UNIVERSIDAD DE CORDOBA

INDICE

Pg.

I.CUIDADOS EN EL LABORATORIO02

II.AMINOCIDOS Y PROTEINAS04

01.Titulacin potencio mtrica de los aminocidos04

02.Separacin e identificacin de aminocidos por electroforesis09

03.Separacin de aminocidos por cromatografa13

04. Determinacin del punto iz elctrico de una protena17

05.Protenas: separacin y caracterizacin20

06.Dosificacin de protenas de la leche por el mtodo fotocolorimtrico del Biuret23

07.Ensayos con protenas29

III.ENZIMAS30

08.Enzimas: amilasa salival30

09.Estudio de la polifenoloxidasa (ppo) extrada de la papa33

10.Enzimas y su desempeo en los alimentos (CHO)37

IV.CARBOHIDRATOS39

11.Identificacin de carbohidratos39

12.Polisacrido - aislamiento e hidrlisis44

V.LPIDOS46

13.Qumica de los lpidos46

14.Determinacin del valor de acidez de una grasa51

15.Extraccin y caracterizacin de lpidos54

VI.BIBLIOGRAFA56

I - CUIDADOS EN EL LABORATORIO

1. Ejecucin de los trabajos prcticos

Realizar todas las prcticas con atencin, rigor tcnico y disciplina.

La falta de observacin de cualquiera de los requisitos tcnicos puede llevar a errores que invalidan, parcial o totalmente, el trabajo realizado, sin llevar en cuenta el desperdicio de material, reactivos y tiempo.

Para que el alumno alcance la eficiencia deseada es necesario que el mismo sea puntual, asista los laboratorios, ordenado, aseado y tenga conocimiento previo del trabajo a ser ejecutado.

Ser exigido de los estudiantes el mximo de cuidado con su local de trabajo y con el respectivo material.

Terminada la prctica, el estudiante deber proceder a la limpieza de su local y material, dejndolo completamente limpios y en condiciones de ser nuevamente utilizado.

Colocar sobre el mesn solamente el material estrictamente necesario como lpiz, borrador, lapicero, regla, gua de laboratorio. Dejar los bolsos y otros objetos fuera del mesn donde ser realizado el trabajo prctico.

No gastar soluciones intilmente. Retirar solamente la cantidad que va a necesitar.

No realizar experiencias "extras" en el laboratorio a ttulo de curiosidad. Los "juegos" pueden llevar a riesgos inesperados.

2. Prevencin de accidentes

Todo laboratorio qumico es normalmente sitio de accidentes, la mayora de pequea importancia, pero algunos de graves consecuencias, causados por descuido o falta de atencin en el trabajo. En el sentido de prevencin de accidentes desnecesarios, se recomienda la observacin rigurosa de las precauciones indicadas a seguir:

Trabajar siempre protegido por la bata.

No fumar dentro del laboratorio.

Al prender el mechero, tener el cuidado de no abrir la llave del gas antes de que tenga a la mano la llama que debe prender el gas.

No trabajar con sustancias inflamables (alcohol, ter) en las proximidades de la llama.

Jams calentar un sistema completamente encerrado.

Es peligroso calentar o mezclar cualquier especie de reactivos prximo al rostro.

Mantener el rostro tan lejos posible durante las operaciones de calentamiento o de mezcla de reactivos.

Evitar montajes no estables de aparatos, como: soporte de libros, lpiz, caja de fsforos, etc.

No degustar nada en el laboratorio, excepto sea especialmente orientado para hacerlo.

Al verter un lquido del frasco, evitar que escurra en el respectivo rtulo, debiendo protegerlo debidamente.

Los reactivos txicos o corrosivos, como lcalis o cidos, fuertes (cuando muy concentrados), no debern ser medidos por pipetas pero medidos en probetas o en algunos casos, en buretas, o con ayuda de una pera.

Al transferir o manipular sustancias que desprendan humos txicos, hacerlo en el interior de una campana extractora de gases o entonces en un local con buena ventilacin.

cido sulfrico concentrado debe ser adicionado al agua y no lo contrario.

Para calentar soluciones, nunca utilizar, como recipiente, un frasco volumtrico.

En caso de dudas en la ejecucin de cualquier trabajo prctico, buscar siempre el instructor.

II. AMINOACIDOS Y PROTEINAS

1.TITULACION POTENCIOMETRICA DE AMINOACIDOS

I. OBJETIVOS

- Construir con datos experimentales la curva de titulacin de un aminocido.

- Establecer grficamente el punto ISOELECTRICO de los aminocidos.

- Interpretar correctamente la curva de titulacin de los aminocidos.

II. INTRODUCCION

Todos los organismos vivos contienen (- aminocidos, los cuales comparten la misma columna estructural.

H

tomo de carbono- ( (

H3N+ ( C ( COO-

Grupo (- amino ( Grupo (- carboxlico

R

Se puede concluir que este tipo de estructura tiene 3 caractersticas comunes:

- Posee un grupo carboxilo (. La letra alfa indica que este grupo est unido al tomo de carbono central o alfa.

- Posee un grupo alfa amino.

- Contiene una cadena lateral o grupo R, que est enlazada con el carbono alfa.

Todos los aminocidos pueden clasificarse como cidos, neutros o bsicos, segn sea la carga del grupo R a pH = 7.

Los grupos R cidos son portadores de una carga negativa a pH = 7 porque son poderosos dadores. Los 2 alfa aminocidos cidos son el asprtico y el glutmico.

Los grupos R, bsicos llevan una carga positiva a pH = 7 porque reciben protones. Los 3 alfa aminocidos bsicos comunes son la lisina, arginina e histidina.

Los aminocidos tienen un marcado carcter anftero debido a la coexistencia en una misma molcula de grupos cidos y bsicos que se pueden disociar dependiendo del pH.

En solucin cida, los aminocidos se encuentran en la forma con carga neta positiva, y en la solucin alcalina en la forma con carga neta negativa segn lo muestra la figura 1.

H H ((((((( H

( ( (

H ( C ( COOH R ( C ( COO- OH- OH- R ( C ( COO- ( ( ((((((( (

NH2 NH3+ NH2

Forma no disociada In doble Forma cida

( predomina en medio bsico)

H

( R ( C ( COOH

(

NH3+

Forma bsica

( predomina en medio cido)

Figura 1

A pH comprendido entre los 2 pKa, el aminocido se encuentra en la forma de zwitterion o de un in doble que es la forma en que cristaliza y la que se obtiene al disolverlo.

Cuando se titulan los aminocidos con NaOH y HCl puede observarse dos mesetas cuyos valores corresponden a los pKa de los grupos alfa carboxilo y alfa amino respectivamente, segn figura 2.

El punto de inflexin en esa figura corresponde al punto isoelctrico del aminocido, pH al que las especies no aportan carga neta y por lo tanto, no migra en un campo elctrico.

Figura 2

pH 14 14 pH

7 7

0 0

10 5 0 5 10

meq HCl consumidos meq NaOH consumidos

Complete la siguiente grfica. Determine el pI del aminocido representado.

14

13

12 pKa3 = 11,8

11

10

9

pH 8

7

6

5

4 pKa2 = 3,9

3

2

1 pKa1 = 2,1

0

10 20 40 60

Meq de NaOH 0,1 M

III. REACTIVOS

L- alanina 0,1 M

L- cido asprtico 0,1 M

L- arginina 0,1 M

L- glicina 0,1 M

Buffers estandarizados pH 3 y pH 9

IV. MATERIALES

Potencimetro

2 vasos de precipitados (50 y 100 ml)

1 agitador magntico

1 bureta (50 ml)

1 soporte de bureta

1 varilla de vidrio

V. MATERIAL DE PRUEBA

Soluciones de aminocidos

VI. PROCEDIMIENTO

1. Calibracin del potencimetro

Calibrar el potencimetro con dos soluciones estandarizadas.

2. Determinacin de un punto isoelctrico de un aminocido.

En un vaso de precipitados, medir 50 ml de una solucin de aminocidos (alanina, arginina y asprtico). Medir el pH inicial del aminocido.

Proceder a titular con HCl 0,1 M adicionando lentamente y tomando el pH despus de cada adicin, hasta que se haya consumido ms de 10 ml de cido.

Desechar el titulado, lavar el vaso y medir nuevamente 50 ml del mismo aminocido y repetir el procedimiento con NaOH 0,1 M.

En el caso del cido asprtico se debe continuar adicionando NaOH hasta que se hayan consumido ms de 20 ml de lcali.

Con los datos del pH frente al de los miliequivalentes (2ml = 1 mEq) de cido o base consumidos, hacer figuras en las que el pH se grafique en las ordenadas y en las abcisas, los miliequivalentes de cido (hacia la izquierda) y lcali (hacia la derecha) consumidos. A partir de la figura, determinar el pH en el punto isoelctrico (pI) y los valores de pK del aminocido con cido y con base.

