I Deo Materijal-Enzimi u PB

7/18/2019 I Deo Materijal-Enzimi u PB

1/62

Primena enzima u

prehrambenojindustriji


2/62

PODRUJA PREHRAMBENEINDUSTRIJE U KOJIMA SE

KORISTE ENZIMI

Obrada mesa i mesnih proizvoda

Obrada voa i vonih sokova Primena enzima u pivarstvu

Obrada pekarskih proizvoda

Obrada ulja i masti Obrada mleka i mlenih proizvoda


3/62

PODRUJA PREHRAMBENEINDUSTRIJE U KOJIMA SE

KORISTE ENZIMI Primena enzima u industriji skroba

Primena enzima u proizvodnji saharoze,

invertnog eera i drugih zaslaivaa Primena enzima u cilju spreavanja kvarenja

sirovina i hrane, spreavanja tamnjenja voa ipovra, kao i izbeljivanja

Primena enzimske hidrolize u modifikaciji i

izolaciji proteina

Primena enzima u proizvodnji bioaktivnih

komponenata hrane


4/62

Osnovna svojstva enzima odznaaja prilikom uvanja i

obrade hrane

Aktivnost enzima (enzimske jedinice)

Specifinost enzima Stabilnost enzima

Industrijski enzimi se karakterizuju naosnovu reakcije koju katlizuju (osnova

klasifikacije enzima) i katalitikeaktivnosti


5/62


obrade hrane Aktivnost enzima (enzimske jedinice) Hemijski sastav neaktivnog enzima ne razlikuje se od sastava

aktivnog. Ne odreujese koncentracija aktivnog enzima hemijskimodreivanjem ve se kvantitativno odreuje preko aktivnosti,odnosno preko praenjabrzine reakcije koju katalizuju!

U industrijskim uslovima enzimi su niskog stepena istoe, pa senjihova cena formira na osnovu aktivnosti. Sekundarne osobine kao

tosu stepen istoe,stepen modifikacije (imobilizacija, aktivacija ili

fizikaforma) mogu takoeda utiuna cenu enzima.

Aktivnost enzima slui i kao osnova za izraunavanje dodatnihproizvodnih trokova,investicionih ulaganja i moeda odredi i cenuproizvoda (veliinapostrojenja).


6/62


obrade hrane Eenzimske jedinice U poetku su proizvoljno definisali aktivnost enzima na osnovu

nekog zapaanja. esto je nedovoljno definisan supstrat korien isirovi ekstrakt enzima.

NEKOLIKO PRIMERA NEDOVOLJNO PRECIZNIH DEFINICIJA

AKTIVNOSTI ENZIMA:

JEDNA JEDINICA AKTIVNOSTI JE KOLIINA ENZIMA KOJA POD

STANDARDNIM USLOVIMA (37 o

C, pH 5,7) RAZLAE 5,26 mg SKROBA POASU.

JEDNA JEDINICA AKTIVNOSTI ENZIMA JE KOLIINA ENZIMA KOJA PODSTANDARDNIM USLOVIMA (40 oC, pH 4,7, 30 MIN) DAJE HIDROLIZAT KOJI IMA

APSORBANCU NA 275 nm EKVIVALENTNU RASTVORU TIROZINA

KONCENTRACIJE 1,1 mg/mL U 0,006 N HCl. TA VREDNOST APSORBANCE JE0,0084


7/62


obrade hrane Enzimske jedinice

Posledice:A) Nedovoljno specificirani uslovi odreivanja aktivnosti to

oteava uvoenje standardnih protokola;

B) esto su birani uslovi koji nisu niti od fundamentalnog niti odpraktinog znaaja;

C) Razliite jedinice su koriene za iste ili sline sisteme to

nepotrebno oteava poreenje enzimskih sistema (iako je toesto bila posledica nedovoljnog fundamentalnog znanja,proizvodne kompanije su namerno unosile pometnju dapotencijalni kupci ne mogu da proraunaju aktivnost po jediniciteine, odnosno da odrede cenu po tretmanu.


8/62

Enzimske jedinice Komisija za enzime za Internacionalne jedinice u

biohemiji 1960. godine sugerisala je da se uvede

standardna jedinica enzimske aktivnosti:

!"#$%"&'!("&)"& +$,!"!'& - !. /!+0 $1 23 4567489956 35:9;6 7426 766:86?6523 - ;48@=A@63359; =@84C9;6 /AD0 EF4'1 =


9/62

G()$H.)&%"& &H#!I"(J# $"K!G& 23 L>42 ;4837=86@=A@6


10/62

Enzimske jedinice Imamo zvanine jedinice usvojene od strane meunarodne komisije

Internacionalna jedinica (IU, Katal, specifina aktivnost, molekularnaaktivnost kcat).

+$,&" H&) 23 456 koliina 35:9;6 7426 766:86?6523 - ;486 @=A@6


11/62

Enzimske jedinice Problemi u industriji:

1) supstrati na koje enzimi deluju nisu hemijski

definisani (smee neistih prirodnih komponenti ijihemijski sastav nije poznat).

ta je mol kukuruznog skroba ili proteina penice?

Sa druge strane promene nastale dejstvom enzimamogu se meriti u pogledu fizikog uticaja (promena uviskoznosti ili brzini filtracije) ili hemijske veliine

(npr. proizvodnja redukujuih eera, -amino azota ujedinici vremena).

