3-16: Encim lipaza ........................................................................................................................ 30

Slika 3-17: Potek reakcije hidrolize nitrofenilbutirata ......................................................................... 33

Slika 3-18: Inkubator Binder ................................................................................................................. 35

Kazalo tabel

Tabela 2-1: Delitev encimov glede na vrsto reakcije, ki jo katalizirajo ................................................. 2

Tabela 7-2: Podatki in rezultati za relativno aktivnost encima in učinkovitost imobilizacije lipaze na

aminosilanske maghemitne nanodelce ............................................................................................... 50

Tabela 7-3: Podatki in rezultati za stabilnost imobiliziranega encima ............................................... 51

Tabela 7-4: Podatki in rezultati za stabilnost prostega encima .......................................................... 51


VIII

Seznam diagramov

Diagram 2-1: Vpliv temperature na katalitično aktivnost encima ........................................................ 3

Diagram 2-2: Vpliv pH-ja na katalitično aktivnost encima .................................................................... 3

Diagram 2-3: Hitrost encimsko katalizirane reakcije v odvisnosti od koncentracije encima (a) in

substrata (b) ............................................................................................................................................ 4

Diagram 4-4: Učinkovitost imobilizacije encima na aminosilanske maghemitne nanodelce v

odvisnosti od spremembe koncentracije encima. ............................................................................... 37


odvisnosti od koncentracije mrežnega povezovalca GA. .................................................................... 38


odvisnosti od mrežnega povezovalca. ................................................................................................. 39

Diagram 4-7: Ohranjena aktivnost encima, vezanega na aminosilanske maghemitne nanodelce, v

odvisnosti od mrežnega povezovalca. ................................................................................................. 39


odvisnosti od časa imobilizacije ........................................................................................................... 40


odvisnosti od časa imobilizacije ........................................................................................................... 41


odvisnosti od časa inkubacije in temperature ..................................................................................... 43

Diagram 4-11: Učinkovitost imobilizacije na aminosilanske maghemitne nanodelce v odvisnosti od

mrežnega povezovalca ......................................................................................................................... 45


odvisnosti od mrežnih povezovalcev ................................................................................................... 45

Diagram 7-13: Umeritvena krivulja za Bradfordovo metodo .............................................................. 49


IX

Uporabljeni simboli in kratice

a specifična površina maghemitnega nanodelca [m2·g-1]

aoc dolžina roba osnovne celice SiO2 [m]

𝑎𝛾−𝐹𝑒𝑂2𝑂3/𝑆𝑖𝑂2 specifična površina γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca [m2·g-1]

ce koncentracija raztopine encima [mg·mL-1]

df faktor redčenja

mAPTES masa aminosilana [g]

𝑚𝛾−𝐹𝑒𝑂2𝑂3/𝑆𝑖𝑂2 celokupna suha masa γ-Fe2O3/SiO2 nanodelcev [g]

𝑀𝛾−𝐹𝑒2𝑂3 molska masa maghemitnega nanodelca [m·mol-1]

mnanodelci masa vseh maghemitnih nanodelcev [g]

𝑚𝑁𝑎2𝑆𝑖𝑂3 masa Na2SiO3 [g]

MAPTES molska masa aminosilana [g·mol-1]

nAPTES množina aminosilana [mol]

Natomi število 𝑆𝑆𝑖𝑂2 atomov v osnovni celici

NA Avogadrovo število [mol-1]

NAPTES število molekul aminosilana na en nanodelec

NAPTES,dej dejansko število molekul aminosilana

NFe število Fe atomov v enem γ-Fe2O3/SiO2 nanodelcu

𝑛SiO2 množina atomov SiO2 [mol]

r polmer magnetnega nanodelca [nm]

𝑅𝑁𝐹𝑒/𝑁𝐴𝑃𝑇𝐸𝑆 razmerje NFe/NAPTES

R polmer γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca [m]

SAPTES površina ploskve ene molekule aminosilana [m2]

S celotna površina maghemitnih nanodelcev [m2]


X

𝑆𝛾−𝐹𝑒𝑂2𝑂3/𝑆𝑖𝑂2 površina enega γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca [m2]

𝑆𝛾−𝐹𝑒2𝑂3/𝑆𝑖𝑂2 površina γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca [nm2]

𝑆𝑆𝑖𝑂2 1/6 površine osnovne celice SiO2 [m2]

U/mlencima specifična aktivnost encima lipaza [ml-1]

tim čas imobilizacije [h]

T temperatura [°C]

VAPTES volumen aminosilana [mL]

Vk končni volumen [mL]

𝑉Na2SiO3 volumen Na2SiO3 [mL]

�̅�𝛾−𝐹𝑒2𝑂3 molski volumen maghemitnih nanodelcev [cm3·mol-1]

Uporabljeni grški simboli

ρAPTES gostota aminosilana [g·mL-1]

𝜌Na2SiO3 gostota Na2SiO3 [g·cm-3]

𝜌𝛾−𝐹𝑒2𝑂3 gostota maghemitnega nanodelca [g·m-3]

ν število vrtljajev [rpm]

γi koncentracija prostega encima [mg·mL-1]

γs koncentracija encima v supernatantu in spiranjih [mg·mL-1]

λ valovna dolžina (nm)

ρ relativna aktivnost [%]

φ učinkovitost imobilizacije [%]


XI

Kratice

APTES (3-Aminopropil)trietoksisilan

Fe železo

Fe2+ železovi II ioni

Fe3+ železovi III ioni

Fe(OH)3 železov hidroksid

FeCl3·4H2O železov klorid tetrahidrat

FeCl3·6H2O železov klorid heksahidrat

GA glutaraldehid

HCl klorovodikova kislina

Na2SiO3 natrijev silikat

NaH2PO4·H2O vodna raztopina natrijevega fosfata

NaOH natrijev hidroksid

NH3 amonijak

-OH hidroksilna funkcionalna skupina

PBS fosfatni pufer

PEHA pentaetilen heksamin

rpm hitrost stresanja (obrati/min)

γ-Fe2O3 maghemit


1

1 Uvod

Biokataliza zajema uporabo encimov za izvedbo kemijskih pretvorb na organskih spojinah. Za to se

uporabljajo encimi izolirani iz celic ali pa celotne celice z encimi znotraj njih. Zgodovinsko najbolj znana

uporaba biokatalizatorjev je v industriji hrane in pijače. V zadnjih desetletjih pa se je razširila njihova

uporaba predvsem v kemični, farmacevtski in kozmetični industriji. Pri organski sintezi je zelo

pomembna selektivnost molekul, ki je potrebna za vzdrževanje visokega izkoristka posameznega

produkta. Biokataliza je še posebej pomembna pri sintezi čistih enantiomerov, ki služijo kot surovine za

zdravilne učinkovine ter kemikalije v kmetijstvu. Prednost biokatalizatorjev je tudi v tem, da so okolju

neškodljivi, saj so popolnoma razgradljivi. Prav tako encimi delujejo pod blagimi pogoji, kar zmanjša

probleme povezane z nezaželenimi stranskimi reakcijami in produkti. Možna pa je tudi njihova uporaba

v več zaporednih reakcijah. [1]

Encimi pa imajo tudi slabe plati. S časom postopoma izgubljajo aktivnost in občutljivi so na zunanje vplive

okolja, kot so temperatura, visok tlak, topila, pH, oksidacija ter sušenje. Vsi ti dejavniki lahko vodijo do

konformacijskih sprememb, kar posledično povzroči deaktivacijo encima.

Zaradi tega encime imobiliziramo. To je tehnika, s katero fizično omejimo ali lokaliziramo encim z

ohranitvijo njegove aktivnosti. Pri imobilizaciji je lahko encim pritrjen na matrico ali lokaliziran na druge

načine. Glavne prednosti metode so: izboljšana stabilnost encima, izboljšanje delovanja encima zaradi

povečanja kontaktne površine med encimom in substratom ter ponovna uporaba oz. neprekinjena

uporaba encimov v različnih reakcijah skozi daljše obdobje. [2]

Namen diplomskega dela je priprava maghemitnih nanodelcev prevlečenih z aminosilanom in

imobilizacija specifičnega biokatalizatorja lipaze na maghemitne nanodelce. S spreminjanjem pogojev

imobilizacije smo opazovali kakšen vpliv imajo le ti na učinkovitost imobilizacije in na ohranjeno

aktivnost lipaze po končani imobilizaciji. Zanimala nas je tudi stabilnost imobiliziranega encima v

primerjavi s prostim encimom pri višjih temperaturah.


2

2 Teoretični del

2.1 Encimi

Encimi so beljakovine ali beljakovinski kompleksi. V organizmih reagirajo s snovmi, katere imenujemo

substrati. Molekula substrata, ki je običajno manjša od molekule encima, se veže na posebno področje

na encimu – aktivno mesto. Encimi so kot katalizatorji specifični, kar pomeni, da en encim deluje le na

eno vrsto substrata ali na skupino različnih substratov s podobno kemijsko zgradbo. Po združitvi encima

in substrata nastane kompleks encim-substrat. Pri tem se zmanjša aktivacijska energija substrata, kar

povzroči, da reakcija poteče. Encim se nato odcepi. [3]

Slika 2-1 predstavlja najenostavnejši model delovanja encima. Molekula izbranega substrata se precej

dobro prilega aktivnemu mestu encima in skupaj tvorita reakcijski intermediat.

Slika 2-1: Model delovanja encima [4]

Encime delimo v 5 razredov, glede na vrsto reakcije, ki jo katalizirajo (tabela 2-1).

Tabela 2-1: Delitev encimov glede na vrsto reakcije, ki jo katalizirajo

Klasifikacijsko št. Razred encimov Vrsta reakcije, ki jo katalizirajo

1 oksidoreduktaze Prenos elektronov, navadno v obliki hidridnih ionov ali vodikovih atomov

2 transferaze Prenos funkcionalnih skupin iz ene molekule na drugo

3 hidrolaze Razcep vezi s hidrolizo

4 liaze Nastanek dvojnih vezi z odvzemom skupin ali adicija skupin na dvojne vezi

5 izomeraze Pretvorba enega izomera v drugega s prenosom skupin znotraj molekule

6 ligaze Z razgradnjo ATP sklopljen nastanek vezi C-C, C-S, C-O in C-N


3

Na aktivnost encima vplivajo številni dejavniki, kot so temperatura, pH, koncentracija encima in

substrata, inhibitorji itd.

Temperatura

Z zviševanjem temperature imajo molekule, ki reagirajo večjo kinetično energijo. Na ta način se povečuje

možnost uspešnega trka in se s tem veča hitrost. Obstaja določena temperatura, pri kateri ima katalitična

aktivnost encima svoj maksimum (diagram 2-1). Ta optimalna temperatura je za encime v človeških

celicah običajno okoli temperature človeškega telesa.

Nad to temperaturo se pričenja encimska struktura razčlenjati (denaturirati). Namreč pri višjih

temperaturah se prekinejo medmolekulske vezi, ker le-ta pridobi še večjo kinetično energijo.

Diagram 2-1: Vpliv temperature na katalitično aktivnost encima [4]

pH

Vsak encim deluje v precej majhnem pH območju. Obstaja pH (diagram 2-2), pri katerem je njegova

aktivnost največja (optimalen pH). To je zato, ker lahko spremembe v pH vrednosti prekinejo

medmolekulske vezi, spremenijo obliko encima in s tem zmanjšajo aktivnost encima.

