UNIVERSIDAD NACIONAL SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD.ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIQUIMICA

Gua : PRCTICAS DE BIOQUIMICA CLINICA Docente : Q.F. CARLOS ENRIQUE CHALLCO APAZA BIOQUMICO - FARMACUTICO

2015 - II

PRACTICA N 1BIOSEGURIDAD1.- FUNDAMENTO.-Las normas de bioseguridad estn destinadas a reducir el riesgo de transmisin de microorganismos de fuentes reconocidas o no reconocidas de infeccin en Servicios de Salud vinculadas a accidentes por exposicin a sangre y fluidos corporales.2.- COMPETENCIAS: Las competencias del alumno de Medicina son: Cumplir con las medidas de prevencin de accidentes del personal de salud que est expuesto a sangre y otros lquidos biolgicos. La conducta a seguir frente a un accidente con exposicin a dichos elementos. Demuestra respeto por la vida humana mediante comportamiento tico y solidario en su actuar profesional.

3.- PRINCIPIOS DE LA BIOSEGURIDAD1. Universalidad:Las medidas deben involucrar a todos los pacientes, trabajadores y profesionales de todos los servicios, independientemente de conocer o no su serologa. Todo el personal debe seguir las precauciones estndares rutinariamente para prevenir la exposicin de la piel y de las membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal del paciente. Estas precauciones, deben ser aplicadas para todas las personas, independientemente de presentar o no enfermedades.2. Uso de barreras:Comprende el concepto de evitar la exposicin directa a sangre y otros fluidos orgnicos potencialmente contaminantes, mediante la utilizacin de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras (ej. guantes) no evitan los accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen las probabilidades de una infeccin.3. Medios de eliminacin de material contaminado:Comprende el conjunto de dispositivos y procedimientos adecuados a travs de los cuales los materiales utilizados en la atencin de pacientes, son depositados

4.- BIOSEGURIDAD EN SALUD OCUPACIONAL.-Se la define como El conjunto de medidas preventivas y correctivas, destinadas a que los procedimientos realizados en Instituciones sanitarias humanas y animales no afecten la salud y seguridad de trabajadores, pacientes, visitantes y medio ambiente.

Se refiere a prevenir y tratar la exposicin a agentes infecciosos. La base es el Sistema de Precauciones Universales que fue establecido por un grupo de expertos del Centro de Control de Enfermedades (C.D.C) de Atlanta, en 1987, con guas para prevenir la transmisin de los pacientes hacia los trabajadores de la salud y viceversa.

PRINCIPIO BASE: UNIVERSIDAD NACIONAL SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO FARMACIA Y BIOUIMICATodos los pacientes y sus fluidos corporales, independientemente del diagnstico, deben ser considerados como infectados e infectantes y tomarse las precauciones necesarias para prevenir la transmisinQ.F. CARLOS E. CHALLCO APAZAPgina 2

5.-CLASIFICACIN DE LAS REAS SEGN EL RIESGO.-A diario el trabajador de salud labora en ntimo contacto con pacientes, por lo que existe la posibilidad de transmitir y contraer enfermedades infecciosas durante la atencin mdica. Segn el rea se clasifica:a) reas de alto riesgo crticas.-Son aquellas en las que existe contacto directo y permanente con pacientes y sus fluidos corporales. Salas de ciruga. Hospitalizacin. Unidades de cuidados intensivos. Neonatologa. Unidades de quemados. Salas de parto. Unidades spticas. Unidades de dilisis. Urologa. Servicios de urgencias. Rayos X de urgencias. Laboratorio clnico. Banco de sangre. Odontologa. Patologa. Lavandera. Depsitos de desechos finales. b) c) reas de riesgo intermedio semicrticas.-reas de actividades en donde el contacto con sangre o lquidos corporales no es permanente: Consulta externa. Esterilizacin. Fisioterapia. Rayos X de hospitalizacin. reas de preparacin de soluciones enterales y parenterales. Servicios de alimentacin. Servicios de mantenimiento. Servicios de limpieza y aseo.d) e) reas de bajo riesgo no crticas.-reas donde se realizan actividades que no implican por s mismas exposicin a sangre y lquidos corporales: reas administrativas Pasillos Salas de espera Farmacia Oficina de nutricin.

6.- TABLA DE NIVELES DE BIOSEGURIDAD Losniveles de bioseguridadson estndares internacionales y su clasificacin est dada en funcin del grado de letalidad de las enfermedadesBSLBiological safety LevelsAgentesInfecciososPrcticasEquipamiento deseguridad.(Barreras Primarias)Infraestructura.(Barreras Secundarias)

Nivel 1No causales de enfermedad en adultos sanosTrabajos microbiolgicos estndaresNo se requierenMesadas con bachas y agua corriente

Nivel 2Asociados conenfermedades en adultos, peligro de infeccin por: herida percutnea, ingestin, exposicin de membranas mucosasBSL-1 ms: Acceso limitado, Sealizacin de peligro biolgico, Manual de bioseguridad disponible, decontaminacin rutinaria de desechos seleccionadosGabinetes de seguridad Clase I o II para todas las manipulaciones de agentes que puedan causar aerosoles o derrames. Guardapolvos, guantes y mascarillas cuando se requieranBSL-1 ms: autoclave dedicada

Nivel 3Exticos con potencial de transmisin por aerosoles, causales de enfermedades serias o letalesBSL-2 ms: Acceso controlado, Decontaminacin de todos los desechos, Decontaminacin de ropa de trabajo, Controles serolgicos peridicosBSL-2 para todas las manipulaciones, respiradores autnomos cuando se requieranBSL-2 ms: Separacin fsica de pasillos y laboratorios, Puertas de acceso doble con cerradura automtica, Aire viciado no recirculado, Flujo de presin negativa en el laboratorio

Nivel 4Exticos peligrosos con alto riesgo de enfermedad letal, infecciones transmisibles por aire y por vas desconocidasBSL-3 ms: Cambio de ropa antes de entrar al recinto, Ducha decontaminante al salir del mismo, todos los materiales decontaminados para salir del mbitoTodos los procedimientos llevados a cabo en gabinetes Clase III, o gabinetes Clase I y II en combinacin con traje completo de presin positivaBSL-3 ms: Edificio aislado o zona caliente. Sistema de circulacin de aire, vaco y decontaminacin dedicados.

7.- CUESTIONARIOIndique cul es el objetivo de la bioseguridad? UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO P.A.P. MEDICINA HUMANACules son los lquidos para los que deben observarse las Precauciones UniversalesQ.F. CARLOS E. CHALLCO APAZAPgina 40

Realice un plan de trabajo para evitar contaminaciones en laboratorio?Indicar los colores frecuentes usados en laboratorio sobre bioseguridad y para qu sirven?indique los principios bsicos de la bioseguridad?

PRACTICA N 2TOMA DE MUESTRA - VENOPUNCION1.- FUNDAMENTO.- Se practica cuando el Medico solicitante ordena un anlisis de sangre para confirmar o descartar su diagnostico clnico.2.- COMPETENCIAS.- Que el alumno aplique los conocimientos y actitudes que se desarrollan dentro del laboratorio. Analiza la importancia y utilidad de la venopuncin. Aplica la tcnica de la venopuncin. Aprende a extraer muestra de sangre. Aprende a utilizar el Vacutainer

