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01/18/11

GentherapieAktuelle Methoden und Forschungsergebnisse

Prof. Theo DingermannInstitut für Pharmazeutische Biologie

BiozentrumMax-von Laue-Str. 9

60438 Frankfurt am [email protected]

Dienstag, 18. Januar 2011

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Arzneimittel

… sind Stoffe oder Stoffgemische unterschiedlicher chemischer Komplexität, die mit Biomolekülen interagieren,• um deren Überaktivität zu hemmen = Inhibitoren• um deren Aktivität zu steigern = Aktivatoren

… sind Stoffe,• die eine fehlende Aktivität ersetzen = Substitutions-Wirkstoffe

oder


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Arzneimittel

… können chemisch unterschiedlich komplex sein.

Sie können relativ klein sein (Inhibitoren oder Aktivatoren) …


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Arzneimittel

… können chemisch unterschiedlich komplex sein.

… oder sie können sehr groß sein (Substitutions-Wirkstoffe)


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Arzneimittel

Warum können Arzneimittel nicht auch Informationseinheiten sein,

die die Zelle in Substitutions-Wirkstoffe umwandelt?

Gentransfer-Vektoren


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Anno 1981

"Gentherapie"anno 1981 beiDrosophila melanogaster

Gerry Rubin


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Inhalt

Regulatorische Aspekte


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Somatischer- vs. Keimbahn-Gentransfer

Eingebrachte Information kann an Folgegenerationen weitergegeben werden.

Keimbahn Gentransfer

Nur der somatische Gentransfer gilt bei der Anwendung am Menschen als ethisch.

Ein Keimbahn-Gentransfer ist bei Menschen streng verboten (Embryonenschutzgesetz § 5)

Somatischer Gentransfer

Eingebrachte Information wird nur in der behandelten Zelle realisiert.


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Definition

• Transfer von DNA in somatische, humane Zellen zu therapeutischen Zwecken.

• Ziel ist die Beeinflussung pathophysiologischer Prozesse, um Krankheiten vorzubeugen, zu heilen, zu lindern, bzw. die Diagnostik zu verbessern.

Somatischer Gentransfer (Gentherapie)

Somit sind Gentransfer-Vektoren für eine somatische Gentherapie Arzneimittel!


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Arzneimittel

§ 2 Abs.1 AMGArzneimittel sind Stoffe und Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper

1. Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhafte Beschwerden zu heilen, zu lindern, zu verhüten oder zu erkennen,

2. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände erkennen zu lassen,

3. vom menschlichen oder tierischen Körper erzeugte Wirkstoffe oder Körperflüssigkeiten zu ersetzen,

4. Krankheitserreger, Parasiten oder körperfremde Stoffe abzuwehren, zu beseitigen oder unschädlich zu machen oder

5. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände zu beeinflussen.


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Note for Guidance…

Art des Gentransfer-Arzneimittels

Beispiele

a) nackte Nukleinsäuren natürliche oder synthetische Nukleinsäure im Allgemeinen eingebunden in entsprechende Plasmide oder Kassetten (ausschließlich Antisense-Oligonukleotide) mit oder ohne Adjuvans

b) komplexierte Nukleinsäuren oder nicht-virale Vektoren

(i) siehe oben, aber mit komplexierten (z.B. Transferrin) oder anderen Polymeren (z.B. DEAE-Dextran, Polylysin)

(ii) wie (i), aber verkapselt oder assoziiert (z.B. in Liposomen)

(iii) wie oben, aber auf Kolloidpartikeln

...on the Preclinical and Clinical Aspects of Gene Transfer Medicinal Products (CPMP/BWP/3088/99)


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Note for Guidance…

Art des Gentransfer-Arzneimittels

Beispiele

c) virale Vektoren Normalerweise replikationsinkompetente Viren, einschließlich Adenovirus, Retrovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpes-simplex-Virus, in einigen Fällen replikationskompetente Viren (z.B. Vaccinia-Virus)d) genetisch modifizierte