VII. CONSULTA

a) Registrar en una tabla los resultados obtenidos.

b) Dibujar y determinar el pI del aminocido.

c) Determinar el pI de los aminocidos que aparecen en la tabla No. 1.

TABLA 1

Aminocido pK1 pK2 pk3 Glicina 2,4 9,7 _

Alanina 2,3 9,9 _

Glutmico 2,2 4,3 9,7

Histidina 1,8 6,0 9,2

Treonina 2,6 10,4 _

Lisina 2,2 9,2 10,8

Asprtico 1,9 3,6 9,6

d) Determinar el pI de los siguientes aminocidos:

Valina

Triptfano

- Metionina

2. SEPARACION Y IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS POR ELECTROFORESIS

I. INTRODUCCION

La electroforesis es una tcnica analtica de separacin fundamentada en la migracin de partculas cargadas cuando sobre la accin de un campo elctrico. Es una tcnica utilizada para la separacin de mezclas de compuestos biolgicos, siendo muy eficiente en la separacin de mezclas de aminocidos, pptidos o protenas.

Sistema bsico de electroforesis

soporte

+ nodo ctodo -

solucin tampn solucin tampn

Fuente de alimentacin (Amperagen/Voltagen)

Una diferencia de potencial es establecida entre dos cubas, conteniendo solucin tampn, por la conexin de dos electrodos a una fuente de alimentacin (amperagen/voltagen). El circuito es completado por una tira de material poroso saturado con solucin tampn (soporte) que tiene las extremidades sumergidas en cada cuba. Compuestos cargados positivamente, en el pH de la solucin tampn conocida irn migrar a travs del soporte para el ctodo (electrodo negativo), compuestos cargados negativamente irn migrar para el nodo (electrodo positivo) y compuestos elctricamente neutros permanecern en el punto de aplicacin (origen). Estos movimientos pueden ser influenciados por la intensidad de corriente elctrica, por la carga lquida de las molculas, por la forma y tamao de las molculas, y por electrosmosis (dependiendo del soporte). La carga lquida de un aminocido en un dado pH es una funcin de los valores de pK de sus grupos ionizables. En una solucin con pH que corresponde al punto isoelctrico del aminocido (pH en el cual el numero de cargas positivas se equivalen al numero de cargas negativas) el aminocido se presenta elctricamente neutro y no hay migracin en campo elctrico. El mismo comportamiento es presentado por pptidos y protenas, donde todos los grupos ionizables de sus radicales contribuyen para la carga total de la molcula.

Tipos de soportes ms usados en electroforesis de aminocidos y protenas: papel de filtro, acetato de celulosa, gel de almidn y de policriamida.

II. OBJETIVOS

Separar una mezcla de aminocidos e identificar los componentes de la mezcla por comparacin con estndares.

Comprender sus propiedades inicas a travs del comportamiento electrofortico de los aminocidos.

III. MATERIAL

Tampn de cido actico/acetato (pH 4,6)

Solucin de glicina, cido asprtico, arginina y mezcla de estos aminocidos

Solucin de ninhidrina en acetona

Tiras de papel de filtro (2 x 15 cm)

Tubos capilares

Nebulizador

Estufa

Aparato de electroforesis

IV. PROCEDIMIENTO

Marcar el centro de la tira de papel con una lnea sombreada a lpiz.

Identificar una extremidad como polo + y la otra como polo -.

Escribir el nombre de la muestra a ser aplicada en una de las extremidades del papel.

Ejemplo: tira de papel donde ser aplicada una solucin de glicina

- Gly +

lnea de aplicacin de la muestra

Cuidado!! Evite tocar con los dedos el papel.

A seguir, aplicar la muestra (solucin de aminocidos) con ayuda del tubo capilar, a lo largo de la lnea sombreada, buscando evitar que la solucin de aminocidos se derrame en el papel.

Repetir la aplicacin por ms dos veces.

Ejemplo: rea de aplicacin de la muestra: mximo 0,5 cm de cada lado de la lnea de cada lado de aplicacin segn esquema

- Gly +

lnea de aplicacin de la muestra

Dejar secar al aire.

Embeber la tira en solucin tampn retirando el exceso con papel higinico.

Colocar la tira de papel en el aparato de electroforesis, siendo que las extremidades de la tira deben permanecer mergulladas en la solucin tampn contenida en las cubas.

Prender el aparato manteniendo el voltaje en 300V por hora.

Retirar el papel y llevar a la estufa hasta que est seca.

Pulverizar con solucin de ninhidrina (revelador de aminocidos) la tira de papel.

Llevar nuevamente a la estufa.

Observar el surgimiento de lneas de color violeta evidenciando la migracin de los aminocidos a lo largo de la tira de papel.

Despus de la revelacin, identificar los componentes de la mezcla por comparacin con los estndares.

Explicar el comportamiento inico de cada aminocido en las condiciones establecidas.

3. SEPARACION DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA

I. INTRODUCIONLa identificacin de sustancias orgnicas tiene despertado el inters de los analistas en el sentido de aprimorar tcnicas conocidas y desarrollar nuevos mtodos de anlisis cada vez ms rpidos y eficientes.

La cromatografa es una tcnica de separacin de sustancias afines que tuvo sus primeros ensayos hechos por el botnico ruso Tswett en 1900. An, solamente en 1906 que este investigador consigui la separacin de pigmentos de hojas. La tcnica iniciada por Tswett para la separacin de sustancias coloreadas (cromos - color) tambin es vlida para sustancias incoloras, desde que haya un revelador. Este invento qued 25 aos olvidado, cuando en 1931 dos otros investigadores, Kuhn y Lederer, usando la tcnica de Tswett conseguirn aislar el ( y (-caroteno de otros pigmentos foliares.

La cromatografa tiene evolucionado desde entonces y hoy contamos con diversas tcnicas tales como:

Cromatografa en papel

Cromatografa en capa delgada

Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de exclusin molecular

Cromatografa de fase gaseosa y lquida

Genricamente, podemos decir que los componentes de la mezcla son distribuidos en dos fases, una estacionaria y otra mvil. La separacin puede ser efectuada de tres modos:

Adsorcin: los componentes son diferencialmente retenidos en la fase estacionaria por fuerza fsica superficial

Particin: los componentes son distribuidos entre un lquido existente en el soporte slido (fase estacionaria) y otro en la fase mvil.

Intercambio inico: cuando se forman interacciones inicas entre la fase estacionaria y el compuesto que se desplaza con el solvente (fase mvil).

La separacin es fundamentada en el coeficiente de particin entre las dos fases (estacionaria y mvil). El coeficiente de particin (() es definido como la relacin entre la concentracin del soluto en la fase estacionaria y la concentracin del soluto en la fase mvil.

( S ( E

( = ( S ( M

En la cromatografa en papel y en capa delgada la distancia recurrida por la muestra relacionada con la distancia recurrida por el solvente, nos da origen a un factor llamado Rf, que es constante para una sustancia en las mismas condiciones de trabajo.

Distancia recurrida por la muestra

Rf = ----------------------------------------------------------- Distancia recurrida por el solvente

Rf ( 1

II. CROMATOGRAFIA EN PAPEL

Es un tipo de cromatografa que se basa en la particin lquido / lquido. El papel acta como soporte para la fase estacionaria lquida (H2O del papel). El papel debe ser uniforme, o sea, sus fibras distribuidas en el mismo sentido; ser puro, con ausencia de sustancias no celulsicas, siendo que el mas usado es el Whatman no. .

El solvente es escogido segn su polaridad. En orden creciente de carcter polar tenemos: ter de petrleo, ciclo-hexano, benceno, n-butano, n-propano, H2O y piridina. En general se trabaja con un sistema de solventes que estn en proporciones definidas. La muestra aplicada se distribuir de acuerdo su afinidad por el H2O del papel (fase estacionaria) y el sistema de solvente (fase mvil).

La migracin de las sustancias podr ser ascendente donde verificase actuacin de la fuerza de capilaridad, o descendente donde acta la fuerza de gravedad. La migracin en una sola direccin es denominada corrida unidireccional. Podemos tambin utilizar la corrida bidireccional. El solvente desplaza primero en una direccin, se seca el papel, se da en el mismo un giro de 90(, colocndolo nuevamente en una cmara cromatogrfica con otro sistema de solvente diferente del primero.

III. OBJETIVO

La presente tcnica tiene como objetivo capacitar al alumno a ejecutar una corrida cromatogrfica en papel.

Calcular el Rf, interpretar el cromatograma e identificar las muestras.

IV. MATERIAL

Papel de filtro (Whatman no. 1)

Muestra (solucin de aminocidos)

Soluciones estndar de aminocidos (0,1 M)

Solvente: mezclar en volmenes 100 partes de n-butanol, 30 partes de cido frmico y 25 partes de agua.

Revelador: solucin de ninhidrina al 0,1% en acetona

Cmara cromatogrfica

Tubos capilares

Estufa a 100(C

Nebulizador

Nota: Evite tocar el papel con la mano.