Los exmenes hechos en la sangre o en partes de sta le pueden suministrar claves importantes al mdico acerca de la salud de la persona, orientndolo hacia el diagnstico y/o tratamiento.3.- METODOS.-El profesional de la salud coloca una banda elstica o torniquete alrededor de la parte superior de la zona que se va a punzar con el fin de aplicar presin en el rea y hacer que las venas se llenen de sangre. El sitio de puncin se limpia entonces con un antisptico, la mayora de las veces con alcohol isoproplico.Algunos profesionales de la salud escogen golpear con suavidad sobre la superficie de la piel por encima de la vena para causar una dilatacin venosa refleja. Otros prefieren evitar esa prctica.4.- PROCEDIMIENTO PARA TOMAR LA MUESTRA: TENER CUIDADO DE: Escribir el nombre del sujeto sobre los tubos que se va a llenar. Usar guantes de goma protectores para asegurar las medidas de precaucin universal. Una vez escogida la vena apropiada para la puncin (vena mediana baslica que es ms superficial). Se limpia la zona de puncin, con alcohol al 70 % no se debe volver a tocar dicha zona. La aguja debe apuntar en la misma direccin que la vena, bisel hacia arriba. La sangre comenzara a penetrar en la jeringa. Tan pronto la aguja entre en la vena y se obtenga una cantidad de sangr se retira el torniquete y luego se retira la aguja. Se coloca una torunda de algodn sobre el sitio de la puncin y se comprime con los dedos de la otra mano no se flexiona el codo. La sangre extrada en el tubo dejar coagular 10 min y luego centrifugar para obtener el suero.5.- COMPLICACIONES QUE SE PUEDEN PRESENTAR EN LA TOMA DE MUESTRA: Sincope (Prdida repentina del conocimiento y de la sensibilidad, debida a la suspensin sbita y momentnea de la accin del corazn En algunos pacientes con tendencia a las hemorragias, puede producirse una estribacin local de la sangre. Aplicando una presin adecuada (torunda) sobre el lugar de puncin se evita la formacin de hematomas. Despus de una serie de punciones venosas repetidas puede producirse trombosis (Formacin de un trombo en el interior de un vaso sanguneo). O flebitis (inflamacin de las venas). La aguja usada debe desecharse en un recipiente adecuado.CUESTIONARIODEFINA VENOPUNCION?INDIQUE LOS PASOS A SEGUIR DURANTE TODO EL PROCESO DE TOMA DE MUESTRA SANGUINEA (VENOSA Y ARTERIAL)?INDICAR LOS USOS DE LOS DIFERENTES TUBOS OBSERVADOS DURANTE LA PRCTICA?QU MATERIALES SE UTILIZA PARA LA PRACTICA? CUALES SON LAS PRECAUCIONES QUE SE DEBE OBSERVAR EN LA TOMA DE MUESTRA?

PRACTICA N 3DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES Y ALBUMINAS1.- FUNDAMENTOS DEL METODO: Las protenas del suero se tratan con SO4Cu en presencia de tartrato alcalino de sodio y potasio para dar una coloracin violeta estable (reaccin de Biuret), la cual se valora por foto colorimetra. La cantidad de color producido es proporcional a la concentracin de protenas y es medida espectrofotomtricamente a 540 nm. En conclusin los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan con el in cprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con mximo de absorcin a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentracin de protenas totales en la muestra.

2. COMPETENCIAS.- Que el alumno tenga una definicin correcta de las protenas. Que el alumno explique las funciones principales de las protenas. Conocer la importancia de las protenas plasmticas. Conocer la importancia nutricional de las protenas y los aminocidos. Manejar la tcnica de cuantificacin de protenas totales y fraccionadas en suero humano, e interpretar los resultados correctamente.

3.- SIGNIFICACION CLINICALas protenas son compuestos orgnicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el organismo y esenciales para la vida. Actan como elementos estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulacin, etc.La protena ms abundante en plasma es la albmina. Una de sus funciones ms importantes es la de permitir el transporte de cidos grasos, hormonas esteroides, bilirrubina, catecolaminas, que en forma libre son insolubles en medio acuoso.La concentracin de albmina en plasma influye notablemente en el mantenimiento de la presin coloidosmtica, lo que estara relacionado con su relativamente bajo peso molecular y su gran carga neta.En condiciones patolgicas como prdidas renales, desnutricin, infecciones prolongadas, etc., suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que en otras como mieloma mltiple, endocarditis bacteriana y hemoconcentraciones de diversos orgenes, se observan hiperproteinemias.En general, ambas situaciones se ven acompaadas tambin por hipoalbuminemias. Los aumentos anormales de albmina son ocasionales y se relacionan casi siempre con deshidratacin que produce el consecuente aumento en el contenido proteico del plasma.4.-SIGNIFICADO DE LOS RESULTADOS ANORMALES:Los niveles superiores a los normales en SUERO puede deberse a: Enfermedades Inflamatorias crnicas Enfermedades infecciosas crnicas ( VIH, Hepatitis B o C) Mieloma mltiple. Enfermedad de Waldenstrom. Deshidratacin ( hiperproteinemia debido a la hemoconcentracin)Los niveles inferiores a los normales puede deberse: Agamaglobulinemia Sangrado ( hemorragias) Quemaduras ( extensas) Glomerulonefritis Enf. Heptica Mala absorcin Desnutricin Enteropata por perdida de protena

5.- Materiales y Metodos: Biolgico. Utilizar suero libre de hemolisis. Reactivo 0.5% (peso/volumen) yoduro de potasio, 0.9% (peso/volumen) tartrato de sodio y potasio, 0.3% (peso/ volumen) de sulfato cprico. ( Reactivo de Valtex). Equipo requerido: Espectrofotmetro con absorbancia de 540nm.5.1. Metodos:B (Blanco)S (Standard)P (Problema)

Muestra (ul)----10 ul

Suero patrn--10 ul--

Agua destilada(ml)10 ul----

Reactivo (ml)1 ml 1 ml1 ml

Mezclar con varilla. Incubar en BM por 15 min a 37C , leer las absorvancias a 540 nm llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos.

6.-PRECAUCIONES.-Puede ser txico si se ingiere. No pipetee con la boca. 7. Resultados.- Se realizan mediante la formulaConcentracin Standard g/dlFactor = -------------------------------------- Absorbancia Standard

Protena Total gr/dl = Factor (27gr/dl) x Absorbancia del desconocido.8. VALORES DE REFERENCIAProtenas totales: 6.1 a 7,9 g/dl.VALORES NORMALES DE PROTENAS EN SUERO Los valores normales en adultos son entre 6 y 8,3 gr/dlLos valores normales en prematuros son entre 4,2 y 7,6 gr/dl Los valores normales en recin nacidos son entre 4,6 y 7,3 gr/dlLos valores normales en lactantes son entre 6 y 6,7 gr/dlLos valores normales en nios son entre 6,2 y 8 gr/dl.

9.- CUESTIONARIO Cules son las razones por las que se realiza el examen de protenas totales?Indique cules son las interferencias en el desarrollo de la prctica?Realice el flujo grama del procedimiento hasta la obtencin de resultados?existe relacin entre la intensidad de la coloracin y la concentracin de proteinas?

DETERMINACION DE ALBUMINAS

1.- FUNDAMENTOS DEL METODO

La albmina reacciona especficamente -sin separacin previa- con la forma aninica de la 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon ftalena (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del Blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albmina presente en la muestra.2.- COMPETENCIAS.- Analizar la importancia que tiene la albumina. Conocer los valores normales de albumina. Entender cmo influye la alimentacin.3.- Significancia clnica.- La albmina es la protena de ms concentracin en la sangre. La albmina transporta muchas molculas pequeas (bilirrubina, progesterona, y medicamentos), y tiene tambin la funcin de mantener la presin sangunea ya que favorece la presin osmtica coloidal para mantener lquidos en el torrente sanguneo y que no pasen a los tejidos, manteniendo un equilibrio. Por ello la concentracin de albmina en la sangre es mucho mayor que la del sodio o cloro, a diferencia de los tejidos en los que ocurre lo contrario. La albmina representa el 60% de las protenas que contiene el suero, el resto son las globulinas.4.-VALORES BAJOS DE ALBUMINA EN SANGRE SE PUEDE DEBER: Mal nutricin Ascitis Enfermedades renales (glomerulonefritis, sndrome nefrtico) Enfermedades del hgado (hepatitis, cirrosis) Enfermedades intestinales con mala absorcin Quemaduras Insuficiencia cardiaca congestiva Cncer como el sarcoma o amiliodosis. Infecciones como la tuberculosis.

5.- Metodos: B (Blanco)S (Standard)P (Problema)

Muestra (ull)----10 ul

Suero patrn --10 ul--

Reactivo BCF(ml)3,5 ml3,5 ml3,5 ml

Mezclar con varilla. Mantener los tubos entre 15 y 28 o C durante 10 min. Leer en espectrofotmetro a 625 nm llevando a cero con el blanco del reactivo estable 20 min.

6.- Resultados.- Se realizan mediante la formula Albumina (mg/dl) = Factor ( 15) x Absorbancia desconocida.7.- Valores de referEncia.-Albumina: 3,5 a 4,8 g/dl. Relacin A/G 1,2 a 2,2 8.- CUESTIONARIOPara que se realiza el anlisis?Indique cuando tenemos valores elevados y si tiene importancia clinica?Explique sobre la relacin albumina /globulina y su importancia?Qu color es la reaccin de las albuminas y tiene relacin con la concentracin?

