ThS. Lê Hải Đường

1

ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ

KHOA DƯỢC BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH

HÓA PHÂN TÍCH DỤNG CỤ

MỤC TIÊUGiải thích dược nguyên tắc và phân loại các kỹ thuật sắc ký

Giải thích được 3 thông số đặc trưng cho sắc ký lỏng

Tối ưu hóa QT sắc ký 2 chất

Trình bày được nguyên tắc và ứng dụng của sắc ký trong định tính và định lượng

BA THÀNH PHẦN CHÍNH TRONG

MỘT HỆ THỐNG SẮC KÝ 2. CHẤT

PHÂN

TÍCH

3. PHA

TĨNH

Sắc ký là quá trình phức tạp, có

sự tương tác giữa ba thành phần

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định

chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước

tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất và

ngược lại.

Các chất khác nhau thì lực lưu giữ trên pha tĩnh và lực kéo

của pha động là khác nhau. Kết quả là chúng sẽ di chuyển

trong cột với tốc độ khác nhau và tách nhau khi ra khỏi cột.

4

Sắc ký là quá trình phức tạp, có sự tương tác giữa ba thành phần

Sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3

Các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau.

F1 là lực giữ chất phân tích trên cột;

F2 là lực kéo của pha động đối với chất

phân tích ra khỏi cột;

F3 là lực ảnh hưởng không lớn

Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở

đây là tổng hợp ba tương tác đó

1. Nguyên tắc chung của kỹ thuật sắc ký lỏng

Dựa theo khả năng phân bố, tương tác khác nhau của các cấu tử

trong mẫu phân tích giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau khi cho

một pha di chuyển liên tục (gọi là pha động) qua pha còn lại (gọi là

pha tĩnh) theo một hướng nhất định (có thể tách hỗn hợp phức tạp

thành đơn giản hơn, hoặc tách riêng được từng chất).

Phân loại theo bản chất (cơ chế) của

quá trình tách (Bảng 8.1 tr 124)

Phân loại theo cách cho pha động

chạy qua pha tĩnh

Phân loại theo phương cách lưu giữ

pha tĩnh

2. Phân loại sắc ký

Sắc ký phẳng

Sắc ký cột

Sắc ký khai triển

Sắc ký rửa giải

Sắc ký hấp phụ

Sắc ký phân bố

Sắc ký phân bố: Sự táchdựa vào sự phân bố khácnhau giữa các chất vớipha tĩnh và pha động

Sắc ký hấp phụ: Sự tách

do ái lực khác nhau

của các chất đối với

pha tĩnh rắn

Sắc ký trao đổi ion: Sự tách

do ái lực khác nhau của

các ion trong dung dịch

đối với các trung tâm trao

đổi ion trên pha tĩnh rắn.

Sắc ký rây phân tử: Sử dụng

các vật liệu rắn có độ xốp lớn,

có các lỗ với kích thước nhất

định để rây chọn lọc các cấu

tử tuỳ theo kích thước và hình

dạng phân tử

Phân loại theo bản chất (cơ chế)

của quá trình tách

Sắc ký khí (gas chromatography)

Pha động là khí

Sắc ký khí lỏng (gas – liquid chromatography)

Pha động là khí

Sắc ký lỏng (liquid chromatography)

Pha động là chất lỏng

Phân loại

theo cách

cho pha động

chạy qua pha

tĩnh

Sắc ký đồ

Là đường biểu diễn sự phụ thuộc của

nồng độ chất đi ra khỏi cột sắc ký

theo thể tích dung môi rửa giải hoặc

thời gian rửa giải.

V hay t

C

V hay t

C

Sắc ký đồ vi phân và sắc ký đồ tích phân

Điều kiện để thu được sắc ký đồ:

Đầu dò (Detector) được lắp đặt ở điểm cuối

của cột và tương thích với chất cần phát hiện

Peak sắc ký

V hay t

Tín

hiệu

oo’ A BG

Điểm O ứng với thời điểm đưa mẫu vào

Điểm O’ ứng với thời điểm xuất hiện của

chất lý tưởng (không bị hấp phụ lên cột)

Đường OB: đường nền

Khoảng cách GH: chiều cao peak

Khoảng cách AB: chiều rộng peak ở chân

Khoảng cách EF: chiều rộng peak ở ½

chiều cao.