Zellenallogene oder xenogene Zellen oder Bakterienzellen mit einem neuen Nukleinsäureabschnitt

...on the Preclinical and Clinical Aspects of Gene Transfer Medicinal Products (CPMP/BWP/3088/99)


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12. AMG-Novelle (2004)

§ 4 Abs. 9 AMG

"Gentransfer-Arzneimittel sind zur Anwendung am Menschen bestimmte Arzneimittel im Sinne des § 2 Abs. 1, die zur genetischen Modifizierung von Körperzellen durch Transfer von Genen oder Genabschnitten bestimmte nackte Nukleinsäuren, virale oder nichtvirale Vektoren, genetisch modifizierte menschliche Zellen oder rekombinante Mikroorganismen, letztere ohne mit dem Ziel der Prävention oder Therapie der von diesen hervorgerufenen Infektionskrankheiten eingesetzt zu werden, sind oder enthalten."


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Andere gesetzliche Vorschriften

Gentechnik-Gesetz (GenTG)

Die Herstellung von Gentherapie-Vektoren bedingt in der Regel die (vorübergehende) Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen, die nur in so genannten gentechnischen Anlagen erfolgen darf.Das bedeutet, dass die Herstellung der Gentransfer-Vektoren und ggf. auch die Ex-vivo-Modifizierung von Patienten-Zellen in einer gentechnischen Anlage unter GMP-Bedingungen erfolgen muss.

Allerdings...

...unterliegt die Anwendung von gentechnisch veränderten Zellen am Menschen ausdrücklich nicht dem GenTG (§ 2 Abs. 2).


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Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer (bis 2004)

"Richtlinien zum Gentransfer in menschliche Körperzellen"

Die Genehmigung einer klinischen Gentherapie-Studie erfordert ein positives Votum der zuständigen Ethikkommission, die bei der fachlichen Beurteilung von Anträgen von der Kommission Somatische Gentherapie (KSG) beraten werden soll.Der verantwortliche Leiter des klinischen Versuches muss ein approbierter Arzt sein.


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Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer (bis 2004)

Gegenstand der Beurteilung

• medizinische Indikation und Begründung für das Vorhaben• wissenschaftliche Qualität des Forschungsvorhabens• Nutzen-Risiko-Abwägung• wissenschaftliche, technische und ärztliche Qualifikation des

Antragstellers• Einhaltung der nationalen und internationalen Regeln für die

biomedizinische Forschung an Menschen gemäß der revidierten Deklaration von Helsinki

• ethische Vertretbarkeit des Forschungsvorhabens


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12. AMG-Novelle

§§ 40, 77, 42 AMG

Klinische Studien müssen prinzipiell von der zuständigen Bundesoberbehörde genehmigt werden (§ 40).

Für die Anwendung von Gentransfer-Arzneimitteln ist die zuständige Bundesoberbehörde das Paul-Ehrlich-Institut in Langen (§ 77).

Eine Gentherapie-Studie darf erst begonnen werden, wenn die Bundesoberbehörde schriftlich eine Zustimmung erteilt hat (§ 42).


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Inhalt

Strategien und Indikationen


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Unterschiedliche konzeptionelle Ansätze

Genersatztherapie

Intakte Kopie einesdefekten Gens


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Tumorvakzinierung

IL2-, TNFα-,GM-CSF-Gen

Fibroblast, T-Zelle,Tumorzelle

IL2TNFαGM-CSF

Tumorzellen werden angelockt und eliminiert


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Sensibilisierung vonZellen für Sekundärtherapie

Multidrug-Resistenz-Gen

HSV-Thymidin-Kinase-Gen


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Indikationen für Gentherapiestrategien

Monogenische Erkrankungen• X-Chromosom gekoppelte SCID• ADA Defizienz (ADA-SCID)• Mucopolysaccharidose• Familiäre Hypercholesterinämie • Cystische Fibrose (Mucoviszidose)• Hämophilie B • Chronische X-Agranulomatose