PRACTICA N 4 SEPARACIN DE PROTENAS POR DILISIS1.- FUNDAMENTO.-Las protenas son los materiales que desempean un mayor nmero de funciones en las clulas de todos los seres vivos. Por un lado, forman parte de la estructura bsica de los tejidos (msculos, tendones, piel, uas, etc.) y, por otro, desempean funciones metablicas y reguladoras (asimilacin de nutrientes, transporte de oxgeno y de grasas en la sangre, inactivacin de materiales txicos o peligrosos, etc.). Tambin son los elementos que definen la identidad de cada ser vivo, ya que son la base de la estructura del cdigo gentico (ADN) y de los sistemas de reconocimiento de organismos extraos en el sistema inmunitario. Son macromolculas orgnicas, constituidas bsicamente por carbono (C), hidrgeno (H), oxgeno (O) y nitrgeno (N); aunque pueden contener tambin azufre (S) y fsforo (P) y, en menor proporcin, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (I), etc.Lo anterior determina que las protenas sean incapaces de atravesar membranas semipermeables, lo que posibilita que una solucin en donde existen protenas y otros constituyentes de menor peso molecular (aminocidos, monosacridos, urea creatinina, sales iones etc.) las primeras pueden ser separadas al no poder pasar atreves de los poros de las membranas semipermeables; en tanto que los otros constituyentes, de menor peso molecular, pasaran sin problema alguno. 2.-COMPETENCIAS: Aprende a aislar las protenas de alto peso molecular del suero sanguneo. Analiza el carcter macromolecular de las protenas, al utilizar un mtodo para separarlas de otros componentes de menor peso molecular. Identificara los dos grandes tipos de protenas (albuminas y globulinas) por su solubilidad en agua y en soluciones salinas diluidas. Estudiar el efecto de la fuerza inica sobre la solubilidad de las protenas del suero sanguneo. Constatara la accin del acido tricloroacetico (TCA) como agente precipitante de las protenas.3.- METODO.- Dilisis del suero sanguneo utilizando como membrana semipermeable una bolsa de celofn.

4.- PROCEDIMIENTO.- 1. Medir en el interior de una bolsa de celofn, 5 ml de suero sanguneo y cerrar la bolsa.2. Colocar la bolsa de celofn en el interior de un beaker conteniendo agua destilada, la misma que debe ser renovada cada cierto tiempo (20 minutos).3. Al notar algo de precipitado en el interior de la bolsa, vaciar su contenido a u tubo de centrifuga y centrifugar por 5 min. a 2500 rpm.4. Separar el sobrenadante en un tubo de ensayo y aadir 5 ml de acido tricloroacetico al 10 % . Observar lo que sucede.5. Trate de disolver el precipitado que quedo en el tubo de centrifuga utilizando agua destilada, de no ser posible, aada unas gotas de NaCl al 10 % y observar si dio resultado.5.- RESULTADOS:1. Escriba si observo precipitado en el interior de la bolsa y a que puede corresponder.2. Que observo al aadir el cido tricloroacetico al 10 %, explique la reaccin.3. Fue posible disolver el precipitado del tubo con agua destilada, investigue porque.4. Que ocurri al aadir el NaCl al 10 %.5. Qu es fuerza inica?6.-CUESTIONARIO:Porque es necesario renovar el agua destilada del beaker cada cierto tiempo?Cul es el fundamento de la precipitacin de las protenas por el cido tricloroacetico?Investigue que es dilisis y para qu sirve?Explique y de un ejemplo de solucin hipotnica, isotnica, hipertnica?

PRACTICA N 5DETERMINACION DE AMILASA en sangre ( amilasemia )1.- FUNDAMENTOS DEL METODOEl sustrato, almidn tamponado, se incuba con la muestra, producindose la hidrlisis enzimtica. Esta se detiene por el agregado de reactivo de iodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidn no hidrolizado. La disminucin de color respecto de un sustrato color (sin muestra) es la medida de la actividad enzimtica, que se expresa en Unidades Amilolticas (Smith & Roe) /decilitro (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarognicas (Somogyi)/decilitro.2.-. SIGNIFICACION CLINICALa amilasa, producida en el pncreas excrino y en las glndulas salivales, escinde los enlaces 1-4 glucosdicos de los polisacridos (almidn y glucgeno).Se encuentra elevada en el suero de pacientes con pancreatitis aguda, alcanzando los valores ms elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para volver a los niveles normales entre las 24 y 48 horas siguientes.Tambin se ve aumentada en este caso la excrecin urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 das, luego de que la actividad srica ha alcanzado los niveles normales.Tambin es posible encontrar valores aumentados en cualquier caso de "abdomen agudo" o intervencin quirrgica en regiones prximas al pncreas.Las parotiditis bacterianas y paperas se asocian tambin con elevaciones en los niveles de amilasa srica.Es una prueba que mide la cantidad de la enzima amilasa en la (sangre). La amilasa se puede tambin probar en orina. 3. PREPARACIN PARA EL EXAMEN.- Se debe evitar el consumo de alcohol antes del examen. Es posible que el mdico aconseje la suspensin de medicamentos que pueden afectar los resultados de ste. Los medicamentos que pueden aumentar las mediciones de amilasa son, entre otros: asparraguinas, aspirina, frmacos colinrgicos, corticoesteroides, indometacina, diurticos de asa y tiazdicos, metildopa, opiceos (codena, morfina), anticonceptivos orales (pldoras anticonceptivas) y pentazocina. 4. RAZONES POR LAS QUE SE REALIZA EL EXAMEN.-Este examen se realiza principalmente para diagnosticar o controlar enfermedades del pncreas e igualmente puede detectar algunos problemas del tubo digestivo. La amilasa es una enzima que ayuda a digerir el glucgeno y el almidn, y es producida principalmente en las glndulas salivales, pncreas, hgado y trompas de Falopio. Cuando el pncreas se enferma o se inflama, la amilasa se escapa hacia la sangre. 5. VALORES NORMALES.-El rango normal es de 23 a 85 U/L. Algunos laboratorios dan un rango de 40 a 140 U/L. 6.- SIGNIFICADO DE LOS RESULTADOS ANORMALES: Los niveles elevados de amilasa pueden indicar: (investigue y fundamente su respuesta)Pancreatitis aguda La disminucin de los niveles de amilasa puede indicar: Dao al pncreas Enfermedad renal Cncer pancretico Toxemia del embarazoOtras afecciones bajo las cuales se puede realizar el examen son: Pancreatitis crnica Cetoacidosis diabtica Seudoquiste pancretico CUESTIONARIOIndique cules son los valores normales de amilasa srica?tiene relacin la intensidad de color con la concentracin de amilasa?Qu cuidados se debe tener durante el procedimiento y cuales son los interferentes en la reaccin?Por qu es importante su determinacin?

PRACTICA N 6 FACTORES QUE DETERMINAN LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA EN TEJIDO ANIMAL Y EN SANGRE1.- COMPETENCIAS.- Analiza la presencia de la enzima catalasa en una muestra de tejido animal (Hgado) y en la sangre. Interpreta el efecto de la temperatura en las reacciones enzimticas. Observa el efecto de un inhibidor sobre la catalasa.

2.- INTRODUCCION.- Las enzimas son protenas que catalizan las reacciones qumicas en los seres vivos con una elevada eficiencia (actividad molar). 2H 2 O2 Catalasa 2H2 O + O2 Esta enzima es una hemoproteina, considerada as por la presencia del grupo hemo que constituye su sitio cataltico. La catalasa aumenta la velocidad de la reaccin en 10 - 10, la regin de la enzima que participa en la reaccin se denomina centro activo, es a travs de este lugar que se puede explicar la eficiencia de las enzimas.

3. MATERIALES Y REACTICOS.- Muestra, suero, perxido de hidrogeno, sulfato de cobre (Reactivo de Biuret).

4. PROCEDIMIENTO.-1. Pesar 10 g de muestra.2. Licuar con 30 ml de agua destilada.3. Centrifugar a 3500 rpm por 15 min.4. A 3 ml del sobrenadante, aadir 5 ml de perxido de hidrogeno.5. Observar el burbujeo que se produce.

5. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA.- Medir un volumen de agua, colocar en un tubo de ensayo y dejar a temperatura ambiente; enseguida adicionar al mismo tubo solucin de catalasa, agitar y medir la altura de la espuma producida. Realizar el mismo procedimiento a diferentes temperaturas,( TA,28,40,60 4 C.).

6.- EFECTO DE UN INHIBIDOR.-Medir un volumen de perxido de hidrogeno agregar la solucin de catalasa y el inhibidor correspondiente, midiendo la altura de espuma producida.CUESTIONARIOInvestigue que otros factores influyen en la reaccin de las enzimas.?importancia de la reaccin de la catalasa?explique con graficas la reaccin que observo?