H

E F

3. Thông số đặc trưng cơ bản cho sắc ký lỏng

Thời gian lưu Hệ số dung lượng k’

Hệ số chọn lọc Tối ưu hóa quá trình tách hai chất

Sơ đồ hệ thống sắc ký khíSơ đồ hệ thống sắc ký lỏng

hiệu năng cao

-

Thời gian lưu (tR):

Thời gian lưu chết (to ):

Thời gian lưu hiệu chỉnh (t’R)

t’R = tR – to. Thể tích lưu hiệu

chỉnh: V’R = VR – Vo

Thời gian lưuTín hiệu

Thời gian

tR chất phân tích được giữ trong

pha động là giống nhau, chỉ khác nhau

ở tR bị lưu giữ chúng trên pha tĩnh

tR mà chất phân tích bị lưu giữ

trên pha tĩnh đặc trưng cho mỗi chất

và là thông số để định danh

Hệ số phân bố k

S,i

M,i

CK=

C

Trong đó: CM,i : Nồng độ của chất tan trong pha động.

CS,i : Nồng độ của chất tan trong pha tĩnh.

Hệ số dung lượng k’

K chỉ tuỳ thuộc bản chất của chất

tan, bản chất 2 pha tĩnh, động

Nếu các chất trong hỗn hợp có K

khác nhau càng nhiều thì khả năng

tách càng dễ hơn

Hệ số dung lượng K’ Mô tả tốc độ di chuyển của chất

phân tích A qua cột hay cò gọi là hệ

số phân bố khối lượng giữa hai pha

k’ =CS.VSCM .VM

= KA.Vs/VM

k’ =tR − tM

tM

k’ phụ thuộc bản chất của chất tan, bản chất 2

pha tĩnh, động và tỉ lệ VS/VM

k’ quá nhỏ hoặc quá lớn làm tR quá nhanh hoặc

quá chậm đều không hiệu quả

Chọn điều kiện sắc ký sao cho 1 ≤ k’ ≤ 5

Hệ số chọn lọcĐặc trưng cho tốc độ di chuyển

tỷ đối của 2 chất A; B

=KB

KA

=(tR)B− tM

(tR)A− tM

=k′Bk′A

Để tách tốt hai chất cần

1,05 ≤ ≤ 2

Trong đó: N

4 là số hạng biểu diễn sự phụ thuộc vào độ hiệu nghiệm cột

α -1

α là số hạng biểu diễn sự phụ thuộc vào độ chọn lọc

'

2

'

2

K

1 + Klà số hạng biểu diễn sự phụ thuộc vào dung lượng cột.

Biểu thức liên hệ

Độ phân giải RS của cột

Khả năng tách định lượng hai chất

trong hỗn hợp trên cột sắc ký

1. Tăng chiều dài cột

2. Giảm đường kính cột

3. Giảm tốc độ dòng của pha động

4. Giảm lượng mẫu

5. Chọn lựa pha động và pha tĩnh thích hợp

6. Sử dụng nhiệt độ và áp suất thích hợp

7. Sử dụng PTV hoặc gradient nồng độ.

Tối ưu hoá QT sắc kýBằng cách thay đổi các điều kiện thực nghiệm để hiệu suất tách cao với chi phí

thấp nhất: giảm giãn rộng peak; thay đổi tốc độ di chuyển của các thành phần

Chọn được tọa độ tối ưu cho các thông số

đặc trưng cho quá trình rửa giải:

Các yếu tố ảnh hưởng độ

phân giải RS

Để tăng RS ta có thể:

Tăng tR, tăng khoảng cách giữa

2 peak

Giảm Wb1 và Wb2, giảm bề rộng

đáy, tăng độ nhọn của peak

Ảnh hưởng của N đến RS :

N ảnh hưởng rất mạnh lên RS, N lớn

làm cho các peak trên sắc ký nhọn

hơn, Wb giảm, RS tăng

Khi N tăng gấp đôi, RS tăng 1.4 lần

1 2 3

4

5

6

7 8

0 2 4 8 10 12 14 16 18 206Time (min.)

