UNIVERSIDAD DEL BIO BIO FACULTAD DE CIENCIAS

DEPTO. DE CIENCIAS BASICAS

BIOQUMICA GENERAL

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS INGENIERIA EN RECURSOS NATURALES

2012

INTRODUCCION

La historia del desarrollo del hombre est plena de logros que son notables en diferentes reas, tanto de la ciencia, tecnologa, arte, entre otras. En este contexto, estn los hallazgos que tienen relacin con la interrogante acerca del funcionamiento de un organismo en trminos de las molculas que la componen, el centro de esta interrogante es la Bioqumica.

Qu es bioqumica? una pregunta simple, pero difcil de responder en trminos sencillos ya que es muy diversa en su enfoque y prctica. Bsicamente el trmino bioqumica significa estudio de la qumica de la vida, esta es una definicin en apariencia sencilla que oculta la profundidad de su significado En bioqumica se estudian una gran variedad de temas que pueden referirse a organismos multicelulares como unicelulares, a sistemas celulares completos o fraccionados, o bien referirse a agregados moleculares como a molculas aisladas, es decir, la bioqumica est relacionada con cualquier fenmeno que se produzca en un organismo. Ya que las cualidades de un ser viviente, sus actividades, su desarrollo, son el resultado de las interacciones que se establecen entre sus constituyentes. De lo que expresado se ve que no es fcil dar una definicin clara y concisa de lo que es bioqumica. En todo caso se debe tener presente que: su tema de estudio es todo fenmeno biolgico, a nivel celular, subcelular o molecular y que trata de responder a una pregunta que ha hechizado a la humanidad a travs de los tiempos Qu es la vida? En otro aspecto, es importante mencionar adems que la bioqumica es fundamentalmente una ciencia de laboratorio, debido a ello, es indispensable que en toda asignatura en que se estudien aspectos de la bioqumica se desarrollen actividades prcticas en paralelo con las actividades tericas. El propsito de los trabajos de laboratorio es familiarizar al alumno con situaciones experimentales que deben abordarse con metodologa cientfica. Entre sus objetivos se pueden mencionar los siguientes: 1.- Ejercitar al alumno en el mtodo cientfico, por medio de tcnicas generales. 2.- Desarrollar destreza en el manejo del material de laboratorio. 3.- Acrecentar habilidad para realizar mediciones y observaciones. 4. Desarrollar capacidad para expresar resultados y conclusiones.

5.- Procurar el desarrollo de iniciativa personal frente a problemas que se planteen 6.- Dar impulso a las actitudes de orden y cooperacin que permitan al alumno, la planificacin de sus actividades y la capacidad de trabajar en equipo. 7.- Promover en el alumno una actitud crtica permanente que le permita analizar sus propias experiencias. Por la naturaleza del curso y para poder cumplir con sus objetivos, es necesario que el alumno llegue al laboratorio con cierta informacin, necesaria para realizar satisfactoriamente el trabajo prctico.

TRABAJO PRACTICO N 1

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS

Las protenas son compuestos orgnicos de elevado peso molecular. Ej.: insulina bovina PM= 5733, seroalbmina humana PM=68500. Las composicin elemental de la mayora de las protenas es muy parecida, los porcentajes aproximados son: C = 50 55; H = 6 8; O = 20 23; N = 15 - 18 y S = 0 - 4. Las protenas estn constituidas por un nmero variable de molculas ms pequeas llamadas aminocidos. Los aminocidos son cidos carboxlicos en que uno de sus hidrgenos ha sido reemplazado por un grupo amino, su frmula general es: R NH2 CH COOH Desde las protenas se aslan alrededor de 20 aminocidos y todos

corresponden a aminocidos, que son aquellos en que el grupo amino

reemplaza a un hidrgeno perteneciente al carbono , es decir, el carbono adyacente al grupo carboxilo. Los aminocidos naturales pueden clasificarse en subclases de acuerdo con la naturaleza qumica (aliftica, aromtica, heterocclica) de sus grupos R. Tambin hay otra clasificacin que se basa en la polaridad del grupo R, en este caso los veinte aminocidos que por lo comn se obtienen de las protenas se clasifican de la manera siguiente:

1. Aminocidos con grupos R no polares o hidrofbicos Este grupo contiene aminocidos con residuos alifticos: alanina, valina, leucina, isoleucina y metionina. Tambin, aminocidos con residuos aromticos: fenilalanina y triptfano que son hidrofbicos. Adems, en este grupo est la prolina, cuyo tomo de nitrgeno aparece en forma de amina secundaria en vez de la amina primaria usual.

2. Aminocidos con grupos R polares pero sin carga elctrica. La mayora de estos aminocidos contienen residuos R polares. Algunos de ellos poseen un grupo hidroxlico: serina, treonina y tirosina o bien grupos sulfhidrilo: cistena. Se incluyen en este grupo a la glicina ya que, an cuando carece de grupo R, presenta una naturaleza polar, esto se debe a que los grupos amino y carboxilo cargados constituyen una gran parte de la masa de la molcula. Tambin se incluyen en esta divisin a los compuestos como: tirosina. (asparagina y glutamina).

3. Aminocidos con grupos R cargados positivamente Aqu se incluyen tres aminocidos; lisina, que posee un segundo grupo amino

en la posicin de la cadena aliftica; arginina, que tiene un grupo quanidinio cargado positivamente y la histina, que tiene la funcin imidazol, dbilmente bsica.

4. Aminocidos con grupos R cargados negativamente.

En esta divisin se incluye a los dos aminocidos dicarboxlicos: cido asprtico y cido glutmico. Los aminocidos pueden condensarse entre s, unindose por el carbono de su grupo carboxilo al nitrgeno del grupo amino de otro aminocido lo que se denomina enlace peptdico. R1 R2 R1 R2 NH3

+-CH-COO- + NH3+-CH-COO- NH3

+-CH-CO-NH-CH-COO-

+H2O Los pptidos se forman por uniones de aminocidos a travs de los enlaces peptdicos, segn el nmero de aminocidos que componen el pptido existen: dipptidos, tripptidos, etc. Si un pptido posee menos de 10 aminocidos se conoce como oligopptido; los que exceden de este tamao son polipptidos. Una unidad de aminocido en un pptido se denomina residuo Las cadenas peptdicas tienen direccin ya que sus extremos son diferentes amino terminal y carboxilo terminal. Por convencin, el inicio de cadena corresponde al extremo amino, de modo que la sucuencia de aminocidos se escribe comenzando con el residuo amino terminal. As por ejemplo en el tripptido: Ala Gly Trp (AGW), alanina es el residuo amino terminal y el triptfano es el residuo carboxilo terminal.

Las protenas estn constituidas por largas cadenas polipeptdicas, en donde los aminocidos estn ubicados en una determinada secuencia y esto corresponde a la estructura primaria de una protena. La estructura secundaria se refiere a la distribucin espacial de los residuos de aminocidos que constituyen la cadena polipeptdica. Algunas de estas relaciones estricas son de tipo regular, dando origen a una estructura

peridica, como es el caso de -hlice y estructura en hoja plegada. La estructura terciaria se refiere al modo como la cadena se curva para formar la estructura estrechamente plegada y compacta de las protenas glubulares, la estabilizacin de esta estructura se atribuye a las diferentes reactividades asociadas a los grupos R de los residuos de aminocidos tales como: interaccin electrosttica; enlaces de hidrgeno; interaccin hidrofbica; unin disulfuro. Las protenas que poseen ms de una cadena polipeptdica (cada cadena se denomina subunidad), presentan un nivel adicional de organizacin estructural que se denomina estructura cuaternaria que pone de manifiesto como se disponen en el espacio las cadenas polipeptdicas individuales. Ej.: la enzima fosforilasa contiene dos subunidades idnticas que por separado son catalticamente inactivas, pero que cuando se unen para formar un dmero, constituyen la enzima activa. Estudios ms recientemente de conformacin y funcin de protenas han revelado la importancia de niveles adicionales de organizacin como: la estructura super-secundaria que se refiere a agrupaciones de estructura secundaria, tales como la unidad alfa alfa, la unidad beta beta y la unidad beta alfa beta. Otro nivel adicional corresponde a los dominios que corresponde a regiones globulares compactas (2 o ms) unidas por segmentos flexibles de cadena polipeptdica.

Reacciones para el reconocimiento de aminocidos y protenas 1. Reaccin de la ninhidrina: Sirve para reconocer y valorar

cuantitativamente a los aminocidos. Los aminocidos reaccionan con la ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) formando un compuesto coloreado, que generalmente es azul - violeta, excepto con los aminocidos prolina e hidroxiprolina en que se obtiene una coloracin amarilla. El grupo amino de los aminocidos se oxida por accin de la ninhidrina formando amonaco ms dixido de carbono y el aldehido (se obtiene por prdida de un carbono del aminocido original).

O R C OH I NH2-CH-COOH + C C C OH

ninhidrina O oxidada O C OH R-CHO + NH3 + CO2 + C C H ninhidrina O reducida Luego un segundo equivalente de ninhidrina reacciona con la ninhidrina reducida y el amonaco, formndose un producto muy coloreado que tiene la siguiente estructura: O O c OH OH c c c +NH3 c OH H c O O O O C C C N = C C C

O O + 3 H2O La reaccin de la ninhidrina es positiva con todos los compuestos que contienen un grupo amino primario. La coloracin de la ninhidrina con las protenas es muy dbil, debido a la escasa presencia de NH2 libres, por lo cual se le considera negativa.