Diagram 2-2: Vpliv pH-ja na katalitično aktivnost encima [4]


4

Koncentracija encima in substrata

Hitrost encimsko katalizirane reakcije je odvisna od koncentracije encima in substrata. Z večanjem

koncentracije se veča tudi hitrost. Za dano koncentracijo encima se hitrost reakcije povečuje z večanjem

koncentracije substrata do neke točke, preko katere nadaljnje večanje nima več vpliva na hitrost reakcije

(diagram 2-3). To je zato, ker so aktivna mesta encimskih molekul v danem trenutku praktično nasičena

s substratom. Kompleks encim/substrat se mora najprej ločiti, da se sprostijo aktivna mesta in lahko

sprejmejo več substrata.

Pod pogojem, da je koncentracija substrata visoka in da sta temperatura in pH konstantna, je hitrost

reakcije sorazmerna s koncentracijo encima (diagram 2-3).

a) b)

Diagram 2-3: Hitrost encimsko katalizirane reakcije v odvisnosti od koncentracije encima (a) in substrata (b) [4]


5

Inhibitorji encimske aktivnosti

Nekatere substance zmanjšujejo ali celo ustavijo katalitično aktivnost encimov v biokemičnih reakcijah.

Delujejo tako, da blokirajo ali onemogočijo vezavo substrata na aktivno mesto encima. Te kemikalije se

imenujejo zaviralci ali inhibitorji, saj inhibirajo biokemično reakcijo.

Inhibitorje, ki zasedejo aktivno mesto in s tem preprečijo molekuli substrata, da bi se vezala na encim,

imenujemo kompetitivni inhibitorji. Obstaja pa tudi inhibicija, pri kateri se lahko substrat in inhibitor

hkrati vežeta na molekulo encima. To vrsto imenujemo nekompetitivna inhibicija. Vezava inhibitorja ne

vpliva na vezavo substrata, vendar vpliva na katalitično delovanje encima. [4,5]

2.1.1 Lipaze

Lipaze (glicerol ester hidrolaze EC-3.1.1.3) so encimi, ki katalizirajo hidrolizo estrov - triacilglicerolov v

diacilglicerole, monoacilglicerole, glicerol in maščobne kisline (slika 2-2). So zelo razširjene, najdemo jih

lahko v bakterijah, glivah, rastlinah in živalih. Uporabljamo jih za hidrolizo maščob, pri sintezi arom, za

razgradnjo odpadkov, ki vsebujejo maščobe, v pralnih sredstvih, za živilsko industrijo (sirarstvo), pri

sintezi estrov, pri transesterifikaciji maščob in olj, v farmaciji in medicini, v analitiki, v papirni industriji,

v industriji usnja, v organski kemiji, …

Za klasično hidrolizo maščob se uporablja postopek, ki poteka pri visokih temperaturah (250 - 260 °C in

pri 50 bar) razmeroma dolgo časa, kar zahteva veliko energije in je iz okoljevarstvenega vidika oporečen.

Lipaze pa omogočajo hidrolizo maščob pri nizkih temperaturah (20 – 40 °C) v krajšem času. To je še

dodatni vzrok za uporabo lipaz pri hidrolizi maščob. [6,7]

Slika 2-2: Struktura lipaze [6]


6

2.2. Imobilizacija biokatalizatorja

Imobilizacija je lokalizacija molekul encima v času procesa katalize. Encimi so fizično vezani na trden

nosilec, preko katerega se pretaka substrat, ki ga encim pretvori v enega ali več produktov. Uporaba

imobiliziranih encimov ima vrsto prednosti pred uporabo v vodi topnih encimov:

- lahko jih večkrat uporabimo,

- možnost hitre ustavitve reakcije z odstranitvijo encimov (in obratno),

- z vezavo se encimi navadno stabilizirajo,

- produkti se ne kontaminirajo z encimom,

- cenejši procesi,

- kažejo večjo obstojnost v širšem območju temperature in pH,

- običajno so manj občutljivi na delovanje aktivatorjev in inhibitorjev.

Pri imobilizaciji encima na površino je najpomembneje, da izberemo metodo vezave, katera bi preprečila

izgubo aktivnosti s spreminjanjem kemijske strukture ali reakcijskih skupin na aktivnem mestu encima.

[8,9]

2.2.1 Vezava encima na nosilec

Vezava na nosilec je najstarejša tehnika imobilizacije encimov. Pri tej metodi sta količina vezanega

encima in njegova aktivnost po imobilizaciji odvisni od narave nosilca (slika 2-3). Izbira primernega

nosilca je odvisna od encima samega, kakor tudi od velikosti delca, površine, molarnega razmerja

hidrofilnih in hidrofobnih skupin encima ter kemijske sestave. Najpogosteje uporabljeni nosilci so

polisaharidi ali polisaharidni derivati, kot so: celuloza, dekstran, agaroza in poliakrilamidni gel. [8]

Slika 2-3: Vezava encima na trdni nosilec [8]


7

Glede na način vezave encima na nosilec poznamo več metod:

- fizično adsorbcijo,

- ionsko vezavo encima na nosilec ter

- kovalentno vezavo encima na nosilec.

2.2.1.1 Kovalentna vezava encima na nosilec

Kovalentna vezava je zelo razširjena metoda imobilizacije encima na nosilec. Temelji na nastanku

kovalentne povezave med encimom in nosilcem, kjer nastane vez med funkcionalno skupino na površini

nosilca in funkcionalno skupino aminokislinskih ostankov na površini encima (slika 2-4). Vezava med

biokatalizatorjem in nosilcem je zelo močna ter je posledično uhajanje biokatalizatorja minimalno. Za

vezavo je primernih več skupin, kot so npr. amino, karboksilna, hidroksilna in sulfidna skupina. Za

kovalentno vezavo se uporabljajo naravni (npr. celuloza, CM celuloza, agaroza) ter sintetični nosilci (npr.

derivati poliakrilamida), ki so narejeni iz netopnih materialov. Ostali materiali, ki so uporabni kot nosilci

za kovalentno vezavo encimov, so še: keramika, steklo in materiali iz kovinskih oksidov. [11,12]

2.2.1.2 Zamreženje

Metoda temelji na tvorbi intermolekularnih povezav encima z drugimi molekulami encima. Navzkrižna

povezava encima samega s seboj je draga in neučinkovita, saj določen del encimov deluje večinoma kot

opora in ne opravlja encimske funkcije (slika 2-4). To lahko vodi v zmanjšano aktivnost. Zaradi tega se

zamreženje navadno uporablja v sodelovanju še s katero drugo metodo. Najpogosteje se uporablja za

stabilizacijo adsorbiranih encimov in tudi za preprečevanje uhajanja encimov iz poliakrilamidnih gelov.

Glutaraldehid (GA) se najpogosteje uporablja kot reagent za zamreženje. [8,10]


8

2.2.2 Tehnika zamreženja v polimerih

Metoda temelji na zamreženju encima znotraj polimernega matriksa ali membrane. Primerna je

predvsem za imobilizacijo tistih encimov, katerih substrati in produkti, nastali med encimsko reakcijo,

imajo nizko molsko maso. Metoda se razlikuje od kovalentne vezave v tem, da se sam encim ne veže na

matrico oz. membrano. Zaradi tega je metoda zelo uporabna. Onemogoča namreč uhajanje encima,

hkrati pa omogoča prehajanje substrata. Pomembno je, da smo pazljivi pri izbiri polimera, saj moramo

izbrati takega, ki bo imel čim manj vpliva na aktivnost izbranega encima. [8,10]

2.2.3 Mikroinkapsulacija

Pri mikroinkapsulaciji encime zapremo v polprepustno membransko kapsulo. S tem je velikim

molekulam omejen vstop v kapsulo, medtem ko lahko majhne molekule prosto prehajajo skozi

polprepustno membrano. Tako membrana zadržuje ujet encim, medtem ko omogoča prost prehod

substratom in produktom med encimsko reakcijo (slika 2-4). Najpogosteje uporabljamo membrane iz

celuloznega nitrata in najlona. Metoda je enostavna in poceni, njena učinkovitost je v glavnem odvisna

od stabilnosti encima v kapsuli. [8]

Slika 2-4: Tehnike imobilizacije encimov: a) vezava encima na nosilec, b) kovalentna vezava na nosilec, c) zamreženje (npr. zamreženi encimski skupki), d) ujetje encima, e) mikroinkapsulacija. [11]


9

2.3 Nanotehnologija

Nanotehnologija je veda, ki izrablja posebne lastnosti nanomaterialov, tako tankih plasti kot kvantnih

pik, samoorganiziranih struktur in novih bioloških molekulskih gruč. Je delo, ki poteka na objektih, ki

merijo manj kot desetmilijoninko metra, na t. i. nanoskali, a imajo produkti uporabnost v realnem

svetu. To delo je izvedeno s samourejanjem atomov, molekul ali njihovih skupkov, ali pa so uporabljeni

kemijski in fizikalni procesi, s katerimi načrtujemo in ustvarjamo nanoobjekte ter jih postavljamo v

medsebojne povezave. Razvijajoča se nanotehnologija že ima in bo v prihodnosti imela vse večji vpliv

prav na vsa področja znanosti in tehnologije.

Tehnološki obeti in znanstvena odkritja nanotehnologije so izjemni, še posebej v proizvodnji

materialov, v medicini, v nanoelektroniki in varovanju zdravja, v biotehnologiji, informatiki in v

zagotavljanju varnosti. Postalo je že jasno, da bo imela nanotehnologija močan vpliv tudi na ekonomijo

in družbena dogajanja 21. stoletja.

Izzivi, ki naj bi jih nanotehnologija uresničila, so nešteti, od zgodnje diagnostike in zdravljenja

trenutno neozdravljivih bolezni, detekcije ene same rakave celice in njenega uničenja, minimizacije

elektronskih komponent, do izboljšanja površinskih lastnosti materiala, ki bi postal odporen proti

poškodbam in bi morebitne poškodbe znal sam odpraviti, ali pa bi opravljal več hkratnih funkcij,

kot na primer fotokatalizo, preprečevanje zaledenitve ali pisanja grafitov, itd. Tudi na teoretičnem

področju bo prišlo z razvojem novih orodij za opazovanje pojavov v nanosvetu do novih znanj, ki

bodo do zdaj makroskopsko razumevanje površin, rasti kristalov, gibanja zelo drobnih delcev, prevajanja

električnega toka in drugih zakonitosti morala postaviti v povsem novo luč. [13]


10

2.4 Nanodelci kot nosilci za imobilizacijo encimov

Nanodelci so drobni delci, ki so velikosti nanometrov (nm). Ker so premajhni, jih mnogokrat ne

vidimo s prostim očesom. Načeloma lahko vsako snov pripravimo v njeni nanostrukturni obliki, zato so

nanodelci najpogosteje čisto običajne snovi, na primer kovine (železo, zlato, srebro, cink), kovinski oksidi

(silicijev oksid, železov oksid, titanov dioksid …), ogljikovi delci, polimeri … Ker so tako majhni, imajo

večjo specifično površino in se lažje povezujejo z drugimi delci, zato so bolj kemijsko aktivni kot njihove

večje različice. Povečana kemijska aktivnost majhnih delcev prispeva k njihovemu medsebojnemu

združevanju v večje skupke. Pri tem se kemijske in fizikalne lastnosti nanodelcev izgubijo, kar želijo

proizvajalci preprečiti tako, da površino nanodelcev oksidirajo ali na površino nanesejo tanko plast druge

spojine in tako preprečijo združevanje nanodelcev.

Izbor nosilca je odvisen od njegovih površinskih lastnosti: Ali se bo encim adsorbiral na površino? Ali ima

material funkcionalne skupine, uporabne za vezavo z encimom? Ali se da površino nosilca kemijsko

modificirati?