V. PROCEDIMIENTO:

Cortar el papel con las dimensiones 15 x 15 cm.

Trazar con lpiz al largo de una de las extremidades a 2,5 cm de las bordas.

Marcar puntos distintos con distancias adecuadas a lo largo de la raya para aplicacin de la muestra y de los estndares.

Aplicar crculos de solucin de aminocidos de ( 0,5 cm de dimetro usando tubos capilares.

Con auxilio de una grapadora dar la forma cilndrica al papel.

Introducir el cilindro de papel en la cmara cromatogrfica, teniendo el cuidado de no dejar el solvente tocar en las manchas formadas en los puntos de aplicacin de las muestras.

Sellar la cmara y dejar que el solvente se desarrolle hasta ( 1 hora o hasta alcanzar 1 cm de la extremidad superior del papel.

Retirar el cilindro de papel y marcar con lpiz la altura alcanzada por el solvente (frontera del solvente).

Dejar secar en estufa .

Revelar con ninhidrina al 0,1% en acetona y secar. Despus de secado aparecern las manchas que sealan la presencia de los aminocidos.

Identificar los aminocidos de la muestra por comparacin con los estndares y calcular los Rfs.

Conclusin e interpretacin.

Nota: Evitar que la ninhidrina toque en su piel.

4. DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE UNA PROTENA

I. OBJETIVO Hallar el punto isoelctrico de la casena.

II. TEORIA

Las unidades fundamentales de una protena son los aminocidos, los cuales contienen en sus molculas grupo amino y grupo carboxilo; por lo tanto tienen propiedades cidas y bsicas.

Los aminocidos de las protenas se pueden obtener por hidrlisis cida o enzimtica. Estos aminocidos son fcilmente solubles en agua y existen como iones bipolares conocidos como zwitterion, no como molculas ionizadas.

Dependiendo del pH de la solucin, los aminocidos pueden tener carga positiva, negativa o neutra; igual comportamiento tiene las protenas.

Existe un pH en el cual los aminocidos y las protenas forman especies sin carga; en este valor de acidez estas molculas no migran en un campo elctrico, y este valor se le llama punto isoelctrico o pH isoelctrico.

En el pH isoelctrico las protenas tienen la menor solubilidad, conductividad, presin osmtica y la menor viscosidad.

III. REACTIVOS

- 0,25 g de casena

- NaOH 1N

- CH3COOH

IV. MATERIALES

- Vaso de precipitado de 100 ml.

- 4 buretas

- 9 tubos de ensayoV. PROCEDIMIENTOEn un vaso de 100ml limpio y seco, pesar 0,25g de casena. Agregar luego con exactitud 20ml de agua y 5 ml de NaOH 1N, agitar hasta obtener una disolucin total. Adicionar 5ml de cido actico 1N. Determinar el punto isoelctrico de una protena.

Pasar el contenido del beaker a un baln volumtrico de 50ml, lavando las paredes del beaker con suficiente agua destilada y llevando el volumen hasta la marca. Mezclar muy bien. La solucin deber quedar clara y limpia, de lo contrario debe filtrarse o repetir el procedimiento.

Preparar cuatro buretas de 25 ml y rotularlas as:

- Bureta No. 1, agua destilada

- Bureta No. 2, cido actico 0,1 N

- Bureta No. 3, cido actico 0,01 N

- Bureta No. 4, cido actico 1 N

Las soluciones 2 y 3 se preparan por dilucin a partir de la solucin 1N.

Colocar en la gradilla los tubos de ensayo y preparar las siguientes soluciones:

Tubo No.123456789

Agua destilada8,47,758,758,587517,4

Ac.actico ,01 N0,621,25-------

Ac.actico 0,1 N--0,250,51248-

Ac. actico 1 N--------1,6

pH resultante5,95,65,354,74,44,13,83,5

Agregar a cada tubo 1ml de la solucin de casena; agitar el tubo inmediatamente y dejar reposar 20 minutos.

Usando la escala de cruces, anotar el grado de turbidez de cada tubo; mirar el grado de precipitacin de cada tubo y anotar el pH al que presenta mayor precipitacin. Este pH en el cual se dio la mayor precipitacin, es el ms cercano al pI de la casena.

VI. PREGUNTAS

1. Cual fue el pI hallado por usted en el laboratorio para la casena ?

2. Cul es el pI para la casena y en qu alimento(s) se encuentra en forma abundante?

3. Un a.a. tiene los siguientes pK de acidez: 1,82 6 9,17

Seale si las informaciones son falsas o verdaderas, segn lo anterior:

a. El aminocido es bsico

b. El pI del aminocido es 3,91

c. El pI del aminocido es 7,59

d. El aminocido es cido

e. A un pH de 5, el aminocido se desplazar a ctodo

f. El pI de la arginina debe ser: ( tenga en cuenta su estructura )

- cerca de 7

- muy por debajo de 7

- muy por encima de 7

5. PROTENAS: SEPARACIN Y CARACTERIZACIN

I. INTRODUCCION

Diversas propiedades caractersticas de las protenas globulares en solucin pueden ser utilizadas para separar mezclas de protenas tales como peso molecular, solubilidad, carga elctrica, diferencias en las caractersticas de adsorcin y afinidad biolgica por otras molculas. En ese sentido, varios mtodos de separacin han sido desarrollados como, por ejemplo, centrifugacin, dilisis, precipitacin isoelctrica, fraccionamiento por solventes, electroforesis, cromatografa de intercambio inico, filtracin glica y otros.

Las protenas pueden ser clasificadas, de acuerdo con su solubilidad en diversos solventes, en:

a) Albminas: protenas solubles en agua y soluciones salinas.

b) Globulinas: protenas ligeramente solubles en agua, solubles en soluciones salinas diluidas.

c) Prolaminas: protenas insolubles en agua, pero solubles en etanol 70-80%.

d) Glutelinas: protenas insolubles en agua y etanol, mas solubles en cidos y bases.

e) Escleroprotenas: protenas insolubles en solventes acuosos.

Segn esos criterios de solubilidad, se puede obtener informaciones preliminares sobre las caractersticas de las protenas de un material biolgico.

El efecto de la temperatura tambin se puede observar en relacin a la solubilidad de protenas, siendo por lo tanto utilizado como criterio de separacin. En temperaturas de 0 a 40(C, la solubilidad de las protenas globulares aumenta progresivamente. En el rango de 40 a 50(C la mayora de las protenas se tornan inestables y empiezan a desnaturalizar con prdida de la solubilidad. Entre 60 a 70(C las protenas presentan desnaturalizacin. La desnaturalizacin consiste en el desenrollamiento de la estructura nativa caracterstica de las protenas globulares, pasando a una cadena doblada al acaso. La estructura primaria se mantienen inalterada siendo rotas los enlaces dbiles que estabilizan la estructura terciaria nativa de una protena globular (puentes de H, atracciones electrostticas, interacciones hidrfobas). La ocurrencia de estos fenmenos causa cambios en las propiedades de las protenas como disminucin de la solubilidad y prdida de la actividad biolgica. Entre los diversos agentes desnaturalizantes se pueden citar variaciones bruscas del pH, temperaturas elevadas, solventes orgnicos, radiaciones, urea, sulfato de amonio, cloruro de guanidina, etc.

Una vez aislada la protena, ella puede ser caracterizada por una secuencia de mtodos para evaluar sus propiedades, como, peso molecular, composicin aminoacdica, y la secuencia de aminocidos en la cadena, numero de cadenas peptdicas, etc.

La caracterizacin o el reconocimiento de la porcin protica en un material biolgico puede ser hecha, sencillamente, a travs de reacciones colorimtricas, como la reaccin del Biureto, reaccin xantoprotica, etc.

II. TRABAJO PRCTICO

Separacin de las protenas de la clara del huevo por la solubilidad en agua, identificacin de protenas por la reaccin xantoprotica.

La clara del huevo esta constituida principalmente por protenas (albminas y globulinas). La albmina de la clara del huevo es la ovomucina. Agitndose la clara del huevo con agua se consigue separar la ovalbumina (soluble en agua) de la ovomucina (poco soluble en agua).

La reaccin xantoprotica ocurre cuando las protenas son calentadas con cido ntrico concentrado, formando compuestos amarillos. El cido ntrico reacciona con los compuestos bencnicos formando nitroderivados de color amarillo. En las protenas tenemos aminocidos con anillo bencnico sustituido como la tirosina, el triptfano y la fenilalanina. La reaccin ocurre, por lo tanto, a nivel de los radicales de aminocidos que contiene anillos aromticos y que hacen parte de las cadenas peptdicas de la mayora de las protenas. En medio alcalino la coloracin amarilla se intensifica debido al comportamiento como indicador de los nitroderivados formados. De esta manera, a travs de la reaccin xantoprotica, se puede hacer el reconocimiento de la porcin proteica de un material biolgico.