2. Reaccin del Biuret La prueba de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino) es positiva para todos los compuestos que contenga dos o ms uniones peptdicas. La coloracin prpura de una reaccin positiva se debe a un complejo de coordinacin entre el Cu2+ y cuatro tomos de nitrgeno provenientes de enlaces peptdicos. O = C H2O C = O NH NH R CH CH - R Cu2+ O = C C = O NH NH R CH H2O CH - R 3. Reaccin xantoproteica o reaccin del cido ntrico En esta reaccin se obtiene una coloracin amarilla (griego XANTHOS=amarillo). El ensayo es positivo para las protenas con aminocidos que llevan el anillo bencnico (aromtico) como tirosina, triptfano y fenilalanina. El color amarillo, se debe a la formacin de un compuesto aromtico nitrado. Esta reaccin explica la aparicin de una coloracin amarilla al caer gotas de cido ntrico sobre la piel. 4. Reaccin de Millon El reactivo de Millon es una mezcla de nitrato y nitrito mercrico, que se obtiene al disolver mercurio en cido ntrico. Al agregar el reactivo a una solucin de protena, sta precipita y al calentar, el precipitado toma una coloracin rojiza.

Este color desarrollado en la reaccin positiva se debe a los grupos fenlicos del aminocido tirosina. 5. Reaccin de Sakaguchi La argina presenta un grupo reactivo guanidino, por lo tanto, los mtodos qumicos de estimacin de las guanidinas se aplican a la determinacin de argina en forma libre o peptdica. La base de esta prueba es la reaccin colorimtrica que se produce entre

argina y -naftol. En general las sustancias que dan color en la reaccin de Sakaguchi tienen la siguiente frmula: NH-X En donde X es un cido graso o un radical C alquilo. HN NH2

. CH2-NH-C-NH2 I II CH2 NH aminocido arginina I CH2 I NH2-CH-COOH Aunque se ha dicho que las protenas dan positiva la reaccin debido al grupo guanidino libre de la arginina, la intensidad de esta coloracin es mucho menor del que cabra esperar basndose en su contenido en arginina. 6. Reaccin de los aminocidos azufrados El azufre de la cistena, cistina y metionina, puede ser mineralizado por calentamiento en medio alcalino. En estas condiciones se les reconoce agregando una sal de plomo con la que reacciona para formar PbS precipitado de color negro. R-SH + 2 NaOH ROH + Na2S Na2S + (CH3COO)2Pb 2CH3COONa + PbS

Parte Experimental

1. Identificacin de aminocidos con ninhidrina y su diferenciacin de protena.

Esquema de Trabajo:

Reactivos N Tubos

I II III IV V VI

Sol. de aminocidos (ml)

5

-

-

-

-

-

Sol. de prolina (ml) - 5 - - - -

Sol. de arginina (ml) - - 5 - - -

Sol. de tirosina (ml) - - - 5 - -

Sol. de protena (ml) - - - - 5 -

Agua destilada (ml) - - - - - 5

Ninhidrina (ml)

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Ponga los tubos en B.M. hirviendo por dos minutos y deje enfriar. Se desarrolla un color azul o azul violeta. Anote los resultados obtenidos, para las soluciones de aminocidos, protena y blanco. 2. Reaccin Xantoproteica Esquema de Trabajo

Reactivos

N Tubos

I II III

Sol. de protena (ml) 2 - -

Sol. de aa aromtico (ml) - 2 -

Agua destilada (ml) - - 2

Acido ntrico conc. (ml) 1 1 1

Agite los tubos Caliente los tubos suavemente hasta ebullicin en B.M. por 1minuto Anote los resultados obtenidos para cada tubo.

3. Reaccin de Biuret Esquema de Trabajo

Reactivos

N Tubos

I II III

Sol de aminocidos (ml) . 3 - -

Sol. de protenas (ml) - 3 -

Agua destilada (ml) - - 3

Reactivo de Biuret (ml) 1 1 1

Ponga los tubos a 37C por dos minutos Observe la coloracin 4. Reaccin de Millon Esquema de Trabajo

Reactivos N Tubos

I II III

Sol. de protena (ml) 2 - -

Sol. de aa aromtico (ml) - 2 -

Agua destilada (ml) - - 2

Reactivo de Millon (ml) 1 1 1

Calentar a B.M. hasta aparicin de color

5. Reaccin de Sakaguchi Esquema de Trabajo:

Reactivos

N Tubos

I II III IV

Sol. de aminocidos (ml) 3 - - -

Sol. de arginina (ml) - 3 - -

Sol. de protena (ml) - - 3 -

Agua destilada (ml) - - - 3

NaOH 5% (ml) 1 1 1 1

-naftol 1% (gotas) 2 2 2 2

Hipodromito de Sodio (gotas) 1 1 1 1

6. Reaccin de aminocidos azufrados Esquema de Trabajo

Reactivos N Tubos

I II

Cistena pta. esptula --

Agua destilada -- 2

Hidrxido de sodio 5% (ml) 2 2

Acetato de plomo 10% (ml) 1 1

Caliente suavemente hasta ebullicin 6. Identificacin de una muestra problema Con su muestra problema proceda a efectuar las reacciones que usted estime conveniente para lograr su identificacin. En el mismo laboratorio entregue el informe correspondiente. Modelo hoja informe: a) Nombre del prctico b) Nombre del alumno/s c) N de muestra d) Reaccin color resultado (+/-) e) Conclusiones

Cuestionario

1. Qu mtodos se utilizan para romper un enlace peptdico? 2. Qu significa que la unin peptdica o grupo amida CONH- sea coplanar? 3. Qu efecto tiene un agente oxidante como cido perfrmico sobre los

enlaces disulfuro de las cadenas polippticas de una protena? 4. Cules son los productos de la hidrlisis completa de una protena? Qu

reaccin qumica le permitir identificarlos? 5. Cul es el significado de una reaccin xantoproteica positiva para protena? 6. Cul es el nmero mnimo de aminocidos que necesita tener un pptido

para dar la reaccin de Biuret

TRABAJO PRACTICO N2

PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS

Las propiedades biolgicas de una protena, as como parte de sus propiedades fsico-qumicas, dependen de su estructura. Cuando estas estructuras se alteran o se destruyen, aunque no haya ruptura de las cadenas polipeptdicas, la protena pierde sus caractersticas funcionales y se alteran sus propiedades fsico-qumicas; este proceso se denomina desnaturalizacin. El trmino desnaturalizado tiene una variedad de significados, segn: la protena sea o no oligomrica, la prdida de la conformacin sea parcial o completa y la actividad biolgica se pierda o no. En algunos casos el proceso es reversible, se puede restaurar la conformacin nativa y la actividad biolgica. Los agentes desnaturalizantes actan esencialmente destruyendo los enlaces puente hidrgeno y las uniones disulfuro, lo que altera las estructuras secundarias y terciarias de las protenas. Los agentes desnaturalizantes ms comunes son cidos fuertes, bases fuertes, calor y agitacin mecnica. El aspecto ms visible en la desnaturalizacin es el descenso de la solubilidad proteica. Una protena desnaturalizada es atacada ms fcilmente por las enzimas proteolticas , lo que puede evidenciarse en su mayor digestibilidad (coccin de alimentos, batido de claras de huevos, accin del limn sobre la carne o huevos crudos). La prdida de la estructura primaria, es decir, ruptura de los enlaces peptdicos constituye la proteolisis y se puede obtener por accin de cidos o bases fuertes concentrados por tiempos prolongados y elevadas temperaturas (Ej.: hidrlisis cida: HCI 6N, 18 hrs,110C) (Ej.: hidrlisis bsica: NaOH 5N, 10hrs, 121C). Tambin puede lograrse con enzimas proteolticas (hidrlisis enzimtica) tales como: pepsina, tripsina y peptidasas en general que actan rpidamente a 37C. Por tales causas, los manejos de protenas se hacen a temperatura reducida para evitar la desnaturalizacin trmica, se emplean tampones para mantener el carcter poli-inico natural de la protena y se evita el trauma fsico como la agitacin o se mantiene al mnimo. Las investigaciones que tratan del aislamiento, purificacin y anlisis de las protenas, son verdaderamente representativas del arte del anlisis bioqumico.

Precipitacin por solventes orgnicos

La adicin de solventes orgnicos neutros miscibles con el agua, tales como: metanol, etanol o acetona, disminuye la solubilidad en agua de la mayor parte de las protenas globulares de tal manera que precipitan de la solucin. La solubilidad de una protena a un pH y fuerza inica determinados est en funcin de la constante dielctrica del medio. La constante dielctrica (D) esta definida por la relacin: e1 x e2 F = __________ Dr2 F = Fuerza de atraccin entre dos iones de carga opuesta e1 y e2 = Cargas de los iones r = Distancia entre los iones. El agua tiene constante dielctrica relativamente alta (D=80 a 20C) por lo cual en solucin acuosa disminuye la interaccin entre las molculas proteicas (debido a sus grupos cargados) mientras aumenta la interaccin entre protenas y el agua, esto favorece la solubilidad de las protenas. Los solventes orgnicos tales como metanol, etanol, acetona tienen constantes dielctricas bajas (32, 25 y 19 respectivamente a 20) de modo que al agregarlos a una solucin acuosa de protenas baja la constante dielctrica del medio, lo que favorece la interaccin de los grupos con carga elctrica de las protenas y por lo tanto su precipitacin. La precipitacin proteica por los solventes no solo se explica en funcin de la constante dielctrica, tambin hay que considerar la deshidratacin de las protenas. Las molculas del solvente no acuoso forman hidratos compitiendo

por el agua con las molculas proteicas. Los solventes pueden llegar a distorsionar la estructura de las protenas, posiblemente por accin a nivel de los enlaces hidrofbicos, determinando la desnaturalizacin de las protenas. Este fenmeno disminuye a bajas temperaturas ya que el calor por si mismo es un agente desnaturalizante. Cuando el procedimiento de precipitacin no altera sensiblemente la estructura de las protenas, stas se pueden recuperar como precipitado mediante filtracin o centrifugacin y luego redisolverse en un solvente adecuado, sin que pierdan sus propiedades.

Precipitacin de protenas por formacin de sales insolubles

Las protenas precipitan por la accin de ciertos cidos como el cido tricloroactico, cido tngstico, cido molbidico y otros; tambin las protenas pueden precipitar por la accin de ciertos iones de metales pesados como Hg, Zn, Cd, Fe, Cu y Pb. Todos estos agentes hacen precipitar las protenas porque forman con ellas sales insolubles.