Krebs• Gynäkologische Tumore (Brust, Eierstock, Cervix)• Zentrales Nervensystem (Glioma, Neuroblastoma)• Gastro-Intestinaltrakt (Colon-CA, colorektales CA, Leber-CA)• Urogenitaltrakt (Prostata-CA, Nieren-CA)• Haut (Melanome)• Lungen-CA• Hämatologische Krebserkrankungen


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Indikationen für Gentherapiestrategien

Virus-Infektion• HIV

Andere Erkrankungen• Rheumatische Arthritis• Arterien-Erkrankungen

Markierungsexperimente• GvHD-Kontrolle• Hämatologische Krebserkrankungen• Melanome• Neuroblastome• Non-Small-Cell" Lunge- CA• Blasenkrebs


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Gentherapie in klinischen Studien

Stand Oktober 2009


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Vorgehensweise bei der Therapie mit Gentransfer-Arzneimitteln


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Methoden zur genetischen Veränderung von Zellen

Chemische Methoden• Ca2+-Phosphat-Präzipitation• Liposomen• Nanopartikel

Transfektion

Infektion; Transduktion

Physikalische Methoden• Mikroinjektion• Elektroporation• Bioballistik

Biologische Methoden• Viren


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Der ideale Gentherapie-Vektor …

... hat eine hohe Transfektions-/Transduktionseffizienz;

... hat einen hohen Titer (>108 Viruspartikel/ml);

... ist einfach und reproduzierbar herzustellen;

... infiziert proliferierende und ruhende Zellen;

... erlaubt nachhaltige Expression des therapeutischen Gens;

... wird stabil in das Genom der therapierten Zellen integriert;

... unterstützt Regulierbarkeit der Expression;

... ist spezifisch für bestimmte Zelltypen;

... ist nicht immunogen


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Inhalt

Transfersysteme


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Retroviren Adenoviren AAV Liposomen DNA

Transfersysteme


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Gentransfer-Vektoren

ex vivo in vivo stabil/transient

Virale VektorenVirale VektorenVirale VektorenVirale VektorenRetrovirus + ? SAdenovirus +/- + TAdeno-assoziiertes Virus (AAV) + ? SHerpesvirus +/- + ?Vaccinia-Virus +/- + T

Nichtvirale VektorenNichtvirale VektorenNichtvirale VektorenNichtvirale VektorenLiganden/DNA-Konjugate - + TAdenovirus/DNA-Konjugate - + TLiposomen +/- + TCa-Phosphat-Präzipitation +/- - SDNA-Injektion - + T


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Gentherapie in klinischen Studien

Stand Oktober 2009

Biologische Gentransfer-Methoden sind deutlich effizienter als physiko-chemische Transfektions-methoden


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Retroviren bauen Gene aktiv in Chromosomen ein; Aussicht auf langfristige Stabilität

Durch Retroviren übertragene Gene integrieren nach dem Zufallsprinzip und können deshalb intakte Gene zerstören

Transfersysteme


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Retrovirale Gentransfer-Vektoren

LTR

C-Typ Retrovirus (MLV)

Aufbau von Retroviren


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Vom Retrovirus zum Gentransfer-Vektor



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Problem 1:Ein Gentherapie-Vektor darf nicht selbst replizieren



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Problem 2:Ein Gentherapie-Vektor darf nicht mit HERVs rekombinieren


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Die Konsequenz aus den Problemen 1 + 2:Man trennt Replikation von Funktion



Ergebnis:

Verpackungszelle

VerpackungszelleGentransfer-Vektor

Gentransfer-Vektor


Herstellung replikationsdefekter Retroviren

Verpackungszelle



Verpackungszelle



Verpackungszelle



Verpackungszelle



Verpackungszelle



Verpackungszelle



Zelle des Patienten


Eigenschaften retroviraler Gentransfer-Vektoren

• hohe Transduktionsfrequenz• moderate Virustiter (106-107/ml)• infizieren nur proliferierende Zellen• nicht zelltypspezifisch• nur Ex-vivo-Applikation• geringe Insertgrößen (< 7,5 kb)• Integration• kaum Insertionsspezifität• oft langanhaltende Expression• kaum immunogen