III. MATERIAL

Clara de huevo

Erlenmeyer de 250 ml

Probeta de 250 ml

Embudo

Papel filtro

Beacker de 250 ml

Bastn de vidrio

Pipetas de 2 ml

Tubos de ensayo

Goteros

cido ntrico concentrado

Hidrxido de sodio al 20%

Solucin de tirosinaIV. PROCEDIMIENTO

1. Tomar una clara de huevo en un beacker. Adicionar aproximadamente 200 ml de agua destilada. Agitar con el bastn de vidrio. Dejar en reposo por algunos minutos.

2. Filtrar un poco del sobrenadante; recoger el filtrado en un erlenmeyer (solucin de ovoalbmina).

3. En un tubo de ensayo adicionar 2 ml de la solucin de ovoalbmina y en seguida 5 gotas de HNO3 concentrado (cuidado: no pipetear el cido ntrico). Observar y explicar los cambios cuando se le adiciona cido a la protena.

4. Tomar un beaker con un poco de agua. Colocar el tubo en bao mara y dejar hervir por 2 minutos. Observar y explicar los cambios (reaccin xantoprotica).

5. Enfriar el material y, cuidadosamente, adicionar hidrxido de sodio en exceso. Observar y explicar lo que ocurre.

6. Repetir el mismo test (a partir del tem 3) utilizando 2 ml de solucin de tirosina. Apuntar y explicar los cambios observados.

6. DOSIFICACION DE PROTEINAS DE LA LECHE POR EL METODO FOTOCOLORIMETRICO DEL BIURET

I. INTRODUCCON

La determinacin cuantitativa de protenas puede ser hecha a travs de varios mtodos. La escogencia del mtodo depender de varios factores tales como: la naturaleza de la protena y de otros componentes en la muestra proteica, la rapidez, la eficiencia y sensibilidad del mtodo. Entre los diversos mtodos se puede citar:

a) Mtodo micro-kjeldahl

Escogido para dosificar protenas en alimentos y muestras clnicas y agriculturas. Es tambin usado para estimar nitrgeno no proteico de una muestra despus de la precipitacin de protenas. La muestra es digerida con cido sulfrico concentrado en presencia de catalizador, sob condiciones donde compuestos de nitrgeno son convertidos a sulfato de amonio. Por destilacin a vapor en presencia de una base fuerte (NaOH), el amonio es liberado y se puede estimar por varios medios. En general case todas las protenas posee 16% de nitrgeno en su composicin, o sea, 1 mg de nitrgeno corresponde a 6,25 mg de protena. As, por la cantidad de amonio formado de una conocida cantidad de muestra, se puede calcular la cantidad de protena presente.

b) Mtodo de Lowry

Puede ser aplicado en material seco o en solucin. Es muy sensible, dosifica 5 (g de protena. El color formado es debido a la reaccin de la protena con el cobre alcalino del reactivo y a la reduccin de las sales fosfomolibdato-fosfotungstato en el reactivo por los aminocidos aromticos de la protena (Tyr y Trp). El color producido es medido en el foto colormetro siendo proporcional a la cantidad de protena en la muestra.

c) Mtodo de la Absorcin en el Ultravioleta

Muchas protenas absorben en el ultravioleta en la regin de 280 (m debido a la presencia de tirosina y triptfano. Como la cantidad de esos dos aminocidos es generalmente constante en muchas protenas, se puede estimar la concentracin de las protenas como siendo proporcional a la absorbancia a 280 (m. Soluciones puras de protenas conteniendo 1 mg de protena/ml presentan absorbancia en 280 (m igual a 1,0 cuando en cubetas de dimetro de 1 cm. cidos nucleicos son contaminantes en extractos proteicos y presentan fuerte absorcin en 260 (m, que enmascara la absorcin por la protena. Una frmula es usada para solucionar el problema:

Concentracin de protena (mg/ml) = 1,55 . D.O.280 - 0,76 . D.O.260

d) Mtodo del Biuret

Est basado en el hecho de que compuestos conteniendo dos o mas enlaces peptdicos forman un complejo con sal de cobre en soluciones alcalinas. El color desarrollado es debido a un complejo de coordinacin entre el Ion cuprico y cuatro grupos NH de dos cadenas peptdicas segn lo observado abajo:

................ NH - C - COO - NH - C - COO - NH - C - COO - NH .................

( ( (

R R R

Cu++

............... NH - C - COO - NH - C - COO - NH - C - COO - NH ..................

( ( (

R R R

El procedimiento de este mtodo es simples y rpido, adems de eso, ofrece una buena estimativa de la cantidad de protenas en muestra analizada.

El mtodo es llamado mtodo del "Biuret", porque el Biuret resulta reaccin positiva semejante a la protena cuando colocada en presencia de sal de cobre en medio alcalino. La estructura del Biuret es la siguiente:

H2N - CO - NH - CO - NH2.

No hay prcticamente ninguna otra sustancia presente en materiales biolgicos y que pueda interferir en esto mtodo. Adems el desarrollo del color no es el mismo con todas las protenas y los resultados pueden ser afectados por la presencia de lpidos, de ah la recomendacin de utilizarse muestras desengrasadas.

El mtodo puede ser usado para varios tipos de alimentos, adems de la leche, entre ellos, carnes y cereales, observndose algunos cambios y adaptaciones.

II. TRABAJO PRCTICO

En este experimento ser hecho, inicialmente, la separacin de la casena (principal protena de la leche), a travs de precipitacin isoelctrica.

Alcanzndose el punto isoelctrico de la casena (pH 4,6), esta se precipita, restando en solucin la lactoalbmina y lactoglobulina, cuya proporcin en la leche es considerablemente menor relacionado con la casena. La solubilidad de la mayora de las protenas globulares esta influenciada por el pH del medio en que se encuentran. El pH en que la protena tiene su menor solubilidad es en su pH isoelctrico, definido como el pH en que la molcula no presenta carga elctrica efectiva y es incapaz de desplazarse en un campo elctrico. En esas condiciones, no existe repulsin electrosttica entre las molculas proteicas vecinas y ellas tienden a coalescer y precipitar. Entretanto, en valores de pH arriba o abajo del punto isoelctrico, todas las molculas poseen una carga efectiva de misma seal. Como consecuencia, ellas irn repelar una con las otras, evitando la coalescencia de las molculas aisladas en agregados insolubles. De ese manera, en valores de pH arriba o debajo de su pH isoelctrico la solubilidad de las protenas se eleva acentuadamente. Como las protenas presentan punto isoelctrico diferente, ellas pueden ser separadas unas de las otras por precipitacin isoelctrica.

Despus de la separacin de las protenas de la leche, ser hecha la dosificacin cuantitativa de las protenas basndose en la ley de Lambert Beer: "la concentracin" es directamente proporcional a la absorbancia (A) o densidad ptica (D.O.).

Despus la reaccin del reactivo de Biuret con la protena, la intensidad del color desarrollado es medida en el fotocolormetro con una intensidad de onda de 540 (m y comparada con patrones de protenas tratadas de la misma manera, usndose los datos en la formula a seguir para determinar la concentracin de protena en la muestra.

Absorbancia de la muestra

Conc. de la muestra = x conc. del patrn

Absorbancia del patrn

Al efectuarse estos clculos se hace las debidas correcciones debido a las diluciones de las muestras.

Debe considerarse an en este mtodo que su sensibilidad est alrededor de concentracin de 1,0 a 5,0 mg/ml, por lo tanto muestras que contengan concentraciones de protenas debajo de ese rango, no deben ser analizadas por este mtodo, pus el resultado no ser real; muestras de concentracin arriba de ese rango deben ser diluidas adecuadamente.

III. MATERIAL

Erlenmeyer

Bureta

Pipetas

Probeta

Embudo

Tubos de ensayo

Fotocolormetro

Papel de filtro

Solucin estndar de casena (concentracin 1 mg/ml)

cido clorhdrico al 2%

Leche descremada

Reactivo de Biuret: * Sulfato de cobre cristalizado

Tartarto doble de sodio y potasio

Agua destilada

Hidrxido de sodio al 10%

IV. PROCEDIMIENTO

En esa prctica hay necesidad de preparar dos muestras de leche.

a) Preparo de muestra I:

- En un erlenmeyer adicionar 25 ml de leche y 25 ml de agua destilada.

Homogenizar, acrecentar HCl, gota a gota, utilizndose una bureta, con agitacin constante, hasta que la leche coagule. Anotar en volumen de cido gastado, pues este dato ser utilizado en los clculos finales.

Filtrar (papel de filtro) y usar el filtrado posteriormente para la dosificacin. En esta muestra I tenemos entonces la lactoalbmina y lactoglobulina ya que la casena fue separada por precipitacin isoelctrica.