2) optimalni uslovi i definisana temperatura?

Zbog male rastvorljivosti mnogi industrijski supstrati

ne mogu se koristiti pri optimalnim [S] kao ni uslovimaza odreivanje aktivnosti enzima


12/62

Enzimska doza Treba znati koliko je potrbno enzima za konverziju

odreene koliine supstrata u vremenu;

-esto proizvoai enzima preporuuju npr. xkg enzimaza konverziju tone supstrata kada se koristi yenzimskih

jedinica / g.

- Produktivnost/dozi enzima (samo za slobodne enzime)

U sluaju imobilisanih enzima potrebno je znati iaktivnost i produktivnost

V%(.H#!I"(J# 35:9;6 23 B3W959@656 764 ;6@6

A>49:C3B354? A>49:C4B6 A4 23B959O9 ;6@3 35:9;6 56B3W959@659; =@84C9;6P


13/62

Enzimske jedinice Problemi u industriji:

2) optimalni uslovi i definisana temperatura?

Mnogi industrijski enzimi imaju optimim na visokimtemperaturama, 2-3 puta viim od preporuinih (25oC), pa ima vie smisla odrediti im aktivnost na timuslovima.

Mogua su sledea reenja:A) Koristiti sintetike supstrate kao model sisteme za industrijske

enzimske procese i definisati aktivnost na toj osnovi sledeipreporuke Komisije-npr. estri aminokiselina model sistemi zaproteine

B) Koristiti standardne supstrate i uslove koji valjano aproksimirajuindustrijske uslove-primeniti uslove ispitivanja to blieindustrijskim

C) Zanemariti preporuke Komisije i definisati sopstvene specijalnejedinice.

Treba da postoji razumevanje izmeu enzimskih proizvoaa i potro.


14/62


obrade hrane Specifinost enzima Postoje velika odstupanja u specifinosti enzima: neki katalizuju

samo jednu reakciju sa samo jednim supstratom (STROGA

APSOLUTNA SPRCIFINOST), dok drugi katalizuju odreenuhemijsku promenu sa veim brojem hemijski slinih supstrata(GRUPNA SPCIFINOST).

Razlikuju se etiri osnovna tipa specifinosti:

1. apsolutna specifinost2. grupna specifinost,3. specifinost u odnosu na pojedine tipove reakcija i4. optika ili stereohemijska specifinost

Stroga ili apsolutna specifinostenzima se ogleda u tome da enzimkatalizuje odreenu reakciju samo jednog supstrata


15/62

Primeri:2. ureaza koja katalizuje hidrolizu uree na ugljen

dioksid i

amonijak.3. glukozo-oksidaza (VAAN ENZIM UPREHRAMBENOJ INDUSTRIJI) katalizuje sledeureakciju:

-D-glukoza + enzim-FAD Glukonska kiselina +

enzim-FADH2

Apsolutna specifinostenzima je veoma retka.Ureaza, pored velike specifinostidejstva, pored uree, uizvesnoj meri katalizuje hidrolizu oksiuree na ugljen-dioksid,

amonijak i hidroksilamin. Meutim, poetna brzina hidrolizeoksiuree katalizovana ureazom oko 120 puta manja od brzine

hidrolize uree.

Iako glukozo-oksidaza ima izraenuveliku specifinost,ova

specifinostipak nije apsolutna.


16/62

Supstrat Brzina oksidacije (%)

-D-glukoza 100

2-dezoksi-D-glukoza 25

D-manoza 0,98

-D-glukoza 0,64

Trehaloza 0,28

Maltoza 0,19

D-galaktoza 0,14

D-fruktoza, saharoza, laktoza,

rafinoza, D-riboza, L-arabinoza0,00

Brzina reakcije razliitih supstrata katalizovaneglukozooksidazom pri emu je brzina reakcije sa -D-

glukozom usvojena kao 100%.


17/62

X>=A54 specifini35:9;9 imaju manju specifinost imogu da intereaguju sa veim brojem supstrata priemu je nepohodno da se u molekulima supstrata

nalaze odreeneatomske grupe ili veze.

Primeri: A3A@95 katalizuje hidrolizu samo peptidnihveza koje obrazuju aromatine amino kiselinerasporeenena odreeninainu odnosu na peptidnu

vezuSpecifinost= 4B54@= 56 A423B953 367O926 enzimase ogleda u tome da enzim katalizuje odreenetipove reakcijabez obzira na atomske grupe supstrata koje su prisutne u

neposrednoj blizini veze na koje enzim dejstvuje.Primer: 89A6:3razlausve sloeneestre ukljuujuitu i lipide

(A


18/62

Stereohemijska specifinost enzima

Primeri:

1. )67


19/62

Objanjenje specifinosti enzima

Sterohemijska specifinostenzima prema hiralnim jedinjenjimaje jako izraena. Od optikiaktivnih oblika reaguje samo jedanoblik jer se oblik slike u ogledalu ne moe vezati za aktivno

mesto. Enzimi razlikuju cis-trans izomeriju

Enzim u nekim sluajevimarazlikuje identinegrupe u potpuno

simetrinom molekulu (primer glicerol-kinaza koja katalizujefosforilovanje glicerola, nastaje =C37 3-fosfoglicerat, 5976B 1-fosfoglicerat)

D3;92@79; A=


20/62

Objanjenje specifinosti enzima

(?@


21/62

Templatna hipoteza klju i brava

Emila Fishera

Postoji geometrijska komplementarnost

izmeu molekula enzima i supstrata.