Nosilce za encimsko imobilizacijo z adsorpcijo ali kovalentno vezavo moramo previdno izbrati, saj

vplivajo na aktivnost encima. V industrijskih procesih je pomemben faktor tudi strošek za nosilce, v

razmerju s celotnimi stroški procesa. Idealen nosilec je poceni, inerten, fizično močan in stabilen, poveča

specifičnost encima in zmanjša inhibicijo s produktom, pomakne pH optimuma k želeni vrednosti za

proces in onemogoča mikrobno rast. Pomembne interakcije med površino nosilca in reakcijsko zmesjo

so: sprememba pH raztopine z uporabo nabitega nosilca (sprememba katalitične aktivnosti), hidrofilnost

in hidrofobnost nosilca. Nekateri nanodelci imajo tudi ostale lastnosti, kot na primer feromagnetizem

(npr. magnetni železovi oksidi omogočajo transport biokatalizatorjev na magnetno področje), katalitično

površino (manganov oksid katalitično odstrani hidrogen peroksid, ki ga proizvaja večina oksidaz) ali

zmanjšanje površinskega okolja (titan z oksidacijo inaktivira encim). [14,15]


11

2.4.1 Magnetni nanodelci

Zadnja leta je velika pozornost namenjena uporabi nanodelcev v medicini. Posebno zanimiva je uporaba

magnetnih nanodelcev, ker nanje lahko vplivamo z magnetnim poljem. Zaradi njihovih magnetnih

lastnosti jih lahko spremljamo ali z njimi upravljamo na daljavo. Uporabljamo jih lahko za diagnostične

namene (na primer za povečevanje kontrasta pri slikanju z NMR-tehniko) ali terapevtske tehnike, kot sta

na primer magnetna hipertermija in ciljani vnos zdravilnih učinkovin. Pogoj za njihovo uporabo v

medicini je poleg njihove "nano" velikosti in zadovoljivih magnetnih lastnosti tudi netoksičnost in

specifične površinske lastnosti. Kot magnetni material za uporabo v obliki nanodelcev v medicini se

uporablja predvsem maghemit (γ-Fe2O3), ki velja za nestrupen material. Nanodelci se za medicinske

namene navadno uporabljajo v obliki suspenzij v fiziološkem mediju na vodni osnovi. Nanodelci morajo

ostati dispergirani v mediju tudi ob večjih spremembah v svojem okolju, kot so na primer spremembe v

ionski moči in pH-vrednosti medija. Da bi magnetne delce lahko dispergirali v tekočini, morajo izkazovati

superparamagnetne lastnosti. Take lastnosti imajo pri sobni temperaturi delci magnetnega materiala,

manjši od neke kritične velikosti, ki je navadno manjša od 15 nm. Superparamagnetni nanodelci zunaj

magnetnega polja ne kažejo spontane magnetne polarizacije. Med njimi ni magnetnih interakcij, ki bi

povzročale magnetno aglomeracijo. Stabilne koloidne suspenzije superparamagnetnih nanodelcev

imenujemo tudi magnetne tekočine. [16]


12

2.4.1.1 Maghemit

Maghemit γ - Fe2O3 je rdečerjavi mineral, ki ima spinelno strukturo z vrzelmi in je feromagneten. Ima

kubično zgradbo kristala (slika 2-5). Je ključna komponenta pri zapisu zvoka in slike pri magnetnih

trakovih, zaradi dobre kemične stabilnosti in biokompatibilnosti pa se pogosto uporablja kot magnetni

prenašalni material za ferofluidno hipertermijo v rakastih celicah. Ime maghemit je sestavljeno iz dveh

zlogov mineralov, in sicer Mag netit in angleško besedo za hematit Hem atit skupaj, na podlagi njegove

kemične sestave in magnetizma. Čisti maghemit se pri temperaturi 300 °C pretvori v hematit (α-Fe2O3).

Če se izognemo segrevanju maghemita do visokih temperatur in delce ustrezno stabiliziramo je

maghemit izredno obstojen material. [20]

Površina nanodelcev maghemita (slika 2-6) je relativno inertna in navadno ne omogoča močne

kovalentne vezave molekul. Zato je delce potrebno prevleči s plastjo silike, ki ima na površini silanolne

OH-skupine, ki omogočajo nadaljnjo vezavo učinkovin s kovalentno vezjo. [16]

Slika 2-5: Shematski prikaz kubične strukture maghemita. [21]

Slika 2-6: Nanodelci železovega oksida maghemita [22]


13

2.4.2 Magnetne tekočine

Magnetne tekočine so koloidne disperzije superparamagnetnih nanodelcev s povprečno velikostjo okoli

10 nm, katerih površina je prevlečena s tanko plastjo molekul površinsko aktivne snovi. Delci so stabilno

dispergirani v ustrezni polarni ali nepolarni nosilni tekočini. Uporabnost magnetne tekočine določata

predvsem njena magnetizacija, ki je odvisna od vsebnosti stabilno dispergiranih magnetnih delcev.

Dobre magnetne lastnosti in stabilnost, kljub daljši izpostavljenosti gravitacijskemu ali magnetnemu

polju, omogočata magnetnim tekočinam široko področje tehnoloških aplikacij, kot so npr. ciljno

doziranje zdravilnih učinkovin, NMR slikanje, magnetorelaksometrija, radioterapija, hipertermija itd.

Priprava magnetnih tekočin sestoji iz sinteze magnetnih nanodelcev, adsorbcije surfaktanta na njihovi

površini in suspendiranja prevlečenih nanodelcev v nosilni tekočini. Med obstoječimi načini priprave

magnetnih nanodelcev je najpogosteje v uporabi sinteza s koprecipitacijo, vendar je slabost te metode

v pomanjkljivi kontroli velikosti in morfologiji delcev.

Magnetne tekočine (slika 2-7) so torej tekočine, ki se odzivajo na magnetno polje. Feromagnetni

materiali so povečini snovi v trdnem agregatnem stanju, zato feromagnetne tekočine delujejo

nenavadno. Ko nanje ne deluje magnetno polje, imajo lastnosti oljnate tekočine, a ko jim približamo

magnet, spremenijo svoje lastnosti in tvorijo nenavadne oblike. [17,18]

Slika 2-7: Magnetna tekočina [19]


14

2.4.3 Priprava magnetnih delcev

Za sintezo magnetnih delcev se uporabljajo številni postopki, kot so termični razkroj, mikroemulzija,

sonokemijska in elektrokemična sinteza. Najpogosteje se uporablja tako imenovana metoda obarjanja

ali koprecipitacije magnetnih nanodelcev iz raztopine železovih ionov. Metoda temelji na mešanju

raztopin železovih II in železovih III ionov v molskem razmerju 1:2 v močno bazičnem reakcijskem mediju

pri sobni temperaturi.

Reakcija obarjanja se izvaja tudi pri visokih temperaturah. Na velikost in obliko delcev vpliva izbira

začetnega substrata, iz katerega obarjamo nanodelce. Kot substrat lahko uporabimo železov klorid,

sulfat, nitrat, perklorat, itd. Z atomskim razmerjem železovih ionov, temperaturo reakcije, pH vrednostjo

ter ionsko močjo reakcijskega medija lahko vplivamo na velikost in obliko nanodelcev.

Na nastanek maghemitnih nanodelcev odločilno vplivata temperatura in pH-vrednost reakcijskega

medija. Začetna pH-vrednost medija in temperatura pred začetkom reakcije obarjanja sta ključna

faktorja, ki vplivata na sestavo in velikost formiranih nanodelcev. Za sintezo čistih maghemitnih

nanodelcev je pomembno tudi razmerje med Fe2+ in Fe3+, ki mora biti do konca reakcije obarjanja

konstantno in je v idealnem primeru 0,5. Če je razmerje manjše od 0,5 lahko nastanejo nečistoče, ki

nimajo magnetnih lastnosti. [23]


15

2.4.4 Površinska modifikacija magnetnih nanodelcev

Za uporabo v medicini je treba na površino nanodelcev vezati različne biološke učinkovine. Vezavo

učinkovin na površino nanodelcev dosežemo preko funkcionalizacijskega sloja molekul, vezanih na

površino delcev. Te molekule zagotavljajo funkcionalne skupine za kemijsko vezavo različnih bioloških

učinkovin, hkrati pa zagotavljajo stabilnost suspenzije nanodelcev.

V splošnem so funkcionalni magnetni nanodelci zgrajeni iz železovega jedra in prevlečeni

s tanko, funkcionalno plastjo različnega izvora, organskega ali anorganskega materiala. Največkrat

so organske prevleke iz različnih polimerov kot so polistiren, polimetilmetakrilat in hitozan.

Med anorganskimi materiali se zaradi prednostnih lastnosti, ki so dobro izkoriščene za potrebe v

biomedicini, največ uporabljajo silikatne prevleke oz. silika (SiO2). Magnetni nanodelci, prevlečeni s

plastjo silike, imajo visoko mehansko trdnost, se ne zlepljajo ali aglomerirajo. Med drugim so tudi

biokompatibilni, kar jih naredi še posebno privlačne za ločevanje različnih bioaktivnih učinkovin, živih

celic ali proteinov.

Na voljo je več metod za pripravo visoko funkcionalnih nanokompozitov. Najpogosteje se za

funkcionalizacijo uporablja aminosilan. V tem primeru molekule aminosilana delujejo kot reaktivni sloj,

ki je vezan na plast anorganske silike na magnetnih nanodelcih. Molekule aminosilana zagotovijo visok

delež prostih amino skupin (-NH3) na zunanji površini magnetnih nanodelcev, kar omogoča nadaljnjo

vezavo substanc. [23,24]


16

2.4.5 Aktivacija magnetnih nanodelcev z mrežnimi povezovalci

Pred imobilizacijo encima na magnetne nanodelce je potrebno aktivirati funkcionalne skupine na

površini nanodelcev. Za aktivacijo se najpogosteje uporabljajo mrežni povezovalci, kot so

glutaraldehid (GA) in pentaetilenheksamin (PEHA).

2.4.5.1 Glutaraldehid (GA)

GA je organska spojina z molekulsko formulo C5H8O2 (slika 2-8). Je brezbarvna, viskozna tekočina z ostrim

vonjem. Topi se v vodi, benzenu in alkoholih. Uporablja se za imobilizacijo proteinov, pri encimskih

reakcijah, pri imunokemijskih raziskavah, afinitetni kromatografiji ter kot mrežni povezovalec za

biosenzorje.

Slabost uporabe GA kot mrežnega povezovalca je v tem, da zaradi visoke reaktivnosti in majhnosti lahko

reagira z aktivnim mestom na encimu in povzroča njegovo deaktivacijo.

Za izvajanje imobilizacije z GA se uporabljata dva osnovna mehanizma:

- aktivacija encimskih nosilcev (magnetni nanodelci, poliakrilamid, pore stekla),

- zamreženje encima, pri čemer GA encimske molekule medsebojno povežejo, da nastane gel

(membrane pri encimskih elektrodah, optični senzorji).

GA je mrežni povezovalec, ki ga uspešno uporabljamo pri imobilizaciji encimov, saj vezava poteče hitro

in zanesljivo. Njegova uporaba je zelo razširjena na različnih področjih, predvsem pri encimski in celični

vezavi. GA je enostaven za uporabo in v različnih oblikah, ki so odvisne od pogojev raztopine. V vodnih

raztopinah je večkomponentna mešanica in pri pH 3,1 aldehidne skupine oksidirajo v karboksilne

skupine. GA se nahaja v kislih ali nevtralnih raztopinah kot monomer v obliki hidrata ali hemiacetala.