Column: ZORBAX 300SB-C3 5 µm, 4.6 x

150 mm

Gradient: 15-35% B in 19 min.

Mobile Phase:A: 95 : 5 H2O : ACN và

0.1% TFA

B: 5 : 95 H2O : ACN và

0.085% TFA

1. Leucine Enkephalin 2. Angiotensin

3. RNase A 4. Insulin

5. Cytochrome C 6. Lysozyme

7. Myoglobin 8. Carbonic Anhydrase

Ví dụ: Sự phân tách gradient với mẫu

polypeptides

Các ứng dụng của sắc kýĐược coi là một kỹ thuật phân tích rất hiệu quả để tách và định lượng các hợp chất

có cấu trúc hóa học gần nhau trong một hỗn hợp

Được dùng phổ biến khi mẫu phân tích có nguồn gốc tự nhiên hoặc sinh vật,

So sánh thời gian lưu giữa chất chuân và mẫu phân tích. Thường ghép với IR hoặc ghép với khối phổ

Thường được dùng tách trước khi định tính bằng quang phổ và để kiểm tra tạp chất

ĐỊNH TÍNH

Dựa vào chiều cao hay diện tích peak sắc ký

PP đường chuân (ngoại chuân)

ĐỊNH LƯỢNG

PP nội

chuân

PP chuân

hóa diện

tích

LƯU Ý:

Thời gian lưu tR là đặc trưng riêng của 1

chất khi điều kiện phân tích không thay đổi

(cột sắc ký, thành phần pha động, tốc độ khí

mang hay chương trình nhiệt…)

Thời gian lưu tương đối = tỉ lệ giữa thời

gian lưu hiệu chỉnh của một chất và của một

chất khác được chọn làm chuân. Giá trị này ít

bị ảnh hưởng bởi những thay đổi nhỏ của điều

kiện phân tích.

Phân tích định tính thường dựa trên

việc so sánh thời gian lưu của cấu tử

cần xác định với chất chuân hoặc dùng

phương pháp thêm chuân khi:

Không có sự thay đổi hình dạng peak

Diện tích peak tỉ lệ thuận với lượng mẫu thêm

Với 2 pha tĩnh khác nhau luôn luôn có một peak

Đọc thêm

Định tính trong sắc ký

Cách tính Speak và hpeak

2 cách tính diện tích peak

A’ = h.W1/2

A” = h.WbWb

Cả 2 thông số chiều cao và diện tích đều tỉ lệ với hàm lượng chất phân tích. Trong đó diện tích

S ít thay đổi theo điều kiện phân tích như nhiệt độ… Trong định lượng ta nên sử dụng thông số S

khi peak không đối xứng và sử dụng h khi khả năng phân giải hoàn toàn không đạt được.

peak không đối xứng

peak tách không hoàn toàn

Đọc thêm

Định lượng trong

sắc ký

• tách khỏi pic của thành

phần khác (RS> 1,25)

• gắn với pic của chất

phân tích

Yêu cầu: Chất

chuân nội phải

PP nội chuẩn (Internal standard)Đưa một chất chuân nội vào trong mẫu phân tích và trong DD chuân đối chiếu

Ưu điểm: hạn chế sai số do thể tích mẫu vào cột sắc ký không đồng đều giữa các

lần tiêm và khắc phục những nhược điểm của phương pháp ngoại chuân. Sai số

khoảng 0,5 – 1%).

Chất nội

chuân

Chất cần

xác định

Nguyên tắc: trên cùng sắc ký đồ, dựa vào tỉ

lệ diện tích của các chất với nhau, tính % các

chất hiện diện trong mẫu.

- Thường sử dụng trong tính tỉ lệ phần trăm

của các mẫu rất nhiều thành phần như tinh dầu,

dịch chiết thiên nhiên…và không cần biết nồng

độ chính xác của mỗi chất.

Ưu điểm là dễ sử dụng vì không cần chất

chuân nhưng độ chính xác không cao, ít dùng

trong phân tích định lượng.

PP tính tỉ lệ phần trăm các chất

(Area normalization)