Povrina enzima tako je oblikovana da se

supstrat uklapa u nju kao to kljuulazi ubravu, te samo supstrat i molekuli koji se

malo razlikuju od supstrata mogu da se

uklope u enzim

Po modelu kljui brava pretpostavlja seda na enzimu vepostoji formirano mesto

za vezivanje supstrata

Rendgenskom strukturnom anali-zom je

verifikovana ova hipoteza, kao npr.

LIZOZIM


22/62

Specifinost proteaza

Proteaze se razlikuju jako po specifinosti za razliite peptidne

veze

Pokazano je da tripsin, pepsin i proteaza iz Bacillus subtilis

(subtilizin) hidrolizuju BSA na potpuno razliitim mestima, torezultuju razliitimprofilima nastalih oligopeptida.

Tripsin je primer enzima menje specifinosti. On moe da

katalizuje hidrolizu peptidnih veza u molekulu proteina, ali isto tako

i jednostavne estre aminokiselina i alkohola.


23/62

KLASIFIKACIJA ENZIMA OD ZNAAJA U PREHRAMBENOJINDUSTRIJI

Saharoza-6-

glukoziltransferaza

-1,6-Glukan-4-glukoziltransferaza

2.4.1.5

B. macerans enzim-1,4-Glukan-4-glukoziltransferaza2.4.1.19

KateholmetiltransferazaS-adenozilmetionin:katehol

O-metiltransferaza2.1.1.6

Lipoksigenaza,

lipoksidaza, karotenaza1.99.2.1

PeroksidazaDonor:H2O2

oksidoreduktaza1.11.1.7

KatalazaH2O2:H2O2 oksidoreduktaza1.11.1.6

Katehol-oksidaza,

polifenol-oksidaza,

kateholaza, fenolaza

o-difenol:O2oksidoreduktaza

1.10.3.1

Glukozo-oksidaza,notatin

-D-glukoza:O2oksidoreduktaza

1.1.3.4

Trivijalni nazivSistematski nazivEC broj

OKSIDORE

DUKTAZE

TRANSFERAZE


24/62


Glukoamilaza, -amiloglukozidaza

-1,4-Glukan glukohidrolaza3.2.1.4

Celulaza-1,4-Glukan 4-glukanohidrolaza3.2.1.4

-amilaza-1,4-Glukan maltohidrolaza3.2.1.2

-amilaza-1,4-Glukan glukanohidrolaze3.2.1.1

Pektin-esteraza,

pektinmetil-esteraza,

pektaze

Pektinpektil-hidrolaze3.1.1.11

LipazeGlicerolestar-hidrolaze3.1.1.3

Aril-esteraza, A esterazaArilestar-hidrolaze3.1.1.2

Karboksil esteraza,aliesteraza, B esteraza

Karboksil estar hidrolaze3.1.1.1


HIDROLAZ

E


25/62


Pepsin3.4.4.1

Renin3.4.4.3

-Galaktozidaza, laktaza-D-Galaktozid galaktohidrolaza3.2.1.23

-Glukozidaza-D-Glukozid glukohidrolaza3.2.1.21

-Glukozidaza-D-Glukozid glukohidrolaza3.2.1.20

Poligalakturonaza,

pektinaza

Poligalakturonid

glukanohidrolaza3.2.1.15

Oligo-1,6-glukozidaza,

limit dekstrinazaOligodekstrin 6-glukanohidrolaza3.2.1.10

Amilopektin-1,6-glukozidaza, R enzim

Amilopektin 6-glukanohidrolaza3.2.1.9


HIDROLAZ

E

KLASIFIKACIJA ENZIMA OD ZNAAJA U PREHRAMBENOJ


26/62


EC broj Sistematski naziv Trivijalni naziv

3.4.4.4 Tripsin

3.4.4.5 Himotripsin

3.4.4.7 Pankreaspeptidaza,

elastaza

3.4.4.10 Papain

3.4.4.11 Himopapain

3.4.4.12 Ficin

3.4.4.24 Bromelin

3.4.4.16 Subtilpeptidaza A,subtilizin, bakterijska

HIDROLAZ

E

HIDROLAZ

E

KLASIFIKACIJA ENZIMA OD ZNAAJA U PREHRAMBENOJ


27/62


Glukozofosfat-izomeraza

Glukoza-izomeraza

D-Glukozo-6-fosfat

ketol izomeraza5.3.1.9

Trivijalni nazivSistematski nazivEC brojIZOME

RAZE

PROTEAZE ILI PEPTID HIDROLAZE (Proteolitiki enzimi)


28/62

PROTEAZE ILI PEPTID-HIDROLAZE (Proteolitiki enzimi)Velika grupa enzima (3.4) koja katalizuje hidrolizu belanevinai peptida namanje proizvode:

Uglavnom protein enzimi, ralativno male veliinemolekula, lako se dobijaju

u istom stanju, pogodni za ispitivanje specifinosti dejstva enzima,mehanizma dejstva enzima, odreivanjeprimarne strukture mnogih proteinau biohemiji i drugo

Proteolitikienzimi imaju veliki fiziolokiznaaju razmeni materije i energijekao i veliku primenu u medicini i industriji