El mecanismo de accin de estos agentes es el siguiente: los precipitantes cidos forman sales insolubles con las formas catinicas (+) de la protena , siendo necesario efectuar el proceso a un pH ms cido que el punto isoelctrico. A su vez los metales pesados forman sales insolubles con las formas aninicas de la protena necesitndose entonces un pH ms alcalino que el punto isoelctrico.

Efecto de la temperatura.

Dentro de un intervalo de temperatura entre 0C y 40C aumenta la solubilidad de las protenas con el aumento de temperatura. Por sobre 40C a 50C la mayor parte de las protenas son cada vez ms inestables y comienzan a desnaturalizarse, por lo comn con prdida de solubilidad. La desnaturalizacin puede conducir a la coagulacin de la protena, es decir, a su agregacin precipitacin irreversible. La coagulacin es un criterio para reconocer la desnaturalizacin de una protena. La formacin de un cogulo blanco, insoluble, cuando se hierve la clara de huevo es un ejemplo comn de desnaturalizacin trmica. Los fraccionamientos de protenas por lo general se realizan a 0C ya que la mayor parte de las protenas son estables a bajas temperaturas.

Punto isoelctrico de las protenas

Las molculas proteicas son polivalentes, es decir, llevan varias cargas en forma simultnea. Aparte de los grupos carboxilo (COO-) y amino terminales (NH3

+) la molcula proteica puede tener otras cargas positivas provenientes de aminocidos diaminados. Otras cargas negativas pueden provenir de aminocidos dicarboxlicos, aminocidos con grupos SH y aminocidos de carcter fenlico. Se denomina carga neta de la protena a la diferencia absoluta entre el nmero de cargas positivas y el nmero de cargas negativas. Una misma molcula proteica puede presentar cualquiera de los tres estados electrostticos (+, 0, -) dependiendo del pH del medio en el cual se encuentra disuelta. El pH al que una protena muestra un mnimo de solubilidad es su punto isoelctrico, definido como aquel valor de pH al que la molcula no posee carga elctrica ya que hay igualdad de cargas positivas y negativas y es incapaz de desplazarse en un campo elctrico. Cada protena y aminocido tiene un punto isoelctrico (pHi) caracterstico que depende del nmero de grupos ionizables y de sus constantes de disociacin. La menor solubilidad en el pHi se debe a que como la molcula no tiene carga elctrica, no existen repulsiones electrosttica entre molculas de protena vecinas lo cual conduce a la formacin de agregados insoluble. Puesto que las diferentes protenas poseen valores de pHi tambin diferentes, con frecuencia pueden separarse, una de otras, mediante precipitacin isoelctrica. La menor solubilidad de una protena en su punto isoelctrico puede ser utilizado como un mtodo conveniente para determinar este punto. Basndose en esta caracterstica se determinar en el prctico, el punto isoelctrico de la caseina. La casena ( proteina presente en la leche) a menudo se clasifica como una fosfoprotena, dado su alto contenido de fsforo, se trata de protenas conjugadas con grupos fosfato esterificados a residuos de serina. Representa alrededor del 80% del total de protenas de la leche. Esta casena est presente bajo la forma de una suspencin coloidal al estado de caseinato de calcio y potasio, el pH del medio es prximo a 6,6 de tal manera que para lograr su precipitacin se debe acidificar hasta llegar al punto isoelctrico. Todas las casenas se caracterizan por su baja solubilidad a pH = 4,6.

Electroforesis

Es un trmino que en general se refiere al movimiento de partculas cargadas (iones) en un campo elctrico. Esta tcnica es ampliamente utilizada en Bioqumica, para la separacin y caracterizacin de protenas, ADN y otras molculas con carga elctrica. Bajo la influencia de un campo elctrico, molculas con carga positiva migrarn hacia el ctodo (-), molculas con carga negativa migrarn hacia el nodo (+) y molculas sin carga no migrarn. La electroforesis ha sido muy valiosa en el aislamiento y separacin de protenas esto se debe a que los mtodos electrorticos se pueden realizar en condiciones muy suaves protegiendo a las protenas de cualquier modificacin estructural. En la actualidad han adquirido gran desarrollo las tcnicas electroforticas de zona en que las protenas se mueven a travs de un soporte uniforme del tipo de un gel, almidn, etc. En el gel la movilidad de las molculas est determinada por su carga, su peso molecular, tamao del poro del gel y por el campo elctrico. Geles de poliacrilamida son el medio de soporte de eleccin

para electroforesis porque son qumicamente inertes y se forman rpidamente por polimerizacin de la acrilamida. H O I II H2C= C - C - NH2 acrilamida

Adems el tamao de los poros puede controlarse utilizando diferentes concentraciones de acrilamida y metilenbisacrilamida. H O I II (CH2 = C - C - NH)2 - CH2 metilenbisacrilamina CONH2 CONH2 I I CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH- I CONH I CH2 Formacin de gel de poliacrilamida

CONH l CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-

CONH2 CONH2 Un tipo de electroforesis empleada para las protenas es la electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio (SDS page) . El dodecilsulfato de sodio (SDS) es un detergente que tiene una carga negativa por molcula y que al unirse a las protenas les confiere dicha carga, determinando que, al aplicar un campo elctrico stas migren al polo + La migracin de los derivados de protenaSDS hacia el nodo es inversamente proporcional al logaritmo de su PM.

Propiedades tampn de las protenas

El carcter de cido dbil de las protenas en presencia de sus bases conjugadas les permite funcionar como soluciones tampones, es decir, que pueden agregarse cantidades relativamente grandes de cido o de lcali sin que vare apreciablemente el pH. Esta propiedad es de gran importancia en los sistemas biolgicos, donde se ha visto que las protenas constituyen el principal sistema tampn. Por ejemplo, aproximadamente el 80% del poder amortiguador de la sangre de los mamferos se debe a las protenas.

PARTE EXPERIMENTAL 1. Accin de solventes orgnicos

Esquema de trabajo

Tubos 1 2 3

Solucin de albmina (mL) 2 2 2

Metanol (mL) 2 - -

Etanol (mL) - 2 -

Acetona (mL) - - 2

Observe y anote sus resultados.

2. Precipitacin por formacin de sales

Esquema de trabajo

Tubos 1 2 3 4

Solucin de albmina (mL) 3 1 1 1

TCA (cido Tricloroactico) (mL) 1 - - -

Hidrxido de sodio NaOH (gotas)

- 2 2 2

Hg2Cl2 (gotas) - 5 - -

AgNO3 (gotas) - - 5 -

Pb(NO3)2 (gotas) - - - 5

Observe lo que pasa en cada tubo.

3. Accin del calor sobre las protenas

En un tubo de ensayo colocar 5 mL de solucin de albmina y calentar con cuidado la parte superior hasta que hierva; comparar con la parte inferior.

4. Determinacin del punto isoelctrico de la casena

Una serie de tubos que contienen una cantidad estndar de solucin de protena se tratan con cantidades variables de cido actico. Los pH obtenidos en cada uno de los tubos aparecen en el esquema de trabajo.

El pH del tubo que tenga la mayor precipitacin se toma como punto isoelctrico.

Esquema de trabajo

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Agua destilada (mL) 6,8 5 5 5 5 5 5 5 5

cido actico 1M (mL) 3,2 - - - - - - - -

Sacar 5 mL de tubo anterior

- 5 5 5 5 5 5 5 5 descartar

Sol. de protena casena (mL)

1 1 1 1 1 1 1 1 1

pH de cada tubo 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6 5,9

NOTA a) La solucin de casena se debe agregar a cada tubo rpidamente y mezclar. b) Anotar el efecto inmediato que se produce en los diferentes tubos y el

que se observa despus de 15 minutos. Cuestionario

1. Utilizando la ecuacin de Henderson-Hasselbach: pH=pK + log sal

cido] Compruebe los valores de pH dados en el esquema de trabajo correspondiente a la determinacin del pHi de la casena (pKa=4,7 ac. actico) 2. Cul sera el mnimo de grupos disociables que se puede encontrar en una cadena polipeptdica lineal? 3. En un tetrapptico cuya secuencia es: glicil - glutamil aspartil leucina. Cuntos grupos disociables existen? 4. Algunas veces los aminocidos son utilizados como amortiguadores. Un amortiguador es una solucin que resiste los cambios de pH cuando se le agrega un cido o una base. El intervalo de pH en el cual es efectivo un amortiguador se denomina intervalo amortiguador, generalmente definido como pKa + 1 a pKa 1. a) Indique intervalo (s) amortiguador para Gly, Asp y Lys. b) Escoja un aminocido que sirva para amortiguar a pH = 4,0 y a pH = 9.0. 5. Por qu precipita la casena en su punto isoelctrico? Este

comportamiento es reversible? 6. Hay diferencia entre hidrlisis proteica y desnaturalizacin proteica? 7. Qu influencia tiene la constante dielctrica (D) sobre la atraccin de iones

con carga opuesta en una solucin?