PRACTICA N 7DETERMINACION DEL INDICE DE GLICEMIA

1. FUNDAMENTOS DEL METODO.-El esquema de la reaccin es el siguiente:Glucosa + O2 +H2O -----GOD Acido glucnico + H2O22H2O2 + 4-AF + Fenol ---------POD Quinona coloreada + 4 H2O La glucosa reacciona con el reactivo enzimtico que contiene la mezcla de enzimas glucosa oxidasa (GOD) y peroxidasa (POD). En la primera etapa la glucosa es oxidada enzimaticamente por la GOD (glucosa oxidada)a cido gluconico y agua oxigenada, el agua oxigenada formada es separada por la enzima POD (peroxidasa) que reacciona con el 4-AF (sol de 4- aminofenazona) producindose un compuesto coloreado quinona coloreada ms agua con un mximo de absorcin a 505 nm en cantidad proporcional a la cantidad de glucosa presente:

2.- SIGNIFICACION CLINICALa patologa ms comn relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono es la diabetes mellitus. El diagnstico precoz y el control de los pacientes diabticos, tienen por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones de los sntomas resultantes de la hiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado.Dado que existen mltiples factores causales de hiper o hipoglicemia, debe considerarse en cada caso la condicin fisiolgica y/o la patologa presente en el paciente en cuestin.3.- COMPETENCIAS.- Conocer la importancia de los carbohidratos en la nutricin del ser humano. Explicar el proceso de digestin de los glcidos, su mecanismo de transporte y el destino de estos en el cuerpo humano. Describir las reacciones enzimticas de la va glicoltica sobre la generacin de energa as como su regulacin. Conoce las condiciones para la toma de muestra. Conocer los efectos metablicos de la insulina. Aprende cual es la alimentacin y cuidados del diabtico. Al finalizar la sesin educativa, los alumnos sern capaces de realizar por si solos y sin errores, la tcnica de control de glicemia mediante Hemoglucotest.

4. MATERIALES Y METODO:4.1. Materiales: Biolgico: Utilizar suero libre de hemolisis. Reactivo De WINER LAB para la determinacin de glucosa enzimtica. Standard: solucin de glucosa 1 g/l. Enzimas GOD/POD, Solucin de glucosa oxidasa y peroxidasa. Reactivo 4 AF: solucin de 4 aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92 mol/l. Reactivo fenol: solucin de fenol 55 mmol/l. Equipo requerido: Espectrofotmetro. Rango de absorbancia 505 nm.

4.2. Mtodos:B (Blanco)S (Standard)D (Desconocido)

Standard ( ml)--10ul-

Muestra (ml)---10ul

Reactivo de trabajo (ml) 1ml1ml1ml

Mezclar e incubar 10 min en BM a 37C , leer las absorvancias a 505 nm llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos.

5. RESULTADOS.- Se realizan mediante la frmula: 100g/lFactor = -------------------------------------- Absorbancia StandardGlucosa (g/l) = Factor ( 252) x Absorbancia desconocida.6. VALORES DE REFERENCIA.-Suero o plasma: 0,70 1,10 g/l 70 - 110 mg/dl.

CUESTIONARIOInvestigue sobre la diabetes, causas, clasificacin y prevencin?Importancia de la glicemia?Cules son los interferentes en la reaccin?explique cmo sacar el factor de la glucosa?

PRACTICA N 8PERFIL LIPIDICO DETERMINACION DE COLESTEROL TOTAL.1.- FUNDAMENTOS DEL METODOEl Colesterol es oxidado enzimticamente por el colesterol oxidasa (CHOD), previa hidrlisis enzimtica de los steres mediante una lipasa de origen fungal. El Agua oxigenada (H2O2) generada en la oxidacin permite la unin oxidativa del fenol con la 4-aminoantipirina mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa (POD). El indicador final es la quinoneimina.

El esquema reaccional es el siguiente: lipasasteres de colesterol. > colesterol + cidos grasosCHODcolesterol + O2. > colesten-3-ona + H2O2PODH2O2 + 4-AF + fenol > quinona coloreada + H2O

2.- SIGNIFICACION CLINICALa determinacin de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnstica limitada. Se ha visto que el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formacin de ateromas dado que las complicaciones arteriosclerticas prevalecen en individuos hipercolesterolmicos.Estudios epidemiolgicos demuestran que el riesgo de contraer enfermedad cardaca coronaria para individuos de ms de 40 aos con colesterolemia menor a 2,10 g/l es 3 veces menor que entre individuos con ms de 2,30 g/l y 6 veces menor que entre individuos con ms de 2,60 g/l.

3.- COMPETENCIAS.- Describir el mecanismo de digestin, absorcin, transporte y destino de los lpidos Conoce, las funciones importantes de los lpidos. Aplica condiciones de toma de muestra. Realiza correctamente las tcnicas de dosaje de colesterol en humano e interpretar correctamente los resultados obtenidos. Aprende, el diagnostico de las dislipemias.

4.- Materiales y mtodos Material biolgico: Suero o plasma.REACTIVOS: Standard: solucin de colesterol 2 g/l. Enzimas suspensin conteniendo lipasa fungal 300U/ml, colesterol oxidasa (CHOD).3 U/ml y peroxidasa ( POD) 20 U/ml. Reactivo 4 AF: solucin de 4 aminofenazona 25 mmol/l Reactivo fenol: solucin de fenol 55 mmol/l.Equipo requerido: Espectrofotmetro. Rango de absorbancia 505 nm.Tcnicas:B (Blanco)S (Standard)P (Problema)

Standard--10m ul

Muestra--10 ul

Reactivo enzimtico (ml)1 ml 1ml 1ml

Incubar 15 minutos en BM a 37C o 30 minutos a 25C. Leer las absorbancias a 505 nm llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco. El color resultante es estable por a lo menos 30 minutos.

5.- Resultados y clculos.200g/lFactor = -------------------------------------Absorbancia Standard.Colesterol (g/l) = Factor ( g/l ) x Absorbancia problema.6.-VALORES DE REFERENCIA.-Deseable: 2,00 g/l 200 mg/dlModeradamente alto: 2,00-2,39 g/lElevado: 2,40 g/l No todo lo que brilla es oro, dice el refrn. Ni todo colesterol es malo, se podra agregar. De hecho, no hay colesteroles distintos, ni buenos ni malos, se trata de la misma molcula que es esencial para la vida.

CUESTIONARIOCules son las enfermedades cardiovasculares, explique porque se producen?Dibuje la estructura del colesterol?Mencione las diferentes fracciones del colesterol?indique las enzimas que participan en la reaccin?

PRACTICA N 9DETERMINACION DE FRACCIONES DE COLESTEROL HDL Y LDL HDL COLESTEROL1.- FUNDAMENTOS DEL METODOLas lipoprotenas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las lipoprotenas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de sulfato de dextrn de PM 50.000 en presencia de iones Mg++.En el sobrenadante separado por centrifugacin, quedan las HDL y se realiza la determinacin del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema enzimtico Colesterol oxidasa/ Peroxidasa con colorimetra segn Trinder (Fenol/4-Aminofenazona).

2.- SIGNIFICACION CLINICALas lipoprotenas plasmticas son partculas esfricas que contienen cantidades variables de colesterol, triglicridos, fosfolpidos y protenas. Estas partculas solubilizan y transportan el colesterol en el torrente sanguneo.La proporcin relativa de protena y lpido determina la densidad de estas lipoprotenas.La funcin principal de las lipoprotenas de alta densidad o HDL (high density lipoprotein) en el metabolismo lipdico es la captacin y transporte de colesterol desde los tejidos perifricos al hgado en un proceso conocido como transporte reverso de colesterol (mecanismo cardioprotectivo).El HDL colesterol bajo, est asociado con un alto riesgo de enfermedad cardaca. Por este motivo la determinacin de HDL colesterol es una herramienta til en la identificacin de individuos de alto riesgo.

3. COMPETENCIAS.- Aprende la importancia de los valores altos del colesterol HDL. Conoce las principales enfermedades que se producen en la disminucin de los valores normales de HDL. Analiza la importancia de las lipoprotenas HDL de alta densidad.