El pH de la leche es aproximadamente 6.9 y al adicionarle HCl el pH va bajando hasta llegar a 4.6 (punto isoelctrico de la casena) y en ese pH la casena precipita separndose de la lactoalbmina y lactoglobulina.

b) Preparo de la muestra II

Diluir 1 ml de leche con 19 ml de agua destilada, hacindose por lo tanto una dilucin 1/20. Homogenizar.

En esta muestra no ser separada ninguna de las 3 protenas tenindose por lo tanto en ella las protenas totales.

c) Dosificacin de las muestras y estndar

Enumerar 4 tubos de ensayo y distribuir las soluciones segn el cuadro abajo:

Tubo H2O Protena Muestra I Muestra II Reactivo de

(ml) estndar (ml) (ml) (ml) Biuret (ml)

1 (blanco) 3 12

2 3 12

3 3 12

4 3 12

Mezclar el contenido de los tubos por inversin y dejar en reposo por 15 min para que ocurra la reaccin de complejacin del ion cprico con las cadenas peptdicas de las protenas.

Hacer la lectura de las soluciones en el fotocolormetro a 540 (m usando el contenido del tubo 1 (blanco) para cerrar el equipo.

Hacer los clculos usando la frmula citada anteriormente hacer las correcciones necesarias debido a las diluciones hechas en las muestras.

Reportar los resultados en g de protena por 100 ml de leche y calcular el porcentaje de casena por diferencia entre la muestra I y II.

7. ENSAYOS CON PROTEINAS

I. OBJETIVO

Identificar algunas reacciones de las protenas.

II. TEORA

Las protenas son molculas de alto peso molecular, que contienen carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y con frecuencia azufre.

Las unidades fundamentales de las protenas son los aminocidos que son compuestos orgnicos que contienen grupos amino y carboxilos, por lo tanto poseen propiedades cidas bsicas.

Los aminocidos se unen por enlaces peptdicos para formar dipptidos,

tetrapptidos, oligopptidos y polipptidos.

Las protenas se consideran que estn formadas por polipptidos que

adquieren diferentes configuraciones espaciales, determinando as la

estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las protenas.

Las propiedades fisicoqumicas de las protenas estn determinadas por la

secuencia de aminocidos, su configuracin, las fuerzas interinicas, puentes

de hidrgeno, etc.

III. PARTE EXPERIMENTAL

Preparacin de la muestra*:

- Batir una clara de huevo y acrecentar 6 veces su volumen de agua.

1- Desnaturalizacin

A 3 tubos de ensayo (A, B Y C), adicionar 3 ml solucin albmina.

Al tubo A caliente hasta coagulacin, al tubo B adicione 1 gota de HCl concentrado y al tubo C adicione 1 gota de NaOH.

Anotar observaciones.

* CADA GRUPO DEBE TRAER UN HUEVO.

2 - Solubilidad en Etanol

A un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solucin de albmina y 5 ml de etanol.

Observar lo ocurrido.

3- Reaccin de Biuret

En un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solucin de albmina, 1 ml de NaOH al 10% y 1 gota de CuSO4.al 1%.

- Anotar observaciones.

4- Reaccin de precipitacin de cationes

- En un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solucin de albmina y 3ml CuSO4 al 10%.

Anotar observaciones.

III. ENZIMAS

8. ENZIMAS: AMILASA SALIVAL

I. OBJETIVOS

- Comprobar la accin de la amilasa salival sobre el almidn.

- Analizar los factores que afectan la velocidad de reaccin de las enzimas.

- Comprobar la accin de la amilasa con reactivos de Fehling y de Lugol.

II. TEORIA

Las enzimas son protenas conjugadas, generalmente de estructura globular. Su principal propiedad es ser catalizadores biolgicos. Al ser catalizador, no interviene en el producto final.

Las enzimas poseen un sitio activo en forma de hendidura donde reacciona con el sustrato por medio de enlaces covalentes. Otro aspecto importante de las enzimas es su especificidad, en cuanto a sustrato, temperatura y pH. Cada enzima tiene condiciones ptimas para su funcionamiento.

Las enzimas necesitan una coenzima o cofactor. Este cofactor, es generalmente un compuesto orgnico: un nucletido libre, aunque puede ser un mineral.

III. PARTE EXPERIMENTAL

Calentar agua a 40( C en un beaker, y tomar un poco en la boca.

Enjuagar muy bien.

Recoger el enjuagado, y repetir el proceso 2 veces.

Filtrar la solucin obtenida

b)

- Tomar 3 tubos de ensayo y marcarlos: A, B y C

Agregar a cada uno 5 ml de solucin de saliva

Al tubo A, hervir por 5 minutos y enfriar

El tubo B, no se le echar nada.

Al tubo C, acrecentar 2 ml de HCl 1M.

Mezclar bien el contenido de todos los tubos.

Adicionar 5 ml almidn 2% a cada tubo.

Realizar pruebas de Fehling y Lugol a los 3 tubos.

Colocar los tres tubos a 40 ( C.

Agitar cada 5 minutos.

Realizar pruebas de Lugol y de Fehling a cada 10 minutos hasta observar cambio.

NOTA: Realizar las pruebas de lugol en vidrio de reloj.

9. ESTUDIO DE LA POLIFENOLOXIDASA (PPO) EXTRAIDA DE LA PAPA

I. INTRODUCION

Las enzimas son protenas sintetizadas en la clula viva, que catalizan o aceleran una reaccin qumica. Una de las caractersticas principales de la clula es su capacidad de hacer con que las reacciones complejas se procesen rpidamente a la temperatura del medio circundante. Estas transformaciones se deben a las protenas llamadas enzimas, que son los catalizadores biolgicos. Las enzimas comparadas a los catalizadores no proticos tales como Pt, H+, Cu++, se destacan por la notada especificidad a los sustratos debido a su compleja estructura protica. Muchas veces una enzima exige un componente adicional para que pueda ejercer su funcin, estos componentes son los cofactores que pueden ser: grupos prostticos, coenzimas y activadores metlicos. Las enzimas estn sujetas a influencia de varios factores como: pH, calor, cidos y bases fuertes, pudiendo perder su actividad biolgica "desnaturalizndose". Para su perfecto funcionamiento es necesario, que todos los factores arriba mencionados sean bien definidos. Se evala la actividad de una enzima rutinariamente por el surgimiento de los productos o por el desaparecimiento del sustrato.

II. OBJETIVOS

Extraer la PPO de la papa.

Verificar su especificidad en lo relacionado a diversos compuestos.

Testar la influencia de la temperatura sobre su actividad.

La PPO es una enzima cprica con un pH ptimo alrededor de 6 a 7, presentando su mayor actividad enzimtica a 37(C. Esta enzima cataliza la reaccin de varios difenoles, en la posicin orto y para, llevando estos sustratos a quinonas correspondientes con surgimiento de color.

Tales reacciones comnmente ocurren en vegetales promoviendo el oscurecimiento enzimtico de ciertos frutos y hojas como: pera, durazno, manzana, hojas de tabaco y caf, cuando su tejido es magullado (herido). Estos oscurecimientos poden alterar el sabor, apariencia y hasta mismo el valor nutricional. Algunos alimentos por tradicin son deseados el oscurecimiento como: caf, cervezas, t, etc. La formacin de estas quinonas es dependiente de la enzima y del oxgeno, siendo que la intensidad de la reaccin es verdaderamente evaluada por el consumo de oxgeno. La industria busca prevenir estos oscurecimientos adicionando productos como: CH3I, CH3OH, (CH3)2SO4, cido ascrbico, SO2, a pesar de traer ciertos inconvenientes el uso de algunos de estos (SO2, CH3OH), o an, alterando el pH y la temperatura.

En esta prctica varios compuestos sern tratados con el extracto conteniendo PPO, con la finalidad de verificar la especificidad de esta enzima con varios sustratos, que podr ser observada con el aparecimiento del color oscuro. "Sustratos" como: tirosina, cido qunico, clorognico, cido glico, hidroquinona, glucosa, sern testados para nuestra observacin.

Los meta difenoles raramente son sustratos para las fenolasas y en algunos casos otros sustratos debern antes seren hidroxilados para transformaren en las quinonas correspondientes.

OH OH O Tirosina 3,4 dihidroxifenilalanina 3,4 benzoquinonilanina

Dentro de los sustratos recomendados los difenoles en posicin orto presentan oscurecimiento enzimtico ms rpido y acentuado.

III. MATERIAL Y REACTIVOS

cido cafico

cido clorognico

cido quinico

Glucosa

Floroglucinol

Resorcinol

cido glico

Catecol

Fenol

Tirosina

Hidroquinona

Buffer fosfato 0,1 M pH 6,5

Tubos de ensayo

Bao mara

Pipetas

Licuadora

Tela de lino o gaza

Papa

Termmetro

Vasos

Erlenmeyer

IV. PROCEDIMIENTO

a) Especificidad

El extracto de PPO es preparado licuando una porcin de papa con 150 ml de buffer fosfato 0,1 M pH 6,5.

Filtre en tela de lino o gasa, deje decantar (5 minutos), retire el sobrenadante que es la fuente de PPO.