TRABAJO PRACTICO N3

PROPIEDADES ACIDO-BASICAS DE LOS AMINOACIDOS

El conocimiento de las propiedades cido-bsicas de los aminocidos es de gran importancia en la comprensin y el anlisis de las propiedades de las protenas. En el estado slido y en solucin los aminocidos manifiestan dos propiedades fciles de observar y que proporcionan informacin acerca de su estructura. Los aminocidos, con ciertas excepciones, son solubles en agua y bastante insolubles en solventes orgnicos no polares. Esta observacin est en contradiccin con las propiedades conocidas de los cidos carboxlicos y de las aminas orgnicas. La otra propiedad fsica de los aminocidos que se relaciona con su estructura es su elevado punto de fusin, que con frecuencia determina su descomposicin. En cambio los puntos de fusin de los cidos carboxlicos y de las aminas por lo general son bajos. Las solubilidades y los puntos de fusin sugieren claramente que los aminocidos tienen grupos cargados y altamente polares. Estos y otros datos llevaron a la conclusin que los amincidos se encuentran y cristalizan a partir de las disoluciones acuosas neutras en forma de iones dipolares, llamados tambin iones hbridos en vez de hacerlo en forma de molculas no disociadas. R R I I NH+3 - C - COO

- NH+3 - C - COOH I I H H Forma dipolar Forma no disociada Cuando un ion hbrido cristalizado se disuelve en agua, puede actuar como cido o bien como base, es decir, se trata de sustancias anfteras. Todos los aminocidos tienen al menos un grupo cido (carboxilo) y un grupo bsico (amino), se trata entonces de anfolitos (electrolitos anfteros). Algunos aminocidos contienen adems otros grupos fcilmente ionizables, como por ejemplo: amino libre en la lisina, carboxilo libre en el cido asprtico, hidroxifenilo en la tirosina, sulfhidrilo en la cistena, guanidina en la arginina y el imidazol en la histidina. El comportamiento cido-bsico de los aminocidos corrientes puede explicarse en base a la teora de cidos y bases de Brnsted-Lowry (cido = dador H+) y (base = aceptor H+). Una reaccin cido-bsica comprende

siempre un par cido base conjugado, constituido por un dador de protones y el correspondiente aceptor. Ejemplo: CH3COOH CH3COO

- + H+ dador aceptor Cada cido posee una afinidad caracterstica para su protn. Los que tienen una afinidad elevada por el protn son cidos dbiles, por lo tanto, se disocian muy ligeramente, los cidos que muestran una pequea afinidad por el protn son cidos fuertes y los pierden con facilidad. La tendencia de cualquier cido a disociarse est dada por su constante de disociacin (Ka) Ej.: Para un cido HA: HA H+ + A- Ka = [ H+] [ A- ] [HA] pKa = -log10Ka Los cidos fuertes tienen bajos valores de pKa. Todos los aminocidos tienen al menos dos constantes de disociacin, una

para el grupo - carboxilo, (K1 o K - COOH). O O

- C - C + H+ OH O- (HA) (A-)

y otra para el grupo - amino (K2 o K - NH3+)

-NH3

+ -NH2 + H+

(HA) (A-) Adems algunos aminocidos tienen una cadena lateral ionizable con una tercera constante de disociacin. Ej.: el cido asprtico y el cido glutmico tiene un segundo grupo carboxilo y la lisina un grupo amino adicional.

Valores de pK para la disociacin de los grupos de algunos aminocidos (25C)

Aminocido pK - COOH pK - NH3+ pK R

Gly 2,3 9,6 Ala 2,3 9,7 Val 2,3 9,6 Leu 2,4 9,6 Ser 2,2 9,2 Thr 2,6 10,4 Cys 1,7 10,8 8,3 (SH)

Lys 2,2 9,0 10,5 (-amino) Arg 2,2 9,0 12,5 (Guanidino)

Asp 2,1 9,8 3,9 (-carboxilo)

Glu 2,2 9,7 4,3 (-carboxilo) Phe 1,8 9,1 Tyr 2,2 9,1 10,1 (hidroxifenol) His 1,8 9,2 6,0 (imidazol) El pH de una solucin y la constante de disociacin, Ka, de un grupo ionizable en la solucin estn relacionadas por la ecuacin de Henderson Hasselbalch. pH = pKa + log [A

- ] [HA] Al hacer una valoracin, el valor del pH en el punto medio de la valoracin es numricamente igual al pK del cido valorado. En el punto medio se encuentran presentes concentraciones equimolares de la especie dadora de protones (HA) y de al especie aceptora de protones (A-). Como ya se mencion los aminocidos se encuentran como ion dipolar o Zwitterion, en donde el grupo carboxilo est ionizado y el grupo amino se encuentra protonado. Ej.: estructura dipolar de la alanina: CH3 NH3

+ - CH COO-

La valoracin de un ion dipolar se efecta en la siguiente forma: cuando se agrega el lcali a la solucin neutra del aminocido, es el protn del NH3

+ el que reacciona:

CH3 I OH- NH2 CH COO

- + H2O CH3

NH3

+ - CH COO- CH3 I H+ NH3

+ - CH COOH Al agregar cido a la solucin neutra del aminocido, el grupo carboxilo disociado acepta el protn para formar la especie protonada del aminocido. Si se considera al aminocido en forma inica como in dipolar el grupo amino es el dador de H+ para la neutralizacin con lcalis. En forma similar, el grupo carboxilo disociado es el grupo valorado por los cidos. pH

Curva de titulacin para alanina 14 12

10 pK3 = 9,7 8 6 pHI = 6,02 4 pK1 = 2,3 2 20 10 0 10 20 ml HCl ml NaOH Los valores de pK se numeran generalmente siguiendo la direccin de la regin cida a la bsica Ej.: alanina tiene un pK1 = 2,3 que corresponde a la semineutralizacin del grupo amino protonado. Las curvas de valoracin de los aminocidos con grupos R que se ionizan (tales como lisina, cido glutmico, etc.) son ms complejas, puesto que son una combinacin de curva correspondiente a la disociacin del grupo R y las

curvas de valoracin de los grupos - amino y - carboxilo.

Parte Experimental En este prctico se estudiar el comportamiento de los aminocidos frente a diferentes concentraciones de iones hidrgeno. Observndose el cambio de pH de la solucin de aminocido cuando se le agrega una solucin de un cido o de una base. Pese 200 mg. de un aminocido y disuelva en 20 mL de agua destilada. Mida el pH inicial con peachmetro. En una bureta coloque H2SO4 2N y titule el aminocido disuelto agregando cada vez 0,1 mL de la solucin del cido. Mezcle agitando con bagueta y mida cada vez el pH de la solucin hasta alcanzar pH = 1,2. Anote los volmenes de cido gastados en cada titulacin. Disuelva una segunda muestra de 200 mg de aminocido en 20 mL de agua destilada y titule con NaOH 2N en la misma forma que se titul con cido hasta alcanzar esta vez pH = 12.

PAUTA INFORME: Con los datos experimentales obtenidos y en base a la pauta que se indica a continuacin, confeccione un informe que deber entregar en la prxima sesin de laboratorio. 1. INTRODUCCION ( Debe ser breve y en relacin a las propiedades cido base de los aminocidos) 2. MATERIALES Y METODOS

3. DATOS EXPERIMENTALES a. Presentarlos como tabla de datos: Tabla I pH vol.H2SO4 2N (mL) meq H2SO4

Tabla ll pH vol NaOH 2N (mL) meq NaOH b. Con los datos de las tablas confeccionar el grfico de titulacin del aminocido.

Ponga los valores de pH en las ordenadas y en las abscisas los miliequivalentes de cido o base necesarios para titular la muestra del aminocido.

4. RESULTADOS a. A partir del grfico determinar : pK1, pK2 y pHi

b. Clculo % error relativo para pK1, pK2 y pHi : Compare los valores obtenidos por usted, con los de bibliografa , calculando el % de error relativo en cada caso. % error relativo = (valor observado valor verdadero) x 100 valor verdadero 5. DISCUSION 6. BIBLIOGRAFIA

CUESTIONARIO 1. Para aminocidos monoamino monocarboxlicos el pHi (punto isoelctrico) est definido por la relacin pHi = pK1+pK2 en base a esto calcule los valores de punto 2 isoelctrico para alanina y leucina. 1. a) Escriba todos los estados posibles de ionizacin del aminocido Ser.

b) Indique cual estado de ionizacin predomina a: pH = 10; pH = 7.0 y pH = 11.0

2. En base a los valores de pK, indique la carga neta: negativa (-), cero (0), positivo (+) para los aminocidos: glicina y cido asprtico a: pH = 1.0; pH = 2.1; pH=4,0 y pH = 10.

4. Escriba las formas inicas del aminocido Val presentes a un pH = pk2.

TRABAJO PRACTICO N 4

ENZIMAS Una caracterstica especial de las clulas es su capacidad para realizar reacciones qumicas rpidas a temperatura ambiente. Fuera de la clula, esas reacciones slo se pueden realizar muy lentamente. La compleja actividad metablica de la clula no podra realizarse a velocidades tan bajas. Los agentes bsicos de las transformaciones celulares son un grupo de sustancias proteicas llamadas enzimas. Enzima es una protena sintetizada en la clula, que cataliza una reaccin, de tal forma que la velocidad de esa reaccin sea compatible con los procesos bioqumicos esenciales para la vida celular. Concentraciones sumamente bajas son suficientes para actuar. Su naturaleza proteica les confiere especificidad; esto significa que cada enzima cataliza una reaccin; por lo tanto, son necesarias miles de ellas para acelerar las diferentes reacciones que se producen en la clula. Por su naturaleza proteica una enzima perder sus propiedades catalticas por accin del calor, cidos o bases fuertes, solventes orgnicos u otros agentes capaces de desnaturalizar proteinas. Las enzimas intervienen en las reacciones qumicas aumentando su velocidad, porque disminuyen la energa de activacin y por lo tanto, permiten que stas ocurran a bajas temperaturas; pero no alteran el equilibrio de las reacciones, lo que significa que la cantidad total de reaccionantes transformados al final de la reaccin es igual con o sin enzima. Para ejercer su actividad muchas enzimas necesitan que est presnte una molcula orgnica, de carcter no proteico, que se denomina coenzima, adems las enzimas requieren a veces de algunos iones tales: Mg+2, Mn+2, Ca+2, etc. que favorecen la actividad enzimtica por lo que se denomina activadores. La actividad de las enzimas depende de una serie de factores tales como: temperatura, pH, concentracin de sustrato, concentracin de enzimas, inhibidores, activadores y otros. Las condiciones ptimas de trabajo varan de acuerdo a la enzima considerada. En la prctica es importante mantener en forma adecuada el pH y la temperatura. pH: Una enzima es activa como catalizador dentro de un margen relativamente estrecho de pH, siendo generalmente ms activa a un pH especfico, denominado pH ptimo. A valores de pH distintos del ptimo la enzima es inestable y experimenta alteraciones en su estructura terciaria, lo cual afecta la parte activa. Temperatura: Las reacciones enzimticas son afectadas por los cambios de temperatura. En un comienzo, partiendo de bajas temperaturas, se observa un aumento en la velocidad de reaccin, ya que se aumenta la energa del sistema y ms molculas obtienen la energa de activacin necesaria para que ocurra la reaccin. Si no existieran otros factores que considerar,este incremento en la

velocidad de reaccin con la temperatura podra continuar hasta el infinito . Sin embargo, si se incrementa la temperatura ms all de un cierto lmite, la energa del sistema es suficiente para causar la ruptura de los puentes de hidrgeno y de algunas otras fuerzas que dan lugar a la estructura terciaria. La enzima empieza a perder actividad y puede llegar a inactivarse totalmente. Concentracin de sustrato: La ecuacin de Michaelis- Menten es la expresin matemtica que define la relacin cuantitativa entre la velocidad de una reaccin enzimtica y la concentracin de sustrato. Esta ecuacin corresponde a una curva hiperblica. v Cintica de orden cero v= Vmax x [S]