4. MATERIALES.- Muestra.- Suero o plasma.Reactivo dextran: solucin de sulfato de dextran.Reactivo magnesio: solucin de cloruro de magnasio.5. PROCEDIMIENTO.-En un tubo medir (0.5 ml o 500 ul) de muestra, utilizaremos la mitad 250 ul de suero, (50 ul de Reactivo Precipitante), en este caso 25 ul . Homogeneizar agitando (sin invertir) durante 20 seg y dejar 30 a 40 min en refrigerador ( 4- 10 C ) o 15 min en BM Centrifugar 15 min a 3000 r.p.m.Usar el sobrenadante lmpido como muestra.En 3 tubos de foto colorimtrico marcados B, S y D Colocar:B (Blanco)S (Standard)P (Problema)

Sobrenadante---50 ul

Standard--10 ul

Reactivo enzimtico (ml)1 ml1ml1ml

Mezclar e Incubar 5 min. en BM a 37C, retirar del BM y enfriar. Leer las absorbancias a 505 nm, llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco.

6. CALCULOS DE LOS RESULTADOS.- HDL Colesterol (g/l) = D x F F = 151 g/l

7. VALORES DE REFERENCIA:HDL Colesterol 0,40 0,60 g/l

CUESTIONARIOCul es el significancia clnico de la determinacin de las lipoproteinas?.Importancia del HDL en el organismo?Cul es la importancia del reactivo precipitante?explique los valores elevados y bajos?

DETERMINACION DE FRACCIONES DE COLESTEROL HDL Y LDL LDL COLESTEROL1.-. FUNDAMENTOS DEL METODOLas lipoprotenas de baja densidad (LDL o -lipoprotenas) se separan del suero precipitndolas selectivamente mediante el agregado de polmeros de alto peso molecular. Luego de centrifugar, en el sobrenadante quedan las dems lipoprotenas(HDL y VLDL); el colesterol ligado a las mismas se determina empleando el sistema enzimtico Colesterol oxidasa/Peroxidasa con colorimetra segn Trinder (Fenol/4-AF).Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene el colesterol unido a las LDL.

2.- SIGNIFICACION CLINICAEl contenido aproximado de colesterol en cada familia de lipoprotenas es (en % por unidad de peso): 1% en los quilomicrones, 18% en las VLDL, 50% en las LDL y 23% en lasHDL. Dado que cada familia posee distinta actividad biolgica, el significado clnico de un aumento de colesterol depende de la o las lipoprotenas que se encuentran en exceso.Por otra parte, los mecanismos reguladores de los niveles plasmticos de lipoprotenas son muy complejos y pueden ser afectados por mltiples factores (genticos, ambientales, fisiolgicos o patolgicos), siendo posible encontrar valores de colesterol total cercanos al rango normal acompaados de alteraciones en las fracciones lipoproteicas.Las HDL y las LDL han sido las ms estudiadas por su importanteactividad biolgica: las LDL, producto del metabolismo de las VLDL en plasma, son las encargadas del transporte del colesterol exgeno (y en mucho menos proporcin, endgeno) hacia el interior de las clulas; las HDL, sintetizadas en el hgado, remueven el colesterol no utilizado por las clulas (dentro de ciertos lmites de concentracin), transportndolo hacia el hgado para su degradacin.Diversos estudios epidemiolgicos han confirmado que el exceso de colesterol de LDL con respecto a un valor crtico (1,9 g/l) debe ser considerado como factor de riesgo para el desarrollo de enfermedad cardaca coronaria, considerando que el efecto protector de las HDL slo parece tener relevancia dentro de cierto rango de concentraciones de colesterol circulante.Tales hallazgos permiten deducir que los valores aislados de colesterol de HDL o de LDL no pueden tomarse como ndices predictivos de riesgo, sino que es necesario conformar un perfil lipdico con los valores de colesterol total, colesterol de HDL y colesterol de LDL.

3. COMPETENCIAS.- Analiza la importancia del valor alto de las lipoprotenas LDL. Establece relaciones entre las dos fracciones HDL y LDL. Conoce, identifica y valora, los resultados para determinar las patologas relacionadas a la prueba.

4. MATERIALES.- Suero ( el paciente debe estar en ayunas de 12 a 16 horas).5. PROCEDIMIENTO.-En un tubo colocar: Muestra: 200 ul. Reactivo precipitante: 100 ul. Homogeneizar agitando (sin invertir) durante 20 seg. Y dejar 15 min en un BM entre 20-25 oC. Centrifugar 15 min a 3000 rpm. Separar inmediatamente el sobrenadante y usar para el ensayo colorimtrico. Tomar tres tubos:B (Blanco)S (Standard)P (Problema)

Sobrenadante---50 ul

Standard--10 ul

Reactivo enzimtico (ml)1 ml1ml1ml

Mezclar e Incubar 5 min. en BM a 37C.Retira del bao y dejar enfriar . Leer en espectrofotmetro a 505 nm , llevando a cero con el blanco.

6-CALCULOS DE LOS RESULTADOS.- LDL Colesterol ( g/l) = Colesterol total - D x F

7. VALORES DE REFERENCIA:Riesgo bajo o nulo LDL colesterol menores de 1,29 g/lRiesgo elevado a moderado 1,30 y 1,89 g/lRiesgo muy elevado 1,90g/l.

8.- cuestionario

segn su criterio cual de las lipoproteinas es ideal que se encuentre en concentraciones altas y porque?el LDL es considerado como colesterol bueno o malo por que?Cules son las condiciones pre analticas para la determinacin de LDL colesterol?

PRACTICA N 10DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS1.- FUNDAMENTOS DEL METODOEl esquema de reaccin es el siguiente: lipoprotein lipasatriglicridos > glicerol + cidos grasos glicerol kinasaglicerol + ATP > glicerol-1-P + ADP GPOglicerol-1-fosfato + O2 .> H2O2 + dihidroxiacetonafosfatoPOD2 H2O2 + 4-AF + clorofenol ..> quinonimina roja

2. SIGNIFICACION CLINICA.- Los triglicridos son lpidos absorbidos en la dieta y tambin producidos en forma endgena a partir de los carbohidratos, es el principal tipo de grasa transportado por el organismo. Su medicin es importante en el diagnstico y manejo de las dislipidemias y en el contexto de una actitud preventiva de lesiones ateroesclerticas (Schreier y col., 2001) y por tanto de posibles eventos isqumicos (Immanuel et al, 2006). Estas enfermedades pueden tener origen gentico o ser secundarias a otras tales como nefrosis, diabetes mellitus y disfunciones endcrinas. El aumento de triglicridos se ha identificado como un factor de riesgo en enfermedades aterosclerticas. Luego de comer, el organismo digiere las grasas de los alimentos y libera triglicridos a la sangre. Estos son transportados a todo el organismo para dar energa o para ser almacenados como grasa. El hgado tambin produce triglicridos y cambia algunos a colesterol. El hgado puede cambiar cualquier fuente de exceso de caloras en triglicridos.Los niveles de triglicridos varan con la edad, y tambin dependen de qu tan reciente ingiri alimentos antes del examen. La medicin es ms precisa si no se ha comido en las 12 horas previas al examen. El valor normal es de 150 mg/dl. Para quienes sufren problemas cardiacos, los niveles de esta sustancia deben ser inferiores a los 100 mg./dl.Si el colesterol tiene un valor normal, un nivel elevado de triglicridos no parece ser un factor de riesgo de enfermedad cardiaca, pero s puede ser riesgoso al asociarse con diabetes y pancreatitis.

3. CAPACIDADES.- Estudia la funcin de los triglicridos. Conoce que enfermedades estn asociados a niveles altos de triglicridos. Aprende como estn asociados los triglicridos con el colesterol.

4. Materiales.- Suero o plasma (previo ayuno de 12 a 14 horas).

REACTIVOS PROVISTOS:Enzimas: Viales conteniendo lipoprotein lipasa, glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa GPO, peroxidasa POD ,ATP y 4 aminofenazona,4-AF.

5. PROCEDIMIENTO.- B (Blanco)S (Standard)P (Problema)

Muestra ml----10 ul

Standard ml--10 ul--

Reactivo enzimtico (ml)1 ml1 ml1 ml

Mezclar e incubar 5 minutos a 37C o 20 minutos a TA ( 18-25 C).Enfriar y leer en el espectrofotmetro a 505 nm, llevando el aparato a cero con agua destilada.

.

6.- Resultados y calculosTG g/l = D x F Factor = 360 g/l.Triglicridos (g/l) = Factor x Absorbancia problema.

7. VALORES DE REFERENCIA.- Deseable 1,50 g/l o 150 mg/dlModeramente elevado a elevado: 1,50-1,99 g/lElevado; 2,00 4,99 g/l Muy elevado: 5,00 g/l o 500 mg/dl.