Science 270:470 (1995)Science 270:475 (1995)

Der erste klinische Gentherapie-Versuch war 1990


Science 288:669 (2000)

10 Jahre später: erste Erfolge …


Science 302:415 (2003)

… aber auch Sicherheitsprobleme


Science 300:1749 (2003)

Retrovirus MLV inseriert in aktive Gene


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Alternative: Lentivirale Gentransfer-Vektoren

Aufbau von Lentiviren

Lentiviren sind als Gentransfer-Vektoren interessant, weil sie typischerweise auch nicht-proliferierende Zellen infizieren können.


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Aufbau von Lentiviren

Lentiviren sind als Gentransfer-Vektoren interessant, weil sie typischerweise auch nicht-proliferierende Zellen infizieren können.


• auf der genomischen RNA• TAR (trans-activating response element, Nukleotide 1-55), wird von

Tat gebunden• RRE (Rev-responsive element, Nukleotide 7362-7596) wird von Rev

gebunden• kodierte Proteine

• Tat: steigert die Prozessivität des Transkriptionskomplexes• Rev: verhindert Spleißen der "genomischen" HIV-RNA, steigert den

Export ungespleißter RNA in das Cytoplasma• Vif: wichtig für effiziente DNA-Synthese und Virusstabilität• Vpr: vermittelt Penetration in den Zellkern, induziert Arretierung des

Zellzyklus in G2, dadurch Apoptose• Nef: unterstützt Abbau von CD4-Molekülen durch Endozytose• Vpu: unterstützt Abbau von CD4-Molekülen im ER• p6: bindet an Vpr, unterstützt Einbau von Vpr in Viruspartikel

Funktionen zusätzlicher Elemente in HIV

Humanes Immundefizienzvirus (HIV-1)


Generelle Überlegungen

• einige Akzessorische Proteine sind zwar für die Pathogenität des Virus in vivo essenziell, sind aber für die Replikation in vitro nicht notwendig (Vif, Vpr, Vpu, Nef).

• Das Protein Tat ist nur notwendig, wenn die Expression des Virusgenoms vom 5'-LTR des Virus gesteuert wird.

• Rev ist für eine effiziente Herstellung von Viruspartikel (Gentransfer-Vektor) notwendig.

HIV-basierte Gentherapie-Vektoren




Therapie von AIDS…

... mit HI-Viren?

Vektor VRX496• transduziert CD4+ T-Helferzellen mit

> 90 % Effizienz• transduziert auch andere Zelltypen,

u.a. CD34+-positive Blutstammzellen • Transgen: Antisense-Sequenz gegen

wt-HIV-Env (937 bp)• trägt HIV-Verpackungssignalsequenz

(Ψ)• trägt RRE• Expression des Transgens durch den

wt-HIV LTR-Promotor• Expression abhängig von Tat und Rev


Therapie von AIDS…

... mit HI-Viren?

Vektor VRX496• transduziert CD4+ T-Helferzellen mit

> 90 % Effizienz• transduziert auch andere Zelltypen,

u.a. CD34+-positive Blutstammzellen • Transgen: Antisense-Sequenz gegen

wt-HIV-Env (937 bp)• trägt HIV-Verpackungssignalsequenz

(Ψ)• trägt RRE• Expression des Transgens durch den

wt-HIV LTR-Promotor• Expression abhängig von Tat und Rev


Biologisches Risiko

Auch lentivirale Vektoren inserieren in aktive Gene

Science 300:1749 (2003)


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Adenoviren verursachen keine ernsten Krankheiten; sie besitzen eine große Aufnahmefähigkeit für fremde Gene