Km + S Vmax ------------------------------------------------------- Cintica de orden 0 y primer

Orden (mezcla) Vmax

2 - Cintica de 1 er. orden Km [S] En dicha ecuacin, v es la velocidad que se observa a una concentracin de sustrato dada [S]; Km es la constante de Michaelis, expresada en unidades de concentracin (moles/litro) y V max es la velocidad mxima al punto de saturacin en la concentracin de sustrato. Cuando [S] es de gran magnitud, Km se transforma en insignificante y la ecuacin de Michaelis-Menten queda convertida en: v = Vmax, es decir, una reaccin de orden cero, en la que v es independiente de la concentracin de sustrato. Si se escoge un valor de v = 1 Vmax la ecuacin de Michaelis-Menten puede 2 anotarse de la siguiente forma:

Vmax = Vmax [S]

2 Km+ [S]

Km + [S] = 2 [S] Km = [S]

Si Km es grande en comparacin a [S], la ecuacin se convierte en: V = V max [S] Km Es decir, v depende de S, por lo que la reaccin es de primer orden. Concentracin de enzima: La velocidad de una reaccin catalizada por enzimas es directamente proporcional a la concentracin de enzima presente. La validez de esta relacin lineal es absolutamnete esencial para la medida cuidadosa de la actividad enzimtica. Esta relacin es vlida bajo ciertas condiciones rigurosamente definidas. El pH y la temperatura del sistema deben ser constantes y el sustrato debe estar presente en exceso. La relacin directa es especialmente efectiva en los primeros instantes de la reaccin. Algunas enzimas son inhibidas por productos, inhibicion que aumenta a medida que transcurre el tiempo. Inhibidores. Existen sustancias que sin ser sustratos de la enzima son capaces de combinarse con ella, pero en esta caso no se forman productos estas sustancias interfieren la actividad enzimtica al impedir que el sustrato original forme el complejo. Se considera que un inhibidor es competitivo cuando puede unirse al sitio activo compitiendo con el sustrato enzimtico. Esto determina la disminucin de la actividad cataltica. La proporcin de la inhibicin de este tipo se relaciona con: la concentracin de inhibidor,la concentracin del sustrato y con las afinidades relativas del inhibidor y del sustrato.En este tipo de inhibicin la Km se altera por efecto del inhibidor , pero no la Vmax. El inhibidor es no competitivo cuando se une irreversiblemente con un sitio de la enzima y una vez que esto sucede no puede ser desplazado por el sustrato, aunque la concentracin de ste ltimo se aumente de manera significativa. La proporcin de este tipo de inhibicin se relaciona con: La concentracin del inhibidor y la afinidad del inhibidor con la enzima. La Km no se altera por el inhibidor, pero si la Vmax. Para determinar la actividad de una enzima se mide la cantidad de sustrato consumido o la cantidad de producto formado por un tiempo determinado mediante mtodos qumicos, tales como las reacciones de coloracin o bien por mtodos fsicos tales como viscosidad o espectrofotometra.

Unidades de actividad enzimtica. La actividad de una enzima se puede expresar en unidades de actividad enzimtica, aquella empleada ms corrientemente se define como: la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un micromol (10-6 mol) de sustrato por un minuto a 25C. La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por milgramo de protena, constituye una medida de la pureza de una enzima que aumenta durante el proceso de purificacin y llega a ser mxima y constante cuando sta se encuentra en estado puro. Valoracin de la actividad amilasa. En el trabajo prctico se utilizar la enzima amilasa salival esta enzima hidroliza al amidn transformndolo en dextrinas y maltosa, ya que cataliza la ruptura de los enlaces alfa glucosdicos situados en el centro de la molcula. Se caracteriza por presentar actividad en el rango de pH de 3,8 a 9,4 y su pH ptimo es 6,9. Es activada principalmente por cloruros y en menor grado por otros aniones tales como: bromuro, ntrito, yoduro, etc. Su punto isoelctrico es cercano a 5,3. El reactivo de yodo da un color azul con el almidn, pero no con los productos de degradacin. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentracin de almidn.La actividad enzimtica se determina midiendo la disminucin en color, durante la incubacin de la enzima con el almidn en un cierto perodo. La siguiente pauta ilustra el proceso de degradacin: Almidn Amilasa Amilodextrina + maltosa Amilasa Eritrodextrina + maltosa Acrodextrina + maltosa Amilasa Maltosa

Actividad de catalasa La catalasa es una enzima que acta sobre el perxido de hidrgeno (H2O2) y produce su descomposicin en la siguiente forma: Catalasa 2 H2O2 2H2O + O2 Una molcula de catalasa descompone alrededor de 5.000.000 de molculas de H2O2 por minuto. El rol metablico de esta enzima es de gran importancia ya que evita la acumulacin de perxido de hidrgeno (un producto habitual del metabolismo oxidativo). La catalasa es una protena compleja cuyo grupo prosttico es la forma frrica de la protoporfirina. Esta enzima se encuentra tanto en tejidos animales como vegetales y es abundante especialmente en estructuras de almacenamiento de las plantas tales como: tubrculos(como el de la papa), granos y frutos. En el prctico se trabajar con catalasa de tubrculo de papa, observando su actividad bajo diferentes condiciones.

Parte Experimental 1. Cintica de la reaccin amilsica Disponga de 6 tubos de ensayo con 1 mL de H2SO4 1N cada uno. En otro tubo de ensayo coloque lo siguiente: Almidn 0,1M ___________________________ 0,9 ml Tampn pH = 6,9 ________________ _______ 0,1 ml KCI 0,1M ______________________________ 0,9 ml Agua destilada __________________________ 5,6 ml Enzima diluda __________________________ 0,5 ml 1/10 en S.F. El ltimo componente que debe agregar, es la dilucin de saliva. Luego agite y saque rpidamente una alcuota de 1 mL. Vierta en uno de los tubos que contiene H2SO4 1N (Este corresponde al tiempo cero) Incube los 7 mL restantes a 37C y saque alcuotas de 1 mL a los siguientes tiempos: 1,, 2,, 4, 8, 16. Vierta las alcuotas en cada uno de los tubos con

H2SO4 1N ( el cido desnaturaliza a la protena y por lo tanto detiene la reaccin enzimtica) A cada uno de los tubos agregue 1 gota del reactivo de yodo.Observe y anote lo ocurrido. 2. Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa Disponga de 6 tubos de ensayo y adicione los siguientes reactivos segn el esquema:

REACTIVOS

N Tubos

1 2 3 4 5 6

Tampn pH = 4,9 (ml) 1 1 - - - -

Tampn pH = 6,9 (ml) - - 1 1 - -

Tampn pH = 9,6 (ml) - - - - 1 1

Almidn (ml) 1 1 1 1 1 1

KCI 0,1 M (ml) 1 1 1 1 1 1

Acido sulfrico IN (ml) - 0,5 - 0,5 - 0,5

Enzima diluida 1/10 en S.F. (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Incube a 37 por 15los tubos 1, 3 y 5

Detenga la reaccin con H2SO4 1N (ml) 0,5 -- 0,5 -- 0,5 --

Reactivo de yodo (gotas) 1 1 1 1 1 1

Los tubos 2, 4 y 6 corresponden a lo que se conoce como tiempo cero de la reaccin, es decir, tiene por objeto conocer la composicin qumica del medio antes que se inicie la reaccin enzimtica 3. Efecto de cloruros sobre la actividad de amilasa salival Para estudiar el efecto de cloruros se utilizar saliva dializada. Para esto se coloca la saliva en una bolsa de dilisis lo cual elimina sustancias de peso

molecular bajo 10.000, la dilisis se realiza contra agua destilada,durante 16 a 18 hrs. a 4C. Una parte de la saliva dializada se diluye 1/10 en agua destilada y otra parte se diluye 1/10 en suero fisiolgico. Disponga de 6 tubos de ensayo y adicione los siguientes reactivos segn el esquema:

REACTIVOS

N Tubos

1 2 3 4 5 6

Tampn pH = 6,9 (ml) 1 1 1 1 1 1

Almidn (ml) 1 1 1 1 1 1

Acido sulfrico 1N (ml) - 0,5 - 0,5 - 0,5

Enzima diluida 1/10 en S.F. (ml) 0,5 0,5 - - - -

Enzima dial. y dil. 1/10 en S.F. (ml) - - 0,5 0,5 - -

Enzima dial. y dil. 1/10 en agua (ml) - - - - 0,5 0,5

Incube a 37 por 15los tubos 1, 3 y 5

Detenga la reaccin con H2SO4 1N (ml) 0,5 -- 0,5 -- 0,5 --

Reactivo de yodo (gotas) 1 1 1 1 1 1

Los tubos 2,4 y 6 corresponden al tiempo cero de la reaccin. 4. Deteccin de catalasa En el prctico se trabajar con catalasa de tubrculo de papa, observando su actividad bajo diferentes condiciones.