CUESTIONARIO Indique la importancia de los triglicridos?En qu alimentos se encuentra mayor concentracin de triglicridos?Explique el fundamento del mtodo?explicar cmo se calcula el factor?

PRACTICA N 11PRUEBAS FUNCIONALES RENALES O PERFIL RENAL DETERMINACION DE UREMIA.1.- FUNDAMENTOS DEL METODOLa ureasa descompone especficamente a la urea produciendo dixido de carbono y amonaco; ste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimtricamente.

2.- SIGNIFICADO CLINICO.- La urea CO(NH2)2 es uno de los constituyentes nitrogenados no proteicos (NNP) ms abundantes en el cuerpo ( lquidos biolgicos). Los dems son la creatinina, el cido rico, el amonio y los aminocidos. En otros tiempos todos eran medidos juntos (prueba del NNP), pero debido a que el anlisis de cada componente por separado es bastante sencillo y proporciona datos ms precisos, las pruebas individuales han sustituido al global casi por completo. La urea es el principal producto nitrogenado de desecho del metabolismo de las protenas y slo se sintetiza en el hgado, a partir de la destruccin de las protenas, durante la digestin las protenas son separadas en aminocidos, estos contienen nitrgeno que se libera como in amonio, y el resto de la molcula se utiliza para generar energa en las clulas y tejidos. El ion amonio se une a pequeas molculas para producir urea, la cual aparece en la sangre y es eliminada por la orina. Su concentracin es igual en todos los lquidos corporales, con excepcin de la sangre entera debido a la diferencia de valores que existe entre el suero y los eritrocitos. Por lo tanto, se prefiere el suero o plasma a la sangre entera para analizar el nitrgeno de urea. Las determinaciones de urea y creatinina en suero son dos de los estudios ms solicitados para detecta la capacidad del rin para excretar desechos metablicos. La elevacin de estos valores se emplea, junto con otros, como indicador de la necesidad de dilisis en pacientes con insuficiencia renal crnica. La interpretacin de los valores del nitrgeno de urea exige el conocimiento de la ingestin de protena exgena y de lquidos, y las condiciones que pueden incrementar la produccin endgena (por ejemplo: la actividad muscular, un traumatismo, la infeccin de una dieta muy restringida, el ayuno o la inanicin). Cualquiera de estas variables puede aumentar la concentracin sangunea o urinaria que en s mismo no es un reflejo real de la depuracin renal de urea. Pueden usarse dos pruebas, con las debidas precauciones e la interpretacin, como indicadores aproximados de mejora o deterioro de la funcin renal del individuo. Aunque las determinaciones de urea es mucho menos especfica que de la creatinina srica, es de uso comn, particularmente en pediatra, como una prueba de rutina para la funcin renal y para conocer algo sobre el estado de hidratacin del individuo. Grados menores de disfuncin renal requieren anlisis ms sofisticados como las pruebas de depuracin. En general es un parmetro que indica la disfuncin renal si existe una concentracin srica de urea, los valores sricos de urea se encuentran ntimamente relacionados con la dieta y el metabolismo proteico por lo que cualquier alteracin en estas variantes se traducir en un cambio de la concentracin de urea en el suero.

3.- COMPETENCIAS.- Aprende los valores normales de uremia y las variaciones que sirven para el diagnstico de las enfermedades renales y hepticas. Interpreta los resultados de esta prueba de laboratorio para el adecuado diagnostico evaluacin de tratamiento y pronostico del paciente portador de estas patologas. Aprender a explicar al paciente las razones para los exmenes que se le practican y guardara la confidencialidad de los resultados.

UREA

Puede aparecer la urea disminuida en:

Dieta pobre en protenas Insuficiencia heptica

Exceso de hidratacin. Malnutricin

4. Materiales.- Suero problema. Reactivos: Reactivo liquido para la determinacin enzimtico de urea (uremia mtodo enzimtico). R-1; reactivo desecado conteniendo fenol y nitroferricianuro de sodio. R-2; reactivo concentrado de hipoclorito de sodio e hidrxido de sodio. Standard: solucin de urea 0,60 g/l. Nota: 1 gota tiene aproximadamente 50 ul.

5. Tcnicas: Seguir el siguiente cuadro:B (Blanco)S (Standard)P (Problema)

Muestra ml----10ul

Standard ml--10ul--

Ureasa 25 ul 25 ul25 ul

Mezclar por agitacin suave y esperar 5 minutos a 37 C. Luego agregar.

Reactivo 10,5ml0,5ml0,5ml

Reactivo 20,5ml0,5ml0,5ml

Mezclar por agitacin suave e incubar 5 min a 37

Agua destilada5ml5ml5ml

Mezclar por inversin y retirar del BM. Despus de 10 minutos leer las absorbancias en el espectrofotmetro a 540nm llevando a cero con el blanco de reactivo.

6. Resultados y calculos.-

Urea (g/l) = Factor ( 252) x Absorbancia problema.

7. VALORES DE REFERENCIA: 0.20 a 0.45 g/l. 20 - 45 mg/dl.

CUESTIONARIOEn qu patologas esta elevado la urea explique?Explique el fundamento de la uremia?En qu casos se encuentra urea disminuida?Se podr trabajar en suero y en plasma o existe alguna diferencia explique?

PRACTICA N 12DETERMINACION DE ACIDO URICO.1.- FUNDAMENTOS DEL METODOEl esquema reaccional es el siguiente: UODcido rico + 2 H2O + O2 .> alantona + H2O2 + CO2 PODH2O2 + 4-AF + clorofenol .> quinona coloreada + H2O

2.- SIGNIFICACION CLINICAEl cido rico es un metabolito de las purinas, cidos nucleicos y nucleoprotenas. Habitualmente la concentracin de cido rico en suero vara de un individuo a otro de acuerdo a diversos factores tales como: sexo, dieta, origen tnico, constitucin gentica, embarazo.Niveles anormales de cido rico en suero son ndice de desorden en el metabolismo de las sustancias que lo originan o de defectos en su eliminacin.

3.-COMPETENCIAS.- Aprender la importancia de una buena alimentacin. Analizara la relacin directa de la ingesta de protenas con patologas propias de su metabolismo. Conoce, Identificara las complicaciones que produce el exceso de acido rico en la sangre. Analiza el ciclo del acido rico.

4.-Materiales y mtodos Material biolgico: Suero problema. Reactivos: Reactivo liquido para la determinacin enzimtico de Acido rico (uricostat enzimtico).Tcnicas; B (Blanco)S (Standard)P (Problema)

Standard--50 ul

Muesta--50 ul

Reactivo enzimtico (ml)2.5 ml2.5ml2.5 ml

Mezclar e incubar 15 minutos a 37C, o a TA por 30 min. Retirar enfriar y leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco de reactivo a 505 nm. El color resultante es estable por a lo menos 30 minutos.

5. Resultados y calculos.Acido rico (mg/l) = D x F ( 45 )

6. VALORES DE REFERENCIA:Varones 25 a 60 mg/l. 2,5 6 mg/dlMujeres 20 a 50mg/l 2 6 mg/dl

CUESTIONARIOCul es significado clnico de la determinacin de cido rico?Cules son las condiciones para la toma de muestra para cido rico?En qu situaciones se incrementa el cido rico?En qu enfermedades menos frecuentes se producen aumento de cido rico? Cules son los alimentos prohibidos cuando tenemos el cido rico alto?

PRACTICA N 13 DETERMINACION DE CREATININA.1.- FUNDAMENTOS DEL METODOLa creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa desproteinizacin con cido pcrico, obtenindose un cromgeno que se mide a 510 nm.

2. SIGNIFICACION CLINICA.- La creatinina (anhdrido de la creatina) es un compuesto orgnico de desecho, generado a partir de la degradacin de la creatina (que es un nutriente til para los msculos). Es producida por el cuerpo en una tasa muy constante (dependiendo de la masa y funcin muscular) normalmente filtrada por los riones y excretada en la orina.La creatinina es excretada del cuerpo completamente por los riones y con una funcin excretora renal normal, el nivel de creatinina srica debe mantenerse constante y normal.Su determinacin se utiliza para evaluar la funcin renal, que cuando est anormal, muestra aumento en los niveles de creatinina en la sangre, debido a la disminucin en su excrecin por la orina. Los niveles de creatinina tambin pueden variar de acuerdo con la talla y masa muscular de la persona. Algunos medicamentos y otras sustancias pueden producir toxicidad renal y aumentar los niveles sricos de creatinina, entre los cuales merece destacar: aminoglicsidos (por ejemplo, gentamicina), cimetidina, agentes quimioteraputicos como el Cisplatino, los cuales deben ser administrados bajo estricta vigilancia mdica.