Enumere los tubos de 1 a 12, y en cada tubo adicione 1 ml del extracto de PPO, 1 ml de sustrato, homogeneice, colocando en bao mara a 37(C, durante 5 minutos.

El tubo 1 ser el blanco y contendr a penas 1 ml de agua y 1 ml del extracto de PPO. A mayor especificidad ser observada en los tubos donde aparezca el color ms oscuro el que demuestra la especificidad de la enzima por el sustrato resultando en las quinonas correspondientes.

Comente su observacin y justifique.

b) Influencia de la temperatura

Tome cerca de 3 ml del extracto conteniendo PPO y le de un ligero calentamiento.

A seguir, coloque en un tubo de ensayo 1 ml de este extracto y 1 ml del sustrato que mejor reacciono con PPO en la prueba anterior. Deje por 5 minutos a 37(C.

Comente su observacin y justifique.

En otro tubo de ensayo coloque 1 ml del extracto de PPO y deje en bao de hielo por 5 minutos. Adicione 1 ml del mismo sustrato tambin mantenido a 0(C. Homogeneice. Deje descansar por 5 minutos en bao de hielo.

Comente su observacin y justifique.

En cul temperatura (0(C, 37(C, calentamiento) la enzima presento mayor actividad?

10. ENZIMAS Y SU DESEMPEO EN LOS ALIMENTOS (CHO)

I. INTRODUCION

La saliva es producida por las glndulas partidas submaxilares y sublinguales, as como tambin por las glndulas bucales y membranas mucosas de la boca, garganta y esfago.

La saliva contiene un 99% de agua. El material slido que contiene, incluye ptialina (amilasa salivaria), varias protenas y otras sustancias como urea, cido rico, colesterol, calcio, sodio, potasio, fosfato, etc. El pH promedio es de 6,8.

PARTE A

Determinacin del pH ptimo en la accin de la ptialina.

II. PROCEDIMIENTO

- Coloque en una gradilla 5 tubos de ensayo y mrquelos pH 8; 7,4; 7,0; 6,8; 5,2.

- Aada a cada tubo 5 ml de la solucin amortiguadora de su respectivo pH. A continuacin aada a cada tubo 2 ml de almidn al 1%, 1 ml de cloruro de sodio al 0,1 M, 1 ml de saliva diluida* y 3 gotas de lugol.

- Coloque todos los tubos numerados, en un bao de agua a 38( C y determine cual tubo alcanza el punto acrmico ( sin color ).

* 1 ml de saliva en 9 ml de agua destilada.

III. PREGUNTAS

a) Cul es el pH ptimo para la Ptialina?

b) Cmo explica la accin incontinua de la Ptialina en el estmago?

c) Qu ocurre cuando se alcanza el punto acrmico?

PARTE B

Influencia de la temperatura sobre la accin de la Ptialina.

II. PROCEDIMIENTO

- Tome 4 tubos de ensayo y reprtalos as:

El primero No. 1, en mezcla de agua-hielo

El segundo No. 2, temperatura ambiente

El tercero No. 3, en bao mara a 38( C.

- Aada a cada uno de los 3 primeros tubos, 5 gotas de saliva diluida ( 1:9 ) y 2 ml de solucin de almidn al 1% y mezcle bien. Al cuarto tubo aada 2 gotas de saliva diluida que haya sido calentada en agua hervida por 5 minutos, mas los 2 ml del almidn al 1%.

- A intervalos de 5 minutos, saque una muestra de cada tubo y pruebe con 2 gotas de yodo 0,01M y note la velocidad de digestin en cada tubo; cuando no haya color, se da por terminada la reaccin.

III. PREGUNTAS

a) Cul tubo alcanza primero el punto acrmico?

c) Qu significa que los otros tubos permanezcan iguales?IV. CARBOHIDRATOS

11. IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS

I. OBJETIVOS

Al finalizar esta prctica, el estudiante estar en capacidad de:

- Reconocer la presencia de carbohidratos en una sustancia orgnica, utilizando reactivos de Molisch Antrona.

- Diferenciar un carbohidrato reductor de otro no reductor, de acuerdo a la formacin de un precipitado de color amarillo o rojo ladrillo, en presencia del reactivo de Fehling, Benedict o Tollens.

II. MATERIAL Y EQUIPO

- Tubos de ensayo

- Esptula

- Beaker

- Bao de Mara

- Antrona

- Molisch

- Acido sulfrico concentrado

- Hielo

- Agua

- HCl concentrado

- Fehling

- Lugol

- Tollens

- Seliwanoff

- Acetado de sodio

- HCl 10%

- NaOH 10%

- Sacarosa 5%

- Glucosa 5%

- Fructosa 5%

- Almidn en polvo

- Clorhidrato de fenilhidrazona

II. TEORIA

Los hidratos de carbono son compuestos que contienen adems de carbono, hidrgeno y oxgeno en proporcin de 2 a 1. Este nombre tambin se usa para algunos de sus derivados en los que la definicin dada no se cumple estrictamente. Los carbohidratos ms simples contienen C, H, O pero muchas de las que existen en la naturaleza contienen tambin P, S y/o N.

Cx(H2O)y

Han sido definidos como polihidroxialdehidos o polixidroxicetonas.

Segn el grupo carbonlico que presenten, se clasifican como aldosas y cetosas.

Se dividen en 4 grandes grupos:

a. Monosacridos: aquellos carbohidratos que no son hidrolizables a compuestos ms simples. Ej: glucosa

b. Disacridos: un carbohidrato que por hidrlisis da dos molculas de monosacridos. Ej: sacarosa, maltosa, etc.

c. Oligosacridos: son los carbohidratos que por hidrlisis, generan entre 2 y 10 unidades de monosacridos. Ej: rafinasa, estaquiosa.

d. Polisacridos: al hidrolizarlos se obtiene ms de 10 unidades de monosacridos.

Ej: Almidn, celulosa.

Los carbohidratos y sus derivados se encuentran en casi todas las partes de la clula, desempeando papeles tanto estructurales como funcionales.

Estos compuestos son de importancia fundamental en la biosfera y se elaboran durante la fotosntesis. Por fotosntesis las plantas verdes y las algas pueden usar la energa solar, para sintetizar hidratos de carbono a partir de bixido atmosfrico y agua. Muchas plantas almacenan grandes cantidades de hidratos de carbono, que en algunos casos, son consumidos por el hombre y los animales para su alimento. Despus de que los carbohidratos complejos han sido ingeridos, la molcula se rompe en el estmago e intestinos, dando glucosa, la cual es luego oxidada a CO2 y H2O, o es almacenada temporalmente como glicgeno en el hgado y los msculos.

En el hombre ms del 60% de los requerimientos totales de energa proviene de la oxidacin de los hidratos de carbono.

En esta forma los animales, que no pueden realizar fotosntesis, pueden aprovechar la energa solar.

CO2 + H2O

Energa solar

CO2 + H2O CO2 + H2O

Energa

Cx(H2O)y Cx(H2O)y

Plantas verdes Animales

O2 O2 Ciclo del carbono en la biosfera

IV. PARTE EXPERIMENTAL

1. Reacciones Genricas de los Carbohidratos

1.1. Reaccin de la Antrona

El H2SO4 concentrado, hidroliza enlaces glicosdicos para dar monosacridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus derivados. Estos productos se combinan con antrona dando un complejo azul-verdoso.

El procedimiento es el siguiente: en tubos de ensayo a aproximadamente 2 ml de las soluciones problemas, agregue 5 gotas del reactivo de Antrona; agite lentamente y observe el cambio de color.

1.2. Reaccin de Molisch

El fundamento es similar al de la reaccin de antrona, excepto que el furfural se combina con (- naftol sulfonado, originando un complejo prpura.

El procedimiento es el siguiente: agregue 2 gotas de la solucin de (- naftol a 2 ml de la sustancia problema. Aada cuidadosamente por las paredes del tubo aproximadamente 1 ml de H2SO4 concentrado hasta que se formen dos capas , observe cuidadosamente cualquier cambio de color en la interfase de los dos lquidos.

Repita el procedimiento para cada una de las muestras problemas disponibles, y tambin con el agua en vez de la muestra problema.

1.3. Reacciones de los Azcares Reductores

En la prctica se usa una solucin alcalina de una sal de cobre y un compuesto orgnico, que contiene OH alcohlico bajo estas condiciones, el cobre forma un complejo soluble y el reactivo es estable; ste complejo en presencia de sustancias reductoras y calor se precipita a xido cuproso de coloracin parda, as:

2 Cu(OH)2 ( CU2O + H2O

Los carbohidratos que poseen un aldehdo libre o potencialmente libre o un grupo cetnico, tienen propiedades reductoras en solucin alcalina.