Peptidhidrolaze su jako rasprostranjene u prirodi

NH-CH-C

R

O

NH-CH-C

R1

O

+ H2O

NH-CH-COOH +

R

NH2-CH-C

R1

O

P d l


29/62

Podela proteaza

U starijoj literaturi dele se na PROTEINAZE (deluju na belanevine) i naPEPTIDAZE(deluju samo na peptide manje molekulske mase i razlauih doaminokiselina)

Savremena istraivanja su, meutim, pokazala da pepsin, tripsin,himotripsinmogu da deluju, pored belanevina i na peptide, samo ako se utim peptidima nalaze adekvatne peptidne veze

1937. Bergman (Bergmann) i Fruton (Fruton) predlaupodelu proteinazana:

ENDOPEPTIDAZE(pepsin, tripsin, himotripsin, renin)

EGZOPEPTIDAZE (karboksipeptidaze, aminopeptidaze i

dipeptidaze)

Amino-acil-peptid-hidrolaze (EGZOPEPTIDAZE) ili prosto PEPTIDAZE

dejstvuju samo na krajevima peptidnih lanaca odvajajuipostepeno po jednuaminokiselinu i na taj nainprogresivno skraujupeptidne lance

Peptidil-peptid-hidrolaze (ENDOPEPTIDAZE) ili prosto PROTEINAZE

dejstvuju u sredini peptidnih lanaca i razlaumolekule belanevina i peptidana peptide manje molekulske mase


30/62

Dejstvo na estre i specifinesupstrate

sposobni su da hidrolizuju estre i specifineamide

sintetiki supstrati kao to su estri i amidi aminokiselina iliBENZOIL ili HIPURIL derivati mogu da poslue za utvrivanjenakoju epeptidnu vezu delovati koja proteaza

BAEE (benzoil-L-arginin-etilestar) ili BAA (benzoil-L-

argininamid)

SPECIFINOST DEJSTVA PROTEAZA

Specifinost odreuje jedna od dve aminokiseline i to ona sa C-stranepeptidne veze.

Primer: Tyr-Lys-Glu-Tyr (slobodna NH2grupa sa leve i COOH sa desnog

kraja) pokazuje da tripsin katalizuje hidrolizu druge veze sa desna, dok

himotripsin katalizuje treusa desne strane

AFINITET TRIPSINA PREMA BAZNIM AMINOKISELINAMA

AFINITET HIMOTRIPSINA PREMA AROMATINIMAMINOKISELINAMA

Proteaze mogu da katlizuju i reakcije transpeptidacije

Bz-Tyr-NH2+ Gly-NH2Bz-Tyr-Gly-NH2 + NH2


31/62

Supstrat Tripsin Himotripsin

Bz-Gly-NH20 0

Gly-Gly 0 0

Gly-DL-Ala 0 0

Gly-Tyr 0 0Gly-Asp 0 0

Trp-NH2 0 +-

Bz-Tyr-NH2 0 +++

Tyr-O-Et +- +-

Ac-Tyr-O-Et + ++++++

Bz-Arg-NH2 ++ 0

Bz-Arg-O-Me ++++++ +



32/62


pepsin

tripsinhimotripsin


33/62

PREGLED PRIMENE PROTEAZA U

PREHRAMBENOJ INDUSTRIJI

Proteaza Oblast primene

Papain, bromelin, ficin -Razmekavanje mesa- Bistrenje piva

- Proizvodnja proteinskih hidrolizata

Fungalne proteaze -Pekarska industrija (modifikacija

glutena)

- manje (hidrolizati proteina)

Tripsin - Hidrolizati proteina

Renin i pepsin U proizvodnji sira (taloenjekazeinske surutke)

Bakterijske proteaze -Hidrolizati proteina

- Bistrenje piva

- Spreavanje elatiniranja ribljihostataka

Svi se koriste kao pomonadigestivna sredstva, oblast primene na graniciprehrambene i farmaceutske industrije


34/62

PREGLED PRIMENE PROTEAZA U

PREHRAMBENOJ INDUSTRIJI

Delovanje proteaza se moe posmatrati i kao osnova procesa

fermentacije (zrenje sira, mesa, proizvodnja orijentalne hrane-sojasosa.

Mogu se razmatrati i u kontekstu hidrolize skleroproteina

(keratinaze, kolagenaze, elastaze)-iskorienje sporednihproizvoda mesne industrije

Karboksipeptidaze i aminopeptidaze-odgoravanje hidrolizataproteina

GENERALNI KRITERIJUMI ZA ODABIR PROTEAZE

Specifinost je svakako osnovni kriterijum (nekad i jedini-renin) zaprimenu u prehrambenoj industriji, ali vanisu i:

- pH optimum

- termalna stabilnost

- aktivatori ili inhibitori

- cena i komercijalna dostupnost


35/62

Ponekad je potrebna stroga (apsolutna specifinost)-renin ili

nespecifinost-proizvodnja hidrolizata male molekulske mase, zaodgoravanje-peptidaze

Specifinost je potrebna i za razmekavaje mesa: fungalneproteaze deluju samo na proteine miinih vlakana, papainhidrolizuje i njih ali i proteine vezivnih tkiva


Ponekad je potrebna velika termalna stabilnost nekada basmeta, nprkod konzerviranih unkivrise blaga pasterizacija-papain ostaje aktivan

pH profil je izuzetno vaan:

- kad se koriste protiv zamuenja piva, proteaze treba da buduaktivne pri pH 4,5 (zato je papain podesan, mada i pepsin (nii pHoptimum) i fungalne proteze (neto vii pH optimum) takoe mogu bitipodesne.