3. COMPETENCIAS.- Aprende a identificar la funcin de la creatina fosfato e identificar el producto final de la degradacin de este. Conoce la funcin importante del rin en la eliminacin de este metabolito. Comprende que su medicin es til en el diagnostico de diversas nefropatas. Entiende que su control permanente es de gran utilidad en pacientes que requieren dilisis. Conoce algunos medicamentos que producen toxicidad renal y aumentar los niveles de creatinina. Analiza la importancia de los valores altos de la creatinina en sangre.

4. Materiales y mtodos Material biolgico: Suero u orina Se obtiene suero de la manera usual. Puede emplearse tambin orina de 2 o de 24 horas, su recoleccin en recipiente limpio mantenido en refrigerador ( 2 10 oC) durante el tiempo de recoleccin.

5. Procedimiento.- En caso de que la muestra a utilizar sea suero, debe efectuarse una DESPROTEINIZACIN:En un tubo de ensayo se verter: 07 ml o lo que es su equivalente 700 ul de suero, se utilizara la mitad; (350 ul), agregar 3,5 ml de R. N 1, la mitad es 1,75 ml R-1.Mezclar por inversin. Dejar reposar 10 min. y centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 min. Suero + cido Pcrico Suero desproteinizadoREACTIVOS:R # 1 ; acido pcrico 41,4 mmol/lR # 2 ; buffer glicina/NaOH 1 mol / ph final 12,4S. solucin de creatina 20 mg/l. Seguir el siguiente cuadro:BSDsDo

Desproteinizado 1,5ml (sobrenadante)

Standard 0,25 ml

Orina diluida ( 1:50) 0,25 ml

Agua destilada 0,5ml 0,25 ml 0,25 ml

Reactivo 1 1 ml 1 ml 1 ml

Reactivo 2 0,25 ml 0,25 ml 0,25 ml 0,25 ml

Mezclar por inversin. Incubar 20 minutos a TA.Leer en espectrofotmetro a 510 nm, llevando el aparato a cero con agua destilada. (Estable 10 min).

6. Resultados y calculos.Creatinina en suero (mg/l) = Factor (8,8 ) x Absorbancia problema. F=20mg/l 7. VALORES DE REFERENCIA:Suero: 8 a 14 mg/l. o 0,8 a 1,4 mg/dlOrina: 0,9 a 1,5 g/24 horas.

CUESTIONARIODefina la importancia de la creatinina?Cundo una persona necesita de hemodilisis?Cules son las caractersticas observables en un paciente con nefropata? Indique algunos medicamentos que producen dao renal? indique cuales son los valores normales de creatinina y por que existe incremento en dao muscular?

PRACTICA N 14PRUEBAS FUNCIONALES HEPATICAS O PERFIL HEPATICODETERMINACION DE BILIRRUBINA.1.- FUNDAMENTOS DEL METODOLa bilirrubina reacciona especficamente con el cido sulfanlico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimtricamente a 530 nm.Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso (Reactivo A) que posibilite su reaccin. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafena al medio dereaccin.

2.- SIGNIFICACION CLINICALa bilirrubina, compuesto de degradacin de la hemoglobina, es captada por el hgado para su conjugacin y excrecin en la bilis. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias.La eritroblastosis fetal o anemia hemoltica del recin nacido es una patologa provocada por incompatibilidad materno-fetal en la que se produce una destruccin excesiva de glbulos rojos. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina srica con el consecuente riesgo de difusin del pigmento al sistema nervioso central, por lo que la determinacin de la bilirrubina en estos nios recin nacidos resulta sumamente importante.

3.- COMPETENCIAS: Aprende que la bilirrubina es el producto de la degradacin de la hemoglobina. Busca e investiga fuentes de informacin. Aprende las manifestaciones clnicas de la hiperbilirrubinemia. Aprende a evaluar la funcin del hgado.

4. MATERIALES.- Suero, plasma, o lquido amnitico. Reactivos.- Desarrollador: sol acuosa de benzoato de cafena. R. sulfanilico: sol de acido sulfanilico y acido clorhdrico. Diazoreactivo = NaNO2 (nitrato de sodio) + cido Sulfanlico

Seguir el siguiente cuadro:B (Blanco)D (Directa)T (Total)

Muestra ( suero)0 200ul200ul200ul

Agua destilada (ml)2.5 ml2.5 ml--

Desarrollador----2,5ml

Reactivo Sulfanilico200ul

Diazoreactivo200ul200ul

Mezclar cada tubo por inversin. Luego de 5 min leer en el espectrofotmetro a 530nm, bilirrubina total es estable por 15 minutos la bilirrubina directa se mide a los 5 minutos exactos.

5. VALORES DE REFERENCIA.- En adultos:Directa: Hasta 2mg/l.Total: Hasta 10mg/l Recin Nacidos. Hasta las 24 horas 60mg/l. Hasta el 3er o 4to da: 120 mg/l6. VALORES AUMENTADOS: En la bilirrubina indirecta .

Anemia hemoltica

Eritroblastosis fetal

Ictericia fisiolgica del recin nacido

Problemas en las transfusiones de sangre Enfermedad de Gilbert Otras anemias

Los niveles aumentados de bilirrubina total pueden indicar:

Cirrosis

Hepatitis

Obstruccin de va biliar (colangitis, colelitiasis)

Tumores de vas biliares

Deficiencia enzimtica

Ictericia7- Resultados y clculos.Bilirrubina Total (mg/l) = (T B) x f ( 20 )Bilirrubina Directa = (D-B) x f ( 20 )

CUESTIONARIO Indique la importancia de la bilirrubina en recin nacidos?Explique el fundamento de la determinacin de bilirrubinas?Diga ud las diferencias entre bilirrubina directa y la indirecta?En qu patologas encontramos valores elevados de bilirrubinas?

PRACTICA N 15 DETERMINACION DE TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA TGP.DETERMINACION DE TRANSAMINASA GLUTAMICO OXALACETICA TGO.

1.- FUNDAMENTOS DEL METODOLa GOT cataliza la siguiente reaccin:

GOTL aspartato+ alfa cetoglutarato Glutamato+ Oxalacetato

TGPL alanina+ alfa cetoglutarato Glutamato+ Piruvato

El piruvato formado (el oxalacetato es inestable y se transforma en piruvato), reacciona con la 2,4-dinitrofenilhidracina producindose, en medio alcalino, un compuesto coloreado que se mide a 505 nm.

Reaccin qumica de coloracin Oxalacetato Piruvato+ 2,4 dinitrofenilhidrazina Hidrazona

2.- SIGNIFICACION CLINICALas transaminasas GOT y GPT son enzimas ampliamente difundidas en el organismo con elevada concentracin en corazn, hgado, msculo esqueltico, rin y eritrocitos.La actividad srica en condiciones normales es baja o nula.Un dao o enfermedad en cualquiera de estos tejidos conduce a un aumento en los niveles sricos. As, luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad de GOT (abundante en msculo cardaco).En hepatitis virales y otras formas de enfermedad heptica que involucren necrosis tisular, predominar la actividad srica de GPT (abundante en tejido heptico).Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse tambin en traumas accidentales o quirrgicos y en distrofias musculares o miositis.

3. competencias.- Conoce la existencia de enzimas en rganos especficos cuya funcin son especficas. Aplica las recomendaciones para la toma de muestra en la determinacin de esta prueba. Expone cuando se produce un aumento de transaminasas en la sangre. 4. CAUSAS DE AUMENTO DE LA TGO y TGP.- La TGO y la TGP son importantes en la clnica y su aumento se debe a un proceso necrtico en rganos con alta funcionalidad como lo es el hgado y el miocardio. En lesiones hepticas aumentan ambas transaminasas en el suero; cuando sobreviene la mejora clnica ambas descienden en forma paralela, y si aparece una recada, las dos suben nuevamente. Sus modificaciones son muy precoces y se puede hacer el diagnstico de la hepatitis hasta 3 semanas antes de la aparicin de los sntomas y signos clnicos.Las transaminasas tambin se elevan en casos de cirrosis e ictericia por obstruccin; en las ictericias por lesin hepatocelular, su elevacin es muy marcada, coincidiendo con una elevacin muy baja o nula de fosfatasa alcalina, mientras en las obstrucciones las transaminasas suben de modo discreto y la fosfatasa alcalina se encuentra elevada.El tejido miocrdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaa a los procesos destructivos del corazn; sube al mximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 7 das. El ascenso es, en general, proporcional a la extensin del infarto; a veces da datos positivos en casos con datos electrocardiogrficos de difcil interpretacin, pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros, sobre todo en la congestin heptica.Razn por las que se les llama de "escape". Estas enzimas siempre estn presentes en el suero pero en concentraciones muy bajas, por lo tanto su elevacin nos indicara que hay un proceso anormal en estos rganos, lo cual las hace muy tiles en los diagnsticos.