Die übertragenen Gene sind nur temporär aktiv; Die Viren lösen Immunreaktion aus

Transfersysteme


Adenovirale Gentransfer-Arzneimittel

• lineare, doppelsträngige DNA mit 36.000 - 38.000 bp.• an den beiden 5'-Enden jeweils kovalent ein Molekül "Terminales

Protein (TP)", die das Genom „quasi zirkularisieren“.• Invertierte Wiederholungssequenzen von 54-166 bp• E1A-Protein fungiert als Transkriptionsaktivator der frühen Gene

E1B, E2A, E2B, E3 und E4.• Adenoviren können in normalen Körperzellen nur replizieren, wenn

die Proteine E1A und E1B vorhanden sind. • E1A und E1B binden an die Tumorsuppressorproteine Rb und p53

und inaktivieren diese.



• hohe Transduktionsfrequenz• sehr hohe Virustiter (1011-1012/ml)• infizieren auch nicht proliferierende Zellen• kaum zelltypspezifisch• Ex-vivo- und In-vivo-Applikation möglich• große Inserts (8 kb, maximal 30 kb)• keine Integration• zeitlich begrenzte Expression• stark immunogen



Erste Generationsvektoren

Verpackungszelle

Gentherapie-Vektor



Zweite Generationsvektoren

Verpackungszelle

Gentherapie-Vektor



Dritte Generationsvektoren (gutless-Vektoren)

Verpackungszelle

Gentherapie-Vektor


Nat. Genet. 8:42 (1994)

Erste klinische Studien


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Adeno-assoziierte Viren bauen Gene aktiv in Chromosomen ein; Sie verursachen keine ernsten Krankheiten

Adeno-assoziierte Viren besitzen eine relativ geringe Aufnahmekapazität

Transfersysteme


Adeno-assoziiertes Virus (AAV)Gentransfer-Arzneimittel

• nicht humanpathogene Parvoviren• besitzen ein einzelsträngiges DNA-Genom von ca. 4.700

Nukleotiden• 125 Basen lange Inverse terminale Wiederholungen (ITRs =

inverted terminal repeats) an beiden Enden.• AAVs gehören zu den "Dependoviren“, d.h. sie benötigen für ihre

eigene Replikation andere "Helferviren" wie Adeno- oder Herpesviren.

Adeno-assoziiertes Virus (AAV)



Aufbau von Gentransfer-Vektoren

Verpackungszelle


• hohe Transduktionsfrequenz• hohe Virustiter (<1010/ml)• benötigt Adenovirus für Replikation• Gefahr der Kontamination mit Adenoviren• infizieren auch "stille" Zellen• In-vivo-Applikation• kleine Inserts (<4,5 kb)• spezifische Integration (Rep-abhängig)• z.T. langanhaltende begrenzte Expression• nicht immunogen



Nat. Genet. 24:257 (2000)

Erste klinische Studien

Klinische Studien zur Gentherapie der Hämophilie


Gentherapie mit replikationsfähigen Viren

• Adenoviren sind prinzipiell cytolytische Viren, wenn sie zur Replikation in der Lage sind.

• Diese Fähigkeit erreichen sie, indem sie mit ihren Genprodukten E1A und E1B die Tumorsuppressorgene p53 bzw. Rb inaktivieren.

• Da Tumorzellen diese Gene häufig durch Mutation verloren haben, können auch Adenoviren mit Deletionen der E1A- und E1B-Funktionen replizieren und die Tumorzellen lysieren.








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Liposomen enthalten keine viralen Gene und bergen deshalb keine sekundären biologischen Gefahren.„Nackte DNA“ wurde lange eher für Impfungen angewendet. Heute aber durchaus auch für genthetapeutische Ansätze in Erprobung.

Liposomen sind als Transfersysteme deutlich weniger effizient als Virale Systeme. Die DNA wird nicht gezielt sondern eher zufällig ins Genom integriert.Der Gentransfer mit „nackter“ DNA ist sehr ineffizient; Meist erweisen sich die DNA und die Transformation als instabil.