Medtem ko pri višjih koncentracijah polimerizira do oligomernega hemiacetala. Pri bazičnih pogojih je

izpostavljen adolni kondenzaciji, ki tvori α, β – nenasičene aldehide. [25,27]

Slika 2-8: Struktura glutaraldehida


17

2.4.5.2 Pentaetilenheksamin (PEHA)

PEHA je rumenkasta, bistra in viskozna tekočina s formulo C10H28N6 (slika 2-9). Je topna v vodi, etanolu,

acetonu, etru in benzenu ter ima pomembno vlogo v številnih industrijskih panogah. Kot trdilec se

uporablja pri delu z epoksi smolami, je pa tudi intermediat pri sintezi številnih substanc, ko so npr.

kemikalije, katere se uporabljajo kot dodatek k asfaltu pri asfaltiranju cest. PEHA ima široko uporabo

tudi v proizvodnji mazalnega olja in dodatkom goriva.

PEHA je zdravju nevaren, ob stiku z očmi pa povzroči rahle do zmerne opekline. Povzroči lahko tudi

zmerno draženje kože ali alergijsko reakcijo kože s simptomi rdečice, srbenja, otekanja ali izpuščajev.

Hlapi lahko dražijo oči, nos, grlo in dihala. Pri zaužitju se lahko pojavi slabost, bruhanje, bolečine v

trebuhu, opekline v grlu, požiralniku in želodcu. [28]

Slika 2-9: Struktura pentaetilenheksamina


18

3 Eksperimentalni del

3.1 Materiali in reagenti

Pri eksperimentalnem delu smo uporabili naslednje kemikalije:

- železov klorid heksahidrat (FeCl3·6H2O, Merck)

- železov klorid tetrahidrat (FeCl2·4H2O, Merck)

- 96 % etanol (Kefo)

- 37 % klorovodikova kislina (HCl, Merck)

- 25 % amonijak (NH3, Merck)

- metanol (Sigma-Aldrich)

- parafinsko olje (Pharmachem)

- citronska kislina (Merck)

- natrijev hidroksid (NaOH, Merck)

- 25 % glutaraldehid (GA, Sigma-Aldrich)

- pentaetilen heksamin (PEHA, Sigma-Aldrich)

- aminoorganosilan ((3-Aminopropil)trietoksisilan (APTES), Sigma-Aldrich)

- natrijev dihidrogen fosfat monohidrat (NaH2PO4·H2O, Merck)

- kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4, Merck)

- barvilo Coomassie Brilliant Blue (Merck)

- 85 % (v/v) fosforna kislina (H3PO4, Merck)

- deionizirana voda

- 4-nitrofenil butirat (C10H11NO4, Sigma-Aldrich)

-encim lipaza Lipozyme TL 100 L (Novozymes)


19

3.2 Laboratorijska oprema in aparature

Pri eksperimentalnem delu smo uporabili naslednjo opremo in aparature:

- stekleni reaktor s tremi vratovi

- mikrocentrifugirke (1,5 ml in 2 ml)

- steklene čaše (50 ml, 100 ml, 250 ml, 400 ml, 1000 ml)

- centrifugirke (50 ml)

- epruvete

- merilne valje (1000 ml, 100 ml, 50 ml)

- pipete (5 ml, 1 ml, 0,1 ml)

- termometer

- ultrazvočno in vodno kopel

- tehtnico (Sartorius, Nemčija)

- pH meter (Hanna Instruments, Madžarska)

- vorteks (Mikro+Polo, Slovenija) (slika 3-10)

- stresalnik (Heidolph Unimax 1010, Nemčija) (slika 3-11)

- magnetno mešalo (Rotamix, Slovenija)

- UV-VIS spektrofotometer (Varian Cary 50 Probe) (slika 3-12)

- centrifugo (Eppendorf Centrifuge 5804R, Nemčija)

- sušilnik (Binder, Nemčija)

Slika 3-10: Vorteks Micro+Polo


20

Slika 3-11: Stresalnik (Heidolph Unimax 1010)

Slika 3-12: UV-VIS spektrofotometer (Varian Cary 50 Probe)

3.3 Eksperimentalne metode

Laboratorijsko delo je obsegalo imobilizacijo encima lipaze na maghemitne nanodelce prevlečene s

plastjo aminosilana. Najprej smo pripravili zadostno količino maghemitnih nanodelcev ter magnetne

tekočine, ki smo jo potrebovali za sintezo aminosilanskih maghemitnih nanodelcev. Sledila je

imobilizacija encima na pripravljene nanodelce in preverjanje učinkovitosti imobilizacije ter preostale

aktivnosti imobiliziranega encima.


21

3.3.1 Priprava magnetnih nanodelcev maghemita

Maghemitne nanodelce smo pripravili z obarjalno reakcijo ali koprecipitacijo Fe ionov

(c(Fe2+) = 0,027 mol/L, c(Fe3+) = 0,023 mol/L ) s koncentriranim amonijakom (25 %). V 250 mL čašo smo

zatehtali 2,684 g FeCl3·6H2O in 3,11 g FeCl2·4H2O. Snovi smo ločeno raztopili v 250 mL miliQ vode in čaši

z raztopinama postavili za 5 minut na ultrazvočno kopel. Sinteza maghemitnih nanodelcev je potekala v

steklenem reaktorju s tremi pokončnimi vratovi, dodatno opremljenim z mehanskim mešalom.

Nato smo počasi dodajali predhodno pripravljeno raztopino amonijaka (150 mL miliQ vode in 3 mL 25 %

amonijaka), da smo zvišali pH vrednost železovih ionov na pH = 3 ± 0,1 in jo ob konstantnem mešanju

vzdrževali 30 minut. Pri tem se obori Fe(OH)3, kar lahko opazimo kot spremembo barve iz oranžne v

črno (slika 3-13).

V drugi stopnji smo na hitro dodali 250 ml amonijaka v reaktor, s tem zvišali pH na 11 ± 0,1 ter pustili

raztopino mešati še naslednjih 30 minut. V tej stopnji se železov hidroksid oksidira z zračnim kisikom in

nastane produkt iz maghemita. Reaktor smo postavili na magnet ter počakali eno uro, da so se delci

posedli. Preostalo tekočino smo odlili v odpadno čašo, posedene delce pa obdržali z magnetom v

reaktorju. Ponovno smo dodali raztopino amonijaka (150 mL miliQ vode + 3 mL amonijaka), premešali

in prelili delce iz reaktorja v čašo. Čašo smo postavili na magnet in po nekaj minutah odlili odpadno

tekočino. Čašo s preostalimi maghemitnimi nanodelci smo stehtali. Nato smo s spiranjem in magnetom

odstranili delce, ki niso bili namagneteni. Sprane in posušene delce smo zdrobili v terilnici ter jih uporabili

za nadaljnje postopke. [18]

Slika 3-13: Obarjanje z dodatkom raztopine amonijaka (sprememba barve)


22

3.3.2 Priprava magnetne tekočine

Sprane magnetne delce, sintetizirane po opisanem postopku v poglavju 3.3.1, smo dispergirali v 60 mL

miliQ vode. S tem smo preprečili aglomeracijo nanodelcev in omogočili prekritje nanodelcev s

surfaktantom. Mešanici smo dodali 2,5 mL raztopine citronske kisline (2,5 g citronske kisline raztopljene

v 5 mL miliQ vode). Kislina preprečuje aglomeracijo nanodelcev ter tako pripomore k večji stabilnosti

suspenzije. Nato smo s 25 % amonijakom, ki smo ga dodajali po kapljicah, uravnali vrednost pH na

5,2 ± 0,1, saj je pri tej pH vrednosti adsorpcija kisline na nanodelce najučinkovitejša. Tako pripravljeno

suspenzijo smo segreli na 75 °C in mešali 90 minut. V tem času se je citronska kislina vezala na površino

nanodelcev.

Po končanem mešanju smo suspenzijo ohladili na sobno temperaturo in z amonijakom uravnali pH na

10,1 ± 0,1. Pri pH = 10,1 se količina nanodelcev, ki preidejo v stabilno suspenzijo, močno poveča.

Neaglomerirani delci v suspenziji so tako dolgoročno stabilni. Nato smo suspenzijo centrifugirali 5 minut

na 5000 rpm in tako iz tekočine odstranili aglomerirane ter nestabilne delce. Magnetno tekočino

(slika 3-14) smo zatem uporabili za sintezo aminosilanskih maghemitnih nanodelcev. [16]

Slika 3-14: Magnetna tekočina


23

3.3.3 Priprava aminosilanskih maghemitnih nanodelcev

Kemijska modifikacija površine maghemitnih nanodelcev je potekala v dveh stopnjah. Ker je površina

maghemitnih nanodelcev inertna, ne omogoča močne kovalentne vezave molekul. Zaradi tega je

potrebno nanodelce prevleči s tanko funkcionalno plastjo silike (SiO2). Kot izvorni material za nastanek

funkcionalnega plašča iz silikatne prevleke smo izbrali natrijev silikat (Na2SiO3).

V drugi stopnji smo izvedli reakcijo silanizacije z aminosilanom za sintezo visoko funkcionalnih

maghemitnih nanodelcev, pripravljenih za nadaljnjo površinsko obdelavo (slika 3-15). Aminosilan, ki smo

ga uporabili za pripenjanje aminoskupin na površino maghemitnih nanodelcev, je

(3-Aminopropil)trietoksisilan ali na kratko APTES, ki spada v široko družino silanov. [24]

Slika 3-15: Priprava aminosilanskih delcev

3.3.3.1 Nanos silike (SiO2)

Magnetno tekočino (60 mL) smo v čaši segreli na 85 - 90 °C. Nato smo dodali določeno količino raztopine

natrijevega silikata v prebitku ter s pomočjo mehanskega mešala zmes mešali 3 ure pri temperaturi 90 °C.

Mešanico smo nato ohladili na sobno temperaturo in z 0,1 M HCl znižali pH na 6,0 ± 0,1. Temu je sledilo

centrifugiranje pri 5000 rpm za 5 minut, da smo ločili delce od supernatanta. Supernatant smo zavrgli,

posedene delce pa pustili, da so se posušili na zraku.