5. Materiales.- Suero problema.B TGOB TGPP TGOP TGP

Sustrato TGO0,5 ml0,5 ml

Sustrato TGP0,5ml0,5 ml

Muestra (Suero)100 l100 l

Agua destilada100 ul100 ul

Mezclar por agitacin suave e incubar a 37C durante 30 minutos.

Reactivo de Color 2,4-DHNF0,5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml

Incubar por 10 minutos 37 oC.

Diluyente para enzima NaOH 1N5 ml5 ml5 ml 5 ml

Mezclar por inversin y retirar del bao. Despus de 2 min leer la absorvancia en espectrofotmetro a 505 nm.Llevando el aparato a cero con los blancos respectivamente.

6. Resultados y calculos.Realizar el clculo grficamente segn curva patrn anexado para reactivo de Wiener Lab.7. VALORES DE REFERENCIA.-.Se consideran valores normales de transaminasas ( GOT y GPT ) hasta 12 U/L.CUESTIONARIO. Indique el fundamento de la reaccin?Por qu en problemas cardiacos existe elevacin de la TGO?Cul de las transaminasas se eleva en dao heptico y por qu?Se puede utilizar plasma fresco para su determinacin y por que?

PRACTICA N 16 DETERMINACION DE FOSFATASA ALCALINA.1.- FUNDAMENTOS DEL METODOLa fosfatasa alcalina desdobla al fenilfosfato de sodio en medio alcalino tamponado con aminometil propanol (AMP). El fenol liberado se determina por reaccin con 4-amino-antipirina y ferricianuro como agente oxidante. El color desarrollado es directamente proporcional a la actividad enzimtica y se mide a 520 nm.

2.- SIGNIFICACION CLINICALa fosfatasa alcalina es una enzima ampliamente distribuida en el organismo. Hidroliza los monosteres del cido ortofosfrico en medio alcalino.En el adulto proviene en parte del hgado (fraccin termoestable) y en parte del hueso, sistema reticuloendotelial y vascular (fraccin termolbil), dando lugar a distintas isoenzimas.La actividad srica de fosfatasa alcalina sea, en condiciones normales, alcanza su mayor actividad en los nios en edad de crecimiento (llegando a triplicar los niveles del adulto) debido a que esta isoenzima se localiza en los osteoblastos (relacionados con la calcificacin y formacin de estructuras seas). Tambin es fisiolgico el aumento que se produce al final del primer trimestre del embarazo, a expensas de laisoenzima placentaria que en este perodo alcanza niveles mximos (aproximadamente el doble de los valores normales).Entre las patologas que afectan la actividad srica de fosfatasa alcalina, se pueden citar: carcinomas metastsicos en hgado y en hueso (productores de enzima), colestasis biliar, fenmenos osteoblsticos, trastornos de malabsorcin acompaados de lesiones ulcerosas (donde la deficiencia de vitamina D produce osteomalacia con el consecuente aumento de fosfatasa alcalina sea) e incluso lesiones en vas de reparacin tales como infarto agudo de miocardio, infarto pulmonar o renal

3.- COMPETENCIAS.- Conoce las principales enfermedades que producen variaciones significativas en los parmetros bioqumicos de Fosfatasa alcalina. Entiende que tanto el aumento como la disminucin de estas enzimas tiene significado clnico.

4. Muestra.- Suero problema.BSP

Sustrato 0.5 ml0.5ml0,5ml

Pre Incubar a 37C durante algunos minutos, luego agregar.

Suero50l

Standart50l

Mezclar e Incubar por 10 minutos con cronometro

Reactivo de Color.2,5 ml2,5 ml 2,5 ml

Mezclar de inmediato. Retirar los tubos del bao y leer en el espectrofotmetro a 520nm.

5. Resultados y calculos.

Realizar el clculo de Fosfatasa alcalina (UI/L).Fosfatasa alcalina = Factor x Absorbancia Problema. 200 UI/LDonde Factor = F= ----------------------------------------Absorbancia standard

6. NIVELES ELEVADOS DE FOSFATASA ALCALINA PUEDE INDICAR: Alcoholismo Anemia Cncer de hueso, prstata Curacin de fracturas seas Hepatitis Colestasis ( obstruccin de va biliar) Enfermedades de hueso, hgado, riones.

7.NIVELES BAJOS DE FOSFATASA ALCALINA Ingesta insuficiente de protenas Malnutricin

8. VALORES DE REFERENCIA:Fosfatasa alcalina: Adultos: 68-240 UI/L Nios: 100 400 UI/LNOTA: Debido al proceso osteoblastico, la isoenzima sea se encuentra aumentada en la niez y adolescencia hasta los 18 aos, proporcionando valores de fosfatasa alcalina elevados habindose observado valores de hasta 700 UI/L sin patologa que justificara un origen extra seo.

CUESTIONARIOPor qu la fosfatasa alcalina forma parte del perfil heptico?Por qu los niveles de fosfatasa son elevados en nios?el consumo excesivo de lpidos alterara la fosfatasa por qu?En que patologas se eleva la fosfatasa y en qu disminuye? explique el fundamento de la determinacin de fosfatasa alcalina?

PRACTICA N 17 DETERMINACION DE LOS NIVELES DE CALCIO.

1.- FUNDAMENTOS DEL METODOEl calcio reacciona con la cresolftalen complexona (cfx) a pH 11, dando un complejo de adicin color magenta que se mide fotocolorimtricamente a 570 nm.

2.- SIGNIFICACION CLINICAEl calcio es esencial en la mayora de las reacciones de la coagulacin sangunea y en la regulacin de la excitabilidad de las fibras musculares. Su concentracin en suero y orina est regulada por la accin de factores tales como niveles de parathormona, vitamina D y fsforo, observndose fluctuaciones fisiolgicas debidas a edad, sexo, embarazo, actividad fsica, cambios estacionales (por accin de la luz solar).La hipercalcemia est relacionada con distintas patologas: hiperparatiroidismo, neoplasias seas, intoxicaciones con vitamina D. La hipocalcemia se asocia con desrdenes tales como hipoparatiroidismo, deficiencia de vitamina D, malabsorcin.3.- COMPETENCIAS.- Valora la importancia de una buena alimentacin a base de lcteos y derivados Experimenta en el laboratorio los resultados del anlisis de calcio en sangre. Expresa sus vivencias y emociones relacionadas al tema. Asume sus responsabilidades en la educacin nutricional.

4. Materiales.- Suero problema.5.PROCEDIMIENTO.-se aconseja trabajar directamente en los tubos de fotocolormetro.SP

Reactivo Cfx25l25l

Buffer1,75ml1,75ml

Mezclar con la varilla y leer la absorbancia de ambos tubos (blancos internos de BS y BP) en el espectrofotometro a 570nm llevando el equipo a cero con agua destilada.Agregar:

Standard10l

Muestra10l

Mezclar e Incubar por 10 minutos a TA volver a leer el Standard y el Problema

5. Resultados y calculos.Realizar el clculo de Calcio en suero.Corregir los valores quitando del Blanco del Stardard y el blanco del suero.Calcio en suero = Factor ( 33 ) x Absorbancia Problema. 6. VALORES DE REFERENCIA:Calcio Srico: 8.5 a 10.5 mg/dl.Los niveles aumentados de Calcio en la sangre pueden indicar:

Hiperparatiroidismo Acromegalia Enfermedad de Paget Hiperparatirodismo Hipertiroidismo Metstasis seas Mieloma mltiple Insuficiencia adrenal Aumento de la ingesta de Calcio enfermedades renales Fracturas mltiples Ingestin excesiva de carbonato de calcio. Tumores paratiroideos; reposo en cama prolongado.Los niveles disminuidos de Calcio en la sangre pueden indica

CUESTIONARIO. Por qu es importante la determinacin de calcio?En nios existe elevacin o disminucin por qu?Explique el fundamento de la tcnica?Mencione algunos interferentes en la muestra y si es posible determinar calcio en orina?

NOTA. Se adicionara posteriormente prcticas relacionadas al cur