Osetljivost na inhibitore takoemoebiti bitno za primenu proteze:

- fungalne protezae se koriste u pekarstvu jer su tripsin i/ili biljne

proteaze jer su osetljive na prirodne inhibitore u branu ili na oksidujueagense


36/62

Tekoje uzeti u obzir sve ove faktore, u praksi vepostoje neka

iskustva. Enzimi se biraju praktino mnogo pre nego to su sepoznavala njihova svojstva i pre nego tose ocenjivala efikasnostnjihove primeneu zavisnosti od svojstava.

Dananje poznavanje svojstava enzima omoguava da serazmotre nove primene postojeih enzima u prehrambenoj

industriji ili da se za postojee primene proizvedu enzimi boljihsvojstava



37/62

Uticaj pH na aktivnost (a) kisele proteaze iz A. niger (b) neutralne proteaze iz B.subtilis (c) alkalne proteaze iz B. licheniformisi (d) superalkalne proteaze iz B.licheniformis.

Aktivni centar proteolitikih enzima


38/62

Aktivni centar proteolitikih enzima

Sa aspekta strukture proteolitikienzimi se dele na tri grupe:

Grupa koja za svoju aktivnost ne zahteva nikakve kofaktore

Grupa koja za svoju aktivnost zahteva prisustvo odreenihredukcionihsredstava (tiol-proteinaze)

peptid-hidrolaze, metaloproteini

1. Prva grupa enzima se opet deli na dve manje grupe: kisele proteinaze

(pepsin i renin) i alkalne proteinaze. O strukturi aktivnog centra kiselih

proteaza se malo zna. Alkalne proteinaze (tripsin, himotripsin, trombin,elastaza, subtilizin) su serin-proteinaze

2. Druga grupa enzima (papain, bromelin, ficin) se aktivira u prisustvu

redukcionih sredstava. Obratno, oksidaciona sredstva (J2, H2O2)

inaktiviraju enzim. Zakljuak za katalitiku aktivnost neophodna je

slobodna SH grupa3. Treagrupa enzima su ;34


39/62

Amino-acil-peptid hidrolaze ili EGZOPEPTIDAZE

Dejstvuju na peptide manje molekulske mase: polipeptide, oligopeptide i

dipeptide. Dele se na tri grupe:

Aminopeptidaze

Karboksipeptidaze

Dipeptidaze

Aminopeptidaze (3.4.11)

Za njihovo dejstvo je neophodno da supstrata ima slobodnu terminalnu NH2

grupu:

NH2-CH-C

R

O

NH-CH-C

R

O

Primeri: Leucin-aminopeptidaza (3.4.11.1) najbre deluje na peptide kojisadre leucin. Neophodni joni Mg2+ i Mn2+, Aminotripeptidaza (3.4.11.4)najbre dejstvuje na tripeptide sa neutralnim aminokiselinama i to na vezu

gde se nalazi slobodna NH2grupa uz stvaranje aminokiseline i dipeptida

Karboksipeptidaze (3.4.12)


40/62

Karboksipeptidaze (3.4.12)

Sledea grupa amino-acilpeptid-hidrolaza. Dejstvuju na peptide saslobodnom terminalnom COOH grupom. Primeri: Karboksipeptidaza A,

Karboksipeptidaza B

Dipeptidaze (3.4.13)Hidrolizuju dipeptide, odnosno oligopeptide koji u neposrednom susedstvu

imaju slobodne COOH i NH2grupe. Neke od njih sadre jon Mn2+. Primeri:Glicinglicin-dipeptidaza, Prolin-dipeptidaza

Veza izmeu Mn2+i katalitikog centra molekuladipeptidaze sa supstratom-dipeptidom

PEPTIDIL-PEPTID-HIDROLAZE ili ENDOPEPTIDAZE


41/62

PEPTIDIL PEPTID HIDROLAZE ili ENDOPEPTIDAZE

(ranije proteinaze)

Velika grupa enzima koja se nalazi u sokovima za varenje, krvnoj plazmi,

serumu, elijamaivotinjai mikroorganizama.

Razlauproteine i polipeptide na peptide manje mase tako todejstvuju napeptidne veze nasuminou sredini peptidnih lanaca

Nema dovoljno biohemijskih kriterijuma da bi se napravila podela unutar

ove vanegrupe enzima, vesu zadranitrivijalni nazivi

Papain (3.4.22.2)


42/62

p ( )

Biljna proteinaza, nalazi se u sokovima i tkivima biljaka

Dobijen u istom kristalnom stanju, M=20700, optimalni pH 5.0-7.5, 198aminokiselinskih ostataka

Pod papainom se smatra sirovi enzimski preparat dobijen iz lateksa papajekao i istafrakcija proteaze

Svojstva papaina

Cys 25 His 159 i Asp 158 uestvujuu katalitikojreakciji

Osnovna osobina: Cys 25je esencijalan za katalitikuaktivnost

gubi aktivnost usled dejstva oksidacionih agenasa i inhibiraju ga

joni tekihmetala

Ponovo postaje aktivan pod uticajem izvesnih redukcionih agenasa

(glutation, cistein, H2S, askorbinska kiselina, cijanidi) ili dodatkom EDTARedukujui agensi daju razliite rezultate u zavisnosti od puferskogsistema!