24

Količino Na-silikata, ki smo ga dodali v stabilno magnetno tekočino, smo določili na osnovi teoretične

velikosti premera enega nanodelca, ki znaša približno 20 nm, in dejanske mase maghemitnih

nanodelcev, ki smo jih uspešno dispergirali v stabilni magnetni tekočini. Pri izračunu smo upoštevali še

gostoto nanodelca, ki znaša 4,87 g·cm-3. Osnovna celica SiO2 naj bo kubične oblike z robovi dolžine 0,716

nm, kar upoštevamo pri izračunu površine osnovne celice SiO2. Za izračun potrebne količine natrijevega

silikata smo uporabili naslednje matematične zveze [23]:

a) izračun specifične površine magnetnega delca

a = 3

𝑟∙𝜌 (3.1)

a -specifična površina maghemitnega nanodelca [m2·g-1]

r -polmer magnetnega nanodelca [nm]

ρ -gostota maghemitnega nanodelca [g·cm-3]

b) izračun celotne površine maghemitnih nanodelcev

S = a∙mnanodelci (3.2)

S -celotna površina maghemitnih nanodelcev [m2]

a -specifična površina maghemitnega nanodelca[m2·g-1]

mnanodelci-masa vseh maghemitnih nanodelcev [g]

c) izračun površine osnovne celice SiO2, ki sestavlja plast silike:

𝑆SiO2 =

1

6·6·aOC

2 (3.3)

𝑆SiO2 -1/6 površine osnovne celice SiO2 [m2]

aOC -velikost stranice osnovne celice [nm]


25

d) izračun števila atomov v osnovni celici SiO2:

Natomi = 𝑆

𝑆SiO2

(3.4)

Natomi -število 𝑆𝑆𝑖𝑂2 atomov v osnovni celici

S -celotna površina maghemitnih nanodelcev [m2]

𝑆SiO2 -1/6 površine osnovne celice SiO2 [m2]

e) izračun množine SiO2 atomov:

𝑛SiO2 =

𝑁atomi

𝑁A (3.5)

Natomi -število atomov SiO2

𝑛SiO2 -množina atomov SiO2 [mol]

NA -Avogadrovo število [mol-1]

f) izračun mase SiO2 za nanos silike na površino maghemitnih nanodelcev:

𝑚Na2SiO3= 𝑛SiO2

∙ 𝑀Na2SiO3 (3.6)

𝑚Na2SiO3 -masa Na2SiO3 [g]

𝑛SiO2 -množina atomov SiO2 = množini atomov Na2SiO3 [mol]

𝑀Na2SiO3 -molska masa Na2SiO3 [g·mol-1]

g) izračun SiO2 za nanos silike na površino maghemitnih nanodelcev:

𝑉Na2SiO3 = 𝑚Na2SiO3

𝜌Na2SiO3

(3.7)

𝑉Na2SiO3 -volumen Na2SiO3 [mL]

𝑚Na2SiO3 -masa Na2SiO3 [g]

𝜌Na2SiO3 -gostota Na2SiO3 [g·cm-3]


26

3.3.3.2 Nanos aminosilana na maghemitne nanodelce, prevlečene s siliko (γ-Fe2O3/SiO2)

V manjši čaši smo 1 mL miliQ vode dodali izračunan volumen APTES in naravnali pH-vrednost raztopine

na vrednost 4,0 ± 0,1 s počasnim dodajanjem mravljične kisline. Čista raztopina APTES je rahlo rumene

barve, ob dodatku vode ter kisline pa se zaradi procesa hidrolize obarva oranžno-rjavo.

Posušenim in zdrobljenim nanodelcem, prevlečenim s plastjo silike, smo dodali 20 mL metanola ter še

20 mL glicerola. Suspenzijo smo segreli na 90 °C in ob tem intenzivno mešali z mehanskim mešalom.

Nato smo po kapljicah dodali predhodno pripravljeno raztopino aminosilana in zmes pustili mešati tri

ure. Po zaključeni reakciji smo zmes ohladili ter centrifugirali 5 minut pri 5000 rpm. Supernatant smo

zavrgli, delce pa smo sprali z raztopino NaCl in ponovno centrifugirali. Delce smo nato hranili v zaprti

posodi do njihove uporabe.

Volumen izbranega aminosilana, ki smo ga dodali suspenziji, je odvisen od suhe mase nanodelcev

prevlečenih s siliko. V enačbah smo upoštevali, da premer delcev γ-Fe2O3/SiO2 znaša približno 26 nm,

ena molekula polimera iz aminosilana pa prekriva površino γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca v velikosti 0,40 nm2.

Za izračun smo uporabili naslednje matematične zveze [23]:

a) izračun števila Fe atomov v enem γ-Fe2O3/SiO2 nanodelcu:

𝑁𝐹𝑒 =4

3∙𝜋∙𝑅3∙𝑁A

�̅�γ−Fe2O3

· 2 (3.8)

NFe -število Fe atomov v nanodelcu

R -polmer maghemitnega nanodelca [cm]


�̅�γ−Fe2O3 -molski volumen maghemitnih nanodelcev [cm3·mol-1]


27

b) izračun molskega volumna maghemitnih nanodelcev

�̅�γ−Fe2O3 =

𝑀γ−Fe2O3

𝜌γ−Fe2O3

(3.9)

�̅�γ−Fe2O3 -molski volumen maghemitnih nanodelcev [cm3·mol-1]

𝑀γ−Fe2O3 -molska masa maghemitnega nanodelca [m·mol-1]

𝜌γ−Fe2O3 -gostota maghemitnega nanodelca [g·ml-1]

c) izračun teoretičnega števila molekul aminosilana na nanodelec:

𝑁APTES =𝑆γ−Fe2O3/SiO2

𝑆APTES =

4∙𝜋∙𝑅2

𝑆APTES (3.10)

𝑁APTES -število molekul aminosilana

𝑆γ−Fe2O3/SiO2 -površina γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca [nm2]

SAPTES -površina ploskve ene molekule aminosilana [nm2]

R -polmer γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca [nm]

d) izračun atomskega razmerja NFe/NAPTES:

𝑅NFe/NAPTES =

𝑁Fe

𝑁APTES (3.11)

NFe -število Fe atomov v enem γ-Fe2O3/SiO2 nanodelcu

NAPTES -število molekul aminosilana na en nanodelec


28

e) izračun specifične površine γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca:

𝑎γ−FeO2O3/SiO2 =

3

𝑅∙𝜌γ−Fe2O3

(3.12)

𝑎γ−FeO2O3/SiO2 -specifična površina γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca [m2·g-1]

R -polmer γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca [m]

𝜌γ−Fe2O3 -gostota maghemitnega nanodelca [g·m-3]

f) izračun celokupne površine γ-Fe2O3/SiO2 nanodelcev

S = 𝑎γ−FeO2O3/SiO2·𝑚γ−FeO2O3/SiO2

(3.13)

S -celokupna površina γ-Fe2O3/SiO2 nanodelcev [m2]

𝑎γ−FeO2O3/SiO2 -specifična površina γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca [m2·g-1]

𝑚γ−FeO2O3/SiO2 -celokupna suha masa γ-Fe2O3/SiO2 nanodelcev [g]

g) izračun dejanskega števila molekul aminosilana, ki prekrivajo celotno površino γ-Fe2O3/SiO2

nanodelcev:

𝑁APTES,dej =𝑁APTES∙𝑆

𝑆γ−FeO2O3/SiO2

(3.14)

𝑁APTES,dej -dejansko število molekul aminosilana

𝑁APTES -število molekul aminosilana na en nanodelec

𝑆γ−FeO2O3/SiO2 -površina enega γ-Fe2O3/SiO2 nanodelca [m2]

S -celokupna površina γ-Fe2O3/SiO2 nanodelcev [m2]


29

h) izračun množine aminosilana:

𝑛APTES =𝑁APTES,dej∙𝑅NFe/NAPTES

𝑁A (3.15)

nAPTES -množina APTES [mol]

𝑁APTES,dej -dejansko število molekul APTES

𝑅NFe/NAPTES -razmerje NFe/NAPTES


i) izračun mase aminosilana:

mAPTES = nAPTES·MAPTES (3.16)

mAPTES -masa APTES [g]

nAPTES -množina APTES [mol]

MAPTES -molska masa APTES [g·mol-1]

j) izračun volumna APTES:

𝑉APTES =𝑚APTES

𝜌APTES (3.17)

𝑉APTES -volumen APTES [mL]

mAPTES -masa APTES [g]

ρAPTES -gostota APTES [g·ml-1]


30

3.4 Imobilizacija lipaze na magnetne nanodelce

Pred izvedbo imobilizacije lipaze na magnetne nanodelce je potrebno površino magnetnih nanodelcev

aktivirati. V mikrocentrifugirke smo zatehtali 5 mg predhodno pripravljenih aminosilanskih maghemitnih

nanodelcev ter dodali 1 mL pufra s pH = 7 in določeno količino GA oziroma 1 mL 0,02 M PEHA. Zmes smo

dobro zvorteksirali ter stresali 2 uri pri sobni temperaturi. Po končanem stresanju smo

mikrocentrifugirke postavili na magnet, da so se delci posedli na dno in odpipetirali supernatant ter ga

zavrgli. Delce smo ponovno sprali s pufrom pH = 7. S tem postopkom smo pridobili aktivirane trde

nosilce.

K aktiviranim delcem smo nato dodali 1 mL določene koncentracije lipaze Lipozyme TL 100 L (slika 3-16).

Ponovno smo dobro zvorteksirali ter delce z raztopino encima stresali na stresalniku pri 410 rpm 24 ur

pri sobni temperaturi. Po končani imobilizaciji smo mikrocentrifugirke spet postavili na magnet, da so se

delci posedli in odpipetirali supernatant v novo mikrocentrifugirko. Sledilo je spiranje, saj je bilo

potrebno odstraniti encim, ki se ni vezal. K delcem smo dodali 1 mL 0,1 M fosfatnega pufra PBS

(NaH2PO4·H2O), zmes dobro zvorteksirali, mikrocentrifugirko postavili na magnet in ponovno

odpipetirali supernatant v novo mikrocentrifugirko. Dodali smo 1 mL pufra in postopek še enkrat

ponovili. Postopek smo ponavljali, dokler v supernatantu ni bilo več zaznati proteinov. Na ta način smo

si pripravili vzorce, s pomočjo katerih smo določili učinkovitost imobilizacije ter ohranjeno aktivnost

vezanega encima.

Za določanje učinkovitosti imobilizacije smo uporabili kolorimetrično metodo po Bradfordu, preostalo

aktivnost pa smo določili z aktivnostnim testom za lipaze.

Slika 3-16: Encim lipaza


31

3.4.1 Določanje učinkovitosti imobilizacije

Koncentracijo imobiliziranega biokatalizatorja smo določevali s kolorimetrično metodo po Bradfordu, ki

uporablja barvni reagent Coomassie Brilliant Blue za detekcijo proteinov v vzorcu. Metoda temelji na

dejstvu, da se barvilo Coomassie Brilliant Blue G-250 specifično veže na protein in se rdeča barva barvila

spremeni v modro, s tem pa se spremeni absorpcijski maksimum barvila iz 465 na 595 nm.

Koncentracijo proteinov smo merili pri valovni dolžini λ=595 nm na UV-VIS spektrofotometru, s

programom Advanced reads. Vzorce smo si pripravili tako, da smo k 1 mL Bradfordovega reagenta dodali

20 μL encimskega vzorca. Za umeritev s slepim vzorcem pa smo namesto encimskega vzorca uporabili

20 µl pufra PBS. Pripravljene vzorce smo dobro zvorteksirali, inkubirali 15 min na sobni temperaturi in

izmerili absorbance. Izmerili smo tudi absorbanco prostega encima.

Na podlagi umeritvene krivulje za Bradfordovo metodo (diagram 7-1) smo nato preko absorbanc določili

koncentracije encima v supernatantu in spiranjih ter tudi koncentracijo prostega encima. Iz teh podatkov

smo nato po enačbi 3.18 izračunali učinkovitost imobilizacije.


32

3.4.1.1 Priprava Bradfordovega reagenta

Bradfordov reagent smo pripravili tako, da smo raztopili 100 mg barvnega reagenta Coomassie Brilliant

Blue v 100 mL 85 % fosforne kisline in v 50 mL 95 % etanola. Nato smo celotno zmes razredčili na

volumen 1L z miliQ vodo.

3.4.1.2 Priprava umeritvene krivulje

Za pripravo umeritvene krivulje, katero smo uporabili za izračunavanje koncentracije proteinov v vzorcu,

smo uporabili standardni protein albumin iz govejega seruma (BSA). Zatehtali smo 10 mg BSA in ga

razredčili z 1 mL miliQ vode. V 6 mikrocentrifugirk smo si pripravili naslednje vzorce:

1. 1000 µL miliQ vode → 0,0 mg/mL

2. 980 µL miliQ vode + 20 µL raztopine BSA → 0,2 mg/mL





V vsako mikrocentrifugirko smo dodali 1 mL Bradfordovega reagenta in 20 μL vzorca. Kivete z vzorci smo

dobro zvorteksirali, inkubirali 15 min pri sobni temperaturi in na UV-VIS spektrofotometru izmerili

absorbanco pri 595 nm. Skonstruirali smo umeritveno krivuljo, katero smo nato uporabljali za izračun

koncentracije proteinov v vzorcih (priloga 7.1).