1.3.1. Reaccin de Fehling En tubos de ensayo mezcle 2 ml de la solucin A de Fehling con 2 ml de la solucin B de Fehling, agregar 2 ml de la solucin problema. Introduzca los tubos en bao Mara previamente calentado, contine el calentamiento, registre el tiempo necesario para la aparicin de un precipitado rojizo.

Caliente como mximo 25 minutos.

1.3.2. Reaccin de Tollens

Coloque en un tubo de ensayo 1 ml de reactivo de Tollens, aada 2 ml de la solucin problema, caliente en bao Mara 10 15 minutos. Observe si hay formacin de espejo de plata.

1.4. Reaccin de Seliwanoff

Mezcle 1 ml del reactivo con 1 ml de la solucin problema al 5%. Caliente la mezcla a ebullicin, el desarrollo de un color rojo en 2 minutos, es indicativo de que la prueba es positiva, para presencia de cetosas.

1.5. Preparacin de Ozasonas

En un tubo de ensayo, coloque 0,2 g de clorhidrato de fenilhidrazona y 0,3 g de acetato de sodio disueltos en 3 ml de agua, agregue 1 ml de la solucin problema. Caliente por 20 minutos, enfre y observe. Mida el tiempo de formacin de cada osazona.

1.6. Hidrlisis de la Sacarosa

Tres tubos de ensayo, conteniendo cada uno 4 ml de solucin acuosa de sacarosa al 50%, se colocan en bao Mara y se les agrega igual volumen de agua al primero, al segundo HCl al 10%, y al tercero de NaOH al 10%. Se calientan y despus se ensaya una porcin de cada uno de ellos con el reactivo de Fehling. Qu grado de hidrlisis observ en cada caso?

1.7. Hidrlisis del Almidn

Mezcle 1 g de almidn molido con 10 ml de agua fra, y vierta esta suspensin en 200 ml de agua hirviendo. Enfrie 5 ml de esta solucin, y agregue 4 gotas de lugol.

Al resto de la solucin aada 10 ml de HCl concentrado y lleve a ebullicin. A cada 5 minutos, tome 2 porciones de 3 ml cada una y haga la prueba de Fehling en una y en la otra, previo enfriamiento con bao de hielo, la prueba del lugol.

12. POLISACARIDO - AISLAMIENTO E HIDROLISIS

I. OBJETIVO

Al finalizar la prctica, el estudiante estar en capacidad de :

- Identificar monosacridos a partir de una hidrlisis de polisacridos, mediante las pruebas caractersticas de carbohidratos.

II. MATERIAL Y EQUIPO

- Hgado

- cido tricloroactico (TCA) 10% en agua

- Etanol absoluto

- Etanol al 95%

- ter etlico

- cido clorhdrico

- Hidrxido de sodio

- Hielo

III. TEORIA

El glicgeno es un polisacrido de almacenamiento en las clulas animales. A menudo se le designa como almidn animal, tiene una estructura ramificada con unidades de cadena lineal de 11 a 18 (-D- glucopiranosas, las cuales presentan una unin glucosdica en ( (1-4) con ramificacin, mediante uniones glucosdicas en ( (1-6).

El glicgeno no es reductor y con el yodo toma un color rojo.

IV. PARTE EXPERIMENTAL

1. Aislamiento

El hgado fro deber ser pesado. Luego, macere el hgado en un mortero preenfriado con TCA 10% (1ml de TCA por gramo de hgado). Centrifugue el homogeneizado por 5 minutos; pase el sobrenadante a un tubo de ensayo, se agrega lentamente 2 volmenes de etanol 95%, mezcle bien y deje decantar el precipitado; si esto no ocurre agregue una pizca de sal y caliente de nuevo el tubo hasta que el precipitado flocule, centrifugue despus por 3 minutos.

Descarte el sobrenadante, el precipitado es el glicgeno.

Disolver el precipitado en 5 ml de agua, adicione luego 2 volmenes de etanol al 95%, centrifugue, lavar el precipitado con 3 ml de etanol 95%.

Saque la preparacin en un vidrio de reloj y pese el glicgeno.

2. Hidrlisis cida de glicgeno

Haga una solucin de glicgeno de 8 mg/ml, tome un volumen de 5 ml, rotule 4 tubos de ensayo. Deje el tubo 1 con 0,4 ml de agua como blanco, al resto de los tubos coloque 0,4 ml de la solucin de glicgeno y aada 0,6 ml de HCl 2 N; a los tubos 1 y 2 agregue 1 ml de NaOH 1,2 N; colquelos en un bao de agua hirviendo, lo mismo haga con el tubo 3 , al cabo de 10 min neutralice el cido en el tubo 3 con 1 ml de NaOH 1,2 N; el tubo 4 djelo 25 minutos, y luego neutralice con 1 ml de NaOH 1,2 N.

Determine la glucosa liberada mediante algn mtodo conocido (antrona-Molisch). Determine por el mtodo de lugol, la presencia de glicgeno.

V. LIPIDOS

13. QUIMICA DE LOS LIPIDOS

I. OBJETIVO

Al finalizar esta prctica, el estudiante estar en capacidad de identificar la presencia de lpidos en un compuesto orgnico o alimento, mediante la comprobacin de diferentes propiedades fsicas.

II. MATERIAL Y EQUIPO

- Tubos de ensayo

- Beacker

- Agua destilada

- Cloroformo

- ter

- Alcohol

- Aceite de algodn

- Sales biliares

- Solucin saponificada (grasa y KOH etanlico al 20%)

- Cloruro de calcio 10%

- cido ntrico concentrado

- cido esterico 5%

- cido oleico

- Aceite de oliva

III. TEORIA

Los lpidos son un grupo grande y heterogneo de biomolculas orgnicas, presentes en las clulas, solubles en solventes orgnicos no polares, por ejemplo (benceno, cloroformo, ter, tetracloruro de carbono) y son insolubles en agua.

Los lpidos pueden clasificarse en complejos y simples, segn que por hidrlisis alcalina generan o no sales de cidos grasos (jabones).

Los lpidos simples como esteres de cidos grasos son diversos alcoholes (grasas y ceras).

Tenemos como ejemplo derivados de lpidos como terpenos, esteroides y prostaglandinas.

1. Acilglicrido

Son esteres de los cidos grasos y del alcohol glicerol, son los ms abundantes dentro de los lpidos, sobre todo los de reserva en los seres vivos, la estructura se representa as: O

CH2 - O - C

O ( R1

C - O - C - H

R2 ( O

CH2 - O - C

R3

O-Los grupos acilo ( R - C ) pueden ser iguales o diferentes y los R forman

R1parte de cidos grasos de cadena lineal larga; estas cadenas completamente saturadas constituyen las grasas y con insaturaciones, los aceites.

2. Fosfoglicridos

Son componentes esenciales de las membranas biolgicas. Los fosfoglicridos y las esfingomielinas se consideran fosfolpidos o fosftidos, porque contienen el grupo fosfato en la molcula.

O- CH2 - O - C

O R1 C - O - CH

R2 OH

CH2 - O - P O - X

La X constituye grupos de cabeza polar, provenientes de amino alcoholes, inositol, glicerol, carbohidrato y componentes ms complejos.

Se encuentran principalmente en las membranas celulares del tejido nervioso.

Los esfingolpidos se dividen en esfingomielina y glucoesfingolpidos.

4. Ceras

Son esteres de cidos grasos saturados superiores, con alcoholes monohidroxlicos o con esteroles y son insolubles en el agua: el principal constituyente de la cera de abejas es el palmitato de miricilo.

O

CH3 - (CH2)14 - C

O - ( CH2)29 - CH3

Las ceras forman pelculas protectoras en la superficie de las hojas, frutos, piel, pelo y plumas.

5. Terpenos

Son compuestos lineales o cclicos constituidos por dos o ms unidades de isopreno.

CH2 = C - CH = CH ( CH3

Los terpenos y terpenoides se encuentran en las plantas en la forma de aceites esenciales, resinas, pigmentos, caucho, etc. Ej: geraniol, limoneno, eucaliptol, alcanfor, carotenides, vitaminas A, E, K, y la coenzima Q.

6. Esteroles Son derivados del ciclopentano perhidrofenantreno.

Los esteroles son alcoholes esteroides cuyo miembro representativo es el colesterol, el cual se encuentra normalmente esterificado con los cidos grasos, otros ejemplos de esteroides son los cidos biliares, hormona corticales y sexuales y la vitamina D.

7. Prostaglandinas

Son derivados cclicos de cidos grasos, no saturados de 20 tomos de carbono que actan en la regulacin metablica.

IV. PARTE EXPERIMENTAL

1. Solubilidad de los lpidos

Preparar 4 tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema:

TUBOS No.1234

ml agua destilada2---

ml cloroformo-2--

ml ter--2-

ml alcohol---2

Gotas de aceite de algodn5555

Agitar los tubos y observar los resultados.

2. Emulsin de los lpidos.

Preparar 2 tubos de acuerdo al siguiente esquema:

TUBOS No.12

ml de agua destilada75

ml sales biliares-2

Gotas de aceite de algodn33

Agitar los tubos y observar los resultados.