Hidrolitikiaktivan vid papaina je redukovani oblik:

+2H+


43/62

Katlizuje hidrolizu polipeptida, ali kao i druge endopeptidaze, dejstvuje i na

estre.Katalizuje i reakcije prenosa i sinteze

pH stabilnost: stabilan pri pH 5, stabilnost opada naglo pri 3>pH>11

pH optimum aktivnosti (u zavisnosti od supstrata pH 7 za belance, pH 5 za

elatin.

Termostabilan (gubitak aktivnosti od svega 20% pri inkubaciji na 70 oC 30

min na pH 7)

Malo specifian, katalizuje hidrolizu malih peptida i proteina, estara iamida, BAA je odliansupstrat za papain

Pa-S-S-Pa+2H

-2H+

Pa-SH + HS-Pa

Himopapain (3.4.22.6)

slian papainu ali pokazuje i neke zanimljive razlike (jo termostabilniji,pokazuje manji afinitet prema homoglobinu, veoma stabilan pri pH 2


44/62

Ficin (3.4.22.3) i bromelin (3.4.22.5)

Ficin se nalazi u soku raznih Ficus vrsta, u

soku smokve, dok se bromelin nalazi u sokuAnanas vrsta. Spadaju u sulfhidrilneproteinaze, aktiviraju se pod uticajem

cisteina

Ficin iz smokve je dobijen u kristalnom

obliku-sastoji se iz viefrakcija koje nastajuautoproteolizom. Kada se doda natrijum-

tetrationat-dobija se jedna frakcija

Inaktiviraju ga sulfhidrilni reagensi, 1 mol jedinjenja ive inhibira 1 molficina

imamo jednu SH grupu u aktivnom centru

Optimum pH stabilnosti u intervalu od 6-8, jako zavisi od prisustvasupstrata

Temperaturni optimum je vremenski zavistan (za elatinposle 25 min na

pH 7,5 OPTIMUM 62,5o

C. Potpuno se inaktivira na 80o

C.

Fi i (3 4 22 3) i b li (3 4 22 5)


45/62

Ficin (3.4.22.3) i bromelin (3.4.22.5)

Bromelin se dobija iz soka ananasa ili oteenjihstabljika biljke

Slian papainu po mehanizmu inaktivacije sulfhidrilnim agensima,

pokazuje i slinuspecifinost,ali i razlike. Hidrolizuje estre, amide, pokazujeafinitet prema arginin estrima i amidima, ali ne i prema L-Leu-NH2 , CBz-L-Glu-Phe, Cbz-Gly-L-Phe ili Gly-L-Phe-NH2

AKTIVAN JE SAMO NA TRIPSIN SUPSTRATE

Tripsin (3.4.21.4)

Tripsin je jedan od najvanijih proteaza pankreasa i u obliku sirovogekstrakta-pankreatina koristi se u prehrambenoj industriji za proizvodnju

hidrolizata proteina

Tripsin kao endopeptidaza je jedan od najvie prouenih proteaza zbogsledeihvanihsvojstava:

1) pokazuje veliku specifinostka odreenimpeptidnim vezama

2) formira se kao neaktivni prekursor

3) inhibira se prirodnim inhibitorima proteaza

Tripsin, himotripsin i elastaza veoma slini (oko 240 AK, 40% primarne

strukture identino, sve imaju reaktivni Ser i His: His 57-Ser 195 Asp102

Aktivacija prekursora proteaza


46/62

Sintetiuga elijepankreasa u obliku neaktivnog TRIPSINOGENA

Tripsinogen se prevodi u aktivni tripsin u dvanestopalanom crevu

pod uticajem enterokinaze i autokatalitiki. Odvaja se heksapeptid-tripsin inhibitor formule Val-(Asp)4-Lys, ubrzavaju je joni Ca2+, inhibitoripankreasa su vani

Aktivacija prekursora proteaza

Ovo je vano jer najmanje tripsin, himotripsin, pepsin renin ikarboksipeptidaza se sintetiuu obliku neaktivnih prekursora. Ti prekursori se

mogu aktivirati pod dejstvom kiselin aili proteaza ili autokatalitiki

Prekursor Aktivirajui agens

Kiselina Tripsin Entero-

peptidaza

Pepsin Renin

Pepsinogen + +

Prorenin + +

Tripsinogen + +

Himitripsinogen +

Prokarboksipeptidaza A +

T i i (3 4 21 4)


47/62

Tripsin (3.4.21.4)

M=23.000, izoelektrinataka7,5, 233 aminokiselinska ostatka

Endopeptidaza, SERINSKA PROTEAZA

Veoma specifian,pa usled njgove hidrolize nastaju veliki fragmenti

Razlae peptidne veze izmeu COOH grupa baznih aminokiselina (lizin,arginin) i susednih aminokiselina tako da nastaju peptidi sa terminalnim

COOH grupama baznih aminokiselina. Prisustvo NH2ili COOH grupe u blizini

peptidne veze inhibira dejstvo tripsina.