33

3.4.2 Izračun učinkovitosti imobilizacije

Učinkovitost imobilizacije nam pove, koliko encima se je uspelo vezati na površino magnetnih

nanodelcev v postopku imobilizacije. Izračunamo jo po enačbi:

Φ = (𝛾𝑖−𝛾𝑠)∙100

𝛾𝑖 (3.18)

kjer so:

Φ -učinkovitost imobilizacije [%]

γi -koncentracija prostega encima [mg·mL-1]

γs -koncentracija encima v supernatantu in spiranjih [mg·mL-1]

3.4.3 Merjenje preostale aktivnosti imobiliziranega encima

Za merjenje preostale aktivnosti prostega in imobiliziranega encima smo uporabili UV-VIS

spektrofotometer, na katerem smo pri valovni dolžini λ=346 nm merili spremembo absorbance med

potekom specifične encimske reakcije za biokatalizator lipazo. Aktivnostni test za lipazo smo izvajali v

epruvetah. Pred vsakim merjenjem smo spektrofotometer dobro sprali z destilirano vodo ter umerili s

slepim vzorcem.

3.4.3.1 Aktivnostni test

Aktivnost encima smo določili z aktivnostnim testom na osnovi reakcije hidrolize 4-nitrofenilbutirata

(NPB). Pri tem je nastal rumeno obarvan produkt p-nitrofenol, katerega absorbanco smo merili

(slika 3-17).

Slika 3-17: Potek reakcije hidrolize nitrofenilbutirata


34

Pripravili smo si raztopino NPB, tako da smo raztopili 0,0626 g NPB-ja v 2 mL n-heptana. Najprej smo si

pripravili slepi vzorec, zato smo v epruveto odpipetirali 2 mL pufra PBS ter dodali 13,4 µL raztopine NPB-

ja. Nato smo v naslednjo epruveto z imobiliziranim biokatalizatorjem dodali 2 mL pufra in 13,4 µL

raztopine substrata NPB ter vorteksirali 2 min. Zatem smo epruveto postavili na magnet, supernatant

odlili in mu izmerili absorbanco pri valovni dolžini λ=346 nm.

Naredili smo test tudi za prosti encim. Postopek je bi enak, le da smo namesto delcev z imobiliziranim

biokatalizatorjem v epruveto dodali 13,4 µL raztopine čistega encima.

3.4.3.2 Izračun aktivnosti encima

Specifično aktivnost proste in imobilizirane lipaze smo izračunali po naslednji enačbi [29]:

𝑈/𝑚𝑙encima = 𝐴346 nm∙𝑉𝑘∙𝑑𝑓

0,0148∙𝑉𝑒 (3.19)

U/mlencima -specifična aktivnost encima lipaza [mL-1]

Vk -končni volumen [mL]

df -faktor redčenja

0,0148 -mikromolarni ekstinkcijski koeficient

Ve -volumen encima [mL]

𝑈/𝑚𝑔encima = 𝑈/𝑚𝑙encima

𝑐𝑒 (3.20)

U/mgencima -specifična aktivnost encima lipaza [mg-1]

ce -koncentracija raztopine encima [mg/mL]


35

Ohranjeno aktivnost encima imobiliziranega na nosilec smo izračunali po enačbi:

Ohranjena aktivnost (%) = (𝑈/𝑚𝑔 encima (𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑖𝑟𝑎𝑛𝑖)

𝑈/𝑚𝑔encima (𝑝𝑟𝑜𝑠𝑡𝑖)) · 100 % (3.21)

Ohranjena aktivnost (%) -preostala aktivnost imobiliziranega encima glede na prosti encim [%]

𝑈/𝑚𝑔encima (𝑝𝑟𝑜𝑠𝑡𝑖) -specifična aktivnost encima lipaza [mg-1]

𝑈/𝑚𝑔 encima (𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑖𝑟𝑎𝑛𝑖) -specifična aktivnost imobiliziranega encima [mg-1]

3.4.4 Proučevanje stabilnosti encima

Spremljali smo, kako na stabilnost prostega in imobiliziranega encima vpliva temperatura. Encim smo za

določen čas izpostavili različnim temperaturam ter tako proučevali vpliv temperature na njegovo

stabilnost. Postopek smo izvedli pri 35 °C, 45 °C in sobni temperaturi. Za inkubacijo vzorca pri določeni

temperaturi smo uporabljali inkubator proizvajalca Binder (slika 3-18).

Slika 3-18: Inkubator Binder


36

4 Rezultati in diskusija

Rezultat diplomskega dela je bila sinteza maghemitnih nanodelcev s slojem aminosilana in uspešna

imobilizacija encima lipaze na magnetne nanodelce. Maghemitne nanodelce smo pripravili s

koprecipitacijo železovih II in železovih III ionov. Njihovo površino smo nato modificirali z dvoslojno

funkcionalno prevleko, ki zajema vezavo silike na površino delcev in zatem pripenjanje aminosilana. S

spreminjanjem procesnih pogojev, kot so koncentracija encima, koncentracija mrežnega povezovalca,

sprememba vrste mrežnega povezovalca, sprememba časa imobilizacije, smo želeli ugotoviti, kako ti

parametri vplivajo na učinkovitost imobilizacije in ohranjene aktivnosti encima. Proučili smo tudi vpliv

temperature na stabilnost imobiliziranega encima v primerjavi s prostim encimom pri različnih

temperaturah izpostavitve.

4.1 Vpliv koncentracije encima na učinkovitost imobilizacije

Najprej smo preverili kako na učinkovitost imobilizacije vpliva koncentracija dodanega encima. Delcem

smo dodali mrežni povezovalec (1 % GA oz. 1 mL 0,02M PEHA) in izvedli 24 h imobilizacijo encima pri

sobni temperaturi ter hitrosti stresanja 410 rpm na stresalniku Heidolph Ultimax 1010. Pripravili smo

raztopine različnih koncentracij encima, in sicer: 5, 7,5 in 10 µL/mL. Masa nanodelcev je bila 5 mg.

Ugotovili smo, da najvišjo učinkovitost imobilizacije dosežemo pri koncentraciji encima 7,5 µL/mL.

Največ encima se je vezalo na delce, katere smo aktivirali z 1 % GA in sicer 99,2 %. Iz grafa (diagram 4-4)

je razvidno, da smo pri enaki koncentraciji encima dosegli boljšo učinkovitost imobilizacije v primeru, ko

smo delcem dodali 1 % GA, kakor pa kadar smo delcem dodali 0,02M PEHA. Z naraščanjem koncentracije

dodanega encima s 5 µL/mL na 7,5 µL/mL narašča učinkovitost imobilizacije neglede na izbrano vrsto

mrežnega povezovalca. Z nadaljnim naraščanjem koncentracije dodanega encima pride do upada v

učinkovitosti imobilizacije. Najnižjo učinkovitost imobilizacije smo dosegli pri delcih, katerim smo dodali

raztopino encima koncentracije 10 µL/mL ter uporabili 0,02M PEHA kot mrežni povezovalec in sicer

31,64 %.

Najvišjo učinkovitost imobilizacije (99,2 %) smo dosegli kadar smo imobilizirali encim s koncentracijo

7,5 µL/mL ter kot mrežni povezovalec uporabili 1 % GA. Kot optimalno koncentracijo encima smo za vse

nadaljne eksperimente uporabili koncentracijo 7,5 µL/mL.


37

Diagram 4-4: Učinkovitost imobilizacije encima na aminosilanske maghemitne nanodelce v odvisnosti od spremembe koncentracije encima. Reakcijski pogoji: čas imobilizacije 24 ur, hitrost stresanja 410 rpm, sobna temperatura, masa magnetnih delcev 5 mg.

4.2 Vpliv koncentracije glutaraldehida na učinkovitost imobilizacije

Želeli smo ugotoviti, kako sprememba koncentracije mrežnega povezovalca vpliva na učinkovitost

imobilizacije. Tako smo nanodelcem dodali različne koncentracije GA v območju od 0,75 – 5 %.

Koncentracija encima je bila 7,5 µL/mL, ker smo v tem primeru dobili najvišje vrednosti učinkovitosti

imobilizacije. Čas imobilizacije je ostal 24 ur pri 410 rpm na stresalniku Heidolph Ultimax 1010.

Iz diagrama 4-5 je razvidno, da smo dosegli najvišjo učinkovitost imobilizacije pri dodatku 1 % GA, in sicer

99,2 %. Pri dodatku 5 % GA je bila učinkovitost nižja za 1,9 %. Vzrok za to je najverjetneje prisotnost

povečanega števila polimernih molekul GA v vzorcu, ki se niso vezale na nosilec, ampak se medsebojno

zamrežile, kar je posledica nadaljnjega dodajanja GA k vzorcu. Nanje se je vezal encim, mi pa smo z

magnetom obdržali samo tisti encim, kateri se je vezal na nosilec, ostalega pa smo s supernatantom

izgubili. Najnižjo učinkovitost imobilizacije, 94,1 %, smo dosegli pri dodatku 0,75 % GA. Najverjetneje je

bilo v reakcijski mešanici premalo molekul GA.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

5 7,5 10

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]

Koncentracija encima [µL/mL]

Vpliv koncentracije encima na učinkovitost imobilizacije

dodatek 1% GA

dodatek 0,02M PEHA


38

Diagram 4-5: Učinkovitost imobilizacije encima na aminosilanske maghemitne nanodelce v odvisnosti od koncentracije mrežnega povezovalca GA. Reakcijski pogoji: čas imobilizacije 24 ur, hitrost stresanja 410 rpm, sobna temperatura, koncentracija encima 7,5 µL/mL, masa magnetnih delcev 5 mg.

4.3 Vpliv mrežnega povezovalca PEHA na učinkovitost imobilizacije in na

ohranjeno aktivnost encima

Zanimalo nas je, kakšen vpliv ima dodatek mrežnega povezovalca PEHA na učinkovitost imobilizacije ter

ohranitev aktivnosti encima lipaze, vezanega na aminosilanske maghemitne nanodelce. Nanodelcem

smo namesto 1 % GA dodali 0,02M PEHA. Vsi drugi parametri so ostali enaki kot v prejšnjih primerih.

Koncentracija encima je bila 7,5 µl/mL in hitrost stresanja 410 rpm.

Iz diagrama 4-6 lahko vidimo, da je učinkovitost imobilizacije pri dodatku 0,02M PEHA za približno 5 %

nižja kot v primeru, ko smo dodali 1 % GA. Najvišjo učinkovitost imobilizacije (99,2 %) smo dosegli kadar

smo kot mrežni povezovalec uporabili 1 % GA.

Ugotovili smo, da dosežemo najboljšo ohranjeno aktivnost pri imobiliziranem encimu, kjer smo kot

mrežni povezovalec uporabili 0,02 M PEHA. Ohranjena aktivnost encima ob dodatku mrežnega

povezovalca PEHA je znašala 1,505 %, ob dodatku 1 % GA pa je bila aktivnost za 0,2 % nižja (diagram 4-7).

70

75

80

85

90

95

100

0,75 1 5

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]

Koncentracija GA [%]

Vpliv koncentracije glutaraldehida na učinkovitost imobilizacije


39

Diagram 4-6: Učinkovitost imobilizacije encima na aminosilanske maghemitne nanodelce v odvisnosti od mrežnega povezovalca. Reakcijski pogoji: čas imobilizacije 24 ur, hitrost stresanja 410 rpm, sobna temperatura, koncentracija encima 7,5 µL/mL, masa magnetnih delcev 5 mg.