Procedimiento: Disponga de 4 tubos de ensayo y proceda como se indica en el esquema que aparece a continuacin.

N Tubo

1 2 3 4

Macerado papas(ml) 2 2 2 --

Macerado papas calentado a 100C

-- -- -- 2

KCN 5%(gotas) -- 5 -- --

Agua oxigenada(gotas) 5 5 5 5

Cuestionario: 1. Qu diferencia existe entre los catalizadores inorgnicos y las enzimas? 2. Qu se entiende por velocidad mxima (Vmax) de una reaccin

enzimtica? 3. La ecuacin final obtenida por Michaelis al desarrollar matemticamente su

hiptesis es:

V = V max x [S] Km +[S]

Despeje Km en funcin de la otras variables. 4. En qu unidades se expresa Km? 5. Por qu al medir una actividad enzimtica es necesario aadir al medio de

incubacin una solucin amortiguadora de pH? 6. Qu se entiende por coeficiente de temperatura Q10? 7. Son sinnimos inactivacin y desnaturalizacin de una enzima? 8. Por sobre cierta temperatura la actividad de un sistema enzimtico

disminuye. Cul es el mecanismo predominante que determina la disminucin?

9. Qu efecto tiene el aumento de la concentracin de sustrato sobre

inhibicin competitiva de una reaccin enzimtica? 10. Cuando en una reaccin enzimtica la [S] no es saturante En qu forma

se puede encontrar la enzima?

TRABAJO PRCTICO N 5

IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS

Los carbohidratos se definen qumicamente como derivados aldehdicos o cetnicos de alcoholes superiores polivales (con ms de un grupo OH) o como compuestos, que por hidrlisis dan estos derivados. Constituyen un grupo importantsimo de compuestos orgnicos, no slo desde el punto de vista bilogico, sino muchos de ellos en el campo industrial. 1. Los carbohidratos sirven como: almacenadores de energa, combustible

e intermediarios metablicos. Es el caso del almidn en las plantas y glicgeno en los animales, los cuales pueden ser movilizados rpidamente y convertidos en glucosa, principal combustible para la generacin de energa.

2. Algunos carbohidratos son componentes estructurales del DNA y RNA

es el caso de la ribosa y desoxirribosa. 3. Tambin hay carbohidratos que son elementos estructurales de las

paredes celulares en bacterias, plantas y exoesqueleto de artrpodos. Por ejemplo, la celulosa, es el constituyente principal de las paredes celulares de las plantas.

4. Adems, los carbohidratos tienen un gran valor industrial, especialmente

la celulosa y sus derivados. Clasificacin: Los carbohidratos pueden clasificarse en tres grupos principales: monosacridos, oligosacridos y polisacridos. Monosacridos Son aquellos carbohidratos que no pueden ser hidrolizados en formas ms simples. Su frmula emprica es (CH2O)n. Considerando el nmero de carbonos que constituyen su molcula se clasifican en: triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, etc. que tienen 3, 4, 5 y 6 tomos de carbono respectivamente. Entre los monosacridos ms simples con n = 3 estn el gliceraldehido (aldosa) y la dihidroxiacetona (cetosa). El gliceraldehido tiene un tomo de carbono asimtrico de modo que existen dos estereoismeros: D gliceraldehido y L- gliceraldehido.

CHO CHO CH2OH I I I H C OH HO C H C = O I I I CH2OH CH2OH CH2OH D gliceraldehido L gliceraldehido dihidroxiacetona Entre las pentosas estn por ejemplo la ribosa

CHO HOCH2

I O H C OH OH I

H C OH 4 1 I H C OH H H I H 3 2 H CH2OH OH OH D ribosa

- D ribosa

( - D ribofuranosa) Entre las hexosas estn entre otras: glucosa, galactosa y fructosa.

CHO CHO CHO I I I H C OH H C OH C = O I I I

HO C H HO C - H HO C - H I I I H C OH HO C H H C -O H I I I

H C OH H C OH H C - O H I I I

CH2OH CH2OH CH2OH D glucosa D galactosa D fructosa

Las hexosas se ciclan formando anillos de furanosa o piranosa Ej.: 6 CH2OH 5 O H 6 O 1 H HOCH2 CH2OH H 4 1 5 H OH 2 OH H OH 3 2 OH H OH H OH 4 3 OH H

- D glucosa - D - fructosa

( - D glucopiranosa) ( - D fructofuranosa) Oligosacridos Dan por hidrlisis dos a seis molculas de monosacridos. Estn aqu los disacridos que al ser hidrolizados dan como producto final dos molculas de monosacridos. Los disacridos de mayor importancia son: sacarosa, lactosa y maltosa que por hidrlisis dan origen a: Sacarosa = glucosa + fructosa Lactosa = glucosa + galactosa Maltosa = glucosa + glucosa En su mayor parte, los monosacaridos y oligosacridos son compuestos cristalinos, solubles en agua, con frecuencia de sabor dulce. Polisacridos Son cadenas largas o polimeros de los monosacridos, que pueden presentar una estructura lineal o ramificada. Los polisacridos ms importantes son: almidn, glucgeno y celulosa. Por hidrlisis del polisacrido se obtienen los monosacridos que constituyen y derivados sencillos de monosacridos. Los polisacridos difieren en la naturaleza de sus unidades monosacridas. Se dividen en homopolisacridos, constituidos por un solo tipo de unidad monomrica y heteropolisacridos, que contienen dos o ms unidades monmeras diferentes. Por lo general, los polisacridos son inspidos, insolubles y de peso molecular elevado.

Almidn Es el reservorio nutricional que poseen las plantas, el cual existe en dos formas: amilosa, tipo de almidn no ramificado, constitudo por molculas de

glucosa unidas mediante enlaces glucosdos - 1,4. Amilopectina, forma ramificada de almidn, dichas ramificaciones se forman por unin de glucosa

con enlace glucosdico - 1,6 en la parte no ramificada, las uniones son las mismas de amilosa. Ms de la mitad de los carbohidratos ingeridos por el ser

humano coresponde a almidn, que es rpidamente hidrolizado por - amilasa, secretada por las glndulas salivales y el pncreas. Glucgeno Es la forma de almacenamiento de glucosa de las clulas animales. Es un polmero ramificado de glucosa, la mayora de las cuales estn unidas por

enlaces glucosdicos - 1,4. La ramificaciones se forman por enlaces

glucosdicos - 1,6. Celulosa Polisacrido estructural presente en las plantas. Es el compuesto orgnico ms abundante en la bisfera. Se trata de un polmetro no ramificado de

molculas de glucosa unidas por enlaces - 1,4. Los mamferos no tienen celulasa y por lo tanto no pueden digerir fibras vegetales. Sin embargo, algunos rumiantes almacenan celulasa producida por bacterias en su tracto digestivo y as pueden digerir celulosa. Reacciones de Identificacin de Carbohidratos Existen diversas reacciones para los carbohidratos, que son importantes, ya que constituyen la base de la mayora de las pruebas para el anlisis de estos compuestos. Reaccin de Molish Es el test ms general para carbohidratos. Si la solucin de carbohidrato se

trata con una solucin de - naftol y se aade cido sulfrico concentrado, se obtiene en la unin de los dos lquidos, un anillo color violeta. La reaccin se debe a que al actuar el H2SO4 sobre el hidrato de carbono, produce su deshidratacin generndose furfural aldehido o derivados los cuales al

condensarse con el - naftol dan productos coloreados.

CHO I CH OH I H+ CH OH I CH OH CHO I O CH2OH furfural CHO I CH OH I CH OH I H+

CH OH I CH OH HOCH CHO I O CH2 OH

5- hidrometil OH furfural OH + 2 H2SO4 CHO O

-naftol HOCH2 O CH

OH

O H2SO4 HOCH2 C O HO3S SO3H Reaccin de Fehling Esta reaccin se basa en el poder reductor del grupo carbonilo (aldehido o cetona) de un carbohidrato que pasa a cido, reduciendo las sales cpricas en medio alcalino (reactivo de Fehling) a xido cuproso. El reactivo de Fehling es de color azul intenso (debido al complejo cprico) se agrega a la solucin de carbohidrato y se hierve. CHO COONa H C OH H C OH React. Fehling HO C H OH C H + Cu2O H C OH calor H C OH pp xido cuproso H C OH H C OH CH2OH CH2OH glucosa gluconato de sodio Si el carbohidrato posee un grupo aldehido o cetona libre, se forma un precipitado amarillo de xido cuproso hidratado que pasa a un color rojo de xido cuproso anhidro al continuar la ebullicin. Esta reaccin sirve para identificar azcares reductores y cuantificarlos.

Reaccin de Seliwanoff Esta reaccin permite diferenciar entre cetosas y aldosas. Se basa en la conversin ( por accin del HCl) de la cetona a 5 hidroximetil furfural, el cual se condensa con resorcinol (reactivo de Seliwanoff) formando un producto de color rojo. Durante el mismo intervalo en que, con la fructosa (cetohexosa) aparece un color rojo intenso, con la glucosa (aldohexosa) se origina un ligero color rosa.