Transfersysteme


• geringe Transfektionsfrequenz• billig in großen Mengen herzustellen• keine Belastung durch Viren• Transfektion von nicht prolifierenden Zellen• In-vivo-Applikation• auch große Inserts• kaum Integration, zeitlich begrenzte Expression• transgene Zelllinien für Langzeitexpression (z.B.

Stammzellen)• kaum immunogen

Virusfreie Gentherapie-Vektoren

Plasmid-DNA


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Nichtvirale Systeme für die somatische Integration

• DNA-Transposasen• Sleeping Beauty (SB); Integration in ein TA-Dinukleotid • PiggyBac (PB); Integration in eine TTAA-Nukleotidsequenz


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Nichtviraler stabiler Gentransfer – somatische Integration


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• Phagenintegrase PhiC31• bindet an die genannte Pseudo-attP-Anheftungsstellen in

Säugetier-Genomen, von denen es beim Menschen etwa 100 bis 1000 Vertreter gibt.


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• Phagenintegrase PhiC31• bindet an die genannte Pseudo-attP-Anheftungsstellen in

Säugetier-Genomen, von denen es beim Menschen etwa 100 bis 1000 Vertreter gibt.

• Zinkfinger-Nukleasen: Fusionsproteine, die aus zwei wesentlichen Bestandteilen bestehen:• einer DNA-Bindungsdomäne und • einer DNA-Nukleasedomäne.


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Episomale persistierende therapeutische Genfähren: DNA-Replikons

• DNA-Replikons, die von einem Herpesvirus abgeleitet sind• Z.B. das EBV-Replikon, das aus dem viralen Protein EBNA1

und einem origin of plasmid replication (oriP) besteht.• Artifizielle Episomen, die rein auf zellulären Komponenten

aufbauen• Alle bekannten Replikationsursprünge aus höheren

Organismen enthalten eine DNA-Sequenz (Scaffold/Matrix Attached Region, S/MAR), die an eine subnukleare Struktur, die Kernmatrix oder Kern-Scaffold, binden.


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Inhalt

Die Frankfurter Studie


Gentherapie der septischen Granulomatose: Die Frankfurter Studie

Im Universitätsklinikum Frankfurt wurden im Jahre 2004 zwei Patienten mit X-CGD (25 und 26 Jahre alt) mit genmodifizierten, G-CSF mobilisierten peripheren Blutstammzellen behandelt.



Für den Gentransfer wurde ein gamma-retroviraler Vektor (SF71gp91phox) mit gp91phox cDNA unter der transkriptionellen Kontrolle viraler Steuerungselemente verwendet.





Bei den beiden Patienten in der Frankfurter Studie kam es zur Rückbildung von Leberabszessen und einer Pilzinfektion der Lunge innerhalb von 50 Tagen.

Danach waren beide Patienten, unter einer für CGD-Patienten typischen antimikrobiellen Prophylaxe, über 18 Monate klinisch stabil und frei von Infekten. Dabei lag die Anzahl Oxidase positiver Granulozyten im Blut bei 180-400/µl.

Schließlich entwickelte sich durch Insertionsmutagenese eine klonale Expansion in der Hämatopoese und schließlich ein myelodysplastisches Syndrom mit Monosomie 7 bei beiden Patienten.




Zusammenfassung

Viele Erwartungen in die Gentherapie haben sich bisher nicht erfüllt:

Grund 1Gentransfer-Experimente mit Viren zeigen transiente Erfolge in Zielzellen; die Zellen sterben jedoch nach Ablauf ihrer normalen Lebenserwartung ab und werden automatisch durch „kranke“ Zellen ersetzt.

Grund 2Immunologische Reaktionen gegen infizierte Zellen mit Langzeitwirkung


Ausblick

Reparatur von defekten Genen durch Induktion von Reparaturprozesse und Gabe einer Matrize:

1. Reparatur einzelner Bausteine bei monogenischen Erkrankungen2. Ersetzen eines defekten Gens durch ein intaktes Gen durch homologe Rekombination.


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