Njegovo dejstvo na bazne aminokiseline se objanjavakao rezultat jonskihinterakcija COOH grupa aspartil ostatka iz aktivnog centra i baznih grupa

aminokiselina.

Optimum pH aktivnosti interval izmeu7,0 i 9,0

Optimum pH stabilnosti u kiseloj sredini ispod pH 6 (najbolje pH 3), pri

viimpH vrednostima dolazi do autokatalizeInhibitori tripsina

DIFP ga inhibira u stehiometrijskom odnosu (reaguje samo sa Ser195

IMA JEDNU OH GRUPU U AKTIVNOM CENTRU


48/62

Inhibitori tripsina


49/62

inhibiraju ga prirodni proteini kao sojini inhibitori (STI i BBI inhibitor),

inhibitori penice,ovomukoid

Do inhibicije dolazi usled kovalentnog vezivanja aktivnog mesta tripsina i

Arg(64)-Ile(65) inhibitora.Prouavanje inhibitora soje, njihovo prisustvo u odreenoj hrani, kao iefekti na digestivni trakt su prdmet aktuelnih istraivanja.

p

Isto ga sintetiu elije pankreasa u obliku neaktivnogHIMOTRIPSINOGENA. Izluuje se u duodenum i tamo pretvara aktivnihimotripsin u prisustvu tragova tripsina.

SERINSKA ENDOPROTEAZA (karakteristinakatalitikatriada)

U pankreasnom soku se mogu nai: HIMOTRIPSINOGEN A i

HIMOTRIPSINOGEN B

M=25000, sastoji se iz 246 ostataka aminokiselina

Optimum pH aktivnosti pH 7-9, toodgovara njegovoj prirodnoj funkciji utankom crevu

Himotripsin (3.4.21.1)


50/62

Dejstvuje kao endopeptidaza, razlae belanevine na peptide sa C-terminalnog kraja aromatinih aminokiselina. Dakle, raskida peptidne vezeizmeu COOH grupe aromatine aminokiseline i bilo koje drugeaminokiseline.

Pokazuje specifinost prema aromatinim aminokiselinama i veimnepolarnim aminokiselinama. Stvaraju se gorki hidrolizati peptida.

Prisustvo slobodne COOH grupe u blizini peptidne veze ini supstratotpornim na dejstvo himotripsina, u nekim sluiajevimai NH2grupa. Moedahidrolizuje i veze izmeumetionina, leucina, triptofana. Moeda deluje i naizvesne estre i amide

Aktivni centar serin-proteinaza


51/62

p

Tretiranje HIMOTRIPSINA sa diizopropil fosfatom (DPF) blokira se OH

grupa serina i enzim se inaktivira u aktivnom centru se nalazi ostatak

serina, koji je sa jedne strane vezan sa asparaginskom kiselinom, a sa

druge sa glicinom. Postoji niz indirektnih dokaza da je aktivirajuagrupa serina-HISTIDIN.

&H#!I"! '$"#&% INE ,I& (J#H& D!J#!,!"& !(J#&H J$%!"&

Himotripsin


52/62

Moe da se koristi za transpeptidaciju ime se odgoravaju hidrolizatisojinih peoteina

Pepsin (3.4.23.1)


53/62

Proteolitikienzim eludanogsoka. Luise u obliku neaktivnog enzima-PEPSINOGENA (autokatalitikiili u prisustvu H+jona odvaja se postepeno 8peptida i pepsin inhibitor i stvara se aktivni oblik pepsina)

Jedan od peptida-inhibitor pepsina, aktivira se pri pH veim od 5stvaranjem EI kompleksa. Pri pH


54/62

Ranije poznat kao lab-ferment ili sirite

Stvara se iz prorenina u elucuodojadii mladih ivotinjadok sisaju.

Renin deluje na kazein iz melka i prevodi ga u parakazein i surutku

Enzim intenzivno zgruava mleko. 1 g renina pri pH 6.2 i na 37 oCkoagulie4.5 miliona grama mleka.

( )

Primena proteaza u mesnoj industriji


55/62

Primena proteaza u mesnoj industriji

Proteaze se koriste u proizvodnji mesa i mesnih preradjevina kao dodatne

supstance pri obradi mesa. Cilj njihovog dodavanja je da se poboljaju senzornasvojstva proizvoda od mesa, ubrza proces zrenja i pobolja nutritivna vrednostproizvoda.

Proteolitiki enzimi se koriste u mesnoj industriji za ubrzavanje procesa zrenjamesa. Odmah nakon rtvovanja ivotinje, meso je prilicno suvo, tvrdo i ilavo.Ta ilavost potie od kolagena, osnovnog proteina vezivnog tkiva iji stepenumreenosti zavisi od starosti ivotinje.

Kod mladih ivotinja, molekuli kolagena su umreeni u manjem stepenu, paprilikom kuvanja elatinizuju usled ega je ovo meso veoma mekano.

Kod starijih ivotinja stepen umreenosti kolagena je daleko veci, tako da seprilikom kuvanja kolagen delimino rastvori i meso ostaje ilavo i posle kuvanja.

Koliinai nainupotrebe proteaza kao dodatka u obradi mesa veoma je

specifinai zavisi od navika i ukusa potroaau pojedinim zemljama


56/62

Da bi meso nakon klanja ivotinje postalo mekano i prijatnog ukusaono se uva na temperaturi od 2-4C u toku 1-4 nedelje da bi dolo

do procesa zrenja i omekavanja mesa usled dejstva proteolitikihenzima na temperaturi od 8-10C.