Diagram 4-7: Ohranjena aktivnost encima, vezanega na aminosilanske maghemitne nanodelce, v odvisnosti od mrežnega povezovalca. Reakcijski pogoji: čas imobilizacije 24 ur, hitrost stresanja 410 rpm, sobna temperatura, koncentracija encima 7,5 µL/mL, masa magnetnih delcev 5 mg.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]Vpliv mrežnega povezovalca PEHA na učinkovitost imobilizacije

1 % GA 0,02M PEHA

Mrežni povezovalec

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

imo

bili

zira

ne

lipaz

e [%

]

Mrežni povezovalec

Vpliv mrežnega povezovalca PEHA na ohranjeno aktivnost

1 % GA 0,02M PEHA


40

4.4 Vpliv časa imobilizacije na učinkovitost vezave in ohranjeno aktivnost

encima

Zanimalo nas je, kako vpliva čas imobilizacije na učinkovitost vezave encima na nanodelce. Najprej smo

opravili imobilizacijo pri času 24 ur, nato pa smo ta čas skrajšali oz. podaljšali. Nanodelcem smo dodali

1 % GA, koncentracija encima je bila 7,5 µL/mL. Imobilizacija je potekala 24 ur pri hitrosti stresanja

410 rpm.

Ugotovili smo, da je s skrajšanim časom imobilizacije tudi učinkovitost imobilizacije nižja, saj ni dovolj

časa, da bi se ves encim vezal na nanodelce. Pri času imobilizacije 9 ur je učinkovitost znašala 86,1 %, kar

je za 13,1 % manj kot v primeru 24-urne imobilizacije. Kadar pa smo čas imobilizacije lipaze na

maghemitne nanodelce podaljšali (30 ur), se učinkovitost imobilizacije ni spremenila in je ostala 99,2 %.

(diagram 4-8).

V nasprotju z učinkovitostjo imobilizacije je bila ohranjena aktivnost imobiliziranega encima pri krajšem

času imobilizacije višja. Pri času imobilizacije 9 ur je znašala ohranjena aktivnost 1,44 %, kar je za približno

0,15 % manj kot pri encimu, katerega je imobilizacija trajala 24 ur (diagram 4-9). Pri času 30 ur pa je bila

ohranjena aktivnost še nižja.

Diagram 4-8: Učinkovitost imobilizacije encima na aminosilanske maghemitne nanodelce v odvisnosti od časa imobilizacije. Reakcijski pogoji: hitrost stresanja 410 rpm, sobna temperatura, koncentracija encima 7,5 µL/mL, masa magnetnih delcev 5 mg, mrežni povezovalec 1 % GA.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

9 24 30

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]

Čas imobilizacije [h]

Vpliv časa imobilizacije na učinkovitost vezave


41

Diagram 4-9: Ohranjena aktivnost encima, vezanega na aminosilanske maghemitne nanodelce, v odvisnosti od časa imobilizacije. Reakcijski pogoji: hitrost stresanja 410 rpm, sobna temperatura, koncentracija encima 7,5 µL/mL, masa magnetnih delcev 5 mg, mrežni povezovalec 1 % GA.

1,1

1,15

1,2

1,25

1,3

1,35

1,4

1,45

1,5

9 24 30

Oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

[%]

Čas imobilizacije [h]

Vpliv časa imobilizacije na ohranjeno aktivnost


42

4.5 Vpliv temperature na stabilnost imobilizirane lipaze

Proučili smo vpliv temperature na ohranitev aktivnosti imobiliziranega encima. Študijo smo izvedli na

magnetne nanodelce imobilizirani lipazi. Delce smo aktivirali z 1 % GA, koncentracija encima je bila

7,5 µL/mL ter čas imobilizacije 24 ur pri stresanju na 410 rpm. Najprej smo izvedli imobilizacijo lipaze in

ji izmerili aktivnost. Nato smo imobilizirane magnetne nanodelce inkubirali 1 uro pri določeni

temperaturi. Po preteku časa smo izmerili aktivnost encimu in postopek ponovili, le da smo čas

izpostavitve postopno podaljševali. Meritve smo opravili tudi za prosti encim.

Iz diagrama 4-10 lahko vidimo, da se je imobiliziranemu encimu, katerega smo izpostavljali pri

temperaturi 37 °C aktivnost na začetku povečevala, pozneje pa začela upadati in je po preteku 31 ur

padla na 59 % začetne aktivnosti. Podobno je bilo tudi pri imobilizirani lipazi, ki smo jo izpostavili pri

temperaturi 45 °C, le da je ohranjena aktivnost hitreje padala ter je na koncu znašala le še 26,8 % začetne

aktivnosti.

Prosti in imobiliziran encim smo inkubirali pri sobni temperaturi v časovnem intervalu od 0 – 31 ur.

Imobiliziranemu encimu se je po 1 uri izpostavitve sobni temperaturi aktivnost malenkost povečala,

pozneje pa pričela padati in po 31 urah inkubacije je znašala 98 % prvotne aktivnosti. Aktivnost prostega

encima se je gibala podobno kot imobiliziranega, le da je pri višjem času izpostavitve pričela hitreje

upadati in je pri 31 urah znašala 96,9 %.

S tem smo prišli do spoznanja, da čeprav je preostala aktivnost imobiliziranega encima zelo nizka, je le-

ta bolj stabilen pri sobni temperaturi od prostega (neimobiliziranega) encima, kar nam daje številne

uporabne možnosti.


43

Diagram 4-10: Ohranjena aktivnost encima, vezanega na aminosilanske maghemitne nanodelce, v odvisnosti od časa inkubacije in temperature. Reakcijski pogoji: čas imobilizacije 24 ur, hitrost stresanja 410 rpm, sobna temperatura, koncentracija encima 7,5 µL/mL, masa magnetnih delcev 5 mg, mrežni povezovalec 1 % GA.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

0 1 3 6 12 31

Oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

[%

]

Čas inkubacije [h]

Vpliv temperature na stabilnost imobilizirane lipaze

sobna temp.

T=37°C

T=45°C

prosti encim pri sobni temp.


44

4.6 Vpliv kombinacije različnih mrežnih povezovalcev na učinkovitost

imobilizacije in ohranjeno aktivnost imobiliziranega encima

Preverili smo vpliv kombinacije obeh mrežnih povezovalcev na učinkovitost imobilizacije ter ohranjeno

aktivnost imobiliziranega encima, vezanega na aminosilanske maghemitne nanodelce. Spreminjali smo

koncentracije dodanega mrežnega povezovalca in razmerje glutaraldehid/PEHA. Koncentracija encima

je bila 7,5 µL/mL, ter čas imobilizacije 24 ur. Stresali smo pri 410 rpm na stresalniku Heidolph

Unimax 1010.

Najprej smo proučevali vpliv kombinacije že prej uporabljenih koncentracij mrežnih povezovalcev,

tj. 1 % GA ter 0,02M PEHA, na učinkovitost imobilizacije in ohranjeno aktivnost imobilizirane lipaze.

Učinkovitost imobilizacije lipaze na magnetne nanodelce je bila višja od 90 %, kadar smo kot mrežni

povezovalec uporabili 1 % GA ali 0,02 M PEHA.

Kadar smo kot mrežni povezovalec uporabili 1 % GA in 0,02 M PEHA v volumskem razmerju 1:1 se je

učinkovitost imobilizacije zmanjšala in je znašala le 55,7 % (diagram 4-11). Najvišjo učinkovitost

imobilizacije (70 %) smo dosegli ob dodatku 0,01 M PEHA in 1 % GA (1:1 v/v) in najnižjo učinkovitost

imobilizacije ob dodatku 0,01 M PEHA in 0,5 % GA (1:1 v/v). Le ta je znašala 45,2 %.

Izvedli smo tudi študijo vpliva kombinacije različnih mrežnih povezovalcev na ohranjeno aktivnost

imobilizirane lipaze. Dodatek obeh mrežnih povezovalcev je ugodno vplival na ohranjeno aktivnost

lipaze. Najvišjo ohranjeno aktivnost encima smo dobili, ko smo delcem dodali 0,01M PEHA in 0,5 % GA

(1:1 v/v) in sicer 2,87 % (diagram 4-12), pri dodatku 0,01M PEHA in 1 % GA je preostala aktivnost

znašala 1,85 %.


45

Diagram 4-11: Učinkovitost imobilizacije na aminosilanske maghemitne nanodelce v odvisnosti od mrežnega povezovalca. Reakcijski pogoji: čas imobilizacije 24 ur, hitrost stresanja 410 rpm, sobna temperatura, koncentracija encima 7,5 µL/mL, masa magnetnih delcev 5 mg.

Diagram 4-12: Ohranjena aktivnost encima, vezanega na aminosilanske maghemitne nanodelce, v odvisnosti od mrežnih povezovalcev. Reakcijski pogoji: čas imobilizacije 24 ur, hitrost stresanja 410 rpm, sobna temperatura, koncentracija encima 7,5 µL/mL, masa magnetnih delcev 5 mg.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Uči

nko

vito

st im

ob

iliza

cije

[%

]Vpliv kombinacije mrežnih povezovalcev na učinkovitost

imobilizacije

c) 0,02 M PEHA + 1% GA

d) 0,01 M PEHA + 0,5% GA

e) 0,02 M PEHA + 0,5% GA

f) 0,01 M PEHA + 1% GA

Mrežni povezovalec

a) 1 % GA

b) 0,02 M PEHA

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Oh

ran

jen

a ak

tivn

ost

[%

]

Vpliv kombinacije mrežnih povezovalcev na ohranjeno aktivnost

a) 1 % GA

e) 0,02 M PEHA + 1 % GA

Mrežni povezovalec

b) 0,02 M PEHA

c) 0,02 M PEHA + 1 % GA

d) 0,01 M PEHA + 0,5 % GA

f) 0,01 M PEHA + 1 % GA

a b c d e f

a b c d e f


46

5 Zaključek

Naš izbrani encim lipazo Lipozyme TL 100 L iz Thermomyces lanuginosus smo uspešno imobilizirali na

aminosilanske maghemitne nanodelce. Imobilizacija je vsebovala pripravo maghemitnih nanodelcev,

aktivacijo funkcionalnih skupin in vezavo encima na nosilec, ter preverjanje aktivnosti imobiliziranega

encima. Za aktivacijo funkcionalnih skupin smo uporabili mrežna povezovalca GA in PEHA.

V diplomskem delu smo se osredotočili na optimizacijo procesnih parametrov, ki vplivajo na proces

imobilizacije. Iskali smo optimalno koncentracijo encima, optimalno vrsto in koncentracijo mrežnega

povezovalca ter optimalen čas imobilizacije. Najvišjo stopnjo imobilizacije (99,2 %) smo dosegli po

aktivaciji magnetnih nanodelcev z 1 % GA, vezavo encima s koncentracijo 7,5 µL/mL ter časom

imobilizacije 24 ur pri 410 rpm, vendar se je ohranilo le 1,3 % začetne aktivnosti. Predvidevamo, da je

razlog za tako slabo aktivnost v napačni vezavi med encimom ter funkcionalnimi skupinami nosilca, pri

čemer se aktivna mesta blokirajo in tako postajajo nedostopna substratu. Najvišjo preostalo aktivnost

imobilizirane lipaze (2,87 %) smo dosegli kadar smo kot mrežni povezovalec uporabili kombinacijo

0,01 M PEHA in 0,5 % GA v volumskem razmerju 1:1 kljub temu, da je bila v tem primeru učinkovitost

imobilizacije le 45,2 %. Študij stabilnosti imobiliziranega encima pri povišani temperaturi je pokazal, da

je aktivnost imobiliziranemu encimu pri daljši izpostavljenosti povišani temperaturi padala počasneje

kakor pri prostem encimu. To nas navdaja z optimizmom, saj smo z imobilizacijo uspeli izboljšati

temperaturno stabilnost encima in s tem smo korak bližje k morebitni uporabi tako imobiliziranega

encima v industrijske namene. Vsekakor pa bi bile potrebne še nadaljne študije usmerjene v

razumevanje mehanizma vezave encima in s tem v izboljšanje ohranjene aktivnost imobiliziranega

encima.