Reaccin del yodo con los polisacridos Algunos polisacridos como almidn, glicgeno y dextrinas dan colores caractersticos con el yodo. Se acepta que las cadenas de polisacridos estn enrrolladas sobre si mismas formando hlices dentro de las cuales hay espacio suficiente para incluir cadenas lineales de tomos de yodo. El color de la reaccin se debe a que, el yodo as atrapado absorbe ms luz e incluso cambia su espectro de absorcin de la luz. La reaccin depende de la temperatura, ya que el color desaparece por calentamiento y reaparece al enfriar la solucin; la desaparicin del color se intepreta como desenrollamiento de las hlices con exclusin del yodo a medida que se aumenta la temperatura. La reaccin coloreada se produce en medio neutro y cido; en medio alcalino no se produce el color debido a que desaparece el yodo libre, por transformacin en yoduro e hipoyodito. Hidrlisis cida de almidn La hidrlisis de los enlaces glucosidicos del almidn es catalizada tanto por cidos como por enzimas. En la hidrlisis cida los enlaces se rompen al azar, formndose inicialmente, adems de glucosa, polisacridos de menor tamao molecular (dextrinas) y oligosacridos, los cuales finalmente se convierten en glucosa. La velocidad de la hidrlisis depende de la naturaleza y concentracin de cido, as como de la temperatura. La naturaleza polisacrida del almidn puede verificarse demostrando la aparicin y aumento de los grupos reductores, a medida que progresa la hidrlisis.

PARTE EXPERIMENTAL 1. Reaccin de Molish: :

1 2 3 4 5

Glucosa (mL) 2

Fructosa (mL) 2

Lactosa (mL) 2

Sacarosa (mL) 2

Agua (mL) 2

-Naftol 5% (gotas) 2 2 2 2 2

H2SO4 conc. (mL) 1 1 1 1 1

IMPORTANTE

Luego de agregar -Naftol agitar vigorosamente

Agregar con cuidado el H2SO4 concentrado por las paredes del tubo inclinado de modo que el cido forme una capa sin mezclarse con la solucin de carbohidrato. En unos pocos segundos aparecer un anillo violeta en la zona de contacto.

2. Reaccin de Fehling:

1 2 3 4 5

Fehling A (ml) 1 1 1 1 1

Fehling B (mL) 1 1 1 1 1

Glucosa (mL) 1

Fructosa (mL) 1

Lactasa (mL) 1

Sacarosa (mL) 1

Agua (mL) 1

IMPORTANTE Agitar bien cada uno de los tubos y calentar en un bao de agua hirviendo. Reaccin positiva es la aparicin de un color rojo ladrillo.

3. Reaccin de Seliwanoff: En 3 tubos de ensayo numerados, colocar

respectivamente: 1 mL de solucin fructosa, 1 mL de solucin de glucosa y 1 mL de agua. Agregar a cada tubo 5 mL del reactivo de Seliwanoff recientemente preparado.

(Reactivo de Seliwanoff: tomar 3,5 ml de solucin de resorcina al 0,5% y agregarle 12 mL de HCl concentrado y diluir con agua hasta 35 mL).

4. Reaccin del yodo: Disponer de 6 tubos de ensayo y agregar

respectivamente: 1 mL de solucin de glucgeno, 1 mL de solucin de almidn, 1 mL de solucin de dextrina, 1 mL solucin de maltosa, 1 mL solucin de glucosa y 1 mL de agua.

Agregar a cada tubo 1 gota del reactivo de yodo. 5. Hidrlisis cida del almidn: A dos tubos de ensayo agregar 1 mL de

solucin de almidn al 5%. Luego a uno de los tubos agregar 2 mL de H2SO4 2N, al otro agregar 2 mL de agua. Agitar el contenido de cada tubo.

Colocar los tubos en un bao de agua hirviendo por 30 minutos. Enfriar los tubos y agregar al que corresponde 2 mL de NaOH 2N (para neutralizar el hidrolizado). Con el contenido de los tubos repetir el test de Fehling como lo efectu en la parte 2.

1. Identificacin de una muestra problema Con su muestra problema proceda a efectuar las reacciones que usted estime conveniente para lograr su identificacin. En el mismo laboratorio entregue el informe correspondiente. Modelo hoja informe a. Nombre del prctico b. Nombre del alumno(s) c. Nmero muestra d. Reaccin color resultado (+/-) e. Conclusiones

Cuestionario 1. Qu significa que un carbohidrato sea dextrgiro o levgiro? 2. Qu se entiende por configuracin D y L de los azcares? 3. Qu tomo de carbono de un monosacrido determina que este tenga la configuracin D L?

4. Qu se entiende por ismetros y de la glucosa? 5.Qu grupos funcionales son responsables del poder reductor de un monosacrido? 6. Por qu solo algunos disacridos tienen poder reductor? De ejemplos concretos de disacridos reductores y no reductores. 7. Qu enzima pueden usarse para hidrolizar el almidn ? 8.Qu enzimas se necesitan para hidrolizar totalmente el glicgeno? 9. Haga un esquema de la molcula de glucgeno. Indicando claramente los tipos de enlace que se establecen entre sus unidades constituyentes. 10.Cmo se explica la reaccin de los polisacridos con el yodo?

TRABAJO PRACTICO N 6

LIPIDOS

El trmino lpido, se refiere a cualquier sustancia apolar que se encuentra en la naturaleza y que es casi o totalmente insoluble en agua, pero es soluble en solventes apolares, tales como cloroformo, ter, benceno, entre otros. Debido a la diversidad estructural y biofuncional de los lpidos, este enunciado es bastante vago y muy general, sin embargo, se basa en una propiedad fisicoqumica particular relacionada con la estructura lipdica, es decir, su naturaleza apolar es la base para la funcin biolgica de los lpidos. En la mayora de los casos, la apolaridad de los lpidos se debe a la presencia de uno o ms residuos de cidos grasos que contienen largas cadenas hidrocarbonadas alifticas. Como ya se mencion los lpidos presentan una gran diversidad funcional como por ejemplo: a.- Asociados con protenas y carbohidratos, sirven como unidad estructural de la membranas celulares. b.- Como componentes de las membranas, ayudan al establecimiento y preservacin de una disposicin ordenada de las protenas funcionalmente activas, localizadas en la membrana. c.- A nivel metablico, constituyen una de las principales formas de almacenamiento de energa qumica. d.- Sirven como principal sistema de transporte de los materiales apolares a travs de fludos biolgicos. Entre los lpidos se distinguen principalmente: a.- Acidos grasos d.- Fosfolpidos b.- Acilglicridos e.- Esteroides c.- Ceras f.- Terpenos Acidos grasos Son cidos carboxlicos de cadena aliftica larga. La mayora son monocarboxlicos y con nmero par de tomos de carbono. En algunos cidos grasos esta cadena est completamente saturada, otros tienen uno o ms dobles enlaces. Los cidos grasos ms abundantes tienen nmero par de tomos de carbono. Con cadenas carbonadas con ramificaciones y que tienen entre 12 a 24 carbonos. Algunos de ellos son:

Estructura Esqueleto carbonado Nombre Comn CH3(CH2)14COOH 16:0 Acido palmtico (del griego palma=palmera) CH3(CH2)16COOH 18:0 Acido esterico (del griego stear=grasa dura) CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COHH 16:1(

9) Acido palmitoleico CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 18:1(

9) Acido oleico (del griego oleum=aceite) La importancia de los cidos grasos radica en que son componentes fundamentales de muchos lpidos. Las propiedades fsicas de los cidos grasos y de los compuestos que los contienen estan determinadas en gran parte por la longitud y grado de insaturacin de la cadena hidrocarbonada. Los cidos grasos pueden ser saturados o no saturados. Una reaccin que permite su diferenciacin es la absorcin de halgeno. La adicin de halgeno a los dobles enlaces de los cidos grasos no saturados, constituyen el fundamento de su separacin respecto de los cidos grasos saturados. El principal empleo de este mtodo es la determinacin del grado de inasaturacin de los cidos grasos. Si un halgeno (Cl2, Br2, I2) se designa por X2, la adicin del mismo a un enlace etilnico puede ocurrir as: Mecanismo 1: CH2: :CH2 + X : X CH2 : CH2 : X : X

- X : CH2 : CH2X L a velocidad de incorporacin del halgeno a los enlaces etilnicos de los cidos grasos no saturados depende de la estructura del cido, del tipo de halgeno y de los disolventes y catalizadores empleados. Otra teora de la reaccin de halogenacin sostiene que la molcula de halgeno se polariza: X2 X

+ X- El catin halogenado reaccionara entonces con la olefina para formar un grupo polarizado; inmediatamente tendra lugar una rpida adicin del anin que completara la reaccin. Mecanismo 2:

CH2 : : CH2 + X+X- CH2 : CH2 : X

+ CH2 : CH2 X + X- X : CH2 : CH2 :

X Adems de las reacciones de adicin ya descritas el cloro y el bromo pueden intervenir en reacciones de sustitucin. El yodo en cambio reacciona lentamente, pero normalmente no origina productos de sustitucin; este reactivo tiene la ventaja de ser especfico para la reaccin de adicin y el inconveniente de su lenta velocidad de reaccin. Se emplear este halgeno en forma de reactivo de Hbl. Para la identificacin de los cidos grasos es de gran utilidad la formacin de complejos con urea. Los complejos de urea con los cidos grasos constituyen derivados tiles para la identificacin, preparacin y aislamiento de los cidos grasos de mezclas sencillas o complejas. La reaccin no puede expresarse con una ecuacin a causa de sus proporciones macromoleculares, si bien, pueden formularse las reacciones entre el nmero de molculas de cido graso y de urea. Acilglicridos Corresponden a steres de cido graso y del trihidroxialcohol glicerol, segn el nmero de grupos hidroxilo esterficados, se tienen: monoacilglicridos, diacilglicridos y triacilglicridos, estos ltimos son los ms abundantes en la naturaleza. Segn su estado fsico a temperatura ambiente los triacilglicridos se llaman grasas neutras si son slidos y aceites neutros si son lquidos.

Debido a que en estos compuestos los hidroxilos polares del glicerol y los carboxilatos polares de los cidos grasos estn unidos en enlaces ster, los triacilglicridos son molculas apolares, hidrofbicas, prcticamente insolubles en agua. Los triacilglicridos constituyen los depsitos de grasa, que es la forma principal de almacenamiento de material lipdico. Las semillas tambin almacenan triacilglicridos, proporcionando energa y precursores cuando germinan las semillas. En ciertos animales polares de sangre caliente, los triacilglicridos no slo sirven para almacenar energa sino tambin como aislamiento para las temperaturas muy bajas.