Najbolja organoleptika svojstva mesa se postiu primenom biljnihproteaza (bromelin, papain, ficin). Zahvaljujui velikoj aktivnostipapaina na povienim temperaturama (optimalan je 65C) i velikojtermalnoj stabilnosti, enzim produeno deluje na kolagen ak i utoku kuvanja mesa. Iako papain, kao i ostale proteaze, nema tako

veliki afinitet prema prirodnom kolagenu, kako dolazi do promene

njegove strukture u toku kuvanja, aktivnost papaina se poveava ipostize se efekat kakav se ne moe postii primenom drugih

proteaza.

-Ukoliko se dodaju prakasti enzimi oni se utrljavaju ili posipaju popripremljenom mesu za obradu. Nedostatak ovih postupaka je u

tome sto enzimi deluju uglavnom na povrinskom sloju, pa se ne

mogu koristiti za obradu vecih komada.


57/62

Za obradu veih komada, meso se uranja u rastvor enzima ili serastvoreni enzimi ubrizgavaju u meso pomou specijalnih uredjaja.

U SAD se pre klanja ivotinje, u ivotinju ubrizga rastvor proteaza uvenu u cilju to bolje raspodele enzima u miinom tkivu.

Proteolitiki enzimi se koriste i prilikom dobijanja kobasica zatretiranje creva koja se pune mesom, pri emu se poveava njihovaelastinost i mekoa.

Obradom ribljih poluproizvoda proteolitikim enzimima znaajno sesmanjuje vreme proizvodjnje i uklanja se neugodan riblji miris. Pored

toga, primena ovih enzima pri preradi ribe ubrzava se usoljavanje i

sazrevanje.

Primena proteaza u pekarstvu


58/62

Primena proteaza u pekarstvu

Kod proizvodnje dvopeka, keksa, hleba u cilju kontrolisanog

razlaganja proteina brana.

Smanjuje se vreme meanja i omoguava dobijanje mekanog,uniformnog testa.

Proteaze (najee mikrobne) deluju na gluten i spreavaju njegovoumreavanje i pozitivno utiu na strukturu pora koje se formirajutokom fermentacije.

Postoji optimalna koliina proteaza koju greba dodati. Ne treba da sesuvie razloi glutenska struktura jer nee moi da se zadrava CO2,

pa testo postaje gumasto. Vrtsta i koliina proteaza treba da se strogo kontroliu.

Koriste se neutralne, termolabilne proteaze iz Aspergillus oryzaejerse inaktivira tokom peenja i omoguava kontrolisanu razgradnjuglutena samo tokom zamesa testa. Manje se koriste bakterijske

proteaze zbog produenog dejstva


59/62

Primena proteaza u pivarstvu

Proteaze se koriste u proizvodnji piva, alkohola i vina

Za oeerenje slada neslaenog zrna koriste se amilaze i proteazemikrobnog porekla

Koriste se i da spree zamuenje piva proteinima do ega dolazi pri

hlaenju piva i duem lagerovanju Dodatak proteaza poveava stabilnost piva pri lagerovanju

Najvie se koriste biljne proteaze papain i bromelin


60/62

Slatki dipeptid ASPARTAM (od fenilalanina i aspartata)

200 puta slai od saharoze

Metilestar-L-aspartil-L-fenilalanin

Termolizin-metlo endopeptidaza EC (3.4.24.4)

Enzim sadri atom Zn i etiri atoma Ca i aktivan je u neutralnimuslovima

Ravnotea reakcije se pomera u pravcu sinteze:

Dodatkom u vodi rastvornih organskih rastvaraa

Dodatkom nepolarnih organskih rastvaraa koji se ne meajusa vodom

Taloenjem proizvoda reakcije

Kompleksacijom proizvoda u sporednim reakcijama

Vodi se proces na povienoj temperaturi

Imobilizacijom enzima

Primena termolizina u proizvodnjiaspartama

Aspartam (L-Asp-L-Phe-Methyl Ester)


61/62

pAspartam je dipeptid koji nastaje vezivanjem L-fenilalanin metilestra i L-aspartanske

kiseline

o200X slai od saharoze

o velika primena u pivarstvu i prehrambenoj industrijio godinja proizvodnja 800 miliona US$

o Nutrasweet Corp proizvodi 75% aspartama za ameriko

trite

Hemijski postupak

aminogrupa aspartinske kiseline mora da se zatiti da ne bireagovala sa jo jednim molekulom kiseline i da ne bi nastajalineeljeni proizvodi

moraju se koristiti optiki ista jedinjenja (oba reaktanta)

Enzimski postupak

Termolizin je specifian i reaguje samo sa -COOH grupom

mogu se koristiti racemske smee oba supstrata

Blagi reakcioni uslovi, 40 oC , pH=6-8

E i k i d j A t


62/62

Enzimska proizvodnja Aspartama

PhHO2C

CO2H

H2O

Termolizin

D,L-fenilalaninmetilestar

Cbz-aspartam

PhCH2OCNH

O

+CO2MeH2N

HO2C

CNHPhCH2OCNH

O

CO2Me

Ph

O

N-Cbz-aspartinskakiselina

Cbz, benziloksicarbonil

Documents

I Deo Materijal-Enzimi u PB