47

6 Viri

[1] Wikipedia, Biocatalysis. http://en.wikipedia.org/wiki/Biocatalysis (dostop 7.5.2014)

[2] Saunders P, Brask J. Improved immobilization supports for Candida antarctica lipase B. Biocatalysis

in polymer chemistry. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA; 2010. p. 65–82

[3] Svarog. http://mss.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10967 (dostop 15.5.2014)

[4] Royal society of chemistry, Enzymes. http://www.rsc.org/Education/Teachers/Resources/cfb/

enzymes.htm (dostop 7.5.2014)

[5] Boyer R.,Temelji biokemije, Študentska založba, Ljubljana, 2005

[6] Fernandez-Lafuente R: Lipase from Thermomyces lanuginosus: uses and prospects as an industrial

biocatalyst. J Mol Catal B Enzym 2010, 62:197–212

[7] Petrič D., Pipan N., Podoreh T., Selčan R.: Proizvodnja lipaz, Ljubljana, 2001

[8] Methods of Immobilization, Rensselaer Polytechnic Institute, (dostop 15.5.2014)

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/methods.htm

[9] Bezjak A., Stropnik Č.: Immobilization of Trypsin on the Surface of Cellulosic Acetate Membranes,

Kovine, zlitine, tehnologije, 28, 1994, 375-377

[10] Sheldon R.: Enzyme Immobilization: The Quest for Optimum Performance. Advanced Synthesis and

Catalysis, 2007, 349: 1289–1307

[11] Brena B, Batista-Viera F: Immobilization of Enzymes and cells, Methods in biotechnology 22, 2nd

ed. Totowa (NJ): Humana Press: 2006

[12] Enzymes. http://enzymeimmobilization.blogspot.com/2011/02/enzyme-immobilization.html

(dostop 20.5.2014)

[13] Remškar M. Nanodelci in nanovarnost. Ljubljana: Ministrstvo za zdravje, Urad RS za kemikalije,

2009. Dostopno na: http://www.kemijskovaren.si/files/nano_knjiga.pdf

[14] Kovač Hace S., Nanodelci, Konzorcij šolskih centrov Slovenije v okviru projekta MUNUS 2, 2011.

Dostopno na: ttp://www.mizs.gov.si/fileadmin/mizs.gov.si/pageuploads/podrocje/

Strukturni_skladi/Gradiva/MUNUS2/MUNUS2_92Kemija_Nanodelci.pdf (dostop 13.6.2014)

[15] Bailey, J.E. and Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals. 2nd. Ed., McGraw-Hill, New York,

1986, 595-606

http://en.wikipedia.org/wiki/Biocatalysis

http://mss.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10967

http://www.rsc.org/Education/Teachers/

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/methods.htm

http://enzymeimmobilization.blogspot.com/2011/02/enzyme-immobilization.html


48

[16] Čampelj S., Makovec D., Bele M., Drofenik M., Jamnik J. Sinteza magnetnih nanodelcev,

funkcionaliziranih s tanko plastjo silike. Materiali in tehnologije, 41 (2), 103-107, 2007

[17] Magnetne tekočine. http://projekti.gimvic.org /2010/2a/Magnetne_tekocine/

magnetnetekocine (dostop 1.6.2014)

[18] Košak A., Makovec D., Žnidaršič A., Drofenik M. Priprava magnetnih tekočin. Materiali in

tehnologije, 39 (1 -2), 37-41,

[19] Cinecia cinetica. http://ccinetica.wordpress.com/2012/07/19/como-hacer-un-ferrofluido-o-

liquido-magnetico/ (dostop 1.6.2014)

[20] Vučko M. Sinteza maghemita iz železovega oksalata. Diplomsko delo. Maribor. Univerza v Mariboru,

Fakulteta za naravoslovje in matematiko, 2009

[21] TU-Braunschweig, Maghemite. http://www.emg.tubs.de/forschung/material/

maghemite_d.html (dostop 1.6.2014)

[22] H. Guo, A. S. Barnard, Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry

and environmental stability. J. Mater. Chem. A 2013, 1, 27

[23] Šulek F. Nanostrukturirani materiali za imobilizacijo biokatalizatorja. Doktorska disertacija. Maribor:

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2011.

[24] Pezdevsek N. Imobilizacija hrenove peroksidaze na maghemitne nanodelce, modificirane z

aminosilanom in hitozanom. Diplomsko delo. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in

kemijsko tehnologijo, 2012.

[25] Wikipedia, Glutaraldehyde. http://en.wikipedia.org/wiki/Glutaraldehyde (dostop 15.6.2014)

[26] Sheldon R. A. Cross-linked enzyime aggregates (CLEAs): stable and recycable Biocatalysts,

Biochemical Society Transatcions, 35, 1583-1587, 2007.

[27] Walt D. R., Agayn V. I. The chemistry of enzyme and protein immobilization whit glutaraldehyde,

Trends in Analytical Chemistry, 13/10, 425 – 430, 1994.

[28] Pentaethylenehexamine, Technical Resources International, (dostop 10.7.2014)

http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/htdocs/chem_background/exsumpdf/4067-16-7_508.pdf

[29] Enzymatic Assay of LIPOPROTEIN LIPASE, Sigma-Aldrich, https://www.sigmaaldrich.com/

content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/lipoprotein_lipase.pdf

(dostop 25.8.2014)

http://ccinetica.wordpress.com/2012/07/19/como-hacer-un-ferrofluido-o-liquido-magnetico/

http://ccinetica.wordpress.com/2012/07/19/como-hacer-un-ferrofluido-o-liquido-magnetico/

http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/htdocs/chem_background/exsumpdf/4067-16-7_508.pdf

https://www.sigmaaldrich.com/


49

7 Priloge

7.1 Umeritvena krivulja za določevanje koncentracije proteinov po

Bradfordu

Diagram 7-13: Umeritvena krivulja za Bradfordovo metodo

y = 0,2315x + 0,0167R² = 0,9941

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Ab

sorb

anca

pri

59

5 n

m

Koncentracija [mg/ml]

Umeritvena krivulja - Bradford


50

7.2 Tabele z rezultati

Tabela 7-2: Podatki in rezultati za preostalo aktivnost encima in učinkovitost imobilizacije lipaze na aminosilanske maghemitne nanodelce

mn [mg] ce [µl/ml] w GA [%] c PEHA [M] čas [h] ν [rpm] φ [%] ρ [%]

5 10 1 - 24 410 59,41 -

5 10 / 0,02 24 410 31,64 -

5 7,5 1 - 24 410 99,2 1,303

5 7,5 / 0,02 24 410 94,7 1,505

5 5 1 - 24 410 88,16 -

5 5 / 0,02 24 410 76,03 -

5 7,5 5 - 24 410 97,3 -

5 7,5 - 0,03 24 410 54,74 -

5 7,5 1 0,02 24 410 55,77 2,57

5 7,5 0,75 - 24 410 94,06 1,387

5 7,5 1 0,01 24 410 70 1,846

5 7,5 0,5 0,02 24 410 51,4 2,539

5 7,5 0,5 0,01 24 410 45,2 2,877

5 7,5 1 - 9 410 86,01 1,445

5 7,5 1 - 30 410 99,2 1,258


51

Tabela 7-3: Podatki in rezultati za stabilnost imobiliziranega encima

Tabela 7-4: Podatki in rezultati za stabilnost prostega encima

T [°C] tink [h] σ [%] ρ [%]

37 0 1,303 100,000

37 1 1,368 105,005

37 3 1,178 90,421

37 6 1,349 103,546

37 12 1,199 92,051

37 31 0,766 58,765

45 0 1,303 100,000

45 1 1,292 99,128

45 3 1,092 83,823

45 6 0,953 73,160

45 12 0,871 66,855

45 31 0,349 26,809

sobna 0 1,303 100,000

sobna 1 1,336 102,500

sobna 3 1,305 100,150

sobna 6 1,259 96,590

sobna 12 1,289 98,900

sobna 31 1,278 98,050

T [°C] tink [h] σ [%] ρ [%]

sobna 0 1,303 100,000

sobna 1 1,318 101,200

sobna 3 1,294 99,300

sobna 6 1,298 99,600

sobna 12 1,277 98,030

sobna 31 1,263 96,940


52

8 Življenjepis

OSEBNI PODATKI Žarn Matej

Stolovnik 54a, 8280 Brestanica (Slovenija)

051 213 717

[email protected]

Spol Moški | Datum rojstva 13.8. 1989 | Državljanstvo slovensko

DELOVNE IZKUŠNJE

IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE

KOMPETENCE

1/3/2013–30/4/2013 Opravljanje dvomesečne strokovne prakse

Krka d.d., Šmarješka cesta 6, 8000 Novo mesto, (Slovenija)

Delo v laboratoriju: opravljanje encimsko kataliziranih reakcij za pridobivanje intermediatov

farmacevtskih učinkovin, analiza rezultatov s pomočjo tankoslojne kromatografije (TLC)

11/2013–4/2014 Opravljanje praktičnega dela v okviru diplomske naloge

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Smetanova ulica 17, 2000 Maribor

Delo v laboratoriju: priprava magnetne tekočine, priprava modificiranih magnetnih nanodelcev,

imobilizacija encimov na nanodelce, določanje aktivnosti in učinkovitosti encimov z UV-VIS

spektrofotometrom

2008–2014 Univerzitetni diplomirani inženir kemijske tehnologije

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Smetanova ulica 17, 2000 Maribor

Pridobljeno znanje na področju encimskih tehnologij, biokemije, analizne kemije. Osvojeno znanje

anorganske, organske fizikalne kemije, mikrobiologije, termodifuzijskih separacijskih procesov,

farmacevtskih učinkovin. Pridobljene veščine dela v laboratoriju.

2004–2008 Gimnazijski maturant

ŠC Krško-Sevnica, CKŽ 131, 8270 Krško

1996–2004 Osnovna šola Adama Bohoriča Brestanica

Materni jezik Slovenščina


53

Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE

Slušno razumevanje Bralno razumevanje Govorno

sporazumevanje Govorno sporočanje

angleščina B2 B2 B2 B2 B2

nemščina A2 A2 A1 A1 A1

hrvaščina A2 A2 A2 A2 A2

Stopnja: A1/A2: Osnovni uporabnik - B1/B2: Samostojni uporabnik - C1/C2: Usposobljeni uporabnik Skupni evropski jezikovni okvir

Komunikacijske kompetence

timski duh, posredovanje znanja drugim (inštrukcije)

Organizacijske/vodstvene kompetence

sodelovalnost, odločnost, sposobnost opazovanja, samoorganizacija pri delu

Računalniške kompetence Obvladanje orodij Microsoft Office, osnovno delo s programom ChemBio Draw,

osnove programiranja (Java, FORTRAN)

Vozniško dovoljenje B

http://europass.cedefop.europa.eu/sl/resources/european-language-levels-cefr

Documents

Imobilizacija lipaze na maghemitne nanodelce, modificirane