3. Saponificacin de las grasas

Preparar 3 tubos de acuerdo al siguiente esquema:

TUBOS No.123

ml solucin saponificada555

ml cloruro de calcio al 10%-1-

ml cido ntrico (gota a gota)--1

Agitar los tubos y observar los resultados.

Solucin saponificada: Tome 10 g de grasa en un erlenmeyer, aada 30 ml de KOH etanlico (20%), colquelo por 1 hora en bao de Mara, agregue luego 30 ml de agua destilada.

4. ndice de YodoPreparar 4 tubos de ensayo segn es siguiente esquema:

TUBOS No. 1234

ml cloroformo5555

Gotas de cido esterico al 5%-2--

Gotas de cido olico--2-

Gotas de aceite de oliva---2

A cada tubo aada solucin de HUBL, gota a gota, con agitacin, hasta reproducir el color desarrollado en el tubo No. 1, comparar las cantidades de solucin de HUBL gastadas en cada caso.

Explicar los resultados.

5. Consultar:

a) Qu es ndice de Yodo?

b) Qu es ndice de saponificacin?

c) Qu es cido graso?

d) Qu es glicolpido?

e) Qu es lipoprotena?

14. DETERMINACIN DEL VALOR DE ACIDEZ DE UNA GRASA

I. FUNDAMENTOLas grasas almacenadas pueden enranciarse debido a la oxidacin de los dobles

enlaces, para formar perxidos; y, a su hidrlisis por microorganismos, con

liberacin de cidos grasos. La cantidad de cidos grasos da, por tanto, un ndice

de la frescura y la calidad de la grasa.

Se sugiere que cada par de estudiantes escoja un lpido y haga un ensayo de:

- Una muestra seca.

- Una que haya sido expuesta al aire por un tiempo.

Compare sus resultados con los obtenidos por otros grupos para diferentes

lpidos.

El valor de acidez es el numero de miligramos de KOH requerido para neutralizar los cidos grasos libres presentes en 1g de grasa.

II. MATERIALES

1. Aceite de oliva, mantequilla y margarina (usar una muestra fresca y otra que se ha dejado al aire por varios das.

2. Solvente de grasa (volmenes iguales de 95% v/v de alcohol y ter) neutralizado a la fenolftalena.

3. Fenolftalena (10 g/l en alcohol).

4. KOH (0,1 mol/l).

5. Buretas (5 ml y 25 ml).

III. METODOLOGIA

1. Determinacin de la acidez

Pesar cuidadosamente 10 g de la sustancia problema, y suspenderla, despus de

derretirla, en 50 ml de un solvente de grasa. Agregar 1 ml de solucin de

fenolftalena; mezclar cuidadosamente y titular con KOH 0,1 mol/l, hasta que el

color rosado plido permanezca por ms de 20-30 s. Anotar el nmero de

ml de lcali que necesita, y calcular el valor de acidez de la grasa.

Nota: 0,1 mol/l KOH contiene 5,6 g/l o 5,6 mg/ml.

2. Prueba del fro

Utilizar aceite de girasol, algodn, oliva y manteca de cerdo.

Rotular 3 tubos de ensayo y poner 5 ml de cada aceite en cada tubo segn la

rotulacin.

Colocar los tubos sumergidos en un bao de hielo dentro de una nevera, a

intervalos vayan observando para determinar si se produce enturbiamiento del

aceite por cristalizacin de sus glicridos y anoten el tiempo en que ella se

produce.

3. Pruebas de insaturacin

Esas pruebas son aplicadas en la caracterizacin y el control del procesamiento de tales productos para transfrmalos en mantecas vegetales.

a) Prueba de adicin de yodo

- Colocar 1 ml de cada aceite por ensayar en un tubo de ensayo rotulado.

- Agregar 3 gotas de solucin de yodo o lugol a la muestra de aceite, agitar con

vigor y observar el color rojizo de la mezcla.

- Calentar con suavidad y observar si el color va cambiando hasta desaparecer

por completo.

- Enfriar, agregar 5 gotas de solucin de almidn, agitar y observar si no hay

yodo libre en la mezcla.

- Repetir la prueba con otra muestra del mismo aceite, pero agregando lugol

hasta que su coloracin rojiza persista en la mezcla y observen la coloracin

azul que se produce con el almidn, lo cual indica que ya hay yodo libre en la

prueba.

b. Prueba de adicin de bromo

- Colocar 1 ml de cada aceite por ensayar en un tubo de ensayo rotulado.

- Disuelve 2 ml de bromo en 50 ml de tetracloruro de carbono.

- Gota a gota, con ayuda de una pipeta graduada, vaya agregando solucin de bromo a cada muestra de aceite, con agitacin despus de cada gota de reactivo, hasta cuando el bromo se decolore por completo.

- Anotar el volumen o el numero de gotas de solucin de bromo requeridas para que el reactivo deje de decolorarse, con el fin de comparar entre los aceites ensayados.

Trate de explicar los resultados obtenidos, con inclusin de las correspondientes

reacciones.

15. EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE LIPIDOS.

I. OBJETIVOS

Extraer e identificar los lpidos de la yema de huevo: triacilglicridos, fosfolpidos, colesterol.

II. MATERIAL

Yema de huevo

Beacker

Erlenmeyer

Pipetas

Condensador de reflujo

Plancha de calentamiento

Papel de filtro

ter sulfrico

ter etlico

Cloroformo

cido sulfrico concentrado

KOH 10% etanlico

Solucin de cloruro de calcio saturada

Acetato de cadmio o zinc

Acetona

Acetato de plomo

Bastn de vidrio

III. PROCEDIMIENTO

Tome una yema de huevo en un beacker de 200 ml juntamente con 50 ml de ter etlico, agitando con un bastn durante 5 minutos.

Deje reposar hasta que se forme buen volumen de sobrenadante.

Retire el sobrenadante para un vaso de 100 ml y abandone el precipitado.

a) Prueba para Fosfolpido

Adicione 20 ml de propanona sobre el sobrenadante.

Filtre en papel de filtro, reservando el filtrado para las siguientes etapas.

Pase por el papel de filtro en uso 10 ml de etanol y recoja 2 ml en un tubo de ensayo.

Adicione algunas gotas de acetato de cadmio; la formacin de un precipitado blanco confirma la presencia de fosfolpido.

b) Reaccin de Saponificacin

Al filtrado reservado adicione 20 ml de KOH etanlico al 10%, en un baln acoplado a un condensador de reflujo y calentado con la plancha.

Mantenga el calentamiento (ebullicin) por 15 minutos. Transfiera todo el material del baln para el embudo de separacin con 30 ml de ter de petrleo y 30 ml de agua. Agite cuidadosamente dejando en reposo sobre el soporte para la separacin.Pruebas para confirmacin del jabn

Recoja de la fase inferior (fase acuosa) 2 ml en un tubo de ensayo con 3 ml de agua y agite obstruyendo la boca del tubo con el dedo. Observe lo que ocurri.

Recoja 2 ml en otro tubo y adicione algunas gotas de solucin saturada de cloruro de calcio, observe lo que ocurri.

Repita el mismo ensayo para la solucin de acetato de plomo.

c) Prueba para Colesterol

Recoja un poco (3 ml) de la fase etrea del embudo de separacin en un beacker y, a seguir, pngalo en una plancha de calentamiento para que todo el ter se evapore hasta que se seque (cuidado con esta operacin).

Cuando el beacker estuviere fro adicione 2 ml de cloroformo, agitando con un bastn de vidrio.

Retire 2 ml para un tubo de ensayo y con este inclinado adicione a lo largo de la pared 1 ml de H2SO4 concentrado.

El aparecimiento de un anillo rojo confirma la presencia de colesterol.

16. BIBLIOGRAFIA

ALEMANY, M. y FONT, S. Prcticas de Bioqumica. Espaa: Alhambra, 1983.

BOHINSKI, R. C. Bioqumica. Bogot: Addison-Wesley Iberoamericana, 1991.

COOPER, T. C. Instrumentos y Tcnicas de Bioqumica. Espaa: Revert, S.A. 1984.

GONZALEZ, J. M. et alli. Problemas de Bioqumica. Espaa: Alhambra, 1979.

MACARULLA, J. M. y MARIO, A. Bioqumica cuantitativa. Espaa: Revert, S.A. 1988. UNIVERSIDAD DE CORDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS

PROGRAMA DE INGENERIA DE ALIMENTOS

BIOQUIMICA GENERALGUIAS DE LABORATORIO

PROF. CLAUDIA DENISE DE PAULA

M.Sc. CIENCIA DE LOS ALIMENTOS

MONTERIA, 2000

OH

H2N - C -COOH

(

CH2

(

H2N - C -COOH

(

CH2

(

H2N - C -COOH

(

CH2

(

(

+ O2

PPO

+ O2

PPO

O

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