Por otra parte, una gran cantidad de alimentos contienen triacilglicridos, es as como la mayora de los aceites vegetales, los productos lcteos y las grasas animales son mezclas complejas de triacilglicridos sencillos y mixtos. Los aceites vegetales como el aceite de maz y el de oliva estn compuestos mayoritariamente de triacilglicridos con cidos grasos no saturados. Pueden ser convertidos en grasas slidad por hidrogenacin cataltica que reduce algunos de sus dobles enlaces a enlaces simples. Los triacilglicridos que slo contienen cidos grasos saturados, tales como la triestearina, componente principal de la grasa de vacuno, son slidos a temperatura ambiente. En general los acilglicridos se hidrolizan cuando se hierven con cidos y con bases, o tambin se hidrolizan por accin de las lipasas: Las hidrlisis en presencia de alcalis se denomina saponificacin y da como producto una mezcla de jabones y glicerina. CH2O - COR1 CH2OH R1 COOK+ CHO COR2 CHOH + R2COOK

+

Saponificacin CH2O COR3 CH2OH R3COOK

+

3KOH triacilglicrido glicerol jabones (sales de ac. grasos Ceras Son steres de alcohol y cidos grasos, en que ambos tienen cadenas hidrocarbonadas largas. Su punto de fusin es generalmente ms elevados que los de los triacilglicridos. En la naturaleza, las ceras son generalmente productos metablicos finales cuyo papel biolgico ms importante es servir de cubierta qumica protectora en la superficie de animales y plantas. Fosfolpidos Pueden derivar del glicerol (fosfoglicridos) o de la esfingosina (fosfoesfingsidos) En los fosfoglicridos uno de los grupos hidroxilo primario del glicerol se halla esterificado por el cido fosfrico, los dems grupos hidroxilo estn esterificados por cidos grasos. Se les encuentra en las membranas de todos los tipos de clulas. Los cidos grasos de los fosfoglicridos son variados,

diferentes en las distintas especies, como tambin en tejidos diferentes de la misma especie y en los diversos fosfoglicridos de un mismo tejido. En general contienen un cido saturado en C-1 y un cido graso no saturado en C-2 y sus longitudes de cadena son habitualmente 16 y 18 carbonos. Los fosfoesfingsidos derivan de la molcula de esfingosina o 4 esfingenina (aminoalcohol de cadena larga), tienen un cido graso de cadena larga, grupo fosfato y un alcohol de cabeza polar. Como ejemplo de este tipo de compuestos estn las esfingomielinas que tienen colina o etanol amina como grupo de cabeza polar. Las esfingomielinas son componentes importantes de las membranas celulares. Esteroides Su estructura bsica corresponde al ciclopentano perhidrofenantreno. Los esteroides se encuentran en todos los organismos, donde estan asociados con diversas funciones. La presencia de una cadena lateral en la posicin 17 y de un grupo hidroxilo en la posicin 3 caracterizan a un gran nmero de esteroides llamados esteroles El colesterol es el principal esterol en los tejidos animales. En otros eucariotas se encuentran esteroles similares como el estigmasterol en plantas y el ergosterol en hongos.

Los esteroles son constituyentes de membranas, y tambin sirven como precursores de diversos productos con actividades biolgicas especficas como es el caso de hormonas esteroidales y cidos biliares. Para la determinacin de esteroles se dispone de diferentes reacciones coloreadas. Algunas se basan en el tratamiento de los esteroles con cidos fuertes o con Br2 en condiciones anhidras. Los esteroles no saturados en el

anillo A o B o en ambos originan cromforos. Los que no reaccionan bajo estas condiciones contienen anillos saturados. La reaccin de Lieberman-Burchard es una de las ms usadas. En esta reaccin una solucin clorofrmica de esterol se trata con anhdrido actico, adicionndole inmediatamente gotas de cido sulfrico concentrado, originando un color rosa, que cambia a prpura y finalmente a azul verdoso y verde. El cromforo obtenido puede utilizarse para la estimacin cuantitativa del colesterol. El mecanismo de reaccin es desconocido debido a las dificultades existentes para aislar productos cromofricos. Esta reaccin puede representarse: CH3-CO Esterol + O + H2SO4 Deshidratacin, condensacin e Isomerizacin de sales halocr- CH3-CO micas (verde) Terpenos Estn constitudos por mltiples unidades de isopreno (2-metil-1,3 butadieno). Los terpenos con dos unidades de isopreno corresponden a monoterpenos, con tres unidades es un sesquiterpeno, los que tienen cuatro, seis y ocho unidades reciben el nombre de diterpenos, triterpenos y tetraterpenos, respectivamente. Los terpenos pueden presentar estructura lineal o cclica y algunos los dos tipos. En los vegetales se ha identificado un nmero bastante grande de terpenos y son componentes de los aceites esenciales obtenidos de plantas, como es el caso de los monoterpenos, geraniol, limoneno, mentol, pineno, alcanfor, entre otros. CH3

CH=C-CH=CH2 Isopreno Entre los diterpenos, se encuentra el fitol, componente de la clorofila. Existen terpenos superiores como los carotenoides, entre ellos se encuentra el B-caroteno, hidrocarburo precursor de la vitamina A. Las vitaminas E y K tambin son de naturaleza terpenoide.

PARTE EXPERIMENTAL 1. Solubilidad de lpidos: En cada uno de 3 tubos de ensayo, coloque 1 ml

de aceite y agregue los siguientes solventes: tubos N1, 3 ml de agua, tubo N2, 3ml de etanol y tubo N 3,3 ml de CCi4. Agite los tubos vigorosamente y filtre a travs de papel filtro humedecido con el solvente respectivo.

Los lquidos que pueden ser considerados como solventes de grasa disolveran una cantidad suficiente de ella como para dejar un depsito al evaporarse. Para observar esto, marque 3 puntos en un papel filtro y deposite una gota de cada uno de los filtrados. Espere que el solvente se evapore, examine en que puntos quedan manchas de grasa. Cul de los solventes usados disuelve las grasas? 2. Identificacin de glicerol 2.a. Caractersticas. Examine una muestra (aproximadamente 1 mL) de glicerol puro. Describa su color, olor y estado fsico. Agregue 5 mL de agua, agite. Es soluble? Fundamente su observacin. 2.b. Test de acrolena. En el fondo de un tubo de ensayo seco coloque 4 gotas de glicerol, agregue unos cristales de bisulfato de potasio. Caliente cuidadosamente el fondo del tubo a la llama note el olor irritante de la acrolena. La acrolena se forma por deshidratacin del glicerol en presencia de bisulfato. Es un test especfico para glicerol; tanto en forma libre como combinada. La acroleina, formada puede reconocerse por las caractersticas reductoras de su grupo CHO. En la boca del tubo del cual se estarn desprendiendo los vapores de acrelena, coloque un papel filtro impregnado en una solucin al 5% de AgNO3 amonacal. Observe la coloracin del papel en la parte expuesta a los vapores. Glicerol a) color= b) estado fsico= c) solubilidad en agua= d)ecuacin de formacin de acrolena= 3. Absorcin de halgeno (Reaccin de Hubl) En 4 tubos de ensayo limpios y secos, coloque 5 ml de CHCl3 y a continuacin agregue 2,5 ml de reactivos de Hbl. Luego adicione respectivamente 0,2 ml de aceite; 0,2g de cido palmtico; 0,2 ml de cido oleico y 0,2 ml de agua. Agitar los tubos por 2. Observar a los 10.

4. Complejos de urea Disponga de 2 tubos de ensayo, en uno coloque 0,2g. de cido palmtico y en el otro 0,2 ml de cido oleico. Disuelva cada cido graso en 4 ml de metanol absoluto que contiene 0,6 g de urea; calentar si fuera necesario. Enfriar al chorro de agua y observar los cristales con lupa. 5. Identificacin de grasas a. Saponificacin Coloque 2 mL de aceite en un tubo de ensayo, agregue 1 mL de solucin al 5% de cloruro de calcio y gotas de NaOH 1N, con lo que se obtiene un precipitado insoluble de jabones de calcio, si en el medio de reaccin existen grasas. b. Reaccin con Sudn III Disponga de 2 tubos de ensayo y coloque 2 mL de agua y 2 mL de aceite respectivamente. Agregue 5 gotas de Sudn III a cada uno de los tubos Qu observa? 6. Identificacin de colesterol. Reaccin de Lieberman Burchard En un tubo de ensayo limpio y seco coloque 2 mL de colesterol al 0,1%. Luego aada 10 gotas de anhdrido actico, mezcle bien y agregue lentamente por las paredes del tubo 2 gotas de H2SO4 concentrado. Dejar en la oscuridad 5 a 10 minutos. Se obtiene una gama de colores que se estabiliza en el verde.

Cuestionario 1. Cules son los productos de la hidrlisis enzimtica y de la hidrlisis

alcalina de un triacil glicridos? 2. Dibuje la estructura del lpido intacto que corresponde a cada una de las siguientes mezclas de productos obtenidos de la hidrlisis completa del lpido: a.- glicerol y 3 molculas de cido palmtico b.- glicerol, cido palmtico, cido esterico y fosfato inorgnico 3. Una mezcla de un triacilglicrido y de cido fosfatdico en benceno se agita con un volumen igual de agua.Despus de dejar que se separen las dos fases. Cul ser el lpido que se encuentra en mayor concentracin en la fase acuosa? Por qu? 7. Qu productos se obtienen al hidrolizar con NaOH el triacilglicrido: 1

estearil, 2, 3 dipalmitoil-glicrido? 8. Si una membrana contiene 60% en peso de protenas y un 40% de

fosfoglicridos, calcular la relacin molar de fosfoglicrido a protenas. Suponga que la molculas de lpido posee un peso molecular medio de 800 y que las protenas tienen peso molecular medio de 50.000

Rp.: 41,7